WO1993003055A1 - Composes peptidiques, inhibiteurs de l'adsorption du hiv sur ses cellules cibles - Google Patents
Composes peptidiques, inhibiteurs de l'adsorption du hiv sur ses cellules cibles Download PDFInfo
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Classifications
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- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/22—Tachykinins, e.g. Eledoisins, Substance P; Related peptides
-
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-
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- the present invention relates to a new class of chemicals having antiviral activity and, in particular, activity inhibiting the binding of the HIV virus.
- HTV viruses have been described by F. Barré-Sinoussi et al. (Science, 1983, 2 ⁇ . 868: 871) and by Clavel et al. (Science, 1986, 233, 343: 346). In this document, the terms "HIV” or "HIV” will be used interchangeably to designate these viruses.
- substance P has been described in J. Physiology, 1931, 2 ”74:87, by Von Euler and Gaddum, then characterized by Chang et al. (J. Biol. Chem., 1970, 245. 4784).
- Boc terbutyloxycarbonyl
- P1 H-Arg-Pro-Lys-Pro-OH
- P2 H-Arg-Pro-Lys-Pro-OCH3
- P3 CH 3 - (CH2) ⁇ o-CO-Arg-Pro-Lys-Pro-OCH3
- P4 H -Arg-Pro-Lys-Pro-NH- (CH 2 ) ⁇ -CH3
- P5 CH3- (CH 2 ) ⁇ o-CO-Arg-Pro-Lys-Pro-OH
- FIG 1 shows the structural formula of the derivatives described.
- Boc Proline methylester, or Boc Proline alkylamide is deprotected with trifluoroacetic acid at 40% in dichloromethane, at 25 ° C. Deprotection is followed by chromatography, on a thin layer (Merck silica plates, solvent: methanol / chloroform 1/9 volume). The coupling with N ⁇ Boc-L- ( ⁇ carbobenzoxy) lysine is carried out at -15 ° C, in the presence of N-methylmorpholine, the proline derivative being in slight excess (M. Bodanszky and A. Bodanszky - la: "The
- the coupling agent is isobutyl chloroformate.
- the dipeptide formed: Boc Lys (Z) -Pro-R is then deprotected on the N-terminal part with trifluoroacetic acid at 40%. This process is repeated until the tetrapeptide A-Arg-Pro-Lys-Pro-R is obtained, which is ultimately deprotected on the side chains by anhydrous hydrofluoric acid (see Bodanszky p. 174).
- the purification is carried out by gel chromatography and reverse phase chromatography, high performance (HPLC), on grafted silica.
- pseudopeptides have been synthesized by chain extension, like the corresponding homologous peptides.
- the methylene amino-y bond (CH 2 -NH) -, reduced peptide bond, is obtained by condensation, according to the method of Sasaki and Coy (Peptides, 1989, &, 119: 121).
- Boc-aminoaldehyde is condensed with the amino function of an amino acid or a peptide.
- the intermediate Schiff base is reduced in situ by sodium cyanoborohydride (NaBH 3 CN).
- the HIV virus (LAV-1 strain) was produced on infected T lymphoblastoid cells (CEM-LAV-1 line). Every 3 or 4 days, the cells are centrifuged, resuspended in new medium and mixed at 50% with uninfected EMFs at the final concentration of 0.5.10 6 cells per milliliter.
- the virus present in the supernatant was concentrated 150 times by precipitation with 10% polyethylene glycol for 24 hours at 4 ° C. After centrifugation at 5000 rpm for 30 min, the pellet was resuspended in an NTE buffer (pH 8) (0.1M NaCl, 0.01M Tris, 0.0001M EDTA), placed on a 30-40% sucrose cushion and centrifuged for one hour at 26,000 rpm (Rotor Kontron TST 28-38).
- NTE buffer pH 8
- the purified virus was recovered, diluted in NTE buffer (pH 8), then concentrated by centrifugation at 26,000 rpm for 1 hour. The pellet was resuspended in the NTE buffer, aliquoted and stored at -80 ° C.
- the HIV-1 virus used for this study has a titer greater than 10 8 IU / ml (IU: Infectious Unit) for MT4 cells and a titer of 10 9 cpm ml in reverse transcriptase assay.
- D. is a continuous line of human lymphoblastoid cells. These cells are cultured in RMPI 1640 medium 10% FCS (Flow), 1% PSN (penicillin, streptomycin, neomycin (GIBCO), 1% glutamine (GIBCO)).
- An ⁇ -GP 110 (anti-HIV glycoprotein envelope 1):
- This antibody is marketed by the Amersham Company (Ref. RN 1001). ⁇ is used and diluted to 25th in PB solution A. The revelation of this antibody is obtained by streptavidin phycoer thrine (Becton Dickson).
- the SupTl cells (5.10 5 cells) were washed twice in the PB A solution and incubated individually with 10 " 6 M of each product PI, P2, P3, P4 and P5 respectively (samples 11, 12, 13, 9a and 10a ), for 30 min at 37 ° C, then 1 ⁇ g of concentrated HTV-1 virus was added and the whole was maintained at 37 ° C for 30 min.
- the cells were incubated with the anti-GPHO antibody, then with the biotinylated anti-mouse antibody and, finally, with streptavidin phycoerythrin. Each incubation is carried out at 4 ° C. for 30 min and the cells are washed twice with the PB A solution, after each of these steps. Prior to cytofluorograph (Ortho) analysis, the cells were resuspended in the PBA solution supplemented with 1% formalin.
- the cells were incubated with medium, then, respectively, with anti-GPHO, biotinylated anti-mouse and streptavidin phycoerythrin (samples 3 and 3a).
- the cells were incubated with each of the products individually, then successively with medium, anti-GPHO, biotinylated anti-mouse and streptavidin phycoerythrin (samples 4, 5, 6 and 4a, 5a).
- Table I presents the results of the cytofluorograph analysis of the samples PI, P2 and P3. Under our experimental conditions, 53% of the cells binding the HIV-1 viras are detected (sample 1).
- Pretreatment of the cells with the products allows a significant reduction in the binding of the HIV-1 virus with the products PI and P3 (respectively samples 11 and 13) and a total blocking of the fixation with the product P2 (sample 12).
- Table II shows the results obtained with products P4 and P5.
- the various witnesses present the same observations as those previously described for the products PI, P2 and P3.
- the present invention also covers the derivatives of these substances and, in particular, derivatives which cannot be hydrolyzed by modification, in particular, of peptide bonds, if these derivatives retain an inhibitory activity equivalent to the original products.
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Abstract
L'invention est caractérisée par l'activité inhibitrice de la fixation du virus HIV-1 sur des cellules par l'apport de dérivés analogues de la partie N-terminale de la Substance P: Arg-Pro-Lys-Pro (voir schéma). Ces nouvelles molécules pourraient constituer une nouvelle stratégie thérapeutique des infections HIV. De plus, ces molécules peuvent correspondre à de nouveaux marqueurs de surface des cellules du système immunitaire (lymphocytes CD4+, macrophages...), éventuellement utilisables pour le diagnostic et le suivi biologique de certaines maladies immunologiques.
Description
COMPOSES PEPTIDIQUES, INHIBITEURS DE L'ADSORPTION DU HIV SUR SES CELLULES CIBLES
La présente invention est relative à une nouvelle classe de produits chimiques ayant une activité antivirale et, en particulier, une activité inhibant la fixation du virus VIH.
Ces composés peptidiques inhibiteurs de la fixation du virus HTV-1 sur des cellules d'une lignée lymphoblastoïde humaine sont décrits ci-après. Les applications thérapeutiques desdits produits inhibiteurs font partie de la présente invention. Les virus HTV ont été décrits par F. Barré-Sinoussi et al. (Science, 1983, 2Ω. 868:871) et par Clavel et al. (Science, 1986, 233. 343:346). Dans le présent document, on utilisera indifféremment les termes "VIH" ou "HIV" pour désigner ces virus.
Dans la propagation de l'infection rétrovirale, l'adso tion du virus sur la membrane cellulaire représente une étape préliminaire, qui dépend de la liaison de la glycoprotéine virale GP120 au récepteur cellulaire CD4 présent dans certains groupes de lymphocytes T et de cellules du système immunitaire. L'inhibition de ce phénomène peut donc constituer une cible intéressante pour la chimiothérapie antivirale. Plusieurs substances douées de propriétés inhibitrices envers l'infection à VIH (héparine, polysulfate de pentosan, sulfate de dextran, PVAS et PAVAS) et certains peptides courts et hydrophobes (Pro-Phe) ont récemment été décrits pour des propriétés semblables (Finberg étal, Science, 1990, 249. 287:291).
Nous avons constaté que la substance "P" ou des peptides, acylpeptides, peptides esters et peptides amides C-terminaux, analogues de la partie N-terminale et hydrophile de la Substance P : Arg-Pro-Lys-Pro-OH, ont une activité inhibitrice sur la liaison du virus HIV-1 avec la surface de cellules lymphoblastoïdes humaines. A titre d'exemple, la substance P a été décrite dans J. Physiology, 1931, 2 » 74:87, par Von Euler et Gaddum, puis caractérisée par Chang et al. (J. Biol. Chem., 1970, 245. 4784).
Les peptides préférés selon l'invention répondent à la formule générale :
A-Arg-Pro-Lys-Pro-R
A ≈Boc, H, CH3-CO-, CH3-(CH2)m-CO- ; m = 2, 4, 6, 10
Boc = terbutyloxycarbonyl
R = -OH, -OCH3, -NH-(CH2)n-CH3 ; n = 3, 5, 7, 11
B. s'agit, notamment, des produits PI, P2, P3, P4 et P5 suivants :
P1 =H-Arg-Pro-Lys-Pro-OH P2 = H-Arg-Pro-Lys-Pro-OCH3 P3 = CH3-(CH2)ιo-CO-Arg-Pro-Lys-Pro-OCH3 P4 = H-Arg-Pro-Lys-Pro-NH-(CH2)ιι-CH3 ' P5 = CH3-(CH2)ιo-CO-Arg-Pro-Lys-Pro-OH
produits dont les activités inhibitrices ont été évaluées en utilisant des tests de screening in vitro de substances à activité antivirale.
La figure 1 représente la formule développée des dérivés décrits.
I - SYNTHESE DES DERIVES PEPTIDIQUES
Schéma des synthèses
* La Boc Proline méthylester, ou Boc Proline alkylamide, est déprotégée par l'acide trifluoracétique à 40 % dans le dichlorométhane, à 25° C. La déprotection est suivie par chromatographie, sur couche mince (plaques de silice Merck, solvant : méthanol/chloroforme 1/9 volume). Le couplage avec la Nα Boc-L- (ω carbobenzoxy) lysine est effectué à -15° C, en présence de N-méthylmorpholine, le dérivé proline étant en léger excès (M. Bodanszky et A. Bodanszky - la : "The
Practice of Peptide Synthesis" ; Springer Verlag Berlin, 1984, p. 109:110).
L'agent de couplage est le chloroformiate d'isobutyle. Le dipeptide formé : Boc Lys (Z)-Pro-R est ensuite déprotégé sur la partie N-terminale par l'acide trifluoracétique à 40 %. Ce processus est répété jusqu'à l'obtention du tétrapeptide A-Arg-Pro- Lys-Pro-R, lequel est, finalement, déprotégé sur les chaînes latérales par l'acide fluorhydrique anhydre (voir Bodanszky p. 174).
* La purification est faite par chromatographie sur gel et chromatographie en phase inverse, à haute performance (HPLC), sur silice greffée.
L'absence de racémisation est vérifiée par couplage de l'hydrolysat avec le réactif de Marfey et HPLC. Les critères de pureté sont PHLC, spectométrie de masse (FAB), RMN et analyse d'acides aminés.
* Les pseudopeptides ont été synthétisés dans le but d'éviter la dégradation par les protéases et de modifier la structure de la séquence peptidique de référence (Arg- Pro-Lys-Pro).
A-Arg-Pro-y(CH2-NH)-Lys-Pro-R A = Boc-, H-, CH3-CO-, CH3-(CH2)m-CO- ; m = 2, 4, 6, 10
R = -OH, -OCH3, -NH-(CH2)n-CH3 ; n = 3, 5, 7, 11
Ces pseudopeptides ont été synthétisés par élongation de chaîne, comme les peptides homologues correspondants.
La liaison méthylène amino-y(CH2-NH)-, liaison peptidique réduite, est obtenue par condensation, selon la méthode de Sasaki et Coy (Peptides, 1989, &, 119:121).
Ainsi, on condense un Boc-aminoaldéhyde avec la fonction aminé d'un acide aminé ou d'un peptide. La base de Schiff formée intermédiairement est réduite in situ par le cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN).
Les critères de pureté sont, là encore, définis par HPLC, spectométrie de masse (FAB), RMN et analyse d'acides aminés. La formule développée des dérivés décrits est présenté sur le schéma n° 1.
L'activité inhibitrice de ces composés peptidiques sur la fixation du virus HIV-1 sur ces cellules cibles a été évaluée selon le procédé suivant
H - ETUDE DE L'INHIBITION DE L'ADSORPTION DU HIV A LA SURFACE DES CELLULES-CIBLES PAR UNE ANALYSE EN
CYTOMETRIE DE FLUX
A - MATERIEL UTILISE POUR CETTE ETUDE
1) Les molécules testées
Les peptides PI, P2, P3, P4 et P5 ont été synthétisés selon le procédé de synthèse décrit ci-dessus. Ces produits ont été dissous dans l'eau, conservés et congelés à -20° C.
2 Levinιs HIV-l
Le virus HIV (souche LAV-1) a été produit sur des cellules lymphoblastoïdes T infectées (lignée CEM-LAV-1). Tous les 3 ou 4 jours, les cellules sont centrifugées, resuspendues dans du nouveau milieu et mélangées à 50 % avec des CEM non infectées à la concentration finale de 0.5.106 cellules par millilitre.
Le virus présent dans le surnageant a été concentré 150 fois par une précipitation avec 10 % de polyéthylène glycol pendant 24 heures à 4° C. Après centrifugation à 5000 rpm pendant 30 min, le culot a été resuspendu dans un tampon NTE (pH 8) (NaCl 0,1M, Tris 0.01M, EDTA 0,0001M), déposé sur un coussin de sucrose 30- 40 % et centrifugé une heure à 26000 rpm (Rotor Kontron TST 28-38).
Le virus purifié a été récupéré, dilué dans du tampon NTE (pH 8), puis concentré par centrifugation à 26000 rpm pendant 1 heure. Le culot a été resuspendu dans le tampon NTE, aliquoté et stocké à -80° C.
Le virus HIV-1 utilisé pour cette étude a un titre supérieur à 108 Ul/ml (UI : Unité Infectieuse) pour les cellules MT4 et un titre de 109 cpm ml en dosage de transcriptase inverse.
3) Les cellules SupTl (Smith et al. Cancer Research, 1984, , 5657:5660)
D. s'agit d'une lignée continue de cellules lymphoblastoïdes humaines. Ces cellules sont cultivées en milieu RMPI 1640 10 % SVF (Flow), 1 % PSN (pénicilline, streptomycine, néomycine (GIBCO), 1 % glutamine (GIBCO)).
4) Les anticor s
a) Anή-GP 110 (anti glycoprotéine d'enveloppe du VIH-1) :
Cet anticorps a été produit par Genetic System, il est utilisé au lOOème dans une solution de PBS, BSA 1 %, Azide 0,1 % (PBA).
b) Anti-souris biorinvlé :
Cet anticorps est commercialisé par la Société Amersham (Réf. RN 1001). π est utilisé et dilué au 25ème dans la solution PB A. La révélation de cet anticorps est obtenue par la streptavidine phycoér thrine (Becton Dickson).
B) METHODE D'ETUDE DE LA FIXATION DU VIRUS HIV-1 A SA
CELLULE-CIBLE
Cette méthode a été décrite par Mac Dougal et al, Journal of Immunology, 1986, 137. 2937:2944).
Les cellules SupTl (5.105 cellules) ont été lavées deux fois dans la solution PB A et incubées individuellement avec 10"6M de chaque produit PI, P2, P3, P4 et P5 respectivement (échantillons 11, 12, 13, 9a et 10a), pendant 30 min à 37° C, puis 1 μg de virus HTV-1 concentré a été ajouté et l'ensemble a été maintenu à 37° C pendant 30 min.
Les cellules ont été incubées avec l'anticorps anti-GPHO, puis avec l'anticorps anti- souris biotinylé et, finalement, avec la streptavidine phycoérythrine. Chaque incubation se fait à 4° C pendant 30 min et les cellules sont lavées deux fois avec la solution PB A, après chacune de ces étapes. Préalablement à l'analyse au cytofluorographe (Ortho), les cellules ont été resuspendues dans la solution PBA additionnée de 1 % de formol.
Pour ces expériences, plusieurs contrôles ont été réalisés :
* Contrôles positifs :
- Contrôle de la fixation du virus HTV-1 et du système de révélation : les cellules ont été incubées avec le virus HTV-1, puis, respectivement, avec l'anti-GPHO, l'anti- souris biotinylé et la streptavidine phycoérythrine (échantillons 1 et la).
- Contrôle du blocage de la fixation du virus HTV-1 avec l'anticorps OKT4a (Ortho Diagnostics) : les cellules ont été incubées avec l'anticorps OKT4a, puis, respectivement, avec le virus HIV-1, l'anti-GPHO, l'anti-souris biotinylé et la streptavidine phycoérythrine (échantillons 2 et 2a).
* Contrôle,, négatifs :
Les cellules ont été incubées avec du milieu, puis, respectivement, avec l'anti-GPHO, 1 'anti-souris biotinylé et la streptavidine phycoérythrine (échantillons 3 et 3a).
Les cellules ont été incubées avec chacun des produits individuellement, puis successivement avec du milieu, de l'anti-GPHO, de l'anti-souris biotinylé et de la streptavidine phycoérythrine (échantillons 4, 5, 6 et 4a, 5a).
- Contrôle de la présence de la molécule CD4 : les cellules ont été incubées avec l'anticorps OKT4a, puis un anti-souris fluorescent (échantillons 6a et 7).
- Contrôle de l'effet des substances sur la fixation de l'anticorps OKT4a sur la molécule CD4 (échantillons 8, 9, 10 et 7a, 8a).
C) RESULTATS
Le Tableau I présente les résultats de l'analyse au cytofluorographe des échantillons PI, P2 et P3. Dans nos conditions expérimentales, 53 % des cellules fixant le viras HIV-1 sont détectées (échantillon 1).
Lorsque la fixation du virus HIV-1 est bloquée par la préincubation des cellules avec l'anticorps anti-CD4 (OKT4a), seulement 1 % de cellules fluorescentes sont détectables (échantillon 2). Les produits PI, P2 etP3 ne modifient pas la fixation de l'anticorps OKT4a sur les cellules SupTl.
Le prétraitement des cellules avec les produits permet une diminution significative de la fixation du virus HIV- 1 avec les produits PI et P3 (respectivement échantillons 11 et 13) et un blocage total de la fixation avec le produit P2 (échantillon 12).
Le Tableau II montre les résultats obtenus avec les produits P4 et P5. Les différents témoins présentent les mêmes observations que celles précédemment décrites pour les produits PI, P2 et P3.
Les prétraitements des cellules avec les produits P4 et P5 montrent une diminution de la fixation du virus HTV-1 (échantillons 9 et 10), comparativement à la fixation du virus HIV-1 sur ces cellules non traitées (échantillon la).
in - CONCLUSIONS
Dans ces conditions expérimentales, cinq produits étudiés modifient la fixation du virus HIV-1 sur les cellules SupTl.
A la concentration de 10-6M, les produits ci-après conduisent au blocage de la fixation du virus dans les rapports suivants :
Formule % inhibition
Pl = H-Arg-Pro-Lys-Pro-OH 89
P2 = H-Arg-Pro-Lys-Pro-OCH3 96
P3 = CH3-(CH2)n-CO-Arg-Pro-Lys-Pro-OCH3 89
P4 = H-Arg-Pro-Lys-Pro-NH-(CH2)n-CH3 85
P5 = O CH^n-CO-Arg-Pro-Lys-Pro-OH 80
La présente invention couvre, également, les dérivés de ces substances et, en particulier, des dérivés non hydrolysables par modification, notamment, des liaisons peptidiques, si ces dérivés conservent une activité inhibitrice équivalente aux produits d'origine.
TABLEAU I
Analyse au cytofluographe des échantillons PI, P2 et P3
Nomenclature Pourcentag
ECHANTILLONS utilisée de cellules fluorescent
* Témoins positifs
= Cellules puis virus HTV-1 puis anti-GPHO puis anti¬ 53 % souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine
= Cellules puis OKT4 puis virus HIV-1 puis anti-GPHO 1 % puis anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine
* Témoins négatifs :
= Cellules puis milieu puis anti-GPHO puis anti- -souris 2 % biotinylé puis streptavidine phycoérythrine
= Cellules puis produit puis milieu puis anti-GPHO puis anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine
Produit PI 4 1 %
Produit P2 5 1 %
Produit P3 6 1 %
* Contrôle de la molécule çp4 :
= Cellules puis anticorps OKT4a puis anti-souris 99 % fluorescent
= Cellules puis produit puis anticorps OKT4a puis anti¬ souris fluorescent
Analyse au cytofluographe des échantillons P4 et P5
Nomenclature Pourcentag ECHANTILLONS utilisée de cellules fluorescente
* Témoins positifs :
= Cellules puis virus HTV-1 puis anti-GPUO puis anti- la 53,41 % souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine
= Cellules puis OKT4 puis virus HIV- 1 puis anti-GPl 10 2a 8,57 % puis anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine
* Témoins négatifs :
= Cellules puis milieu puis anti-GPUO puis anti-souris 3a 10,47 % biotinylé puis streptavidine phycoérythrine
= Cellules puis produit puis milieu puis anti-GPUO puis anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine
Produit P4 4a NT*
Produit P5 5a NT*
* Contrôle de la molécule CD4 :
= Cellules puis anticorps OKT4a puis anti-souris 6a 95,5 % fluorescent
= Cellules puis produit puis anticorps OKT4a puis anti¬ souris fluorescent
Produit P4 7a 89,28 %
Produit P5 8a 92,20 %
* Expérience :
= Cellules puis produit puis virus HIV-1 puis anti-GPl 10 puis anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine
Produit P4 9a 19,43 %
Produit P5 10a 15,15 %
NT* : non testés
Claims
1. Utilisation nouvelle de substances de formule générale
A-Arg-Pro-Lys-Pro-R
- dans laquelle A désigne un groupe choisi parmi :
Boc-, H-, CH3CO-,
C^CH^m-CO- avec m = 2, 4, 6, 10.
- dans laquelle R représente un groupe choisi parmi :
-OH, -OCH3,
-NH-.CH^n-CHs avec n = 3, 5, 7, 11.
pour l'inhibition de la fixation du virus HIV-1 sur des cellules cibles humaines.
2. L'invention est caractérisée par des substances selon la revendication 1, destinées à entrer dans la fabrication d'un médicament inhibant la fixation du virus HIV-1. Ces substances sont caractérisées par la séquence peptidique et/ ou pseudo-peptidique : Arg-Pro-Lys-Pro.
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|---|---|---|---|
| FR9109941A FR2680174A1 (fr) | 1991-08-05 | 1991-08-05 | Nouveaux composes peptidiques, inhibiteurs de l'adsorption du virus hiv sur ses cellules cibles. |
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- 1991-08-05 FR FR9109941A patent/FR2680174A1/fr active Pending
-
1992
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| FR2680174A1 (fr) | 1993-02-12 |
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