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WO1993006134A1 - Facteurs de la regulation fonctionnelle cellulaire et leurs applications biologiques - Google Patents

Facteurs de la regulation fonctionnelle cellulaire et leurs applications biologiques Download PDF

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Publication number
WO1993006134A1
WO1993006134A1 PCT/FR1992/000867 FR9200867W WO9306134A1 WO 1993006134 A1 WO1993006134 A1 WO 1993006134A1 FR 9200867 W FR9200867 W FR 9200867W WO 9306134 A1 WO9306134 A1 WO 9306134A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
proteins
cell
hepatocytes
protein
Prior art date
Application number
PCT/FR1992/000867
Other languages
English (en)
Inventor
Christiane Guillouzo
Anne Corlu
Bernard Kneip
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Priority to US08/204,417 priority Critical patent/US5859192A/en
Priority to EP92921013A priority patent/EP0604584A1/fr
Priority to JP5505833A priority patent/JPH06510994A/ja
Publication of WO1993006134A1 publication Critical patent/WO1993006134A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the invention is proteins capable in particular of constituting functional regulation factors of the cell and their biological applications.
  • Cell-cell interactions are of major importance in the development and organization of multicellular organisms, as well as in their physiology and pathology. It is generally accepted that these interactions are effected by the effect of circulating soluble factors, but also by the intermediary of cellular adhesion molecules (CAM), of molecules of adhesion to the matrix support and of molecules constituting functional structures. between cells.
  • CAM cellular adhesion molecules
  • the invention further relates to the biological applications of these proteins, in particular as factors of functional regulation and as markers of cell differentiation.
  • the proteins of the invention are characterized in that they comprise or consist of an amino acid sequence capable of reacting specifically with a monoclonal antibody as obtained by immunization of an animal with rat epithelial cells. hepatic origin, followed by the fusion and cloning steps carried out according to conventional techniques, in particular the monoclonal antibody secreted by the hybridoma strain deposited at the DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) on June 19, 1991 ° DSM ACC 2011.
  • DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
  • proteins are capable of playing a critical role in cellular communication, and in particular in the specific recognition and interaction of different cell populations and lead to the active transcription of certain genes and the expression of functions characteristic of a given tissue. They constitute communication proteins between cells of a given type and contiguous or contiguous heterologous cells. They indeed prove capable of ensuring the transmission of a signal or signals of one cell type to another cell type which may be contiguous or proximal. Concerning tissue distribution, in the adult state, the proteins of the invention are expressed in particular in the liver, exocrine pancreas, testes, ovaries and hematopoietic tissues.
  • the proteins according to the invention are further characterized in that they are expressed in particular by hepatocytes, epithelial cells of the bile ductules, endothelial cells, Ito cells and macrophages. They are also characterized in that, in the testes, they are expressed in the seminiferous tubes by Sertoli cells (so-called nourishing cells) and spermatocytes at a precise stage of maturation, end leptotene and zygotene.
  • CEFR hepatocytes and epithelial cells of rat liver
  • the proteins of the invention are also characterized in that they are expressed in hematopoietic tissues (bone marrow, thymus, lymph nodes and spleen) and in blood, (by monocytes, granulocytes, erythrocytes and lymphocytes).
  • liver epithelial cells have shown the involvement of proteins in the proliferation and maturation of these hematopoietic cells.
  • the direct involvement of the proteins was further confirmed by the discovery of the proteins of the invention in cells making up the stromal tissue of the bone marrow and by obtaining a maturation of the hepatocytes when they are put in co-culture with stromal cells.
  • the proteins of the invention constitute membrane glycoproteins. These proteins are more specifically characterized in that they are formed from an amino acid sequence having a molecular weight (MW) of about 85,000 daltons, as measured by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.
  • This sequence comprises one or more of the following sequences, namely: -PQDMSGFQK, INP- (T) -DES, GLQMK,
  • the proteins of the invention demonstrated in the hepatocyte co-cultures are membrane proteins having a pi of approximately 4.9 to 5.1 by analysis on two-dimensional gel.
  • these proteins are presented in a form having a MW of approximately 73,000 daltons, having the epitope recognized by the monoclonal antibody (or abbreviated mAb) defined above, corresponding to truncated membrane proteins.
  • These proteins have in particular a pi of the order of 5.2.
  • the PM of the protein sequences can vary appreciably from one species to another, or even from one tissue to another and from one cell type to another. They also have a specific region or domain of a cell type for a given tissue, of a given species.
  • these proteins of the invention are further characterized in that they consist of a single protein chain.
  • the immunoreaction of the proteins of the invention with the monoclonal antibody results in a loss of the adult hepatocyte phenotype, and as in pure cultures, in a survival reduced to 5 to 6 About a few days, a rapid decrease in the secretion of serum albumin with a rate of less than about 50% of normal production, accompanied by a decrease in the level of the corresponding m-RNA and of the m-RNA of other specific liver genes.
  • the hepatocytes of co-cultures treated with the monoclonal antibody in question synthesize procollagen I ⁇ i which does not polymerize.
  • the proteins in question are characterized in that they are glycoproteins.
  • the proteins of the invention are characterized in that they are constituted as such, by the active part of the proteins defined above, that is to say the part responsible for the communication between the cells of a given type and the adjacent or proximal heterologous cells.
  • the invention relates in particular to the glycosylated part of the proteins defined in the above.
  • the proteins active with respect to cell-cell regulation are recombinant proteins and contain at least the active part mentioned above.
  • the proteins of the invention are analogues of the proteins defined above, that is to say that their amino acid sequence may differ from that of the active reference protein sequence by one or more amino acids deleted and / or replaced and / or substituted, provided that these changes do not alter the properties defined above.
  • protein as used in the description and the claims denotes both proteins as obtained by synthesis, as proteins in native form or in recombinant form, the active parts of these proteins. , and their analogs as defined above.
  • the invention also relates to a process for obtaining the proteins defined above.
  • This method comprises contacting an extract of liver membranes with a monoclonal antibody capable of specifically recognizing a surface protein of rat liver epithelial cells, or a Fab fragment having such a property.
  • the liver membranes are advantageously solubilized with an agent having the effect of lyzing them, in particular a detergent agent such as Triton X100.
  • the monoclonal antibody, or the Fab fragments is advantageously coupled to a support, more especially a support which can be used in a column such as Sepharose 4B.
  • the proteins sought selectively bind to the antibody by immunoreaction and are then eluted. To this end, an increase in the pH of the buffer is advantageous.
  • the eluate collected containing a given protein is brought into contact with a selective adsorbent making it possible to eliminate proteins of molecular weights identical to that of the desired protein but with different isoelectric points, then the protein is desorbed at 1 using an appropriate buffer and it is recovered from the eluate.
  • the proteins of the invention can also be purified using a polyclonal antibody conventionally induced by immunization of an animal.
  • polyclonal antibodies directed against the proteins of the invention in native or recombinant form, or their active part, or their analogs as defined above also come within the scope of the invention.
  • any tissue, other than the liver membranes, giving rise to an immunological reaction with antibodies as defined above can be used to obtain the proteins of the invention. Note that recognition by the antibody is not species specific.
  • the monoclonal antibody used as a protein identification tool is as obtained by secretion from strains of hybridomas resulting from the fusion of an immortal non-secreting myeloma cell with a cell producing antibodies directed against a protein. of rat liver epithelial cells.
  • the step of merging the two cell types is in particular carried out according to the most commonly used technique, namely that of Kohler and Milstein, Nature, vol. 256, p. 495, 1975.
  • Antibody producing cells are splenocytes. These cells are recovered after in vivo immunization of the animal with a cell suspension of live CEFRs.
  • Immortal cells are non-secreting myeloma cells, which makes it possible to obtain hybridomas secreting only the immunoglobulin of the specificity of the producer cell.
  • SP2 / 0-Ag myeloma cells are conventionally used.
  • the hybridomas obtained are cultured and cloned according to the limiting dilution method.
  • hybridomas are selected whose culture supernatants produce immunoglobulins, using a standard immunofluorescence test.
  • a second level of selection is carried out among the positive clones retained at the end of the preceding step, by only retaining the clones capable of recognizing a protein of the plasma membrane by giving rise to a reaction of the antigen-antibody type but not not reacting with two types of non-hepatic cells, namely corneal endothelial cells and human skin fibroblasts.
  • the recovered monoclonal antibodies can be used as such or are purified, for example on an affinity column, and stored by freezing, or optionally lyophilized.
  • the invention relates especially to the L8 monoclonal antibody, the mode of production of which is reported in the examples.
  • strains of hybridomas producing monoclonal antibodies defined above, as well as their method of obtaining, comprising the steps of fusion and selection defined above in relation to the monoclonal antibodies also come within the scope of the invention.
  • the proteins recognized by the monoclonal antibodies in the method of the invention correspond to recombinant proteins comprising or formed partially or completely by the active part with respect to cell-cell regulation.
  • these proteins are produced in hosts, transformed by the introduction of expression or cloning vectors, in particular of plasmids, containing the gene fragments coding for the acid sequences. amines sought.
  • fragments are introduced by ligation into an appropriate site of the chosen vector.
  • suitable hosts for carrying out the invention include bacteria, yeasts or even arthropod, vertebrate or plant cells.
  • the expressed proteins are recovered from the culture medium, after lysis of the bacteria, and purified.
  • the proteins of the invention are formed by the active part as already defined, or by the sequences given above, or are analogs of these proteins, of these sequences, or of their active part. These proteins are obtained by genetic recombination or peptide synthesis according to conventional techniques.
  • transformed cell hosts expression vectors such as plasmids, and DNA fragments as mentioned above are within the scope of the invention.
  • the proteins of the invention are obtained by synthesis.
  • a determined peptide chain is formed using a synthesizer.
  • the proteins of the invention are of great interest as a factor for functional regulation of target cells in a given tissue.
  • the invention relates in particular to their use in cell cultures with a view to ensuring the restoration and maintenance of the functional activity of a given type of cells.
  • the cultures are advantageously carried out under the usual conditions and the protein is added to the medium.
  • the proteins of the invention play a major role in the hepatocyte functioning in culture.
  • the invention therefore more specifically relates to a method of culturing hepatocytes, in particular human hepatocytes, comprising the use of a protein as defined above to replace the CEFR used in the method of the patent already mentioned.
  • proteins of the invention are used to restore or maintain the functioning, for example, of hematopoietic cells in culture.
  • they can be used to promote the proliferation of hematopoietic cells so as to constitute an additional treatment for aplastic patients, who have lost, after chemotherapy or radiotherapy, their progenitors or a large part of their hematopoietic cells.
  • bone marrow cells or hematopoietic cells are taken from the patient or from compatible donors, and they are cultured with proteins of the invention or cells which express them. The cells produced are then injected into the patient.
  • the invention further relates to a kit comprising the protein as defined above and the reagents or part of the reagents necessary for carrying out a given cell culture.
  • the kit also advantageously contains the cells concerned.
  • the proteins of the invention can also be used as cell markers.
  • the proteins of the invention advantageously constitute markers of cell differentiation, of cell polarity or of cell distribution.
  • the detection of the proteins of the invention is advantageously carried out using polyclonal or monoclonal antibodies, developed according to conventional techniques, capable of specifically recognizing these proteins.
  • these antibodies are antibodies directed against at least part of the region or domain of the amino acid sequence specific for a cell type of a given tissue, of a given species.
  • these antibodies are characterized in that they are capable of recognizing, by giving rise to a reaction of the antigen-antibody type, at least one of the fragments given above, of sequences: LPQDMSGFQK, INP- (T) -DES, GLQMK, DMVEF- (R)
  • the proteins of the invention make it possible to characterize a given stage of differentiation.
  • the proteins of the invention constitute markers of germ cells at a precise stage of differentiation at the adult stage, but also during development.
  • tests carried out on cultures of testis cells have shown that the proteins of the invention are expressed in the seminiferous tubes by Sertoli feeder cells and spermatocytes at a very precise stage of maturation (see article RA Hess in Biology of reproduction 43,525-542, 1990).
  • the antibodies directed against these proteins advantageously formed, according to conventional techniques against a purified protein of human origin, and more particularly against the specific region of this protein, for this type of tissue, constitute particularly valuable tools for diagnosing high accuracy, or cell selections.
  • the proteins of the invention are also present in the oocytes and the follicular cells which surround them only in the mature follicles recognizable by the formation of the atrium.
  • the use of antibodies directed against these proteins allows the recognition of mature oocytes which are the only fertilizable.
  • the invention therefore relates to the application of these antibodies as bioreactives for the in vitro diagnosis in a biological sample of the presence of male germ cells or female germ cells at precise stages of maturation as indicated above, with a view to their characterization and / or their selection.
  • the antibodies are free.
  • the proteins of the invention constitute markers of blood cells.
  • the invention therefore also relates to the antibodies directed against the specific proteins of the various blood cells.
  • the method according to the invention for in vitro diagnosis of the presence of proteins as defined above in a biological sample or of cells is characterized in that it comprises the following steps:
  • the sample to be analyzed or the cells is brought into contact with a preparation of an antibody, or of a Fab fragment, as defined above, immobilized on a solid support, under conditions suitable for the production of an antigen-antibody complex with said proteins, when they are present in the sample, then the formation of such an antigen-antibody type complex is demonstrated by operating advantageously according to the usual techniques.
  • Cytofluorometry techniques are used, for example.
  • This detection method makes it possible to reveal with great sensitivity and quickly the presence of these membrane proteins in the sample tested.
  • proteins therefore constitute, for example, markers of differentiation, on the one hand, of Sertoli cells and spermatocytes at a given stage, on the other hand, of oocytes also at a precise stage of maturation, to localize them, or even to collect them selectively. and quantify them.
  • the above method is also applicable for selecting from cell populations those of cells which express the proteins of the invention.
  • the invention also relates to a kit for the demonstration of said proteins for the purpose of in vitro diagnosis of their presence in a biological sample or for carrying out cell selection.
  • an appropriate solid phase serving as a support for the assay such as a micro-titration plate
  • the recognition of native proteins by antibodies against these proteins authorizes the use of these antibodies as a contraceptive vaccine.
  • Administration of these antibodies to mice can lead to inhibition of fertility during treatment.
  • the invention therefore also relates to a contraceptive vaccine characterized in that it contains, in association with an inert vehicle, an antibody directed against proteins, or parts of proteins of mature oocytes or spermatocytes as defined above, more particularly against at least part of the region of these tissue specific proteins.
  • the following description includes examples in which the results obtained are reported with hepatocytes as the cell type.
  • FIGS. 1 to 11 represent:
  • FIG. 1 of micrographs of co-cultures (B, C), or of pure cultures (A), of hepatocytes treated (A, C) or not (B) with mAb L8,
  • FIG. 2 represents albumin production as a function of the duration of a co-culture (in days), in the presence of increasing concentrations of AcM L8,
  • FIG. 3A is an immunolocalization on a section of the liver of an adult rat and FIGS. 3B and 3C are micrographs showing the immunolocalization of the AcM L8-protein complex in hepatocyte cultures,
  • FIG. 5 represents micrographs of cocultures with deposit of matrix fibers, treated (B, D) or not (A, C) with mAb L8, then stained with reticulin (impregnation with silver),
  • FIG. 6A represents immunoprecipitates of proteins of the invention with mAb L8 from corneal endothelial cells (1), hepatic epithelial cells (2) and hepatocytes (3), under non-reducing conditions;
  • FIG. 6B the same immunoprecipitates under reducing conditions;
  • FIG. 6C represents a two-dimensional electrophoresis revealing the pHI of the proteins and
  • FIG. 6D shows an immunoprecipitation after extraction of the proteins with Triton X114, and - Figure 7 shows sections of adult rat tissue, after reaction with mAb L8, A / and B / ovarian follicle, C / small intestine D of seminiferous tubes.
  • FIG. 8 measurements by cytofluorimetry on hematopoietic cells
  • FIG. 9 the results of electrophoresis with the thymus, CEFR, bone marrow and erythrocytes, with indication of the molecular weight PM,
  • Laminin-entactin complex, laminin, heparan sulphate and IV collagen extracts of the tumor, of mouse sarcoma (Engelbreth-Holm-Swarm) (1) operating according to (2) with the modifications given in (3).
  • Hybridization probes for the analysis of m-RNA pRSA8 for the albumin gene (4), A4C9 for the aldolase B gene (5) and the procollagen la ⁇ (6).
  • Anti-cytokeratin 18 antibodies anti CK 49 of known specificity (7).
  • Peroxidase-labeled anti-mouse IgM antibodies Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, The Netherlands.
  • anti mouse Ig labeled with isothiocyana and fluorescein Diagnostic Pasteur, Marnes-la-Coquette, France.
  • Tsol-chili cells t * ⁇ culture isolation of hepatocytes; preparation of pure cultures or co-cultures.
  • Normal adult hepatocytes are obtained by infusion of rat liver (Sprague-Dawley; 150-200 grams) with a 0.025% collagenase solution buffered with 0.1M Hepes, (4- (21 - hydroxyethyl) acid - l-piperazine ethane sulfonic) (pH 7.4).
  • the procedure is carried out according to the Seglen method described in (11) using the modifications reported by Guguen et al., In (12).
  • the hepatocytes are seeded in culture flasks in a mixture formed from 75% of MEM medium and 25% of medium 199, supplemented with 10% of fetal calf serum and containing per ml: penicillin (100 IU), streptomycin sulfate (100 ⁇ g), beef insulin (5 ⁇ g) and beef serum albumin or BSA (1 mg).
  • penicillin 100 IU
  • streptomycin sulfate 100 ⁇ g
  • beef insulin 5 ⁇ g
  • beef serum albumin or BSA beef serum albumin
  • the co-cultures are prepared according to the conditions described in (13).
  • the medium is removed and the non-transformed CEFRs, or other cell types, suspended in fresh medium, are added. 24 h later, the medium is supplemented with 7 x 10 ⁇ 5M of hydrocortisone hemisuccinate and then renewed each day.
  • the hepatocytes from the cocultures are selectively separated from the CEFRs by incubation for 10 min with a collagenase solution. free of calcium (0.05%, pH 7.6) buffered with 0.1 M Hepes
  • fibroblasts Cultures of fibroblasts, myofibroblasts and endothelial cells.
  • the 3T3 mouse fibroblasts, ox corneal endothelial cells, human skin fibroblasts and rat liver myofibroblasts are maintained in the medium supplemented with the serum mentioned above, without insulin, corticosteroids or albumin. . Culture of epithelial cells.
  • CEFR cells are isolated by treating livers from normal 10-day rats with trypsin (14) and (15). Groundhog liver epithelial cells
  • CEFM marmots imported from the U.S.A.
  • CEFR, CEFM and beef lens epithelial cells are cultured in William's E medium supplemented with 10% fetal calf serum.
  • Balb / c mice are immunized with a cell suspension of 10? CEFR alive. The splenocytes are recovered. Five different fusions are performed with SP2 / 0-Ag myeloma cells. Culture supernatants producing immunoglobulins are selected with regard to the positive response given to the indirect immunofluorescence test with CEFR cells and hepatocytes. Out of 400 positive hybridoma cultures,
  • the strain producing mAbs capable of significantly reducing the survival of hepatocytes in coculture is isolated, but having no effect on the viability of cells in pure culture. These mAbs are called L8. As indicated above, this hybridoma strain was deposited at the D.S.M. June 19, 1991 under DSM ACC 2011.
  • Figure 1 shows the photos of:
  • A pure cultures of 2-day hepatocytes treated with a supernatant of hybridomas producing L8;
  • C 5-day hepatocyte co-cultures, treated with a supernatant of hybridomas producing L8. 500 .mu.l 'of AcML ⁇ are added to the culture medium at the start of the culture, then every day at each renewal of the medium.
  • the typical polygonal shape of the hepatocytes maintained in co-culture is lost in presence of L8 mAb and most of the hepatocytes died on the 5th or 6th day, while the CEFRs were not affected.
  • the ability of cells to secrete albumin is studied in cultures treated daily with L8 mAb.
  • the albumin secretion rate is quantified in the culture media for 5 or 6 days by laser immunonephelometry by operating according to (18).
  • MAb is added at different concentrations.
  • the serum albumin level is measured in the medium taken each day.
  • FIG. 2 shows the results obtained with the pure cultures (—Q— ⁇ ), the control co-cultures (- V ⁇ r—) maintained without the addition of mAb L8, and co-cultures to which 2 have been added. , 5 (-),
  • AcM L8 is characterized as being of IgM class according to the Ouchterlony technique.
  • the L8 mAb is added at the start of cell seeding, then the treatment is stopped 1, 2, 3, or 4 days later.
  • CEFR their growth and obtaining a confluence with hepatocyte colonies.
  • the pure hepatocyte cultures and the cocultures are fixed in a 4% paraformaldehyde solution buffered with 0.1 M sodium cacodylate (pH 7.4) for 30 min at 4 ° C.
  • the mAbs are localized using indirect staining with immunoperoxidase or the indirect immunofluorescence technique.
  • the incubations are carried out in the presence of 0.1 or 0.2% saponin.
  • a second antibody consists of an anti-
  • Fluorescein isothiocyanate The immunopositive reaction with mAb L8 is uniformly localized in the plasma membrane of freshly solved hepatocytes and pure cultures of hepatocytes and this, only in the first 4 days then disappears.
  • mAb L8 immunoreacts with the plasma membranes of hepatocytes in coculture for two weeks. The reaction then slowly decreases over time.
  • FIG. 3B A photo on a 3-day co-culture is reported in FIG. 3B showing, using the munofluorescence technique, the location of the protein on the plasma membrane and its uniform distribution around the cells. It appears strongly expressed by hepatocytes and weakly by CEFRs.
  • the cells are then fixed with 2.5% of glutaraldehyde, then incubated for 30 min with a solution containing 1% of osmium in a 0.1 M cacodylate buffer. The cells are then dehydrated in pure ethanol and included in Epon R.
  • FIG. 3C shows an electron micrograph of a 3-day co-culture.
  • the protein molecule is detected by an immunoperoxidase reaction. Dense deposits of electrons are observed, uniformly distributed on the cell surface of hepatocytes and CEFRs. No intracellular staining is visible.
  • FIG. 3A shows the distribution of the protein on a section of adult rat liver. It appears uniformly distributed in the lobule and located essentially at the sinusoidal pole of the cells. vi Reaction of different cell types with RA hepatocytes in CO-CUlture and immnnréartivitP with mAb L8.
  • mice, marmots, dogs, baboons and humans are all capable of reacting with CEFRs and of maintaining high functional stability in co-culture. All of these results show that the cells which give rise to an antigen-antibody type reaction with mAb L8 are capable of reacting with hepatocytes in coculture, giving rise to the establishment of intercellular communications allowing the maintenance the differentiated state of hepatocytes.
  • the levels of albumin (a), procollagen I ⁇ l (b) and aldolase B (c) of freshly isolated hepatocytes (0) and of hepatocytes maintained in co-cultures 2 or 5 are analyzed.
  • the pure cultures were analyzed at 2.4 and 6 days.
  • A corresponds to co-cultures
  • B to pure cultures of hepatocytes, 2, 4 and 6 days after sowing.
  • Equal amounts of total RNA (20 ⁇ g) from these different sources are used.
  • Total RNA is obtained using the technique of Chirgwin et al. (19) with 5 M guanidium thiocyanate / CsCl.
  • Total RNA (20 ⁇ g) is resolved by electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter.
  • the filter is prehybridized in a conventional manner and hybridized with a nick-translated DNA probe 3 x 10 ⁇ cpm / ml of 32p for 18 h at
  • Hybridization is carried out with an excess of cDNA probes corresponding to (A), (B) and (C).
  • the results are reported in FIG. 4.
  • the levels of albumin and aldolase B mRNA increase strongly from the second to the fifth day in the untreated co-cultures whereas these levels decrease sharply in the presence of the mAb L8 on the fifth day.
  • increasing amounts of procollagen I ⁇ are observed in the presence of the L8 mAb.
  • pure cultures of hepatocytes are extended up to eight days in the presence of 25 mM of nicotinamide and continuously exposed to mAb L8.
  • the in vitro translation products were analyzed for hepatocytes untreated or treated daily with L8 mAb and maintained in culture. pure or in co-culture.
  • 5 ⁇ g of total RNA from pure cultures and co-cultures, untreated or treated each day with 10 ⁇ g / ml of partially purified L8 mAb (1, 3 and 5 days) are translated in vitro using rabbit reticulocyte lysates (20) containing 50 ⁇ Ci of [35s] -methionine. The translation is carried out for 2 h at 30 ° C.
  • the material which can be precipitated with trichloroacetic acid (4 ⁇ 10 5 cpm) is developed on SDS-PAGE and autoradiographed. It is found that the profile of the proteins synthesized by the pure cultures is similar during the culture period, whether or not there is the presence of the L8 mAb. On the other hand, the treatment of cocultures with mAb L8 for 3 days specifically induces significant changes in the level of synthesis of the various proteins.
  • Cytoskeleton II has already been established that the cell form and the cytoskeleton are closely associated with the differentiated phenotype of hepatocytes.
  • the examination carried out focused on cell-cell contacts with CEFRs to check whether they induce early or late changes in the cytoskeleton.
  • Cytokeratins CK8 and CK18 which form the intermediate-sized filaments of the hepatocyte cytoskeleton, were analyzed.
  • the immunolocalization of the protein CK18 is carried out in pure cultures and in co-cultures in the presence or absence of the L8 mAb.
  • the cytokeratin filaments form a complex network uniformly distributed in the cytoplasm of hepatocytes in pure cultures while they are mainly located at the cell periphery just below the plasma membrane in coculture. It was found that the daily addition of mAb L8 from the start of the coculture strongly disturbs the reorganization of these components of the cytoskeleton. . Deposition of the extracellular matrix
  • the reticulin staining by silver impregnation of the extracellular matrix is carried out according to the method of Gordon et al. described in (20) in co-cultures fixed with a mixture of 4% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in cacodylate buffer (pH 7.4) for 15 min at 4 ° C.
  • FIGS. 5A and 5B report the micrographs obtained with co-cultures established by adding the CEFRs 4 hours after having seeded the hepatocytes to obtain a monolayer of cells.
  • the coloring is carried out on co-cultures of
  • the extracellular matrix is first located between the two cell populations. This frame or network gradually covers the colonies of hepatocytes within a week.
  • the results given above having shown that the activity of the protein of the invention is inhibited by the monoclonal antibody recognizing it specifically during the establishment of contacts between the two cell populations, experiments were carried out to study the effect of this antibody on the attachment of hepatocytes to CEFR.
  • FIGS. 5C and 5D The micrographs obtained with these co-cultures are reported in FIGS. 5C and 5D. Plates of 3.5 cm in diameter covered by a confluent monolayer of CEFR are preincubated with 2 ⁇ l of ascitic fluid of SP2 / 0-Ag (C) or L8 (D) per ml of medium devoid of serum for 1 hour. The freshly isolated hepatocytes (106 cells) are then inoculated and maintained at 37 ° C. in the same medium containing SP2 / 0-Ag or the mAb L8.
  • the media of the flasks are harvested in duplicate after 2, 3, 4, 7 and 22 h and the number of unattached hepatocytes is estimated by measuring the lactate dehydrogenase activity after lysis of the cells with PBS containing 0.2% of Triton X-100.
  • EHS gel, fibronectin, collagen IV, laminin, laminin-entactin complex, heparan sulfate are examined.
  • 3% BSA is added to a (final concentration of 1.5%) for another 30 min.
  • the medium is eliminated and the hepatocytes previously incubated for 30 min in a medium devoid of serum containing increasing amounts of mAb L8 or of ascites fluid SP2 / 0-Ag and 0.02% of BSA are, inoculated.
  • the cultures are washed twice with PBS. The number of attached and non-attached hepatocytes is measured as described above.
  • the seeding of hepatocytes in a medium containing increasing concentrations of mAb L8 or in ascitic fluid SP2 / 0-Ag does not prevent or delay the attachment to plastic substrates, fibronectin, laminin, laminin-antactin complex -IV collagen, heparan-sulfate-proteoglycan. Pre-incubation of cells with L8 mAb does not affect these results.
  • Immunoprecipitation is performed on cell lysates after iodination of the cell surface of hepatocytes and CEFRs (21).
  • the cells are labeled with Na [125i] by catalyzed reaction to lactoperoxidase.
  • the lysates from the different sources are precipitated with the ascites fluid obtained with the hybridomas secreting the mAb L8.
  • a 90 min incubation is carried out with 3 ⁇ l of ascites fluid.
  • the ascites fluid is treated with protein A-Sepharose before use.
  • the samples are then incubated with IgM made in anti-mouse goats, then protein A-Sepharose.
  • the marbles affinity are washed with the lysis buffer and the fixed material is eluted with 100 ⁇ l of buffer sample according to Laemmli (22) to determine the molecular weight, or with 100 ⁇ l of lysis buffer according to O'Farell (23) determine the pi.
  • SDS-PAGE electrophoresis is carried out in polyacrylamide gel forming a linear gradient of 4 to 15% or 7.5 to 15% in the Laemmli buffer system mentioned above.
  • the measurement of the isoelectrofocus is carried out with Ampholines of pH 3 to 10 in the O'Farell buffer system mentioned above.
  • FIG. 6A gives the results obtained by SDS-PAGE analysis under reducing conditions with immunoprecipitates of lysates of endothelial cells from beef cornea (lane 1), hepatocytes (lane 2) and
  • Hepatocytes are extracted with Triton X-114 and a phase of operation at 30 C C as described in (24). The results obtained are shown in Figure 6D.
  • the two polypeptides are essentially recovered from the hydrophobic phase (lane 1), which is related to their membrane nature. They cannot be extracted from the plasma membrane after treatment with PBS or EDTA.
  • the aqueous phase (lane 2), the hydrophobic phase (lane 3) and the aqueous phase (lane 4) are immunoprecipitated with mAb L8.
  • FIGS. 7A and 7B show photos of rat ovarian follicles with weak (A) and strong (B) respectively after reaction with the L8 mAb.
  • FIG. 7C a photo of a section of the small intestine is shown showing intestinal villi. No reaction with mAb L8 is observed. Only the red cells appear colored. . Rat testis.
  • Figure 7D shows a photo of a section of rat testis showing several seminiferous tubes.
  • mAb L8 a photo of a section of rat testis showing several seminiferous tubes.
  • the cultures are washed 3 times with PBS, then the cells are detached from the Petri dish, centrifuged at 6,500 rpm for 10 seconds and solubilized either in 1% Triton X-100, SDS 0.01 %, 2 mM EDTA, 130 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) or in 1% Triton X-114, 130 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7 , 4), by passing five times through a G26 needle with a syringe and maintained for 30 min at 4 ° C.
  • protease inhibitors are added to all of the buffers, namely aprotinin (100 IU / ml) and phenylmethylsulfoxide (2mM).
  • the cell lysates are centrifuged for 10 min at 13,000 rpm.
  • the soluble material is extracted into Triton X-114, it is subjected to a phase separation, then the two phases are adjusted by adding either Triton X-114 or the buffer in order to obtain the same contents of salts and surfactants in different samples.
  • the protein is purified from a crude preparation of adult rat liver membranes. These membranes are lysed in the presence of Triton X-100 (1%) and SDS (0.1%). The lysate is centrifuged for 30 min. at 20,000 g. The supernatant is deposited on a sepharose-4 B affinity column activated with CNBr and coupled to the monoclonal antibody L8 (AcML8). After washing, the protein is eluted with 0.05 M diethylamine pH 11.5, 0.1% Triton X-100. The preparation is then subjected to anion exchange chromatography using a DEAE-cellulose column, then eluted with a NaCl gradient of 0 to 1 M.
  • the elution peak is located at 0.15 - 0, 2 M NaCl.
  • the eluate is precipitated with 10% TCA and analyzed in 8.5% SDS polyacrylamide gel.
  • the protein is revealed by amido black staining. It appears in the form of two bands of 85,000 and 73,000 Da.
  • the 85,000 Da gel strip is cut and dried.
  • the gel is rehydrated and then incubated in 150 ⁇ l of buffer containing 0.6 ⁇ g of pork trypsin, for 4 h 30 at 37 ° C.
  • the peptides formed are extracted from the gel by incubation for 20 min at 37 ° C. in 2 x 100 ⁇ l of 60% acetonitrile. They are separated on a C18 - HPLC column, then eluted. Six peaks could thus be collected, four corresponding to pure peptides; they were sequenced automatically using Edman's reaction.
  • the thymus, spleen and lymph nodes of rats are isolated and cut into small fragments in RPMI 1640 culture medium.
  • the isolated hematopoietic cells are released into the culture medium and collected.
  • Bone marrow cells are obtained from rat femurs by washing the internal cavity with culture medium.
  • Peripheral blood cells are collected on heparin.
  • the erythrocytes are lysed in an 8.3 g / l ammonium chloride solution and the remaining leukocytes are washed in PBS.
  • the erythrocytes are isolated by centrifuging heparin blood at 1000 g for 10 min. The collected pellet is washed three times.
  • cytofluorimetry For the cytofluorimetry analysis, samples of 0.5 or 1 ⁇ 10 6 cells are incubated with the antibody for 1 h at 4 ° C. After washing, the cells are incubated with the 2nd antibody coupled to fluorescein for 30 min. The cells are then fixed with 1% formaldehyde and analyzed with a FACS 440 laser cytofluorimeter. All the hemapoietic cells coming from all the hemapoietic organs are positive with the antibody mAb L8 by cytofluorimetry, namely the mononuclear cells, the granulocytes and the erythrocytes. This is illustrated in Figure 8.
  • erythrocytes and thymocytes which essentially correspond to T lymphocytes
  • erythrocytes only have a band of 85,000 Da
  • thymocytes have two bands of 85,000 and 73,000 Da.
  • Rat bone marrow cells are collected from femurs by scraping from the internal cavity. The culture of these cells is carried out at 37 ° C. in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum, and 5 ⁇ g / ml insulin. Only the stromal cells adhere in 18 h, the other cells are eliminated. Generally, the long-term culture of stromal cells is initiated from 10 x 10 6 cells freshly isolated from marrow, placed in 5 ml of medium and in 25 cm 2 flasks. After 4 to 5 days, the cells profited. Demonstration of the protein in marrow stromal cells was obtained from these cultures by indirect immunolocation.
  • hematopoietic cells attached to the layer of stromal cells, adipocytes and fibroendothelial cells (Fig. 10 A and 10 B ( Figure 10 A representing a view of the bone marrow cells in phase contrast and Figure 10 B immunolocation mAb L8 in bone marrow cells).
  • the hepatocytes isolated from rat liver by enzymatic perfusion are seeded on a monolayer already made up of marrow stromal cells. In 2-4 h the hepatocytes adhere, aggregate with each other, forming colonies of parenchymal cells with perfectly recognizable morphological characteristics, can be kept alive for about three weeks and actively secrete albumin. This confirms that the coculture signal mediated by the LRP protein is common to the 2 tissue categories: liver and bone marrow (Fig. 11).

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Abstract

L'invention concerne des protéines caractérisées en ce qu'elles constituent des protéines de communication entre les cellules d'un type donné et les cellules hétérologues contiguës ou proximales.

Description

FACTEURS DE LA REGULATION FONCTIONNELLE CELLULAIRE ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES
L'invention a pour objet des protéines capables notamment, de constituer des facteurs de régulation fonctionnelle , de la cellule, et leurs applications biologiques.
On connaît le rôle fondamental des interactions et des communications entre les cellules.
Les interactions cellule-cellule revêtent une importance majeure dans le développement et l'organisation des organismes multicellulaires, ainsi que dans leur physiologie et leur pathologie. II est généralement admis que ces interactions s'effectuent par l'effet de facteurs solubles circulants, mais aussi par 1'intermédiaire de molécules d'adhésion cellulaire (CAM), de molécules d'adhésion au support matriciel et de molécules constituant des structures fonctionnelles entre les cellules.
Ces molécules assurent toutes à la fois, une régulation de la genèse durant les stades précoces du développement, incluant en outre les processus primaires tels que la prolifération et les migrations cellulaires. Elles donnent naissance à des signaux qui conduisent à une expression différentielle des gènes et par là, à une induction embryonnaire (voir notamment Gallin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83 : 8235-8239, 1986 ; Edelman, Immunol. Rev. 100:11-45, 1987 ; Jessel, Neuron. 1:3-13, 1988). Si le rôle de ces molécules a bien été établi, les mécanismes moléculaires impliqués dans ces régulations coordonnées sont toutefois.peu élucidés à ce jour. Les communications entre cellules jouent également un rôle important dans le maintien de l'expression différentielle des gènes des cellules matures des tissus adultes, comme l'ont montré notamment des travaux réalisés sur les systèmes nerveux périphérique et central (voir notamment Rathjen et al., J. Cell. Biol. 104 : 343 - 353, 1987 et Seilheimer et al., J. Cell. Biol. 109:3095 - 3103, 1989). Un autre exemple de grand intérêt à cet égard est fourni par le foie adulte. On constate en effet que la dissociation du tissu hépatique pour isoler des hépatocytes conduit à une forte diminution de la transcription des gènes codant pour les fonctions spécifiques du foie (voir Clayton et al. Mol. Cell Biol. 5:2623 - 2632, 1985). De plus, il a été constaté que l'établissement en culture d'interactions homotypiques, c'est-à-dire des hépatocytes entre eux, ne permet pas de préserver leur phénotype adulte, alors que les protéoglycanes induisent la formation de structures jonctionnelles fonctionnelles et restaurent la transcription d'ARNm spécifiques en cultures primaires. L'ensemble de ces résultats tend à démontrer le rôle majeur des cellules non parenchymateuses sur la transcription différentielle des gènes spécifiques du foie dans les hépatocytes adultes.
Certains des co-inventeurs de la présente demande ont décrit dans le brevet FR 8307148 du 29 avril 1983, au nom de l'INSERM, un procédé de co-culture d'hépatocytes humains adultes avec une population cellulaire hétérologue, mais d'origine hépatique. Durant la co-culture, on constate l'établissement de contacts entre les deux populations cellulaires. Il s'ensuit un maintien des activités fonctionnelles des hépatocytes sur plusieurs semaines. Durant la co-culture, on observe la sécrétion et le dépôt de divers composants d'une matrice donnant un réseau matriciel extracellulaire complexe qui entoure et recouvre les colonies d'hépatocytes et, en parallèle et de manière coordonnée, une activation de l'expression de gènes spécifiques du foie. Les inventeurs ont utilisé ce système de co- culture d'hépatocytes pour étudier les relations causales entre les différents événements biologiques qui conduisent à une différenciation stable des hépatocytes dans le foie adulte.
Une approche immunologique de ce problème leur a permis, en utilisant un anticorps monoclonal déterminé, de mettre en évidence le rôle critique joué à cet égard par une protéine de membrane. En poursuivant ces travaux, les inventeurs ont constaté que d'autres cellules que les hépatocytes, dans d'autres tissus que les tissus du foie, comportaient dans leur membrane des protéines de ce type reconnues également par 1'anticorps monoclonal en question. L'invention a donc pour but de fournir des protéines impliquées de façon majeure dans les interactions et les communications de cellule à cellule.
Elle vise plus spécialement à fournir des protéines de régulation de cellules différenciées, ou de cellules en cours de différenciation.
L'invention vise en outre les applications biologiques de ces protéines, en particulier comme facteurs de régulations fonctionnelles et comme marqueurs de différenciation cellulaire. Les protéines de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent ou sont constituées par une séquence d' acides aminés capable de réagir spécifiquement avec un anticorps monoclonal tel qu'obtenu par immunisation d'un animal avec des cellules épithéliales de rat d'origine hépatique, suivie des étapes de fusion et de clonage effectuées selon les techniques classiques, en particulier 1'anticorps monoclonal sécrété par la souche d'hybridome déposée à la D.S.M (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) le 19 juin 1991 sous le n° DSM ACC 2011.
D'une manière inattendue, il apparaît que de telles protéines sont capables de jouer un rôle critique dans la communication cellulaire, et notamment dans la reconnaissance spécifique et l' interaction de populations cellulaires différentes et conduisent à la transcription active de certains gènes et l' expression de fonctions caractéristiques d'un tissu donné. Elles constituent des protéines de communication entre les cellules d'un type donné et les cellules hétérologues contigϋes ou jointives. Elles s'avèrent en effet capables d'assurer la transmission d'un signal ou de signaux d' un type cellulaire à un autre type cellulaire qui peut être contigϋ ou proximal. Concernant la distribution tissulaire, à l'état adulte, les protéines de l'invention sont exprimées notamment au niveau du foie, du pancréas exocrine, des testicules, des ovaires et des tissus hématopoïétiques.
Au niveau cellulaire dans le foie, elles sont caractérisées en ce qu'elles sont membranaires et polarisées au pôle sinusoïdal des hépatocytes adultes normaux.
Cette polarité peut disparaître dans les cellules d'hépatomes, le foie foetal et le foie en régénération. Les protéines selon l'invention sont encore caractérisées en ce qu'elles sont exprimées notamment par les hépatocytes, les cellules épithéliales des ductules biliaires, les cellules endothêliales, les cellules de Ito et les macrophages. Elles sont également caractérisées en ce que, dans les testicules, elles sont exprimées au niveau des tubes séminifères par les cellules de Sertoli (cellules dites nourricières) et les spermatocytes à un stade précis de maturation, fin leptotène et zygotène. Elles sont en outre caractérisées en ce que, dans l'ovaire, elle sont exprimées par les ovocytes et les cellules folliculaires (cellules nourricières), qui les entourent, uniquement à un stade de maturation très précis, tout comme les spermatocytes dans les testicules. Les études effectuées sur des co-cultures d'hépatocytes et de cellules épithéliales de foie de rat (en abrégé CEFR), selon le procédé du brevet FR mentionné plus haut, ont montré l'implication de protéines spécifiques, du type de celles définies plus haut, dans les interactions entre ces deux populations cellulaires.
Ces protéines spécifiques sont également impliquées dans l' activité fonctionnelle des cellules germinales.
Les études effectuées sur des co-cultures de cellules de Sertoli et de cellules épithéliales de foie, réalisées avantageusement selon le procédé du brevet FR ci- dessus, ont montré l'implication des protéines du type défini plus haut dans la différenciation des cellules de Sertoli.
Les protéines de 1'invention sont caractérisées aussi en ce qu'elles sont exprimées dans les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, thymus, ganglions lymphatiques et rate) et dans le sang, (par les monocytes, granulocytes, érythrocytes et lymphocytes).
Les études effectuées sur des co-cultures de cellules épithéliales de foie et de cellules hématopoïétiques ont montré 1'implication des protéines dans la prolifération et la maturation de ces cellules hématopoïétiques.
L'implication directe des protéines a été en outre confirmée par la mise en évidence des protéines de 1'invention dans des cellules composant le tissu stromal de la moelle osseuse et par l'obtention d'une maturation des hépatocytes lorsqu'ils sont mis en co-culture avec des cellules stromales.
Dans ces différents cas, les protéines de 1'invention constituent des glycoprotéines de la membrane. Ces protéines sont plus spécialement caractérisées en ce qu'elles sont formées d'une séquence d'acides aminés ayant un poids moléculaire (PM) d'environ 85000 daltons, tel que mesuré par électrophorèse en gel dénaturant de polyacrylamide. Cette séquence, selon une disposition de l'invention, comprend un ou plusieurs des enchaînements suivants, à savoir : -P-Q-D-M-S-G-F-Q-K, I-N-P- ( T ) -D-E-S , G-L-Q-M-K,
D-M-V-E-F-(R)
De manière conventionnelle, les lettres utilisées ont les significations suivantes :
L≈leucine, P≈proline, Q≈glutamine, D≈acide aspartique, M≈méthionine, S≈sérine, G≈glycine, F=phénylalanine, K≈lysine, I≈isoleucine, N≈asparagine, T≈thréonine, E≈acide glutamique, V≈valine, R≈arginine. Selon un autre aspect, les protéines de l'invention mises en évidence dans les co-cultures d'hépatocytes sont des protéines membranaires présentant un pi de 4,9 à 5,1 environ par analyse sur gel bidimensionnel. Dans une variante, ces protéines se présentent sous une forme ayant un PM de 73 000 daltons environ, possédant l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal (ou en abrégé AcM) défini plus haut, correspondant à des protéines de membrane tronquées. Ces protéines présentent notamment un pi de l'ordre de 5,2. On notera que le PM des séquences protéiques peut varier sensiblement d' une espèce à l' autre, voire d' un tissu à l'autre et d'un type cellulaire à l' autre. Elles possèdent de plus une région ou domaine spécifique d'un type cellulaire pour un tissu donné, d'une espèce donnée. Sous l'un des divers aspects évoqués ci-dessus, ces protéines de 1'invention sont encore caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une seule chaîne protéique.
L'implication de ces protéines peut être appréciée au regard de l'altération de l'activité fonctionnelle des hépatocytes matures lorsqu'on ajoute à la co-culture un anticorps monoclonal les reconnaissant spécifiquement, comparée à l'activité fonctionnelle de co-cultures non traitées par l' AcM. Cette altération est observée au regard de paramètres significatifs d'un bon maintien d'un stade de différenciation en co-culture, à savoir la survie de l'hépatocyte pendant plusieurs semaines, la production d'albumine, la présence de niveaux élevés d'ARN-m spécifiques du foie, l'organisation caractéristique des composants du cytosquelette et le dépôt de fibres de matrice extracellulaire. Comme montré dans les exemples rapportés ci-après, 1'immunoréaction des protéines de 1'invention avec 1'anticorps monoclonal se traduit par une perte du phénotype adulte des hépatocytes, et comme dans les cultures pures, par une survie réduite à 5 à 6 jours environ, une diminution rapide de la sécrétion de sérum albumine avec un taux inférieur à environ 50 % de la production normale, accompagnée d'une diminution du niveau des ARN-m correspondants et des ARN-m d'autres gènes spécifiques du foie.
On constate que, comme dans les cultures pures, les hépatocytes de co-cultures traitées par l'anticorps monoclonal en question synthétisent du procollagène Iαi qui ne polymérise pas.
Ces changements correspondent à une perte pratiquement complète de dépôt de matrice extracellulaire. Ils coïncident également avec une incapacité des hépatocytes à développer une architecture du cytosquelette caractéristique du phénotype différencié.
Les résultats obtenus sur les hépatocytes mettent en évidence le rôle des protéines de 1'invention dans la régulation fonctionnelle des cellules.
On mesurera en particulier les effets coordonnés, induits ou médiés, par ces protéines, l'expression de gènes spécifiques de tissus, l'organisation de protéines du cytosquelette et le dépôt d'une matrice extracellulaire. Selon un autre aspect de l'invention, les protéines en question sont caractérisées en ce qu'il s'agit de glycoprotéines.
Selon encore un autre aspect, les protéines de 1'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont constituées en tant que telles, par la partie active des protéines définies plus haut, c'est-à-dire la partie responsable de la communication entre les cellules d'un type donné et les cellules hétérologues contigûes ou proximales.
L'invention vise notamment la partie glycosylée des protéines définies dans ce qui précède. Selon encore un autre aspect de l'invention, les protéines actives vis-à-vis de la régulation cellule- cellule sont des protéines recombinantes et renferment au moins la partie active évoquée plus haut.
Dans une autre variante de l' invention, les protéines de l' invention sont des analogues des protéines définies ci-dessus, c'est-à-dire que leur séquence d' acides aminés peut différer de celle de la séquence protéique active de référence par un ou plusieurs acides aminés délétés et/ou remplacés et/ou substitués, dès lors que ces changements n' altèrent pas les propriétés définies ci-dessus.
On notera à cet égard que le terme protéine tel qu' utilisé dans la description et les revendications désigne aussi bien les protéines telles qu' obtenues par voie de synthèse, que les protéines sous forme native ou sous forme recombinante, les parties actives de ces protéines, et leurs analogues comme défini plus haut.
L'invention vise également un procédé d'obtention des protéines définies ci-dessus. Ce procédé comprend la mise en contact d'un extrait de membranes de foie avec un anticorps monoclonal capable de reconnaître spécifiquement une protéine de surface de cellules épithéliales de foie de rat, ou un fragment Fab ayant une telle propriété. Les membranes de foie sont avantageusement solubilisées avec un agent ayant pour effet de les lyser, notamment un agent détergent tel que le Triton X100.
Pour l'étape de mise en contact, 1'anticorps monoclonal, ou les fragments Fab, est avantageusement couplé à un support, plus spécialement un support utilisable dans une colonne comme le Sépharose 4B.
Les protéines recherchées se fixent sélectivement sur l'anticorps par immunoréaction et sont ensuite éluées. A cet effet, on procède avec avantage à une augmentation du pH du tampon.
Comme tampon approprié, on citera la diéthylamine de pH 11,5 renfermant 0,05 % de Triton XI00. Aux fins de purification, l'éluat recueilli renfermant une protéine donnée est mis en contact avec un adsorbant sélectif permettant d'éliminer des protéines de poids moléculaires identiques à celui de la protéine recherchée mais de points isoélectriques différents, puis on désorbe la protéine à l'aide d'un tampon approprié et on la récupère à partir de l'éluat.
Les ,protéines de 1'invention peuvent être également purifiées à 1'aide d'un anticorps polyclonal induit de manière classique par immunisation d'un animal. D'une manière générale, les anticorps polyclonaux dirigés contre les protéines de 1'invention sous forme native ou recombinante, ou leur partie active, ou leurs analogues tels que définis plus haut, entrent également dans le cadre de l'invention. Naturellement, tout tissu, autre que les membranes de foie, donnant lieu à une réaction immunologique avec des anticorps tels que définis ci-dessus peut être utilisé pour obtenir les protéines de l'invention. On notera que la reconnaissance par l'anticorps n'est pas spécifique d'espèce.
L'anticorps monoclonal utilisé comme outil d'identification des protéines est tel qu'obtenu par sécrétion à partir de souches d'hybridomes résultant de la fusion d'une cellule immortelle de myélome non sécréteur avec une cellule productrice d'anticorps dirigés contre une protéine de surface de cellules épithéliales de foie de rat.
L'étape de fusion des deux types cellulaires est notamment réalisée selon la technique la plus couramment utilisée, à savoir celle de Kôhler et Milstein, Nature, vol. 256, p. 495, 1975.
Les cellules productrices d'anticorps sont des splénocytes. Ces cellules sont récupérées après immunisation in vivo de l'animal avec une suspension cellulaire de CEFR vivantes.
Les cellules immortelles sont des cellules de myélome non sécréteur, ce qui permet d'obtenir des hybridomes ne sécrétant que l'immunoglobuline de la spécificité de la cellule productrice. On utilise de manière classique des cellules de myélome SP2/0-Ag.
Conformément à la technique usuelle, les hybridomes obtenus sont mis en culture et clones selon le procédé de dilution limite. On sélectionne avantageusement les hybridomes dont les surnageants de culture produisent des immunoglobulines, en utilisant un test classique d'immunofluorescence.
Un deuxième niveau de sélection est opéré parmi les clones positifs retenus à l'issue de l'étape précédente, en ne retenant que les clones capables de reconnaître une protéine de la membrane plasmatique en donnant lieu à une réaction du type antigène-anticorps mais ne réagissant pas avec deux types de cellules non hépatiques, à savoir les cellules endothéliales de cornée et les fibroblastes de peau humaine.
Les anticorps monoclonaux récupérés peuvent être utilisés tels quels ou sont purifiés, par exemple sur colonne d'affinité, et conservés par congélation, ou éventuellement lyophilisés.
L'invention vise tout spécialement l'anticorps monoclonal L8 dont le mode de production est rapporté dans les exemples.
Les souches d'hybridomes productrices d'anticorps monoclonaux définies ci-dessus, ainsi que leur procédé d'obtention, comprenant les étapes de fusion et de sélection définies plus haut en rapport avec les anticorps monoclonaux, entrent également dans le cadre de l'invention. Dans une variante de l'invention, les protéines reconnues par les anticorps monoclonaux dans le procédé de lrinvention correspondent à des protéines recombinantes comportant ou formées partiellement ou totalement par la partie active vis-à-vis de la régulation cellule-cellule.
En opérant selon les techniques classiques de transfert de gènes du génie génétique, ces protéines sont produites dans des hôtes, transformés par introduction de vecteurs d'expression ou de clonage, notamment de plasmides, renfermant les fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées.
Ces fragments sont introduits par ligation dans un site approprié du vecteur choisi.
A titre d'exemples, des hôtes appropriés pour la mise en oeuvre , de 1'invention comprennent des bactéries, des levures ou encore des cellules d'arthropodes, de vertébrés ou de plantes. Les protéines exprimées sont récupérées du milieu de culture, après lyse des bactéries, et purifiées.
Dans encore une autre variante, les protéines de l'invention sont formées par la partie active comme déjà défini, ou par les séquences données plus haut, ou sont des analogues de ces protéines, de ces séquences, ou de leur partie active. Ces protéines sont obtenues par recombinaison génétique ou synthèse peptidique selon les techniques classiques.
La mise en oeuvre de ces techniques conduit à l'élaboration d'outils qui constituent des produits nouveaux. Ainsi, les hôtes cellulaires transformés, les vecteurs d'expression tels que plasmides, et fragments d'ADN tels qu'évoqués ci-dessus entrent dans le cadre de 1'invention. Dans une autre variante, les protéines de l'invention, plus spécialement les parties actives, ou des fragments de séquences, sont obtenues par voie de synthèse. En opérant avantageusement selon les techniques habituelles, on forme une chaîne peptidique déterminée à l'aide d'un synthétiseur.
Compte tenu de leur rôle dans la communication et dans les interactions entre cellules, les protéines de 1'invention présentent un grand intérêt comme facteur de régulation fonctionnelle des cellules cibles dans un tissu donné.
L'invention vise en particulier leur utilisation dans les cultures cellulaires en vue d'assurer la restauration et le maintien de l'activité fonctionnelle d'un type donné de cellules.
Les cultures sont réalisées avantageusement dans les conditions habituelles et la protéine est ajoutée au milieu. Comme rapporté dans les exemples, les protéines de l'invention jouent un rôle majeur dans le fonctionnement hépatocytaire en culture.
L'invention vise donc plus spécialement un procédé de culture d'hépatocytes, en particulier d'hépatocytes humains, comportant la mise en oeuvre d'une protéine telle que définie ci-dessus en remplacement des CEFR utilisées dans le procédé du brevet déjà mentionné.
Dans une autre application comme facteur de régulation fonctionnelle, les protéines de l'invention sont utilisées pour restaurer ou maintenir le fonctionnement, par exemple, de cellules hématopoïétiques en culture.
Ainsi, elles peuvent être utilisées pour favoriser la prolifération des cellules hématopoïétiques de manière à constituer un traitement supplétif pour des patients en aplasie, ayant perdu, après chimiothérapie ou radiothérapie, leurs progéniteurs ou une grande partie de leurs cellules hématopoïétiques.
Avant de procéder à ces traitements, on prélève des cellules de moelle osseuse ou des cellules hématopoïétiques sur le patient ou sur des donneurs compatibles, et on les met en culture avec des protéines de l'invention ou des cellules qui les expriment. Les cellules produites sont ensuite injectées au patient.
Les éléments pour de telles cultures cellulaires sont avantageusement disponibles, conformément à l'invention sous forme de kits, qui permettent également
1'établissement de banques de cellules à partir desquelles il est possible de produire régulièrement des cellules hématopoïétiques, des progéniteurs et précurseurs pouvant ' être injectés à des malades, en l'absence de problèmes de compatibilité.
L'invention vise en outre un kit comportant la protéine telle que définie ci-dessus et les réactifs ou une partie des réactifs nécessaires pour réaliser une culture cellulaire donnée. Le kit renferme également avantageusement les cellules concernées.
Les protéines de 1'invention sont également utilisables comme marqueurs cellulaires.
Ces marqueurs permettent d'effectuer des études de mécanismes fondamentaux.
Ils sont en particulier utilisables en pharmacopée constituant des modèles cellulaires pour l'étude de la toxicité ou de la myélotoxicité de molécules médicamen¬ teuses et/ou l' analyse des produits de métabolisation.
Les protéines de 1'invention constituent avantageusement des marqueurs de différenciation cellulaire, de polarité cellulaire ou encore de distribution cellulaire.
La mise en évidence des protéines de 1'invention est avantageusement réalisée à 1'aide d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, élaborés selon les techniques classiques, capables de reconnaître spécifiquement ces protéines.
Il s'agit avantageusement d'anticorps dirigés contre au moins une partie de la région ou du domaine de la séquence d'acides aminés spécifique d'un type cellulaire d'un tissu donné, d'une espèce donnée. Dans une variante, ces anticorps sont caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître, en donnant lieu à une réaction du type-antigène-anticorps, au moins l'un des fragments donnés ci-dessus, de séquences : L-P-Q-D-M-S-G-F-Q-K, I-N-P-(T)-D-E-S, G-L-Q-M-K, D-M-V-E-F-(R)
Comme déjà souligné, les protéines de l'invention permettent de caractériser, un stade donné de différen¬ ciation. Ainsi, selon un aspect présentant un intérêt majeur, les protéines de l'invention constituent des marqueurs des cellules germinales à un stade précis de différenciation au stade adulte, mais aussi au cours du développement.
Des essais réalisés sur des cultures de cellules de testicules ont montré que les protéines de 1'invention sont exprimées au niveau des tubes séminifères par les cellules nourricières de Sertoli et les spermatocytes à un stade bien précis de la maturation (voir article R.A. Hess dans Biology of reproduction 43,525 - 542, 1990).
Les anticorps dirigés contre ces protéines, avantageusement formés, selon les techniques classiques contre une protéine purifiée d'origine humaine, et plus particulièrement contre la région spécifique de cette protéine, pour ce type de tissu, constituent des outils particulièrement précieux pour effectuer des diagnostics de grande précision, ou des sélections cellulaires.
Ils sont ainsi utilisables pour la caracterisation de spermogrammes.
Les protéines de l'invention sont également présentes dans les ovocytes et les cellules folliculaires qui les entourent uniquement dans les follicules matures reconnaissables par la formation de l'atrium. L'utilisation d'anticorps dirigés contre ces protéines permet la reconnaissance des ovocytes matures qui sont les seuls fécondables.
L'invention vise donc l'application de ces anticorps en tant que bioreactifs pour le diagnostic in vitro dans un échantillon biologique de la présence de cellules germinales mâles ou de cellules germinales femelles à des stades précis de maturation comme indiqué plus haut, en vue de leur caracterisation et/ou de leur sélection. Dans cette application, les anticorps sont libres.
En variante, ils sont fixés sur un support solide non i munogène. Selon un autre aspect de grand intérêt, les protéines de 1'invention constituent des marqueurs des cellules sanguines.
L'invention vise donc également les anticorps dirigés contre les protéines spécifiques des différentes cellules sanguines.
D'une manière générale, la méthode selon l'invention de diagnostic in vitro de la présence de protéines telles que définies ci-dessus dans un échantillon biologique ou des cellules est caractérisée par le fait qu'elle comprend les étapes suivantes :
- on, met en contact 1'échantillon à analyser ou les cellules avec une préparation d'un anticorps, ou d'un fragment Fab, comme défini ci-dessus, immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec lesdites protéines, lorsqu'elles sont présentes dans l'échantillon, puis on met en évidence la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps en opérant avantageusement selon les techniques habituelles.
On a recours par exemple aux techniques de cytofluorométrie.
Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité et rapidement la présence de ces protéines membranaires dans l'échantillon testé.
Ces protéines constituent donc par exemple des marqueurs de différenciation d'une part des cellules de Sertoli et les spermatocytes à un stade donné, d'autre part, des ovocytes également à un stade précis de maturation, de les localiser, voire de les collecter sélectivement et de les quantifier.
On mesurera 1'intérêt de cette méthode dans le cadre des fécondations in vitro pour la sélection des ovocytes matures ou pour la culture d'ovocytes à des fins de conservation et/ou de maturation in vitro.
Ces applications immunohistologiques basées sur le rôle précoce joué par les protéines de l'invention dans les différenciations cellulaires, s'étendent à tous les tissus susceptibles de les exprimer au stade embryonnaire précoce ou à des stades plus tardifs du développement.
Elles permettent d'étudier la spécificité d'expression à l'état adulte des cellules d'un tissu donné. La méthode ci-dessus est également applicable pour effectuer une sélection parmi des populations cellulaires de celles des cellules qui expriment les protéines de l' invention.
Elle s'applique également avec avantage au diagnostic et suivi de toutes les hémopathies, notamment les aplasies en permettent de détecter un élément sanguin manquant, une anomalie au niveau des cellules stromales ou la perte des progéniteurs des cellules hématopoïétiques.
L'invention vise également un kit pour la mise en évidence desdites protéines aux fins de diagnostic in vitro de leur présence dans un échantillon biologique ou pour effectuer une sélection cellulaire.
Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration,
- une préparation d'anticorps ou de fragment Fab libre ou immobilisé, comme défini ci-dessus, des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
Selon un autre aspect de l'invention, la reconnaissance des protéines natives par des anticorps contre ces protéines, autorise l'utilisation de ces anticorps comme vaccin contraceptif. L'administration de ces anticorps à des souris peut conduire à une inhibition de la fertilité pendant le traitement.
L'invention vise donc également un vaccin contraceptif caractérisé en ce qu'il renferme, en association avec un véhicule inerte, un anticorps dirigé contre les protéines, ou parties des protéines des ovocytes matures ou des spermatocytes comme défini plus haut, plus particulièrement contre au moins une partie de la région de ces protéines spécifiques des tissus en question.
La suite de la description comprend des exemples dans lesquels sont rapportés les résultats obtenus avec, comme type cellulaire les hépatocytes.
Il est clair toutefois que ces exemples ne sont donnés que pour illustrer l'invention, d'autres types cellulaires pouvant être utilisés dès lors qu'ils répondent aux définitions de l'invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 11, qui représentent :
- la .figure 1 des micrographies de co-cultures (B,C), ou de cultures pures (A), d'hépatocytes traités (A,C) ou non (B) avec 1'AcM L8, - la figure 2 représente la production d'albumine en fonction de la durée d'une co-culture (en jours), en présence de concentrations croissantes d'AcM L8,
- la figure 3A est une immunolocalisation sur coupe de foie de rat adulte et les figures 3B et 3C sont des micrographies montrant 1'immunolocalisation du complexe AcM L8-protéine dans des cultures d'hépatocytes,
- la figure 4 donne les résultats d'hybridation d'ARN-m d'hépatocytes avec différentes sondes.
- la figure 5 représente des micrographies de co- cultures avec dépôt de fibres matricielles, traitées (B,D) ou non (A,C) par l'AcM L8, puis colorées à la réticuline (imprégnation à 1' argent),
- la figure 6A représente des immunoprécipités de protéines de 1'invention avec 1'AcM L8 à partir de cellules endothéliales de cornée (1), de cellules épithéliales hépatiques (2) et d'hépatocytes (3), en conditions non réductrices ; la figure 6B les mêmes immunoprécipités en conditions réductrices; la figure 6C représente une électrophorèse bidimensionnelle révélant le pHI des protéines et la figure 6D montre une immunoprécipitation après extraction des protéines avec le Triton X114, et - la figure 7 montre des coupes de tissus de rat adulte, après réaction avec l'AcM L8, A/ et B/ de follicule ovarien, C/ d' intestin grêle D de tubes séminifères.
- la figure 8, des mesures par cytofluorimétrie sur des cellules hématopoïétiques,
- la figure 9, les résultats d'électrophorèse avec le thymus, CEFR, moelle osseuse et érythrocytes, avec indication du poids moléculaire PM,
- les figures 10A et 10B, la localisation de L8 dans le thymus et les cellules stromales et,
- la figure 11, une co-culture d'hépatocytes. I. REACTIFS ET PRODUITS UTILISES
. Complexe laminine-entactine, laminine, héparane- sulfate et collagène IV : extraits de la tumeur, de sarcome de souris (Engelbreth-Holm-Swarm) (1) en opérant selon (2) avec les modifications données dans (3).
Fibronectine et collagénase : Boehringer Mannheim France S.A. Meylan.
. Milieu minimum essentiel : Gibco . Milieu 199 : Gibco
. Milieu E de Williams : (14)
. Sondes d'hybridation pour l'analyse d'ARN-m : pRSA8 pour le gène de l'albumine (4), A4C9 pour le gène de l'aldolase B (5) et du procollagène la± (6). . Anticorps anti-cytokératine 18 (anti CK 49) de spécificité connue (7).
. Fibroblastes de souris 3T3 (8). . Cellules endothéliales de cornée de boeuf (9). Cellules épithéliales de cristallin de boeuf (10).
Anticorps anti-IgM de souris marqué à la peroxydase: Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, Pays-Bas. anti Ig de souris marquée avec de 1'isothiocyana e de fluoresceine : Diagnostic Pasteur, Marnes-la-Coquette, France.
> [35s] - mêthionine et [125i]Na : Amersham France S.A., Les Ulis. . IgM de chèvre anti-souris (Nordic Immunological Laboratories).
Protéine A-Sépharose et Ampholines (Pharmacia France SA, Saint-Quentin-en-Yvelines). II Tsol-piment des cellules t*± culture : isolement des hépatocytes ; préparation de cultures pures ou de co-cultures.
- hépatocytes.
Les hépatocytes normaux adultes sont obtenus par perfusion de foie de rat (Sprague-Dawley ; 150-200 grammes) avec une solution de collagénase à 0,025 % tamponnée avec de l'Hepes 0,1M, (acide 4-(21 - hydroxyéthyl)-l-pipérazine éthane sulfonique) (pH 7,4). On opère selon la méthode de Seglen décrite dans (11) en utilisant les modifications rapportées par Guguen et al., dans (12).
- Cultures pures.
Dans le cas d'une culture pure, les hépatocytes sont ensemencés dans des flacons de culture dans un mélange formé de 75 % de milieu MEM et de 25 % de milieu 199, supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal et contenant par ml : pénicilline (100 UI), sulfate de streptomycine (100 μg), insuline de boeuf (5 μg) et albumine de sérum de boeuf ou BSA (1 mg). Le milieu, auquel on ajoute 7 x 10~5 M d'hémisuccinate d'hydrocortisone, est renouvelé 4 h plus tard, puis chaque jour.
- Co-cultures.
Les co-cultures sont préparées selon les conditions décrites dans (13).
Brièvement, 4 h après 1'ensemencement des hépatocytes, on enlève le milieu et on ajoute les CEFR non transformées, ou d'autres types cellulaires, mis en suspension dans un milieu frais. 24 h plus tard, le milieu est supplémenté avec 7 x 10~5M d'hémisuccinate d'hydrocortisone et renouvelé ensuite chaque jour. Pour analyser l'ARN, les hépatocytes des co- cultures sont sélectivement séparés à partir des CEFR par incubation 10 min avec une solution de collagénase dépourvue de calcium (0,05 %, pH 7,6) tamponnée avec de l'Hepes 0,1 M.
. Cultures de fibroblastes, myofibroblastes et cellules endothéliales. Les fibroblastes de souris 3T3, les cellules endothéliales de cornée de boeuf, les fibroblastes de peau humaine et les myofibroblastes de foie de rat sont maintenus dans le milieu supplémenté avec du sérum évoqué ci-dessus, sans insuline, corticostéroïdes, ni albumine. . Culture de cellules épithéliales.
Les cellules CEFR sont isolées en traitant des foies de rats normaux de 10 jours, avec de la trypsine (14) et (15). Des cellules épithéliales de foie de marmotte
(CEFM) sont préparées à partir de marmottes importées des E.U.A.
Les CEFR, CEFM et les cellules épithéliales de cristallin de boeuf sont mises en culture dans un milieu E de William supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal.
III Production et sélection des anticorps monoclonaux
Des souris Balb/c sont immunisées avec une suspension cellulaire de 10? CEFR vivantes. Les splénocytes sont récupérés. Cinq fusions différentes sont réalisées avec des cellules de myélome SP2/0-Ag. On sélectionne les surnageants de culture produisant des immunoglobulines au regard de la réponse positive donnée au test d'immunofluorescence indirecte avec les cellules CEFR et les hépatocytes. Sur 400 cultures d'hybridomes positives,
95 % environ sont positives avec les CEFR et les hépatocytes et 5 % environ sont positives seulement avec les CEFR. Les clones positifs sont ensuite sélectionnés selon leur aptitude à reconnaître à la fois une protéine membranaire plasmatique du foie et leur inaptitude à réagir avec des cellules non hépatiques, telles que les fibroblastes de peau humaine et les cellules endothéliales de cornée de boeuf. Finalement, 24 hybridomes sécrétant activement des anticorps dirigés contre des protéines de membranes plasmatiques de foie sont sélectivement clones et mis en culture.
IV Sélection d'AcM an regard de l'effet SUT l'activité fonctionnelle des hépatocytes. L'aptitude des anticorps monoclonaux à modifier les capacités fonctionnelles des hépatocytes en co-culture est contrôlée en ajoutant des quantités croissantes de surnageants de cultures des hybridomes sélectionnés, à des cultures pures d'hépatocytes et à des co-cultures. On ajoute ainsi 100, 200, et 500 μl de surnageant.
On isole la souche produisant des AcM capables de réduire signifiçativement, la survie des hépatocytes en co- culture, mais n'exerçant aucun effet sur la viabilité des cellules en culture pure. Ces AcM sont appelés L8. Comme indiqué plus haut, cette souche d'hybridome a été déposée à la D.S.M. le 19 juin 1991 sous le n° DSM ACC 2011.
Ils sont caractérisés comme étant de classe IgM selon la technique d'Ouchterlony. . Effet sur la viabilité des hépatocytes et sur la sécrétion d'albumine.
On ajoute à des co-cultures d'hépatocytes le surnageant de cultures d'hybridomes sécrétant AcML8 et, dans quelques expériences, on utilise des IgM L8 concentrées par traitement à l'euglobuline, puis dialyse du fluide d'ascite contre de l'eau distillée à pH 5 (voir (16) et (17)).
La figure 1 représente les photos de :
A : cultures pures d'hépatocytes de 2 jours traitées avec un surnageant d'hybridomes produisant L8 ;
B : de co-culture d'hépatocytes de 5 jours ;
C : de co-cultures d'hépatocytes de 5 jours, traitées avec un surnageant d'hybridomes produisant L8. 500 μl'd'AcMLδ sont ajoutés au milieu de culture au démarrage de la culture, puis tous les jours à chaque renouvellement du milieu.
Au troisième jour, la forme typique polygonale des hépatocytes maintenus en co-culture est perdue en présence de l'AcM L8 et la plupart des hépatocytes sont morts au 5ème ou 6ème jour, tandis que les CEFR ne sont pas affectées.
La capacité des cellules à sécréter de 1'albumine est étudiée dans les cultures traitées chaque jour avec l'AcM L8. Le taux de sécrétion d'albumine est quantifié dans les milieux de culture durant 5 ou 6 jours par immunonéphélométrie par laser en opérant selon (18).
L'AcM est ajouté à différentes concentrations. Le taux de sérum albumine est mesuré dans le milieu prélevé chaque jour.
Sur la figure 2, on a représenté les résultats obtenus avec les cultures pures ( —Q—~ ), les co-cultures témoins ( — VÊr— ) maintenues sans addition d'AcM L8, et des co-cultures auxquelles on a ajouté 2,5 ( — ),
5 ( — — ) , 10 ( — τ s— ) et 20 μg/ml ( —A— ) d'AcM partiellement purifié. L'anticorps est ajouté lors de l'ensemencement de CEFR et tous les jours à chaque renouvellement de milieu. On constate que la sécrétion d'albumine est maintenue à un niveau élevé dans les co-cultures non traitées et chute dans celles auxquelles on a ajouté 10 ou 20 μg d'anticorps partiellement purifié par ml de milieu (figure 2a). . Classe de l'AcM L8 :
L'AcM L8 est caractérisé comme étant de classe IgM selon la technique d'Ouchterlony.
On rapporte ci-après deux expériences réalisées pour déterminer à quel moment l'AcM L8 exerce un effet sur des hépatocytes en co-culture.
Dans une première expérience, on ajoute l'AcM L8 au début de l'ensemencement cellulaire, puis on arrête le traitement 1, 2, 3, ou 4 jours après.
Dans une deuxième série d'expériences, la co- culture est initiée sans anticorps et le traitement est commencé seulement 1, 2, ou 3 jours après. L'effet de 1'AcM L8 est évalué en mesurant la capacité des hépatocytes à survivre et à sécréter l'albumine dans le milieu.
On constate que la suppression du traitement avec l'AcM L8 au premier jour ainsi que l'addition tardive de l'anticorps au troisième jour, n'a pas d'incidence significative sur la viabilité cellulaire et la production d'albumine. On met en évidence un effet inhibiteur seulement lorsque 1'anticorps est présent entre les premiers et deuxièmes jours après l'ensemencement des CEFR correspondant à 1'établissement de contacts entre les deux populations cellulaires. Le premier jour de décalage de phase représente le temps nécessaire pour 1'attachement des
CEFR, leur croissance et l'obtention d'une confluence avec les colonies d'hépatocytes.
L'étude par microcinématographie des cellules épithéliales de foie établissant des contacts avec des hépatocytes montre l'apparition d'une zone claire et plate au site de contact au bout de 20 min et une réorientation des organelles intracytoplasmiques de manière radiale en direction de ce site. v Immunolocalisation de la protéine ..réagissant avec l'AcM L8 :
Les cultures pures d'hépatocytes et les co- cultures sont fixées dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % tamponnée avec du cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,4) pendant 30 min à 4°C. Les AcM sont localisés en utilisant une coloration indirecte avec de 1'immunoperoxydase ou la technique d'immunofluorescence indirecte. Les incubations sont réalisées en présence de 0,1 ou de 0,2 % de saponine.
Un deuxième anticorps est constitué par un anticorps anti-
IgM de souris marqué par de la peroxydase ou par une immunoglobuline anti-souris marquée avec de
1'isothiocyanate de fluorescéine. La réaction immunopositive avec l'AcM L8 est uniformément localisée au niveau de la membrane plasmatique d'hépatocytes fraichement solés et de cultures pures d'hépatocytes et ce, seulement dans les 4 premiers jours puis disparaît.
En revanche, l'AcM L8 immunoréagit avec les membranes plasmatiques des hépatocytes en co-culture pendant deux semaines. La réaction diminue lentement ensuite avec le temps.
On rapporte sur la figure 3B) une photo sur une co-culture de 3 jours montrant, en utilisant la technique d'i munofluorescence, la localisation de la protéine sur la membrane plasmatique et sa distribution uniforme autour des cellules. Elle apparaît fortement exprimée par les hépatocytes et faiblement par les CEFR.
Pour l'étude par microscopie électronique, les cellules sont ensuite fixées avec 2,5 % de glutaraldéhyde, puis incubées 30 min avec une solution renfermant 1 % d'osmium dans un tampon 0,1 M de cacodylate. Les cellules sont ensuite déshydratées dans de l'éthanol pur et incluses dans de l'EponR.
La figure 3C montre une micrographie au microscope électronique d'une co-culture de 3 jours. La molécule de protéine est détectée par réaction d'immunoperoxydase. On observe des dépôts denses d'électrons, uniformément distribués à la surface cellulaire des hépatocytes et des CEFR. Aucune coloration intracellulaire n'est visible. La figure 3A montre la distribution de la protéine sur une coupe de foie de rat adulte. Elle apparaît uniformément distribuée dans le lobule et localisée essentiellement au pôle sinusoïdal des cellules. vi Réaction de différents types cellulaires avec des hépatocytes de ra en CO-CUlture et immnnnréartivitP avec l'AcM L8.
On rapporte ci-après les résultats obtenus avec des co-cultures de différents types cellulaires avec des hépatocytes de rat. On considère que les cellules qui sont capables d'améliorer à la fois la survie des cellules et la sécrétion d'albumine, sont capables d'établir des interactions cellulaires- avec les hépatocytes. L'immunoréactivite avec l'AcM L8 est mise en évidence par localisation indirecte avec 1'immunoperoxydase. Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous.
Figure imgf000027_0001
Autres types cellulaires
- Myofibroblastes de foie Rat ND
- Fibroblastes de peau Homme ND
- Cellules endothéliales Boeuf ND de cornée
- Fibroblastes 3T3 Souris ND
*ND signifie qu'aucune réactivité n'a été décelée.
L'examen de ce tableau montre que deux lignées cellulaires différentes de CEFR et une lignée cellulaire épithéliale de foie de marmotte (CEFM), sont capables de favoriser la survie d'hépatocytes de rat et la sécrétion d'albumine. Toutes ces cellules sont immunoréactives avec l'AcM L8. En revanche les cellules épithéliales de cristallin de boeuf et les myofibroblastes de foie de rat ne réagissent pas avec les hépatocytes en co-culture.
En outre, des essais ont été effectués combinant des hépatocytes de différentes espèces avec les CEFR. Les hépatocytes de souris, de marmotte, de chien, de babouin et d'homme sont tous capables- de réagir avec les CEFR et de maintenir une stabilité fonctionnelle élevée en co-culture. L'ensemble de ces résultats montrent que les cellules qui donnent lieu à une réaction du type antigène- anticorps avec l' AcM L8 sont capables de réagir avec les hépatocytes en co-culture, donnant lieu à l'établissement de communications intercellulaires permettant le maintien de l'état différencié des hépatocytes.
VII Etude de l'action de l'AcM L8 sur l'expression de gènes spécifiques du foie d'hépatocytes en co-culture.
On analyse les niveaux d'ARNm de l'albumine (a), de procollagène I αl (b) et d'aldolase B (c) d'hépatocytes fraîchement isolés (0) et d'hépatocytes maintenus en co- cultures 2 ou 5- jours avec (+) ou sans (-) 20 μg/ml d'AcM L8 partiellement purifié. A titre de comparaison les cultures pures ont été analysées à 2,4 et 6 jours. A correspond aux co-cultures, B aux cultures pures d* hépatocytes, 2, 4 et 6 jours après ensemencement.
Des quantités égales d'ARN total (20 μg) de ces différentes sources sont utilisées.
L'ARN total est obtenu en suivant la technique de Chirgwin et al. (19) avec 5 M de thiocyanatë de guanidium/CsCl.
L'ARN total (20 μg) est résolu par électrophorèse et transféré sur un filtre de nitrocellulose. Le filtre est préhybridé de manière classique et hybride avec une sonde d'ADN nick-translaté 3 x 10^ cpm/ml de 32p pendant 18 h à
65° C.
On réalise l'hybridation avec un excès de sondes d'ADNc correspondant à (A), (B) et (C). Les résultats sont rapportés sur la figure 4. Les niveaux d'ARNm de l'albumine et de l'aldolase B augmentent fortement du deuxième au cinquième jour dans les co-cultures non traitées alors que ces niveaux diminuent fortement en présence de l'AcM L8 au cinquième jour. En revanche, des quantités croissances de procollagène I ± sont observées en présence de l'AcM L8. Pour démontrer que l'AcM L8 altère spécifiquement la régulation des gènes spécifiques du foie, médiée par le contact cellule-cellule, des cultures pures d'hépatocytes sont prolongées jusqu'à huit jours en présence de 25 mM de nicotinamide et exposées en continu à 1'AcM L8. Ni la morphologie, ni la sécrétion d'albumine n'est modifiée dans ces cellules quand l'AcM L8 est présent. En revanche, les co-cultures avec ou sans nicotinamide perdent leur capacité à sécréter des niveaux élevés d'albumine en présence de 1' AcM L8.
Pour vérifier que l'AcM L8 n'a pas d'effet direct sur les cultures d'hépatocytes pures, on a analysé les produits de traduction in vitro des hépatocytes non traités ou traités tous les jours avec l'AcM L8 et maintenus en culture pure ou en co-culture. A cet effet, 5 μg d'ARN total de cultures pures et de co-cultures, non traitées ou traitées chaque jour avec 10 μg/ml d'AcM L8 partiellement purifié (1, 3 et 5 jours) sont traduits in vitro en utilisant des lysats de réticulocytes de lapin (20) contenant 50 μCi de [35s]-méthionine. La traduction est réalisée pendant 2 h à 30°C. Le matériau précipitable avec de l'acide trichloracétique (4 x 105 cpm) est développé sur SDS-PAGE et autoradiographié. On constate que le profil des protéines synthétisées par les cultures pures est semblable durant la période de culture, qu'il y ait ou non présence de l'AcM L8. En revanche, le traitement des co-cultures avec l'AcM L8 pendant 3 jours induit spécifiquement des changements importants dans le niveau de synthèse des différentes protéines.
VIII Etude de l'effet de l'AcM L8 sur l'organisation du cytosquelette des hépatocytes et sur le dépôt des composants de la matrice extracellulaire. . Cytosquelette II a déjà été établi que la forme cellulaire et le cytosquelette sont étroitement associés avec le phénotype différencié des hépatocytes. L'examen effectué a porté sur les contacts cellules-cellules avec les CEFR pour vérifier s'ils induisent des changements précoces ou tardifs du cytosquelette. Des cytokeratines CK8 et CK18, qui forment les filaments de taille intermédiaire du cytosquelette des hépatocytes, ont été analysés. L'immunolocalisation de la protéine CK18 est réalisée dans les cultures pures et dans les co-cultures en présence ou en l'absence de l'AcM L8. Les filaments de cytokératine forment un réseau complexe uniformément distribué dans le cytoplasme des hépatocytes en cultures pures tandis qu'ils sont principalement localisés à la périphérie cellulaire juste en dessous de la membrane plasmatique en co-culture. On a constaté que l'addition journalière de l'AcM L8 à partir du démarrage de la co-culture perturbe fortement la réorganisation de ces composants du cytosquelette. . Dépôt de la matrice extracellulaire
La coloration de la réticuline par imprégnation d'argent de la matrice extracellulaire est réalisée suivant la méthode de Gordon et al. décrite dans (20) dans des co- cultures fixées avec un mélange de paraformaldéhyde à 4 % et de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon cacodylate (pH 7,4) pendant 15 min à 4°C.
Il a déjà été démontré que la présence de la matrice extracellulaire est associée au maintien des fonctions hépatocytaires en co-culture. Le rôle de l'AcM L8 sur le dépôt de la matrice extracellulaire a été étudié en co-culture en utilisant la coloration de la réticuline. On rapporte, sur les figures 5A et 5B, les micrographies obtenues avec des co-cultures établies en ajoutant les CEFR 4 heures après avoir ensemencé les hépatocytes pour obtenir une monocouche de cellules.
La coloration est effectuée sur des co-cultures de
3 jours, traitées tous les jours avec 2 μl/ml de fluide d'ascites de cellules de myélome SP2/0-Ag servant de témoin
(A) et de fluide d'ascites obtenus avec des hybridomes sécrétant l'AcM L8 (B).
Dans les cellules en co-culture non traitées, la matrice extracellulaire est tout d'abord localisée entre les deux populations cellulaires. Cette trame ou réseau couvre graduellement les colonies d'hépatocytes en une semaine. L'addition précoce et journalière de 5 μg et 10 μg par ml de l'AcM L8 aux co-cultures inhibe fortement le dépôt de la matrice extracellulaire dans les deux conditions de co-culture mise en oeuvre. Les résultats donnés ci-dessus ayant montré que 1'activité de la protéine de 1'invention est inhibée par 1'anticorps monoclonal la reconnaissant spécifiquement durant l'établissement des contacts entre les deux populations cellulaires, des expériences ont été réalisées pour étudier l'effet de cet anticorps sur l'attachement des hépatocytes aux CEFR.
On rapporte sur les figures 5C et 5D les micrographies obtenues avec ces co-cultures. Des boîtes de 3,5 cm de diamètre couvertes par une monocouche confluente de CEFR sont préincubées avec 2 μl de fluide ascitique de SP2/0-Ag (C) ou de L8 (D) par ml de milieu dépourvu de sérum pendant 1 heure. Les hépatocytes fraîchement isolés (106 cellules) sont alors ensemencés et maintenus à 37"C dans le même milieu contenant SP2/0-Ag ou 1'AcM L8. Les milieux des fioles sont récoltés en double au bout de 2, 3, 4, 7 et 22 h et le nombre d'hépatocytes non attachés est estimé en mesurant 1'activité lactate déshydrogénase après lyse des cellules avec PBS contenant 0,2 % de Triton X-100.
On n'observe aucune différence significative dans l'attachement des hépatocytes aux CEFR en présence de l'AcM L8. Les différences entre les cellules traitées ou non traitées sont observées seulement après trois jours et consistent en un retard à l'étalement de l'hépatocyte dans la co-culture avec l'AcM L8, tandis que les cellules non traitées ne s'étalent pas bien. De plus, le dépôt de matrice extracellulaire est fortement réduit et la viabilité des hépatocytes est limitée à quelques jours comme indiqué ci-dessus.
On a également vérifié si 1'AcM L8 est capable d'altérer l'adhésion des hépatocytes à différents composants de la matrice extracellulaire.
On rapporte les résultats obtenus avec les substrats suivants : gel de EHS, fibronectine, collagène IV, laminine, complexe laminine-entactine, héparane- sulfate, sont examinés. On -recouvre avec 2 μg de protéines les fonds des flacons de culture de tissus renfermant des puits de 0,32 cm2 contenant 100 μl de milieu dépourvu de sérum. Après 2 h, on ajoute 3 % de BSA à une (concentration finale de 1,5 %) pendant encore 30 min. Le milieu est éliminé et les hépatocytes préalablement incubés pendant 30 min dans un milieu dépourvu de sérum contenant des quantités croissantes d'AcM L8 ou de fluide ascitique SP2/0-Ag et 0,02 % de BSA sont, ensemencés. Au bout d'une heure, les cultures sont lavées deux fois avec PBS. Le nombre d'hépatocytes attachés et non attachés est mesuré comme décrit ci-dessus.
L'ensemencement d'hépatocytes dans un milieu contenant des concentrations croissantes en AcM L8 ou en fluide ascitique SP2/0-Ag n'empêche pas ou ne retarde pas l'attachement à des substrats de plastique, fibronectine, laminine, complexe laminine-antactine-collagène IV, hépara- ne-sulfate-protéoglycane. La préincubation des cellules avec l'AcM L8 n'affecte pas ces résultats.
Il a de plus été vérifié que les hépatocytes ensemencés avec l'AcM L8 sur des boîtes recouvertes de gel ESH ne montrent aucun changement dans leur survie et leur capacité fonctionnelle.
Ces données suggèrent que l'épitope reconnu par l'AcM L8 n'est vraisemblablement pas impliqué dans la réactivité avec la matrice extracellulaire. IX Caracterisation des polypeptides reconnus par l'ftcM L8.
On effectue l'immunoprécipitation sur des lysats cellulaires après iodination de la surface cellulaire des hépatocytes et des CEFR (21). Les cellules sont marquées avec Na [125i] par réaction catalysée à la lactoperoxydase. Les lysats des différentes sources sont précipités avec le fluide d'ascites obtenus avec les hybridomes sécrétant l'AcM L8. On réalise une incubation 90 min avec 3 μl de fluide ascitique. Afin d'éliminer les fixations non spécifiques, le fluide ascitique est traité par de la protéine A-Sépharose avant utilisation. Les échantillons sont ensuite incubés avec, des IgM faits chez la chèvre anti-souris, puis de la protéine A-Sépharose. Les billes d'affinité sont lavées avec le tampon de lyse et le matériau fixé est élue avec 100 μl d'échantillon tampon selon Laemmli (22) pour déterminer le poids moléculaire, ou avec 100 μl de tampon de lyse selon O'Farell (23) pour déterminer le pi. L'électrophorèse SDS-PAGE est effectuée en gel de polyacrylamide formant un gradient linéaire de 4 à 15 % ou de 7,5 à 15 % dans le système tampon de Laemmli évoqué ci-dessus.
La mesure de 1'isoélectrofocus est effectuée avec des Ampholines de pH 3 à 10 dans le système tampon O'Farell mentionné plus haut.
. détermination du poids moléculaire.
La figure 6A donne les résultats obtenus par analyse SDS-PAGE dans des conditions réductrices avec des immunoprécipités de lysats de cellules endothéliales de cornée de boeuf (piste 1), des hépatocytes (piste 2) et de
CEFR (piste 3).
L'analyse SDS-PAGE des immunoprécipités de l'AcM L8 montre deux chaînes peptidiques ayant des poids moléculaires apparents de 85 kD et 73 kD à la fois pour les hépatocytes et les CEFR. Ces deux bandes ne sont jamais détectées après immunoprécipitation avec le fluide ascitique des cellules de myélome SP2/0-Ag utilisées pour la fusion et servant de témoin, ni lorsqu'on prépare des lysats détergents iodés à partir de cellules endothéliales de cornée de boeuf (piste 1).
Sur la figure 6B, on a représenté les résultats de l'analyse SDS-PAGE dans des conditions non réductrices des immunoprécipités obtenus avec les hépatocytes (piste 1) et les CEFR (piste 2).
On constate que les deux polypeptides sont constamment présents aussi bien dans des conditions réductrices que non réductrices, ce qui suggère que les deux chaînes ne sont pas liées par des ponts disulfure. La chaîne la plus lourde (85 kD) parait migrer légèrement plus vite dans des conditions non réductrices avec un poids moléculaire apparent de 80 kD.
. mesure du pi (figure 6C) Le pi est de 4,9 - 5,1 environ pour le polypeptide de 85 kD et de 5,2 pour celui de 73 kD.
Les hépatocytes sont soumis à une extraction avec du Triton X-114 et à un fonctionnement de phase à 30CC comme décrit dans (24). Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 6D. Les deux polypeptides sont essentiellement récupérés à partir de la phase hydrophobe (piste 1), ce qui est à relier à leur nature membranaire. Ils ne peuvent être extraits de la membrane du plasma après traitement avec PBS ou EDTA. La phase aqueuse (piste 2), la phase hydrophobe (piste 3) et la phase aqueuse (piste 4) sont immunoprécipitées avec l' AcM L8. x Etude dff .1 'inrniunoréactivi-tê de dif érents tissus avec l'ftcM L8. . follicule ovarien de rat
On a représenté sur les figures 7A et 7B de photos de follicule ovarien de rat respectivement à faible (A) et fort (B) après réaction avec l'AcM L8.
On observe sur ces figures le follicule mature comportant des cellules folliculaires et l'ovocyte avec formation d'un atrium.
On observe également un petit follicule immature sans atrium.
On constate un marquage tout autour des cellules folliculaires proches de l'ovocyte et autour de 1'ovocyte lui-même, indiquant une immunoréaction avec l'AcM L8. . Intestin grêle
Sur la figure 7C, on a représenté une photo d'une coupe d'intestin grêle montrant des villosités intestinales. Aucune réaction avec l'AcM L8 n'est observée. Seules les hématies apparaissent colorées. . Testicule de rat.
La figure 7D représente une photo d'une coupe de testicule de rat montrant plusieurs tubes séminifères. On reconnaît à la périphérie les spermatocytes marqués par l'AcM L8, mettant en évidence l'expression de protéines de
1'invention par ces cellules-. XI Extraction de la protéine memlvrana-i-re du plasma
Les cultures sont lavées 3 fois avec du PBS, puis les cellules sont détachées de la boîte de Pétri, centrifugées à 6 500 t/min pendant 10 secondes et solubilisées soit dans du Triton X-100 à 1 %, du SDS à 0,01 %, 2 mM d'EDTA, 130 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) ou dans du Triton X-114 à 1 %, 130 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4), en passant cinq fois au travers d'une aiguille G26 avec une seringue et maintenue 30 min à 4° C. On ajoute dans tous les tampons deux inhibiteurs de protéases, à savoir l'aprotinine (100 Ul/ml) et du phénylméthylsulfoxyde (2mM). Les lysats cellulaires sont centrifugés 10 min à 13 000 t/min.
Lorsque le matériau soluble est extrait dans du Triton X-114, on le soumet à une séparation de phase, puis on ajuste les deux phases en ajoutant soit du Triton X-114 ou le tampon afin d'obtenir les mêmes teneurs en sels et en agents tensioactifs dans les différents échantillons.
XII Purification fi± séquençage de la protéine réagissant avec l'anticorps monoclonal LB.
La protéine est purifiée à partir d'une préparation brute de membranes de foie de rat adulte. Ces membranes sont lysées en présence de Triton X-100 (1 %) et SDS (0,1 %). Le lysat est centrifugé pendant 30 min. à 20000 g. Le surnageant est déposé sur une colonne d'affinité sépharose - 4 B activé au CNBr et couplé à l'anticorps monoclonal L8 (AcML8). Après lavage, la protéine est éluée avec de la diéthylamine 0,05 M pH 11,5, Triton X-100 à 0,1 %. La préparation est ensuite soumise à une chromatographie echangeuse d'anions à l'aide d'un colonne DEAE-cellulose, puis éluée par un gradient NaCl de 0 à 1 M. Le pic d'élution se situe à 0,15 - 0,2 M NaCl. L'éluat est précipité au TCA 10 % et analysé en gel de polyacrylamide SDS 8,5 %. La protéine est révélée par coloration au noir d'amido. Elle apparaît sous forme de deux bandes de 85000 et 73000 Da.
Pour le séquençage, la bande de gel de 85000 Da esτ découpée et séchée. Le gel est réhydraté puis incubé dans 150 μl de tampon contenant 0,6 μg de trypsine de porc, pendant 4 h 30 à 37°C.
Les peptides formés sont extraits du gel par incubation 20 min à 37°C dans 2 x 100 μl d'acétonitrile 60 %. Ils sont séparés sur une colonne C18 - HPLC, puis élues. Six pics ont pu ainsi être recueillis, quatre correspondant à des peptides pures ; ils ont été séquences automatiquement en utilisant la réaction d'Edman.
X XI Expression de la protéine reconnue par l'AcM L8. par les cellules des tissus hématopoïétiques.
Le thymus, la rate et les ganglions lymphatiques de rat sont isolés et coupés en petits fragments dans du milieu de culture RPMI 1640. Les cellules hématopoïétiques isolées son relarguées dans le milieu de culture et collectées. Les cellules de moelle osseuse sont obtenues de fémurs de rats par lavage de la cavité interne avec du milieu de culture. Les cellules du sang périphérique sont collectées sur héparine. Les érythrocytes sont lysés dans une solution de chlorure d'ammonium à 8,3 g/1 et les leucocytes restants sont lavés dans le PBS. Les érythrocytes sont isolés par centrifugation du sang héparine à 1000 g pendant 10 min. Le culot recueilli est lavé trois fois.
Pour l'analyse en cytofluorimétrie, des échantillons de 0,5 ou 1 x 106 cellules sont incubés avec l'anticorps pendant 1 h à 4°C. Après lavage, les cellules sont incubées avec le 2ème anticorps couplé à la fluoresceine pendant 30 min. Les cellules sont ensuite fixées avec 1 % de formaldéhyde et analysées avec un cytofluorimètre laser FACS 440. Toutes les cellules hémapoïétiques venant de tous les organes hémapoïétiques sont positives avec l'anticorps AcM L8 par cytofluorimétrie, à savoir les cellules mononucléaires, les granulocytes et les érythrocytes. Ceci est illustré par la figure 8.
Pour analyser plus précisément la protéine reconnue par AcM L8 au niveau de ces différents types cellulaires, celle-ci a été i munoprécipitée comme décrit plus haut, à partir de lysats de ces différentes cellules après iodination de leur membrane. Elle est mise en évidence par électrophorèse en gel acrylamide SDS. Il apparaît comme le montre la figure 9, que la bande de 85000 Da est exprimée par la majorité des types cellulaires attestant d'une grande homologie de la protéine d'un type cellulaire à un autre. Par contre, des caractères spécifiques singularisent la molécule entre ces différents types de cellules, au niveau de la seconde bande. Ceci est particulièrement net entre érythrocytes et thymocytes (qui correspondent essentiellement à des lymphocytes T) ; les érythrocytes ne , présentent qu'une bande de 85000 Da alors que les thymocytes présentent deux bandes à 85000 et 73000 Da. XIV Expression de la protéine reconnue par AcM L8. par la moelle osseuse
Les cellules de moelle osseuse de rat sont recueillies à partir de fémurs par grattage de la cavité interne. La culture de ces cellules se fait à 37°C dans le milieu DMEM additionné de 10 % de sérum de veau foetal, et 5 μg/ml insuline. Seules les cellules stromales adhèrent en 18 h, les autres cellules sont éliminées. Généralement, la culture à long terme de cellules stromales est initiée à partir de 10 x 106 cellules fraîchement isolées de moelle, placées dans 5 ml de milieu et dans des flasks de 25 cm2. Après 4 à 5 jours, les cellules ont profiféré. La mise en évidence de la protéine dans les cellules stromales de moelle a été obtenue à partir de ces cultures par immunolocalisation indirecte. Après lavage, les cellules sont fixées dans 4 % de paraformaldéhyde pendant 30 min à 4°C. L'immunolocalisation est réalisée avec l'AcM L8 et un 2ème anticorps couplé à la fluoresceine, comme décrit plus haut. En général, 3 types de cellules sont positives : les cellules hématopoïétiques accrochées à la couche de cellules stromales, les adipocytes et des cellules fibro- endothéliales (Fig. 10 A et 10 B (la figure 10 A représentant une vue des cellules de moelle osseuse en contraste de phase et la figure 10 B 1'immunolocalisation de l'AcM L8 au niveau des cellules de moelle osseuse). De façon intéressante, on peut confirmer qu'il s'agit bien d'une expression de la même protéine au niveau du stroma de moelle et du foie car l'immunoprécipitation et l'analyse par électrophorèse en gel d'acrylamide - SDS montre les deux mêmes bandes 85 000 et 73 000 Da avec parfois une bande à 64 000 Da. La présence de la protéine à la fois au niveau du stroma et des cellules hémapoïétiques renforme l'idée d'un signal de communication cellulaire tout comme dans le foie.
XV Coculture 'hépatocytes avec des cellules stromales de moelle osseuse
Les hépatocytes isolés de foie de rat par perfusion enzymatique, sont ensemencés sur une monocouche déjà constituée de cellules stromales de moelle. En 2- 4 h les hépatocytes adhèrent, s'agrègent entre eux, formant des colonies de cellules parenchymateuses aux caractéristiques morphologiques parfaitement reconnaissables, peuvent être maintenus en survie pendant environ trois semaines et sécrètent activement l'albumine. Ceci confirme que le signal de coculture médié par la protéine LRP, est commun aux 2 catégories tissulaires : foie et moelle osseuse (Fig. 11).
Références bibliographiques
1/ Kleinman H.K. et al.
Biochemistry 21:6188-6193, 1982 2/ Timpl R. et al. J. Biol. Chem. 254:9933-9937, 1979 3/ Hassel J.R., et al.
J. Biol. Chem. 260:8098 - 8105, 1985 4/ Sargent T.D., et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:3256-3260, 1979 5/ Simon M.P. et al.
J. Biol. Chem. 258:14567-14584, 1983 6/ Clavel C. et al.
Int. J. Cancer. 44:548-553, 1989 7/ Leroux-Nicollet I. et al. Biochem. Res. Commun. 114:556-563, 1983 8/ Rheinwald J.G. et al. Cell. 6:317-330, 1975 9/ Gospodarowicz D. G. et al.
Exp. Eye Res. 29:485-509, 1979 10/ Arruti C. et al.
Exp. Cell. Res. 117:283-292, 1978 11/ Seglen P.O.
Exp. Cell. Res. 76:25-30, 1973 12/ Guguen C. et al. Biochimie 57:1065-1071, 1975 13/ Guguen-Guillouzo C. et al.
Exp. Cell Res. 143:47-54, 1983 14/ Williams G.M. et al.
Exp. Cell Res. 69: 106-112, 1971 15/ Morel-Chany E. et al
Eur. J. Cancer. 14:1341-1352, 1978 16/ Goding J.W. 1986. Académie Press Inc. London. 104-141,
1986, Godin J.W. editor. 17/ Garcia Gonzalez M. S. et al. J. Immunol. Meth. 111:17- 23, 1988.
18/ Lescoat G. N. , Cell Differ. 16:259-268, 1985.
Guillouzo, A. et al. C. Biol. Cell. 43:163-172, 1982. 19/ Chirgwin J.M. et al. Biochemistry. 18:5294-5299, 1979. Andrews G. K. et al., J. Biol. Chem., 257:5148-5153,
1982. Eur. J. Biochem. 67:247-256, 1976. / Gordon H. et al., Am. J. Pathol. 12:545-551, 1936.
Rubin K. et al, Exp. Cell Res. 163:127-138, 1986. / Clément,B., et al. J. Biol. Chem. 264:12467-12471,
1989. / Laemmli U.K., Nature (Lond.) 227:680-685, 1970. / O'Farell P., J. Biol. Chem. 250:4007-4021, 1975. / Bordier, C. , J. Biol. Chem. 256:1604-1607, 1981.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Protéines capables notamment de constituer des facteurs de régulation fonctionnelle de la cellule, caractérisées en ce qu'elles comprennent ou sont constituées par une séquence d' acides aminés capable de réagir spécifiquement avec un anticorps monoclonal tel qu'obtenu par immunisation d'un animal avec des cellules épithéliales de rat d'origine hépatique vivantes, suivie des étapes de fusion et de clonage effectuées selon les techniques classiques, en particulier avec l'anticorps monoclonal sécrété par le clone déposé à la D.S.M. le 19 juin 1991 sous le n° DSM ACC 2011.
2/ Protéines selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles constituent des protéines de communication entre les cellules d'un type donné et les cellules hétérologues contigues ou proximales.
3/ Protéines selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que, dans les tissus adultes, elles sont exprimées au niveau du foie, du pancréas exocrine, des testicules, des ovaires et des tissus hématopoïétiques.
4/ Protéines selon la revendication 3, caractérisées en ce que, au niveau cellulaire dans le foie adulte normal, leur localisation est membranaire et polarisée au pôle sinusoïdal des hépatocytes.
5/ Protéines selon la revendication 3, caractérisées en ce que, dans les tissus du foie, elles sont exprimées par les hépatocytes, et d' autres cellules non parenchymenteuses, notamment les cellules épithéliales des ductules biliaires, les cellules endothéliales, les cellules de Ito et les macrophages.
6/ Protéines selon la revendication 3, caractérisées en ce que, dans les testicules, elles sont exprimées au niveau des tubes séminifères par les cellules de Sertoli et les spermatocytes à un stade précis de maturation, fin leptotène et zygotène.
7/ Protéines -selon la revendication 3, caractérisées en ce que, dans l'ovaire, elles sont exprimées par les ovocytes matures et les cellules folliculaires qui les entourent.
8/ Protéines selon la revendication 1, caractérisées en ce que, dans les tissus hématopoïétiques, elles sont exprimées par la moelle osseuse, le thymus, les ganglions lymphatiques et la rate, et dans le sang, par les monocytes, granulocytes, érythrocytes et lymphocytes.
9/ Protéines selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont telles qu'exprimées par les cellules composant le tissu stromal de la moelle osseuse.
10/ Protéines selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisées en qu'elles correspondent à une séquence d'acides aminés ayant un poids moléculaire apparent de 85.000 daltons environ, avec un pi de 4,9 à 5,1 environ.
11/ Protéines selon la revendication 10, caractérisées en ce que leur séquence comprend un ou plusieurs des enchaînements suivants, à savoir : L-P-Q-D-M-S-G-F-Q-K, I-N-P-(T)-D-E-S, G-L-Q-M-K, D-M-V-E-F-(R), les lettres correspondant à celles utilisées de manière conventionnelle pour désigner les acides aminés.
12/ Protéines selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisées en ce que leur séquence d'acides aminés possède un poids moléculaire de 73 000 daltons environ, avec un pi de 5,2 environ.
13/ Protéines selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisées en ce qu'elles possèdent une région ou domaine spécifique d'un type cellulaire pour un tissu donné, d'une espèce donnée. 14/ Protéines selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une seule chaîne protéique.
15/ Protéines selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce qu'il s'agit de glycoprotéines.
16/ La partie active des protéines selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, capables d' assurer la régulation cellule-cellule, en particulier la partie glycosylée de ces protéines.
17/ Protéines recombinantes, ou telles qu'obtenues par voie de synthèse, caractérisées en ce qu'elles renferment la partie active des protéines selon la revendication 16.
18/ Analogues des protéines selon l' une quelconque des revendications 1 à 17, dont la séquence comporte un ou plusieurs acides aminés différents par rapport aux séquences desdites protéines ou parties actives, et/ou délétés, et/ou substitués, dès lors que ces changements nV altèrent pas leurs propriétés dans la communication cellulaire.
19/ Anticorps polyclonaux capables de reconnaître une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, en donnant lieu à un complexe du type antigène- anticorps, et anticorps monoclonaux capables de réagir spécifiquement avec un épitope d'une telle protéine, ou leurs fragments Fab, en particulier ceux sécrétés par le clone déposé à la D.S.M. sous le n° DSM ACC 2011 le 19 juin 1991.
20/ Procédé d'obtention de protéines selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un extrait de membranes de foie ou d'un autre tissu capable d'exprimer les protéines recherchées avec un anticorps monoclonal capable de reconnaître spécifiquement une protéine de surface de cellules épithéliales de foie de rat, ou un fragment Fab ayant une telle propriété.
21/ Procédé d'obtention de protéines selon la revendication 1, ou de leurs fragments, caractérisé en ce qu'on a recours aux techniques du génie génétique, en introduisant dans des vecteurs les fragments des gènes codant pour les séquences d'acides aminés recherchées et en réalisant 1'expression de ces vecteurs dans des hôtes cellulaires.
22/ Application d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 comme facteur de régulation cellulaire, en particulier à la culture cellulaire notamment d'hépatocytes, et en particulier d'hépatocytes humains, ou de cellules hématopoïétiques, ou de cellules stromales.
23/ Kit pour culture cellulaire, caractérisé en ce qu'il comporte une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 et les réactifs ou une partie des réactifs nécessaires pour réaliser une culture cellulaire donnée, ainsi qu'avantageusement les cellules concernées.
24/ Application d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 comme marqueur de différenciation cellulaire, de polarité cellulaire ou encore de distribution cellulaire, et en particulier comme marqueur des cellules germinales ou de cellules hématopoïétiques à un stade donné de leur différenciation. 25/ Méthode pour mettre en évidence dans un échantillon biologique ou des cellules la présence de protéines selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée par le fait qu'elle comprend les étapes suivantes : - on met en contact l'échantillon à analyser ou les cellules avec une préparation d'anticorps selon la revendication 19, ou d'un fragment Fab, immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec lesdites protéines, lorsqu'elles sont présentes dans l'échantillon, puis, on met en évidence la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps en opérant avantageusement selon les techniques habituelles. 26/ Kit pour la mise en évidence de la présence dans un échantillon biologique ou des populations cellulaires de protéines selon l' une quelconque des revendications 1 à 18, en particulier aux fins de diagnostic ou de sélection cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation d'anticorps ou de fragement Fab libre ou immobilisé, comme défini dans la revendication 19, des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4136434B2 (ja) * 2002-04-17 2008-08-20 進 清野 インスリン産生細胞の誘導
WO2009078022A2 (fr) * 2007-12-17 2009-06-25 Izun Pharmaceuticals Corporation Combinaisons synergiques de facteurs de croissance à des compositions d'herbes destinées à améliorer la réparation tissulaire

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1389662A (en) * 1971-03-16 1975-04-03 Rabin B R Biological test

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOLOGICAL ABSTRACTS vol. 92, no. 9 , 1 Novembre 1991, Philadelphia, PA, US; abstract no. 97586, G. BAFFET ET AL. 'DISTINCT EFFECTS OF CELL-CELL COMMUNICATION AND CORTICOSTEROIDS ON THE SYNTHESIS AND DISTRIBUTION OF CYTOKERATINS IN CULTURED RAT HEPATOCYTES.' page AB-291 ; *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 104, no. 5, 3 Février 1986, Columbus, Ohio, US; abstract no. 32390j, J.-M. FRASLIN ET AL. 'DEPENDENCE OF HEPATOCYTE-SPECIFIC GENE EXPRESSION ON CELL-CELL INTERACTIONS IN PRIMARY CULTURE.' page 395 ; *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 112, no. 5, 29 Janvier 1990, Columbus, Ohio, US; abstract no. 33895e, A. TINGSTROEM ET AL. 'DISTRIBUTION AND DYNAMICS OF CELL SURFACE-ASSOCIATED CellCAM 105 IN CULTURED RAT HEPATOCYTES.' page 392 ; *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 114, no. 19, 13 Mai 1991, Columbus, Ohio, US; abstract no. 182615g, U. HOPF ET AL. 'GLYCOPROTEINS OF RAT LIVER PLASMA MEMBRANES: THEIR HEPATOCELLULAR, INTESTINAL AND RENAL EXPRESSION IN RAT, RABBIT AND HUMAN.' page 503 ; *
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA. vol. 83, no. 21, Novembre 1986, WASHINGTON US pages 8235 - 8239 W.J. GALLIN ET AL. 'ANTIBODIES TO LIVER CELL ADHESION MOLECULE PERTURB INDUCTIVE INTERACTIONS AND ALTER FEATHER PATTERN AND STRUCTURE.' cité dans la demande *
THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY vol. 115, no. 2, Octobre 1991, NEW YORK, N.Y., US pages 505 - 515 A. CORLU ET AL. 'A PLASMA MEMBRANE PROTEIN IS INVOLVED IN CELL CONTACT-MEDIATED REGULATION OF TISSUE-SPECIFIC GENES IN ADULT HEPATOCYTES.' *

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