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WO1993014111A1 - Novel compound ustiloxin a or b, or derivative thereof - Google Patents

Novel compound ustiloxin a or b, or derivative thereof Download PDF

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Publication number
WO1993014111A1
WO1993014111A1 PCT/JP1993/000018 JP9300018W WO9314111A1 WO 1993014111 A1 WO1993014111 A1 WO 1993014111A1 JP 9300018 W JP9300018 W JP 9300018W WO 9314111 A1 WO9314111 A1 WO 9314111A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ustyroxine
compound
salt
rice
hydrogen atom
Prior art date
Application number
PCT/JP1993/000018
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeo Iwasaki
Kuniko Koiso
Tomowo Kobayashi
Original Assignee
Sankyo Company, Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sankyo Company, Limited filed Critical Sankyo Company, Limited
Publication of WO1993014111A1 publication Critical patent/WO1993014111A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound having an antitumor effect, ustyroxin A or ustyroxin B, a derivative thereof, or a salt thereof (hereinafter, referred to as “us thyroxines”), and a method for producing them.
  • the rice koji disease fungus (Ustyraginoidea 'Virens Cooke') belongs to imperfect fungi, but a complete generation formed on the sclerotium has been observed, and Claviceps virens Sakurai and (Yadao Harada, Nissho Disease Report, Volume 3, p. 387 (1984)).
  • Ustilagino idinn A, B and C (Tadaharu Yabuta, Yusuke Sumiki, Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry, Vol. 9, p. 47S (1933)) and Ustilaginoidin D, E, F, G, I1, I and J (K. Koama and S. Natori, Chem. Pharm. Bull., Vol. 36, p. 146, (1988)) are known.
  • these compounds and the ustyroxins of the present invention are clearly different in physicochemical properties and structure.
  • Examples of the 13-membered ring compound having one ether bond and two peptide bonds in ⁇ include Phomopsisin A (Phomopsin A) produced from Phomopsis leptostromiformis (CLAUDE CJ CULVENOR et al., Tetrahedron, Vol. 45, No. 8, p. 2351 (1989)) is known. However, the structure of the side chain is completely different from usthyroxines.
  • the present inventors have found that the novel compounds ustiloxin A and ⁇ styroxine B, which are novel compounds isolated from rice koji, which naturally occurred in rice ears or artificially generated in rice ears, caused a strong antitumor effect.
  • the present inventors have found that the inducer has a strong antitumor effect, and have completed the present invention.
  • the present invention General formula
  • R 1 is In addition hydrogen atom an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • R 2 is an aliphatic Ashiru group having 2 to 6 water ⁇ resonator or carbon atoms
  • R 3 is methyl group or propyl group
  • R 1 is a water atom or a alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • R 2 is water, an atom or an aliphatic acyl group having 2 to 6 carbon atoms,
  • n R 3 is a methyl group or a pulp ⁇
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • examples thereof include straight-chain or branched-chain alkyl groups such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, and pentyl. It is preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and most preferably a methyl group.
  • R 2 is an aliphatic acetyl group having 2 to 6 carbon atoms
  • examples thereof include a linear or branched aliphatic acetyl group such as acetyl, propionyl, butyryl, valeryl, and hexanoyl.
  • it is an aliphatic acetyl group having 2 to 4 carbon atoms in a direct sale form or a branched sale form, and most preferably an acetyl group.
  • the compound represented by the above general formula (I) of the present invention can be converted into a salt according to a conventional method.
  • R 1 is a hydrogen atom, for example, salts of alkali metals such as lithium, sodium, and potassium; salts of alkaline earth metals such as magnesium, calcium, and barium; methylamine, ethylamine, dimethylamine, and dipyramine And salts of aliphatic primary to tertiary amines such as trimethylamine; salts of amino acids such as lysine and arginine; and ammonium salts.
  • it is a salt of an alkaline metal such as sodium or potassium.
  • R 2 is a hydrogen atom
  • salts of hydrohalic acids such as hydrofluoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid; nitrates; perchlorates; sulfates; Or an alkanesulfonic acid salt of a lower alkanesulfonic acid such as methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid or ethanesulfonic acid; a salt of an arylarylsulfonic acid such as benzenesulfonic acid or di-toluenesulfonic acid; glutamic acid or asparagine Organic acid salts such as salts of amino acids such as acids; salts of carboxylic acids such as fumaric acid, succinic acid, citric acid, tartaric acid, oxalic acid, and maleic acid; Preferably, it is a hydrochloride.
  • the optimal one is a pharmacologically acceptable i. '
  • the compound having the above general formula (I) has ⁇ isomerism.
  • all of these isomers are represented by the formula 5- . Therefore, the present invention includes all of these isomers and mixtures of these isomers.
  • a so-called “prodrug compound” which is derived into a compound having the general formula (I) in vivo
  • R 1 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 2 represents a hydrogen atom or an aliphatic acyl group having 2 to 4 carbon atoms
  • R represents a methyl group or a propyl group
  • a compound or a salt thereof A compound or a salt thereof.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom or an acetyl group
  • R 3 represents a methyl group or a propyl group
  • a compound or a salt thereof A compound or a salt thereof.
  • the compound No. 1-2.6.7.10, 16 or a salt thereof the thyroxine belonging to the genus Ustyraginoidea or the thyroxine B 'production ability
  • rice cypress A which has the ability to produce ustyroxin A or usty sigma xin ⁇ belonging to the genus Styraginoidea, is available from Ustilaginoidea virens (Cooke) Takahashi SAN 15391 strain.
  • R 1 represents a hydrogen atom
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 3 represents a methyl group
  • a compound ie, ustyroxin A
  • R 1 represents a hydrogen atom
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 3 represents a propyl group
  • the rice koji (koji grain) generated in the rice spike due to the infection of the rice koji disease fungus (Ustilaginoidea virens Cooke) in the rice field is collected.
  • the koji grains can be picked up by hand from the 'spreading ears' in the piloerection, air-dried indoors for about one week, and pulverized with a mill.
  • those stored in a refrigerator at around 5 ° C can also be used.
  • an extract containing thyroxine A or usthyroxine B can be obtained. This can be achieved by isolating and purifying Usuloxin A or Ustiloxin B from the product: 2. Utilizing its physicochemical properties. For example, it can be removed using an adsorbent. Examples of the adsorbent used include activated carbon or adsorbent resin Amberlite XAI3-2, XAD-4, XAD-7, etc.
  • cellulose such as Avicel (Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) or Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia) is used.
  • Effective methods include column chromatography, extraction using the difference in the partition ratio of solvents mixed with usthyroxine A or b, and the counter-current partitioning method.
  • Ustiloxin A or usthyroxin B can be separated and purified by repeatedly using the above separation and purification means alone or in an appropriate combination.
  • the rice two to six weeks before heading can be inoculated from above with conidia or chlamydospores of SANK 15391 to generate rice koji.
  • the conidiospore suspension can be obtained by transplanting the mycelium pieces into an Erlenmeyer flask containing a potato decoction medium for adding sucrose, and performing liquid culture under dark conditions at 26 ° C. for 12 to 20 days.
  • a surfactant 20, such as Tween This suspension was added 0.05% equivalent amount, field of rice, a method of approximately IL / ra 2 sprayed and inoculated from the top of the body is preferred.
  • the time of spray inoculation is preferably around 19:00.
  • Chlamydospores can be obtained by the following method. If ⁇ ⁇ if] Using a potato decoction medium at step 26 26: ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ !!! ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the chaos of the chlamydospores directly above the rice plant in the field can produce the koji.
  • the inoculation is preferably used a small dusting device, also, as the intake of 30 to 40 sheets per m 2 petri dish chlamydospores are preferred. ⁇
  • the inoculation time is preferably performed during the day.
  • test varieties There are no particular restrictions on the test varieties, but late-growing varieties such as No. 1 and Norin 21 are preferred.
  • Rice koji strain Ustilaginoidea virens (Cooke) Takahashi SAN K 15391 which makes rice koji can be isolated, stored and used as needed as follows. Immediately, spores (chlamydospores) are collected from rice panicles that show diseased and dark green symptoms, and are placed in a culture medium such as a potato-glu-use medium and cultured at 23 to 28 ° C for 1 to 2 days. . A part of this culture solution is taken, observed under a microscope, and spores that have begun to germinate are subjected to monospore separation using a manipulator.
  • a culture medium such as a potato-glu-use medium and cultured at 23 to 28 ° C for 1 to 2 days.
  • a suitable agar medium for example, potato dextrose agar medium, and cultured at 23 to 28 ° C, and the well-grown one is stored.
  • Growth on potato dextrose agar is slow, with initially white fluffy hyphae growing, but then dark greenish brown. It also produces a dark green soluble pigment in the medium.
  • the mycelium is colored and has partition walls. Its diameter is 2-0 to 5.0 ⁇ , the wall is very thick, dark green-brown, and often forms hyphal mass. Conidia occur in the symposiform type, and are 1 cell, colorless, 5.0-8.0 ⁇ 3.0-4.5 m. Chlamydospores found in rice koji are not observed.
  • R 1 represents an alkyl group
  • the compound is obtained as follows.
  • an esterification reaction with ustiloxin ⁇ or ustiloxin ⁇ and an alcohol such as methanol or ethanol with an acid.
  • the acid used in the reaction is not particularly limited.
  • mineral acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid, chloric acid, and perchloric acid; and organic acids such as formic acid and trifluoroacetic acid are preferred.
  • the reaction temperature and reaction time vary depending on the reagents and solvents used, but are usually 0-100. C can be converted to another alkyl group by transesterification in 1 to 24 hours.
  • the target compound After completion of the reaction, the target compound is obtained by distilling off the solvent from the reaction mixture and drying the residue. If an acid is used in excess of usthyroxine A or usthyroxine B as the starting compound, the target compound is obtained as a salt of the acid.
  • the target compound thus obtained can be further purified by recrystallization or ordinary column chromatography.
  • the reaction can also be achieved by reacting with diazoal compounds such as diazome.
  • the reaction is performed in the presence of a solvent.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not affect the reaction. Ethers such as getyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, and dimethoxetane; esters such as ethyl acetate; dimethylform Amides such as amides; sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; are preferred.
  • the reaction temperature and the reaction time vary depending on the reagents, solvents and the like to be used.
  • reaction temperature and reaction time are ffl. Although different, usually 0 to 0 ° C ⁇ L to time is suitable.
  • the solvent of the target compound is distilled off from the reaction mixture, and water and an organic solvent such as nitrile acetate are added to the residue to carry out liquid separation. It is obtained by concentrating the organic layer and purifying the residue by recrystallization or ordinary column chromatography.
  • R 2 represents an aliphatic acyl group
  • the compound is obtained as follows.
  • acylating agent used in the reaction for example, acid anhydrides such as acetic anhydride and propionic anhydride; and acid halides such as acetyl chloride and acetyl bromide are preferable.
  • the reaction is suitably performed in the presence of a solvent.
  • the solvent used is not particularly limited as long as it does not affect the reaction. For example, water, alcohols such as methanol and ethanol, or a mixed solvent thereof are preferable.
  • the reaction is performed in the presence of a base.
  • Examples of the base used include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; alkali metal carbonates such as sodium carbonate and potassium carbonate; sodium hydrogen carbonate and hydrogen carbonate Metal bicarbonates such as potassium sulfide; aromatic amines such as pyridine; heterocyclic amines such as proline; aliphatic amines such as triethylamine and getylamine.
  • the reaction temperature varies depending on the type of the acylating agent, etc. Usually, 0 to 50 ° C is preferable.
  • the reaction time varies depending on the reaction conditions, but is usually 1 to 5 hours.
  • the target compound thus obtained may be subjected, if necessary, to adsorption column chromatography using a carrier such as silica gel or florisil; reverse-phase partition chromatography using silica gel having octadecyl or octyl groups; Distribution column chromatography using frullose or SEPHADE "NOX Lii-20 [manufactured by FULL MACIA CORPORATION] or the like; Use a difference in the distribution ratio of the pure substance to the solvent to make the purification process easier.
  • a carrier such as silica gel or florisil
  • reverse-phase partition chromatography using silica gel having octadecyl or octyl groups
  • the compound of the present invention having the general formula (I) can be obtained by appropriately combining the reactions of the above 1) to 3).
  • R 1 is a hydrogen atom
  • compounds in which R 1 is an alkyl compound such as sodium hydroxide, hydroxide hydroxide, and other alkali metal hydroxides; and sodium carbonate, potassium carbonate, and other alkali metals. It can also be obtained by hydrolyzing in the presence of a metal carbonate.
  • the compound having the above general formula (I) thus obtained is further exemplified by an adsorption column chromatograph using a carrier such as silica gel or Florisil, and Fadex LH-20 (manufactured by Pharmacia). It can be purified by partition column chromatography used, high-performance liquid chromatography using normal phase or reverse phase columns, and the like.
  • Rice ears caused by the infection of rice koji fungus (Ustilaginoidea virens Cooke) :; spikelets that were spontaneously generated were collected. After drying, 100 g of the rice koji were pulverized in a mixer with 10 times the volume of water, and extracted by shaking at room temperature for i hours. 100 () ml of the extract was filtered, concentrated to one tenth, and applied to a 50 ml iDODS column (ODS-T. Senshiyu Kagaku (Sekiyu)).
  • the mixture was developed and eluted with 0.5 liter of a mixture of methanol and water at a ratio of 2:98, and 200 ml of the eluted fraction between 200 and 400 ml was collected to obtain a fraction containing ustiloxin A.
  • crude crystals of about 20 nig were obtained. When this crude crystal is recrystallized with water, the melting point
  • the ultraviolet absorption spectrum measured in water is as follows.
  • the nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in heavy water at 50 ° C using tetramethylsilane as an external standard is as shown below.
  • Nuclear magnetic spectrum (00 MHz) measured in heavy water using tetra-ethylsilane as an external standard is as follows.
  • Adsorbent silica gel plate Art. 5715 (Merck)
  • Koji grains were generated in rice plants by artificial inoculation, and Soxin A was isolated from O and purified.
  • the seedlings sown on April 14 were transplanted to Honda on May 20.
  • the cultivation density was: i. 75 plants per 3 m 2 , i. Fertilizer: nitrogen (N) as the basal dressing, phosphate (P 2 0,) and using the per 10a 8 Kg potassium to (K 2 0) as the component amount, the nitrogen (N) as a top dressing on July 14 2 kg was applied per llhi. Other methods followed the customary law.
  • Rice koji disease SANK 15391 strain was cultured, and chlamydospores formed after standing were obtained by the following method.
  • the mycelial suspension obtained by liquid culture at 26 ° C for 7 days using a potato decoction medium for sucrose was poured onto a potato decoction agar medium for sucrose so that it spreads thinly.
  • the cells were cultured in the dark at 25 ° C.
  • the rice spores were generated by inoculating the chlamydospores directly on the rice plant in the field.
  • rice spikelets were generated when sprayed on rice ears growing in the field and left for a certain period of time (about 2 months).
  • These rice koji were collected and uthyroxine A was isolated and purified in the same manner as described in Example 1.
  • About 1 mg of the target compound was isolated from 10 g of rice koji.
  • Example 2 5 mg of usthyroxine A obtained in Example 1 was dissolved in 0.5 ml of methanol containing 12% hydrochloric acid and released overnight at 4 ° (: overnight. The solution was concentrated under reduced E; After distilling off the agent, the desired product-m.m3 ⁇ 4 was obtained.
  • the nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured at 50 using tetramethylsilane as an external standard in deuterated dimethyl sulfoxide is as follows.
  • Koji grains were generated in rice by artificial inoculation, and ustyroxin B was isolated and purified from this.
  • the artificial inoculation was performed using the rice koji fungus SANK 15391 strain, and the inoculation was performed according to the method described in Example 2.
  • Ustyroxine B obtained in this example exhibited the following physical properties.
  • the infrared absorption spectrum measured with calcium fluoride (CaF) ⁇ film (film) is as follows.
  • Nuclear magnetic resonance spectra (500) measured in 5 () using 2,2-dimethyl-2-shiventan-5-sulfonic acid sodium (DSS) as an external standard in heavy water. MHz) is as shown below.
  • the nuclear magnetic resonance spectrum (100 ⁇ ⁇ ) measured in heavy water using DSS as the external standard is as follows.
  • Rf cruise: D.14 Adsorbent-Shiri gel plate 5715
  • Ustyroxine ⁇ and ustyroxine ⁇ of the present invention and their induction have an antitumor effect.
  • the compound having the s-general formula (I) is a novel compound which has not been described in the literature, and has a strong growth inhibitory effect on various human cancer cells.
  • E The compound having the general formula (r) is used as a medicament as a medicament, in a funeral hall, or in accordance with a conventional method, by itself or an appropriate pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent. They can be mixed and safely administered orally or parenterally in the form of powders, condyles, tablets, capsules, injections and the like.
  • the dose varies depending on the target disease, the administration route and the number of administrations. For example, the effective daily dose for adults is 1

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Description

明 ίϋ m
新規化合物 スチロキシン Aもしくはウスチロキシン Bまたはそれら 誘導^ [技術分野]
本発明は、 抗腫瘍作用を有する新規化合物ウスチロキシン Aもし くはウスチロ キシン Bまたはそれらの誘導体あるいはそれらの塩 （以下、 「ウスチロキシン類 」 という。 ） ならびにそれらの製法に関する。
[背景技術]
稲コウジ病菌 （ウスチラギノイデア ' ヴィ レンス ' コ一ク ： Usti laginoidea v irens Cooke ) は不完全菌類に属するが、 菌核上に形成される完全世代も認めら れており、 Claviceps virens Sakurai と称される （原田幸雄、 日植病報、 第 3 巻、 387 頁 （ 1984年） ） 。 稲コウジ病菌の代謝産物として Ustilagino idi n A 、 B 、 C (藪田貞治郎、 住木諭介、 日本農芸化学会誌、 第 9 巻、 47S 頁 （1933 年） ） および Ustilaginoidin D 、 E 、 F 、 G 、 I1 、 I 、 J ( K. Ko ama and S . Natori 、 Chem. Pharm. Bull.、 第 36 巻、 146 頁、 （1988年） ） が知られている 。 しかし、 これらの化合物と本発明のウスチロキシン類とは理化学的性質および 構造が明らかに異なる。
また、 璟内に 1 個のエーテル結合と 2 個のペプチド結合を有する 13 員環 化合物としては、 例えばカビの一種 Phomopsis leptostromiformis から生産さ れるフォモブシン A (Phomopsin A) ( CLAUDE C. J. CULVENOR ら、 Tetrahedr on、 第 45 巻、 8 号、 2351頁 （1989 年） ） が知られている。 しかし、 その側鎖 の構造はウスチロキシン類とは全く異なる。
[発明の開示]
本発明者らは、 稲コウジ病菌により、 自然的に稲穂に発生したまたは人為的に 稲穂に発生せしめた稲コウジから単離された新規化合物ウスチロキシン A及びゥ スチロキシン Bが強い抗腫瘍作用を有することを ¾出すとともに、 それらの化学 修飾による誘¾体も強い抗腫瘍作用を有することを見出して本発明を完成した。 本発明は、 一般式
Figure imgf000004_0001
(式中、
R 1 は水素原子またば炭素数 1乃至 5個を有するアルキル基、 R 2 は水桌原子または炭素数 2乃至 6個を有する脂肪族ァシル基、 R 3 はメチル基またはプロピル基
を示す。 ）
で示される化合物またはその塩に関し、
さらに好適には、
上記の一般式 （I ) において、
一般式
Figure imgf000004_0002
(式中、
R 1 は水 原子または炭素数 1乃至 5個を有するマルキル基、
R 2 は水, 原子または炭素数 2乃至 6個を有する脂肪族ァシル基、
n R 3 はメチル基またはプ口ピル ί
を示す。 ）
で示される化合物またはその塩に関する。
R 1 が炭素数 1乃至 5個を有するアルキル基である場合、 例えばメチル、 ェチ ル.、 プロビル、 ブチル、 tーブチル、 ペンチルなどの直鎖状もしくは分技鎖状の アルキル基があげられる。 好適には炭素数 1乃至 3 ί固を有する直鎖状もしくは分 技鎖状のァルキル基であり、 最適にはメチル基である。
R 2 が炭素数 2乃至 6個を有する脂肪族ァシル基である場合、 例えばァセチル 、 プロピオニル、 プチリル、 バレリル、 へキサノィルなどの直鎖状もしくは分枝 鎖状の脂肪族ァシル基があげられる。 好適には炭素数 2乃至 4個を有する直銷状 もしくは分枝銷状の脂肪族ァシル基であり、 最適にはァセチル基である。
本発明の前記一般式 （ I ) で示される化合物は、 常法にしたがって塩とするこ とができる。
そのような塩としては R 1 が水素原子の場合、 例えばリチウム、 ナトリウム、 カリウムなどのアルカリ金属の塩；マグネシウム、 カルシウム、 バリウムなどの アルカリ土類金属の塩； メチルァミン、 ェチルァミン、 ジメチルァミン、 ジブ口 ピルァミン、 卜リメチルァミンなどの脂肪族第 1乃至第 3ァミンの塩； リジン、 アルギニンなどのアミノ酸の塩； アンモニゥム塩；等の塩をあげることができる 。 好適にはナトリゥム、 力リゥムなどのアル力リ金属の塩である。
また、 R 2 が水素原子の場合、 例えば弗化水素酸、 塩酸、 臭化水素酸、 ヨウ化 水素酸などのハロゲン化水素酸の塩；硝酸塩；過塩素酸塩；硫酸塩；燐酸塩；等 の無機酸塩、 またはメタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 ェタン スルホン酸などの低級アルカンスルホン酸の塩； ベンゼンスルホン酸、 Ρ-卜ルェ ンスルホン酸などのァリールスルホン酸の塩； グルタミン酸、 ァスパラギン酸な どのアミノ酸の塩； フマール酸、 コハク酸、 クェン酸、 酒石酸、 蓚酸、 マレイン 酸などのカルボン酸の塩；等の有機酸塩を挙げることができる。 好適には塩酸塩 である。
これらの塩において、 最適なものは薬理上許容しうる i である。 ' なお、 前^一般式 （ I ) を有する化合物は、 ^々 異性 を有する， 前記一般 式 （ I ') を有する化合物においてはこれらの ¾性体がすべて 5-—の式で示されて いる。 従って、 本発明においてはこれらの異性 ίおおよびこれらの異牲体の混合物 をもすベて含むものである。
更に、 本発明の前記一般式 （I) を有する化合物においては、 生体內において 前記一般式 （ I) を有する化合物に誘導される、 いわゆる 「プロドラッグ化合物
」 もすベて含まれるものである。
前記一般式 （ I ) を有する化合物:こおいて、
好適には、
R 1 が水素原子または炭素数 1乃至 3個を有するァルキル基を示し、
R 2 が水素原子または炭素数 2乃至 4個を有する脂肪族ァシル基を示し、
Rュ がメチル基またはプロピル基を示す、
化合物またはその塩である。
a¾適に t 、
R1 が水素原子またはメチル基を示し、
R2 が水素原子またはァセチル基を示す、
R3 がメチル基またはプロピル基を示す、
化合物またはその塩である。
本発明の前記一般式 （I) を有する化合物の具体例としては、 例えば下記の表 に記載する化合物をあげることができる。
【表 1】
化合物番号 R 1 R R
1 H H M e つ H A c M e
3 H P r n M e 4 H B y r M e 5 H C O (CH CH M e 6 e H M e 7 M e A c M e 8 M e P r n M e 9 M e B y r M e 0 E t H M e
E t Ac M e
1 2 P r H M e 1 3 P r A c M e 1 4 B u H M e 1 5 B u A c M e 1 6 H H P r 但し、 表中
H =水素 Κί子、 M e =メチル、 E t =ェチル、
Ρ r =プロピル、 B u =ブチル、 A c =ァシル、
P r n =プロピオニル、 B y r =ブチリル
基を示す。
上記化合物^中、 好適には例示化合物番号 し 2 、 3 、 G . 7 . 1 0 . 1 1 , 1 12 、 1 . I 6またはその塩である。
最適には ί 1示化合物番号 1 - 2 . 6 . 7 . 1 0 、 1 6またはその塩てある， 本発明ば、 また、 ウスチラギノイデア属に属する スチロキシン Αまた ウス チロキシン B '生産能を有する稲コウジ病菌を用いて稲に稲コウジを発生せしめ、 該稲コウジよりウスチロキシン Aまたはウスチロキシン Bを単離することを特徴 とする、 ウスチロキシン Aまたはウスチロキシン Bの製造法に関し、 好適には、 スチラギノ ィデァ属に属するウスチロキシン Aまたはウスチ σキシン Β生産能 を有する稲コウジ丙囷が、 Ustilaginoidea virens (Cooke) Takahashi SAN 15 391 株 （微ェ研条寄第 3631号： BP-3691 である上記製造法に関する。 ' 1 ) 本発明の前記一般式 （ I ) を有する化合物のうち、
R 1 が水素原子を示し、
R 2 が水素原子を示す、
R 3 がメチル基を示す
化合物 （即ち、 ウスチロキシン A ) 、 または、
R 1 が水素原子を示し、
R 2 が水素原子を示す、
R 3 がプロピル基を示す、
化合物 （即ち、 ウスチロキシン B )
は次のようにして得られる。
即ち、 稲田において稲コウジ病菌 (Ustilaginoidea virens Cooke)の感染によ り稲穗に発生した稲コウジ （コウジ粒） を採取する。 コウジ粒は、 立毛中の'展病 穂から手で取り、 室内で約 1週間自然乾燥し、 粉 機で粉砕した後に使用するこ とができる。 また、 粉砕後に、 5°C前後の冷蔵庫で保存したものを使用すること もできる。
このものより、 水、 メタノール、 エタノールなどのアルコール類、 酢酸ェチ儿 などの有機酸ェ又テル類、 アセトン、 メチルェチルケトンなどのケトン類を単独 または組み合わせて用いて抽出することにより、 ウスチロキシン Aまたはウスチ ロキシン Bを 有する抽出物を得ることができる.， このようにして得られた抽出 物から、 ウス ロキシン Aまたはウスチロキシ ン Bを荦離、 精製すろ:二 、 そ . 物理化学的性状を利 ¾することによつて達成される。 例えば. 吸着剤を ¾いて ¾ 取することができる。 使用される吸着剤としては例えば、 活性炭、 または吸着樹 脂であるアンバーライ 卜 XAI3— 2 、 XAD- 4 、 XAD - 7 等 （ローム - アン ド ■ '\ —ス社製） 、 ダイアイオン HP 10、 HP 20 、 IIP 50 、 CHP 20P (三菱化成 （株） 製） 、 ポリアミ ドゲル （ エルム社製） 等が使用される。 ウスチロキシン Aまた はウスチロキシン Bを含む抽出液を上記の吸着剤の層を通過させてウスチロキシ ン Aまたはゥスチロキシン Bを含む液に含まれる不純物を吸着させて取り除くか 、 またはウスチロキシン Aまたはウスチロキシン Bを吸着させた後、 適当な溶剤 で溶出することによって得られる。 このようにして得られたウスチロキシン Aま たはウスチロキシン Bを更に精製するためにはアビセル （旭化成工業 （株） ） な どのセルロース、 セフアデックス LH - 20 (フアルマシア社製） などを用いた分 配カラムクロマトグラフィー、 ウスチロキシン Aまたはウスチロキシン Bと混在 する不純物との溶剤に対する分配率の差を利用した抽出法、 または向流分配法な どが有効な方法である。
以上の分離、 精製の手段を単独または適宜組み合わせ、 反復用いることにより ウスチロキシン Aまたはウスチロキシン Bを分離、 精製することができる。
あるいは、 本発明者らにより単離された稲コウジ病菌株 Ustilaginoidea vir ens (Cooke) Takahashi SANK 15391 の胞子懸濁液を圃場に成育している稲穂に 噴霧して一定期間後に発生させた稲コウジを用いて上記と同様にしてウスチロキ シン Aまたはウスチロキシン Bを得ることができる。
この場合、 出穂 2〜 6週間前の稲に SANK 15391の分生胞子または厚膜胞子を上 から噴霧接種し、 稲コウジを発生させることができる。
分生胞子の懸濁液は、 ショ糖加用ジャガイモ煎汁培地を入れた三角フラスコに 菌糸片を移植し、 26°Cの暗黒条件下で 12~ 20日間液体培養して得ることができる 。 この懸濁液にツイーン 20等の界面活性剤を 0. 05% 相当量添加し、 圃場のイネ、 体の上から約 I L/ra2 噴霧接種する方法が好ましい。
また、 噴霧接種の時刻は、 19時頃が好ましい。
厚膜胞子は、 以下の方法により得ることができる。 ョ搪加 if]ジャガイモ煎汁培地を用いて 26でて 間液 ίί:培養して得た菡糸]! 濁液を、 ショ搪加 ジャガイモ煎汁寒天培地上に薄く がるよ に流し込み. ^
2Γじの暗黒条 ί牛で培養する。
最初の 1週間位は分生胞子を形成するが、 それ以降は!？膜胞子が形成される このような条件下で 1〜3か月間培養後、 ベトリ ]10 ふたをとつた状態て 22 C 內外の室內に 7日間放置し、 乾燥させたものを培地ごとミキサーで粉砕し、 所望 の厚膜胞子を得ることができる。
この厚膜胞子を直接圃場のィネ体の上から接沌することにより稿コウジを ¾生 .させることができる。 接種には、 小型散粉器を用いるのが好ましく、 また、 摂取 量としては、 m2当たりペトリ皿 30〜40枚分の厚膜胞子が好ましい。 ·
接種時刻は、 日中行うのが好ましい。
供試品種としては、 特に制限はないが、 とりで 1号、 農林 2 1号などの晩成品 種が好ましい。
稲'コウジを作る稲コウジ菌株 Ustilaginoidea virens (Cooke) Takahashi SAN K 15391 は次のようにして単離、 保存し必要に応じて使用することができる。 即 ち、 羅病し暗緑色に病徴を示した稲穂から胞子 （厚膜胞子） を採取し、 これをポ テトグルユース培地などの培養液に入れ 23 〜28 °Cにて 1〜2 日間培養する。 この培養液の一部を取り、 顕微鏡下で観察し、 発芽しはじめている胞子をマニブ レータにて単胞子分離を行なう。 これを適当な寒天培地、 例えばポテトデキスト ロース寒天培地上にとり 23 〜28 °Cで培養し充分成育したものを保存してお く。 ポテトデキストロース寒天培地上での成育は緩慢で、 はじめは白色綿毛状の 菌糸が成育するがやがて暗緑褐色となる。 また、 培地中にも暗緑色の可溶性色素 を産出する。 菌糸は有色で隔壁を有し、 その径は 2- 0〜5. 0 μ ιη で壁が非常に 肥厚し暗緑褐色を示し、 菌糸塊を形成するものが多く見られる。 分生子はシンポ ジォ型に生じ、 1 細胞、 無色で 5. 0〜 8. 0 Χ 3. 0〜 4. 5 m である。 稲コウジ に見られる厚膜胞子は観察されない。
なお、 これらの諸性状は撟岡らの報告 （埼玉県立農業試験場研究報告第 2 号 1〜20 頁、 〖351 年出版） に詳細に記述されている。
本発明者らにより単離された稲コウジ病菌 Ust i lagino idea virens iCooke) Takahashi SA K15391 は、 通産省工業技術院微生物工業技術研究所に国際寄託 されている （寄託番号、 微ェ研条寄第 36!H ^ i FERM BP- 36!31 ) ：寄託日 1991 年 12 月 24 曰） 。
2 ) 本発明の前記一般式 （ I ) を有する化合物 όち、
R 1 がアルキル基を示す、
化合物は次のようにして得られる。
即ち、 ウスチロキシン Αまたはウスチロキシン Βとメタノール、 エタノールの ようなアルコール類を甬いて、 酸でエステル化反応を行なうことによつて達成さ れる。 反応に使用される酸としては、 特に限定はなく、 例えば硫酸、 塩酸、 塩素 酸、 過塩素酸のような鉱酸； ギ酸、 トリフルォロ酢酸のような有機酸；が好まし レ、。 反応温度、 反応時間は使用する試薬、 溶剤等で異なるが、 通常、 0 〜100 。C 、 1 〜24 時間、 でエステル交換反応により他のアルキル基に変換できる。
反応終了後、 目的化合物は反応混合物から溶剤を留去し、 残渣を乾燥すること により得られる。 ウスチロキシン Aまたはウスチロキシン Bを原料化合物として 酸を過剰に用いた場合は目的化合物は酸の塩として得られる。 このようにして得 られた目的化合物は更に再結晶または通常のカラムクロマトグラフィーに付して 精製することができる。
あるいはジァゾメ夕ンのようなジァゾアル力ン類と反応させることによつても 達成される。 反応は溶剤の存在下で行なわれる。 使用される溶剤としては反応に 影響を与えないものであれば特に限定はなく、 ジェチルエーテル、 テ卜ラヒドロ フラン、 ジォキサン、 ジメ トキシェタンのようなエーテル類；酢酸ェチルのよう なエステル類； ジメチルホルムアミ ドのようなアミ ド類； ジメチルスルフォキシ ドのようなスルフォキシド類；が好ましい。 反応温度、 反応時間は使用する試薬 、 溶剤等で異なるが、 通常、 室温〜 50で、 1 〜24時間が好適である。
あるいは R 1 が水素原子を示す化合物をアルキル化することによって得ること もできる。 反応は炭酸カリウム、 炭酸ナト リウムのようなアルカリ金属炭酸塩の 存在下、 ヨウ化メチル、 ヨウ化工チルのようなハロゲン化アルキル化合物と反応 させる。 反応は溶剤の存在下で行なわれる。 使用される溶剤としては反応に影響 — を与えないも であれば特に限定はなく、 テトラヒ ドロフラン、 ジォキサン、 ジ メ トキシェ 'ノンのようなエーテル類： ジメチルホ；レムアミ ド ょ όなアミ ド類； ジメチルスルフォキシドのようなスルフォキシド類；が好まし 、 , 反 温度 反 応時間は使 fflする試薬、 溶剤等で異なるが 通常、 0 〜 0 °c\ L 〜 時間が 好適である。
反応終了後、 目的化合物は反応混合物から溶剤を留去し、 残渣に水および酢酸 ニチルのような有機溶剤を加えて分液する。 有機層を濃縮し、 残渣を再結晶また は通常のカラムクロマトグラフィーに付して精製することにより得られる-
3 ) 本発明の前記一般式 f l ) を有する化合物のうち、
R 2 が脂肪族ァシル基を示す、
化合物は次のようにして得られる。
即ち、 R 2 が水素原子を示す化合物の一級アミノ基を塩基の存在下で選 的に ァシル化することによって得られる。 反応に使用されるァシル化剤としては， 例 えば無水酢酸、 無水ブロピオン酸のような酸無水物；ァセチルクロリ ド、 ァセチ ルブロミドなどの酸ハライ ド；が好適である。 反応は溶剤の存在下で好適に行な われる。 使用される溶剤としては反応に影響を与えなければ特に限定はなく、 例 えば水、 メタノール、 エタノールのようなアルコール類またはこれらの混合溶荊 が好ましい。 反応は塩基の存在下で行なわれる。 使用される塩基としては例えば 水酸化ナトリウム、 水酸化力リウムのようなアル力リ金属水酸化物；炭酸ナ卜リ ゥム、 炭酸カリウムのようなアルカリ金属炭酸塩；炭酸水素ナトリウム、 炭酸水 素力リゥムのようなアル力リ金属重炭酸塩； ピリジンのような芳香族ァミン類； プロリンのような複素環ァミン類； トリェチルァミン、 ジェチルァミンのような 脂肪族アミン頹；が好ましい。 反応温度はァシル化剤の種類などによって異なる 力 通常は 0〜50°Cが好ましい。 反応時間は反応条件で異なるが通常 1〜5 時間 である。
このようにして得られた目的化合物は必要に応じて、 シリカゲル、 フロリジル などの担体を Πいた吸着カラムクロマトグラフィー；ォクタデシル基、 ォクチル 基などを有するシリカゲルを用いた逆相分配クロマトグラフィー； アビセル （姐 化成工業 （株） 社製） などの亡ルロースまたはセフアデ"ノクス Lii -20 【フ？ル マシア社製） などを fflいた分配カラムクロマ卜 ラフィー；あるいは混在する不 純物との溶剂に対する分配率の差を利 ¾した拙出 なビて精製すろ二とがてきろ
4 ) 本発 の前記一般式 （ I ) を有する化合物は上記 1 ) 〜3 ) の反応を適宜 組み合わせる二とによって得られる。
また、 R 1 が水素原子であ'る化合物は、 R 1 がアルキルである化合物を水酸化 ナトリウム、 水酸化力リゥムなどのアル力リ金¾水酸化物；炭酸ナトリウム、 炭 酸カリウムなどのアルカリ金属炭酸塩；の存在下で 水分解することによつても 得られる。
このようにして得られた前記一般式 （ I ) を有する化合物は、 更にシリカゲル 、 フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマ卜グラフ'ィー、 亡ファデッ クス LH - 20 (フアルマシア社製） などを用いた分配カラムクロマトグラフィー 、 および順相、 逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製するこ とが出来る。
[発明を実施するための最良の形態]
次に実施例、 試験例を挙げて本 ¾明を更に具体的に読明すろが 太 ¾明 二れ らに限定されるものではない。
実施例 1 . ゥスチロキシン A
稲コウジ病菌 （ Ustilaginoidea virens Cooke) の感染により稲穂:;：自然発生 した稲コウジを採集し、 乾燥後、 100 g を 10 倍 ¾の水と共にミキサーで粉砕し 、 室温で i 時間振とう抽出した。 抽出液 100() ml をろ過後、 十分の一に濃縮 し 50 ml iDODS カラム （ODS- T . センシユウ科学 （探） 製） に 入し た。 紫外吸収 254 nm でモニタ一しながら、 水 2. 5 リ ッ トル、 メタノール：水 = 2 ： 8 の混 液 2. 5 リ ッ トル、 100 %メタノール 1. 5 リ ッ トルで展開溶出 した。 メタノール：水 = 2 ： 8 の混合液で溶出した分画を集め、 濃縮した。 この 濃縮物を水に溶解後、 再度 30 ml の 0DS カラムに注入した。 メタノール：水 = 2 ： 98 の混合液 0. 5 リッ トルで展開溶出し、 分画 200 ml から 400 ml の 間の溶出分 200 ml を分取し、 ウスチロキシン Aを含む分画を得た。 これらの分 画を濃縮すると約 20 nigの粗結晶が得られた。 この粗結晶を水で再結晶すると 融点
195 °C (分解） を有する目的化合物の純品 14 mgが結晶としてが得られた。 本実施例で得られたウスチロキシン Aは、 以下の物性値を示した。
1 ) 構造式
NH-CH2-C00H
H00C
Figure imgf000014_0001
) 物質の性状：水溶性、 白色針状結晶
) 分子式： C23 Η,, 0,Ξ Ν5 :·;
) 分子- ： 673
) 質量分析： FAB- MS ； m/z 674 (M+H! ：
HR FAB- S ； m/2 674.2730 (M+H! (理論値 674.2718 ) 元素分析： C28 II .,3 012 . S 2.5 il2 ()として （％)
実測姐： 46.69 ； H &.92 ； 、 ：).64 S、 4.23 理論値： 46.80 ； H 6.82 ； 、 9.75 S、 4.45
) 紫外線吸収スペク トル： ん max nm ( ε )
水中で測定した紫外線吸収スぺクトルは、 次に示す通りである。
207(21300)、 249 (6000) . 287 (3200)。
) 赤外線吸収スぺク トル： ： y max cm"1
臭化力リゥム（KBr) 錠剤法で測定した赤外線吸収スぺクトルは、 次に示 す通りである。
3700~2400 (broad) 、 1650、 1640、 1540、 1500、 1465、 1400、 1295、 1225、 1155、 1130、 1090. 1030, 900 。
) —核磁気共鳴スペクトル： （ δ ; ρρπι )
重水中、 外部基準にテトラメチルシランを使用して 50 °Cで測定した核 磁気共鳴スペクトル （500 MHz) は、 次に示す通りである。
0.80 (311, d,J=7.0 Hz) , 0.88 (3Η, d, J=7.0 Hz), 1.09 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.73(lH，dd,J=7.2および 14.2 Hz) 、 1.77 (3H,s) 、
1.532(111, dd,J=7.0および 10.0 Hz) 、
2.12(lH,ddd,J=3.0,8.0 および 15.0 Hz) 、
2.22(111, ddd,J=8.0，10.0および 15.0 Hz) 、
2.24(lll,dd，J=7.2および 14.2 Hz) 、 2.77(3H,s) 、
3.04(lll，dd,J=3.0および 13. & Hz) 、
3.33(lH,dd,J=10.0 および 1:5.6 Hz) 、
3.73(211, s), 4.01 (1H. dd, J=4.0 および 8·ί) Hz)、 ' 4. I3i"lH,d. J=ll). () IIz 4.23 (Hi, J, J=H). Π Hz!
4.33 1【， tt .i=3.0および 10.0 Hz) l.S 11i[.si .
4.96il[l,d,.J=ll).0 Hz), 7. LI (lILs) 7.61(lH,s)
) 13C 核磁気共鳴スぺク トル ： S ; ppm I
重水中、 外部基準にテトラ- チルシランを使用して測定した核磁気共嗚 スペントル 00 MHz) は、 次に示す通 である。
7.8(q 17.9 (q) 13.3 (q) > 2i.1 iq) 28.7(d)
22.1 ((} 2) , 36.7it) , 43.8 (t) . 52.7(d) 59.6(d) .
60.1(d) 63.8(d) 64.8(t) 66.7(d) 73.9(d)
87.2 (s) 114.0(d), 124.2(d) 128.0(s). 13G.4(s)
146.0(s), 152.2 (s)、 16B.4(s). 170.3(s)、 m.o(s)、
174.4 (s), 176.3(s)0
) 溶解性：
水に易溶、 含水メタノールに可溶。
) 呈色反応：
ニンヒドリンに陽性。
) 薄層クロマトグラフィー：
Rf 値； 0.16
吸着剤； シリカゲルプレー卜 Art. 5715 (メルク社製）
展開溶剤； π ブタノール：酢酸：水 = 3 : 1： 1
検出；紫外線 254 nra およびニンヒドリン発色。
) アミノ酸分析：
6 N塩酸で 11ひ °C 20 時間加水分解後、 反応混合物より溶剤を留去 した。 ^られた残渣をアミノ酸分析機で分析し、 パリンとグリシンを検出 した。 バリンについて高速液体クロマトグラフィーで分析した結果 > L— バリンに一致した。
カラム ； Enantio L1 (4.6 mm ID X250 、 東ソ （株） 社製'） 溶剤； 0.8 mM CuSOi
am' ϊ 流 ill； 1 ml / '→
検 ；赤外線 25ϋ nm -.
実施例 2 . 'スチロキシ ン A
人工接種により稲にコゥジ粒を発生せしめ、 このも Oより ス キシン Aを 単離、 精製した。
稲は以下の方法で育成した。
4月 14日に播種した苗を 5月 20日に本田に移植した。 栽培密度は ： i. 3m2当たり 75株とし、 i侏 1本上とした。 肥料 : 基肥として窒素（N) 、 ン酸 (P20, ) およ びカリ（K20) を成分量として 10a 当たり各 8Kgを使用し、 7月 14日に追肥として 窒素（N) を llhi 当たり 2Kg 施用した。 その他方法は、 慣行法に従った。
稲コウジ病菡 SANK 15391 株を培養し、 以下の方法により、 放置後形成した厚 膜胞子を得た,，
ショ糖加用ジャガイモ煎汁培地を用いて 26°Cで 7日間液体培養して得た菌糸懸 濁液を、 ショ糖加用ジャガイモ煎汁寒天培地上に薄く広がるように流し込み、 約
25°Cの暗黒条件で培養した。
最初の 1週間位は分生胞子を形成じたが、 それ以降は厚膜胞子が形成された。 このような条件下で 1 ~ 3か月間培養後、 ペトリ皿のふたをとつた状態で 22 内外の室内に 7日間放置し、 乾燥させたものを培地ごとミキサーで粉砕し、 厚膜 胞子を得た。
この厚膜胞子を直接圃場のィネ体の上から接種することにより稲コゥジを発生 させた。 すなわち、 圃場に成育している稲穂に噴霧し、 一定期間 （約 2 ヶ月） 放置しておくと稲コウジが発生した。 これらの稲コウジを採集し、 実施例 1 . 記 載と同様の方法によりウスチロキシン Aを単離、 精製した。 10 g の稲コウジか ら約 1 mg の目的化合物を単離した。
本実施例で得られたウスチロキシン Aの物性値は実施例 1 . で得られたウスチ ロキシン Aの物性値と同じであった。
実施例 3 . ウスチロキシン Aジメチルエステル ' ジ塩酸塩
実施例 1で ί られたウスチロキシン A 5 mg を 12 % 塩酸を含むメタノー ル 0. 5 ml に溶解し、 4 ° (： で一夜放^した。 この溶液を減 E下で濃縮し、 ； 剤を留去すろと目的化 -き物 . m¾ が得られた，
■■V ロキシン Aジメ ルエス · ジ塩酸 の物性値 次 通 nである
1 ) 構造式
Figure imgf000018_0001
2 ) W—核磁気共鳴スぺクトル： （ 5 ； ppm )
重ジメチルスルホキシド中、 外部基準にテ卜ラメチルシランを使用して 50 でで測定した核磁気共鳴スペクトル （500 MHz) は、 次に示す通りで
$> O o
0.77(3H,d)、 0.83(3H,d) 、 1.02 (3H,dd), 1.43(3H,s) 1.87 (lH,m) , 1.98 (2H,m), 2.08(lH，dd)、 2.43 (3H, s) 、 2.79(lH,dd) 、
3.04 (III, dd) 、 3.61 (3H,s) 、 3.74(3H,s)\ 3.82(3H,m) . 4.07(lH,m) 、 4.22(lH,dd) 、 4.47(1H, ddK 4-83(lH,d). 4.93(lH,dd) 、
6.51(lH，s)、 7.07(1H, s)
3) 薄層クロマトグラフィー：
Rf ϋ； 0.33
吸着剂； シリカゲルブレー卜 Art. 5715 (メルク社製）
展開溶剤； n—ブタノール ： メタノール：水 = 3： 1 : 1 。
実施例 4. ' - ーァセチルウスチロキシン A · ジ十トリウム塩
実施例 1で f-iられたウスチロキシン A 5.4 mg を 2 % 炭酸水素ナトリウム 水溶液 0.5 ml に溶解し， 無水舴 IIを過剰量加え. 0 で で 2 時間揎拌した' 。 反応混合物を 炭酸水素-トトリ 1^ム水溶液で中和後、 グイャィォ二 HP 2 力 ラム （三菱化成 （株） 社製） 2 m l に吸着させた。 マタノ一ルを展開溶剤として 用いて溶出し、 目的化合物を含む分画を集めた， この分画を減圧下で濃縮し、 溶 剤を留去し乾燥すると、 目的化合物 4 · 6 が得られた .，
4 ' — N -ァセチルウスチロキシン A · ジナ卜 リウム塩の物性値は次の通りで 3 。
1 ) 構造式
NaOOC
Figure imgf000019_0001
2 ) 呈色反応：
ニンヒ ドリンに陰性。
3 ) 薄層クロマトグラフィー：
Rf ί【β； 0. 39
吸着剂； シリカゲルプレー卜 Art. 5715 (メルク社製）
展開溶剤； n—ブタノール： メタノール：水 = 3： 1 : 1 。
実施例 5 . ウスチロキシン B
人工接種により稲にコウジ粒を発生せしめ、 このものよりウスチロキシン Bを 単離、 精製した。 なお、 人工接種には、 稲コウジ病菌 SANK 15391 株を使用し、 接種方法は、 実施例 2に記載の方法に従つた。
稲穂に発生した稲コウジを採集し， 乾燥後、 10D g を 10 倍量の水と共にミキ サ一で粉砕し、 室温で 1 時間振とう抽出した。 抽出液 1000 ml をろ過後、 十 分の一に濃縮し、 50 ml の ODS カラム （ODS- SS- 1 ()2ϋ Τ 、 センシユウ科学 （株、 製） に注入した。 紫外吸収 254 am てモ二：' '一しながら、 水 2.5 リツ トル、 ス クノ一,'レ：水 =2 ： 8 の混合液 2.5 に 卜 .'L-、 ίθί) % Ά々ノール ί.δ リ 'ソ ト ルで展開溶出した。 メタノール ：水 =2 ： 8 の g会液で溶出した分画を集め、 濃 縮した。 この濃縮物を水に溶解後、 再度 30 ml の 0DS カラムに注？、した。 クノール：水 =2 ： 98 の混合液 D-5 リ ッ ト で展開溶出し、 ウスチロキシン Aより先に流出するウスチロキシン Bを含む分 ί®を得た この分画を再度、 ODS カラムに; ΐ入し、 メタノール：水 = 1 ： 33の混合液で展開溶出し、 祖ウスチロ キシン Β粉末を得た。 この祖粉末を、 0DS カラム:こ注入し、 0.02¾ のトリフルォ 口酢酸を含む、 メタノール：水 = 25:75 の混合液で溶出展開し、 ウスチロキシン Βの精製画分を得た。 稲こうじ 100 g 当たり約 3 mgのウスチロキシン Bが得 られた。
本実施例で得られたウスチロキシン Bは、 以下の物性値を示した。
1 ) 構造式
Figure imgf000020_0001
2 ) 物質の性状：水溶性、 白色固体
) 分子式： C2SH39NS 012 S
) 分子量： G 45
) 質量分析： FAB-MS: m/z 646 (M+H)
) 旋光度： +14.1 ° (c=0.55, H20)
) 紫外吸収スペクトル： ； Lmax nm( ε )
水中で測^した紫外線吸収スぺク卜ルは、 以ドに示す通りである; !13：)1)()) , 252 ίηΟΟΠ' . 290 !2501)1
8 赤外線吸収スぺク トル ： ν cm"1
弗化カ ルシウム （CaF) ^膜 （フ ルム） で測定した赤外線吸収スペク トル は. 次に示す通りである
37(M)〜24()0 (broad)， 1670, 1B00, 1550, 151)0, 1465. 1430, 1380, 1290, 1200, 1140
9 ) 'Η- 核磁 ¾共鳴スぺクトル ： （ δ ； ρρπι )
重水中， 外部基準に 2,2- ジメチル -2- シ ベンタン- 5- スルホン酸ナ卜リ ゥム （ D S S ) を使用して 5()でで測定した核磁気共鳴スぺク卜ル（500 MHz) は、 次に示す通りである。
().92(3H,d(i, J=7.2, 7.2Hz) , 1.14(311, d, ,J=7.0Hz) , .63(1H, dq, J=14.0, 7.2Hz) , l.BS (3H, s)， 2.01 (1H, ddd, J=3.(), 15.0, 8.0 Hz) , 2.0δ(1Η, dq, J= 14.0, 7.2 Hz) , 2.12 (1H, ddd, ,】=10.0， 15.0, 4.0Hz) , 2.60(3H, s) , 2.96(1 H, dd, J=13.4, 2.8Hz) , 3.30 (1H, dd, J=13.4, 10.0Hz) , 3.70 (1H, d, J=17.0H z), 3.76(1H, d, J=17.0Hz), 3.90(1H, d, J=10.0Hz), 3.90(1H, dd, J=8.0, 4. 0Hz) , 4.29 (11し m, J=2.8, 10.0, 3.0, 10.0Hz) , 4.37 (1H, q, J=7. OHz) , 4.65 (1 H,s)， 4.80(111, d, J=10.0Hz) , 7.28(1H, s) , 7.47(1H, s)
1 0) 13H-核磁気共鳴スペク トル （ δ ;ρρπι)
重水中、 外部標準に D S Sを使用して測定した核磁気共鳴スペク トル （100 ΜΗ ζ ) は、 次に示す通りである。
8.36(q) , 1B.72 (q) , 22.24 (q) , 31.68(t) , 33.00 (q) , 37.0S(t) , 44.24 (t) , 50.00 (d) , 53.16(d), 60.26 (d), 64.22 (d) , 65.11(t), 68.15(d), 74.70(d) , 84.48(s) , 114.42(d) , 124.62(d) , 128.96 (s) , 137.14 (s) , 146.34 (s) , 153.24 (s) , 169.40 (s) , 170.59 (s), 172.72 (s) , 174.82 (s) , 176.92 (s)
1 1 ) 溶解性：
水に易溶、 水メタノールに可溶。
1 2 ) 呈色反応：ニンヒ ドリンに陽性。
1 3) 薄層クロマトグラフィー：
Rf航： D.14 吸着-剤； シリ力ゲルプレート 5715
展開溶 ¾； n-ブクノール ： m：水 =3 : I ： i
挨出：紫外線 254 nm . ニニ ヒ ドリン％色
1 4) ァミノ酸分折：
6 N塩酸で 110°C、 20時間加水分解後、 反応混合物より溶剤を留去した。 得られた殍渣をアミノ酸分析機で分祈し. ァラニンと - リ シンを検出した。 ァ ラニンについては HPI で分析した結果 . L -ァラニンに一致した：
カラム； Enantio L1 (4.6 ID Χ2δί) mm 、 東、,'一 ¾製 '： 溶剤； 0.8 mM CuS04
?Ίτπ / ■ ϊ 2 / し
流速； 1 ml Ζ分 '
検出；赤外線 250 rim ウスチロキシン Bの紫外線吸収スぺクトル、 旋光度はウスチロキシン Aとよく —致し、 分子量はウスチロキシン Aより 28 (C2H4に相当） 小さい 645である。 こ のことは構造中に含まれる発色団、 および、 立体構造の絶対配置がウスチロキシ ン Aと一致していることを示す。
アミノ酸分析では、 ウスチロキシン Aで検出された L-バリンに代わって、 L-ァ ラニンが検出された。 NMRでは、 ウスチロキシン Aのスペクトルで示された、 バリン残基に由来する、 δ 0.80 、 0.88 ppm の 2本のメチルシグナルおよび 0 .92 ppm のメチルシグナルが観察されず 代わって、 δ 1.14 ppm にメチルシグ ナルが現れている。 同様に、 13C-NMR においても、 炭素シグナルが 2本少なく、 バリン残基に代わつてァラニン残基の存在が示された。
以上のデータから、 ウスチロキシン Bの構造は、 ウスチロキシン Aにおける L- バリンが L-ァラニンに代わつたものと決定した。
実施例 6. 抗) !i瘍作用
本発明のウスチロキシン Αおよびウスチロキシン Βならびにその誘導 は抗腫 瘍作用を有する。
以下に、 スチロキシン A及び X "^口キシン Bについて抗腫瘍作 ¾を測定し
0 た結果を i己敉する。
アレイ （Michael C. Alley ) らの方法 （Canc''「 Research 、 48 巻， 589 〜 f; 01頁（1988 年） ） に準じて、 ウスチロキシン/ λ¾びウスチロキシン Bの抗腫瘍作 ^を検討した.，
即ち、 9Β 穴培養プレードに各種癌細胞を ixlt)3 個 Z100 μ ΐ メディウム （ RPMI-1 40 + 10 % FCS) ずつ懸濁した..， 但し、 RERF— IX— ΜΑ は 4Χ 102 個、 WiDr、 SW- 480 、 KU-2 は 5X 102 個、 Ζίί— 75— 30 は 3Χ 1(13 個、 SBC-5 は 2. δ X 102 個懸濁した。 これらの懸濁液を 5 % C02下、 37で で 24 時間培養後 、 希釈サンプルを含む 100 M l のメディウムを加え、 同じ条件下で更に 48 時間培養した。 培養後、 200 ll のメディウムで 3 回洗浄し、 薬剤を除去した 。 次いで、 5 % C02下、 37°Cで 96 時間培養後、 50/ig /50μ 1 の Μπを加 え、 同条件下で更に 4 時間培養した。 培養液を除去し、 150 μ ΐ の DMS0 を 加え撹拌し、 540 nm における吸光度から細胞増殖率を算定した。 細胞増殖を 50 % 阻害するのに必要な試験化合物の濃度 （ICS。； /zg Zml) を表 1. に示 す。
【·表 2〗 ウスチロキシン A及びウスチロキシン Bのヒト Bl««胞增 «阻害効果 細胞 由来 組緻型 I C,。（ ue
ウスチロキジン A S-FU (対 s化合物 )
MKN-1 Ι9β 腺] 平上皮 S 2.46 2.S5 5.73
陽- 7 霄 as 分化型腺 as 3.75 5.04 3.34
-74 高分化型管状腺 s 3.9 & 11 1.40
RERF-LC-HA 肺 s 小袖 4.27 β.8 0.314
SBC-5 肺 s 小袖胞 S 0.254
MCF-7 乳 s 腺 S 0.656 1.38 0.915
ZR-75-30 充実腺管 35 2.93 >1D
WiDr 結 3.57 5.S 1.05
SW-480 結 MS 腺 as 4..G4 7.3 3.44
KU-2 3.3S 2.55 2.79
2. から FIJIかの如く、 ウスチロキシン A及びウスチロキシン Bは各種のヒ卜 腫瘍細胞に して、 優れた増殖阻害効 ¾を示した
[産業上の利 可能性]
本発明の前, s—般式 （ I ) を有する化合物は、 文献未載の新規化合物であり、 種々のヒ卜癌細胞に対して強い増殖抑制作用を示し. 抗腫瘍剤として有用である 本発明の前； E—般式 （ r ) を有する化合-物を医薬として,弔いる場会、 常法に従 つてそれ自体または適宜の薬学的に許容される担体、 賦形剤、 希釈剤と混合し、 粉末、 顆拉、 錠剤、 カプセル剤、 注射剤などの形態で経口的または非経口的に安 全に投与することが出来る。 投与量は対象疾患、 投与経路および投与回数などに より異なる。 例えば成人に対して有効 1 日投与量は注射の場合、 患者の体重 1
Kg 当たり 0. 01 mgから 80 mg 、 経口投与の場合 0. 5 mg から 12G mg を、 症 状に応じて 1 回または数回に分けて投与するのが好ましい。

Claims

請 求 の 範 一般式
Figure imgf000025_0001
(式中、
R 1 は水素原子または炭素数 1乃至 5個を有するアルキル基、
R 2 は水素原子または炭素数 2乃至 6個を有する脂肪族ァシル基、
R 3 はメチル基またはプロピル基
を示す。 ）
で示される化合物またはその塩。
2 .
クレーム 1記載の一般式 （ I ) において、
一般式
R!OOC /
Figure imgf000025_0002
(式中、
R 1 は水素原子または炭素数 1乃至 5個を有するアルキル基、
R 2 は水素原子または炭素数 2乃至 6個を有する脂肪族ァシル基、
R 3 はメチル基またはプロピル基
を示す。 ）
で示される化合物またはその塩。
3 - ウスチラギノイデア属に属するウスチロキシン Aまたはウスチロキシン B生 産能を有する稲コウジ病菌を用いて稲に稲コゥジを発生せしめ、 該稲コウジより ウスチロキシン Aまたはウスチロキシン Bを単離することを特徴とする、 ウスチ ロキシン Aまたはウスチロキシン Bの製造法。 ·
4 . ウスチラギノイデア属に属するウスチロキシン Aまたはウスチロキシン B生 産能を有する稲コウジ病菌が、 Ustilaginoidea virens (Cooke) Takahashi SAN K 15391 株 （微ェ研条寄第 3691号： BP-3691 ) であるクレーム 3記載の製造法。
5 . クレーム 1又は 2に規定される化合物またはその塩の治療学的有効量を、 薬 学的に許容し得る担体又は賦形剤とともに含有する、 薬学的組成物。
6 . クレーム 1又は 2に規定される化合物またはその塩の治療学的有効量を、 薬 学的に許容し得る担体又は賦形剤とともに含有する、 制癌剤。
7 . クレーム 1又は 2に規定される化合物またはその塩の治療学的有効量を、 癌 患者に投与する、 癌の治療又は予防方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103760353A (zh) * 2014-02-08 2014-04-30 中国农业大学 检测稻曲菌素a的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN106279359A (zh) * 2016-08-11 2017-01-04 中国水稻研究所 一种制备五种稻曲病菌毒素的方法

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