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WO1993017122A1 - Protein with novel pharmacological characteristic - Google Patents

Protein with novel pharmacological characteristic Download PDF

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Publication number
WO1993017122A1
WO1993017122A1 PCT/JP1993/000207 JP9300207W WO9317122A1 WO 1993017122 A1 WO1993017122 A1 WO 1993017122A1 JP 9300207 W JP9300207 W JP 9300207W WO 9317122 A1 WO9317122 A1 WO 9317122A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pro
glu
protein
tyr
lys
Prior art date
Application number
PCT/JP1993/000207
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tsukasa Seya
Toshinori Kanamori
Atsushi Nii
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Publication of WO1993017122A1 publication Critical patent/WO1993017122A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention has, in part, the same amino acid sequence structure as natural membrane cofactor protein (Mebrane Cofactor Protein, hereinafter referred to as MCP).
  • MCP membrane cofactor Protein
  • the present invention relates to a bioactive protein that is effective for diseases characterized in that the complement system obtained acts disturbingly on autologous cells and tissues.
  • C3b an activation fragment of the third component of complement, which is important for the activation of the complement system, is a new cofactor required for inactivation of factor I by cofactor I.
  • the present invention relates to a protein having various pharmacological properties.
  • the present invention also relates to a DNA having a nucleotide sequence encoding a protein having the novel pharmacological properties, and a pharmaceutical composition containing this protein as an active ingredient and used for the above diseases.
  • Background art
  • the complement system is a biological defense system composed of about 20 protein components present in blood.In the late 1880s, it was discovered in plasma as a lytic substance that was inactivated when heated to 55 . Subsequent studies have isolated and identified the various protein components that make up this complement system. This system is a force-scale reaction with two different starting points for activation (classical and alternative pathways). It has become clear that. The classical pathway is mainly activated by the antigen-antibody complex, and the second pathway is mainly activated by foreign substances (such as microorganisms) that have entered the living body. In addition, in both pathways, each component reacts along a cascade in order to finally lyse the target cell.
  • the third component of complement (hereinafter referred to as C 3) is an important cascade product in this system.
  • the mechanism of formation of the convertase complex and the fifth component of complement (hereinafter referred to as C5) are different in the two pathways.
  • the C3 convertase complex of classical sutra bound to cell membranes and the like as a reaction complex of the fourth component of complement (hereinafter referred to as C4) and the second component of complement (hereinafter referred to as C2).
  • C4b2a, and the C5 convertase complex is C4b2a3b, which is a reaction complex between the C3 convertase complex and C3.
  • the C3 convertase complex in the alternative pathway is C 3 b B b bound to the cell membrane or the like as a reaction complex
  • the C 5 convertase complex is a reaction complex between C 3 b B b, which is a C 3 convertase complex, and C 3 C 3 b B b 3 b.
  • C 5 (C 5 b) activated by the C 5 convertase complex reacts sequentially with C 5 -C 9, ultimately leading to the membrane attack complex ⁇ embrane A tack Complex, (Hereinafter referred to as MAC) to cause cell lysis.
  • some cascade products of the complement system have various physiological activities in addition to direct cytotoxicity.
  • C3a, one of the C3 activation products, and C5a, one of the activation products of C5 are also known as anaphylatoxin (ana-Phy1at0Xin). It is known to exhibit the action of releasing histamin from mast cells and chemotactic action on leukocytes.These enhance blood vessel permeability and activate the complement system. It is thought that it acts to attract leukocytes to the site where it has been converted, and it may be reasonable for phagocytosis of immune complexes and lysed cell fragments.
  • DAF Disposal Facor
  • MCP Membrane cofactor protein
  • CR 1 is 1) an action of converting C 3 b and C 4 b into inactive forms of i C 3 b and i C4 b (irreversible proteolytic action) as a cofactor of factor I in plasma; 2) It was identified in 1990 as a cell membrane protein with a molecular weight of about 200 kd, which has the action of strongly promoting the dissociation of the C3 convertase complex (reversible complex dissociation action) (Fearon, D T. J. E xp. Med. 15 22 0 — 30, 198 0).
  • CR1 is a transmembrane structure composed of a total of 4 units, each of which consists of 7 repeats (Short C oncensus Repeat, hereinafter referred to as SCR) consisting of about 60 amino acids. It is a glycoprotein (Klickstein, LB. eta 1. J. Ex. Med. 1651 910-111, 112, 198 7).
  • DAF has a function of strongly promoting the dissociation of C3 and C5 convertase complexes (reversible complex dissociation).
  • a molecular weight of about 70 isolated from human erythrocytes kd glycoprotein (Nicholson-Weiler, A. eta 1. J. Imm unol. 1 291 184-189,
  • MCP is the most recently cloned membrane glycoprotein of 45-70 kd of these three species (Lublin, DM. e "a 1 J. E xp. M ed 1 6 8 1 8
  • MCP also has four repetitive structures of about 60 amino acids, which are similar to the structure of DAF, but MCP is active as an I: factor cofactor (irreversible C3 b and C—4b inactivate) but do not have a decay accelerating effect (Seya, Teta J. Expp
  • Human MCP has at least six isoforms due to differences in the splicing style of its mRNA (International Publication Nos. W091Z0202 and Post, TW. J.
  • MCP acts on C3b present on cells that have the MCP, but does not act on C3b on other cells.
  • Extracted and isolated native MCP acts on C 3b in the liquid phase or on C 3b bound to solubilized substrates, but hardly on C 3b bound to insoluble substrates. It is clear that it does not act (Tsashiya Seya Japanese clinical study 46 (9) Separate volume 9 3 3-
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for use in diseases where the complement system acts harmfully on autologous cells and tissues.
  • Practical field in which the complement system exhibits a damaging effect with a relatively low molecular weight, that is, a novel pharmacological property that suppresses the action of the complement system component adsorbed on a solid substrate (cell membrane) The purpose is to create a protein having
  • the present inventors have found that there is a site in the currently known natural type MCP molecule that, when used exogenously, acts on C3b on the solid phase. Presumed that We thought that the lack of a harmful site could add important pharmacological properties that also act on C 3 b on the solid phase. As a result of intensive studies based on such a new idea, the present inventors succeeded in creating a protein having a novel pharmacological property and completed the present invention based on the protein.
  • the first aspect of the present invention relates to the lack of at least the transmembrane region and the intracellular region of a natural membrane protein (Membrane Cofactor Protein, MCP).
  • MCP Membrane Cofactor Protein
  • the first embodiment of the present invention is preferable when the first embodiment has at least a part of the amino acid sequence represented by the following formula 1.
  • a second aspect of the present invention provides a DNA having a nucleotide sequence encoding a protein having the novel pharmacological characteristics of the first aspect of the present invention.
  • a third aspect of the present invention is characterized in that the protein having the novel pharmacological property of the first aspect of the present invention is contained as at least one active ingredient. It is a pharmaceutical composition for use in diseases that act disturbingly.
  • FIG. 1 shows the structures of the six isoforms of human MCP.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a method of constructing pUC 19 -sMCP (C).
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a method of constructing PUC19-sMCP (D).
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a method for constructing pUC 19 -sMCP1234.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a method for constructing a C0SI expression plasmid.
  • FIG. 6 is a view showing a band pattern of SDS-PAGE, which indicates cofactor activity.
  • FIG. 7 is a graph showing the number of cells, showing the effect on complement-dependent cytotoxicity. Structure of the invention
  • the protein according to the first aspect of the present invention is a protein comprising a native membrane protein (Membrane Cofactor Pro— tein (MCP) is a protein with novel pharmacological properties characterized by the lack of at least the transmembrane and cytoplasmic domains.
  • MCP Membrane Cofactor Pro— tein
  • FIG. 1 is a quotation of FIG. 3 of International Publication No. W091 Z02002, and shows the isoforms of the six MCPs given by cDNA.
  • the transmembrane region of the native MCP generally refers to a region in which a native MCP, which exists on a cell membrane in a form penetrating the membrane, penetrates the membrane, and is denoted as HY in FIG. The part that is being done.
  • the cytoplasmic region refers to a portion indicated as CYT 1 or CYT 2 in FIG.
  • amino acid numbers 295 to 317 in FIG. 1 of International Publication No.W091 Z02002 are transmembrane regions and 318 to 350 are cytoplasmic regions. Area.
  • Protein least for a membrane spanning region and a cytoplasmic region of the present invention the first aspect is lacking, ST in MCP clone of Figure 1 (ST A, ST B, ST c) protein corresponding to and UK It is a protein that lacks the C-terminal amino acid sequence from the upper region or any point on the boundaries at both ends of those regions. Specifically, proteins of [4 SCR s — ST C — UK] structure,
  • Protein [4 SCR s - ST A - - ST B ST c] structure, [4 SCR s - ST C ] protein structure include protein of [4 SCR s] structure.
  • the protein of the present invention has at least a part of the amino acid sequence represented by the following formula 1, has the amino acid sequence represented by the following formula 1 or 2, and further has the following formula 1 or The case indicated by 2 is preferred.
  • Cys Pro Tyr lie Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gin Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80
  • the protein having the novel pharmacological properties according to the first aspect of the present invention is significantly different from the conventionally known MCP, and is similar to the case of C 3 b in the liquid phase.
  • the effect of factor I as a cofactor means that C 3b is inactivated in the complement system, that is, the activity of factor I as a cofactor in the conversion reaction from C 3b to i C 3b.
  • exogenously supplemented protein of the present invention acts as a cofactor for factor I, one of the complement system regulators, and as a result, complement system component C
  • complement system component C This refers to the irreversible decomposition of 3b to suppress or eliminate its action as 3b.
  • C 3 b on the solid phase means that activated complement system component C 3 b Refers to a state in which the substance is bonded to an artificially placed artificial tangible substance or the like via a covalent bond or a non-covalent bond. b etc.
  • the C3b in the liquid phase is, for example, C3b existing in a free state in a biological fluid or various solutions or C3b bound to a solubilized substrate.
  • the protein having novel pharmacological properties of the present invention was created based on a new idea of removing a part of the MCP, which hinders the action of the known MCP on C3b on the solid phase. Any substance may be used as long as it has an effect on C 3 b on the solid phase in the same manner as the cofactor activity on C 3 b in the liquid phase.
  • the basic properties (physical properties, activity, etc.) of the protein of the present invention, in particular, mutations such as deletions, additions or substitutions in the amino acid sequence can be made without changing the presence or absence of an action on C3b on the solid phase. Can be introduced.
  • substitution of a hydrophobic amino acid residue for another hydrophobic amino acid residue substitution of a positively charged amino acid for another positively charged amino acid, Glu and Asp or Mutations between Lys, His, and Arg, or between groups of lie, Va1, Met, Leu, groups of Gly, Ala, Ser, Cys, and ⁇ ⁇ , T Substitution between yr and P he groups Can be estimated.
  • a substance obtained by subjecting the mutant to various chemical modifications such as sugar addition alkylation, oxidation, reduction, hydrolysis, or a substance formed by forming a salt with a pharmacologically acceptable acid or base, etc.
  • the protein having the novel pharmacological properties according to the first aspect of the present invention can be obtained by a standard polypeptide synthesis method such as the Merrifield method, or a natural product MCP containing the protein molecule of the present invention. It may be obtained from the cells, but is preferably produced from cultured cells by genetic engineering using DNA or the like according to the second aspect of the present invention described below. It is more preferable that the cultured cells are Escherichia coli and cultured mammalian cells. Or the inhibitory effect on the action of C3b on the solid phase due to the nucleotide sequence of MCP disclosed in International Publication No. WO 91/0202 Nucleotide sequence in which the nucleotide sequence corresponding to the base sequence has been deleted, that is, at least the DNA having the nucleotide sequence of the following formula 3 (SEQ ID NO: 3)
  • GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600
  • GTCTCAAAH ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACITGACAG TITGGAnGA 840
  • a generally used host-vector system can be used.
  • Escherichia coli is used as the Invite host example
  • L ac UV 5 as a promoter and foremost, preparative Riputofa emissions promoter one or; LP L promoter and the like can be used. It can also be obtained as a fusion protein with / 3-galactosidase by using L phage vector; L gtll.
  • sal COS cells when cultured mammalian cells are used as a host, sal COS cells, Chinese hamster CH 0 cells, mouse 3T3 cells, or human fibroblasts are suitable.
  • SV40 early promoter When these are used as hosts, SV40 early promoter, adenovirus major late promoter or / 3-actin promoter / polypeptide chain elongation factor promoter can be used as a promoter.
  • the novel pharmacology of the present invention can be obtained by culturing each host under conditions that allow it to grow suitably and providing conditions that allow each promoter to function. A protein having specific characteristics can be obtained.
  • the protein having the novel pharmacological properties of the present invention is more preferably a purified protein, but is not particularly limited thereto.
  • the obtained protein having a novel activity is currently commonly used. It can be purified using the known proteinaceous substance purification method. For example, salting out, acid alkaline precipitation, ultrafiltration, ion-exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography It can be carried out by appropriately combining chromatography, HPLC, chromatofocusing, and electrophoresis. For example, a solution containing the protein of the present invention is dialyzed against 0.02 M NaC 1/10 mM phosphate buffer (pH 7.5), and then subjected to ion exchange chromatography. , Eluting with a linear gradient of NaCl.
  • the active fractions are collected and further subjected to affinity chromatography using a monoclonal antibody. This is dissolved in glycine-HC1 buffer (PH2.5) to obtain an active fraction.
  • glycine-HC1 buffer PH2.5
  • MCP monoclonal antibody
  • it may be carried out according to a known method for purifying MCP (Seya, T. eta 1. J. Exp. Med. 16 383 7-855, 1986).
  • the activity of MCP may be confirmed by confirming the inactivation of C 3 b in the presence of factor I, that is, the conversion of C 3 b to i C 3 b.
  • Seya et al. Seya, T. eta1. Clin. Chime. This is the substrate Add MCP molecules in the presence of factor I.
  • the mixture is reduced with ⁇ -merile potato ethanol (e.g., mercaptoethanol) and subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis (hereinafter referred to as SDS-PAGE).
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis
  • a second aspect of the present invention provides a DA having a nucleotide sequence encoding a protein having a novel pharmacological property of the first aspect of the present invention.
  • the DNA of the second embodiment of the present invention has at least a part of the base sequence represented by the following formula 3 (SEQ ID NO: 3), and has the base sequence represented by the following formula 3 or 4 (SEQ ID NO: 4) It is more preferable than the case defined by the base sequence represented by the following formula 3 or 4.
  • GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATITCC AGTAGTCGAA 600
  • GTCTCAAAH ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACHGACAG TUGGA GA 840
  • GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600
  • the DNA of the present invention may further have a nucleotide sequence corresponding to a signal peptide derived from a natural MCP.
  • the DNA of the second aspect of the present invention may be obtained entirely by a general DNA synthesis method, or may have a translation stop codon at an appropriate site of a known MCP gene by a site-specific nucleotide sequence mutation method. It may be obtained by introducing.
  • a known method for cloning mRNA encoding MCP (Lublin, DM. Eta 1. J. Ep. Med. 168 188 1—19.4, 198 88) Therefore, after obtaining the cDNA, it is preferable that the cDNA be used to delete and reconstitute unnecessary parts by a genetic method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the DNA of the second aspect of the present invention may be a DNA having any base sequence as long as it encodes the MCP of the first aspect and can be expressed under appropriate conditions.
  • Equation 3 or I s a DNA defined by the base sequence represented by the above formula 4, but in addition to the base sequence, any one or more bases at its 5 'end and Z or 3' end and Z or its intermediate part May be added or substituted.
  • the nucleotide sequence of a gene can be replaced without changing the amino acid sequence of the protein encoded by it. That is, most amino acids are encoded by a plurality of genetic codes.
  • the DNA of the second embodiment of the present invention also includes a mutant in which one or more bases of the base sequence are replaced with other bases, as long as the amino acid sequence encoded by the DNA is not changed.
  • An E. coli strain [HB101 (pM851)] transformed with a plasmid (pM851) containing the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 is commercially available. Deposited with the Research Institute of Microbial Industry and Technology of the Ministry of Industry [Transferred to Deposit No. FE RM BP-4195 from International Deposit No. P-127 155] .
  • a third aspect of the present invention comprises the protein having the novel pharmacological properties of the first aspect as at least one active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for use in diseases in which the complement system acts harmfully on autologous cells may be composed of only the first aspect, but as long as the novel pharmacological properties of the present invention, that is, the activity acting on C 3b on the solid phase, are not impaired, It may contain excipients, stabilizing agents or solubilizing agents, which are commonly used pharmaceutical mixtures. Examples include Ringer's solution, phosphate buffer, human serum albumin, hydrolyzed gelatin, sucrose, dextran, polyethylene glycol, etc., depending on the drug form; Is done.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately adjusted depending on the age, weight, and sex of the patient and the type and degree of the disease, but is usually 1 ng / kg to 10 mg / kgx. Is preferably lg Z kg to 10 mg / kg, more preferably 10 g / kg to 5 mg / kg.
  • the disease to be treated in this way may be any disease in which the complement system has a disturbing effect on autologous cells and tissues, but in particular nephritis, hepatitis, vasculitis, asthma, autoimmune disease, Occurs with bloody organ disorders, reperfusion, rheumatoid arthritis, transplant rejection, shock, multiple organ failure, disseminated intravascular coagulation, adult respiratory distress syndrome (ARDS), and hemodialysis ARDS-like illness, shock or burn Les ,.
  • ARDS adult respiratory distress syndrome
  • the method of treatment using the pharmaceutical composition of the third aspect of the present invention may be any method as long as the protein of the present invention having novel pharmacological properties is administered in such a manner that its effective amount reaches the affected area.
  • systemic administration such as intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular, or oral
  • topical administration such as intraarticular, intrathecal, or intranasal, intratracheal, or oral administration
  • Therapeutic methods include mucosal administration, and furthermore, intestinal administration using suppositories and the like.
  • the gene (hereinafter, the clone name is referred to as PUC19-MCP (D)) was modified.
  • the MCP structural gene used corresponds to the clone H2-15 in FIG. 1, which is represented by Post et al. (Post, TW. Eta 1.), Journal of Peripheral Medicine (J. Exp. Med. ;;), 17493-102, 1991, which are the same as those described in FIG.
  • Example 1 This was double-digested with restriction enzymes KpnI (Takara Shuzo) and BsmI (New England Biolab), and pUC19—MCP (D) -derived digested with the same restriction enzymes. Ligation was performed using difragment and DNA ligase (Takara Shuzo). The resulting plasmid was designated as PUC 19—s MCP (C). The steps of Example 1 are schematically illustrated in FIG.
  • Example 2 Modification of a region corresponding to the vicinity of the N-terminus of the MCP gene
  • the MCP gene The region corresponding to the region near the N-terminus was modified.
  • the following two types of single-stranded DA were synthesized in the same manner as in Example 1 in order to obtain an artificial linker.
  • Example 2 After annealing, pUC19-sMCP (C) obtained in Example 1 was combined with restriction enzymes Ec0RI (Takara Shuzo) and Eco52I (Takara Shuzo). And the large fragment obtained by double digestion with-was combined in the same manner as in Example 1. The resulting plasmid was designated as PUC19—sMCP (D).
  • the steps in Example 2 are schematically illustrated in FIG.
  • Example 2 Using the plasmid p UC 19 -s MCP (D) obtained in Example 2, the MCP gene further modified in the C-terminal equivalent region was prepared. First, the following two primers were synthesized in the same manner as in Example 1.
  • Example 1 pCR was performed in the same manner as in Example 1 using pUC19-sMCP (D) as a template.
  • the resulting fragment of about 100 bp was double-digested with the restriction enzymes KpnI (described above) and Bsml (described above), and the PUC 19-digested with the same restriction enzymes.
  • the sMCP (D) -derived large fragment was bound in the same manner as in Example 1.
  • the resulting plasmid was named pUC19-SMCP12234.
  • the process of Example 3 is abbreviated in FIG.
  • P EF—BOS (Mizushima, S. e_ta1.ucleic A cids Res. 1853), known as a powerful expression vector in mammalian cultured cells, A plasmid for COSI cell expression was constructed based on pEFN-I, which is an improved vector of 199).
  • PEFN-I has an SV40 origin of replication (Ori), a promoter region of human polypeptide chain elongation factor 1 ⁇ , and an SV40 polypeptide addition signal sequence.
  • Example 4 P UC 19 -s MCP (D) obtained in Example 2 or p UC 19 -s sMCP 1 234 obtained in Example 3 was treated with restriction enzymes Eco RI and ⁇ ⁇ . After double digestion, the MC MC structural gene fragment (small fragment) of each plasmid was isolated. Each of these fragments was ligated to PEF F-I double-digested with the same restriction enzymes in the same manner as in Example 1. The resulting brasmids were named PM851 and ⁇ 852, respectively. The steps of Example 4 are schematically illustrated in FIG.
  • ⁇ 851 is a plasmid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • ⁇ 852 is a plasmid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Each of ⁇ 851 and ⁇ 852 prepared in Example 4 was introduced into C0SI cells to express the protein of the present invention. That is, 0.5 jg PM 851 or ⁇ ⁇ 852 is converted to 5 JLO 1 10 mM Tris-HCl buffer (hereinafter referred to as Tris-HC1) (pH 7.4) / 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter referred to as EDTA) solution. mg / ml DEAE-dextran and 50 mM Tris-HC1 (pH 7.4) Dulbecco's modified Eagle's medium (D-ME medium, Soyui Pharmaceutical) Then, a DNA-DEAE dextran mixture was prepared.
  • Tris-HC1 Tris-HC1
  • D-ME medium Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Example 5 The culture supernatant obtained in Example 5 was added to 20 mM acetate buffer (pH 5.0) containing 0.05% nonidet P—40 (hereinafter referred to as NP-40) at 4%. Dialyzed overnight. Centrifuge the precipitate , And the supernatant was subjected to chromatographing column chromatography. That is, a column (diameter: 2 cm) packed with chromatophoresis gel (Pharmacia) and equilibrated with 10 mM MTris-HC1 (pH 9.0) / 0: 05% NP-40.
  • NP-40 nonidet P—40
  • EA 1 25 C 3 b erythrocyte membrane
  • EA 1 25 C 3 b erythrocyte membrane
  • the immobilized 125 I-labeled C 3 b was obtained.
  • Lane 2 immobilized C 3 b + factor I + native M C P
  • Lane 4 immobilized C3b + I factor 10 protein of the present invention
  • lane 1 and lane 2 are compared, no change is observed in the band pattern of C3b.
  • native MCP has no activity as a cofactor for factor I on C 3 on the solid phase.
  • lane 3 to which NP — 40 was added bands disappeared in the range of 116 Kd to 120 Kd compared to lane 2.
  • NP-40 solubilized by NP-40 was degraded by factor I, a cofactor of native MCP.
  • Lane 4 shows the results obtained by reacting factor I with the protein of the present invention on C3b on the solid phase in the absence of NP-40. The disappearance of the 20 Kd band is observed.
  • the protein of the present invention also has an action as a cofactor of factor I on C3b on a solid phase. It is shown that. This demonstrates that the protein of the present invention exhibits cofactor activity on C3b on the solid phase, as does native MCP on C3b in the liquid phase. Natsuta
  • CHO-K1 cells (AT CCCCL61) containing 10% serum (Cell Culture Laboratories) The cells were cultured using a medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) according to a conventional method.
  • the anti-C ⁇ 0 cell rabbit antiserum shown in Reference Example 5 was added as one sample of about 1 ⁇ 10 ⁇ cells, and treated at 0 ° C. for 15 minutes. Then 1 0 0 m MEG TA, 1 0 mM M g C 1 2 gelatin Verona one Le buffer containing (0. 1 45 MN a C l ZO.
  • the number of live cells, the number of dead cells, and the fluorescence intensity (proportional to the amount of C 3 b deposited on CH 0 cells) in the specimens subjected to such treatment were determined by the fluorescence-activated cell sorter (EPICSP rofi 1e II, The analysis was performed using the following method.
  • Figure 7 shows the results.
  • the experimental method is as described in Example 8.
  • a) is live cells in the control group (no MCP) and b) is dead cells.
  • c) is a living cell in the presence of the protein of the present invention, and
  • d) is a dead cell.
  • the vertical axis of each graph indicates an index indicating the number of cells, and the horizontal axis indicates the fluorescence intensity.
  • iC3b-deposited cells peaks with higher fluorescence intensity
  • Example 7 the protein of the present invention differs from native MCP in that C 3b on the solid phase is also b It was thought to decrease the absolute amount and, as a result, suppress the cytotoxicity of the complement system. (Example 9) Toxicity test
  • Example 6 Using the protein of the present invention obtained in Example 6, a toxicity test was performed on mice and rats. That is, the protein obtained in Example 6 was compared to 10 male and female B a1 b Zc mice of 6 to 8 weeks of age and 10 male and female Wistar rats of the same age each. Intravenous administration for one week every day. The general characteristics of each animal were observed throughout the administration period. In this study, no deaths were observed in any of the animals in the 10 mg / Kg group, which was the highest dose group, and there was no change in general characteristics.
  • Example 6 One OO mg of the protein of the present invention obtained in Example 6 was dissolved and dissolved in 100 ml of a physiological saline solution containing 10 mg of hydrolyzed gelatin of l O mgZm 1 to obtain a solution having a pore size of 0.22 ⁇ .
  • the solution was sterilized by filtration using a filter (Mylex GV, Millipore). This was aseptically dispensed into glass vials in 10 ml increments and sealed to give a solution for injection.
  • 100 mg of the protein of the present invention obtained in Example 6 was dissolved in 100 ml of 100 mM PBS (pH 7.4) containing 100 mg of human serum albumin, and Bore size 0.2 2 ⁇ Sterile sterilization using a filter (Mylex GV, Millipore). This was aseptically dispensed into glass vials in 3 ml portions, lyophilized, sealed and used as a lyophilized preparation for injection.
  • Cola first class (Kohler, G.eta1.
  • Monoclonal antibodies against MCP were prepared according to the method of Nature 2564495-497, 1975). The specific method was reported in Seya, T. eta1. Cmplemen Inf1 amm. 1_78-89, 199. That is, purified MCP derived from the cell membrane fraction (0.5 iLtg / 0.5 ml PBS / 0.02% NP-140) was sufficiently added to 0.8 ml of Freund's complete adjuvant. And administered subcutaneously to B a1 b Zc strain mice. Administration was performed three times at 10-day intervals.
  • the spleen of the mouse was excised, spleen cells were isolated, and fused with NS-1 cells, a mouse myeloma-derived cell line, according to a conventional method.
  • the culture supernatants of these fused cell clones were screened by protein A rosette formation method using hedging erythrocytes to obtain clones producing antibodies against MCP.
  • These hybridomas were transplanted intraperitoneally into Ba1b / c mice and irradiated with 400 rad. 4 & was. Approximately 10 days later, ascites was collected from the mice. Ammonium sulfate was added to the ascites so as to be 50% saturated, and salting out was performed.
  • an enzyme-labeled antibody was prepared using the monoclonal antibody obtained in Reference Example 1.
  • 0.1 MNaI 0.2 ml was added to 1 ml of a horseradish peroxidase (Toyobo Co., Ltd.) aqueous solution prepared to 4 mg Zm 1, and mixed. Left at C for 15 minutes.
  • 0.2 ml of a 1.5% aqueous solution of ethylene glycol was added to this was added 0.2 ml of a 1.5% aqueous solution of ethylene glycol; after mixing, the mixture was allowed to stand at 25'C for another 20 minutes. Thereafter, the cells were dialyzed three times against 1 mM sodium acetate buffer (pH 4.4).
  • Each hole of the 6-hole multi-time knob plate (Nunc) 0.1 ⁇ l of one of the monoclonal antibodies obtained in Reference Example 1 in 5 ⁇ g Zm 1 as a primary antibody was dispensed into each sample, and left at 4 ° C. for a while. After washing each well five times with 0.3 ml of ion-exchanged water, add 0.1 ml of a test substance or standard substance mixed with an equal volume of PBS containing 10% serum albumin, and add at room temperature. Left for 2 hours. Each well was washed five times with 0.3 ml of a physiological saline solution (washing solution) containing 0.05% Tween 20 and then washed once with 0.3 ml of ion-exchanged water.
  • washing solution containing 0.05% Tween 20
  • reaction stopping solution (INH 2 S 04) after stirring added 0. 1 ml, the absorbance at 49 0 nm of the reaction solution (0 D 49.)
  • My Kuropure preparative reader one (ETY- 9 6 A-type, measuring Toyo Instrument Company). Calculate the amount of MCP in the sample from the calibration curve obtained from the “OD of the standard substance”. did.
  • the cell suspension was adjusted to approximately 1 X 1 0 7 cells Z m 1.
  • About 2 ml of this cell suspension was intraarterially administered to Japanese white rabbits. This administration was repeated once a week five times, and one week after the last administration, rabbit blood was collected from the ear artery. After the serum was separated, salting out was performed in the same manner as in Reference Example 1. The precipitate was collected, dissolved in an appropriate amount of water, and dialyzed against PBS. This was used as an anti-CHO cell rabbit antiserum preparation.
  • the protein having novel pharmacological properties of the present invention acts as a cofactor for factor I on C 3b on the solid phase as well as on C 3b in the liquid phase It is intended to provide a protein having novel pharmacological properties.
  • the present invention provides a DNA encoding the protein, Pharmaceutical compositions containing the same are also provided.
  • the present invention relates to diseases in which the complement system acts impaired on self cells, nephritis, hepatitis, vasculitis, asthma, autoimmune diseases, ischemic organ damage, reperfusion injury, rheumatoid arthritis, transplanted tissue Treatment of rejection, shock, multiple organ failure, disseminated intravascular coagulation, adult respiratory distress syndrome (ARDS), and ARDS-like illness associated with hemodialysis—shock or burns It opens up a new path to treatment.
  • ARDS adult respiratory distress syndrome
  • ARDS-like illness associated with hemodialysis shock or burns It opens up a new path to treatment.
  • Cys Pro Tyr lie Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gin Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80
  • Cys Pro Tyr lie Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gin Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80
  • Thr Pro Pro Pro Lys lie Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160
  • Sequence type nucleic acid
  • GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600
  • Sequence type nucleic acid.
  • rooster cDNA to mRNA
  • GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATITCC AGTAGTCGAA 600

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Description

明
発明の名称 新規な薬理学的特性を有する蛋白質
技術分野
糸田
本発明は 、 天然型メ ン ブ レ ン コ フ ァ ク タ ープ ロ テ イ ン 、 M e m b r a n e C o f a c t o r P r o t e i n、 下 M C Pと記す） と同じアミノ酸配列構造を一部に有し、 .活性 化された補体系が自 己細胞や組織に対して障害的に作用す るこ とを特徴とする疾患に有効な生理活性蛋白質に関する。 詳しく は、 補体系活性化に重要な補体第 3成分の活性化断片で ある C 3 bを I 因子が不活化する際に必要なコ フ ァ ク タ一 ( c o f a c t o r , 補因子） としての新規な薬理学的特性を 有する蛋白質に関する。 また、 その新規な薬理学的特性を有す る蛋白質をコー ドする塩基配列を有する D N A、 この蛋白質を 有効成分と して含有する上記疾患に用いるための医薬組成物に 関する。 背景技術
補体系は血中に存在する約 2 0種類の蛋白質成分から構成さ れる生体防御系で、 1 880年代末に、 5 5でに加熱すると失 活する溶菌性の物質として血漿中に発見された。 その後の研究 によってこの補体系を構成する各種蛋白質成 _分の単離、 同定が 為され、 この系は二つの異なった活性化の出発点を有する力ス ケード反応 （古典経路と第二経路） .を形成-しているこ とが明か となった。 古典経路は、 主として抗原抗体複合体によって活性 化され、 第二経路は、 主として生体内に侵入した異物 （微生物 等） により活性化される。 また、 両経路とも最終的に標的細胞 を溶解するよう に各成分が順次カスケー ドに沿って反応する が、 この系での重要なカスケード産物である補体第 3成分 （以 下 C 3 と記す） 転換酵素複合体と、 補体第 5成分 （以下 C 5 と 記す） 転換酵素複合体の形成機転が二つの経路で異なって いる。 即ち、 古典経^の C 3転換酵素複合体は、 補体第 4成分 (以下 C 4と記す） と補体第 2成分 （以下 C 2.と記す） の反応 複合体として細胞膜等に結合した C 4 b 2 aであり、 C 5転換 酵素複合体は、 C 3転換酵素複合体と C 3 との反応複合体であ る C 4 b 2 a 3 bである。
一方、 第二経路での C 3転換酵素複合体は、 C 3 と B闵子の 反応複合体と して細胞膜等に結合した C 3 b B bであり 、 C 5 転換酵素複合体は、 C 3転換酵素複合体である C 3 b B b と C 3 との反応複合体である C 3 b B b 3 bである。
両経路において、 C 5転換酵素複合体によつて活性化された C 5 ( C 5 b ) は、 C 5〜C 9 と順次反応して最終的に膜侵襲 複合体 ^ e m b r a n e A t a c k Co m p l e x , 以下、 M A Cと記す） を形成して細胞溶解を引き起こす。 ま た、 補体系のカスケード産物の中には、 直接的な細胞障害作用 以外に種々の生理活性を有するものが知られている。 特に C 3 の活性化産物のひ とつである C 3 aおよび C 5の活性化産 物のひとつである C 5 aは別名アナフイ ラ トキシン （ a n a— P h y 1 a t 0 X i n ) と も呼ばれ、 肥満細胞からのヒス夕 ミ ン .（ h i s t a m i n) の遊離作用や白血球に対する走化作' 用を示すこ とが知られている れらは血管の透過性を亢進さ せ、 補体系が活性化されている箇所に白血球を呼び寄せるよう に作用していると考えられ、 免疫複合体や溶解した細胞断片の 貪食等による処理に対して合理的なものであろう。
このように細菌や異種細胞に対する補体系の細胞溶解作用機 序が明らかになる一方で、 補体系は何故自己細胞に対しては障 害作用を示さないのかという疑問が生じてきた。 その疑問に対 する解答の一つと して、 近年になって細胞膜上に自己の補体系 の作用を抑制する分子群が存在することが明かとなった。 中で も補体系カスケ一ド反応中で重要な位置にある C 3 bに結合す る三種の細胞膜蛋白質の発見は、 自己細胞に対する補体系の作 用を理解する上で画期的な出来事であった。 即ち、 補体受容体 1 (C o mp l e m e n t R e c e p t o r 1 , 以 卜 、 C R 1 と記す） 、 崩壊促進因子 （ D e c a y— A c c e.1 — e r a t i n g F a c o r , 以下 D A Fと記す） 、 および メ ンブレンコフ ァ クタ プロテイ ン （M e m b r a n e C o f a c t o r P r o t e i n、 MC P ) が次々 と発見さ れ、 その遺伝子がクローニングされ、 それぞれの作用特性、 補 体系制御機序についても種々の検討が為されるに至った。
C R 1は、 1 ) 血漿中の I因子のコファクタ一として C 3 b および C 4 bを i C 3 bおよび i C4 bという不活性型に変換 する作用 （不可逆的蛋白分解作用） と、 2 ) C 3転換酵素複合 体の解離を強力に促進する作用 （可逆的複合体解離作用） とを 併せ持つ分子量約 2 0 0 k dの細胞膜蛋白質と して 1 9 8 0年 に同定された （F e a r o n, D T. J . E x p . M e d. 1 5 2 2 0 — 3 0 , 1 9 8 0 ) 。 その遺伝子は 1 9 8 7 年にクローユングされ、 その塩基配列からの解析による と、 C R 1 は約 6 0アミノ酸からなる繰り返し構造 （ S h o r t C o n c e n s u s R e p e a t , 以下 S C Rと記す） 7 つを 1 ュニ ッ 卜 と して、 計 4ュニ ヅ 卜 から構成されている 膜貫通型の糖蛋白質である （ K l i c k s t e i n , L B . e t a 1 . J . E x . M e d . 1 6 5 1 0 9 5 - 1 1 1 2 , 1 9 8 7 ) 。
D A Fは、 C 3および C 5転換酵素複合体の解離を強力 に促進する作用 （可逆的複合体解離作用） を有する物.質と して.ヒ ト赤血球よ り 単離された分子量約 7 0 k dの糖蛋白 質である （N i c h o l s o n— W e i l e r， A. e t a 1 . J . I mm u n o l . 1 2 9 1 84 - 1 89 ,
1 9 8 2 ) 。 その遺伝子も 1 9 87年にクローニングされ、 そ の解析によ り D A Fも約 6 0アミ ノ酸からなる繰り返し構造 を 4個持つこ とが明かとなった （ C a r a s， I W. e t aj^ . N a u r e 3 2 5 54 5 - 54 9 , 1 9 8、7 および M e d o f ， M E . e t a 1 . P r o c .
N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 4 2 0 0 7 -
2 0 1 1 , 1 9 8 7 ) 。
M C Pはこれら三種の中で最も新たにクローニングされた分 子量 4 5〜7 0 k dの膜糖蛋白である （ L u b l i n , D M. e " a 1 J . E x p . M e d 1 6 8 1 8
1 94 , 1 9 88 ) 。 M C Pも約 6 0アミノ酸からなる繰り返 し構造を 4個有しており、 これは D A Fの構造に類似している が、 M C Pは I：因子のコフ ァクターと しての活性 （不可逆的 C 3 bおよび C— 4 b不活化作用） を示すのみで、 崩壊促進作 用は持たない （ S e y a , T e t a J . E x p
M e d 6 3 83 7— 8 55 , 1 9 8 6 ) 。 ヒ ト MC P はその m R N Aのスプライ シ ング様式の相違によって、 少 なく とも 6種のィ ソ体が存在する （国際公開番号 W0 9 1 Z 0 2 0 0 2 および P o s t , TW. 一 a J .
E x . Me d 74 9 3 - 1 0 2 9 9 1 )
さ らに興味深いこ とに M C Pは、 その M C Pを有してい る細胞上に存在する C 3 bに対しては作用するが、 他細胞上の C 3 bには作用 しないこ と、 および細胞膜から抽出単離さ れた天然型 M C Pは、 液相中の C 3 bあるいは可溶化され た基質に結合した C 3 bには作用するが、 不溶性基質に結 合した C 3 bにはぽとんど作用しないこ とが明かとなって いる （瀬谷 司 日本臨床 4 6 ( 9 ) 別冊 9 3 3 -
9 3 7 9 8 8 e y a T e t a
B i o c h e m. J 2 64 58 58 8 , 1 9 8 9 および 国際公開番号 W 0 9 1 0 2 0 0 2 ) 。
以上のように細胞膜上に存在する補体系制御蛋白質の実態が 明.らかになるに伴って、 それを疾患の治療剤と して応用する試 みが為されるようになった。 従来よ り種々の疾患に於いて、 補 体系の活性化による血中総補体価の低下や炎症組織への補体成 分の沈着が認められている （典型的な例と しては、 腎炎、 血管 炎、 S L E等が挙げられよう） 。 従って、 このよ うな疾患状態 では補体系が自己細胞に対して障害的に作用しているこ とが予 想され、 補体制御蛋白質はこのような病態を治療するのに有効 な薬物となると考えられる。
C R 1 に関しては、 遺伝子工学的に産生された可溶型 C R 1 を用いて、 虚血後心筋壊死モデル （ W e i s m a n， H F . e t a 1 S c e n c e 2 4 9 1 4 6 - 1 5 1 ,
1 9 9 0 ) 、 逆受身アルザス反応モデル （ Y e h , C G e t a 1 J m m u n o 1 1 4 6 2 5 0
2 5 6 , 1 9 9 1 ) 、 移植組織片超急性拒絶反応モデル
( P r u t t S K e t a 1 J . S u r g
R e s 5 0 3 5 0 - 3 5 5 , 1 9 9 に対する有効性 が検討されており、 いずれの場合も可溶型 C R 1 がモデル病態 に対して抑制的に作用したこ とが報告されている D A Fについては、 発作性夜間へモグロビン尿症患者赤血球 (当該患者の赤血球膜上には D A Fが欠損しており、 自己の補 体系によって溶血を起こすことが知られている） を用いてその 治療効果が検討された （M e d o f , ME . e t a 1 . P r o c . N a l . A c a d . S c i . U S A 8 2 29 80 - 2 9 84 , 1 9 85 ) 。 しかしながら、 本検討では この病態を完全には回復することができなかったことが報告さ れている。
以上のように補体系制御蛋白質の医療用治療剤としての応用 が有望視され始めてはいるが、 実際にそれらを医療現場に提供 するには、 いくつかの克服すべき重要な問題が存在している。 即ち、 C R 1は種々の病態モデルでその有効性が確認されてお り、 医療用治療剤として最も有望であろう と思われるが、 分子 量が約 2 0 0 K dと巨大であり、 一般的にはその生産や精製ェ 程での取り扱いが容易ではない。 D A Fは前記のようにその治 療剤としての効果が期待通りではない。
M C Pについては、 その有効性に関する具体的な報告は現時 点では無いが、 M C Pは固相基質 （不溶性基質） に吸着した C 3 bには作用しないことが明かとなつている。 （瀬谷 司 日本臨床 46 ( 9 ) 別冊 1 9 3 3— 1 9 3 7， 1 9 8 8· ; S e y a , T e t a 1 B o c h e m . J
2 6 4 5 8 1 - 5 8 8 , 1 9 8 9 ; および 国際公開番号 W 0 9 1 / 0 2 0 0 2 ) 。 すなわち補体系が細胞に障害的に作 用する場が細胞膜上であるこ と と、 外因的に用いられた天然型 M C Pの持つ作用特性である固相基質あるいは他の細胞上に吸 着した C 3 bには作用せず、 液相においてのみ I 因子のコフ ァ クタ一と して作用するという事実とを併せて考えると、 M C P の有効性は従来技術において、 あま り期待できない。 発明の開示
本発明は、 補体系が自己細胞や組織に対して障害的に作用し てしま う ような疾患に用いるための医薬組成物を医療現場に提 供するために、 生産や精製工程での取り扱いが容易な比較的 低分子量であり、 かつ、 補体系が障害作用を示す実際の場、 即 ち、 固相基質 （細胞膜） に吸着した補体系成分の作用を抑制す るような新規な薬理学的特性を有する蛋白質を創造するこ とを 目的とする。
そこで、 本発明者らは、 現在知られている天然型 M C P分子 中にはそれが外因的に用いられた場合固相上の C 3 bに作用す るこ とを阻害するような部位が存在していると推定し、 その阻 害部位を欠如させることにより、 固相上での C 3 bにも作用す るという重要な薬理学的特性を付加できるであろう と考えた。 そしてこのような新しい着想に基づき鋭意研究を重ねた結果、 本発明者らは新規な薬理学的特性を有する蛋白質の創造に成功 し、 それを基に本発明を完成させた。
一-すなわち、 本発明の第 1態様は、 天然型メ ンブレンコファク タープロテイ ン （ M e m b r a n e C o f a c t o r P r o t e i n , MC P ) の少なく とも膜貫通領域および細 胞質内領域が欠如していることを特徴とする新規な薬理学的特 性を有する蛋白質を提供する。
さらに、 本発明の第 1態様は、 下記式 1 に示したアミノ酸配 列の少なく とも一部を有するものである場合好適である。
本発明の第 2態様は、 本発明の第 1態様の新規な薬理学的特 性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有する D N Aを提供 する。
本発明の第 3態様は、 本発明の第 1態様の新規な薬理学的特 性を有する蛋白質を、 少なく とも 1つの有効成分として含有す るこ とを特徴とする、 補体系が自己細胞に対して障害的に作用 する疾患に用いるための医薬組成物である。 図面の簡単な説明
第 1 図は、 ヒ ト M C P の 6 種のイ ソ体の構造を示す図で ある。
第 2図は、 p U C 1 9 — s M C P ( C ) の構築方法を示す略 図である。
第 3図は、 P U C 1 9 - s M C P ( D ) の構築方法を示す略 図である。
第 4図は、 p U C 1 9 — s M C P 1 2 3 4の構築方法を示す 略図である。
第 5図は、 C 0 S I発現用プラスミ ドの構築方法を示す略図 である。
第 6図は、 コフ ァ クター活性を表す、 S D S — P A G Eの バン ドパターンを示した図である。
第 7図は、 補体依存性細胞障害作用への影響を表す、 細胞数 を示すグラフで-ある。 発明の構成
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明第 1態様の蛋白質は、 天然型メ ンブレンコフ アクター プロテイ ン （M e m b r a n e C o f a c t o r P r o — t e i n , M C P ) の少なく とも膜貫通領域および細胞質内 領域が欠如していることを特徴とする新規な薬理学的特性を有 する蛋白質である。
図 1は国際公開番号 W09 1 Z020 02の図 3を引用した ものであり、 c D N Aよ り与えられた 6種の MC Pのイ ソ体の 搆造を表わしている。 図 1 中の 4 S C R sは、 4つの S C R 領域、 S T ( S T A 、 S TB および S T C ) は富セリ ンースレ ォニン 域 (S e r i n e— " t h r e o n i n e r i c h r e a g i o n ) 、 U Kはその配列の機能が未知である U K領 域 （ u n k n o w n ) 、 H Yは疎水性領域 （ h y d r o — h o b i c r e a g i o n ) 、 C Y T ( C Υ Τ 1 およ び C Y T 2 ：) は細胞質内領域 （ c y t o p l a s m i c t a i l r e a g i o n) を表わしてレ、る。
前記天然型 M C Pの膜貫通領域とは、 通常、 細胞膜上に膜を 貫通した形で存-在する天然型 MC Pが、 膜を貫通している領域 をさし、 それは図 1に HYとして表記されてい.る部分をさす。 また細胞質内領域とは図 1中で C Y T 1 あるいは C YT2 と表 記されている部分をさす。 アミノ酸配列上において例示する と、 国際公開番号 W 0 9 1 Z02002の図 1中のアミノ酸番 号 2 9 5〜3 1 7が膜貫通領域で 3 1 8〜3 5 0が細胞質内領 域である。
本発明第 1 態様の少な く と も膜貫通領域および細胞質内 領域が欠如 している蛋白質は、 図 1 の M C P ク ローン中の S T ( S T A 、 S T B 、 S T c ) および U Kに相当する蛋白質 上の領域部分、 または、 それら領域部分の両端の境界の任意の 点から、 C末端側のァミノ酸配列を欠如された蛋白質である。 具体的には、 [ 4 S C R s — S T C — U K ] 構造の蛋白質、
[ 4 S C R s - S T A - S T B - S T c ] 構造の蛋白質、 [ 4 S C R s - S T C ] 構造の蛋白質、 [ 4 S C R s ] 構造の 蛋白質等が挙げられる。
図 1 に示される様に、 MC Pにはその m R N Aのスプライ シ ング様式の相違によって少なく と も 6種のイ ソ体が存在するこ 一とが明かとなっている （国際公開番号 W 0 9 1 Zひ 2 0 0 2 および P o s t , T W . e t a 1 . J . E x p . M e d . 1 74 9 3 - 1 0 2 , 1 9 9 1 ) 。 本発明の、 新 しい着想に基づき創造された新規な活性を有する蛋白質の中 で、 下記式 1 (配列番号 1 ) に示したものは国際公開番号 W 0 9 1 / 0 2 0 0 2明細書、 図 1 中のアミ ノ酸番号— 3 4〜 一 1 、 2 5 2〜 2 6 6および 2 9 5以降を欠如させたものであ り 、 下記式 2 (配列番号 2 ) に示 したものは国際公開番号 W0 9 1 Z 0 2 0 0 2明細書、 図 1中のアミノ酸番号一 3 4〜 一 1および 2 5 2以降を欠如させたものである。
また、 さらに、 本発明の蛋白質は、 下記式 1に示したァミノ 酸配列の少なく とも一部を有する場合、 下記式 1 または 2に表 されるアミノ酸配列を有する場合、 さらには、 下記式 1 または 2で示される場合が好適である。
(式 1 )
Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu lie Gly Lys Pro
1 5 10 15
Lys Pro Tyr Tyr Glu lie Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys
20 25 30
Gly Tyr Phe Tyr lie Pro Pro Leu Ala Thr His Thr lie Cys Asp Arg
35 40 45
Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr
50 55 60
Cys Pro Tyr lie Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gin Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80
Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gin Met His Phe lie Cys Asn Glu Gly
85 90 95
Tyr Tyr Leu He Gly Glu Glu lie Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser
100 105 110
Val Ala lie rrp Ser Gly Lys Pro Pro lie Cys Glu Lys Val Leu Cys
115 120 125
Thr Pro Pro Pro Lys He Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val
130 135 140 、
Glu .Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160
Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu lie Gly Glu Ser Thr He Tyr Cys
165 170 175
Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val
180 185 190
Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gin lie Ser Gly Phe
195 200 205 OTI 901 ΟΟΐ
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gin He Ser Gly Phe
195 200 205
Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys
210 215 220
Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr lie Val Cys Asp Ser Asn Ser
225 230 235 240
Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys
245 250 251 また、 本発明の第 1態様である新規な薬理学的特性を有する 蛋白質は、 従来知られていた M C P とは大き く異なり、 液相中 の C 3 bに対する場合と同様に従来ならば作用を示さない固相 上の C 3 bに対する I 因子のコファクターと しての作用を有す る こ と を特徴 と する新規な薬理学的特性を有する蛋白質で ある場合が好ま しい。 I 因子のコフ ァ クターと しての作用 と は、 補体系において C 3 bが不活化する、 すなわち、 C 3 bか ら i C 3 bへの変換反応における、 I因子の補因子としての活 性作用であり、 より具体的には、 外因的に補充された本発明の 蛋白質が補体系制御因子の 1 つである I 因子の補因子と し て作用し、 結果と して補体系成分 C 3 bを不可逆的に分解しそ の 3 b と しての作用を抑制あるいは消失せしめるこ とをさ す。
この現象は当該技術分野の一般的常識を覆すものであり、 未 だかって何人も推定し得なかったことである。 事実、 国際公開 番号 W 0 9 I / O 2 0 0 2明細書中で、 その発明者は可溶型 M C Pを創造してはいるが、 このような新規な薬理学的特性を 認識あるいは推定するには至っておらず、 逆に可溶型 M C Pは 固相土の C 3 bに対しては I因子のコファクターとしての作用 が無い旨の開示をしている。 従って、 本発明の明細書に開示さ れる M C Pは、 国際公開番号 W O 9 1ノ 0 2 0 0 2に開示され たものとは異なるのみならず、 発明として一線を画すものであ る。
固相上の C 3 b とは、 活性化された補体系成分 C 3 bが生体 組織や細胞あるいは生体を搆成する有形成分さらには生体内に 人為的に設置された人工有形物等に共有結合または非共有結合 を介して結合している状態を指し、 例えば細胞膜などの固相ま たは不溶性基質に吸着または結合した状態で存在する C 3 b等 がある。 また、 液相中の C 3 bとは、 例えば生体液や各種溶液 中に遊離した状態で存在する C 3 bまたは可溶化された基質に 結合した C 3 b等である。
本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白質は、 既知である M C Pから固相上の C 3 bへの作用に対して障害と なる、 M C P中の一部を除く という新たな着想に基づき創造されたも ので、 固相上の C 3 bに対して、 液相中の C 3 bに対するコ ファクター活性と同様に作用を示すものであれば如何なるもの でもよい。 本発明の蛋白質の基本的な性質 （物性、 活性等） 、 特に、 固相上の C 3 bに対する作用の有無を変化させるこ とな く 、 そのアミノ酸配列に欠失、 付加あるいは置換といった変異 を導入するこ とができる。 例えば、 疎水性アミノ酸残基の他の 疎水性ア ミ ノ酸残基への置換、 陽性電荷を持つア ミ ノ酸の 他の陽性電荷を持つアミノ酸への置換、 G l uと A s pあるい は L y s と H i s と A r gでの相互置換、 または l i e , V a 1 , M e t , L e uの群間、 G l y， A l a , S e r , C y sの群間、 および Τ Γ Ρ , T y r , P h eの群間での置換 は推定できる。 従って、 前記式 1 または 2で示されたアミノ酸 配列そのもので規定される蛋白質、 もしく は上記式 1 または 2 で示されたアミノ酸配列を少なく とも有する蛋白質の、 N末端 および/または C末端および Zまたは内部において、 一つ以上 のアミノ酸の置換、 欠失、 付加等が生じてなる変異体も、 本発 明の新規な薬理学的特性を有する蛋白質の上記の基本的な性質 が認められるかぎり、 本発明の蛋白質に包含される。 加えて、 該変異体に、 糖付加アルキル化、 酸化、 還元、 水解等、 種々の 化学修飾を施してなる物質、 あるいは薬理学上許容されうる酸 または塩基との塩を形成させてなる物質等も、 もちろん、 本発 明の新規な薬理学的特性を有する蛋白質に包含される。
また、 本発明第 1態様の新規な薬理学的特性を有する蛋白質 は、 メ リフィールド法のような標準的なポリぺプチ ド合成法に より、 あるいは本発明の蛋白質分子を含有する天然物 M C Pか ら得られたものであってもよいが、 好ましく は、 後記する本発 明の第 2態様の D N A等を用いて遺伝子工学的手法により、 培 養細胞によって産生されたものがよい。 また、 培養細胞が、 大 腸菌および哺乳動物培養細胞である場合、 より好ましい。 若し く は、 国際公開番号 W O 9 1 / 0 2 0 0 2明細書中で開示され ている M C Pの塩基配列よ り固相上の C 3 bへの作用に阻害的 な部位に相当する塩基配列を欠失させた塩基配列すなわち、 下 記式 3 (配列番号 3 ) の塩基配列を有する D N Aの少なく と も
—部を用いる こ とによ って、 遺伝子工学的に得られたもので あってもよい。
(式 3 )
TGTGAGGAGC CACCAACAH TGAAGCTATG GAGCTCA G GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGAHGGTG AACGAGTAGA mTAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCH 120 GCCACCCATA CTATITGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180
TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240
GGGACTTACG AGTTTGGm TCAGATGCAC ΉΤΑΤΠΌΤΑ ATGAGGGHA ΉΑϋΠΑΚΠ 300
GGTGAAGAAA HCTATAHG TGAACHAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360
CCAATATGTG AAAAGGTTIT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420
TTTAGTGAAG TAGAAGTAH TGAGTATCTT GATGCAGTAA CHATAGHG TGATCCTGCA 480
CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACmOTGGA GAGAGCACGA TTOOTGTGG TGACAAHCA 540
GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600
AATGGAAAAC AGATATCAGG ATITGGAAAA AAATTITACT ACAAAGCAAC AGnATGTTT 660
GAATGCGATA AGGGinTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA HGTCTGTGA CAGTAACAGT 720
ACHGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCH AAAGGTCCTA GGCCTACTTA CAAGCCTCCA 780
GTCTCAAAH ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACITGACAG TITGGAnGA 840
本発明の蛋白質を遺伝子工学的に得るには、 一般的に使 用されている宿主一ベク ター系を用いる こ とができ る。 例 えば宿主と して大腸菌を用いる場合は、 プロモータ一と して L a c U V 5 , ト リプトファ ンプロモータ一や ； L P L プロモー ター等が使用可能である。 また、 ； Lファージ系のベクターであ る ； L g t l lを用いて、 /3 —ガラク トシダーゼとの融合蛋白質 として得ることもできる。
さらに、 哺乳動物培養細胞を宿主と して使用する場合は、 サ ル由来 C 0 S細胞、 チャイニーズハムスター由来 C H 0細胞、 マウス由来 3 T 3細胞あるいはヒ ト由来線維芽細胞等が好適 である。 これらを宿主とする場合には、 プロモーターと して、 S V 4 0初期プロモーター、 アデノ ウイルス主要後期プロモー ターあるいは /3 —ァクチンプロモータ一ゃボリペプチ ド鎖伸長 因子プロモーター等が使用できる。 これらの宿主一ベクター系 を用いた場合、 各々の宿主が好適に増殖し得る条件下で培養 し、 かつ、 各々のプロモーターが機能するような条件を与える こ とによって、 本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白質を 得ることができる。
本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白質は、 精製された 蛋白質である場合がより好ましいが、 特にこれに限定されるも のではない。
得られた新規な活性を有する蛋白質は、 現在一般的に用いら れている蛋白性物質の精製法を用いて精製するこ とができる。 例えば、 塩析、 酸 ' アルカ リ沈澱法、 限外濾過法、 イ オン交換 クロマ トグラフィ ー、 ゲル濾過クロマ トグラフィ ー、 疎水クロ マ トグラフィー、 吸着クロマ トグラフィ ー、 ァフ ィ 二ティ ーク 口マ トグラフィ ー、 H P L C、 クロマ ト フォーカシング、 電気 泳動法等を適宜組み合わせるこ とによって実施でき る。 例え ば、 本発明の蛋白質を含有する溶液を 0. 0 2 M N a C 1 / 1 0 mM 燐酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) に対して透析した後、 ィ オン交換クロマ トグラフィーに付し、 N a C l の直線濃度勾配 によ.つて溶出する。 活性画分を集め、 更にモノ クローナル抗体 を用いたァフィ ユティークロ トグラフィーに付す。 これをグ リ シン （ G l y c i n e ) - H C 1緩衝液 （ P H 2. 5 ) で溶 一 出し、 活性画分を得ればよい。 あるいは、 M C Pを精製する公 知の方法 （ S e y a， T . e t a 1 . J . E x p . M e d . 1 6 3 83 7 - 8 5 5 , 1 9 8 6 ) に従って実施 しても よい。 M C Pの活性は、 I 因子存在下での C 3 bの 不活化、 即ち、 C 3 bから i C 3 bへの変換を確認すればよ .い。 例えば、 瀬谷らの方法 （ S e y a , T . e t a 1 . C l i n . C h i m . A c t a 1 1 9 1 8 9 - 1 9 6 , 1 9 8 2 ) に従って蛍光標識した C 3 bを作製し、 これを基質 として I因子存在下で MC P分子を添加する。 反応終了後、 β 一メリレ力プ 卜ェタノ一リレ (m e r c a p t o e t h a n o l j 等で還元し、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム一ポリ アク リルアミ ド電 気泳動 （以下、 S D S— P A G Eと記す） に付す。 そのゲルを フルォロメーターで走査するこ とによ り 、 C 3 bから i C 3 b への変換の状態をその分子量の相違から確認すればよい。
本発明の第 2態様は、 本発明の第 1態様の新規な薬理学的特 性を有する蛋白質をコ一ドする塩基配列を有する D Aを提供 する。 本発明第 2態様の D N Aは下記式 3 (配列番号 3 ) に示 した塩基配列の少なく とも一部を有する場合、 下記式 3または 下記式 4 (配列番号 4 ) で示した塩基配列を有する場合好適で あり、 さらには下記式 3または 4で示した塩基配列で規定され —る場合より好適である。
(式 3 )
TGTGAGGAGC CACCMCA TGAAGCTATG GAGCTCAHG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGA GGTG AACGAGTAGA HATAAGTGT AAAAAAGGAT ACHCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180
TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CC1TTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240
GGGACHACG AGTITGGTTA TCAGATGCAC nTATITGTA ATGAGGGHA HAOTAAH 300
GGTGAAGAAA TOTATAHG TGAACHAAA GGATCAGTAG CAATITGGAG CGGTAAGCCC 360
CCAATATGTG AAAAGGTITT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420
TTTAGTGAAG TAGAAGTAH TGAGTATCH GATGCAGTAA OTATAGHG TGATCCTGCA 480
CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTA GGA GAGAGCACGA TITAnGTGG TGACMTTCA 540
GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATITCC AGTAGTCGAA 600
AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTITACT ACAAAGCAAC AGmTGTIT 660
GAATGCGATA AGGGimTA CCTCGATGGC AGCGACACAA HGTCTGTGA CAGTAACAGT 720
ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCIT AAAGGTCCTA GGCCTACTO CAAGCCTCCA 780
GTCTCAAAH ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACHGACAG TUGGA GA 840
(式 4 )
TGTGAGGAGC CACCAACAH TGAAGCTATG GAGCTCAHG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGA GGTG AACGAGTAGA HATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCIT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180
TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240
GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC ΉΤΑΤΠΏΤΑ ATGAGGGHA ΤΐλΟΉΑΚΠ 300
GGTGAAGAAA TOTATAHG TGAACHAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360
CCAATATGTG AAMGGTTIT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420
TTTAGTGAAG TAGAAGTAH TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGITG TGATCCTGCA 480
CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACmO GGA GAGAGCACGA nTAHGTGG TGACAATTCA 540
GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600
AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGnATGTTT 660
GAATGCGATA AGGGTnTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA HGTCTGTGA CAGTAACAGT 720
ACHGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCIT AAATGA 756 式 3に示したものは国際公開番号 W O 9 1 / 0 2 0 0 2明細 書の図 3、 すなわち本願図 1のクローン H 2— 1 5のシグナル ペプチ ド領域 （ S P ) 、 疎水性領域 （H Y ) および細胞質内領 域 C Y T 2 を欠如させたものに相当する。 式 4に示したもの は、 天然型 M C Pの 4つの S C R部分 （ 4 S C R s ) に相当す る。
本発明の D N Aは、 天然 M C P由来のシグナルペプチ ド等に 相当する塩基配列をさらに、 有していてもよい。 本発明第 2態様の D N Aは、 その全てを一般的な D N A合成 法によって得られたものでもよく 、 また、 部位特異的塩基配列 変異法によって公知の M C P遺伝子の適当な部位に翻訳停止コ ドンを導入するこ とによつても得られたものであってもよい。 好ま し く は M C Pをコードする m R N Aをクローニングするた めの公知の方法 （ L u b l i n , DM. e t a 1 . J . E p . M e d . 1 68 1 8 1 — 1 9.4， 1 9 8 8 ) に 従ってその c D N Aを得た後、 その c D N Aを用いて遺伝子ェ 学的手法によ り不用な部分を削除および再構成するこ とによつ て得られたものがよい。
例えば、 図 1のクローン H 2— 1 4あるいは H 2 — 1 5をテ ンプレート と して、 その疎水性領域直前に翻訳停止コ ドンを有 するような部分ミスマッチブライマーを用いて遺伝子連鎖増巾; 法 ( P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n , 以下 P C Rと記す） によ り人工的に翻訳停止コ ドンを付加した C末端遺伝子部分を得る。 これを適当な制限酵素で切断し、 同 様に制限酵素処理した N末端領域遺伝子と結合させればよい。
また、 本発明の第 2態様の D N Aは第 1態様の M C Pをコ一 ドし適当な条件下で、 発現し得るような D N Aであれば如何な る塩基配列を有する D N Aでも良く 、 さらには、 前記式 3また は前記式 4で示された塩基配列に規定される D N Aであって も、 該塩基配列に加え、 その 5 ' 末端および Zまたは 3 ' 末端 および Zまたはその中間部に任意の 1つ以上の塩基が付加また は置換されたものであってもよい。 当該技術分野では、 遺伝暗 号の縮重に伴い、 それがコードする蛋白質のアミノ酸配列を変 化させることなく遺伝子の塩基配列を置換することができる。 即ち、 ほとんどのアミノ酸は複数個の遺伝暗号でコ一ドされて おり、 例えば、 V a lは G TT， G T A , G T C , GT Gの何 れかでコードされ、 A l aは G CA， G C T , G C C , G C G の何れかでコードされる。 従って、 本発明の第 2態様の D N A はそのコードするアミノ酸配列に変化を与えない限り、 その塩 基配列の 1つ以上の塩基が他の塩基に置換された変異体をも包 含する。 なお、 配列番号 3および 4に示した塩基配列を有する D N Aを含有するプラスミ ド ( p M 8 5 1 ) によ り形質転換さ れた大腸菌株 [H B 1 0 1 (pM8 5 1 ) ] は通商産業省工業 技術院微生物工業技術研究所に寄託されている [寄託番号微ェ 研菌寄第 P - 1 2 7 1 5号より、 受託番号 F E RM B P - 4 1 9 5の国際寄託に移管] 。
さらに本発明の第 3態様は、 第 1態様の新規な薬理学的特性 を有する蛋白質を少なく とも 1つの有効成分として含有するこ とを特徴とする、 補体系が自己細胞に対して障害的に作用する 疾患に用いるための医薬組成物を提供する。 本発明の医薬組成 物は、 第 1態様のみで構成されていてもよいが、 本発明の新規 な薬理学的特性すなわち、 固相上の C 3 bに作用する活性を損 なわない限り、 一般的に使用される製剤学的混合物である賦型 剤、 安定化剤あるいは溶解補助剤等を含有していてもよい。 具 体例と して、 リ ンガー液、 燐酸緩衝液、 ヒ ト血清アルブミ ン、 水解ゼラチン、 蔗糖、 デキス ト ラ ン、 ポ リ エチレングリ コール 等があり、 薬剤形態によ '；）、 適宜選択使用される。
本発明の医薬組成物の投与量は患者の年齢、 体重、 性別およ びその疾患の種類や程度に よ り 適宜調節されるが、 通常は 1 n g / k g ~ l O m g / k g x 子ま し く は l g Z k g〜 1 0 m g / k g , さらに好ま しく は 1 0 g / k g〜 5 m g / k gがよい。 このような治療の対象となる疾患は、 補体系が自 己細胞や組織に対して障害的に作用する疾患であればよいが、 なかでも腎炎、 肝炎、 血管炎、 喘息、 自己免疫疾患、 虚血性臓 器障害、 再濯流障害、 関節リ ウマチ、 移植組織片拒絶、 ショ ッ ク、 多臓器不全、 播種性血管内凝固症、 成人呼吸窮迫圧症候群 ( A R D S ) 、 および血液透析に伴って発症する A R D S様疾 患やショ ッ クあるいは火傷によるショ ッ クである場合が好ま し レ、。
本発明第 3態様の医薬組成物を用いた治療方法は、 新規な薬 理学的特性を有する本発明の蛋白質を、 その有効量が患部に到 達するような方法で投与されれば如何なるものでもよい。 例え ば、 静脈内、 動脈内、 皮下、 筋肉内、 経口のような全身的投与 や、 関節腔内、 髄腔内のような局所投与、 あるいは鼻腔内、 気 管内、 口腔内投与のような経粘膜投与、 さらには座剤等による 腸管内投与による治療方法が含まれる。
実施例
以下に本発明を実施例を も っ て よ り 具体的に示すが、 こ れは本発明の実施様態の一つの例示であり 、 本発明はこれに限 定されるものではない。 なお、 実施例中の学術用語、 略号等は 特に断らない限 り 当該技術分野で一般的に使用されている ものに従った。 また、 遺伝子組換えに関わる基本的操作は、 マ ユアチス等 （M a n i a t i s , T . e t a 1 . ) 、 " モ レキユラ一 クローニング、 ァ ラボラ ト リー マ ニ ュ ア ル ( M o l e c u l a r C l o n i n g , A L a b. o — r a t o r y M a n u a l ) " コールド ス プ リ ン グ ハーバー ラボラ ト リー （ C o l d S p r i n H a r b o r L a b o r a t o r y ) 、 1 9 8 9 、 蛋白質精製 に関わる基本的操作は、 日本生化学会編 " 新生化学実験 講座第 1巻 蛋白質 I 分離 · 精製 ， 性質" 東京化学同人 1 9 9 0 をそれぞれ参考として実施した。 各種機器、 試薬の 使用法は各々附属の使用説明書に従った。
(実施例 1 ) M C P遺伝子の C末端相当領域の改変 1
新規な薬理学的特性を有する本発明の新規な薬理学的特 性を有する蛋白質を遺伝子工学的に産生させるために、 プ ラスミ ドベクターである p U C 1 9にクローン化された M C P 遺伝子 （以下クローン名を P U C 1 9 - M C P ( D ) と記 す） を改変した。 用いた M C P構造遺伝子は図 1のクローン H 2 - 1 5に相当し、 これはポス ト等 （P o s t , TW. e t a 1. ) 、 ジャーナル ォブ ェクスペリメ ンタル メディ スン （ J . E x p . M e d . ；) 、 1 7 4 9 3 - 1 0 2 , 1 9 9 1の図 4に記載のものと同一である。
まず P C R用のプライマーとして以下の 2種の一本鎖 D N A を D N A合成機 （ 3 8 1 A型， アブライ ドパイォシステムズ 社） を用いて合成した。
センスプライマー ：
5 ' - GT TAT GT T T GAAT G C GAT A
A G G - 3 '
アンチセンスブライマー：
5 J - C C G G T AC C C TAT CAA T C CAAAC T G T C AA G TAT T C C - 3 '
1 0 mM 卜 リ ス （ T r i s ) - H C 1 ( p H 8. 3 ) / 50 mM K C 1 / 1. 5 m M M g C 12 / 0. 0 1 %ゼラ チン溶液 1 0 0 μ 1に、 上記 2種のプライマー各々 0. 8 /i g と、 テンプレート と して P UC 1 9— M C P (D) 5 0 n gお よび耐熱性 D N Aポ リ メ ラーゼ （パーキンエルマーシータ ス社） 2 . 5単位さ らに基質と して 2 0 0 μ Μとなる よ う に d N T P ( Nは A， T , C， Gの 4種を表す） を溶解し、 P C R用恒温槽 （サーマルサイ ク ラ一， パーキ ンエルマ一 シータ ス社） を用いて P C R (遺伝子連鎖増幅法） を実施 した。 操作は、 ミカェル等 （M i c h a e l , A I . e t a 1 . ) " P C R プロ ト コール （ P r o t o c o l s ) , ァ ガイ ド ト ウ メ ソ ヅ ズ ア ン ド アプ リ ケー シ ョ ン ( A G u i d e t o M e t h o d s a n d A p - p l i c a t i o n s ) " アカデミ ッ ク ブレス (A c a— d e m i c P r e s s ) , 1 9 9 0を参考と して実施した。 反応終了後、 フヱノール/クロ口ホルム抽出、 エタノール沈澱 法によ り 増幅された約 1 9 0 b pの D N Aフ ラグメ ン ト を 得た。 これを制限酵素 K p n I (宝酒造社） および B s m I (ニューイ ングラ ン ドバイオラブ社） とで二重消化し、 同様の 制限酵素によ り消化された p U C 1 9— M C P ( D ) 由来ラー ジフラグメ ン ト と D N Aリガーゼ （宝酒造社） を用いて結合し た。 得られたプラスミ ドを P U C 1 9— s M C P ( C ) と命名 した。 実施例 1の工程を図 2に略記した。
(実施例 2 ) M C P遺伝子の N末端近傍相当領域の改変 遺伝子組換え時の操作性の向上を目的と して、 M C P遺伝子 の N末端近傍相当領域の改変を実施した。 まず、 人工リ ンカ一 を得るために以下の 2種の一本鎖 D Aを実施例 1 と同様の方 法で合成した。
合成リ ンカー （ 1 )
アッパース トラ ン ド ：
5 ' - AAT T C G T C GA C AT G GA G C C T
C C C - 3 '
合成リ ンカ一 （ 2 )
ロア一ス トラン ド ：
3 ' - G CAG C T G T A C C T C G GA G G G C
C G G - 5 '
これをァニールした後、 これと、 実施例 1で得られた p U C 1 9 - s MC P (C) を制限酵素 E c 0 R I (宝酒造社） およ び E c o 5 2 I (宝酒造社） で二重消化して得られるラージフ ラグメン トとを-実施例 1 と同様の方法で結合した。 得られたプ ラスミ ドを P U C 1 9— sMC P (D) と命名した。 なお、 実 施例 2の工程を図 3に略記した。
(実施例 3 ) M C P遺伝子の C末端相当領域の改変 2
実施例 2で得られたプラスミ ド p U C 1 9— s M C P ( D ) を用いて、 さらに C末端相当領域に改変を有する MC P遺伝子 を作製した。 まず、 以下の 2種のプライマーを実施例 1 と同様 の方法で合成した。
センスプライマー ：
5 ' — G T T A T G T T A A T G C G A T A
A G G - 3 '
アンチセンスプライマー ：
5 ' - AA G G T A C C C T A T CA T T T AA G A C A C
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これらを用いて、 p U C 1 9— s M C P ( D ) をテンプレー ト として実施例 1 と同様の方法で P C Rを実施した。 得られた 約 1 0 0 b pのフラグメン を制限酵素 K p n I (既出） およ び B s m l (既出） で二重消化し、 これと、 同様の制限酵素に よ り消化された P U C 1 9— s MC P ( D ) 由来ラージフラグ メ ン ト とを実施例 1 と同様の方法で結合した。 得られたプラス ミ ドを p U C 1 9— S M C P 1 2 34と命名した。 なお、 実施 例 3の工程を図 4に略記した。
(実施例 4 ) C O S I細胞発現用プラスミ ドの構築
哺乳動物培養細胞での強力な発現ベクターと して知られてい る p E F— B O S (M i z u s h i m a , S . e_t a 1 . u c l e i c A c i d s R e s . 1 8 5 3 2 2 , 1 9 9 0 ) の改良型ベクターである p E F N— Iを基に C O S I細胞発現用プラスミ ドを構築した。 P E F N— I は、 S V 4 0の複製開始点 （ 0 r i ) 、 ヒ トポリペプチ ド鎖伸長因子 1 αのプロモーター領域および S V 40のポリ Α付加シグナル 配列を有する。
実施例 2で得られた p U C 1 9— s M C P ( D ) あるいは実 施例 3で得られた p U C 1 9 一 s MC P 1 2 3 4を制限酵素 E c o R Iおよび Κ ρ η Ιで二重消化し、 各々のプラスミ ドの 有する MC Ρ構造遺伝子断片 （スモールフラグメ ン ト） を単離 した。 これらの断片を各々、 同様の制限酵素で二重消化した P E F Ν - I と実施例 1 と同様の方法で結合した。 得られたブ ラスミ ドを各々 P M 8 5 1および ρ Μ 8 5 2 と命名した。 な お、 実施例 4の工程を図 5に略記した。
Ρ Μ 8 5 1は配列番号 3に示される塩基配列を ρ Μ 8 5 2は 配列番号 4に示される塩基配列を各々有するプラスミ ドで ある。
(実施例 5 ) C 0 S I細胞での発現
実施例 4で作製した ρ Μ 8 5 1および ρ Μ 8 5 2 を各々 C 0 S I細胞へ導入し、 本発明の蛋白質を発現させた。 即ち、 0. 5 j gの P M 8 5 1 あるいは ρ Μ 8 5 2を 5 JLO 1の 1 0 m M ト リ ス塩酸緩衝液 （以下 T r i s - H C 1 と記す） ( p H 7. 4 ) / 1 m M エチ レ ンジァ ミ ン四酢酸 （以下 E D T A と記す） 溶液に溶解し、 0 . 2 m g /m l D E A E—デキス トランおよび 5 0 mM T r i s — H C 1 ( p H7. 4 ) を含有するダルベッ コ変法イーグル培地 （ D— M E培 地， 曰水製薬社） 7 0 0 ii l を添加し、 D N A— D E A Eデキ ス トラン混合液を作製した。 直径 3. 5 c mの培養プレ一 ト内 でセミ コンフルェン トまで単層培養された C 0 S I細胞にその D N A— D E A Eデキス トラン混合液を滴下し、 5 % C 02 Z 9 5 %空気下 3 7 eCにて培養した。 4時間後、 D N A— D E A Eデキス トラン混合液を除去し、 1 %ゥシ胎児血清 （ァ一バ イ ンサイエンティ フィ ック社） を含有する D.— M E培地を添加 した。 2 4時間培養後、 培地を血清不含の D—M E培地に交換 し、 さらに 48〜9 6時間培養した。 この培養上清を回収し、 本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白質の精製に供し た。
(実施例 6 ) 培養上清からの本発明の蛋白質の精製
実施例 5で得られた培養上清を 0. 0 5 %ノニデッ 卜 P— 4 0 (以下 N P - 40と記す） 含有 2 0 mM酢酸緩衝液 （ p H 5. 0 ) に対して 4でで一晩透析した。 沈澱物を遠心分離操作 によ り 除去し、 上清をク ロマ ト フォ一カ シ ングカ ラムクロ マ トグラフィ一に供した。 即ち、 クロマ トフ ォ一 シングゲル (フ アルマシア社） を充填し、 1 0 m M T r i s — H C 1 ( p H 9. 0 ) / 0： 0 5 % N P - 4 0で平衡化したカラム (直径 2 c m X長さ 7 0 c m ) に試料を付し、 2 0 mM 酢酸 緩衝液 （ p H 4. 7 5 ) 0. 0 5 % N P - 4 0 /' l 0 % ポリ パヅ フ ァー 7 4 (フ アルマシア社） でカラムを洗浄した 後、 1 0 % ポリパヅファー 7 4にて作製された 2 0〜 2 5 0 mM酢酸緩衝液 （ p H 4. 3 ) の直線濃度勾配にて-溶出した。 参考例 4に示した M C P の酵素免疫測定法による陽性画分 をブールし、 1 0 mM 燐酸緩衝生理食塩液 （以下 P B S と 記す， p H 7. 4 ) / 0. 0 5 % N P— 4 0に対して透析し た。 これを参考例 2 に作製法を示した W C P に対する単ク ローン性抗体をリガン ドとしたァフィ二ティ カラムクロマ トグ ラフ ィ 一に供した。 ァフ ィ 二ティ カ ラム （直径 2 c m X長 さ 1 0 c m) に試料を付し、 P B S ( p H 7. 4 ) / 0. 0 5 % N P — 4 0、 次いで P B S ( p H 7. 4 ) / 0 - 5 M N a C l Z O . 0 5 % N P — 4 0 でカ ラムを洗净した。 0 . 1 7 M グリ シン （ G l y c i n e ) — H C 1 緩衝液 ( p H 2. 5 ) /0. 0 5 % N P — 4 0 を用いて蛋白質を 溶出 し、 ただちに溶出画分 1 0 m 1 に対し 1 m 1 の 1 M T r i sを添加し、 中和した。 これを 2 0 m M 燐酸 緩 衝 液 ( P H 6 . 0 ) / 0 . 0 5 % N P — 4 0に対して一晚透析し た後、 濃縮装置 （M s . B T A U R Y - K N , ア ト一社） を用 いて濃縮した。 実施例 6の工程によって本発明の蛋白質を、 回 収率 Ί 0 %以上で、 S D S — P A G E後の銀染色にて単一バン ドとなるまで精製できた。
(実施例 7 ) 固相上の C 3 bに対する作用
細胞膜から抽出された天然型 M C Pは、 液相中の C 3 bには I因子のコファクター活性を示すが固相上の C 3 bに対しては 作用を示さないこ とが瀬谷等によ って明らかにされている S e y a , T . e jt 1 . B i o c h e m . J . 2 6 4 5 8 1 - 5 8 8 , 1 9 8 9 ) 。 そこで本発明者等は、 実施例 6で得られた蛋白質について固相上の C 3 bに対する作 用について検討'した。 方法は、 この瀬谷等の文献に記載の方法 に準じて実施した。
まず、 以下に記載の公知の方法に従って補体系の各成分を精 製した。 C マツモト等 （M a t s um o t o , M . et al. ) ジャーナル ォブ ィムノ ロジー
( J m m u n 0 ) 、
4 2 2 7 4 3 - 2 7 5 0 , 9 8 9
C 2 ： ナガサヮ等 （N a g a s a w a , S . et al.)
プロシーディ ングス ォブ ザ ナショナル アカデミー ォブ サイエンス ォブ ザ
ユナイテッ ド ステイ ト ォブ アメ リカ
P r o c a t A c a d . S c
U S A) 、
74 2 9 9 8 - 3 0 0 9 7 7
C 3 セャ等 （S e.y a , T et al. ) 、 ジャーナル
ォブ バイオケミスト リー （ J . B i o c h e m. )
8 9， 6 5 9 - 6 6 4 , 1 9 8 1
C 4 ： ナガサヮ等 （ N a g a s a w a， S . et al.)
モレキュラー ィムノロジー （M o l e c .
m m u n o 1 . ) 、 1 7 3 6 5 - 1 3 7 2
9 8 0 B セャ等 （ S e y a , T . et al.) 、 コンブレメ ン ト
( C o m p l e m e n t ) 、 2 1 6 5 - 1 74
1 9 8 5
D ボラナキス等
( V o l a n a k i s , J E . et al. )
ジャーナル ォブ ィムノ ロジー
( J . 'I mm u n o l . ) 、 1 1 9_
3 3 7 - 3 4 2 , 1 9 7 7
ナガサヮ等 （ N a s a s a w a , S . et al.) ジャーナル ォブ ィムノ ロジー
( J m rri u n o 丄 . ) 、 —1—2— 5—
5 78 - 5 8 2 , 9 8 0
さらに精製された C 3の一部は過沃素酸標識試薬 （ピアースケ ミカル社） を用いて 125 I·で標識した。
赤血球膜上に固着した C 3 bを得るために、 ヒッジ洗浄赤血 球 （ E， 日研生物社） と抗ヒッジ赤血球ゥサギ抗体 （A， コ一 ディ ス社） を反応させた後、 順次 C 1、 C 4、 C 2を添加し、
E A C 4 b 2を形成させた れに少量の未標識 C 3を加え
E A C 4 b 2 a 3 bを形成させた後、 125 I標識 C 3、 B因子 および D因子を各々添加して E A 1 25 C 3 b (赤血球膜上に 固着化じた 125 I標識 C 3 b ) を得た。 この赤血球 1 X 1 07 〜3 X 1 07 細胞を基質として、 これに 1 gの I因子および 実施例 6で得た蛋白質 40 n を加え、 総量 1 6 0 μ 1 として 3 7。Cにて 1時間放置した。 3 %N P— 40および 1 0 % ドデ シル硫酸ナト リ ウム （S D S ) を各々 1 0 j l、 3—メルカブ トエタノールを 5 /x 1および S D S— P AG E用色素.混合液を 45 1加えることで反応を停止させ、 S D S— P A G Eで分 離後ォートラジ才グラフィ一を用いて固相上の C 3 bの分解状 態を解析した。 なお、 H S B— 2細胞株の細胞膜画分よ り実施 例 6に記載の方法に準じて精製した天然型 M C Pを C 3 b分解 能の対照として用いたが、 これは固相上の C 3 bには作用しな い為、 反応開始時に 0. 4 %となるように N P— 40を加え予 め赤血球膜を溶解し、 C 3 bが液相中に存在するように処理し た後に反応を実施した。 - その結果を図 6に示す。 図 6は各種処理を行った 125 Iで標 識された C 3 bの各種反応処理後の試料の S D S—. P A G Eの オートラジオグラムである。 各レーンの試料の処理条件を以下 に示す。 レーン 1 ： 固相化 C 3 b + I 因子
レーン 2— ： 固相化 C 3 b + I 因子 +天然型 M C P
レーン 3 ：
固相化 C 3 b + I 因子 +天然型 M C P + N P - 4 0 ( N P — 4 0は固相上の C 3 bを可溶化するために 添加）
レーン 4 ： 固相化 C 3 b + I因子十本発明の蛋白質 レーン 1 と レーン 2を比較すると C 3 bのバン ドパターンに は変化が見られない。 これは天然型 M C Pは固相上の C 3 に 対して-は I 因子のコファクターと しての活性を持たないこ とを 示している。 これに N P — 4 0を加えたレーン 3では、 レーン 2に比較して 1 1 6 K d〜 1 2 0 K dのバン ドの消失がみられ る。 これは、 N P — 4 0によって可溶化された C 3 bが、 天然 型 M C Pをコファクターとする I因子によって分解されたこ と を示す。 、 レーン 4は、 固相上の C 3 bに I 因子と本発明の蛋白質を N P — 4 0非存在下で反応させたものであるが、 レーン 3 と同 様に 1 1 6 K d〜 1 2 0 K dのバン ドの消失がみられる。 これ は本発明の蛋白質が、 天然型 M C P と は異な り 、 固相上の C 3 bに対しても I 因子のコファクターと しての作用を有する こ とを示している。 これによ り 、 本発明の蛋白質は固相上の C 3 bに対しても、 天然型 MC Pが液相中の C 3 bに対する場 合と同様にコファクター活性を示すこ とが明かとなつた。
(実施例 8 ) 補体依存性細胞障害作用への影響
ヒ ト補体系による細胞障害作用に感受性を示す C H 0細胞を 用いて、 本発明の蛋白質の細胞障害保護効果について検討し た。 C H O— K 1細胞 （AT C C C C L 6 1 ) を 1 0 %ゥシ 血清 （セルカルチャーラボラ ト リーズ社） 含有ノ \ム？一 1 2培 地 （日水製薬社） を用いて、 常法に従って培養した。 1検体約 1 X 1 0 ε 細胞と して、 参考例 5に示した抗 C Η 0細胞家兎抗 血清を加え、 0 °Cにて 1 5分間処理した。 次いで 1 0 0 m M E G TA, 1 0 mM M g C 12 を含有するゼラチンベロナ一 ル緩衝液 （ 0. 1 45 M N a C l ZO . 0 5 M バルビタ一 ルナ ト リ ウ ム （ p H 7 . 4 ) / 0 . 1 %ゼラチン Z 1 0 0 mM E G T A-) にて 2 0 %に調製された正常ヒ ト血清及び本 発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白質;!勺 4 0 0 n gを 加え、 3 7 eCにて 1時間放置した。 その検体にさらに抗ヒ ト i C 3 bマウスモノ クローナル抗体を加え、 0 °Cで 4 5分間処 理し、 さらに F I T C標識抗マウス I g: Gャギ抗体 （カッペル 社） 及びヨウ化プロ ビジゥムを加え、 0 °Cで 3 0分間処理し た。 なお、 抗ヒ 卜 i C 3 bマウスモノ クローナル抗体はニュー ヨーク大学の飯田恭子博士よ り供与されたもの （ I m m u — n 0 1 0 g y 6_2 4 1 3 - 4 1 7 , 1 9 8 7 ) を用いた。 このよ う な処理を施した検体中の生細胞数、 死細胞数及び蛍光 強度 （ C H 0細胞への C 3 b沈着量に比例） を蛍光活性セル ソ一タ一 （ E P I C S P r o f i 1 e II, コ一ル夕一社） を 用いて解析した。
その結果を図 7に示す。 実験方法は実施例 8に記載した通り である。 a ) は対照群 （M C P非存在） での生細胞、 b ) は死 細胞である。 c ) は本発明の蛋白質存在下での生細胞、 d ) は 死細胞である。 各グラフの縦軸は細胞数を表す指数、 横軸は蛍 光強度を示している。 これによ り 、 本発明の蛋白質非存在下で は死細胞画分中に多量の i C 3 b沈着細胞 （蛍光強度の強い側 のピーク） が検出され [図 7 ( b ) ] 、 一方、 本発明の M C P 分子存在下では i C 3 b沈着細胞が激減すると と もに死細胞自 体も減少する事 [図 7 ( d ) ] が明かとなった。
この結果と実施例 7の結果とを併せて考えると、 本発明の蛋 白質は、 天然型 M C P とは異なり、 固相上の C 3 b も分解する こ とによ り細胞に沈着する C 3 b絶対量を減少せしめ、 その結 果と して補体系の細胞障害性を抑制するものと思われた。 (実施例 9 ) 毒性試験
実施例 6で得られた本発明の蛋白質を用いてマ ウスおよ びラ ッ 卜における毒性試験を実施した。 即ち、 6〜 8週齢の B a 1 b Z c系マウス雌雄各々 1 0匹および同週齢の Wistar系 ラッ 卜雌雄各々 1 0匹に対して実施例 6で得られた蛋白質を 1 曰 1回 1週間連日静脈内投与した。 投与期間中を通して各動物 個体の一般性状を観察した。 本試験では最高投与量群である 1 0 m g/K g群でも何れの動物においても死亡例は観察され ず、 一般性状においても変化はみられなかった。
(実施例 1 0 ) 注射用溶液剤の調製
実施例 6で得られた本発明の蛋白質 1 O O m gを l O m gZ m 1 の水解ゼラチンを ^有する生理食塩液 1 0 0 m 1 に溶 一解し、 ポアサイズ 0. 2 2 μ πιのフ ィ ルター （マイ レッ クス G V , ミ リ ポア社） を用いて濾過滅菌した。 これを無菌的に 1 0 m 1ずつガラスバイアルに分注後密栓し、 注射用溶液剤と した。
(実施例 1 1 ) 注射用凍結乾燥製剤の調製
実施例 6で得られた本発明の蛋 質 1 0 0 m gを 1 0 0 m gZm 1のヒ ト血清アルブミンを含有する 1 0 mM P B S ( p H 7. 4 ) 1 0 O m lに溶解し、 ボアサイズ 0. 2 2 μ πι のフィ ルター （マイ レッ クス G V， ミ リ ポア社） を用いて滤過 滅菌した。 これを無菌的に 3 m 1 ずつガラスバイアルに分注、 凍結乾燥後密栓し、 注射用凍結乾燥剤と した。
参考例 1 M C Pに対する単クローン性抗体の調製
'基本的にコーラ一等 （ K o h l e r , G . e t a 1 .
N a t u r e 2 5 6 4 9 5 - 4 9 7 , 1 9 7 5 ) の方法 に従って M C P に対する単グローン性抗体を作製した。 具 体的な方法は、 S e y a， T . e t a 1 . C o m p l e m e n I n f 1 a m m . 1_ 7 8 - 8 9 , 1 9 9 0 に報告した。 即ち、 精製された細胞膜画分由来天然型 M C P ( 0 . 5 iLt g / 0 . 5 m l P B S / 0. 0 0 2 % N P 一 4 0 ) を 0. 8 m l のフロイ ン ド完全ァージュバン 卜 と充分 に混合し、 B a 1 b Z c系マウスに皮下投与した。 投与は 1 0 日間隔で計 3回実施した。 最終投与から 4日後にマウスの脾臓 を摘出し、 脾細胞を単離後、 マウス骨髄腫由来細胞株であ る N S — 1細胞と常法に従って融合させた。 これら.融合細胞ク ローンの培養上清をヒッジ赤血球を用いたプロティ ン Aロゼヅ ト形成法にてスク リーニングし、 M C Pに対する抗体を産生し ているクローンを得た。 これらのハイブリ ドーマを B a 1 b / c系マウスの腹腔内に移植し、 4 0 0 r a dの放射線を照射し 4 & た。 約 1 0日後にマウスから腹水を採取した。 この腹水に 5 0 %飽和となるよう に硫酸アンモニゥムを加え、 塩析を実施し た。 4時間後遠心分離法によ り沈澱を回収し、 水に溶解した 後 0. 5 M N a C 1 / 0. 0 2 M T r i s - H C l ( p H 8. 9 ) に対して透析し、 抗体粗精製画分と した。 予め 2 MN a C l / 0. 1 M G l y c i n e/0. 0 2 M T r i s— H C 1 ( p H 8. 9 ) で平衡化したプロテイ ン Aセファロ一ス (フ ア ルマシア社） カ ラ ムに抗体粗精製画分を付し、 平衡 化緩衝液にてそのカラムを洗浄後、 0. 1 — クェン酸 （ 11 6 . 0 ) および 0·. 1 M クェン酸 （ P H 3 . 0 ) を用いて順 次抗体を溶出させた。 抗体の溶出は 2 80 nmにおける紫外線 ( U V 280 ) の吸収でモニタ一した。 溶出ピークをブールした 後 P B Sに対して透析し、 これを MC Pに対する単クローン性 抗体精製標品とした。
(参考例 2 ) 単クローン性抗体を リ ガン ド と したァフ ィ 二 ティ一担体の調製
参考例 1 で得た単ク ローン性抗体精製標品 1 0 0 m g と B r C Nで活性化されたセファロース 4 B (フ アルマシア社） 5 0 m l とを混合し、 4でで緩やかに撹拌しながら一晚放置し た。 その後 1 M T r i s - H C l (p H 8. 5 ) で洗浄し、 0. 5 M N a C l /2 0 mM 燐酸緩衝液 （ P H 7. 5 ) で 平衡化した。
(参考例 3 ) 酵素標識単クローン性抗体の調製
M C Pの酵素免疫測定系を作製するために参考例 1で得た単 クローン性抗体を用いて酵素標識抗体を調製した。 まず 4 m g Zm 1 に調製した西洋わさびパーォキシダーセ （東洋紡社） 水 溶液 1 m l に 0. 1 M N a I 0 , 0. 2 m l を加え、 混合後 2 5。Cで 1 5分間放置した。 これに 1. 5 %エチレングリ コー ル水溶液 0. 2 m l を加え； 混合後 2 5 'Cでさらに 2 0分間放 置した。 その後 1 m M 酢酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 4. 4 ) に対して 3回透析した。 これに 0. 2 M炭酸ナ ト リ ウム緩衝液 ( 2 0 X S C B , p H 9. 5 ) 70 μ 1 を加え、 直ちに抗体溶 液 （予め 2 x S C Bに対して 3回透析した後、 約 5 m g Zm 1 に調製したもの） を添加し、 撹拌後 2 5でで 2時間放置した。 次いで 1 X S C Bにて 4 m g m 1に調製した N a B H 4 溶液 0. 1 m 1 を加え、 4 eCにてさ らに 2時間放置した。 その後 7 6 mM P B S ( p H 6. 4 ) に対して 3回透析し、 酵素標 識抗体標品と した。
(参考例 4 ) M C Pの酵素免疫測定法
9 6穴マルチタイターィムノブレート （ヌンク社） の各ゥェ ルに一次抗体と して 5 μ g Zm 1の参考例 1で得たモノ クロ一 ナル抗体のうちの一種を 0. 1 m lずつ分注し、 4°Cにて一晚 放置した。 各ゥヱルをイオン交換水 0. 3 m lにて 5回洗浄し た後、 1 0 %ゥシ血清アルブミン含有 P B S と等量混合した検 体或いは標準物質を 0. 1 m 1ずつ加え、 室温にて 2時間放置 した。 0 · 0 0 5 % T w e e n 2 0含有生理食塩液 （洗浄液） 0. 3 m 1を用いて各ゥエルを 5回洗浄した後、 さらにイオン 交換水 0. 3 m 1で 1回洗浄した。 二次抗体と して参考例 3で 得た西洋わさびパーォキシダーゼ標識モノ ク ロ一ナル抗体 ( 0. 5 n g /m 1 ) と 1 0 %ゥシ血清アルブミ ン含有 P B S との等量混合液を 0. 1 m 1ずつ各ゥヱルに加え、 室温にて 2 時間放置した。 洗浄液 0. 3 m lで 5回、 イオン交換水 0. 3 m 1で 1回各ゥヱルを洗浄した後、 発色液 （オルトフヱ二レン ジァミ ン 45 m gおよび 1 %H2 02 40 0 1を燐酸ナト リ ゥム一クェン酸緩衝液 （ρ Η 5. 0 ) で 1 5 m lに溶解したも の） 0. 1 m 1を加え、 室温にて 1 5分間放置した。 その後反 応停止液 （ I N H 2 S 04 ) 0. 1 m lを加え撹拌後、 反応 液の 49 0 nmにおける吸光度 （0 D49。 ) をマイ クロプレー ト リーダ一 （E T Y— 9 6 A型， 東洋測器社） で測定した。 標 準物質の O D"。 から得た検量線よ り検体中の MC P量を算出 した。
(参考例 5 ) 抗 C H 0細胞家兎抗血清の調製
常法通りに培養された C H 0— K 1細胞を P B Sにて充分に 洗浄した後、 約 1 X 1 0 7 細胞 Z m 1 となるように細胞浮遊液 を調製した。 この細胞浮遊液約 2 m 1 を日本在来白色種家兎に 動脈内投与した。 週 1度のこの投与を 5回繰り返し、 最終投与 から 1 週間後に家兎血液を耳動脈よ り採取した。 血清を分離 後、 参考例 1 と同様に塩析を実施した。 沈澱を回収し、 適当量 の水に溶解した後、 P B Sに対して透析した。 これを抗 C H O 細胞家兎抗血清標品とした。 産業上の利用分野
^ 本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白質は、 固相上の C 3 bに対しても液相中の C 3 bに対する場合と同様に I 因子 のコファクターと しての作用を有する、 新規な薬理特性を有す る蛋白質を提供するものである。
これは、 補体系が障害作用を示す実際の場合、 すなわち、 固 .相基質 （細胞膜） に吸着した補体系成分の作用を抑制しう る新 規な蛋白質である。
また、 本発明は同時に該蛋白質をコー ドする D N A、 該蛋白 質を含有する医薬組成物をも提供する。
従って、 本発明は、 補体系が自己細胞に対して障害的に作用 する疾患、 腎炎、 肝炎、 血管炎、 喘息、 自己免疫疾患、 虚血性 臓器障害、 再灌流障害、 関節 リ ウマチ、 移植組織片拒絶、 ショ ッ ク、 多臓器不全、 播種性血管内凝固症、 成人呼吸窮 迫圧症候群 （ A R D S ) 、 および血液透析に伴つて発症する A R D S様疾患ゃショ ヅクあるいは火傷によるショ ッ ク等の治 療に新しい道を開く ものである。
關表】 配列番号： 1
配列の長さ： 279
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質 配列
Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu lie Gly Lys Pro
1 5 10 15
Lys Pro Tyr Tyr Glu lie Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys
20 25 30
Gly Tyr Phe Tyr He Pro Pro Leu Ala Thr His Thr lie Cys Asp Arg
35 40 45
Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr
50 55 60
Cys Pro Tyr lie Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gin Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80
Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gin Met His Phe lie Cys Asn Glu Gly
85 90 95
Tyr Tyr Leu lie Gly Glu Glu lie Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser
100 105 110
Val Ala lie Trp Ser Gly Lys Pro Pro He Cys Glu Lys Val Leu Cys
115 120 125
Thr Pro Pro Pro Lys lie Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140
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S .0Z00/£6df/JOd UI/£6OA 配列番号： 2
配列の長さ： 251
配列の型：アミノ酸
トポロジー： 状
配列の種類：タンパク質 配列
Cys Glu Glu Pro Pro. Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu lie Gly Lys Pro
1 5 10 15
Lys Pro Tyr Tyr Glu lie Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys
20 25 30
Gly Tyr Phe Tyr lie Pro Pro Leu Ala Thr His Thr lie Cys Asp Arg
35 40 45
Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr
50 55 60
Cys Pro Tyr lie Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gin Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80
Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gin Met His Phe lie Cys Asn Glu Gly
85 90 95
Tyr Tyr Leu lie Gly Glu Glu lie Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser
100 105 110
Val Ala lie Trp Ser Gly Lys Pro Pro lie Cys Glu Lys Val Leu Cys
115 120 125
Thr Pro Pro Pro Lys lie Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160
Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu lie Gly Glu Ser Thr lie Tyr Cys
165 170 175
Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val
180 185 190
Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gin He Ser Gly Phe
195 200 205
Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys
210 215 220
Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr lie Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240
Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys
245 · 250 251 配列番号： 3
配列の長さ： 840
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の禾顧： cDNA to niRNA
配列の特徴
特徴 ¾:表す己号： mat peptide
存在位置： 1. - 840
を決定した方法： S 配列
TGTGAGGAGC CACCAACAH TGAAGCTATG GAGCTCAHG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGAHGGTG AACGAGTAGA HATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCIT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180
TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240
GGGACHACG AGTTTGGnA TCAGATGCAC TTTATTrGTA ATGAGGGHA HAOTAAn 300
GGTGAAGAAA TTCTATA G TGAACHAAA GGATCAGTAG CAATITGGAG CGGTAAGCCC 360
CCAATATGTG AAAAGGTTIT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420
TITAGTGAAG TAGAAGTA TGAGTATCTT GATGCAGTAA OTATAGHG TGATCCTGCA 480
CGTGGACCAG ATCCATTTTC ACHOTGGA GAGAGCACGA TITAnGTGG TGACAAHCA 540
GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600
AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTITACT ACAAAGCAAC AGHATGriT 660
GAATGCGATA AGGGTITTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA HGTC GTGA CAGTAACAGT 720
ACITGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCH AAAGGTCCTA GGCCTACHA CAAGCCTCCA 780
GTCTCAAAH ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACHGACAG TTTGGA GA 840 配列番号： 4
配列の長さ： 756
配列の型：核酸 .
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
酉己列の種類： cDNA to mRNA
配列の特徴
特徵を表す eel号： mat peptide
存在位置： 1. .756
特徴を決定した方法： S 配列
TGTGAGGAGC CACCAACA TGAAGCTATG GAGCTCAHG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGAHGGTG AACGAGTAGA HATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCH 120 GCCACCCATA CTATITGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180
TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240
GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TITATITGTA ATGAGGGTTA ΉΚΟΉΚΚΠ 300
GGTGAAGAAA HCTATAHG TGAACITAAA GGATCAGTAG CAATITGGAG CGGTAAGCCC 360
CCAATATGTG AAAAGGTITT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420
TITAGTGAAG TAGAAGTA TGAGTATCH GATGCAGTAA CHATAGHG TGATCCTGCA 480
CCTGGACCAG ATCCATTITC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTOTTGTGG TGACMTTCA 540
GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATITCC AGTAGTCGAA 600
AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATHTACT ACAAAGCAAC AGTrATGTTT 660
GAATGCGATA AGGGTmTA CCTCGATGGC AGCGACACAA HGTCTGTGA CAGTAACAGT 720
ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAATGA 756

Claims

請求の範囲
1 . 天然型メ ンブレ ン コ フ ァ ク タープロ テイ ン （ M e m — b r a n e C o f a c t o r P r o t e i n , M C P ) の少なく と も膜貫通領域および細胞質内領域が欠如しているこ とを特徴とする新規な薬理学的特性を有する蛋白質。
2 . 下記式 1 に示したァミノ酸配列の少なく と も一部を有する こ とを特徴とする請求項 1 に記載の新規な薬理学的特性を有す る蛋白質。
(式 1 )
Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu lie Gly Lys Pro
1 5 10 15
Lys Pro Tyr Tyr Glu lie Gly Glu Arg Val Asp Tyr-Lys Cys Lys Lys
20 25 30
Gly Tyr Phe Tyr lie Pro Pro Leu Ala Thr His Thr lie Cys Asp Arg
35 40 45
Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr
50 55 60
Cys Pro Tyr lie Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gin Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80
Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gin Met His Phe lie Cys Asn Glu Gly
85 90 95 dsy naq jag dsy naq 9 ι iijg
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3 . 前記式 1 または下記式 2に示したアミノ酸配列を有するこ とを特徴とする請求項 1 に記載の新規な薬理学的特性を有する 蛋白質。 (式 2 )
Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu lie Gly Lys Pro
1 5 10 15
Lys Pro Tyr Tyr Glu lie Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys
20 25 30
Gly Tyr Phe Tyr lie Pro Pro Leu Ala Thr His Thr lie Cys Asp Arg
35 40 45
Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr
50 55 60
Cys Pro Tyr lie Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gin Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80
Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gin Met His Phe lie Cys Asn Glu Gly
85 90 95
Tyr Tyr Leu lie Gly Glu Glu lie Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser
100 105 110
Val Ala lie Trp Ser Gly Lys Pro Pro lie Cys Glu Lys Val Leu Cys
115 120 125
Thr Pro Pro Pro Lys lie Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val
130 135 140
Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160
Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu lie Gly Glu Ser Thr lie Tyr Cys
165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val
180 185 190
Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gin lie Ser Gly Phe
195 200 205
Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys
210 215 220
Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr He Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240
Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys
245 250 251
4 . 前記式 1 または 2に示したアミノ酸配列で示される請求項 1 に記載の新規な薬理学的特性を有する蛋白質。
5 . 固相上の C 3 bに対する I因子のコファクターと しての作 用を有することを特徴とする請求項 1ないし 4いずれかに記載 の新規な薬理学的特性を有する蛋白質。
6 . ヒ ト以外の細胞によって産生された請求項 1 ないし 5いず れかに記載の新規な薬理学的特性を有する蛋白質。
7 . 前記ヒ ト以外の細胞が大腸菌である請求項 6に記載の新 規な薬理学的特性を有する蛋白質。
8 . 前記培養細胞が哺乳動物培養細胞である請求項 6に記載の 新規な薬理学的特性を有する蛋白質。
9 . 下記式 3に示した塩基配列を有する D N Aの少なく と も一 部を用いて産生された請求項 6ないし 8いずれかに記載の新規 な薬理学的特性を有する蛋白質。
(式 3 )
TGTGAGGAGC CACCAACAH TGAAGCTATG GAGCTWTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGAHGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCH 120 GCCACCCATA CTATITGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGGCTGT 180
TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240
GGGACHACG AGTTrGGHA TCAGATGCAC TTTATITGTA ATGAGGGHA ΉΚΟΉλΚΠ 300
GGTGAAGAAA HCTATAHG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATITGGAG CGGTAAGCCC 360
CCAATATGTG AAAAGGTnT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TITAGTGAAG TAGAAGTAH TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTOTAGHG TGATCCTGCA. 480
CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACITAnGGA GAGAGCACGA TITAnGTGG TGACMTTCA 540
GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600
AATGGAAAAC AGATATCAGG ATITGGAAAA AAATTITACT ACAAAGCAAC AGnATGTTT 660
GAATGCGATA AGGGimTA CCTCGATGGC AGCGACACAA GTCTGTGA CAGTAACAGT 720
ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCIT AAAGGTCCTA GGCCTACTTA CAAGCCTCCA 780
GTCTCAAAH ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACTTGACAG TTTGGAWGA 840
1 0 . 請求項 1ないし 8いずれかに記載の新規な薬理学的特性 を有する蛋白質をコードする塩基配列を有する D N A。
1 1 . 前.記式 3に示した塩基配列の少なく とも一部を有する請 求項 1 0に記載の D N A。
1 2 . 前記式 3に示した塩基配列を有する D N A。
1 3 . 下記式 4に示した塩基配列を有する D N A。
(式 4 )
TGTGAGGAGC CACCAACAH TGAAGCTATG GAGCTCAHG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGAHGGTG AACGAGTAGA mTAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCIT 120 GCCACCCATA CTATITGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180
TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGTT CCCTGCAAAT 240
GGGACTTACG AGTTTGCTTA TCAGATGCAC TITATITGTA ATGAGGGTTA nACTT IT 300
GGTGAAGAAA nCTATAHG TGAACITAAA GGATCAGTAG C TTTGGAG CGGTAAGCCC 360
CCAATATGTG AAAAGGTTIT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420
TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCIT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480
CCTGGACCAG ATCCATTITC AC TAnGGA GAGAGCACGA HWTCTGG TGACMTTCA 540
GTGTGGACTC GTGCTGCTCC AGAGTCTAAA GTGGTCAAAT GTCGATITCC AGTAGTCGAA 600
AATGGAAAAC AGATATCAGG ATITGGAAAA AAATTITACT ACAAAGCAAC AGHATGTn 660
GAATGCGATA AGGGTmTA CCTCGATGGC AGCGACACAA HGTCTGTGA CAGTAACAGT 720
ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAATGA 756
1 4. 請求項 1 ないし 9いずれかに記載の新規な薬理学的特性 を有する蛋白質を少なく とも 1つの有効成分と して含有するこ とを特徴とする、 補体系が自己の細胞に対して障害的に作用す る疾患に用いるための医薬組成物。
1 5. 請求項 1 ないし 9いずれかに記載の新規な薬理学的特性 を有する蛋白質を、 補体系が自己の細胞に対して障害的に作用 する疾患の治療剤の製造に用いる方法。
1 6. 前記疾患が、 腎炎、 肝炎、 血管炎、 喘息、 自 己免疫 疾患、 虚血性臓器障害、 再灌流障害、 関節リ ウマチ、 移植組織 片拒絶、 ショ ッ ク、 多臓器不全、 播種性血管内凝固症、 成人呼 吸窮迫症候群 （A R D S ) 、 および血液透析に伴って発^する A R D S様疾患ショ ッ クあるいは火傷によるショ ヅ クからなる 群よ り選ばれる少なく とも 1つの疾患である請求項 1 4に記載 の医薬組成物。
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