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WO1993018065A1 - Physiologically active proteinaceous substance - Google Patents

Physiologically active proteinaceous substance Download PDF

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Publication number
WO1993018065A1
WO1993018065A1 PCT/JP1993/000294 JP9300294W WO9318065A1 WO 1993018065 A1 WO1993018065 A1 WO 1993018065A1 JP 9300294 W JP9300294 W JP 9300294W WO 9318065 A1 WO9318065 A1 WO 9318065A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
physiologically active
gly
active substance
chromatography
proteinaceous
Prior art date
Application number
PCT/JP1993/000294
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hajime Nawata
Fumio Umeda
Teruaki Yamauchi
Mitsunori Masakado
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Publication of WO1993018065A1 publication Critical patent/WO1993018065A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention broth tag run Gin 1 2 (also known; prosulfuron evening cyclin (Pros ta cy c 1 in) , hereinafter referred to as PG 1 2) Novel proteinaceous raw physiologically active substance having a production stimulating activity, their preparation and
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing the proteinaceous physiologically active substance.
  • novel proteinaceous physiologically active substance having an activity to promote the production of PG 1 2 from vascular endothelial cells.
  • Prostaglandin pros tagl and ins PG was published in 1930 by Kurzrock et al. [Pro S0c Exp. Biol. Med. 268, 1930], and was reported as a uterine muscle contractile active substance present in semen. Since then, basic research on prostaglandins has developed rapidly. Prostaglandin is a general term for biologically active substances based on prostanoic acid contained in human and animal tissues and organs.A series of chemicals called arachidonic acid cascades starting from arachidonic acid in cells. The reaction produces several prostaglandins with different chemical structures. It is.
  • prostaglandin plays an important role as a vasoactive substance for vascular smooth muscle [Pathophysiology, Vol. 2, p. 792, 1983], and thromboxane, an active prostanoid derived from platelets and blood vessel walls.
  • TXA 2 TXA 2
  • PGI 2 potent platelet aggregation inhibitory action and vascular relaxing action, and antagonism to create the TXA 2 platelet derived are involved in the maintenance of Homeosutashisu in vivo [Pre Tissue Jar Fungus, Narob Pharmacol. (Br. J. Parmac.), Vol.
  • the decrease in production may be attributable to the decrease in PG12 production stimulating activity present in the blood above [Metabolism] (Me t ab o 1 ism) 38, 837, 1989, Ha emo stasis 16, 447, 1986 and Diabetis Research and Clinical Practice (Diab. Res. Cl in. Prac. 3), p. 243, 1987].
  • PGI 2 As described above having a platelet aggregation inhibitory action, smooth muscle relaxing action, such as a blood vessel contact and bronchi besides that, have a gastric acid secretion inhibiting action and the like. Based on these physiological effects, it is conceivable to develop PGI 2 as a pharmaceutical product, but PGI 2 is a very chemically unstable substance with a neutral water of 37 and a half-life of 5 minutes. Absent. On the other hand, while maintaining the natural PG I 2-like activity, chemically stable PG 1 2 class ⁇ the anticoagulants, attempts to cane developed as pharmaceuticals such as a vasodilator has been made. However, it may be more desirable for the living body to make PGI 2 unstable and short.
  • the living body must always be ready to respond to PGI 2 that is produced promptly in an emergency, and by providing a large amount of stable PGI 2 analogs, the PGI 2 It is possible that responsiveness to PGI 2 may be reduced, making it impossible to respond to PGI 2 in an emergency. Indeed, pretreatment of prostaglandin E! (PGEa) and stable PGI 2 analogs due Examples of cells naturally occur to c AMP rise response to PG 1 2 no longer occurs has been reported [Prostaglandins (Pros tag 1 an nd ins.) 19, 2 pages, 1980].
  • PSA is present in blood, but its active substance (PSF) is It has not been identified and identification is desired.
  • PSF stimulates PG 12 production from endothelial cells, inhibiting platelet aggregation having the PG 1 2 by increasing the PG 12 concentration in the blood, smooth muscle relaxing action, to express gastric acid secretion inhibiting action, etc. it can.
  • PSF hemolytic uremic syndrome
  • thrombotic thrombocytopenic purpura peripheral artery occlusion
  • cardiac ischemia cerebral ischemia
  • atherosclerosis cerebral obstruction
  • hyperlipidemia diabetes, heart failure, angina It has the potential to be used in the treatment of sickness, ischemic heart disease, depressive heart disease, choroidal circulation disorder, bronchial disease, gastric ulcer, pregnancy and eclampsia. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel protein bioactive substance by purifying and isolating a substance that stimulates the production of PGI 2 from vascular endothelial cells in view of the above situation. Another object of the present invention is to provide a method for producing the same. It is a further object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the above-mentioned diseases based on the action of the proteinaceous physiologically active substance to stimulate PG12 production.
  • the present inventors have conducted intensive studies on PG12 stimulating activity present in the blood and in the culture supernatant of human cell lines in order to achieve the above-mentioned object, and found that the culture supernatant of normal human diploid fibroblasts It was confirmed that a substance having a PG12 production stimulating activity was present at a high concentration. Next, we succeeded in isolating and purifying a novel proteinaceous physiologically active substance having PGI 2 ⁇ stimulating activity from the culture supernatant, and determined its amino acid sequence.
  • the present invention provides a novel proteinaceous physiologically active substance having the following features.
  • the molecular weight is 30 to 36 kDa in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under non-reducing conditions.
  • the present invention uses at least one of the following steps (a) to (c) from a raw material containing the novel proteinaceous physiologically active substance, preferably a culture supernatant of normal human diploid fibroblasts.
  • a raw material containing the novel proteinaceous physiologically active substance preferably a culture supernatant of normal human diploid fibroblasts.
  • the present invention also provides a novel pharmaceutical composition for treating the following diseases, which comprises the novel proteinaceous physiologically active substance as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a graph showing an elution pattern obtained by DEAE-5 PW anion exchange chromatography.
  • FIG. 2 is a graph showing an elution pattern obtained by heparin-5 PW affinity chromatography.
  • FIG. 3 is a graph showing the development pattern of protein-, gel-filtration and ram chromatography.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an experimental result by SDS-PAGE. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the proteinaceous physiologically active substance of the present invention is a novel substance having at least one amino acid sequence represented by any of the following formulas (1) to (II).
  • amino acid sequence portion of any one of the above formulas (I) to (III) may be any portion of the proteinaceous physiologically active substance of the present invention.
  • the amino acid sequence portions of the above formulas (I) to (III) may be adjacent to each other or may contain an arbitrary amino acid sequence between them.
  • novel proteinaceous physiologically active substance has a molecular weight of 30 to 36 kDa in non-reducing conditions in sodium dodecyl sulfate sodium acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • novel proteinaceous bioactive substances of the present invention have activity which act on vascular endothelial cells, stimulate the production of prostaglandin 1 2 (PG 1 2) from the cells. The method for measuring this activity will be described later.
  • the novel proteinaceous physiologically active substance of the present invention may be of any origin, but is preferably of human origin, more preferably of normal human diploid fibroblasts. Those produced in the culture supernatant of diploid fibroblasts are preferred. For example, it can be obtained by culturing normal human diploid fibroblasts or the like in an appropriate growth medium, collecting a culture solution having a PG production stimulating activity, and purifying a culture supernatant obtained. For culturing normal human diploid cells, a commonly used medium can be used, but Dulbecco's modified Eagle medium, RPMI164 medium, Eagle's minimum essential medium or ham medium is particularly preferable.
  • serum-free medium because the substance of the present invention is purified and isolated from the culture supernatant. It is desirable that the culture supernatant after completion of the culture is concentrated by, for example, a filter method or an ultrafiltration method.
  • the raw material containing the novel proteinaceous physiologically active substance of the present invention obtained as described above is purified by using at least one of the following steps.
  • the following steps (a), (b) and (c) ) May be performed according to a known protocol.
  • the order may be arbitrary, and may be repeated as necessary.
  • operations such as concentration, dialysis, etc. may be added between or before and after one step and the other, depending on the further, for example, chromatofocusing, adsorption chromatography, water chromatography, reverse phase Combination with other chromatography methods such as chromatography, thin-layer chromatography, partition chromatography, and other protein purification methods such as isoelectric focusing, polyacrylamide electrophoresis, and salting Is also good.
  • the collected fraction may be further subjected to reversed-phase high-performance liquid chromatography for the purpose of isolation, purification, purity confirmation, and the like.
  • appropriate elution conditions or developing conditions, eluate or developing solution may be selected in consideration of the properties of each chromatography carrier, target substance, contained contaminants, and the like.
  • the elution may be linear gradient elution or stepwise gradient elution.
  • the novel proteinaceous physiologically active substance of the present invention can be isolated from the culture supernatant preferably by the following method.
  • Culture supernatant of normal human diploid fibroblasts is subjected to anion exchange chromatography, for example, DEAE-5PW (manufactured by Tosoh I), onoQ (manufactured by Pharmacia) or Q-Sepharose column (manufactured by Pharmacia) And elute by sodium chloride concentration gradient method.
  • the PG 1 2 Stimulating activity of the eluted each fractions were measured to obtain fractions which are active. The measurement of the PGI 2 production stimulating activity will be described later.
  • this fraction is adsorbed to affinity chromatography, for example, heparin-15PW (manufactured by Tosoh Corporation) or the like, and eluted by a sodium chloride concentration gradient method.
  • the PGI 2 production stimulating activity is measured in the same manner, and the active fraction is collected. Next, this fraction is subjected to gel filtration chromatography, for example, Protein One Pack (Millipore Limited Waters Chromatography Division), Sephacryl S-100HR (Pharmacia) or TSK Gel G3000 SW XL column (Tosoichisha). Ltd.) and the like developed using, by Rukoto measuring the PG 1 2 production stimulating activity can be obtained biologically active fraction. This fraction is then subjected to affinity chromatography, for example, insulin-like growth factor (Insulin-like growth factor).
  • affinity chromatography for example, insulin-like growth factor (Insulin-like growth factor).
  • IGF e-like growth factor
  • the PGI 2 production stimulating activity can be measured by the following method.
  • vascular endothelial cells collected from the thoracic aorta membrane by a detachment method were subcultured in Dulbecco's modified medium containing 10% fetal serum, and cultured until they reached a saturated cell density. After adding the measurement sample and incubating for 60 minutes, the stable metabolite of PGI 2 in the supernatant is
  • O - Ke Bok - r F la (hereinafter, 6 - keto - PGF described as 1 alpha) can be obtained PG 1 2 production amount by the ⁇ a constant!.
  • a commercially available kit for measuring 6-keto PGF1 ⁇ may be used.
  • the amino acid sequence of the novel proteinaceous bioactive substances of the present invention with purified PG 1 2 production stimulating activity it may be used the following method.
  • the substance of the present invention can be directly analyzed by the sequencer, or peptide fragments obtained by enzymatic cleavage of trypsin, lysyl endopeptidase, etc. can be analyzed.
  • the sequence of each amino acid can be determined.
  • the novel proteinaceous physiologically active substance of the present invention is characterized by inhibiting platelet aggregation of PG I 2
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing the proteinaceous physiologically active substance of the present invention as at least one active ingredient for the following various diseases because it has an action, a smooth muscle relaxing action, a gastric acid secretion inhibitory action and the like.
  • Hemolytic uremic syndrome Hemolytic uremic syndrome, thrombotic thrombocytopenic purpura, peripheral arterial occlusion, cardiac ischemia, cerebral ischemia, arteriosclerosis, cerebral obstruction, hyperlipidemia, diabetes, heart failure, angina, ischemic heart disease, depression Hematologic heart disease, choroidal circulation disorder, bronchial disease, gastric ulcer, pregnancy eclampsia.
  • the dosage of the novel proteinaceous physiologically active substance of the present invention may vary depending on the patient's sex, age, body weight, disease type and its pathological condition, depending on the dosage form, but the effective dosage is 1 ng. 22 mg / kg, preferably 10 ng to 200; / g / kg.
  • the pharmaceutical form of the pharmaceutical composition of the present invention may be any as long as it can supply an effective amount to the disease lesion, and examples thereof include tablets, powders, powders, capsules, ointments, powders, and injections. Etc. are exemplified.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a commonly used pharmaceutical mixture such as an excipient, a stabilizer ⁇ ) or a solubilizing agent, as long as the pharmacological properties are not impaired. May be.
  • Specific examples include Ringer's solution, phosphate buffer, human serum albumin, hydrolyzed gelatin, sucrose, dextran, polyethylene glycol, etc., which are appropriately selected and used depending on the drug form.
  • a culture supernatant was prepared and purified by the following method to obtain a novel proteinaceous physiologically active substance of the present invention.
  • Normal human diploid fibroblasts were prepared in 4.8 ⁇ 10 4 cells ZmL in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 15% fetal bovine serum. 3 L of this cell suspension was inoculated in a rotary culture vessel, and 5% CO 2 -95% air 37. C. Three days after the cell implantation, the culture solution was replaced with 3 L of fresh Dulbecco's modified Eagle's medium containing 15% fetal calf serum, and the culture was continued for 2 days.
  • the culture solution was removed, and the cells were washed with a Ca2 + -and Mg2 + -free Dulbecco's monophosphate physiological saline solution, and 3 L of Dulbecco's modified Eagle's medium without phenol red was added. And cultured for 2 days. After recovering the culture, the cells were filtered through a 2.5 / zm filter (CN cartridge, 30 inch, manufactured by Millipore) to remove cell debris.
  • CN cartridge 2.5 / zm filter
  • a two-stage concentration using a hollow fiber module (Molsep fiber FS-106 kDa cut-off, manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.) and a filtration filter (Omega mini-set, manufactured by Fuji Filter Industries, Ltd.) with a molecular weight cutoff of 10 kDa. It concentrated by operation.
  • This concentrated solution is used in a dialysis tube (stained with a molecular weight cutoff of 3.5 kDa
  • the solution was dialyzed against 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.8) for 4 to 1 minute using the following method. After further dialysis with the same buffer at 4 e C for 8 hours, the mixture was sequentially filtered through 1.2 ⁇ m filter Yuichi (DF Assembly, Nippon Pall) and 0.22 zm filter-one system (Koining). did.
  • Culture supernatant of normal human diploid fibroblasts prepared according to (1) was pre-equilibrated with 2 OmM Tris-monohydrochloride buffer (PH7.8). DEAE-5 PW (Tosoichi) Anion exchange chromatography The mixture was adsorbed on a column, eluted with a linear gradient method of 0 to 1.0 M sodium chloride prepared using a 2 OmM Tris-monohydrochloride buffer (pH 7.8), and the absorbance was simultaneously measured at 280 nm.
  • the active fraction obtained in step 1 was dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) and equilibrated with 1 OmM phosphate buffer (pH 7.4).
  • Heparin (HEPAR IN) -5PW E. Adsorbed on an affinity column and eluted with a linear gradient of 0 to 0 M sodium chloride prepared using 1 OmM phosphate buffer (pH 7.4). The absorbance was simultaneously measured at nm.
  • the eluted PGI 2 production stimulation activity of each off Rakushiyon measures, the fractions with the eluted PG I 2 production stimulating activity at sodium ⁇ beam chloride concentration of 450 to 500 mM were pooled (FIG. 2) o
  • the active fraction obtained in step 2 was concentrated with Centricon-10 (manufactured by Amicon), and then pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.4). It was developed using two connected gel filtration columns from Millipore Limited Waters Chromatography Division, and absorbance was simultaneously measured at 280 nm. Was measured PG 1 2 Stimulating activity of each fraction, activity was observed around a molecular weight 3 OKD a (FIG.
  • Fig. 3 o
  • the numbers in Fig. 3 indicate molecular weight (kDa), Vt indicates the total volume of the filler, and Vo indicates the excluded volume.
  • the active fraction obtained in step 3 was applied to an IGF-affinity column equilibrated with 1 OmM phosphate buffer (pH 7.4).
  • IGF-affinity column a pressure-resistant ram in which recombinant IGF-I was bound as a ligand to AFFEPREP 10 (manufactured by Nippon Bio-Rad Laboratories) was used for this experiment. After adsorption, the sample was eluted with 0.5 M acetic acid. Where was measured PG 1 2 Stimulating activity, PG 1 2 surname stimulating activity was found in non-adsorbed surface min.
  • the molecular weight of the novel proteinaceous physiologically active substance of the present invention obtained in step 5 of Example 1 was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under non-reducing conditions. A single band was observed at a molecular weight of 33 kDa (Fig. 4).
  • Figure 4 is a schematic diagram of a reference photograph after SDS-PAGE electrophoresis.
  • lines A and C are bands of a standard sample having a known molecular weight
  • line B is a band of the novel proteinaceous bioactive substance of the present invention.
  • the numbers represent the molecular weight (kDa) of the standard sample.
  • the novel proteinaceous physiologically active substance of the present invention obtained in step 5 of Example 1 was digested with trypsin to form a peptide fragment.
  • Formula (I) Formula (I)
  • Vascular endothelial cells were collected from the thoracic aorta intima by an isolation method. The obtained vascular endothelial cells were then placed in a Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% OU / mL penicillin and 100 gZmL streptomycin containing 10% fetal calf serum, at 37 ° C under 5% CO 2 -95%. The cells were subcultured in C. The medium was changed twice a week, and after passage 5-10, vascular endothelial cells were treated with 0.05% trypsin.
  • vascular endothelial cells were transferred to a 24-well culture dish containing 1 mL of Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum, and cultured to 5 ⁇ 10 4 cells Z well.
  • Dulbecco's modified Eagle medium 500 containing the following various samples, the mixture was incubated at 37 ° C for 60 minutes.
  • the PG12 production stimulating activity of the proteinaceous physiologically active substance of the present invention increased in a concentration-dependent manner.
  • Example 4 A toxicity test in mice was carried out using the proteinaceous physiologically active substance of the present invention obtained in Example 1. That is, the proteinaceous physiologically active substance obtained in Example 1 was intravenously administered once daily for one week to five male and female 6-week-old ICR mice once a day. Administration period The general characteristics of each animal were observed throughout. The highest dose group in this study
  • Example 6 10 Omg of the proteinaceous physiologically active substance of the present invention obtained in Example 1 was dissolved in 10 OmL of a physiological saline solution containing 1 Omg / mL of hydrolyzed gelatin, and a filter having a pore size of 0.22 m (Mirex GV Filtration and sterilization were carried out using Millipore Corporation. This was aseptically dispensed in 2 mL aliquots into glass vials, sealed and sealed for injection lysate. (Example 6)
  • Example 2 10 Omg of the proteinaceous physiologically active substance of the present invention obtained in Example 1 was dissolved in 10 OmL of 1 OmM PBS (pH 7.4) containing 10 Oiiig / mL of human serum albumin, and the pore size was 0.22 m. And sterilized by filtration using a filter (Mirex GV Millipore). This was aseptically dispensed into glass vials in 3 mL portions, freeze-dried and sealed to give a freeze-dried preparation for injection. Availability of S ⁇
  • the novel proteinaceous bioactive substances of the present invention acts on vascular endothelial cells has the effect of stimulating the PG 1 2 of flavor from the cells. Therefore, based on the inhibitory action of PG12 on platelet aggregation, smooth muscle relaxation, gastric acid secretion, etc., hemolytic uremic syndrome, thrombotic thrombocytopenic purpura, peripheral arterial occlusion, cardiac ischemia, cerebral ischemia, arteriosclerosis, brain It can be expected to be used as a therapeutic drug for obstruction, hyperlipidemia, diabetes, heart failure, angina pectoris, ischemic heart disease, depressive heart disease, choroidal circulatory disorder, bronchial disease, gastric ulcer, pregnancy eclampsia, etc. .

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Description

明 现 曞 発明の名称
蛋癜性生理掻性物質 技術分野
本発明は、 ブロスタグランゞン 12 (別名プロス倕サむクリン Pros t a cy c 1 i n)、 以䞋 PG 12 ず蚘す産生刺激掻性を有する新芏な蛋癜性生 理掻性物質、 その補造方法および該蛋癜性生理掻性物質を含有する医薬組成物に 関する。 詳しくは血管内皮现胞に䜜甚し、 血管内皮现胞からの PG 12 の産生を 促進させる掻性を有する新芏な蛋癜性生理掻性物質に関する。 背景技術
プロスタグランゞン pros tagl and ins PG)は 1930幎にク ルツロックら [プロシヌデむング ォブ ザ ゜サむ゚ティ フォヌ ェクスぺ リメンタル バむオロゞヌ アンド メディスン Pro S 0 c Exp. Bi o l. Med. ) , 28卷、 268頁、 1930幎] により、 粟液䞭に存圚 する子宮筋収瞮掻性物質ずしお発芋報告された。 その埌プロスタグランゞンに関 する基瀎的研究は急速な発展をずげた。 プロスタグランゞンはヒト、 動物の 組織、 臓噚に含たれるプロスタン酞を基本構造ずする生理掻性物質の総称で あり、 现胞内でァラキドン酞を出発物質ずしおァラキドン酞カスケ䞀ドず呌ばれ る䞀連の化孊反応により化孊構造の異なる数皮のプロスタグランゞンが生合成さ れる。 それらは内分泌系、 神経系、 炎症、 免疫系その ft ^䜓の恒垞性の維持に関 䞎する重芁な掻性物質ずしお泚目されおおり、 炎症、 血栓圢成、 末梢埪環、 動脈硬化、 老化などの諞機構に広汎に関䞎する [臚床科孊、 17巻、 958頁、 1981幎] ず考えられおいる。 さらに、 プロスタグランゞンは血管平滑筋に察 する血管䜜動性物質ずしお重芁な圹割をはたしおおり [病態生理、 2巻、 792 頁、 1983幎]、 血小板や血管壁由来の掻性型プロスタノィドであるトロンボ キサン A2 (TXA2 ) [プロシヌデむング ォブ ザ ナショナル ァカ デミ䞀 ォブ サむ゚ンス ォブ ザ ナナむテッド ステむツ ォブ ァメリ 力 Proc. Nat l. Acad. S c i. USA) , 72巻、 2994頁、 1975幎] および PG 12 [ネむチダヌ Na tur e)、 263巻、 663 頁、 197 &幎] が、 血小板ず血管系の生理ず病態における臚床的意矩においお 泚巚されおいる。 これらプロスタグランゞンの䞭で、 ずりわけ PGI2 は匷力な 血小板凝集抑制䜜甚ず血管匛緩䜜甚を呈し、 血小板由来の TXA2 ず拮抗的に䜜 甚し生䜓内のホメォスタヌシスの維持に関䞎しおいる [プリティッシュ ゞャヌ 菌ナル ォブ ファヌマコロゞ䞀 Br. J. P a rma c. ) 、 76巻、 3頁、 1982幎] 。 正垞の血管内皮现胞は、 物理的、 化孊的刺激が加わるず、 䞻ずしお PGI2 を生成し、 血小板の掻性化を抑制するのみならず自ら血管 壁トヌヌスを調節しお局所埪環の恒垞性を維持する機構が䜜動しおいる。 すなわ ち、 血栓症や動脈硬化症などの血管障害の発症には TXA2 および PGI2 の産 生䞍均衡ずりわけ PGI 2 の産生䜎䞋が関䞎しおいる [プリティッシュ ゞャヌ ナル ォブ ファヌマコロゞヌ B r. J. Ph a rma  、 76巻、 3頁、 1982幎] こずが知られおいる。 1978幎マックむンタむダヌら [ネ むチダヌ Na t u r e)、 271巻、 549頁、 1978幎] は流血䞭に血管 壁での PGI2 産生を刺激する因子の存圚を認めおおり、 本因子は熱に䞍安定な 高分子物質であるこずを報告しおいる。 その埌レムッゞらにより溶血性尿毒 症症候矀で本因子が䜎䞋しおいるこずが報告されお以来 [ランセッ ト (L a n c e t ) 2巻、 871頁、 1 978幎] 、 血栓性血小板枛少性玫斑 病 [ランセット Lan c e t) 2巻、 748頁、 1 979幎] 、 鎌状赀血 球性貧血 [ブリティッシュ ゞャヌナル ォブ ぞマトロゞ䞀 Br. J. Ha ema ΐ o 1. ) 48巻、 545頁、 1981幎] 、 急性心筋梗塞 [コロナ リ䞀 C 0 r 0 n a r y) 2巻、 49頁、 1985幎] 、 糖尿病等の血栓性 ·動 脈硬化性疟患で本因子の䜎䞋がその病因ず密接に関䞎しおいるこずが明らかにさ れおいる。 ずくに、 糖尿病性血管障害の発症 '進展因子ずしおの血小板凝集亢進 機序に぀いおは、 血小板由来 TXA2 の産生亢進 [トロンボシス リサヌチ (Th r omb. R e s . ) 19巻、 211頁、 1980幎、 ゞャヌナル ォブ ラボラトリ䞀 アンド クリニカル メディスン J. Lab. C l i n. Me d. ) 97巻、 87頁、 1 981幎] の他に、 血管由来の PG I 2 産生 䜎䞋が糖尿病患者や実隓糖尿病動物に぀いお報告されおいる [ランセッ ト (Lance t) 1巻、 325頁、 1979幎、 ランセット Lance t) 2 巻、 1365頁、 1979幎、 ザ 二ナり むングランド ゞャヌナル ォブ メディスン N. Engl. J. Me d. ) 300巻、 366頁、 1979 幎およびラむフ サむ゚ンス L i f e Sc i. ) 23巻、 351頁、
1978幎] 。 しかも、 この産生䜎䞋は、 侊 の血䞭に 存圚する PG 12 産生 刺激掻性の䜎䞋が䞀因を担っおいる可胜性が圔唆されおいる [メタボリズム (Me t ab o 1 i sm) 38巻、 837頁、 1989幎、 ぞモ ス タ シ ス (Ha emo s t a s i s) 16巻、 447頁、 1 986幎およびダむァ ベティス リサヌチ アンド クリニカル プラクティス D i ab. Re s. Cl in. P r a c t. ) 3巻、 243頁、 1987幎] 。
䞊述のごずく P G 12 は血小板凝集抑制䜜甚を有するが、 それ以倖にも血管お よび気管支などの平滑筋匛緩䜜甚、 胃酞分泌抑制䜜甚等を有する。 これらの生理 䜜甚に基づき PGI2 を医薬甚品ずしお開発するこずが考えられるが、 PGI2 は 37で䞭性の氎で半枛期 5分ず極めお化孊的に䞍安定な物質であり、 実甚 化に至っおない。 䞀方、 倩然の PG I2 様䜜甚を保ちながら、 化孊的に安定 な P G 12類緣䜓を血液凝固阻止剀、 血管拡匵剀等の医薬品ずしお開発しょうず する詊みがなされおいる。 しかし、 生䜓にずっおは、 PGI2 が䞍安定で短 である方がむしろ望たしい堎合も考えられる。 すなわち、 緊急の事態に至っお速 やかに生成される PGI 2 に察しお、 生䜓は垞に反応できる態勢にならなければ ならず、 安定な PGI2類瞁䜓を倚量に䞎えるこずによっお、 现胞の PGI2 に 察する応答性が䜎䞋し、 緊急の堎合に PGI2 に反応できなくなる可胜性も考え られる。 実際、 プロスタグランゞン E! (PGEa )や安定な PGI2類瞁䜓の 前凊理が原因で、 P G 12 に察しお圓然起こるべき c AMP䞊昇反応が生じなく なった现胞の䟋が報告されおいる [プロスタグランゞンズPros tag 1 a nd i ns. ) 19巻、 2頁、 1980幎] 。
埓っお、 PGI 2 の有する䞊述の䜜甚を期埅するのであれば、 化孊的に安定 な類瞁䜓を甚いるよりも、 必芁なずきに必芁な濃床の PG 12 を必芁な郚䜍 に産生させおやるこずが生䜓にずっおより奜たしいず考えられる。 生䜓内で の PG I 2 代謝は 2぀の因子により制埡されおおり、 その 1぀は PG I 2 安 定化因子で近幎アポリポプロティン A— 1 (ΑροΑ— 1) であるこずが同 定された [ザ ゞャヌナル ォブ クリニカル むンべスティゲヌゞペン J. C l i n. I nve s t. ) 82巻、 803頁、 1 988幎】 。 他の 1぀は PG 12 産生刺激因子 (Prostacyclin Production Stimulating Factor, PSF)で ある。 䞊述のごずくすでに血䞭には PG 12 產生刺激掻性 (Pros t acyc 1 i n St imu l at ing Ac t iv i ty. PSA)が存圚するこず が報告されおいるが、 その掻性本䜓PSF)は同定されおおらず同定が望たれ おいる。 PSFは血管内皮现胞からの PG 12 産生を刺激し、 血䞭の PG 12 濃 床を高めるこずにより P G 12 の有する血小板凝集抑制䜜甚、 平滑筋匛緩䜜甚、 胃酞分泌抑制䜜甚等を発珟するこずができる。 このような䜜甚に基づき P S Fは 溶血性尿毒症症候矀、 血栓性血小板枛少性玫斑病、 末梢動脈閉塞、 心虚血、 脳虚血、 動脈硬化、 脳閉塞、 高脂血症、 糖尿病、 心䞍党、 狭心症、 虚血性心 疟患、 う぀血性心疟患、 脈絡膜埪環障害、 気管支疟患、 胃朰瘪、 劊嚠子癇等の治 療に甚いうる可胜性を有しおいる。 発明の開瀺
本発明の目的は、 䞊述のような状況を鑑み、 血管内皮现胞からの PGI 2 の産 生を刺激する物質を粟補単離し、 新芏な蛋癜性生理掻性物質を提䟛するこずであ る。 たた、 本発明はその補造方法を提䟛するこずである。 さらに、 本発明の目的 は、 該蛋癜性生理掻性物質の PG 12 產生を刺激するずいう䜜甚に基づいた䞊述 の疟患に察する医薬組成物を提䟛するこずにある。 本発明者らは䞊述の目的を達成するために、 血䞭およびヒト现胞株培逊䞊枅䞭 に存圚する PG 12 刺激掻性に぀いお鋭意研究を重ねた結果、 正垞ヒトニ倍 䜓線維 胞の培逊䞊枅䞭に PG 12産生刺激掻性を有する物質が高濃床に存圚 するこずを確認した。 次いで、 この培逊䞊枅より PGI 2 ^^刺激掻性を有する 新芏な蛋癜性生理掻性物質を単離粟補するこずに成功し、 さらにアミノ酞配列の を決定した。
すなわち、 本発明は、 䞋蚘の特埵を有する新芏な蛋癜性生理掻性物質を提䟛す 。
(1)䞋蚘匏 (I)ないしIII) いずれかで衚されるアミノ酞配列を、 少なく ずも 1぀有しおいる。
匏I)
lie Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu lie Pro Val Lys'Lys Gly 1 5 10 15
Glu GLy Ala Glu Leu
20
匏ω
Gly His Tyr Gly Val Gin Arg
匏 (ΠΙ)
Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala lie Gin Thr 1 5 10 15
Arg
16
(2)非還元条件䞋におけるドデシル硫酞ナトリりム䞀ポリアクリルアミ ドゲ ル電気泳動 SDS— PAGE) においお分子量が 30〜36kDaである。
(3)血管内皮现胞に䜜甚し、 該现胞からのプロスタグランゞン I 2 (PG 12 ) の産生を刺激する掻性を有する。
たた、 本発明は、 䞊蚘の新芏な蛋癜性生理掻性物質を含む原料、 奜たしくは正 垞ヒトニ倍䜓線維芜现胞の培逊䞊枅から䞋蚘a)〜c) の工皋の少なくずも 1぀を甚いお粟補するこずを特城ずする該蛋癜性生理掻性物質の補造方法を提䟛 する。
(a) むオン亀換クロマトグラフィヌ
(b)ァフィ二ティヌクロマトグラフィヌ
(c) ゲルろ過クロマトグラフィヌ
たた、 本発明は䞊述の新芏な蛋癜性生理掻性物質を有効成分ずしお含有するこ ずを特城ずする、 䞋蚘疟患に察する治療甚の新芏な医薬組成物を提䟛する。 溶血性尿毒症症候矀、 血栓性血小板枛少性玫斑病、 末梢動脈閉塞、 心虚血、 脳 虚血、 動脈硬化、 脳閉塞、 高脂血症、 糖尿病、 心䞍党、 狭心症、 虚血性心疟患、 う぀血性心疟患、 脈絡膜埪環障害、 気管支疟患、 胃朰瘍、 劊嚠子癀。 図面の簡単な説明
図 1は、 D EAE— 5 PW陰むオン亀換クロマトグラフィヌによる溶出パタヌ ンを瀺すグラフである。
図 2は、 ぞパリンヌ 5 PWァフィ二ティヌクロマトグラフィヌによる溶出 パタヌンを瀺すグラフである。
図 3は、 プロテむンヌノ、 'ックゲルろ過力ラムクロマトグラフィ䞀による展開パ タヌンを瀺すグラフである
図 4は、 S D S— PAGEによる実隓結果を瀺す暡匏図である。 発明を実斜するための最良の圢態
以䞋本発明を詳现に説明する。
本発明の蛋癜性生理掻性物質は、 䞋蚘匏 ( 1 ) ないし ΙΙΓ)いずれかで衚され るァミノ酞配列を、 少なくずも 1぀有しおいる新芏な物質である。
匏I )
lie Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu lie Pro Val Lys Lys Gly
10 15
Glu Gly Ala Glu Leu
20
匏II)
Gly His Tyr Gly .Val Gin Arg 匏 (ΠΙ)
Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala lie Gin Thr 1 5 10 15
Arg
16
䞊蚘匏I ) ないしIII) いずれかのアミノ酞配列の郚分は本発明の蛋癜性生 理掻性物質の任意の郚分でよい。 䞊蚘匏 ( I ) ないしII I) のアミノ酞配列郚分 は互いに隣接しおいおも、 それらの間に任意のァミノ酞配列が含たれおいおもよ い 0
この新芏な蛋癜性生理掻性物質は、 非還元条件䞋におけるドデシル硫酞ナトリ ゥムヌボリアクリルアミ ドゲル電気泳動 (S D S - PAG E) においお分子量は 3 0〜3 6 kD aである。
たた、 本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質は、 血管内皮现胞に䜜甚し、 該现胞 からのプロスタグランゞン 1 2 (P G 1 2 ) の産生を刺激する掻性を有する。 こ の掻性の枬定方法は埌述する。
次に本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質の補造方法に぀いお説明する。
本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質は、 いかなる起源のものでも良いが、 ヒト 由来のものが奜たしく、 さらに奜たしくは、 正垞ヒト二倍䜓線維芜现胞由来のも のであり、 特に、 この正垞ヒト二倍䜓線維芜现胞の培逊䞊枅䞭に産生されるもの が奜たしい。 䟋えば、 適圓な生育媒䜓䞭で正垞ヒト二倍䜓線維芜现胞等を培 逊し、 P G 産生刺激掻性を有する培逊液を回収しお埗られる培逊䞊枅を粟補 するこずにより、 埗るこずができる。 正垞ヒトニ倍䜓線維 胞の培逊は、 通垞甚いられる培地を甚いるこずができ るが、 特にダルベッコ改倉むヌグル培地、 R PM I 1 6 4 0培地、 むヌグル最少 必須培地たたはハム培地等が奜たしい。 たた、 血枅を添加しおもしなくおもよい が、 培逊䞊枅より本発明の物質を粟補し、 単離するこずから、 無血枅培地を甚い た方が望たしい。 培逊終了埌の培逊䞊枅は、 䟋えばフィルタ䞀法たたは限倖ろ過 法等の方法により濃瞮した方が望たしい。
䞊述のようにしお埗られた本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質を含む原料を䞋 蚘工皋の少なくずも 1぀を甚いお粟補するが、 䞋蚘工皋 a ) 、 b ) およ びc ) の各々は、 公知のプロトコヌルに埓っお行えばよい。
(a) むオン亀換クロマトグラフィヌ
(b) ァフィ二ティヌク口マトグラフィヌ
( c) ゲルろ過クロマトグラフィヌ '
たた、 その順序は任意でよく、 必芁に応じお繰り返しおもよい。 さらに、 —぀の工皋ず他の工皋ずの間たたは前埌に、 濃瞮、 透析等の操䜜を加えおも よく、 さらに に応じお、 䟋えば、 クロマトフォヌカシング、 吞着クロマトグ ラフィ䞀、 驟氎性クロマトグラフィヌ、 逆盞クロマトグラフィヌ、 薄局クロマト グラフィ䞀、 分配クロマトグラフィヌ等の他のクロマトグラフィヌや、 等電点電 気泳動法、 ポリアクリルアミ ド電気泳動法、 塩折法等の他の蛋癜質の粟補方法ず 組み合わせおもよい。
たた、 工皋a) 〜c) の埌、 単離粟補、 玔床確認等の目的等のため、 さら に、 収集画分を逆盞高速液䜓クロマトグラフィ䞀にかけおもよい。
䞊蚘工皋a) 、 (b) およびc ) は各々、 䜎圧液䜓クロマトグラフィヌで あっおも、 高圧液䜓クロマトグラフィヌ 高性胜液䜓クロマトグラフィヌ、
HPLC)であっおもよい。
各クロマトグラフィ䞀における溶出たたは展開方法は、 各クロマトグラフィヌ 担䜓、 目的物質、 含有される借雑物質の物性等を考慮しお、 適圓な溶出条件たた は展開条件、 溶出液たたは展開液を遞択すればよい。 溶出に際しおは、 盎線濃床 募配溶出であっおも、 段階的濃床募配溶出であっおもよい。
䞊蚘工皋 (a)〜c)を甚いお、 奜たしくは䞋蚘の方法により培逊䞊枅から 本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質を単離するこずができる。
正垞ヒトニ倍䜓線維芜现胞の培逊䞊枅を陰ィォン亀換ク口マトグラフィヌ、 䟋 えば DEAE— 5PW (東゜䞀瀟補、 onoQ (フアルマシア瀟補 たたは Q—セファロ䞀スカラム フアルマシア瀟補 等に吞着させ、 塩化ナトリりムの 濃床募配法にお溶出する。 溶出した各フラクションの PG 12 産生刺激掻性 を枬定し、 掻性のある画分を埗る。 PGI2 産生刺激掻性の枬定に぀いおは埌 述する。 さらにこの画分をァフィ二ティヌクロマトグラフィヌ、 䟋えばぞパリン 侀 5 PW (東゜䞀瀟補 等に吞着させ、 塩化ナトリゥムの 濃床募配法にお溶 出する。 PGI2 産生刺激掻性を同様に枬定し、 掻性のある画分を集める。 次にこの画分をゲルろ過クロマトグラフィヌ、 䟋えばプロテむン䞀パック 日 本ミリポア リミテッド りォヌタヌズ クロマトグラフィヌ事業郚 、 セファ クリル S— 100HR (フアルマシア瀟補 たたは TSKゲル G 3000 SWXLカラム 東゜䞀瀟補 等を甚いお展開し、 PG 12 産生刺激掻性を枬定す るこずにより、 生物孊的掻性画分を埗るこずができる。 さらにこの画分をァフィ 二ティヌクロマトグラフィヌ、 䟋えばむンシナリン様増殖因子 Insu l i n e— l ike growth f ac tor, I GF) — Iたたは IIをリガンド ずしお結合させた IGF—ァフィ二ティ䞀カラム、 たたは、 小麊胚芜凝集玠をリ ガンドずしお結合させた WGA—ァフィ二ティヌカラムにかけるこずにより、 PG 12産生刺激掻性を瀺す新芏な蛋癜性生理掻性物質を単離粟補できる。 各クロマトグラフィヌにおける目的ずする本発明の蛋癜性生理掻性物質の画分 は、 溶出した各フラクションの PG 12 産生刺激掻性を枬定し、 掻性のある面分 を集めるこずにより埗るこずができる。
PGI2産生刺激掻性の枬定は、 以䞋の方法により実斜できる。 すなわちゥシ 胞郚倧動脈內膜より剝離法にお採取した血管内皮现胞を 10 %ゥシ胎児血枅含有 ダルべッコ改倉ィ䞀グル培地で継代培逊し、 飜和现胞密床に達するたで培逊した 埌、 枬定詊料を添加し 60分間むンキュベヌション埌、 䞊枅䞭の PGI2 の安定 代謝産物である、
Ό —ケ 卜 — r F la (以䞋、 6 -ケト- PGF 1 αず 蚘す を !ί定するこずにより P G 12 産生量を求めるこずができる。 この枬定に は垂販の 6—ケトヌ PGF 1 α枬定甚キットを甚いおもよい。
粟補された PG 12産生刺激掻性を有する本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質 のアミノ酞配列を決定するために、 以䞋の方法を甚いるこずができる。 䟋えば、 自動気盞シヌクェンサ䞀を䜿甚する堎合は、 盎接本発明の物質を該シヌクェ ンサ䞀で分析しおも、 たたは、 トリプシン、 リゞル゚ンドべプチダ䞀れ等の酵玠 切断により埗られるぺプチド断片を分析しおもよく、 それぞれのァミノ酞配列を 決定するこずができる。
本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質は、 PG I2 の有する血小板凝集抑制 䜜甚、 平滑筋匛緩䜜甚、 胃酞分泌抑制䜜甚等を有するので、 以䞋の各皮疟患に察 しお、 本発明の蛋癜性生理掻性物質を少なくずも 1぀の有効成分ずしお含有する 医薬組成物を提䟛する。
溶血性尿毒症症候矀、 血栓性血小板枛少性玫斑病、 末梢動脈閉塞、 心虚血、 脳 虚血、 動脈硬化、 脳閉塞、 高脂血症、 糖尿病、 心䞍党、 狭心症、 虚血性心疟患、 う぀血性心疟患、 脈絡膜埪環障害、 気管支疟患、 胃朰瘍、 劊嚠子癇。
本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質の投䞎量は、 患者の性別、 幎霢、 䜓重、 ç–Ÿ 患の皮類やその病態あるレ、は投䞎剀型により適宜倉動するが、 有効投䞎量は ,1 n g〜2 mg/kg、 奜たしくは 1 0 n g〜2 0 0/ g/kgである。
本発明の医薬組成物の医薬圢態は、 その疟患病巣に有効量を䟛絊できるもので あればいかなるものでもよく、 䟋えば、 錠剀、 粉末剀、 散剀、 カプセル剀、 軟膏 剀、 粉霧剀あるいは泚射剀等が䟋瀺される。 たた、 本発明の医薬組成物は、 その 薬理孊的特性を損なわない限り、 䞀般的に䜿甚される補剀孊的混合物である賊型 剀、 安定化剀^)るいは溶解補助剀等を含有しおいおもよい。 具䜓䟋ずしお、 リンガ䞀液、 燐酞緩衝液、 ヒト血枅アルブミン、 氎解れラチン、 蔗糖、 デキスト ラン、 ポリ゚チレングリコヌル等があり、 薬剀圢態により、 適宜遞択䜿甚さ れる。 実斜䟋
以䞋に本発明を実斜䟋をもっおより具䜓的に瀺すが、 これは本発明の実斜態様 の䞀぀の䟋瀺であり、 本発明はこれに限定されるものではない。 なお、 実斜䟋䞭 の孊術甚語、 H各号等は特に断らなレ、限り圓該技術分野で䞀般的に䜿甚されおいる ものに埓った。 たた、 蛋癜質粟補に関わる基本的操䜜は、 日本生化孊䌚線
" 新生化孊実隓講座第 1å·» 蛋癜質 I 分離粟補性質" 東京化孊同人 1990幎を参考ずしお実斜した。 各皮機噚、 詊薬の䜿甚法は各々附属の䜿甚 説明曞に埓った。
(実斜䟋 1 )
䞋蚘の方法で、 培逊䞊枅を䜜補し、 粟補し、 本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物 質を埗た。
なお、 PG 12 産生刺激掻性の枬定は実斜䟋 3に瀺す埌述の方法で行った。 ( 1 ) 正垞ヒトニ倍䜓線維芜现胞の培逊䞊枅の䜜補
正垞ヒトニ倍䜓線維芜现胞を 15 %ゥシ胎児血枅含有ダルべッコ改倉むヌグル 培地にお 4. 8X 104 现胞 ZmLに調補した。 この现胞懞濁液 3 Lを回転培 逊容噚に怍え蟌み、 5%炭酞ガス- 95%空気䞋、 37。Cにお培逊した。 现胞怍 え蟌み 3日埌に培逊液を新鮮な 15 %ゥシ胎児血枅含有ダルべッコ改倉ィヌ グル培地 3 Lに亀換し、 さらに培逊を 2日間継続した。 次いで、 培逊液を陀 去し、 Ca2+、 Mg2+䞍含ダルベッコ䞀リン酞生理食塩溶液を甚いお现胞を 掗浄した埌、 フヱノヌルレツド䞍含のダルベッコ改倉むヌグル培地 3 Lを添 加し、 37お、 2日間培逊した。 培逊液を回収埌、 2. 5/zmのフィルタヌ (CNカヌトリッゞ 30むンチ、 ミリポア瀟補 におろ過し现胞片を陀去 した。 次いでホロ䞀ファむバヌモゞュヌルモルセップファむバヌ FS— 10 6 kDa カツトオフ、 ダむセル化孊工業瀟補 、 分画分子量 10 kDaの限タ ろ過カセット オメガミニセット、 富士フィルタヌ工業瀟補 による 2段階の濃 瞮操䜜にお濃瞮した。 この濃瞮液を分画分子量 3. 5 kDaの透析チュヌブス ぺクトラム瀟補 を甚いお、 2 OmMトリスヌ塩酞緩衝液 pH 7. 8) で 4 、 1晚透析した。 同緩衝液でさらに 4 eC、 8時間透析埌、 1. 2〃 mフィル 倕䞀ディ゚プむ アセンブリ、 日本ポヌル瀟補 、 0. 22 zmフィルタ䞀 システム コ䞀二ング瀟補 で順次ろ過した。
(2) P G 12 産生刺激掻性因子の粟補
工皋 1
( 1 ) に埓っお䜜補した正垞ヒトニ倍䜓線維芜现胞の培逊䞊枅を予め 2 OmM トリス䞀塩酞緩衝液 PH7. 8) で平衡化した DEAE— 5 P.W (東゜䞀 瀟補 陰むオン亀換クロマトカラムに吞着させ、 2 OmMトリス䞀塩酞緩衝 液pH7. 8)を甚いお䜜補した 0〜1. 0Mの塩化ナトリりムの盎線濃床募 配法にお溶出させ、 280 nmにおいお吞光床を同時に枬定した。 溶出した各フ ラクシペンの P G 12 産生刺激掻性を䞊述の方法に埓っお枬定し、 50〜 150 mMの塩化ナトリり厶濃床で溶出された PG I 2 産生刺激掻性を有する画分 をプヌルした 図 1)。
工皋 2
工皋 1で埗られた掻性画分を 10 mMリン酞緩衝液 (pH7. 4)で透析埌、 1 OmMリン酞緩衝液 (pH7. 4)で平衡化したぞパリン HEPAR IN) -5PW (東゜䞀瀟補 ァフィ二ティヌカラムに吞着させ、 1 OmMリン酞緩衝 液pH7. 4)を甚いお䜜補した 0〜し 0Mの塩化ナトリりムの盎線濃床募 配法にお溶出させ、 28 O.nmにおいお吞光床を同時に枬定した。 溶出した各フ ラクシペンの PGI2 産生刺激掻性を枬定し、 450〜 500 mMの塩化ナトリ ゥム濃床で溶出された PG I 2 産生刺激掻性を有する画分をプヌルした 図 2) o
工皋 3
工皋 2で埗られた掻性画分をセントリコンヌ 10 (アミコン瀟補 にお濃 瞮埌、 予め 10 mMリン酞緩衝液 (pH7. 4)で平衡化したプロティンヌパッ ク PROTE IN— PAK) 300 (日本ミリポア リミテッド りォヌタヌ ズクロマトグラフィ䞀事業郚 のゲルろ過カラムを 2本連結したものを甚いお展 開し、 280 nmにおいお吞光床を同時に枬定した。 各フラクションの PG 12 産生刺激掻性を枬定したずころ、 掻性は分子量 3 OkD a付近に認められた 図
3) o 図 3䞭の数字は分子量kDa)、 Vtは充填剀の総䜓積、 Voは排陀䜓 積を衚す。
工皋 4
工皋 3で埗られた掻性画分を 1 OmMリン酞緩衝液 (pH7. 4)で平衡化し た I GF—ァフィ二ティヌカラムにかけた。 I GF—ァフィ二ティヌカラムは、 ァフむブレップ 10 (日本バむオラッドラボラトリヌス瀟補 に組換 IGF— I をリガンドずしお結合させた耐圧力ラムを䜜補し、 本実隓に甚いた。 サンプルを 吞着埌、 0. 5 M酢酞で溶出した。 PG 12 産生刺激掻性を枬定たずころ、 PG 12姓刺激掻性は、 非吞着面分に認められた。
工皋 5 '
工皋 4で埗られた掻性画分を 0 · 1 %トリフルォロ酢酞含有 10 %ァセトニト リノレ氎溶液で平衡化した C 4 逆盾 HP LCカラム りォヌタヌズ瀟補 にァプラ ィした埌、 溶出液 0. 1%トリフルォロ酢酞/ァセトニトリル溶液を甚いお䜜補 した 10〜60%ァセトニトリルの盎線濃床募配法にお溶出した。 その結果、 本 発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質は単䞀なピヌクずしお溶出された。  (実斜䟋 2 )
正垞ヒトニ倍䜓線維芜现胞由来の PG 12 産生刺激因子の物性の枬定
( 1 ) 分子量の枬定
実斜䟋 1の工皋 5で埗られた本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質の分子量を、 非還元条件䞋におけるドデシル硫酞ナトリりム䞀ポリアクリルアミ ドゲル電気泳 動 SDS— PAGE)で求めたずころ、 分子量 33 kD aに単䞀のバンドずし お認められた 図 4)。 図 4は SDS— PAGEの泳動埌の参考写真の暡匏図で ある。 図 4䞭、 ラむン Aおよび Cは既知分子量の暙準詊料のバンドであり、 ラむ ン Bは本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質のバンドである。 たた、 数字は暙準詊 料の分子量 (kDa)を衚す。
(2) アミノ酞配列の解析
実斜䟋 1の工皋 5で埗られた本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質を、 トリプシ ンで消化しペプチドフラグメント化した。 このサンプルを 0. 1%トリフルォロ 酢酞氎溶液で平衡化した C8 逆盾 HPLCカラム セパレヌシペンズグルヌプ瀟 補 にかけた埌、 0. 08 %トリフルォロ酢酞 Zァセトニトリル溶液を甚いお䜜 補した 0〜80%ァセトニトリルの盎線濃床募配法にお溶出させ、 埗られたフラ グメントペプチドに぀いお自動気盞シヌクェンサ䞀アプラむドバむォシステム ズ 477A- 12 OA)を甚い、 ゚ドマン分解により内郚のアミノ酞配列、 䞋蚘 匏I)〜(ΙΠ) を決定した。 匏I )
He Thr Val Val Asp Ala Leu His GIu lie Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15
Glu Gly Ala Glu Leu
20
匏II)
Gly His Tyr Gly Val Gin Arg 匏 (III)
Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala He Gin Thr 1 5 10 15
' Arg '
16
(実斜䟋 3 )
P G 1 2 刺激掻性の枬定
血管内皮现胞はゥシ胞郚倧動脈内膜より剝離法にお採取した。 次いで埗られた 血管内皮现胞を 1 0 %ゥシ胎児血枅を含む 1 0 O U/m Lペニシリンおよび 1 0 0 gZmLストレプトマむシン含有ダルベッコ改倉むヌグル培地䞭、 5 % 炭酞ガス䞀 9 5 % 䞋、 3 7 °Cにお継代培逊した。 培地は週 2回亀換し、 5〜 1 0代継代埌、 血管内皮现胞を 0. 0 5 %トリプシン凊理した。
次いで、 1 0 %ゥシ胎児血枅含有ダルベッコ改倉むヌグル培地 l mLの入った 2 4穎培逊皿に血管内皮现胞を移し、 5 X 1 0 4 现胞 Z穎たで培逊した。 1 0 % 以䞋の各皮詊料含有ダルベッコ改倉むヌグル培地 500 を添加埌、 37°Cで 60分間むンキュベヌションした。
培逊䞊枅からの 6—ケトヌ PGF 1 αの抜出ず粟補はゞダッフェらの方法 [ザ ゞャヌナル ォブ クリニカル むンべスティゲヌシペン J. Cl in. I nve s t. ) 52巻、 398頁、 1973幎] を改良しお行った。 培逊䞊枅 lmLに 0. 1Nå¡©é…ž 1. 5mLを加え、 5 mL酢酞ェチルで 2床抜出した。 窒 玠ガス䞋で酢酞ェチルを蒞発させ、 ゚タノ䞀ルに再溶解させた。 アツセィに䜿甚 するたで䞀 20でで保存した。 4 (TCで゚タノヌルを蒞発させ 0. 1Mリン酞緩 衝液pH7. 2、 1M塩化ナトリりム、 1 %れラチン含有 に溶解させた。
6- [ 3H]ケト PGF 1 αず抗 6—ケトヌ PGF 1 α抗䜓を甚いたニュヌィ ングランドヌクレア䞀 N ew Eng l and Nu c l e a r)瀟補の 6—ケトヌ PGF 1 α枬定ラゞオィムノアッセィキットを甚い、 添付マニュ アルに埓い 6—ケトヌ PGF 1 αの濃床を枬定した。 PG I2 產生量は、 1 時間、 104 现胞圓たりの &ヌケトヌ PGF 1 α産生量pgZl 04 现胞 Z時 間 によっお、 求めた。
本発明の蛋癜性生理掻性物質の瀺す PG 12 産生刺激掻性は濃床䟝存的に増加 した。
(実斜䟋 4 ) 実斜䟋 1で埗られた本発明の蛋癜性生理掻性物質を甚いおマりスにおける毒性 詊隓を実斜した。 すなわち、 6週霢の I CRマりス雌雄各々 5匹に察しお実斜䟋 1で埗られた蛋癜性生理掻性物質を 1日 1回 1週間連日静脈内投䞎した。 投䞎期 間䞭を通しお各動物個䜓の䞀般性状を芳察した。 本詊隓では最高投䞎量矀である
1 Omg/kg矀でもいずれの動物においおも死亡䟋は芳察されず、 䞀般性状におい おも倉化はみられなかった。
(実斜䟋 5 )
泚射甚溶液剀の調補
実斜䟋 1で埗られた本発明の蛋癜性生理掻性物質 10 Omgを 1 Omg/mLの氎 解れラチンを含有する生理食塩液 1 0 OmLに溶解し、 ポアサむズ 0. 22 m のフィルタヌ マむレックス GV ミリポア瀟補 を甚いおろ過枛菌した。 これ を無菌的に 2 m Lず぀ガラスパむアルに分泚埌密栓し、 泚射甚溶翻ずした。 (実斜䟋 6 )
泚射甚凍結也燥剀の調補
実斜䟋 1で埗られた本発明の蛋癜性生理掻性物質 1 0 Omgを 10 Oiiig/mLの ヒト血枅アルブミンを含有する 1 OmM PBS (pH7. 4) 10 OmLに溶 解し、 ポアサむズ 0. 22 mのフィルタヌ マむレックス GV ミリポア 瀟補 を甚いおろ過滅菌した。 これを無菌的に 3 mLず぀ガラスバむアルに 分泚、 凍結也燥埌密栓し、 泚射甚凍結也燥剀ずした。 産 S±の利甚可胜性
本発明の新芏な蛋癜性生理掻性物質は血管内皮现胞に䜜甚し、 該现胞から の PG 12 の趣を刺激する䜜甚を有する。 埓っお PG 12 の有する血小板凝集 抑制䜜甚、 平滑筋匛緩䜜甚、 胃酞分泌抑制䜜甚等に基づき溶血性尿毒症症候矀、 血栓性血小板枛少性玫斑病、 末梢動脈閉塞、 心虚血、 脳虚血、 動脈硬化、 脳 閉塞、 高脂血症、 糖尿病、 心䞍党、 狭心症、 虚血性心疟患、 う぀血性心疟患、 脈 絡膜埪環障害、 気管支疟患、 胃朰瘍、 劊嚠子癇等の治療甚医薬甚途ずしおの応甚 が期埅できる。
配列衚
配列番号  1
配列の長さ 2 0
配列の型 アミノ酞
トポロゞヌ盎鎖状
配列の皮類ぺプチド
配列
lie Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu [le Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ala Glu Leu
20 配列番号  2
配列の長さ 7
配列の型 アミノ酞
トポロゞヌ盎鎖状
配列の皮類ぺプチド
配列
Gly His Tyr Gly Val Gin Arg 配列番号  3
配列の長さ 1 6
配列の型 アミノ酞
トポロゞヌ盎鎖状
配列の皮類ぺプチド
配列
Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala l ie Gin Thr 1 5 10 15
Arg

Claims

請求の範囲
1. 䞋蚘の特城を有する蛋癜性生理掻性の物質、
(1)䞋蚘匏I)ないし σπ) レ、ずれかで衚されるアミノ酞配列を、 少なくず も 1぀有する、
匏I)
lie Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu lie Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15
Glu Gly Ala Glu Leu
20
匏II)
Gly His Tyr Gly Val Gin Arg
1 5
匏 (I I I)
Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala lie Gin Thr 1 5 10 15
Arg
16
(2)非還元条件䞋におけるドデシル硫酞ナトリりム䞀ポリアクリルァミドゲル 電気泳動 (SDS-PAGE)においお分子量が 30〜36kDaである、 (3)血管内皮现胞に䜜甚し、 該现胞からのプロスタグラ ンゞン I 2 (PG 12 ) の を刺激する掻性を有する。.
2. 請求項 1に蚘茉の蛋癜性生理掻性物質を含む原料を、 䞋蚘a)〜c)の 工皋の少なくずも 1぀を甚いお粟補するこずを特城ずする補造方法。
( a ) むオン亀換クロマトグラフィヌ
(b ) ァフィ二ティ䞀クロマトグラフィヌ
( c ) ゲルろ過クロマトグラフィヌ
3. 請求項 1に蚘茉の蛋癜性生理掻性物質を有効成分ずしお含有するこずを特埵 ずする、 䞋蚘疟患のいずれか 1぀の疟患に察する治療甚医薬組成物、
溶血性尿毒症症候矀、 血栓性血小板枛少性玫斑病、 末梢動脈閉塞、 心虚血、 脳 虚血、 動脈硬化、 脳閉塞、 高脂血症、 糖尿病、 心䞍党、 狭心症、 虚血性心疟患、 う぀血性心疟患、 脈絡膜埪環障害、 気管支疟患、 胃朰瘍、 劊嚠子癇。
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