WO1993023032A1

WO1993023032A1 - Remedy for cataract and production thereof

Info

Publication number: WO1993023032A1
Application number: PCT/JP1993/000643
Authority: WO
Inventors: Mitsuyoshi Azuma; Yoshimasa Abe; Shunji Sogo
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.; Senju Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1992-05-20
Filing date: 1993-05-17
Publication date: 1993-11-25
Also published as: HU9403321D0; EP0641563A4; CN1084061A; HUT71250A; CA2135302A1; RU94046058A; MX9302924A; EP0641563A1; BG99197A; BR9306387A; PL306093A1; PL171704B1

Description

明細書

白内障治療剤およびその製造方法

〔技術分野〕

本発明は、（十）一（2 ， 3 ）一3 〔（）ー3—メチルー 1— ( 3—メチルプチルカルバモイル）ブチルカルバモイル〕一 2—ォキシランカルボン酸（以下、 E— 6 4 cと称する）、その塩（以下、 E— 6 4 c塩と称する）またはそのェチルエステル（以下、 E— 6 4 dと称する）を含有してなる新規かつ有用な白内障治療 ·予防剤およびその製造方法に関する。

〔背景技術〕

白内障は、種々の原因で水晶体に混濁が生ずる疾患であり、水晶体の混濁によつて光の散乱が起こり、網膜に正常な像が結ばないことから、視力障害としてその症状が現れてくるものである。

白内障は、その原因により、先天性白内障 (Cataracta stationaris). 老人性白内障 (Cataracta senilis),併発性白内障 (Cataract complicata), 外傷性白内障（Cataracta traumatica)，糖尿病性白内障（Ca racta diabetica)などに分類され、さらにこれらに加えて放射棣白内障、硝子ェ白内障なども知られている。いずれも水晶体の混濁による視力低下を伴う重大な眼疾患の一つである。

白内障に対する治療法としては、これまで、たとえばピレノキシンなどの抗キノイド剤，たとえばシスティンなどのグルタチオン合成に関与する薬剤，たとえばチォプロニンなどの S H基を有する薬剤，たとえばトルレスタツトなどのアルドース還元酵素阻害剤などの各種薬剤の投与が試みられているが、水晶体の新陳代謝が非常に遅いこともあり、未だ満足すべき効果を収めていない。従って、現在の白内障の治療法は手術的療^¾に限定されているといってよい。手術的療法として、混濁した水晶体の位置を眼球内で移動させる方法と水晶体全体を眼球外へ摘出する方法があるが、角膜の切開，縫合や水晶体の切開創が必然的に伴い、近年の手術手段の進歩を考慮しても、患者への負担は大きい。

白内障の病因の詳細は現在も不明であるが、最近、その病因として水晶体タンパクの酸化、分解および凝集などの関与や混濁に至つた水晶体での力ルシゥムの上昇が指摘されている〔インヴエスティゲイティヴオフサルモロジ一

( I n V e .s t . Oph tha lmo l. ) , 1 3巻， 204— 20 9頁（1 9 74) ) ο

そして、カルパインは、カルシウムで活性化されるシスティンプロテアーゼで、水晶体中に存在する主たるタンパク分解酵素であるが、このカルパイン阻害剤であるトランス一エポキシサクシ二ルーロイシルアミドー（4 - グァニジノ）ブタン（以下、 Ε— 64と称する）がセレン白内障モデルや培養ラット水晶体での糖白内障モデルにおいて水晶体の混蜀を抑制することが報^^されている（あたらしい眼科，第 6巻， 1 573〜1576頁, 1 989年）。しかし、 Ε— 64の白內障治療効果は弱く、実用に適していない。

また、システィンプロテアーゼの合成阻害剤である Ε— 64 c、 E— 64 c塩および E— 64 dが、そのシスティンプロテア一ゼ阻窖作用に基づき、急性外傷および脳 ·脊 Kの循環障害による急性中枢神経損傷治療に有用であることも報告されている（特開昭 62— 255423号公報）。

〔発明の開示〕

このような現状に鋈みて、本発明者等は、優れた白内障治療剤、白内障予防剤およびその製造方法を求めて鋭意研究を重ねた結果、 E— 64 c、 E— 64 c塩および E— 64 dが意外にも予期しなかった優れた白内障治療効果、白内障予防効果を有することを見出し、当該化合物を有効成分とする S内障治療 ·予防剤の製造方法を確立することによって本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らは、 E— 64 c、 E— 64 c塩および E— 64 dが pH3〜7において容易に角膜を透過してその薬理活性を発揮すること、また E- 6 dは当該 pHにおいて極めて安定であることを見出して本発明を完成した。

即ち、本発明は、次の通りである

① E— 64 c、 E— 64 c塩および E— 64 dから選ばれる少なくとも一種の化合物を含有し、好適には PH3〜7である白内障治療'予防剤（以下、白内障治療 ·予防剤を白内障治療剤と称する）。

② E— 64 c、 E— 64 c塩および E— 64 dから選ばれる少なくとも一稗の化合物を白内障の治療に有効な量投与することによる白内障治療 ·予防方法（以下、白内障治療 ·予防方法を白内障治療方法と称する）。

③ 白内障治療剤製造のための E— 6 4 c、 E— 6 4 c塩および E— 6 4 dから選ばれる少なくとも一種の化合物の使用。

④ E— 6 4 c、 E— 6 4 c塩および E— 6 4 dから選ばれる少なくとも一種の化合物と水性媒体とを混合した後または混合する前に、最終製剤の p Hが 3〜 7 となるように水性媒体の p Hを調整することを特徴とする点眼剤形態の白内障治療剤の製造方法。

⑤ E— 6 4 c、 E— 6 4 c塩および E— 6 4 dから選ばれる少なくとも一種の化合物と水性媒体とを混合した後または混合する前に、最終水性液の p Hが 3〜 7となるように水性媒体の p Hを調整することを特徵とする当該化合物含有水性液の製造方法。

E— 6 4 cおよび E— 6 4 dは、それぞれ下式で表される化合物である。

〔式中、 Rが水素である化合物が E— 6 4 cであり、 Rがェチルである化合物が E - 6 4 dである。〕

E - 6 4 c塩に用いられる塩は、薬理学的に許容される塩であれば特に制限はなく、たとえば E— 6 4 cとアルカリ金属（たとえば、ナトリウム. カリウムなど）、アルカリ土類金属（たとえば、カルシウム，バリウムなど）、塩基性アミノ酸（たとえば、リジン，アルギニンなど）、ァミン類（たとえば、ジメチルァミン，トリェチルァミンなど）との塩が挙げられる。

E— 6 4 c、 E - 6 4 c瑋および E— 6 4 dは、たとえば特開昭 5 5 - 1 1 5 8 7 8号公報（U S P 4 3 8 2 8 8 9 ) に記載の方法によって容易に製造することができる。本発明にて使用される E— 6 4 c、 E— 6 4 c塩および E— 6 4 dは、後述する試験例より明らかなように、水晶体の混濁に対する優れた抑制効果を有するので、白内障の治療および予防に有効な薬剤として用いることができる。

E— 6 4 c、 E— 6 4 c塩および E— 6 4 dを白内障治療剤として用いる場合、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カブセル剤、注射剤、点眼剤、眼軟膏などの形態とすることができる。特に点眼剤、眼軟耷または注射剤の形態とすることが好ましい。当該製剤は、経口的または非口的に投与することができる。

本発明の製剤は、 E— 6 4 c > E - 6 4 c塩および E— 6 4 dから選ばれる少なくとも一種の化合物（以下、単に化合物ともいう。）と基剤とを混合することによつて製造することができる。

ここでいう基剤とは、それ自体公知の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤などを含む概念である。

点眼剤用の基剤としては、滅菌精製水、生理食塩液、緩衝剤などの水性媒体が例示される。

眼用軟耷用の基剤としては、とりわけワセリン, プラスチベース、流動バラフイン，ボリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロース力好ましい。

点眼剤、眼軟膏の場合には、 E— 6 4 dを有効成分化合物とすることが好ましく、かくして当該化合物が極めて容易に角膜を透過して、眼内の酵素によって速やかに加水分解されて、活性体である E— 6 4 cとなり、所望とする治療効果および予防効果が発揮される。

本発明の点眼剤の p Hは、通常 3〜7、好ましくは 4〜6、より好ましくは 4 . 5〜5 . 5である。 P H 3未満の場合には、眼組攝障害などの副作用が発生しかつ化合物が不安定であり、また p H 7を越える場合には、化合物が不安定であるので好ましくない。

E— 6 4 c、 E— 6 4 c塩または E— 6 4 dは、基剤としての水性媒体に溶解していてもよく、また懸濁していてもよい。

点眼剤に適宜配合されうる添加剤としては、次のようなものが例示される。緩街剤としては、たとえばリン酸塩緩衝剤，ホウ酸塩緩街剤，クェン酸塩锾街剤，酒石酸塩緩衝剤，酢酸塩緩衝剤、アミノ酸などが用いられる。好適には p H 2〜 9の範囲に緩衝能を持つ緩衝剤が使用される。

等張化剤としては、たとえばソルビトール，グルコース，マンニトールなどの糖類、グリセリン，ポリエチレングリコール，プロピレングリコールなどの多価アルコール類，塩化ナトリウムなどの塩類などが用いられる。

防腐剤としては、たとえば塩化ベンザルコニゥム，塩化べンゼトニゥム、パラォキシ安息香酸メチル，パラォキシ安息香酸ェチルなどのパラォキシ安息香酸ェステル類、ベンジルアルコール、フエネチルアルコール、ソルビン酸およびその塩，チメロサール、クロロブタノールなどが用いられる。

増粘剤としては、たとえばヒドロキシェチルセルロース，ヒドロキシブ口ピルセルロース，メチルセルロース，ヒドロキシブ口ピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびその塩などが用いられる。

溶解補助剤（安定化剤）としては、たとえばシクロデキストリン類，ボリビニルピロリドンなどの水溶性高分子、ボリソルベート 8 0などの界面活性剤などが用いられる。

キレート剤としては、たとえばェデト酸ナトリウム，クェン酸ナトリウム，縮合リン酸ナトリウムなどが用いられる。

懸濁化剤としては、たとえばボリソルベート 8 0などの界面活性剤、メチルセルロースナトリウム，ヒドロキシブ口ピルメチルセルロース、メチルセルロースなどの水溶性高分子などが用いられる。

点眼剤は、たとえば水性媒体などの基剤、前記の如き添加剤ならびに E— 6 4 c、 E - 6 4 c塩および E— 6 4 dから選ばれる少なくとも一種の化合物を適宜の順序で加え、適宜の工程で ρ Η 3〜7に調整すること、さらには適宜の工程で滅菌処理することによって製造される。

滅菌処理としては、たとえば通常の過滅菌、高圧蒸気法、流動蒸気法などを使用することができる。好適には、 0 . 2 2 /z mのメンプランフィルターによる濾過滅菌が行われる。

もっとも、化合物が溶解された態様の点眼剤は、基剤に添加剤ならびに E— 6 4 c、 E—& 4 c塩および E— 64 dから選ばれる少なくとも一種の有効成分化合物を適宜の順序で加えた後に p Hを 3〜了に調整することによつて製造されることが好ましい。その際、緩衝剤として pH2〜 9の範囲に緩街能を持つ锾街剤を使用した後に、 pHを 4〜6に調整することが好ましい。

また、化合物が懸濁された態様の点眼剤は、基剤に添加剤を配合した後、 pH を 3〜 7に調整して滅菌処理し、 SU個に滅菌処理した化合物を混合することが好ましい。その際、緩街剤として pH2〜 9の範囲に緩衝能を持つ緩衝剤を使用した後に、 pHを 4〜 6に謂整することが好ましい。

ここで用いられる pH調螯¾¾としては、常法的に使用されるものでよく例えば塩酸、醉酸、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニゥムなどが挙げられる。好適には、 1N—塩酸、 1N—水酸化ナトリウムである。

本発明の白内障治療剤を眼軟膏として用いる場合は、通常用いられる眼用軟耷基剤中に E— & 4 c、 E-64 c塩および E— 64 dから選ばれる少なくとも一種の化合物を混合して、以下常法に従って製剤化することがきる。

本発明の白内障治療剤に含まれる E— 64 c、 E— 64 c塩および E— 64 d から選ばれる少なくとも一種の化合物の量は、該化合物の種類、剤型などによつても異なるが、点眼剤の場合は約 0. 001〜10w/v%、好ましくは 0.01〜 lwZv½程度であり、眼軟膏剤の場合は約 0. 001〜10 w w%^ 好ましくは 0 01〜 1 程度である。

E— 64 c、 E-64 c塩および E— 64 dを白内障治療剤として用いる合の投与量は、化合物の種類、患者の年齢、体重、症状、その剤型などによっても異なるが、たとえば成人の白内障患者に点眼剤として用いる場合は、化合物を約 0. 001〜10wZv%、好ましくは 0. 01〜1 wZv%程度含有する溶解状態の点眼剤または懸濁状態の点眼剤として、 1回量 1〜数滴を 1日 3〜 5回投与することが望ましい。また、眼軟膏剤の場合は、化合物を約 0. 001〜10 /wM. 好ましくは 0 · 01〜 1 wZw 程度含有する眼軟膏剤として、症状に応じて 1日 1〜4回程度投与するのが望ましい。

本発明の白内障治療剤には、本発明の目的に反しないかぎり、さらに他の A内障治療剤、たとえばピレノキシンなどの抗酸化剤、たとえばシステンなどのグルタチオン合成に関与する薬剤、たとえぱチォプロニンなどの S H基を有する薬剤、たとえばトルレスタツトなどのアルドース還元酵素阻害剤などの各種薬剤の 1種または 2種以上を適宜組み合わせて含有させることもできる。

さらに、本発明の白内障治療剤には、本発明の目的に反しないかぎり、上記の各種白内障治療剤のほかに、別種の薬効を奏する成分を適宜含有させることもでさる。

本発明の白内障治療 ·予防剤、治療 ·予防方法は、各種の白内障に対して優れた治療■予防効果を有するものである。

〔図面の簡単な説明〕

図 1 (a), (b) は、 E— 6 4 cの腹腔内投与および E— 6 4 dの点眼によるラットガラクトース白內障に対する効果を示すグラフである。

図 2は、培養ラット水晶体におけるカルシウム ·ィオノフォア（ionophore) 誘発白内障に对する各被験薬物（E— 6 4および E— 6 4 d ) の、対照群での水晶体の混濁に対する抑制効果を示すグラフである。

〔発明を実施するための最良の形想〕

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明し、試験例により本発明の効果を明らかにするが、これらは単なる例示であって、これらにより本発明の範囲が限定されるものではない。

実施例 1

懸濁状態点眼剤

次の処方で懸濁状の点眼剤を調製した。

E - 6 4 d 1 g

ボリビニルアルコール 0 . 5 g

リン酸一水素ナトリウム · 1 2水塩 0 . 5 g

リン酸ニ水素ナトリウム · 2水塩 0 . 2 g

ェデト酸ナトリウム 0 . 0 2 g

塩化ナトリウム 0 . 7 g 塩化ベンザルコニゥム 0. 0 0 7 g

滅菌精製水 JH_

全量 100 m 1

(操作方法）

滅菌精製水 80mlにポリビニルアルコール（ 0. 5 g) , リン酸一水素ナトリウム · 12水塩（0. 5g) , リン酸二水素ナトリウム■ 2水塩（0. 2g) , ェデト酸ナトリウム（0. 02 g)，塩化ナトリウム（ 0. 7 g) , 塩化ベンザルコニゥム（ 0. 007 g) を溶解後、滅菌精製水で全量を 100 m 1とし、 0. 22 ίπιメンブランフィルターでろ過滅菌した（ρΗ6)。これに、予め滅菌しておいた Ε— 64d (1 ) を想濁させることにより懸濁状の点眼剤を調製した。

実施例 2

浦状態点眼剤

次の処方で溶解状の点眼剤を調製した。

E - 64 c 0. 1 g

ホウ酸 1. 7 S

ホウ砂 0. 4 S

ェデト酸ナトリウム 0. 02 S

塩化ベンザルコニゥム 0. 005 g

滅菌精製水適量

全量 100 ml

(操作方法）

滅菌精製水 80mlにホウ酸（1. 7 ) , ホウ砂（0. 4g) , ェデト酸ナトリウム（0. 02 g)，塩化ベンザルコニゥム（0. 005 g) , E-64 c (0. 1 g) を溶解後、滅菌精製水で全置 100mlとし、 0. 22 imのメンブランフィルターでろ過滅菌することにより溶解状の点眼剤を調製した（ p H 7 ) 実施例 3

眼軟耷剤次の処方で眼軟膏剤を調製した _t

E - 64 c 0. 5 g

流動パラフィン 1 S

白色ヮセリン

全量 1 00 g

(操作方法）

流動パラフィン、白色ヮセリンは予め加熱滅菌後使用した。 E— 64 c (0.5 g) を流動パラフィン（1 g) と十分研和後、適量の白色ヮセリンと十分に練り合わせて眼軟耷剤を調製した。

実施例 4

眼軟耷剤

次の処方で眼軟膏剤を調製した。

E - 64 d 0. 1

流動バラフイン 1 g

白色ワセリン適量

全量 1 00 g

(操作方法）

流動パラフィン、白色ワセリンは予め加熱滅菌後使用した。 E— 64 d (0.1 g) を流動パラフィン（ 1 g) と十分研和後、適量の白色ヮセリンと十分に練り合わせて眼軟耷剤を調製した。

実施例 5

溶解状態点眼剤

次の処方で溶解状の点眼剤を調製した。

E - 64 c 1 g

酢酸ナトリウム 0. 05 g

塩化ナトリウム 0. 9 g

パラォキシ安息香酸メチル 0. 026 g

パラォキシ安息香酸プロピル 0. 0 1 4 g 1 N -塩酸遍風

滅菌精製水適

全量 100 m 1

(操作方法）

滅菌精製水 80 mlを約 80でに加熱し、パラォキシ安息香酸メチル（ 0. 026 g) , パラォキシ安息香酸ブ πビル（0. 014 g) を溶解した。室温まで冷却後、酢酸ナトリウム（0. 05 g) , 塩化ナトリゥム（0. 9 g) , E— 64 c (1 g) を溶解し、 11^ー塩酸で 115に調整した。滅菌精製水で全量 100ml とし、 0. 22 mのメンブランフィルターでろ過滅菌することにより溶解状の点眼剤を調製した。

実施例 6

溶解状態点眼剤

次の処方で溶薛状の点眼剤を調製した。

E- 64 c 1 S

リン酸二水素ナトリウム 0. 1 s

グリセリン 2. 6 s

ェデト酸ナトリウム 0. 01 s

塩化ベンザルコニゥム 0. 005 g

1N— Ti酸化ナトリウム Mm.

滅菌精製水

全量 100 m 1

(操作方法）

滅菌精製水 80 mlにリン酸ニ水素ナトリウム（ 0. 1 g) , グリセリン（2.6 g)，ェデト酸ナトリウム（0. 01 g)，塩化ベンザルコニゥム（0. 005 g) . E— 64 c (1 g) を溶解後、 1 N—水酸化ナトリウムで p H 6に調整した。滅菌精製水で全量 100 mlとし、 0. 22tfmのメンプランフィルターでろ過滅菌することにより溶解伏の点眼剤を調製した。

実施例 7 懸濁状態点眼剤

次の処方で懸濁状の点眼剤を調製した,

E - 64 d 1 ε

ε—ァミノカブロン酸 0. 1 g

塩化ナトリウム 0. 9 g

ポリソルベート 80 0. 1

塩化ベンザルコニゥム 0. 005 g

1 Ν -塩酸適量

滅菌精製水適量

全量 1 00 ml

(操作方法）

滅菌精製水 80 mlに £ーァミノカブロン酸（0. 1 g) , 塩化ナトリウム（0.9 g) , ボリソルベート 80 (0. 1 g)、塩化ベンザルコニゥム（0. 005 g) を溶解し、 1 N—塩酸で pH5に調整した。滅菌精製水で全量 1 00 mlとし、 0. 22〃mのメンブランフィルターでろ過滅菌後、予め滅菌しておいた E— 6 4 d (1 ) を懸濁させることにより懸濁状の点眼剤を調製した。

実施例 8

懸濁状態点眼剤

次の処方で懸濁状の点眼剤を調製した。

E- 64 d 1 g

酢酸ナトリウム 0. 05 g

塩化ナトリウム 0. 9 g

バラォキシ安息香酸メチル 0. 026 g

パラォキシ安息香酸プロピル 0. 014 g

IN -塩酸適量

滅菌精製水適量

全量 1 00 ml

(操作方法）滅菌精製水 80 mlを約 8 O'Cに加熟し、パラォキシ安息香酸メチル（0. 026 g) , パラォキシ安息香酸プ口ピル（Ό . 014 g) を溶解した。室温まで冷却後、酢酸ナトリウム（0. 05 g) , 塩化ナトリウム（0. 9 g) を添加し、 1 N—塩酸で pH4に調整した。滅菌精製水で全量を 1 00mlとし、 0. 22μ mのメンブランフィルターでろ過滅菌後、予め滅菌しておいた E— 64 d (l g) を懸濁させることにより、懸濁状の点眼剤を調製した。

実施例 9

眼軟膏剤

次の処方で眼軟膏剤を調製した。

E - 64 d 0. 1 g

流動パラフィン 2 g

白色ワセリン適量

全量 100 g

(操作方法）

流動パラフィン、白色ヮセリンは予め加熱滅菌後使用した。 E— 64 d (0.1 g) を流動パラフィン（2g) と十分研和後、適量の白色ワセリンと十分に練り合わせて眼軟膏剤を調製した。

実施例 10

眼軟膏剤

次の処方で眼軟耷剤を調製した。

E- 64 c 0. 1

流動パラフィン 2 g

プラスチベース適量

全量 100 g

C操作方法）

流動パラフィン、ブラスチベースは予め加熱滅菌後使用した。 E— 64 c(0.1 g) を流動パラフィン（2g) と十分研和後、適量のプラスチンベースと十分に練り合わせて眼軟膏剤を調製した。〔試験例〕

以下に、本発明の白内障治療剤の有効性を示す薬理試験およびその結果を示す。試験例 1

E- 64 cの腹腔内投与および E— 64 dの点眼によるラットガラクトース白内障に対する効果

3週齢の雄性 SD系ラット 30匹を温度 24±4で、湿度 55± 1 5 %の飼育室内で飼育し、飼料はラボ MRストック〔日本農産工業（株）〕を与え、飲料水として水道水を与えた。

被験薬物として、 ① E - 64 c原末を 0. 1 N水酸化ナトリウムで溶解し、

0. 1 N塩酸で pH 5に調整した後、蒸留水で 1 %溶液とし、また、 ② E— 64 d 原末を 1 %になるように 0. 3½Twe en 80溶液中で懸濁した後、それぞれを塩化ナトリウムで浸透圧を 290 mOsin/kg H₂ 0に調整したものを用いた。また、 ③対照として、生理食塩液を用いた。

動物は 1週間予備飼育の後、飼料を 25%ガラクトース飼料（ガラクトースとラボ MRストック粉末を 1 ： 3に混合して固型化したもの）に換えて飼育した。

1日の耠餌時間は、最初の 7日間は 24時間とし、 8日目以降は 1日 9時間とした。薬物投与は、ガラクトース飼料耠餌開始日より、 ① E— 64 cは、 1 00m s/kg (液量として lm 1Z1 00 g) を 1日 1回腹腔内投与し、 ② E— 64 dは、 1回 5 / 1ずつ 1日 4回右眼のみに点眼し、左眼は無処置とした。 ③対照群は、 E - 64 d点眼群と同様の方法で右眼に生理食塩液を点眼し、左眼は無処置とした。

水晶体観察は、対照としての生理食塩液または各被験薬物投与開始後 7日毎に 28日後まで、散瞳下でスリットランプ（SL— 5D) を用いて行い、ジッペル

(S i pp e 1) の採点基準〔インヴエスティゲイティヴオフサルモロジ一（ I nve s t. Opht ha lmo l. ) , 6卷， 568 - 575頁（1 966) 〕に従って、成熟白内障まで以下のように 8段階のステージに分けて白内障の程度

(ステージ）を採点した。ステージ症状

0 正常

0. 5 赤道部周辺に空砲が出現する。

1 前襄皮質浅層部の赤道部から中心部にかけての約 1 Z3

まで空砲が出現する。

1. 5 前囊皮質浅層部の赤道部から中心部にかけての約 2 / 3

まで空砲が出現する。

2 空砲がさらに増加し、癒着する。

3 前襄下の混蘅が消失し、後囊、皮質浅層部に混濁が現れ

る。

4 皮質部は透明化し、核部が混濁する。

5 水晶体全体（皮質部、核部）が混蘅する。生理食塩液（対照）および各被験薬物（E— 64 cおよび E— 64 d) の各観察時点での各ステージの占める割合を、図 1(a), ) に示した。図 1(a), (b) において縱軸は、生理食塩液（対照）および各被験薬物（E— 64 cおよび E— 6 4 d) の各観察時点でのジッペル（S i p p e I ) の採点基準の各ステージの占める割合（％>を表している。

対照群との有意差； +： 0. 05 < P < 0. 10, *： P < 0. 01。図 1 Ca). (b) に示した結果から明らかなように、ウィルコキソン（Wi 1 c oxon) の 2標本検定を行うと、 E— 64 c投与群では投与開始後 14日後に有意な遅延が、 E— 64 d投与群では、投与開始後 7、 14日後に有意な遅延が、 21日後には遅延傾向が見られた。また、時系列分散分析を行うと、 E— 64 c投与群および E— 64 d投与群は、対照群に比べて白内障を有意に遅延していた。

試験例 2

ット水晶体におけるカルシウム 'ィオノフォア（ionophore) 誘発白内障に対する E— 64 dの効果

4週齢の雄性 S.D.系ラットの水晶体を摘出し、 ① 基本培養液（MEM) 、② 基本培養液に 1 0 Mカルシウム ·ィオノフォア（A 23 1 8 7) を加えた培養液、 ③ ②の培養液に 4、 20、 1 00および 500 Mの E— 64または E 一 64 dを加えた培養液で 1日間培養後、カルシウム■ィオノフォアのみを除いた同系統の培養液に交換し、さらに 4日間培養し、水晶体の混濁をイメージアナラィザ一 ( ima e an a l y s e r) で解析した。

対照群の水晶体の混濁に対する各被験薬物（E— 64および E— 64 d) の抑制率を、図 2に示した。図 2中、横軸は各被験薬物の培養液中の濃度（ M) を、縱軸は対照群での水晶体の混濁に対する各被験薬物の抑制率（％) を表している。図 2に示した結果から明らかなように、カルシウム ·ィオノフォア（ionophore) による水晶体の混濁を、 E— 64または E— 6 dはその濃度に依存して抑制した。し力、し、その効果は、 E— 64 dの方が E— 64よりも強く、たとえば 20 で水晶体の混 Sを 50¾以上抑制した。

試験例 3

E— 64 dの腹腔內投与による Nak a n oマウス白内障に対する効果

9日齢の Nakan oマウス 35匹を 3群に分け、各マウスに E— 64 dを 30 mg/kg および 1 0 Omg/kgならびに対照として 5 %アラビアゴム溶液（gum arabic solution ) を 1日 1回、腹腔内投与した。 E— 64 dは 5 %アラビアゴ厶溶液に 0. 1 5 および 0. 5%になるように懸濁させたものを用いた。マウスが開眼した後から、スリップランプで水晶体の混濁伏態を観察して白内障の進行度を測定した。

その結果、対照群では生後 2 1日に水晶体核部の混濁が認められ、その出現率は約 4 0%であった。これに対して、 E— 64 dを投与した群では 3 Onig/kg投与群で約 1 2 であり、 1 00mg/kg投与群ではいずれのマウスにも水晶体核部の混濁は認められなかった。また、その後においても、 E— 64 d投与群のマウス水晶体核部の混濁は、対照群と較べ、軽度に抑えられていた。

試験例 4 E— 64 cの角膜透過性の pHによる影譽 Cin vitro試験）

in vitro角膜透過試験を、家兎角膜を装着した side-by-side型透過セルを用いて行った。下記組成緩街液で調製した 1 %E— 64 c溶液をドナーセルに、下記緩衝液をリセブターセルに加え、 34^eCでィンキュベートした。経時的にリセブターセル側に透過した E— 64 c量を測定した。 1、 2、 3時間後の累積透過量を表 1に示す。 E—& 4 cは p H 7以下で角膜を透過し、その透過性は p H に依存した。しかし、 pH 3以下では角膜が白濁する組織障害が認められた。緩衝液組成

塩化カルシウム 0. 175 g

塩化カリウム 0. 4 g

硫酸マグネシウム 0. 4 g

リン酸ニ水素ナトリウム G. 1 87 g

塩化ナトリウム 7. 97 g

グルコース 1 g

精製水 1000 ml 表 1 : E— 64 cの in vitro角膜透過性透過性（ g/cm² )

1 h 2h 3h pH7 1. 69 6. 15 13. 78

pH5 63. 9 309. 6 61 1. 6

pH3 145. 6 790. 4 1479. 9 試験例 5

E—& 4 dの角膜透過性の pHによる影響 (In vitro試験）試験例 4と同様に操作して、 1 %E— 64 d懸濁液（pH7) の膜透過性を検討した。 E— 64 dはリセブター溶液中には検出されず、角膜中の酵素で加水分解されて生じた E— 64 cが試験開始直後から検出された。 20分、 1時間、 2時間および 3時間後にリセプターセルに検出された代謝物 E— 64 c量は、それぞれ 2. 8、 5. 8、 1 0. 3および 2 1. 4 g/cm² であった。

試験例 6

E— 64 dの pH安定性

各 pHに調整した 1 %E— 64 d懸濁液の安定性について検討した。安定性試験の結果を表 2に示す。その結果、 E— 64 dは pH4〜6付近で安定であつた _c 表 2 ： E - 64 dの pH安定性残存率（％)

4 O'C (4ii) 6 O'C ( 1週〉 pH4 9 6. 6 98

pH5 99. 8 98 7

pH6 95. 2 97 9

pH7 75. 7

Claims

請求の範囲

1. (+) — （2 ， 3 S,) - 3 〔（）一 3—メチルー 1— (3—メチルブチルカルバモイル）プチルカルバモイル〕一 2—ォキシランカルボン酸、その塩およびそのェチルエステルから選ばれる少なくとも一種の化合物を含有する白内障治療 ·予防剤。

2. 化合物が（+) ― (2 ， 3 S.) - 3 C CS) -3—メチルー 1- (3— メチルプチルカルバモイル) プチルカルバモイル〕一 2—ォキシランカルボン酸またはその塩である請求の範囲 1記載の白内障治療 ·予防剤。

3. 化合物が（+) — (2S. 3 S.) 一 3 〔 (S.) 一 3—メチルー 1一（3— メチルブチルカルバモイル）プチルカルバモイル〕一 2—才キシランカルボン酸のェチルエステルである請求の範囲 1記載の白内障治療 ·予防剤。

4. 点眼剤の形態である請求の範囲 1記載の白内障治療 ·予防剤。

5. 化合物を 0. 001〜1 OwZv%含有する点眼剤である請求の範囲 4記載の白內障治療■予防剤。

6. pH3〜7である請求の範囲 4または 5記載の白内障治療'予防剤。

7. 眼軟耷剤の形態である請求の範囲 1記載の白内障治療'予防剤。

8. 化合物を 0. 001〜10wZw¾含有する眼軟膏剤である請求の範囲 7 記載の白内障治療 ·予防剤。

9. (+) — （2 3 ) — 3 〔（）一 3—メチルー 1一（3—メチルブチルカルバモイル）プチルカルバモイル〕一 2—ォキシランカルボン酸、その塩およびそのェチルエステルから選ばれる少なくとも一種の化合物を白内障の治療に有効な量投与することによる白内障治療 ·予防方法。

1 0. 化合物を点眼剤の形態として投与する請求の範囲 9記載の白内障治療. 予防方法。

1 1. 点眼剤中の化合物量が 0. 001〜1 0wZv%である請求の範囲 1 0 記載の白内障治療 ·予防方法。

12. 点眼剤の pHが pH3〜7である請求の範囲 1 0記載の白內障治療 .予防方法。

1 &

1 3. 化合物を眼軟靑の形態として投与する請求の範囲 9記載の白内障の治療 · 予防方法。

14. 眼軟耷中の化合物 fiが 0. 001〜1 0wZw%である請求の範囲 1 3 記載の白内障治療 ·予防方法。

15. 白内障治療 '予防剤の製造のための（+) — (2S., 3S.) -3 〔 (S.) 一 3—メチルー 1一（3—メチルプチルカルバモイル）プチルカルバモイル〕一 2—ォキシランカルボン酸、その塩およびそのェチルエステルから選ばれる一種の化合物の使用。

1 6. 白内障治療 ·予防剤が点眼剤である請求の範囲 15記載の使用。

17. 点眼剤中の化合物量が 0. 001〜1 Ow/v%である請求の範囲 1 6 記載の使用。

1 8. 点眼剤の pHが pH3〜7である請求の範囲 16記載の使用。

1 9. 白内障の治療 ·予防剤が眼軟膏の形態である請求の範囲 15記載の使用。

20. 眼軟育中の化合物量が 0. 001〜1 0w/w9tiである請求の範囲 1 9 記載の使用。

21. (+) — (2S.. 3 S.) 一 3 ( (S.) 一 3—メチルー 1一（3—メチルブチルカルバモイル）プチルカルバモイル〕一 2—ォキシランカルボン酸、その塩およびそのェチルエステルから選ばれる少なくとも一種の化合物と基剤とを混合することを特徵とする白内障治療 ·予防剤の製造方法。

22. 白内障治療 ·予防剤が点眼剤である請求の範囲 21記載の白内障治療 · 予防剤の製造方法。

23. 化合物と水性媒体とを混合した後または混合する前に、最終製剤の pH が 3〜 7となるように水性媒体の p Hを謂整することを特徵とする点眼剤形態である請求の範囲 21記載の白内陣治療 ·予防剤の製造方法。

24. 化合物と水性媒体とを混合した後または混合する前に、最終製剤の pH が 4〜 6となるように水性媒体の p Hを調整することを特徵とする請求の範囲 2 2記載の点眼剤形態の白内障治療 ·予防剤の製造方法。

25. 任意の工程にて pH2〜 9の範囲に緩街能を持つ緩衝剤を加えた後に、 p Hを 4〜 6に謂整することを特锾とする請求の範囲 2 4記載の点剤形態の白内障治療 ·予剤の製造方法。

2 6 . さらに殺菌工程を含むことを特敏とする請求の範囲 2 3〜 2 5記載の点眼剤形態の白内障治療 ·予防剤の製造方法。

2 7. (+) - ( 2 S.. 3 ）一 3 〔（_§_) 一 3—メチルー 1一（3—メチルブチルカルバモイル）プチルカルバモイル〕一 2—ォキシランカルボン酸、その塩およびそのェチルエステルから選ばれる少なくとも一種の化合物と水性媒体とを混合した後または混合する前に、最終水性液の p Hが 3〜7となるように水性媒体の p Hを謂整することを特徵とする当該化合物含有水性液の製造方法。

2 8 . 化合物と水性媒体とを混合した後または混合する前に、最終水性液の p Hが 4〜 6となるように水性媒体の p Hを調整することを特徵とする請求の範囲 2 7記載の当該化合物含有水性液の製造方法。

2 9 . 任意の工程にて p H 2〜 9の範囲に緩街能を持つ锾街剤を加えた後に、 p Hを 4〜 6に調整することを特徴とする請求の範囲 2 8記載の水性液の製造方

3 0 . さらに滅菌工程を含むことを特徵とする請求の範囲 2 7〜2 9記载の水性液の製造方法。