WO1994000591A1

WO1994000591A1 - Monoclonal antibody, production process, antibody-producing cell, and diagnostic method

Info

Publication number: WO1994000591A1
Application number: PCT/JP1993/000854
Authority: WO
Inventors: Hisaaki Kawakatsu; Yumiko Takagaki; Junichi Yano
Original assignee: Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Priority date: 1992-06-26
Filing date: 1993-06-24
Publication date: 1994-01-06

Description

明細書

モノクローナル抗体、製法、抗体産生細胞、及び診断法技術分野

本発明は、 src ファミリ一遺伝子産物の C末端に存在しリン酸化酵素の活性を制御する機能を有する部位を特異的に認識するモノク口ーナル抗体に関する。

背景技術

src 遺伝子は、はじめラウス肉腫ウィルス（Rous sarcoma virus ) のがん遺伝子として知られた（v-src) 。高等生物の細胞内でこれに対応する発ガン遺伝子前駆体を c- src 遺伝子と言った。 src 遺伝子は、ヒト染色体座 20ql3.3に存在する。 src 遺伝子には src ファミリ一と称する類似体が存在する。例えば、 yes 遺伝子はヒト染色体座 18q21.3 に存在し、 fgr 遺伝子は 1P36.1に、 fyn 遺伝子は 6q21 に存在して、それぞれ発現の特徴を有する。

src フアミリーに属するチロシンリン酸化酵素（tyrosine kinase ) は、現在その存在が 10種類ほど知られており、その多くは C末端 (C-terminal domain) にリン酸化により酵素活性が低下するチロシン残基を有している。遺伝子工学の手法によりこのチロシンを他の了ミノ酸に置換した c-src は、発癌能を獲得することが判っている , src 遺伝子の研究は緒についたばかりで、最近知られたこのものの了ミノ酸配列の研究及び欠損症の研究から、医薬品への応用及び診断薬への応用の可能性が期待されている。

c-src の了ミノ酸配列はすでに知られている。近年の研究により、 SH2( src homologous domain 2)を持つ蛋白質が、この領域を用いてリン酸化チロシン（phosphotyrosine) と結合することが明らかになった。 SH2は、 src ファミリーはもちろん、フォスファチジルイノシトール一 3— リン酸化酵素（PI 3- kinase) 、フォスフォライペース C-r (PLC- r ) 、 GTPase 了タティべ一ティングプロテイン（GAP) 等の多様な蛋白質の配列の中に発見されており、 src ファミリ一の C末端領域との相互作用が情報伝達のク口ストーク（cross talk)を担う直接的な経路であることが示唆されている

このような機構においては、細胞外からのシグナルはリセプターを介して細胞膜の内側にぶら下がった状態で存在する src ファミリ一に伝えられ、その情報が上記 SH2を持つ蛋白質によってィノシトール（IP)、ジグリセライド（DG)、 GTPase 系の情報伝達へと伝播されて、多様な応答を引き起こす。

このため、 src ファミリ一以降の情報伝達の解析には特異的に認識するモノクローナル抗体が望ましい。組織、発生段階による (spatio-temporal) リン酸化、結合蛋白質の変化を追跡することができる力、らである。

別の研究によれば、 crkと呼ばれる発癌遺伝子はチロシンリン酸化酵素活性を持たずに SH2領域のみを持っている。 crkは、 SH2領域を用いてチ π シンリン酸化酵素活性を持つ src フアミリーの産物と結合することにより、細胞の癌化を引き起こすと考えられている (Mayer et al. Nature, 332, 272 - 275 (1988) )。

csk という src ファミリーの C末端のチロシン残基を特異的にリン酸化する酵素も発見されている（Noda et al. ature, 351, 69- 71(1991)) 。

src ファミリ一遺伝子産物のなかでは、 c- src が大腸癌、神経芽腫、網膜芽腫、小細胞肺癌、結腸癌、乳癌、撗紋筋肉腫で高いことが報告されている（S. Pahlman and U. Hammerl ing, Am. Rev.

Respir. Dis. , 142, s54-s56) 。特に大腸癌については、 J. B.

Bolen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , 84, 2251-2255 (1987), C. A. Cart right et al. , J. Clin. Invest. , 83, 2025-2033 (1989), C. A. Cartwright et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , 87, 558-562 ( 1990) などでも c-src が高いことが報告されている。しかし、技術上の制約から、いずれも前癌状態であるアデノーマにおいて src フアミリーの活性化を高率よく検出するまでには到っていない。また、 C- fgr がバ一キットリンパ腫や骨髄単球性白血病で、 c-yes が頭頸部癌ゃ腎癌で発現の高いことが明らかになつている。

主として免疫担当細胞で発現している c-fyn 、 c-lyn 、 c-lck 、 c-hck 、 c-blk 、等は、リンパ球特異的な情報伝達に深く関与していることが示唆されている。これらの中でも C- lck が T リンパ腫や —部の結腸癌で、 C- lyn が T細胞白血病でその発現が高いとされている o

癌以外の疾病では、トランスジヱニックマウスを用いた研究から. c-src の欠損が骨化石症（osteopetrosis) を引き起こすことが報告されている。（Sariano et al. Cell. 64, 693-702 (1991) ) _D また、 c-fyn については頭蓋骨の形態形成で重要な役割を果たしている可能性がある。発明の開示

src ファミリ一の活性化を検出できる特異的な抗体は作製されていない。特に病理診断の主流であるホルマリン固定、パラフィン包埋切片の染色が可能な抗体は全くない。

1983年に J. Brugge らが、 v - src を免疫して得たモノクローナル抗体 327がヒトの c - src にのみ交差することから、この抗体によつてヒトの c-src を同定している。

この抗体の結合部位は src の SH2領域とされているが、確かめられているわけではない（Lipsiuli cL ill. J. v ii ul. 8, 352-360 ( 1983))。

v- src を由来として c- src に交差する抗体 GD 11がパーソンズ（ Parsons)ら（ J. Virol. 5 , 272- (1984) )によって、またショウジ (Shoji) らによって MGS-1 が得られている（B. B. . C. 170, 657- 664(1990))。

他の src フアミリーの蛋白質については一部にモノクローナル抗体の報告例はあるが、 C末端領域に対するものは全くない。

ケンプリッジ社（CRB) が C- src の（4?1〜485)ぺプチドを用いたポリクローナル抗体を市販しているが、特異性、結合能力に劣り、これも SH2領域、 src ファミリーの C末端とは関係がない。

上記に鑑み、本発明者らは鋭意研究の結果、 src フアミリーの末端に存在し酵素のリン酸化を制御する機能を有する部位を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成した。

本発明の要旨は、 ① src ファミリーの末端に存在しリン酸化酵素活性を制御する機能を有する部位を特異的に認識するモノクローナル抗体そのもの、 ②そのモノク口—ナル抗体を得るための配列番号 1 のペプチド、 ③そのモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞、 ④そのモノクローナル抗体を病理診断法に用いるところにある。

本発明に係るモノクローナル抗体は、下のようにして取得することができる。

抗原の作製

まず抗原となる上記 C- src の C末端のぺプチドを化学的に合成する。

本発明においては、上記 c-src の C末端のペプチドのうち、例えば、後述する配列審号 1 のようなアミノ酸配列を有するペプチドを合成することができる。配列番号 1のようなペプチドは新規な化合物であり、このペプチドを抗原として用い、 c-src 遺伝子のモノクナル抗体を取得したのは本発^者らがはじめてである。

本発明においては、抗原性を高めるために、上記のようにして取得したペプチドを、適当なキヤリア（carrier) 、例えばキーホールリ厶ぺットへモシァニン (keyhole limpet hemocyanin) 等に結合させて免疫することができる。

ペプチドとキヤリアの結合反応には、適当な化学試薬、例えば、グルタール了ルデヒド、カルボジィミド、 M B S (N-(m- マレイミドペンゾィルォキシ）スクシンイミド）、 S M C C (スルホサクシ二ミジル 4- (N-マレイミドメチル）シクロへキサン- 1- カルボキシレート）等を用いることができる。

以下に、このようにして得られたものを抗原として用い、本発明に係るモノク π —ナル抗体を取得する方法について述べる。

免疫化細胞及び骨髄腫細胞の調製

まず免疫化細胞の調製について説明する。

これは動物の体内に抗原を投与し、その動物の細胞を取得することによって得ることができるものである。当該動物としては、例えば、マウス等のこれまで常法として実験に供されてきた動物を使用することができる。抗原は腹腔内等に投与することが望ましい。

投与は、常法によりフロインドのコンプリートアジュバンドに混合して投与するのが適当であるが、本発明においては投与後数週間の間隔で数回投与を換り返すことが好ましい。投与間隔は、 2週間で充分であるし、投与回数は 2〜 4回が好ましい。その後、当該動物を屠殺し、例えば、脾臓等の臓器を摘出し、常法に従って細胞を

次に免疫化細胞に増殖機能を付与するための骨髄腫細胞との細胞融合について述べる。

ここに用いる骨髄腫細胞は、例えば、 SP 2/0- Ag l 4株等を、例えば、 PCS (牛胎仔血清）を含む培地で培養し、望ましくは対数増殖期にある細胞を用いる。

細胞融合、抗体価の測定、及び抗体産生細胞の選別

細胞融合の方法は、免疫化細胞と骨髄腫細胞を細胞数の比で 1 : 1

〜 10 : 1の範囲で混合し、ポリエチレングリコール等の融合剤又は電気剌激等の方法を用いることができる。

融合後の細胞は、直ちに又は通常培地での前培養後、ヒポキサンチン、了ミノプテリン、チミジンを加えたいわゆる H A T培地で培養することにより、免疫化細胞と骨髄腫細胞の組み合わせで融合した細胞のみを選択することができる。

本発明においては、例えば、酵素免疫測定法（EL I SA法）等によつて抗体価を確認しつつ抗体産生細胞の選別を行うことができる。

抗体価を確認することができた細胞は、限外希釈法、軟寒天法等の常法に従って、ゥヱル（Wel l)プレート及びシャーレによる培養を繰り返し、このあいだに抗体産生能、産生抗体の免疫化学的試験、抗原特異性試験等を行うことによって選別することができる。また、マイクロマ二ュピュレーター又はセルソータ一を用いて選別することもできる。

抗体の取得

本発明に係る抗体産生細胞は、通常の状態において継続的に本発明に係るモノクローナル抗体を産生することができる。従って、本発明に係るモノクローナル抗体を利用するときは、本発明に係る細胞の培養液の上清液を直接そのまま本発明に係るモノクローナル抗体溶液として利用することができる。

また、本発明に係るモノクローナル抗体は、例えばマウス等の通常実験に供される動物体内（例えば腹腔内）に、抗体産生細胞を投与し、例えば腹水等の動物体液を採取することによっても生産することができる。

本発明に係る細胞の培養液又は腹水より本発明に係るモノク D — ナル抗体を精製取得するためには、例えば、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィ一等の方法によって取得することができる。こうして取得したモノクローナル抗体は、例えば各種の緩衝液、必要に応じて塩、更にはアジド等を添加することにより、又は凍結乾燥等の方法により安定した物質として保存することができる。ィミュノグロプリン各クラスの同定

これらの抗体のィミュノグ nプリン各クラスの同定は、クラス特異性抗体を用いた BLISA法により行うことができる。

このようにして得られたモノクローナル抗体は、以下の免疫生化学的手法により、各蛋白質に特異的に結合することを確認することができる。

本発明に係るモノクローナル抗体を用い、ゥエスタン · プロッティングの手法を適用する同定方法について説明する。

この手法は、生物由来検体中の当該ペプチドの同定及び定量に応用することができる。即ち、当該べプチ下又は当該ペプチドを含む生物由来の検体を、常法に従って、 SDS-ポリアクリルァミドゲル電気泳動で分画した後、ナイロンメンブラン又はニトロセルロースメンブランにプロッティングする。メンブラン上に移行したペプチドとモノクローナル抗体とを結合させ、ついで、 ³⁵S又は '²⁵1で標識したプロティン A (protein A) と結合させる。このとき、過剰のモノクローナル抗体とプロティン Aは、そのつど充分に洗浄により除去しておく。

これにより、用いたモノクローナル抗体の特異性に応じて当該べプチドの位置に、その量に応じた^{3 S}S又は ¹²⁵ Iが存在することになり、メンブラン上の³⁵ S又は ¹²⁵1を R Iスキャナー又はオートラジオグラフィ一で検出することでペプチドの同定と定量を行うことができる。

次に、 R I P (ラジオイミュノプレシピテイシヨン）の手法を適用することを特徴とする当該べプチドの同定方法について述べる。

R I Pにおいては、例えば、 ^{3 5} S又は^{3 2} Pォルッフォスフヱイト等で標識したメチォニン等を含む培養液中で、検体となる細胞を培養することによって検体となる細胞に取り込ませる。その後、可溶化のための緩衝液を加えた後、可溶化物（l ysate)を取得する。そして、本発明に係るモノクローナル抗体を加えて混合することにより抗原抗体反応を完結させる。

その後常法に従い、プロテイン A—セファロース等を加えた後、遠心分離と緩衝液による洗浄を繰り返して、本発明に係るぺプチド £1外の混在物を取り除く。その後、常法に従って電気泳動を行い、ラジオァイソトープの検出を行う。検体細胞に当該べプチドが存在すれば、用いたモノクローナル抗体の特異性に応じたバンドが現れることとなる。

次にィミュノサイトケミストリーの手法を適用することを特徴とする生物中の当該ペプチドの検出方法について説明する。

培養細胞の場合は、ホルムアルデヒド一リン酸緩衝液（P BS)溶液等の適切な固定液で固定し、必要に応じてトリトン処理を行い、試料とすることができる。これらの試料に、本発明に係るモノクロ一ナル抗体を加えて抗原抗体反応を完結させた後、リン酸緩衝液で充分に洗浄する。二次抗体としてピオチン結合ー抗ィミュノグロプリンを反応させた後、充分に洗浄する。ここに生じたペプチド一モノク ϋ ーナル抗体一ピオチン結合二次抗体の複合物に蛍光標識した了ビジンを反応させ、その蛍光を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞中のぺプチドを検出することができる。

病理組織の場合には、ホルマリンその他の適切な固定液で固定し切片としたもの、又は凍結は切片をホルムアルデヒド固定したもの等を、必要に応じて界面活性剤等の処理を行った標本を試料として同様の操作によりィミュノサイトケミストリーを行うことができる。病理診断法

本発明に係るモノクローナル抗体を用いることによって、ヒト又はその他の哺乳動物の src ファミリ一遺伝子産物を感度よく同定することができる。従って、本発明に係るモノクローナル抗体は、ヒト又はその他の哺乳動物の src フアミリ一遺伝子由来の疾患の病理診断に使用することができる。

src 遺伝子由来の疾患としては、例えば、大腸癌、肺癌、乳癌、神経芽腫、横紋筋肉腫、網膜芽腫などの癌、骨化石症等を挙げることができる。

本発明に係るモノクローナル抗体を用いた病理診断法としては、一般的なモノク D —ナル抗体を用いる病理診断法をそのまま応用することができ、具体的には、例えば、ウェスタン · ブロッテイング

(Western blotting) 法、イミュノプレシピテーシヨン（

Immunopreci.pitation)法、イミュノサイトケミストリー (

Immunocytochemistry)法等の手法を挙げることができる。これらの手法は、単独で又は組み合わせて用いることができる。

より具体的には、例えば生検又は手術により得られた大腸、肺等の組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋した切片を本発明に係るモノクローナル抗体と反応させ、常法により染色し、 c- src ファミリ一の活性化を検出することによって病理診断することができる。また、肺癌については、喀痰検査を行うことによって診断することができる。具体的には、被検者より痰を採取し、これをスミア塗布によりスライドガラス上に伸展し、その後、例えば - 20 :のァセトン又はメタノールに浸して固定し、本発明に係るモノクローナル抗体と反応させ、常法により染色し、 c-src ファミリ一の活性化を検出することによって診断することができる。形態観察とともに活性化 c - src の検出が認められると確定診断が容易となる。

発明を実施するための最良の形態

以下に、本発明に闋する実施例等を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例等は本発明の一例を示すものであって、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 1 c - src の C末端に対するモノクローナル抗体の作製 (1) 抗原の作製

19個の了ミノ酸からなる配列を有するぺプチドを、常法に従って化学合成した。このペプチドのァミノ酸配列は、配列番号 1 の通りである。

このべプチド 10mgを精製蒸留水 2 mlに溶解したものを、 5 mgZml の K L H溶液（カルビオケム社製）と混合し、カップリング剤として sulfo-SMCC (ピアス（Pierce)社製）を最終濃度 0.2M となるように力 Bえた。

ぺプチドとキヤリ了の conjugate は、デイスポーザブルのゲル濾過カラム（バイオラッド社製）を用いて精製した。このようにして 12mgのべプチド一 K LH結合体を得た。

(2) 免疫化細胞の調製

10週令の BALB/C雌性マウスの腹腔内に、（1)で得られた物質 100 M g を舍む溶液 0.1mlと、フロインドのコンプリートアジュバンド (DIFC0社製） D. lmlとの混合液を投与した。その後 2週間間隔で 2 回、上記溶液とィンコンプリートアジュバンド（DIPC0社製）との混合溶液を腹腔内に投与した。その後、そのマウスを頸椎脱臼により致死させ、無菌的に脾臓を探取した。

セレクタ一（BBLC0社製）に上記脾臓約 1 g を乗せ、ダルべッコ変法 MBM(D-MBM) 培地を供給しながら約 10 のメッシュを通過させて

D-MBMに懸濁状態の脾臓細胞を得た。これを 100G、 5分間の遠心分離にかけて、脾臓細胞を採取した。

0.84 %の塩化了ンモニゥム溶液に 20mMのへぺス（HBPES) 緩衝液（ PH 7.4) を加えた溶液 1 ml中に上記細胞を入れて溶血させた。 1,000 G 、 5分閒の遠心分雛にかけて細胞を取得した。再び D-MBM培地に懸濁させた。

(3) 骨髄腫細胞の調製

マウス骨髄腫細胞株 SP2/0株を、 20%のゥシ胎児血清（FCS) を含む D - MBM培地で、 10%C〇₂ · 37tインキュベータ一内で培養し、対数増殖期にある細胞を集め、次の操作に用いた。

1, 000G. 5分間の遠心分離にかけて細胞のみを取得し、更に D- EM 培地に懸濁して、血球計算盤で細胞数を力ゥントした。再び 1, 000G、 5分間の遠心分離にかけて後、 D- MBM培地に懸濁させた。

(4) 細胞の融合 (2)で得た免疫化細胞 1 0 ^β 〜 3 X 1 0⁸ 個を含む D-MBM培地と、

(3)で得た骨髄腫細胞 1 0 ^β 個を含む D-MBM培地とを混合し一様にした後、 1，000G、 5分間の遠心分離にかけた。上清を除き沈渣を取得し、これに 25% ( /v) のポリエチレングリコール 1500 (PBG 1500 。ベーリンガ一社製）とへぺス緩衝液 37.5m を含む溶液 1 ralを 1分間にわたって滴下した。その後、 D - MBM培地でゆつくり希釈して全体を lOralとした。

これに 20% PCSを含む D- MBM培地 10mlを加えて、 1, 000G、 5分間の遠心分離にかけた。得られた細胞に 20% PCSを含む D- MEMを加えて 1 0⁶ cell/mlになるようにし、コ一二ング社製の 24穴培養プレートに 1 ml/well の割合となるようにのせた。 10%C 0₂ ' 37tィンキュベータ一中で 24時間培養した。

その後、 HAT 溶液を添加して融合細胞以外の細¾を除き、更に 2 週間培養を続けた。

(5) Bい SA法による抗体価の測定

ファルコン社製 BLISA 用プレートの各 wellを、（1)で得たぺプチド 10 ug Zmlでコ一ティングした。測定対象となる抗体を含む上清液 100 1 を wellに採り、 371:インキュベータ一内で 2時間放置し- その後 PBS (リン酸緩衝液）で洗诤した。これにペルォキシダ一ゼ結合ヒッジ抗マウス全抗体を加え、 371：ィンキュベータ一で 1時間放置し、 PBS で洗浄後発色剤（ABTS)を加えて 15分間発色させ、停止液 ( 0.1Mクェン酸一 0.02 %ナトリウム了ジド）を加えて反応を停止させた後、タイターテック社製マルチスキャンで wellの吸光度を測定して、抗体価を算出した。 (6) 抗体産生細胞の選別

BLISA法で確認された well内の細胞を、 60mm のシャーレ内の軟寒天培地上に撒いた。 10%C 0₂ · 37tインキュベーター内で 2週間培養し、コロニーを形成させた。

できたコロニーを採り、 24穴培養プレートにのせた。再び BLISA 法によって抗体活性を確認した。抗体活性の確認された well内の細胞を、 6Omm0のシャーレ内の軟寒天培地上に撒いた。 10%C〇 ₂ · 37でィンキュベータ一内で 2週間培養し、コロニーを形成させた。できたコロニーを採り、 24穴培養プレートにのせた。再び BLISA法によって抗体活性を確認し、有用な細胞を選別した。

このようにして選別した抗体産生細胞（抗体蕃号 28) は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号（郵便番号 3 0 5 ) ) に国際寄託（受託番号： PBRM BP-4253. 寄託日： 1993年 3月 30日）した。

(7) 抗体の取得

① （6)で得た抗体産生細胞は、本発明抗体を常時産生するので、この抗体産生細胞を培養した培養液の上清液は、直接、本発明抗体溶液として使用することができた。

② （6)で得た抗体産生細胞の培養液に硫酸了ンモニゥムを最終濃度 30%となるように加えた。遠心分離し、沈渣をとり、これに pH 7.4 のリン酸緩衝液 20πιΜを加え、同じリン酸緩衝液（0.02 サナトリウムアジドを含む）を用いて透析して硫酸アンモニゥムを除いた。透析後の液体を凍結乾燥して、白色粉末を得た。

③ BALB/C雄性マウス腹腔内に、プリスタン 0.5tnlを注射し、 2週閱飼育した。（6)で得た抗体産生細胞を 1 0⁶ 〜 3 x 1 0 ⁶ cell/ マウスとなるように注射し、 10日間飼育した。腹腔内にたまった腹水約 10mlを注射筒を用いて採取した。

腹氷を Tris 50mM (pH 8.2) 食塩 150mM NaN₃ 0.02%を含む水溶液で 10倍程度に希釈した。この溶液をモノク D —ナル抗体のサブクラスが I gG のものは抗マウスイミュノグロブリン一了ガロース力ラム（了メリカンコ一レツクス社製）でサブクラスが IgG₂のものはブロティン A—セファロース CL-4Bカラム（フアルマシ了社製）で精製した。溶出は、 IgGJ^グリシン一塩酸 0.1M ( pH2.8)で、

I gG₃はイミュノビュ了一エリユージョンバッファ（ピアス社製）で行った。

(8) イミュノグ αブリン各クラスの同定

イミュノグロブリン各クラスの同定は、クラス特異性抗体（IgA, IgG,, IgG_2a IgG_2b, IgG₃, IgM は、バイオライド社製のものを用いた）を加え、 37で、 2時間反応させた後、 PBS で充分に洗浄した , これにペルォキシダーゼ結合ヒッジ抗マウス全抗体を加え、 371ィンキュベータ一で 1時閱放置し、 PBS で洗浄後、発色剤（ABTS)を加えて 15分閒発色させ、各クラスの判定を行った。この結果の一部を表 1 に示す。表 1

試験例 1 R I P (免疫沈降法）

本発明に係るモノクローナル抗体は、チ口シン残基にリン酸化を受ける部位であるため、蛋白質を細胞内で標識するのに³² Ρ—オルソフォスフヱイト又は³⁵ S—メチォニンを用いた。

細胞をコンフルーェント（confluent)な状態まで培養した後、リン酸又はメチォニンを舍まない培地で 2〜 3時間培養した（starvat ion) 。この後、再度培地を交換し³² P—オルソフォスフェイト（ NB 社製 NBX- 053 370MBq/ml)又は³⁵ S—メチォニン（Amersham社製、 SJ1015 370MBq/ral)を加えて、更に 2〜 4時間培養した。培養後、培地を取り除き、 PBS (-) で洗浄し、 RIPA緩衝液で可溶化した _c 得られた lysateの放射能を液体シンチレーシヨンカウンターで計測し、免疫沈降 1検体あたり、 3〜 5 xl05 cpm を使用する。この lysateに本発明の抗体を加え、 4 tで 2時閒ゆったり攪拌して、抗原抗体反応を完成させた。

protein A -了ガロース（ザィメッド社製）を RI PA緩衝液で 10%に懸濁させた溶液を 200 1 加えて、 4 :で 1時間反応させた。反応後、 15， 000 rptnで 1分間遠心分離し上清と分離した。沈澱した抗原 —抗体一 protein A ーセファロース複合体を洗浄するために RIPA緩衝液を 0.75ml 加え、よく擤拌した後、 15, OOOrpmで 1分間遠心分雜し、再度上清と分離した。この操作を 5回繰り返した。これに

SDS- PAGB電気泳動用のサンプル緩衝液 30/ 1 を加え、 lOOtで 2分聞加熱し、蛋白質を変性させた。電気泳動は 10%のポリ了クリル了ミドゲルで行った。泳動終了後、ゲル中の蛋白質を 5 %メタノール, 7.5%酢酸を含む溶液で固定した後、 ³⁵Sラベルの場合は増感剤（ NBN 社製、 ENLIGHTIUNG ) を用いて増感した。ゲルを乾燥させ、 X 線フィルム又はイメージングプレート（Fuji，BAS 2000 用）で感光させ、抗体が特異的に認識するバンドを検出した。

図 1 にこれらの抗体を用いて検出した蛋白質のバンドを示す。

用いた細胞は、レーン番号 1〜 3、 7〜 9が神経芽腫 NB- 1、 4 〜 6、 1 0〜 1 2が急性リンパ芽球性白血病細胞 SKW 3である。モノクローナル抗体は、 1、 4、 7、 1 0が抗体番号 28、 2、 5、 8. 1 1が抗体番号 29、そして 3、 6、 9、 1 2が抗体番号 40を用いた, 本発明のうち、抗体蕃号 28及び 29は、免疫沈降法での検出感度が特に良かった。

抗体番号 28は、 ³²Pラペルでは検出されないバンドが、 ³⁵Sラベルで現れており、リン酸化サイトであるチ αシン残基の近傍を認識していることが判った。

また、抗体番号 29は、 ³²Ρでも^{3 s} Sでも同様のパターンを示し、リン酸化サイト以外を認識する抗体であることが証明された。

その他、抗体番号 40は、上記 2抗体とは違ったバンドを検出したこれらにより、リン酸化の有無による情報伝達の差異を解析することができた。ゥエスタンブロッティング法による例

結果を図 2 ·に示す。抗体は抗体番号 29を用いた。 l ysateを作った細胞株は、レーン番号 1が急性リンパ芽球性白血球病細胞 ΜΰίΤ 3 、レーン番号 2が同じく S 3、レーン番号 3が単球性白血病細胞

J111 、レーン蕃号 4が同 U937 、レーン番号 5がグリア腫瘍

U251 、レーン番号 6が神経芽腫 SC-N - RT、レーン番号 7が同 NB - 1 である。

各細胞より感度よくバンドを検出することができた。

了フイエティカラムによる分雜の例

結果を図 3に示す。抗体は抗体蕃号 28、 29を用いた。レーン番号 1 はラット脳を可溶化した蛋白質全体を示す。レーン番号 2 は、 28 番の了フィニティカラム、レーン蕃号 3は、 29蕃のァフィニティカラムから 3M KSCNで溶出された蛋白質を示す。

診断例 1 大腸癌の病理診断 '

76人の被検者から生検又は手術により得た大腸の切片の各々をパラフィン包埋病理切片とし、これをキシレンに浸してパラフィンを除いた。その後これらを 0. l%NaN ₃ナトリゥム、 0. 3%過酸化水素メタノールで 30分間、次いで 5%の正常ャギ血清、 1%牛血清アルブミン (BSA) Z PBS (-）で 20分間ブロッキングし、 1500倍に希釈した本発明に係るモノクローナル抗体（抗体番号 28) と保湿器（mo i st chamber) 中において 4 でで一晩反応させた。その後、これらを PBS (-)で 3回洗浄し、 500倍に希釈したピオチン化抗マウスィ厶ノグロプリン抗体と室温で 1時間反応させ、発色した。発色は、ペルォキシダーゼ結合アビジン一ピオチン法（ABC comp l ex 法）に 3， 3' - ジァミノべンジジンテトラヒドロクロライド（0. 1%溶液、 0. 02¾ の過酸化水素水と 50mMのトリス塩酸緩衝液を含む）を組み合わせて行った。対比染色にはへマトキシリンを用いた。発色した部位の観察は、光学顕微鏡で行い、クリァ一な茶色の染色のみを腸性とした。その結果を表 2に示す。

表 2

(陽性者数 Z被検者数）表 2から明らかなように、アデノーマ（前癌状態）で髙ぃ src ファミリ一遺伝子産物の活性化（染色陽性）が観察され、癌化することで陽性例は減少した。進行癌においては、腸性例が少なく、モザィク様の染色は皆無であった。

従って、本発明に係るモノクローナル抗体は、特に前癌状態の病理診断に用いることができる。また、アデノーマの染色腸性例の多くは、モザィク様の染色であり、モザィク様の有無は、前癌状態の指標として用いることができる。

診断例 2 肺癌の病理診断

9人の被検者から生検又は手術により得た肺の切片の各々をパラフィン包埋病理切片とし、これをキシレンに浸してパラフィンを除いた。その後これらを 0. 1%NaN ₃ナトリウム、 0. 3%過酸化水素 Zメタノールで 30分間、次いで 5%の正常ャギ血清、 ^牛血清アルブミン

(BSA) / PBS (-)で 20分間ブロッキングし、 1500倍に希釈した本発明に係るモノクローナル抗体（抗体審号 28) と保湿器（mo i st chamber) 中において 4 で一晩反応させた。その後、これらを PBS (-）で 3回洗浄し、 500倍に希釈したビォチン化抗マウスィムノグロブリン抗体と室温で 1時間反応させ、発色した。発色は、ペルォキシダーゼ結合アビジンーピオチン法（ABC comp l ex 法）に 3, 3'一ジ了ミノべンジジンテトラヒドロクロライド（0. 1%溶液、 0. 02% の過酸化水素水と 50mMのトリス塩酸緩衝液を含む）を組み合わせて行った。対比染色にはへマトキシリンを用いた。発色した部位の観察は、光学顕微鏡で行い、神経繊維の染色強度と同等 £1上のものを腸性と判定し/ 0

その結果、 9人の被検者のうち、 5人が明らかな陽性（腺癌 3名、類上皮癌 1名、小細胞癌 1名）を示し、 3人が疑腸性（腺癌 1名、類上皮癌 2名）を示した。

従って、本発明に係るモノクローナル抗体は、肺癌の診断に充分に用い得ることが明らかである。一

配列

配列番号： 1

配列の長さ： 19

配列の型：アミノ酸

トポロジ一：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Leu Gin Aap Tyr Phe Thr Ser Thr Glu Pro Gin Tyr Gin Pro Gly 1 5 10 15

Glu Asn Leu Cys

図面の簡単な説明

図 1 は、免疫沈降法による検出バンドを示す。横軸は、レーン番号を表し、レーン蕃号 1 〜 6 は³² Pによるラペルを、レーン審号 7 - 1 2 は³⁵ Sによるラベルを、それぞれ表す。縦軸は、電気泳動方向を表し、上部は分子量が大を、下部は分子量が小を、それぞれ表す。レーン番号 1 ₃は、分子量マ—カー（^c) の位置を表す。図 2 は、ゥュスタンプロッテイング法での使用例を示す。攢軸は. レーン番号を表し、縦軸は、電気泳動方向を表す。レーン番号 8は分子量マーカー（¹⁴C ) の位置を表す。

図 3は、ァフィ二ティカラムによる分離の例を示す。横軸は、レーン番号を表し、縦軸は、電気咏動方向を表す。レーン番号 4 は分子量マーカー（ '⁴C) の位置を表す。

Claims

請求の範囲

1 . src ファミリー遺伝子産物の C末端に存在しリン酸化酵素の活性を制御する機能を有する部位を特異的に認識するモノクローナル抗体。

2 . src ファミリ一遺伝子産物が c - src 、 c-yes 、 c-f yn ヽ及び c-fgr からなる群より選ばれた一つである請求項 1記載のモノク □ ーナル抗体。

3 . src フアミリ一遺伝子産物が c-src である請求項 1記載のモノク。ーナル抗体。

4 . 工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目 1蕃 3号（郵便審号 3 0 5 ) ) に受託番号 FBRM BP-4253で 1993年 3月 30日に国際寄託した抗体産生細胞が産生するモノクローナル抗体。

5 . 配列番号 1 のアミノ酸配列を有するペプチド。

6 . 請求項 5記載のペプチドを抗原とすることを特徴とする請求項 1乃至 3記載のモノクローナル抗体の製法。

7. 請求項 1乃至 3記載のモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞。

8 . 工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号（郵便番号 3 0 5 ) ) に受託番号 PBRM BP- 4253で 1993年 3月 30日に国際寄託した抗体産生細胞。

9. 請求項 1乃至 4記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする癌又は前癌状態の病理診断法。

10. 癌が大腸癌である請求項 9記載の病理診断法。

11. 癌が肺癌である請求項 9記載の病理診断法。

12. 請求項 2乃至 4記載のモノクローナル抗体を用いることを特徵とする骨化石症の病理診断法。