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WO1994009039A1 - Neues, die gerinnungszeit des blutes verlängerndes protein aus dem landblutegel haemadipsa sylvestris - Google Patents

Neues, die gerinnungszeit des blutes verlängerndes protein aus dem landblutegel haemadipsa sylvestris Download PDF

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Publication number
WO1994009039A1
WO1994009039A1 PCT/EP1993/002793 EP9302793W WO9409039A1 WO 1994009039 A1 WO1994009039 A1 WO 1994009039A1 EP 9302793 W EP9302793 W EP 9302793W WO 9409039 A1 WO9409039 A1 WO 9409039A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
factor
leu
amino acid
new protein
Prior art date
Application number
PCT/EP1993/002793
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Karl-Hermann Strube
Thomas Meyer
Siegfried Bialojan
Burkhard Kroeger
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of WO1994009039A1 publication Critical patent/WO1994009039A1/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the new protein (PT factor) has the following physicochemical properties.
  • the protein shows two bands, which are assigned a molecular mass of 8200 ⁇ 2000 Da and 18600 ⁇ 2000 Da (FIG. 2).
  • Example 8a In the APTT test (Example 8a) and in the PT test (Example 8b), the protein in each case shows significant increases in the plasma coagulation time. Furthermore, it shows a specific factor Xa inhibition in a factor Xa inhibition test (example 8d). In an analog factor VII-He test (FIG. 3b) an inhibitory effect is also found; however, this can also occur indirectly through the inhibition of factor Xa.
  • the proteins determined the following N-terminal amino acid sequence:
  • the new proteins can be obtained from the country's blood leeches
  • the proteins can be further purified from the solution obtained in this way by chromatographic methods, preferably ion exchange chromatography and / or reversed phase HPLC.
  • the purification of the proteins can be followed using the activity tests described in Example 8.
  • a cDNA library is created from the leech in a manner known per se.
  • the gene coding for the protein according to the invention can be isolated from this gene bank by, for example, producing a DNA sample whose sequence is obtained from the N-terminal amino acid sequence described above by back-translation according to the genetic code. The corresponding gene can be found and isolated by hybridization with this DNA sample.
  • a primer the sequence of which was obtained by back-translation from the N-terminal amino acid sequence described above
  • a second primer the sequence of which is complementary to the 3 'end of the cDNA gene fragment, preferably with the sequence poly (dT)
  • the corresponding gene can also be isolated by creating an expression gene bank of leeches and screening them with an antibody which is directed against the protein according to the invention.
  • the corresponding gene After the corresponding gene has been isolated, it can be genetically engineered in organisms, e.g. in bacteria, yeasts or higher eukaryotic cells can be expressed in a manner known per se with the aid of an expression vector.
  • the protein can be isolated from these recombinant host systems on the basis of the physicochemical properties described above.
  • the protein according to the invention is preferably used in the form of its pharmaceutically acceptable salts.
  • the new protein has anticoagulant properties. It can be used, for example, for the prophylaxis of thromboses or arterial reocclusions, for the treatment of thromboses, for the preservation of blood or for extracorporeal circulation.
  • the new protein is an effective anticoagulant. It can be used alone or together with known coagulation factors, for example thrombin inhibitors such as hirudin, as a medicament.
  • 150 g of live landing gel (Haemadipsa sylvestris) were homogenized in 400 ml of 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) with a mixer at 4 ° C. for 10 minutes. The homogenate was centrifuged for 15 minutes at 2000 rpm (Sorvall RC-5B, rotor GS-3) and then after removing the precipitate for 30 minutes at 8000 rpm. The precipitate was discarded and the supernatant was diluted to a volume of about 600 ml with 50 mM tris (hydroxymethyl) amino methane / HCl buffer pH 8.5 (Tris / HCl buffer).
  • the protein solution had a volume of 580 ml, the protein concentration was 4.49 mg / ml and the thrombin-inhibiting activity was 22.2 U / ml.
  • the coagulation time (APTT, see Example 8) of the blood was prolonged by about 200 sec in a 1:10 dilution and the partial thromboplastin time (PT) was prolonged by about 60 sec in a 1:10 dilution.
  • the new protein can be purified from homogenates of leech heads.
  • the leeches were first decapitated and the head preparations obtained in this way were homogenized in an analogous manner.
  • Purification from leech heads has the advantage that the homogenate contains a smaller amount of protein with approximately the same amount of activity.
  • the new protein is already here in a higher purity.
  • a significantly reduced proteolytic activity was determined in the head homogenate.
  • the disadvantage of isolation from leech heads is the limited amount of substance.
  • the protein solution obtained from the Egelhomogenaten was (50-100 ml, 2.5 cm diameter) on a 8.5 equilibrated with 50 mM Tris / HCl buffer pH Q-Sepharose ® column applied. After washing away unbound material with the equilibration buffer, the bound proteins were washed with a
  • the new protein elutes from the column at a salt concentration of 300 to 500 mM NaCl.
  • the value fraction of the Q-Sepharose chromatography was concentrated using a 3000 D membrane (Filtron Omega Alpha Cat. No. AM003062) and buffered to 20 mM succinic acid buffer pH 4.0 or simply with the succinic acid buffer pH 4.0 diluted and the pH adjusted if necessary. This fraction was applied to an S-Sepharose FF column (diameter 1.5-2.5 cm, volume 10-30 ml) equilibrated with 20 mM succinic acid at a flow of 40-80 ml / h. After washing away unbound material with equilibration buffer, the bound proteins were eluted from the column using a linear gradient from 0 to 1 M NaCl in 20 mM succinic acid pH 4.0. The elution was monitored at 280 nm in the UV and
  • the value fraction of S-Sepharose chromatography was dissolved in the smallest possible volume of 0.1% by weight trifluoroacetic acid and on a reversed phase (r) HPLC column (BioRad rp304) after 5 minutes of rinsing with 0.1% by weight.
  • Trifluoroacetic acid using a linear gradient (0.1 wt .-% TFA in water / 0.1 wt .-% TFA in acetonitrile in 65 min to 0.1 wt .-% TFA in 50% acetonitrile) .
  • the one from the HPLC column Eluting proteins were detected by UV detection at 210 nm and fractionated by hand.
  • the PT-prolonging activity contained in the individual fractions was determined after removing the solvent and resuspending in water.
  • the PT factor eluted between 20 and 28% acetonitrile from the column under these conditions.
  • Electrophoresis was carried out as described by Schgger and Jagow (Analytical Biochemistry, 166, 368-379 (1987)). An aliquot (20 ⁇ g) was separated on a 16% Tris / Tricine gel (BAI GmbH, Bensheim). Fig. 3 shows the result after staining the gel with Coomassie Brillant Blau (A) or Silber (B). The new protein (A: lane 2; B: lane 2) shows two bands with molecular masses of 8200 ⁇ 1000 and 18600 ⁇ 2000 Da.
  • the new factor was tested in various assay systems to determine how and which factors in the coagulation cascade are inhibited by it.
  • APTT activated partial thromboplastin time
  • the samples were diluted as described above, with the modification that the corresponding chromogenic substrate (25 ⁇ l) was pipetted in.
  • the new protein very effectively inhibits both factor Xa and the formation of factor VIIa.
  • Thrombin (Boehringer / Mannheim) became a final concentration of (25 mU / ml) in phosphate buffered saline (PBS) (0.8 g / 1 NaCl; 0.2 g / 1 HCl; 0.144 g / 1 sodium phosphate; 0 , 2 g / 1 potassium phosphate, pH 7.5).
  • PBS phosphate buffered saline
  • Chromozym TH (Boehringer / Mannheim) was dissolved in 20 ml H 2 0 / bottle.
  • chromozyme 50 ⁇ l of chromozyme as well as 25 ⁇ l of sample or buffer were added to the wells of a microtiter plate. Immediately afterwards, the absorption at 405 nm was measured at time 0 and after 30 min at 37 ° C. If the sample had a strong intrinsic color, a further control without thrombin was treated as above.
  • FIG. 2 Tris / Tricine - SDS polyacrylamide gel electrophoresis
  • the molar mass of the value fraction of the (r) HPLC separation was determined on a 16% Tris / Tricine gel.
  • Lanes 1.3 Molar mass calibration substance, intact myoglobin 17.2 kDa, cyanogen bromide peptide myoglobin I + III 14.6 kDa, cyanogen bromide cyanide 8.2 kDa, cyanogen bromide cyanide 6.4 kDa, cyanogen bromide cyanide 2.6 kDa,
  • FIG. 3 Measurement of the influence of PT factor on extrinsic coagulation.

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Abstract

Es wird ein neues gerinnungshemmendes Protein aus Landblutegeln der Gattung Haemadipsa mit der N-terminalen Aminosäuresequenz: A-Val-Lys-Phe-Cys-Gly-His-Pro-Leu-Ser-Leu-Pro-Thr-Ala-Leu-Cys-Ala, worin A eine nicht eindeutig zu bestimmende Aminosäure darstellt, beschrieben. Das Protein eignet sich zur Bekämpfung von Krankheiten.

Description

Neues, die Gerinnungszeit des Blutes verlängerndes Protein aus dem Landblutegel Haemadipsa sylvestris
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, die Gerinnungszeit des Blutes verlängerndes Protein aus dem Landblutegel Haemadipsa sylvestris sowie Verfahren zu dessen Herstellung.
Gerinnungshemmstoffe sind wichtige therapeutische Substanzen, die beispielsweise zur Prophylaxe oder Behandlung von Thrombosen oder arteriellen Reokklusionen verwendet werden. Die Hemmung der Gerinnung kann über verschiedene Mechanismen erfolgen. So gibt es Stoffe, die Thrombin hemmen, beispielsweise Hirudin, oder Stoffe, die den Faktor Xa hemmen, beispielsweise TAP (Waxman et al., Science 248, 593 - 596, 1990) oder Antistasin (Tuszynski et al., J. Biol. Chem., 262, 9718 - 9*723, 1989).
Es wurde nun ein neues gerinnungshemmendes Protein aus dem Land¬ blutegel Haemadipsa sylvestris isoliert.
Das neue Protein (PT-Faktor) besitzt folgende physikochemisehen Eigenschaften.
Im Tris/Tricine-SDS Polyacrylamidgel zeigt das Protein zwei Banden, denen eine Molekularmasse von 8200 ± 2000 Da und 18600 ± 2000 Da zugeordnet wird (FIG. 2).
Das Protein zeigt im APTT-Test (Beispiel 8a) und im PT-Test (Beispiel 8b) jeweils signifikante Verlängerungen der Plasma¬ gerinnungszeit. Weiterhin zeigt es in einem Faktor Xa-Inhibi¬ tionstest (Beispiel 8d) eine spezifische Faktor Xa-Hemmung. In einem analogen Faktor VII-He test (FIG. 3b) wird ebenfalls eine Hemmwirkung festgestellt; allerdings kann diese auch indirekt über die Hemmung von Faktor Xa Zustandekommen.
Folgende N-terminale Aminosäuresequenz wurde von den Proteinen bestimmt:
A-Val-Lys-Phe-Cys-Gly-His-Pro-Leu-Ser-Leu-Pro-Thr-Ala-Leu-Cys- Ala, worin A eine nicht eindeutig zu bestimmende Aminosäure darstellt.
Die neuen Proteine lassen sich aus Landblutegeln der Gattung
Haemadipsa isolieren. Hierzu werden die Egel zweckmäßigerweise in einem Puffer bei pH 6 bis 9, vorzugsweise pH 7 bis 8 aufgenommen und mit einem Homogenisator, vorzugsweise einem Mixer, homogeni¬ siert. Anschließend werden die unlöslichen Bestandteile abge¬ trennt, bevorzugt abzentrifugiert.
Aus der so erhaltenen Lösung können die Proteine weiter durch chromatographische Methoden, bevorzugt Ionenaustauschchromato- graphie und/oder reversed phase HPLC, gereinigt werden.
Die Reinigung der Proteine kann über die in Beispiel 8 beschrie- benen Aktivitätstests verfolgt werden.
Besonders geeignet zur Herstellung der erfindungsgemäßen Proteine sind gentechnische Verfahren.
Hierzu wird in an sich bekannter Weise eine cDNA-Genbank aus dem Egel angelegt. Aus dieser Genbank kann das für das erfindungs¬ gemäße Protein codierende Gen isoliert werden, indem man bei¬ spielsweise eine DNA-Probe herstellt, deren Sequenz von der oben beschriebenen N-terminalen Aminosäuresequenz durch Rücküber- setzung gemäß dem genetischen Code erhalten wird. Durch Hybridi¬ sierung mit dieser DNA-Probe läßt sich das entsprechende Gen auf¬ finden und isolieren.
Für die Herstellung des entsprechenden Gens kann aber auch die Polymerase-Chain-Reaction (PCR)-Technik eingesetzt werden.
Beispielsweise läßt sich mit Hilfe eines Primers, dessen Sequenz durch Rückübersetzung aus der oben beschriebenen N-terminalen Aminosäuresequenz erhalten wurde, und eines zweiten Primers, dessen Sequenz komplementär zum 3'-Ende des cDNA-Genfragments ist, bevorzugt mit der Sequenz Poly(dT), das cDNA-Genfragment für das erfindungsgemäße Protein durch PCR-Technik herstellen. Das entsprechende Gen läßt sich auch isolieren, indem man eine Expressionsgenbank von Egeln anlegt und diese mit einem Anti¬ körper, der gegen das erfindungsgemäße Protein gerichtet ist, absucht.
Weitere geeignete DNA-Sequenzen sind solche, die zwar eine andere Nukleotidsequenz besitzen, die aber infolge der Degeneration des genetischen Codes für die erfindungsgemäße Polypeptidkette oder Teile davon codieren. Weiterhin sind solche DNA-Sequenzen geeig¬ net, die für gerinnungshemmende Proteine codieren, und die unter Standardbedingungen mit den obengenannten Nukleotidsequenzen hybridisieren. Die experimentellen Bedingungen für DNA-Hybridi¬ sierung sind in Lehrbüchern der Gentechnik, beispielsweise in J. Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben. Unter Standardbedingungen sind beispielsweise Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 1 x SSC (1 x SSC: 0,15M NaCl, 15 mM Natriumeitrat pH 7,2) zu verstehen.
Nachdem das entsprechende Gen isoliert worden ist, kann es durch gentechnische Verfahren in Organismen, z.B. in Bakterien, Hefen oder höheren eukaryontisehen Zellen, mit Hilfe eines Expressions¬ vektors in an sich bekannter Weise exprimiert werden.
Aus diesen rekombinanten Wirtssystemen läßt sich das Protein aufgrund der oben beschriebenen physikochemisehen Eigenschaften isolieren.
Die generelle Vorgehensweise zur gentechnischen Herstellung eines neuen Proteins bei bekannter Aminosäurepartialsequenz ist in Lehrbüchern der Gentechnologie, beispielsweise E.L. Winnacker, Gene und Klone, Verlag Chemie, Weinheim, 1984, beschrieben. Die experimentellen Bedingungen für die einzelnen Verfahren, wie beispielsweise Anlegen einer Genbank, Hybridisierung, Expression eines Gens, sind bei J. Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben.
Das erfindungsgemäße Protein wird bevorzugt in Form seiner pharmazeutisch annehmbaren Salze verwendet.
Das neue Protein besitzt blutgerinnungshemmende Eigenschaften. Es kann beispielsweise zur Prophylaxe von Thrombosen oder arteriel¬ len Reokklusionen, zur Behandlung von Thrombosen, zur Konser- vierung von Blut oder bei der extrakorporalen Zirkulation verwen¬ det werden.
Das neue Protein ist ein wirksamer Gerinnungshemmer. Es kann allein oder auch zusammen mit bekannten gerinnungshe menden Faktoren, beispielsweise Thrombininhibitoren wie Hirudin, als Arzneimittel verwendet werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter ver¬ anschaulicht. Beispiel 1
Reinigung des PT-Faktors aus Landegeln
Gewinnung von Egelhomogenaten
150 g lebende Landegel (Haemadipsa sylvestris) wurden in 400 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) mit einem Mixer bei 4°C 10 Minuten homogenisiert. Das Homogenat wurde 15 Minuten bei 2000 U/min (Sorvall RC-5B, Rotor GS-3) und dann, nach Entfernen des Niederschlags 30 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen und der Überstand mit 50 mM Tris (hydroxymethyl)-amino-methan/HCL-Puffer pH 8,5 (Tris/HCl- Puffer) auf ein Volumen von etwa 600 ml verdünnt.
Die Proteinlösung hatte ein Volumen von 580 ml, die Protein¬ konzentration betrug 4,49 mg/ml und die thrombininhibierende Aktivität betrug 22,2 U/ml.
Die Gerinnungszeit (APTT, siehe Beispiel 8) des Blutes wurde in einer 1:10 Verdünnung um ca. 200 sec verlängert und die partielle Thromboplastinzeit (PT) wurde in einer Verdünnung von 1:10 um ca. 60 sec verlängert.
Alternativ kann das neue Protein aus Homogenaten von Egelköpfen aufgereinigt werden. Die Egel wurden dazu zunächst dekapitiert und die so gewonnenen Kopfpräparate in analoger Weise homo¬ genisiert. Die Aufreinigung aus Egelköpfen hat den Vorteil, daß das Homogenat bei etwa gleicher Aktivitätsmenge eine geringere Proteinmenge enthält. Das neue Protein ist also hier bereits in einer höheren Reinheit vorhanden. Weiterhin wurde im Kopf- homogenat eine deutlich verringerte proteolytische Aktivität bestimmt. Nachteil der Isolierung aus Egelköpfen ist die limitierte Substanzmenge.
Beispiel 2
Auftrennung von Landegel-Homogenaten durch Ionenaustausch- Chromatographie
Die aus den Egelhomogenaten erhaltene Proteinlösung wurde auf eine mit 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,5 äquilibrierte Q-Sepharose®-Säule (50-100 ml, 2,5 cm Durchmesser) appliziert. Nach dem Wegwaschen nicht gebundenen Materials mit dem Äquili- brierungspuffer wurden die gebundenen Proteine mit einem
Gradienten von 0 - 1 M NaCl in 20 mM Tris/HCl pH 8,5 eluiert. Es wurden Fraktionen von ca. 7 ml aufgefangen und auf Proteingehalt, thrombininhibitorische Aktivität, APTT- und PT-verlängernde Aktivität untersucht. Fraktionen, in denen keine oder geringe Antithrombin-Aktivität, dafür aber hohe APTT- und PT-verlängernde Aktivität gemessen wurde, wurden vereinigt (Abb. 1) .
Das neue Protein eluiert bei einer Salzkonzentration von 300 bis 500 mM NaCl von der Säule.
Beispiel 3
Reinigung des PT-Faktors durch Ionenaustauschchromatographie an S-Sepharose FF
Die Wertfraktion der Q-Sepharose-Chromatographie wurde mit Hilfe einer 3000 D Membran (Filtron Omega Alpha Cat. No. AM003062) kon¬ zentriert und auf 20 mM Bernsteinsäure-Puffer pH 4,0 umgepuffert oder aber einfach mit dem Bernsteinsäurepuffer pH 4,0 verdünnt und der pH-Wert, falls erforderlich, nachgestellt. Diese Fraktion wurde auf eine, mit 20 mM Bernsteinsäure äquilibrierte S-Sepharose FF-Säule (Durchmesser 1,5-2,5 cm, Volumen 10-30 ml) mit einem Fluß von 40-80 ml/h aufgetragen. Nach dem Wegwaschen nicht gebundenen Materials mit Äquilibrierungspuffer wurden die gebundenen Proteine mit Hilfe eines linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in 20 mM Bernsteinsäure pH 4,0 von der Säule eluiert. Die Elution wurde bei 280 nm im UV verfolgt und
Fraktionen von 3-7 ml Volumen aufgefangen. Die erhaltenen Frak¬ tionen wurden auf PT-verlängernde Aktivität untersucht und die entsprechend aktiven Fraktionen wurden vereinigt. Der neue Faktor eluierte unter diesen Bedingungen zwischen 400 und 700 mM NaCl von der Säule. Zur Vorbereitung der weiteren Reinigung des PT-Faktors wurde die Wertfraktion zunächst über eine 3000 D Membran (Filtron Omega Alpha Cat. No. AM003062) konzentriert und schließlich in einem Vakuum-Konzentrator bis zur Trockne ein¬ geengt.
Beispiel 4
Reinigung der PT-verlängernden Aktivität durch reversed phase (r)HPLC '
Die Wertfraktion der S-Sepharose-Chromatographie wurde in dem kleinstmöglichen Volumen 0,1 gew.-%iger Trifluoressigsäure ge¬ löst und auf einer reversed phase (r)HPLC Säule (BioRad rp304) nach 5minütigem Spülen mit 0,1 gew.-%iger Trifluoressigsäure mit Hilfe eines linearen Gradienten (0,1 gew.-%ige TFA in Wasser/ 0,1 gew.-%ige TFA in Acetonitril in 65 min auf 0,1 gew.-%ige TFA in 50 % Acetonitril) aufgetrennt. Die von der HPLC-Säule eluierenden Proteine wurden durch UV-Detektion bei 210 nm erfaßt und mit der Hand fraktioniert. Die in den einzelnen Fraktionen enthaltene PT-verlängernde Aktivität wurde nach Entfernen des Lösungsmittels und Resuspendierung in Wasser bestimmt. Der PT-Faktor eluierte unter diesen Bedingungen zwischen 20 und 28 % Acetonitril von der Säule.
Beispiel 5
Aminoterminale Sequenz des PT-Faktors
Die aminoterminale Sequenz des PT-Faktors wurde mit Hilfe eines Peptidsequenators (Applied Biosystems, Modell 477A) bestimmt. In den Eluaten der rp304-(r)HPLC-Säule wurde die folgende Amino- säure-Sequenz 1 bestimmt:
NH2-XVKFVGHPLSLPTALXA ... , wobei X eine nicht eindeutig zu bestimmende Aminosäure darstellt. Nach Reduktion und Umsetzung mit Vinylpyridin (Huang et al., Biochemistry 1989, Vol. 28, 661 - 666) konnte von dieser Fraktion die Sequenz 2 bestimmt werden:
NH2-XVKFCGHPLSLPTALCA ... , wobei X eine nicht eindeutig zu identi¬ fizierende Aminosäure, möglicherweise ein Asparaginsäurerest, darstellt. Das in Position 5 der Sequenz 1 identifizierte Valin ist dabei, ebenso wie die in Position 16 der Sequenz 1 nicht näher zu bestimmende Aminosäure, eindeutig als pyridylethyliertes Cystein identifiziert worden.
Beispiel 6
Peptide-Mapping des isolierten PT-verlängernden Proteins
Zur Bestimmung weiterer Aminosäureteilsequenzen wurden die PT-verlängernden Fraktionen aus Beispiel 4 einer Reduktion und Pyridyl-Ethylierung (Huang et al., Biochemistry, 1989, Vol. 28, 661 - 666) unterworfen. Der Reaktionsansatz wurde anschließend an einer C-18 (r)HPLC-Säule (Nucleosil; Macherey und Nagel) rechromatographiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde der reduzierte und vinylpyridylierte PT-Faktor einer Spaltung durch die Protease Trypsin (Boehringer Sequence Grade) unterworfen. Das Protein/Protease-Verhältnis betrug dabei 20 - 40 zu 1.
Die Protease-Inkubation wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die erhaltenen Peptid- fragmente wurden durch (r)HPLC an einer C-18-Säule aufgetrennt. Dazu wurde, nachdem die Säule 5 min mit 0,1 gew.-%iger TFA in Wasser gespült worden war, ein linearer Gradient von 0,1 gew.-%iger TFA in Wasser in 120 min auf 60 % 0,1 gew.-%iger TFA in Acetonitril bei einem Fluß von 0,3 ml/min verwendet. Die bei 210 nm detektierten Peptide wurden getrennt aufgefangen und nach Abdampfen des Lösungsmittels im Gasphasensequenzer (Applied Biosystems Modell 477A) analysiert.
In der Tabelle sind die nachgewiesenen Sequenzen der einzelnen Fraktionen aufgeführt:
Figure imgf000009_0001
Beispiel 7
Bestimmung der Molekularmasse durch Tris/Tricine-SDS-Polyacryl- amid Gel Elektrophorese
Die Elektrophorese wurde, wie von Schägger und Jagow (Analytical Biochemistry, 166, 368 - 379 (1987)) beschrieben, durchgeführt. Ein Aliquot (20 μg) wurde auf einem 16 %igen Tris/Tricine Gel (BAI GmbH, Bensheim) aufgetrennt. Abb. 3 zeigt das Ergebnis nach Färben des Gels mit Coomassie Brillant Blau (A) bzw. Silber (B) . Das neue Protein (A: Spur 2; B: Spur 2) zeigt zwei Banden mit Molekularmassen von 8200 ± 1000 und 18600 ± 2000 Da.
Beispiel 8
Angriffspunkt des neuen Proteins in der Gerinnungskaskade
Der neue Faktor wurde in verschiedenen Assaysystemen getestet, um festzustellen, wie und welche Faktoren in der Koagulationskaskade durch ihn inhibiert werden.
a) APTT (= aktivierte partielle Thromboplastinzeit) zum Nachweis einer antikoagulatorisehen Aktivität in der intrinsischen Gerinnungskaskade.
Zu testende Proben wurden in 50 μl humanem Plasma (z.B. Preciclot®, Boehringer/Ma, Nr. 654 370) verdünnt. Dazu wurden 50 μl PTTa-Reagenz (Boehringer/Mannheim, Nr. 886 050) pipettiert und 5 min bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 50 μl 25 mM CaCl2 wurde die Gerinnungskaskade gestartet. Gemessen wurde die Zeit bis zum Auftreten von Plasma¬ gerinnseln. b) PT (= Prothro binzeit, Quick-Test) zum Nachweis einer anti- koagulatorisehen Wirkung auf die extrinsische Gerinnungs¬ kaskade.
Proben wurden in 100 μl humanem Plasma (z.B. Preciclot®, Boehringer/Mannheim, Nr. 654 370) verdünnt. Dazu wurden 100 μl Thromboplastin (1:1 mit NaCl 0,9 % verdünnt) pipet- tiert. Mit 50 μl 25 M CaCl wurde die Gerinnungskaskade ge¬ startet. Gemessen wurde die Zeit bis zum Auftreten von Plas- magerinnseln. Die Proben zeigten eine signifikante Verlänge¬ rung der Plasmagerinnungszeit (extrinsisch) .
Alternativ kann die Bildung einzelner Faktoren der extrinsischen Gerinnung, z.B. Faktor VIII oder Faktor X, durch Messung des Umsatzes chromogener Substrate erfolgen.
Dazu wurden die Proben wie oben beschrieben, verdünnt mit der Abwandlung, daß das entsprechende chromogene Substrat (25 μl) zupipettiert wurde.
Anschließend wurde zu verschiedenen Zeitpunkten die Extink¬ tion bei 405 nm bestimmt. Aus der Differenz zweier Experi¬ mente mit und ohne Inhibitor kann das Ausmaß der Hemmung be¬ stimmt sowie der Angriffspunkt des Inhibitors in der Gerin¬ nungskaskade identifiziert werden. Als chromogene Substrate wurden S 2222 (für Faktor Xa) und CH3S02-D-CHA-But-Arg- pNA-AcOH (Pentapharm, Schweiz) (für Faktor Vlla) eingesetzt.
Wie aus FIG. 3 ersichtlich ist, hemmt das neue Protein sehr effektiv sowohl den Faktor Xa als auch die Bildung von Faktor Vlla.
c) Bestimmung der Hemmung von Thrombin
Thrombin (Boehringer/Mannheim) wurde zu einer Endkonzentra- tion von (25 mU/ml) in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) (0,8 g/1 NaCl; 0,2 g/1 HCl; 0,144 g/1 Natriumphosphat; 0,2 g/1 Kaliumphosphat, pH 7,5) gelöst.
Chromozym TH (Boehringer/Mannheim) wurde in 20 ml H20/Flasche gelöst.
50 μl Chromozym sowie 25 μl Probe oder Puffer wurden in die Näpfe einer Mikrotiterplatte gegeben. Sofort danach wurde zur Zeit 0 und nach 30 min bei 37°C die Absorption bei 405 nm ge- messen. Bei starker Eigenfarbe der Probe wurde eine weitere Kontrolle ohne Thrombin wie oben behandelt.
Durch die Aktivität des Thrombins wird aus dem chromogenen Substrat ein bei 405 nm absorbierender Farbstoff freigesetzt. Die Hemmung des Thrombins durch einen Thrombinhibitor ist an einer geringeren Absorptionszunahme bei 405 nm erkennbar und wurde mit Hilfe einer Eichkurve quantifiziert.
FXa-Inhibitionstest
Proben (verdünnt in PBS) wurden mit Faktor Xa (FXa) und einem spezifischen chromogenen Substrat für FXa 60 min bei Raum¬ temperatur inkubiert:
25 μl Probe
50 μl FXa (Boehringer/Mannheim, Nr. 602 388, 0,025 U/ml) 100 μl S-2222-Farbsubstrat (Kabi-Vitrum, 16,9 ml H20/vial) Nach 5 min wurde die optische Dichte bei 405 nm erstmals gemessen. Nach 60 min wurde die Reaktion mit 50 μl Eisessig gestoppt und die optische Dichte bei 405 nm erneut gemessen.
Als Kontrollen dienen Ansätze ohne FXa sowie Proben ohne Inhibitor. Für die Auswertung wurde ein Δ OD4o5, o- nach folgender Formel errechnet:
Δ OD = [OD60min-OD5min]+FXa " [OD6omin-OD5min]-FXa
(Differenz der Extinktionsänderung mit und ohne FXa) _
Aus entsprechenden Ansätzen mit und ohne Inhibitor ergibt sich der Grad der Inhibition von FXa (in %) durch
Δ OD+Inhibitor % Inhibition = x 100
Δ OD-mhibitor
Legende zu den Figuren
FIG. 1 Chromatographie von Egelhomogenaten auf einer Q-Sepha- rose-Säule. Nach dem Auftrag wurde nicht gebundenes Material durch Spülen mit dem Aqulibrierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) entfernt. Das gebundene Protein wurde durch Anlegen eines Salzgradienten von 0 - 1 M NaCl eluiert. Einzelne Fraktionen wurden auf Thro bin- inhibiton, Verlängerung von APTT und PT, untersucht. Fraktionen, bei denen APTT und PT verlängert waren, die jedoch keine oder nur geringe Thrombininhibition zeigten, wurden vereinigt.
FIG. 2 Tris/Tricine - SDS Polyacrylamid Gel Elektrophorese
Die Molmasse der Wertfraktion der (r)HPLC-Trennung wurde auf einem 16 %igen Tris/Tricine Gel bestimmt. (A) : Fär¬ bung mit Coomassie-Brillant Blau; (B) : Silberfärbung.
Spuren 1,3: Molmasseneichsubstanz, intaktes Myoglobin 17,2 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin I + III 14,6 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin I 8,2 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin II 6,4 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin 2,6 kDa,
Myoglobin 1-14
Spuren 2,4: gereinigter PT-Faktor (20 μg) nach (r)HPLC-Trennung
FIG. 3: Messung des Einflusses von PT-Faktor auf die extrinsische Gerinnung.
a) Messung des S 2222-Umsatzes (Faktor Xa)
b) Messung des CH3S0 -D-CHA-But-Arg-pNA-AcOH-Umsatzes (Faktor Vlla)

Claims

Patentansprüche
1. "Protein aus Landblutegeln der Gattung Haemadipsa mit der N-terminalen Aminosäuresequenz:
A-Val-Lys-Phe-Cys-Gly-His-Pro-Leu-Ser-Leu-Pro-Thr-Ala-Leu- Cys-Ala, worin A eine nicht eindeutig zu bestimmende Amino¬ säure darstellt.
2. DNA-Sequenz codierend für ein Protein gemäß Anspruch 1.
3. DNA-Sequenz, die für ein gerinnungshemmendes Protein codiert und unter Standardbedingungen mit der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 hybridisiert.
4. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung von Krankheiten.
5. Arzneimittel enthaltend ein Protein gemäß Anspruch 1 und eine weitere gerinnungsinhibierende Substanz.
Zeichn.
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