[go: up one dir, main page]

WO1994016067A1 - Recepteurs serotoninergiques (5ht6 et 5ht7) et leurs utilisations - Google Patents

Recepteurs serotoninergiques (5ht6 et 5ht7) et leurs utilisations Download PDF

Info

Publication number
WO1994016067A1
WO1994016067A1 PCT/FR1993/001282 FR9301282W WO9416067A1 WO 1994016067 A1 WO1994016067 A1 WO 1994016067A1 FR 9301282 W FR9301282 W FR 9301282W WO 9416067 A1 WO9416067 A1 WO 9416067A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
receptor
sequence
polypeptides
polypeptide
receptors
Prior art date
Application number
PCT/FR1993/001282
Other languages
English (en)
Inventor
Martial Auguste Simon Ruat
Jorge-Luis Diaz
Regorius Leurs
Joël TARDIVEL-LACOMBE
Elisabeth Marie Traiffort
Jean-Charles Schwartz
Jean-Michel Arrang
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Publication of WO1994016067A1 publication Critical patent/WO1994016067A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to polypeptides having serotonergic receptor activity.
  • nucleotide sequences and in particular DNA, coding for these polypeptides as well as to vectors containing said sequences and to cells transformed to express said sequences and in particular the genes coding for receptors containing, or constituted by, said polypeptides, these cells making it possible to study the activity of agonist or antagonist of said receptors.
  • the invention also relates to nucleotide probes capable of binding by hybridization to said sequences or said genes coding for said polypeptides and intended for the diagnosis of conditions resulting in a qualitative or quantitative modification of the formation or of the activity of said receptors, in humans or animals, and in particular of affections neurological, psychiatric, qastroenterological or neuroendocrine.
  • the invention also relates to monoclonal or polyclonal antibodies, human or not, directed against said polypeptides.
  • It also relates to means for screening for drug candidates, making it possible in particular to study the affinity of candidate substances for said polypeptides.
  • medicaments in particular for the treatment of psychiatric, neurological, qastroenterological or neuroendocrine affections, and containing substances having a high affinity for said polypeptides with serotonergic receptor activity or substances having activity on cells. transfected by said DNA sequences coding for said polypeptides.
  • It also relates to drugs active on one, some, or all of the serotonergic receptors already identified and / or those described in the present invention and in particular to drugs agonists or antagonists of serotonin.
  • 5HT1a 5HT1b, 5HT1c, 5HT1d, 5HT1e, 5HT2, 5HT3 and 5HT4 receptors.
  • the receptor sequences 5HT1a, 5HT1b, 5HT1c, 5HT1d, 5HT1e, 5HT2 and 5HT3 are known (Zifa and Fillion, Pharmacol. Reviews, 44, 401-457, 1992; McAllister et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 5517-5521, 1992).
  • these receptors belong to the family of receptors comprising seven transmembrane domains coupled to a G protein and having a certain degree of homology with receptors of the rhodopsin family which are expressed by photoreceptors of the retina.
  • the 5HT1a, 5HT1b, 5HT1d, 5HT1 receptors are negatively coupled to adenylate cyclase while the 5HT1c and 5HT2 receptors are positively coupled to phospholipase C leading to the hydrolysis of phosphatidyl inositols.
  • the 5HT4 receptor the protein sequence of which is not yet known, would be positively coupled to adenylate cyclase.
  • the invention of the above new polypeptides has made it possible to discover new serotonergic receptors which will be designated, below, by 5HT6 and 5HT7.
  • the subject of the invention is new polypeptides having a serotonergic receptor activity (5HT6 or 5HT7) chosen from the group of polypeptides formed by the sets 1 and 2 defined below:
  • analoque polypeptides or fragments corresponding to other species including the human species, and relating to the serotonergic receptor homologous to the 5HT6 receptor.
  • analoque polypeptides or fragments corresponding to other species including the human species, and relating to the serotonergic receptor homologous to the 5HT7 receptor.
  • 5HT6 and 5HT7 define not only the rat receptors but the homologous serotonergic receptors, human or non-human.
  • the polypeptides of set 1 contain the sites forming part of said sequence of 448 amino acids, the presence of which is necessary, when the polypeptides are presented on a cell membrane in the presence of tritiated serotonin and in the presence of an agonist or a serotonin antagonist, so that the apparent affinity of said antagonists or agonists corresponds to that shown in Table 1 below.
  • polypeptides according to the invention can be used by being isolated, or fixed on supports, in a completely conventional manner. or also joined to amino acid sequences unrelated to the 5HT6 or 5HT7 receptors. They can be glycosylated or not and include disulfide bridges.
  • the present invention also relates to compositions having a significant content of such polypeptides, for example contents obtained by expression in a recombinant host, said polypeptides possibly being present in the form of cell membranes enriched in polypeptides.
  • the present invention also relates to the nucleic acids containing or consisting of the nucleotide sequences coding for any of the polypeptides according to the invention.
  • the nucleic acids according to the invention may comprise or consist of the complete sequence, that is to say the gene, coding for the 5HT6 or 5HT7 receptors in humans or in animals.
  • Nucleic acids according to the invention are in particular nucleic acids comprising or consisting of the sequences SEQ ID No. 1 or No. 2 or fragments of these sequences placed in the reading frame, as well as the homologous sequences, in particular in humans .
  • a particularly interesting nucleic acid is that consisting by the sequence extending from the nucleotide at position 135 to that at position 1 478 in the identifier SEQ ID no 1 or by its counterparts in humans or in animals.
  • the nucleic acids also include the fragments coding for the shorter polypeptides defined above.
  • the acids nucleic acids according to the invention may include the variations specific to the degeneration of the code as well as localized mutations insofar as the variant nucleic acids hybridize with the probes capable of hybridizing, in a specific manner, with the sequences ID No. 1 or ID # 2.
  • nucleic acids according to the invention can be obtained by conventional chemical synthesis of nucleic acid, by replication in vectors which contain them or by any other means. and in particular multiplication by the so-called PCR method from a small amount of nucleic acid according to the invention.
  • the invention also relates to recombinant vectors, which can be used for cloning or for the expression of nucleic acids, and containing a nucleic acid according to the invention, such as plasmids. phages or viruses containing one or more sequences according to the invention at a site which is not essential for replication.
  • the vectors according to the invention may contain. if necessary, the elements necessary for expression in a cellular host such as promoter, initiation codon. finished. signal sequence of the anchor sequence or any other useful control element.
  • a subject of the invention is also the cellular hosts transformed by a recombinant vector according to the invention and capable of expressing the coding sequence according to the invention for the synthesis of a polypeptide according to the invention.
  • These hosts may be prokaryotes, such as for example E. coli, or eukaryotes, for example yeast cells such as S. cerevisiae or mammalian cells, for example CHO cells.
  • the subject of the invention is also the monoclonal or polyclonal antibodies directed against a polypeptide according to the invention.
  • These monoclonal or polyclonal antibodies are obtained by induction from a polypeptide according to the invention and are specific for polypeptides according to the invention, while being capable, or not, of recognizing other serotonin receptors.
  • Obtaining these antibodies can be carried out in a conventional manner, either by injection of a polypeptide according to the invention into an organism and collection of the serum with optionally purification of the specific antibodies, or for the monoclonal antibodies, by the conventional techniques of cell fusion forming hybridomas.
  • the antibodies according to the invention are useful for diagnosis, by antibody-antigen reaction demonstrated using a standard revelation technique, for diagnosing pathological proliferation of cells expressing the 5HT6 or 5HT7 receptor.
  • the subject of the invention is also the nucleotide probes hybridizing with one of the nucleic acids according to the invention or with their complementary sequences or Corresponding RNAs, being specific for the 5HT6 receptor or for the 5HT7 receptor, and which do not hybridize with the nucleic sequences or the corresponding RNAs of the other serotonin receptors described above.
  • the probes comprise at least 10, and preferably at least 15 to 17 nucleic acids.
  • the probes according to the invention are useful for the diagnosis of neurological, psychiatric, gastroenterological or neuroendocrine disorders linked to qualitative or quantitative abnormalities of the 5HT6 or 5HT7 receptors, including for the search for genetic anomalies at this level. .
  • the probes are used in a conventional manner by being brought into contact, under the usual conditions, with preparations presenting nucleic acids of cells suspected of exhibiting an abnormality defined above.
  • the probes can be used to detect an expression if one or the other of the 5HT6 or 5HT7 receptors by revealing the presence of its messenger RNA.
  • the gene can be inserted under the control of a usual promoter, for example promoter of the lactose operon or of the tryptophan operon.
  • the invention also relates to a method of screening of drugs intended for the treatment of neurological conditions, in particular Parkinson's disease, Alzheimer's disease, sleep disorders, migraine, and psychiatric such as mood disorders, depressions, psychotic states, or neuroendocrine, and in particular dysfunctions of the hypothalamic-pituitary axis, or qastroenterological, in particular functional disorders of the intestine, motor or secretory disorders.
  • neurological conditions in particular Parkinson's disease, Alzheimer's disease, sleep disorders, migraine, and psychiatric such as mood disorders, depressions, psychotic states, or neuroendocrine, and in particular dysfunctions of the hypothalamic-pituitary axis, or qastroenterological, in particular functional disorders of the intestine, motor or secretory disorders.
  • the screening of a medicament can in particular use the detection of the capacity of a serotonergergic molecule to behave as a ligand with respect to a polypeptide according to the invention, and consists, for example, in bringing into contact, in a suitable medium, the molecule serotonergergic with the membranes of a cellular host transformed by a vector comprising an insert coding poulle polypeptide and capable of expressing said polypeptide so as to present on the membrane surface one or more specific sites of this polypeptide, in such a way that the specific binding of the candidate ligand can be evaluated or indirectly estimated, for example by detecting the possible ligand-polypeptide complex.
  • This method can also include the measurement of a response induced by the binding with the cell, such as for example the production of cyclic AMP so as to make it possible to differentiate the serotonergic molecules which behave as antagonists and those which behave as aqonists , and even to define the relative character of the latter.
  • a method can also be used to determine the affinity of a polypeptide. of the invention for specific ligands, in which a cell host transformed in accordance with the invention is cultivated to express and present in its membrane the 5HT6 or 5HT7 receptor or a corresponding polypeptide, after which the cell culture is brought into contact with the determined ligand and it is checked whether a specific bond is formed between the cellular hosts and the ligands, in particular by radiolocation tests and preferably, measuring the rate of production or release of a suitable indicator such as AMP cyclic, or intracellular ions, these latter tests make it possible to distinguish and define the agonists and their partial character as well as the antagonists.
  • a suitable indicator such as AMP cyclic, or intracellular ions
  • polypeptide fragments according to the invention for example those comprising a part of the sequence of 448 amino acids SEQ ID No 1, and which include the operational sites allowing the binding and / or the induction of cellular responses. mentioned above.
  • the invention also relates to medicaments containing, in a dose intended to be administered, a therapeutically effective amount of an active substance on a polypeptide according to the invention having a 5HT6 or 5HT7 receptor activity in a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention also relates to medicaments, containing, in a pharmaceutically acceptable vehicle, an effective amount of a substance active on the other serotonergic receptors but not active on at least one of the 5HT6 and 5HT7 receptors.
  • sequence identifier SEQ ID No. 1 represents the sequence of a DNA fragment of 1661 bases, of which 448 codons, identified on the sequence, code for a polypeptide of 448 amino acids constituting a receptor of the serotonin designated by 5HT6.
  • the sequence No. 2 represents a DNA fragment, of which 127 codons code for a polypeptide of 127 amino acids constituting a fraoment of the 5HT7 receptor for serotonin.
  • nucleic sequences in other mammals and in humans can be obtained by hybridization from a library or from a cDNA library with a probe consisting of all or part of the sequences represented, then sequencing of a quite classic way of the fragments thus recognized.
  • a rat brain cDNA library was screened under low streak conditions with a DNA probe labeled with 32 P and corresponding to the nucleotide sequence coding for the rat substance P receptor. In these conditions, a clone ( ⁇ SP45) hybridizes strongly with this probe.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment (1124 bp) thus isolated shows that this cDNA comprises a sequence coding for a peptide of 127 amino acids coding for the terminal MB6, MB7 and NH 2 regions of a protein and having homologies with the family of rhodopsin homologous receptors.
  • a DNA fragment of this clone (nucieotide 8 to nucieotide 539) is then labeled with 32 P, then used to screen a cDNA library of rat hypotha lamus (Strat aqene) under stri ngence conditions. l evée. Twelve clones are then isolated and analyzed by restriction analysis by Southern techniques and the clones having the longest inserts are selected. One of them, called ⁇ HPT3, comprises the nucleotide sequence 404 to 1 661 of the sequence of FIG. 1.
  • a DNA probe labeled with 32 P, located between nucleotides 404 and 607 is used to screen a rat genomic band , partially cut with the HaelII enzyme.
  • nucleotide sequence going from nucieotide 1 to nucieotide 682 of FIG. 1 is thus isolated and sequenced.
  • Nucleotide primers (primer 1: 5'-GGAGATCTCCATTGTGCAGTCTCAGCCAATGA-3 ', located downstream of the stop codon TGA of FIG.
  • primer 2 5'-AAA AGC TTG GCG GGG TCG CCG GCT CCAT-3', located upstream of the first methionine
  • PCR-Mate .391A DNA synthesizer Applied Biosystems
  • They are then used in the RT-PCR technique as follows.
  • a DNA band of expected size 1.5 kb is extracted after electrophoresis on agarose qel and digested with HindIII and Bgl II, then subcloned in a plasmid pGEM 4Z.
  • the sequencing of several plasmids shows that the sequence obtained is identical to the sequence delimited by primers 1 and 2 of the indicator SEQ ID No. 1.
  • the expression vectors are derived from the plasmid pSV D2 (Giros, B. et al., Nature 342. 923-926, 1989).
  • the vector for expressing the 5HT6 receptor is obtained by replacing the HindIII-BglII restriction fragment of pSVD2 with a HindIII-BglII restriction fragment of the RT-PCR clone obtained above, leading to the plasmid PSV 5HT6.
  • These constructs are cultivated, then purified on a cesium chloride gradient (Sambrook J. et al., Molecular cloning - a laboratory manual. C. Nolan, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and transfected (Graham, FL and al., Virol.
  • CHO-K1 Chinese hamster ovary cells deficient in dihydrofolate reductase.
  • the stable transfectants are selected in a culture medium (Dubelcco's Modified Eagle medium) without hypoxanthine and thymidine free.
  • the expression of the 5HT6 receptor is demonstrated by the binding of serotonin- 3 H to membranes of transfected cells; according to the technique of Peroutka and Snyder (Peroutka SJ and Snyder SL; Mol. Pharmacol., 16, 687-699, 1979).
  • serotonin- 3 H has a concentration of 1 to 2 nM.
  • 5HT6 receptors have been expressed in CHO cells which normally do not have binding sites for 3 H serotonin.
  • the K D values of serotonin are 1 nM for the 5HT6 receptor and the Bmax values (Bmax representing the maximum concentration of 5HT6 receptor) are approximately 1 pmol / mg of membrane protein.
  • Table 1 clearly indicates that the gene transfected into CHO cells codes for a serotonergic receptor as indicated by the high affinity of serotonin and its derivatives such as 5-methoxytryptamine.
  • this 5HT6 receptor can in no case be confused with that of a 5HT 1A receptor (8-OH-DPAT has an affinity less than the nanomolar for this receptor), 5HT2 (spiperone and ketanserin have affinities of the order of nM) or 5HT4 (ICS 205 930 has an affinity of 0.5 nM on the 5HT3 receptor and 300 nM on the 5HT4 receptor) or another class of receptors which have been cloned to date.
  • RNAs are prepared from several brain or peripheral tissues of rats or guinea pigs (Chirgwin et al. Biochemistry 18. 5294-5299, 1979; Aviv et al., Proc. Nat l. Acad. Sci ., 69, 1408-1412, 1972). Samples (8 ⁇ g) are denatured, subjected to agarose electrophoresis, transferred to nitiocellulose membranes and hybrids (Traiffort et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 2619-2 653, 1992) using a fragment of
  • 1,106 bp obtained by DNA amplification using oligonucleotide primers, then labeled with 32 P by the "nick-translation" technique.
  • This dotted fragment corresponds to the transmembrane domains 1 to 7 and is used at the rate of 14 ⁇ 10 6 dpm / ml.
  • the membranes are exposed for 7 days at - 80oC with amplifier screens.
  • two transcripts (3.9 and 3.2 kb) can be observed in the brain tissues studied.
  • the hypothalamus, trunk and hippocampus are the regions which seem to express the lowest densities of transcripts of the 5HT6 receptor.
  • two transcripts (3.8 and 3.0 kb) are also observable in most of the brain regions studied.
  • the thalamus and the trunk seem to be the regions which express the highest densities of transcripts of the 5HT6 receptor.
  • GAG AAA GTT GTG ATC GGC TCC ATC CTG ACG CTC ATC ACG CTG CTG ACG ATC GCA GGC AAC TGC CTG GTG GTG ATC TCG GTG TGC TTC 467

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique, médicaments à base de ces polypeptides, fragments nucléotidiques codant pour eux, sondes de détection de ces fragments, vecteurs et hôtes exprimant ces polypeptides, et application au criblage de médicaments. Nouveaux polypeptides ayant une activité de nouveaux récepteurs sérotoninergiques 5HT6 ou 5HT7 et fragments d'acides aminés codant pour ces polypeptides. Des hôtes cellulaires transformés par des vecteurs dans lesquels ont été insérés ces fragments expriment ces polypeptides. Applications de ces polypeptides et fragments à la formation d'anticorps, à la réalisation de médicaments, de sondes nucléotidiques de diagnostic et de détection, au criblage de médicaments destinés, notamment, au traitement d'affections neurologiques ou gastro-entérologiques et à l'identification de tissus ou cellules.

Description

RECEPTEURS SEROTONINERGIQUES (5HT6 ET 5HT7) ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention a trait à des polypeptide ayant une activité de récepteur sérotoninergiqué.
Elle a éqalement trait à des séquences de nucléotides, et notamment d'ADN, codant pour ces polypeptides ainsi qu'à des vecteurs contenant lesdites séquences et à des cellules transformées pour exprimer lesdites séquences et notamment les gènes codant pour les récepteurs contenant, ou constitués par, lesdits polypeptides, ces cellules permettant d'étudier l ' act i v i t é d'agoniste ou antagoniste desdits récepteurs.
L'invention a également trait à des sondes nucléotidiques susceptibles de se fixer par hybridation sur lesdites séquences ou lesdits gènes codant pour lesdits polypeptides et destinées au diagnostic d'affections se traduisant par une modification qualitative ou quantitative de la formation ou de l'activité desdits récepteurs, chez l'homme ou l'animal, et notamment d'affections neurologiques, psychiatriques, qastro-entéroloqiques ou neuro-endocriniennes.
L'invention a eqalement trait à des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, humains ou non, dirigés contre lesdits polypeptides.
Elle a également trait à des moyens de criblage de candidats médicaments, permettant notamment d'étudier l'affinité de substances candidates pour lesdits polypeptides.
Enfin elle a trait à des médicaments, notamment pour le traitement des affections psychiatriques, neuroloqiques, qastro-entéroloqiques ou neuroendocriniennes, et contenant des substances ayant une affinité élevée pour lesdits polypeptides à activité de récepteur sérotoninergique ou encore des substances ayant une activité sur des cellules transfeσtées par lesdites séquences d'ADN codant pour lesdits polypeptides.
Elle a également trait à des médicaments actifs sur l'un, certains, ou la totalité des récepteurs sérotoninergiqués déjà identifiés et/ou ceux décrits dans la présente invention et notamment à des médicaments agonistes ou antagonistes de la sèrotonine.
Il était admis jusqu'alors que les divers effets de la sèrotonine résultaient de son interaction avec différentes classes de récepteurs communément désignés sous les noms de récepteurs 5HT1a, 5HT1b, 5HT1c, 5HT1d, 5HT1e, 5HT2, 5HT3 et 5HT4. Parmi ceux-ci, les séquences des récepteurs 5HT1a, 5HT1b, 5HT1c, 5HT1d, 5HT1e, 5HT2 et 5HT3 sont connues (Zifa et Fillion, Pharmacol. Reviews, 44, 401-457, 1992 ; McAllister et al., Proc. Natl. Acad. Sci ., 89, 5517-5521, 1992). A l'exception du récepteur 5HT3, ces récepteurs appartiennent à la famille des récepteurs comportant sept domaines transmembranaires couplés à une protéine G et présentant un certain degré d'homologie avec les récepteurs de la famille des rhodopsines qui sont exprimés par les photorécepteurs de la rétine.
Ces récepteurs possèdent un profil pharmacologique particulier et sont couplés à différents messager intracellulaires. Les récepteurs 5HT1a, 5HT1b, 5HT1d, 5HT1 sont couplés négativement à l'adénylate cyclase alors que les récepteurs 5HT1c et 5HT2 sont couplés positivement à la phospholipase C conduisant à l'hydrolyse de phosphatidyl inositols. Le récepteur 5HT4 dont la séquence protéique n'est pas encore connue serait couplé positivement à l'adénylate cyclase.
L'existence de récepteurs sérotoninergiques distincts de ceux mentionnés ci-dessus, couplés positivement à l'adénylate cyclase et distincts du récepteur 5HT4, avait été suspectée par différents auteurs sur des observations indirectes portant sur des préparations biologiques complexes, mais ils n'avaient jamais été isolés, ni identifiés quant à leur structure, ni entièrement définis par leurs propriétés pharmacologiques.
L'invention des nouveaux polypeptides ci-dessus a permis de découvrir de nouveaux récepteurs sérotoninergiques qui seront désignés, ci-après, par 5HT6 et 5HT7.
L'invention a pour objet de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique (5HT6 ou 5HT7) choisis dans le qroupe des polypeptides formés par les ensembles 1 et 2 définis ci-après :
- Ensemble 1 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence de 448 acides aminés de rat, relative au récepteur 5HT6, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID n° 1 de la liste de séquences annexée ou des fragments peptidiques de cette séquence, lesdits fragments étant tels que
- soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 448 acides aminés et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier la sèrotonine, ses agonistes ou ses antagonistes,
- soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent éqalement ladite séquence de 448 acides aminés mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs sérotoninergiques décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT7,
- soit ils sont capables d'induire des anticorps reconnaissant ladite séquence de 448 acides aminés mais ne reconnaissant aucun des récepteurs sérotoninergiques décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT7 ;
ou des polypeptides ou fragments analoques correspondant à d'autres espèces, y compris l'espèce humaine, et relatifs au récepteur sérotoninergique homologue du récepteur 5HT6.
- Ensemble 2 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence de 127 acides aminés de rat, relative au récepteur 5HT7, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID Nº 2 de la liste de séquences annexée ou des fragments peptidiques de ces polypeptides, lesdits fragments étant tels que
- soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 127 acides aminés ou tout site voisin sur un polypeptide englobant ladite séquence de 127 acides aminés et codé par un gène exprimant le récepteur 5HT7, et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier la sèrotonine à ses agonistes ou antagonistes,
- soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent également ladite séquence de 127 acides aminés et/ou un polypeptide codé par un gène exprimant le récepteur 5HT7 mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs sérotoninergiqués décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT6,
- soit ils sont capables d'induire des anticorps reconnaissant ladite séquence de 127 acides aminés et/ou un polypeptide codé par un gène exprimant le récepteur 5HT7 mais ne reconnaissant aucun des récepteurs sérotoninergiqués décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT6 ;
ou des polypeptides ou fragments analoques correspondant à d'autres espèces, y compris l'espèce humaine, et relatifs au récepteur sérotoninergiqué homologue du récepteur 5HT7.
Dans la description qui suit, on définit par 5HT6 et 5HT7, non seulement les récepteurs de rat mais les récepteurs sérotoninergiqués homologues, humains ou non humains.
De préférence, les polypeptides de l'ensemble 1 contiennent les sites faisant partie de ladite séquence de 448 acides aminés, dont la présence est nécessaire, guand les polypeptides sont présentés sur une membrane cellulaire en présence de sèrotonine tritiée et en présence d'un agoniste ou d'un antagoniste de la sèrotonine, pour que l'affinité apparente desdits antagonistes ou agonistes corresponde à celle qui est indiguée dans le tableau 1 ci-dessous.
On voit notamment que l'affinité de la sèrotonine pour les polypeptides du récepteur 5HT6 de l'invention est supérieure à ce l l e du LSD.
On voit également, sur le tableau 1, que l'affinité du polypeptide récepteur exprimé dans les cellules est plus importante pour le spipérone que pour la miansérine.
Les polypeptides selon l'invention peuvent être utilisés en étant isolés, ou fixés sur des supports, d'une facon tout à fait classique. ou encore réunis à des séquences d'acides aminés sans relation avec les récepteur s 5HT6 ou 5HT7. Ils peuvent être glycosylès ou non et comporter des ponts disulfures.
La présente invention a èdalement pour objet les compositions ayant une teneur notable en de tels polypeptides, par exemple des teneurs obtenues par expression dans un hôte recombinant, lesdits polypeptides pouvant éventuellement être présents sous forme de membranes cellulaires enrichies en polypeptides.
La présente invention a également pour objet les acides nucléiques contenant ou constitués par les séquences de nucleotides codant pour un quelconque des polypeptides selon l'invention.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent comprendre ou consistei dans la séquence complète, c'est-à- dire le gène, codant pour les récepteurs 5HT6 ou 5HT7 chez l'homme ou chez l'animal. Des acides nucléiques selon l'invention sont notamment des acides nucléiques comprenant ou constitués par les séquences SEQ ID n° 1 ou nº 2 ou des fragments de ces séquences placés dans le cadre de lecture, ainsi que les séquences homologues, notamment chez l'homme. Parmi les acides nucléiques selon l'invention, un acide nuclèique particulièrement intéressant est celui constitué par la séquence s'étendant du nucléotide en position 135 à celui en position 1 478 dans l'identificateur SEQ ID nº 1 ou par ses homologues chez l'homme ou chez les animaux. Les acides nucléiques comprennent également les fragments codants pour les polypeptides plus courts définis précédemment.
Outre les variations de séquences nucléotidiques que l'on peut observer lorsque l'on passe des séquences d'ADN de rat représentées sur les identificateurs nº 1 et nº 2 à des séquences homologues chez l'homme ou d'autres espèces animales, les acides nucléiques selon l'invention peuvent comporter les variations propres à la dégénérescence du code ainsi que des mutations localisées dans la mesure où les acides nucléiques variants s'hybrident avec les sondes susceptibles de s'hybrider, de façon spécifique, avec les séquences ID n° 1 ou ID n° 2.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être obtenus par synthèse chimique classique d'acide nucléique, par réplication dans des vecteurs qui les contiennent ou par tout autre moyen. et notamment multiplication par le procédé dit PCR à partir d'une faible quantité d'acide nucléique selon l'invention.
L'invention a éqalement pour objet les vecteurs recombinants, utilisables pour le clonage ou pour l'expression des acides nucléiques, et contenant un acide nucléique selon l'invention, tels que des plasmides. phages ou virus contenant une ou plusieurs sé quences selon l'invention en un site non essentiel pour la réplication. Les vecteurs selon l'invention peuvent contenir. le cas échéant, les éléments nécessaires pour l'expression dans un hôte cellul aire tels que Promoteur , codon d'initiation. termina teur. séquence signal du séquence d'ancraqe ou tout autre élément utile de régnlon.
L'invention a également pour objet les hôtes cellulaires transformes par un vecteur recombinant selon l'invention et susceptibles d'exprimer la séquence codante selon l'invention poul la synthèse d'un polypeptide selon l'invention. Ces hôtes beuvent être des procaryotes, tels que par exemple E. coli, ou eucaryotes, par exemple des cellules de levure tellen que S. cerevisiae ou des cellules de mammifère, par exemple cellules CHO .
L'invention a également pour objet les anticorps monoclonaux ou polyclonaux diriqés contre un polypeptie selon l'invention. Ces anticorps monoclonaux ou polyclonaux sont obtenus par induction à partir d'un polypeptide selon l'invention et sont spécifiques des polypeptides selon l'invention, tout en étant susceptibles, ou non, de reconnaître d'autres récepteurs sérotoninerqiques.
L'obtention de ces anticorps peut s'effectuer de façon classique, soit par injection d'un polypeptide selon l'invention à un organisme et recueil du sérum avec éventuellement purification des anticorps spécifiques, soit pour les anticorps monoclonaux, par les techniques classiques de fusion cellulaire formant des hybridomes.
Les anticorps selon l'invention sont utiles pour le diagnostic, par réaction anticorps-antigène mise en évidence à l'aide d'une technique de révélation classique, pour diagnostiquer des proliférations pathologiques de cellules exprimant le récepteur 5HT6 ou 5HT7.
L'invention a également pour objet les sondes nucléotidiques s'hybridant avec l'un des acides nucléiques selon l'invention ou avec leurs séquences complémentaires ou ARN correspondants, en étant spécifiques du récepteur 5HT6 ou du récepteur 5HT7, et qui ne s'hybrident pas avec les sèquences nucléiques ou les ARN correspondants des autres récepteurs sérotoninerqiques décrits ci-dessus.
D'une façon en soi connue, on préfère que les sondes comportent au moins 10, et de préférence au moins 15 à 17 acides nucléiques.
Les sondes selon l'invention sont utiles pour le diagnostic d'affections neurologiques, psychiatriques, gastro-entérologiques ou neuro-endocriniennes liées à des anomalies qualitatives ou quantitatives des récepteurs 5HT6 ou 5HT7 , y compris pour la recherche d'anomalies génétiques à ce niveau.
Les sondes sont utilisées de façon classique en étant mises en contact, dans les conditions usuelles, avec des préparations présentant des acides nucléiques de cellules suspectées de présenter une anomalie définie ci-dessus.
En particulier, les sondes peuvent être utilisées pour détecter une expres s i on pa t ho l og i que de l ' un ou l ' aut re des récep t eur s 5HT6 ou 5HT7 en révélant la présence de son ARN messager.
De façon avantageuse pour l'expression en cellules eucaryotes, on peut utiliser le promoteur endogène des récepteurs sérotoninergique ou des promoteurs viraux usuels, par exemple virus SV40 ou virus du sarcome de Rous.
Pour l'expression dans les bactéries, notamment E. Coli, on peut insérer le gène sous le contrôle d'un promoteur usuel, par exemple promoteur de l'operon lactose ou de l'operon tryptophane.
L'invention a également pour objet un procède de criblage de médicaments destines aux traitements d'affections neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les troubles du sommeil, la migraine, et psychiatriques telles que les troubles de l'humeur, les dépressions, les états psychotiques, ou neuro-endocriniennes, et notamment les dysfonctionnements de l'axe hypothalamo-hypophysaire, ou qastro-enterologiques, notamment troubles fonctionnels de l'intestin, troubles moteurs ou secrétoires.
Le criblage d'un médicament peut notamment utiliser la détection de la capacité d'une molécule sérotoninergiqué à se comporter comme ligand vis-à-vis d'un polypeptide selon l'invention, et consiste, par exemple, à mettre en contact, dans un milieu convenable, la molécule sérotoninergiqué avec les membranes d'un hôte cellulaire transformé par un vecteur comprenant un insert codant poulle polypeptide et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à présenter à la surface membranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide, de manière telle que la liaison spécifique du ligand candidat puisse être évaluée ou indirectement estimée, par exemple en détectant l'éventuel complexe ligand-polypeptide . Ce procédé peut également comprendre la mesure d'une réponse induite par la liaison avec la cellule, telle que par exemple la production d'AMP cyclique de façon à permettre de différencier les molécules sérotoninergiqués qui se comportent comme antagonistes et celles qui se comportent comme aqonistes, et même de définir le caractère relatif de ces dernières.
Dans ce but de criblage, on peut egalement ut i l i ser un procédé déterminant l'affinité d'un polypeptide de l'invention pour des ligand détermines, dans lequel on cultive un hôte cellulaire transformé, conformément a l'invention, pour exprimer et présenter dans sa membrane le récepteur 5HT6 ou 5HT7 ou un polypeptide correspondant, après quoi on met la culture cellulaire en contact avec le ligand déterminé et on vérifie s'il se forme une liaison spécifique entre les hôtes cellulaires et les ligands, notamment par des tests de radioliaison et de préférence, de mesure du taux de production ou de libération d'un indicateur convenable tel que AMP cyclique, ou ions intracellulaires, ces derniers tests permettant de distinguer et de définir les agonistes et leur caractère partiel ainsi que les antagonistes.
Ce procède permet également de déterminer les fragments polypeptidiques selon l'invention, par exemple ceux comportant une partie de la sequence de 448 acides aminés SEQ ID Nº 1, et qui comprennent les sites opérationnels permettant la liaison et/ou l'induction des réponses cellulaires précitées.
On peut éqalement identifier ainsi des cellules ou tissus exprimant spontanément à leur surface membranaire un polypeptide selon l'invention, ces cellules ou tissus étant ensuite utilisables pour servir à la mise au point ou au criblage de médicaments ou de ligands interagissant avec les polypeptides selon l'invention.
L'invention a éqalement pour objet des médicaments contenant, dans une dose prévue pour être administrée, une quantité therapeutiguement efficace d'une substance active sur un polypeptide selon l'invention ayant une activité de récepteur 5HT6 ou 5HT7 dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'invention a également pour objet des médicaments, contenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace d'une substance active sur les autres récepteurs sérotoninergiqués mais non active sur l'un au moins des récepteurs 5HT6 et 5HT7.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront a la lecture do la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif.
Dans cette description, l'identificateur de séquence SEQ ID N° 1 représente la séquence d'un fragment d'ADN de 1661 bases, dont 448 codons, repérés sur la séquence, codent pour un polypeptide de 448 acides aminés constituant un récepteur de la sèrotonine désigné par 5HT6.
La séquence nº 2 représente un fragment d'ADN, dont 127 codons codent pour un polypeptide de 127 acides aminés constituant un fraoment du récepteur 5HT7 de la sèrotonine.
Les séquences précitées correspondent a des acides nucléiques chez le rat.
Les séquences nucléiques correspondantes chez d'autres mammifères et chez l'homme peuvent être obtenues par hybridation à partir d'une librairie ou d'une banque d'ADNc avec une sonde constituée par tout ou partie des séquences représentées, puis séquengage d'une façon tout à fait classique des fragments ainsi reconnus.
Clonage des récepteurs 5HT6 et 5HT7 de la sèrotonine
1. Clonage du récepteur 5HT7
On a criblé une banque d'ADNc de cerveau de rat dans des conditions de strinqence basse avec une sonde ADN marquée au 32P et correspondant à la séquence nuelèotidique codant pour le recepteur de la substance P de rat. Dans ces conditions, un clone (λSP45) s'hybride fortement avec cette sonde. La séquence nucleotidique du fragment d'ADN (1 124 pb) ainsi isolé montre que cet ADNc comporte une séquence codant pour un peptide de 127 acides aminés codant pour les régions MB6 , MB7 et NH2 terminales d'une protéine et présentant des homologies avec la famille des récepteurs homologues à la rhodopsine.
2. Clonage du récepteur 5HT6
Un fragment d'ADN de ce clone (nucieotide 8 au nucieotide 539) est alors marqué au 32P, puis utilisé pour cribler une banque d'ADNc d'hypotha lamus de rat ( Strat aqene ) dans des cond i t i ons de s t r i ngence é l evée . Douze clones sont alors isolés et analysés par analyse de restriction par les techniques de Southern et les clones possédant les inserts les plus longs sont sélectionnés. L'un d'eux, appelé λHPT3, comprend la séquence nucléotidique 404 à 1 661 de la séquence de la figure 1. Une sonde ADN marquée au 32P, située entre les nucleotides 404 et 607 est utilisée pour cribler une bande genomique de rat, coupée partiellement avec l'enzyme HaelII. Un clone hybride fortement avec la sonde et un fragment positif, EcoRI-Hind III, de 6,5 kb est subcloné en plasmide ( PGEM 4Z). Une séquence nucléotidique allant du nucieotide 1 au nucieotide 682 de la figure 1 est ainsi isolée et séquencée. Des amorces nucléotidiques (amorce 1 : 5'-GGAGATCTCCATTGTGCAGTCTCAGCCAATGA-3', située en aval du codon stop TGA de la figure 1, et amorce 2 : 5'-AAA AGC TTG GCG GGG TCG CCG GCT CCAT-3', située en amont de la première méthionine) sont alors synthétisées (synthétiseur d'ADN PCR-Mate .391A, Applied Biosystems). Elles sont ensuite utilisées dans la technique de RT-PCR comme suit. On synthétise un ADNc monobrin en utilisant de la reverse transcriptase AMV (20U, Boehringer) et du poly(A)+ ARNm (2 pci) d'hypothalamus de rat et l'amorce 1 décrite ci-dessus. Cette matrice est ensuite amplifiée (Kawazaki E.S. et al. 89-97 , "PCR Technclogy"; éd. Erlich H. A. Stockholm Press, 1989) en utilisant l'amorce 2 (75 mM de chacun) pendant 35 cycles comme suit (94,5°C 1 minute 30 ; 56°C, 1 minute 30 et 72ºC, 3 minutes) avec 5U d'ADN polymérase Tag (Perkin Eliner Cetus).
Une bande d'ADN de taille prévue 1,5 kb est extraite après électrophorèse sur qel d'agarose et digérée avec HindlII et Bgl II, puis subclonée dans un plasmide pGEM 4Z. Le sequengage de plusieurs plasmides montre que la séquence obtenue est identique à la séquence délimitée par les amorces 1 et 2 de l'indicateur SEQ ID N° 1.
3. Expression du récepteur 5HT6 dans des cellules
CHO.
METHODE
Les vecteurs d'expression dérivent du plasmide pSV D2 (Giros, B. et al., Nature 342. 923-926, 1989). Le vecteur pour exprimer le récepteur 5HT6 est obtenu en remplaçant le fragment de restriction HindIII-BglII de pSVD2 par un fragment de restriction HindlII-BglII du clone RT-PCR obtenu ci-dessus, conduisant au plasmide PSV 5HT6. Ces constructions sont cultivées, puis purifiées sur gradient de chlorure de césium (Sambrook J. et al., Molecular cloning - a laboratory manual. C. Nolan, éd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) et transfectées (Graham, F.L. et al., Virol. 52, 456-467, 1973) à des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO-K1), déficientes en dihydrofolate réductase. Les transfectants stables sont sélectionnés dans un milieu de culture (Dubelcco's Modified Eagle médium) sans hypoxanthine et sans thymidine.
L'expression du récepteur 5HT6 est mise en évidence par la liaison de la sèrotonine-3H à des membranes de cellules transfectées ; selon la t echn i que de Peroutka et Snyder (Peroutka S.J. et Snyder S.L.; Mol. Pharmacol., 16, 687-699, 1979). Les expériences de liaison sont ef f ec tuées dans un tampon Tris-HCl 50mM pH = 7.6 (volume total 500 μl) contenant CaCl2 4 mM , 0,1 % d'acide ascorbique, pargyline
10 -5M, et de la sèrotonine-3H a une concentration de 1 à 2 nM.
RESULTATS
Les récepteurs 5HT6 ont été exprimés dans des cellules CHO qui, normalement, n'ont pas de sites de liaison vis-à-vis de la sèrotonine-3H.
Dans des clones transfectés de cellules CHO, exprimant ces sites en permanence les valeurs de KD de la sèrotonine sont de 1 nM pour le récepteur 5HT6 et les valeurs Bmax (Bmax représentant la concentration maximale en récepteur 5HT6) sont d'environ 1 pmol/mg de protéine de membrane.
Le tableau 1 indique clairement que le gène transfecté dans les cellules CHO code pour un récepteur sérotoninergiqué comme l'indique la forte affinité de la sèrotonine et de ses dérivés tels que la 5-méthoxytryptamine. Cependant, la pharmacoloqie de ce récepteur 5HT6 ne peut en aucun cas être confondue avec celle d'un récepteur 5HT 1A (le 8-OH-DPAT présente une affinité inférieure au nanomolaire vis-à-vis de ce récepteur), 5HT2 (le spipérone et la kétansérine présentent des affinités de l'ordre du nM) ou 5HT4 ( 1'ICS 205 930 présente une affinité de 0.5 nM sur le récepteur 5HT3 et de 300 nM sur le récepteur 5HT4) ou une autre classe de ré cep teurs sé rotonineigigues clones a ce jour .
Caractérisation des transcrits du gène du récepteur 5HT6 dans plusieurs tissus
Des ARNs poly(A)+ sont préparées a partir de plusieurs tissus cérébraux ou périphériques de rat ou de cobaye (Chirgwin et coll .. Biochemistry 18. 5294-5299, 1979 ; Aviv et coll. , Proc . Nat l. Acad. Sci., 69, 1408-1412, 1972). Des échantillons (8 μg) sont dénatures, soumis a électrophorèse sur agarose, transfères sur des membranes de nitiocellulose et hybrides (Traiffort et al.. Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 2619- 2 65 3, 1992) en utilisant un fragment d e
1 106 pb obtenu par amplification d'ADN à l'aide d'amorces oligonucleotidiques, puis marque au 32P par la technique de "nick-translation". Ce fragment margué correspond aux domaines transmembranaires 1 a 7 et est utilisé a raison de 14 x 106 dpm/ml. Les membranes sont exposées pendant 7 jours a - 80ºC avec des écrans amplificateurs. Chez le rat, deux transcrits (3,9 et 3,2 kb) sont observables dans les tissus cérébraux étudiés. L'hypothalamus, le tronc et l'hippocampe sont les régions qui semblent exprimer les plus fcrtes densités de transcrits du récepteur 5HT6. Chez le cobaye, deux transcrits (3,8 et 3,0 kb) sont éqalement observables dans la pupart des régions cérébrales étudiées. Le thalamus et le tronc semblent être les régions qui expriment les plus fortes densités de transcrits du récepteur 5HT6.
Réponses induites par la séiotonino dans les cellules CHO transfectées par le récepteur 5HT6
Accumulation d'AMPc : selon la technique décrite dans Traiffort E. et coll., Proc. Natl. Acad. Sci., 89. 2644-2653, 1992), les cellules cultivées sur plagues de 96 puits sont lavées, puis incubées en présence de concentrations croissantes de sèrotonine pendant 10 minutes à 37ºC. L'AMPc est extrait, puis analysé par dosage radioimmunologique (New England Nuclear). La sèrotonine (300 nM) induit une stimulation d'AMPc importante (1,22 ± 0.06 pmol/puits) comparativement au taux basai en absence de sèrotonine (0,07 ± 0,03 pmol /puits). Cette mesure permet de déterminer le caractère agoniste d'une molécule.
TABLEAU 1 pharmacologie du ré cepteur 5 HT6 exprimé dans des cell ules CHO
Figure imgf000020_0001
ANNEXE 1
LISTEDESSEQUENCES
SEQ ID n° 1
Longueur de la séquence : 1 661 paires de bases
Type de molécule séquencée : ADNc monobrin
Sequence nucléotidique du récepteur 5HT6.
116 gcagcggcgctcggcacg ATG ATG GAC GTT AAC AGC AGC GGC CGC CCC GAC CTC TAC GGC CAT CTC CGT TCA CTC ATC CTG CCG GAG GTG 206
M M D V N S S G R P D L Y G H L R S L I L P E V 24
GGG CGC GGG CTG CAG GAC CTG AGC CCC GAC GGT GGC GCC CAC CCT GTG GTG AGC TCC TGG ATG CCG CAC CTG CTG AGT GGC TTC CTA 293
G R G L Q D L S P D G G A H P V V S S W M P H L L S G F L 53
GAG GTG ACG GCT AGC CCG GCG CCC ACC TGG GAC GCG CCA CCG GAC AAT GTC TCA GGC TGC GGG GAG CAG ATC AAC TAT GGC AGA GTG 380
E V T A S P A P T W D A P P D N V S G C G E Q I N Y G R V 82
GAG AAA GTT GTG ATC GGC TCC ATC CTG ACG CTC ATC ACG CTG CTG ACG ATC GCA GGC AAC TGC CTG GTG GTG ATC TCG GTG TGC TTC 467
E K V V I G S I L T L I T L L T I A G N C L V V I S V C F 111
GTC AAG AAG CTC CGC CAG CCC TCC AAC TAC CTG ATT GTG TCC CTG GCG CTG GCT GAC CTC TCG GTG GCC GTG GCG GTC ATG CCT TTC 554
V K K L R Q P S N Y L I V S L A L A D L S V A V A V M P F 140
GTT AGT GTC ACC GAC CTC ATC GGG GGC AAG TGG ATC TTC GGC CAC TTC TTC TGC AAC GTC TTC ATC GCC ATG GAC GTC ATG TGC TGC 641
V S V T D L I G G K W I F G H F F C N V F I A M D V H C C 169
ACG GCC TCG ATC ATG ACC CTG TGC GTG ATC AGC ATC GAC AGG TAC CTT GGG ATC ACG AGA CCC CTC ACG TAC CCG GTG AGG CAA AAT 728
T A S I M T L C V I S I D R Y L G I T R P L T Y P V R Q N 198
GGG AAA TGT ATG GCC AAA ATG ATT CTG TCG GTC TGG CTG CTC TCT GCC TCC ATC ACC TTA CCT CCT CTC TTC GGA TGG GCT CAG AAT 815
G K C M A K M I L S V W L L S A S I T L P P L F G W A Q N 227
GTG AAC GAT GAC AAA GTG TGC TTG ATC AGC CAG GAT TTT GGC TAC ACG ATC TAC TCC ACT GCG GTG GCG TTT TAT ATC CCC ATG TCG 902
V N D D K V C L I S Q D F G Y T I Y S T A V A F Y I P M S 256
GTC ATG CTG TTC ATG TAC TAT CAG ATT TAC AAG GCC GCC AGG AAG AGT GCA GCC AAA CAC AAG TTC CCA GGC TTC CCA CGC GTG CAG 989
V M L F M Y Y Q I Y K A A R K S A A K H K F P G F P R V Q 285
CCG GAG AGT GTC ATC TCC CTG AAT GGT GTG GTG AAG CTC CAG AAG GAG GTG GAA GAG TGT GCG AAC CTT TCG AGA CTG CTC AAA CAC 1076
P E S V I S L N G V V K L Q K E V E E C A N L S R L L K H 314
GAA AGG AAA AAC ATC TCC ATC TTC AAG CGG GAA CAG AAA GCA GCC ACT ACC TTC GGG ATC ATC GTG GGA GCC TTC ACT GTG TGC TGG 1163 E R K N I S I F K R E Q K A A T T L G I 1 V G A F T V C W 343
CTG CCG TTT TTC CTC TTG TCC ACA GCC CGC CCC TTT ATC TGT GGC ACC TCC TGT AGC TGC ATT CCT CTG TGG GTG GAG AGG ACA TGT 1250
L P F F L L S T A R P F 1 C G T S C S C I P L W V E R T C 372
CTG TGG CTG GGC TAT GCA AAC TCT CTC ATT AAT CCT TTT ATA TAT GCC TTC TTC AAC CGG GAC CTG AGG ACC ACC TAT CGT AGC CTA 1337
L W L G Y A N S L I N P F I Y A F F N R D L R T T Y R S L 401
CTC CAG TGC CAG TAC CGG AAT ATC AAC CGG AAG CTC TCT GCT GCA GGC ATG CAT GAA GCC CTG AAA CTT GCT GAG AGG CCC GAG AGA 1424
L Q C Q Y R N I N R K L S A A G M H E A L K L A E R P E R 430
TCC GAG TTT GTG CTA CAA AAC TCT GAC CAC TGT GGG AAA AAG GGT CAT GAT ACA tgatccagagtggaaccctggatgaattcatgcagaacaggtg 1521
S E F V L Q N S D H C G K K G H D T 448
1637 agatggcaaccτctcccttttttt 1661 SEQ ID n º 2
Lonqueur de la séquence : 1124 paires de bases
Type de molécule séquencée : ADNc monobrin
Séquence partielle du récepteur 5HT7
gt GCC AGT TTC TCT CGT CTG CTT AAG AAC GAC AGG AAA 38
A S F S R L L K N D R K 12
AAC ATC TCC ATC TTC AAG CGG GAG CAG AAG GCG GCC GCT 77
N I S I F K R E Q K A A A 25
ACG TTG GGG ATC GTT GTG GGG GCC TTC TCT GTC TGC TGG 116
T L G I V V G A F S V C W 38
CTG CCC TTC TTC CTG ATG TCC ACG GCC AGG CCC TTC ATC 155
L P F F L M S T A R P F I 51
TGT GGG GTA GAA TGT AGC TGC GTT CCC CTC TGG GTG GAA 194
C G V E C S C V P L W V E 64
AGG TTT CTC CTC TGG CTG GGC TAC GCC AAC TCC CTC ATC 233
R F L L W L G Y A N S L I 77
AAC CCA TTC ATC TAT GCC TTC TTC AAC AGG GAC CTG AGG 272
N P F I Y A F F N R D L R 90
ACC ACC TAC CGT AAC ATC TTG CTC TGC AGG TAC AGG AAC 311
T T Y R N I L L C R Y R N 103
ATT AAC CGC AAA CTC TCC GCC GCC TGC ATG CAC GAG GCC 350
I N R K L S A A C M H E A 116
ATC AAA CTG GCT GAG AGG CCG GAT CTG GAG ATC tagaaca 390
I K L A E R P D L E I 127 gtgtttcttaaacttctctaacactttgctacacaaggaccagcaaactatg 442 gtttagatcagggtgtcaaacatttgactgcggcctgtgggtggtttgagta 494 ataaaaaaaaactcaatgtagtgataatggacttacattttacagtctcttc 546 actctgtccatcttgttaacaatcatcaaaacgaaagccgaacagtcaggga 598 gcatcaaaatgacaaaaataaggtgcaaaatgagtttgacacccctagttta 650 aatgaaaacttgggcttgacatatgactaaattggagcagacaaccatctgt 702 ggtcacaggtcacagacaggggtgaaaacactactctagagatctatcagtc 754 atgaggtagagaggctactgcatgtgtatagatgctgacatatgtcatactg 806 tatggacttacatttacagtctcttcactctgtcgtctgtacatcatcaaac 858 gaagccgaaaaggctacatgcatgtgtatagaataactgacattattgttca 910 tacctggcacacacaagaacattagatccacatcttgtcaggttatacacag 962 tacattttgcagtgttcatttcacttaaagagttcattttaacactacctca 1014 gataacatatagtcccactctacagagtgtaaaaagtactctgattgtagtg 1066 ttacattttgagtgttaatgtaacacttcatattataaaatattaacattcg 1118 atttca 1124

Claims

REVENDICATIONS
1. Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergiqué ( 5HT6 ou 5HT7 ) choisis dans le groupe des polypeptides formés par les ensembles 1 et 2 définis ci-après :
- Ensemble 1 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence de 448 acides aminés de rat, relative au récepteur 5HT6, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID nº 1 de la liste de séquences annexées ou des fragments peptidiques de cette séquence, lesdits fragments étant tels que
- soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 448 acides aminés et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier la sèrotonine, ses agonistes ou ses antagoni stes,
- soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent éqalement ladite séquence de 448 acides aminés mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs sérotoninergiqués, y compris le récepteur 5HT7,
- soit ils sont capables d'induire des anticorps reconnaissant ladite séquence de 448 acides aminés mais ne reconnaissant aucun des récepteurs sérotoninergiqués décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT7 ;
ou des polypeptides ou fragments analogues correspondant à d'autres espèces, y compris l'espèce humaine, et relatifs a récepteur sérotoninergiqué homologue du récepteur 5HT6.
- Ensemble 2 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence de 127 acides aminés de rat, relative au récepteu 5HT7, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID N° 2 de la liste de séquences annexée ou des fragment peptidiques de ces polypeptides, lesdits fragments étant tels que
- soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 127 acides aminés ou tout site voisin sur un polypeptide englobant ladite séquence de 127 acides aminés et codé par un gène exprimant le récepteur 5HT7, et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier la sèrotonine, ses agonistes ou antagonistes,
- soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent éqalement ladite séquence de 127 acides aminés et/ou un polypeptide codé par un qène exprimant le récepteur 5HT7 mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs sérotoninergiques, y compris le récepteur 5HT6,
- soit ils sont capables d'induire des anticorps reconnaissant ladite séquence de 127 acides aminés et/ou un polypeptide codé par un qène exprimant le récepteur 5HT7 mais ne reconnaissant aucun des récepteurs sérotoninerqiques décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT6 ;
ou des polypeptides ou fragments analogues correspondant à d'autres espèces, y compris l'espèce humaine, et relatifs au récepteur sérotoninergique homologue du récepteur 5HT7.
2. Polypeptides de l'ensemble 1 de la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils contiennent les sites faisant partie de ladite séquence de 448 acides aminés, dont la présence est nécessaire, guand les polypeptides sont présentés sur une membrane cellulaire en présence de sèrotonine tritiée et en présence d'un aqoniste ou d'un antagoniste de la sèrotonine, pour que l'affinité apparente desdits antagonistes ou agonistes corresponde à celle gui est indiguée dans le tableau 1.
3. Acides nuc l é i gues contenant ou constitués par les séquences de nuc l éo t i des codant pour un quelconque des polypeptides selon la revendication 1.
4. Acides nucléiques consistant dans ou comprenant la séquence complète codant pour les récepteurs 5HT6 ou 5HT7 chez l'homme ou chez l'animal.
5. Acides nucléiques comprenant ou constitués par les séquences SEQ ID nº 1 ou n° 2 ou des fragments de ces séquences placés dans le cadre de lecture, ainsi que les séquences homologues, notamment chez l'homme.
6. Acide nucléique selon la revendication 5 constitué par la séquence s'étendant du nucieotide en position 135 à celui en position 1 478 dans l'identificateur SEQ ID nº 1 ou à ses homologues chez l'homme ou chez le animaux.
7. Vecteurs recombinants, utilisables pour le clonage ou pour l'expression des acides nucléiques, et contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 3 à 6.
8. Hôtes cellulaires transformés par un vecteur recombinant selon la revendication 7 et susceptibles d'exprimer la séquence codante pour la synthèse d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2.
9. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 .
10. Sondes nucléotidiques s'hybridant avec l'un des acides nucléiques selon l'une des revendications 3 à 6 ou avec leurs séquences complémentaires ou ARN correspondants, en étant spécifiques du récepteur 5HT6 ou du récepteur 5HT7, et qui ne s'hybrident pas avec les séquences nucléiques ou les ARN correspondants des autres récepteurs sérotoninergiqués.
11. Sondes selon la revendication 10 pour le diagnostic d'affections neurologiques, psychiatriques, gastro-entérologiques ou neuro-endocriniennes liées à des anomalies qualitatives ou quantitatives des récepteurs 5HT6 ou 5HT7.
12. Procédé de criblage de médicaments destinés aux traitements d'affections neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les troubles du sommeil, la migraine, et psychiatriques telles que les troubles de l'humeur, les dépressions, les états psychotiques, ou neuro-endocriniennes, et notamment les dysfonctionnements de l'axe hypothal amo-hypophysaire, ou gastro-entérologiques, notamment troubles fonctionnels de l'intestin, troubles moteurs ou sécrétoires, dans lequel on met en contact, dans un milieu convenable, une molécule candidate avec les membranes d'un hôte cellulaire transformé par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à présenter à la surface membranaire des sites spécifiques de ce polypeptide, l'éventuel complexe ligand-polypeptide gui se forme étant alors détecté.
13. Procédé de criblage de médicaments destinés aux traitements d'affections neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les troubles du sommeil, la migraine, et psychiatriques tels que les troubles de l'humeur, les dépressions, les états psychotiques, ou neuro-endocriniennes, et notamment les dysfonctionnements de l'axe hypothalamo-hypophysaire, ou gastro-entérologiques, notamment troubles fonctionnels de l'intestin, troubles moteurs ou sécrétoires dans lequel on mesure une réponse induite par la liaison d'une molécule candidate avec une cellule, transformée par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de fagon à présenter à la surface menbranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide de telle maniere que la mesure d'un signal tel que la production d'AMP cyclique permette de différencier les molécules sérotoninergiqués qui se comportent comme antagonistes et celles qui se comportent comme agonistes.
14. Procédé de criblage de ligands marqués tels que ligands radioactifs ou fluorescents dans lequel on mesure la liaison spécifique de ligands candidats avec la membrane d'une cellule transformée par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à exprimer à la surface membranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide de maniere telle que la liaison spécifique du ligand candidat puissse être évaluée ou indirectement estimée.
15. Procédé d'identification de tissus ou cellules exprimant spontanément à leur surface membranaire un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 de telle manière que lesdits tissus ou cellule, puissent servir a la mise au point de médicaments ou ligands marqués selon les revendications 12 a 14.
16. Médicaments contenant, dans une dose prevue pour être administrée, une quantité therapeutiquement efficace d'une substance active sur un polypeptide ayant une activité de récepteur 5HT6 ou 5HT7 dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
17. Médicaments contenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace d'une substance active sur les autres récepteurs sérotoninergiqués mais non active sur l'un au moins des récepteurs 5HT6 et
5HT7.
18. Utilisation d'une molécule selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, pour la réalisation d'un médicament non actif sur l'un au moins des récepteurs 5HT6 et 5HT7, mais actif sur les autres récepteurs sérotoninergiques.
PCT/FR1993/001282 1992-12-30 1993-12-21 Recepteurs serotoninergiques (5ht6 et 5ht7) et leurs utilisations WO1994016067A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9215929A FR2699922B1 (fr) 1992-12-30 1992-12-30 Polypeptides à activité de récepteur sérotoninergique, médicaments les comprenant, séquences codant pour eux, sondes vecteurs et hôtes les exprimant, et application au criblage des médicaments.
FR92/15929 1992-12-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1994016067A1 true WO1994016067A1 (fr) 1994-07-21

Family

ID=9437290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1993/001282 WO1994016067A1 (fr) 1992-12-30 1993-12-21 Recepteurs serotoninergiques (5ht6 et 5ht7) et leurs utilisations

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2699922B1 (fr)
WO (1) WO1994016067A1 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698766A (en) * 1995-04-05 1997-12-16 The Regents Of The University Of California Transgenic animal model for testing drugs for treating eating disorders and epilepsy
US6083749A (en) * 1992-11-03 2000-07-04 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof
US6300087B1 (en) 1992-11-03 2001-10-09 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991017174A1 (fr) * 1990-05-08 1991-11-14 Neurogenetic Corporation Adn codant des recepteurs 5-ht1d humains et leurs emplois
US7980514B2 (en) * 2008-03-14 2011-07-19 Northrop Grumman Space & Mission Systems Corp. Solar array momentum control

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991017174A1 (fr) * 1990-05-08 1991-11-14 Neurogenetic Corporation Adn codant des recepteurs 5-ht1d humains et leurs emplois
US7980514B2 (en) * 2008-03-14 2011-07-19 Northrop Grumman Space & Mission Systems Corp. Solar array momentum control

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMLAIKY, N. ET AL.;: "Isolation of a mouse '5HT1E-like' serotonin receptor expressed predominaantly in Hippocampus.", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY., vol. 267, no. 28, 5 October 1992 (1992-10-05), BALTIMORE US, pages 19761 - 19764 *
DATABASE WPI Week 9319, Derwent World Patents Index; AN 93-159493 *
RUAT, M. ET AL.;: "A novel rat serotonin (5-HT6) receptor : molecular cloning, localization and stimulation of cAMP accumulation.", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS., vol. 193, no. 1, 28 May 1993 (1993-05-28), DULUTH, MINNESOTA US, pages 268 - 276 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083749A (en) * 1992-11-03 2000-07-04 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof
US6300087B1 (en) 1992-11-03 2001-10-09 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof
US6376243B1 (en) 1992-11-03 2002-04-23 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4b) and uses thereof
US6432655B1 (en) 1992-11-03 2002-08-13 Synaptic Pharmaceutical Corporation Method of obtaining compositions
US5698766A (en) * 1995-04-05 1997-12-16 The Regents Of The University Of California Transgenic animal model for testing drugs for treating eating disorders and epilepsy

Also Published As

Publication number Publication date
FR2699922A1 (fr) 1994-07-01
FR2699922B1 (fr) 1995-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5639652A (en) DNA encoding a human 5-HT1F receptor and uses thereof
US5472866A (en) DNA encoding 5-HT4A serotonin receptors
CA2045658C (fr) Polypeptides ayant une activite de recepteur .beta. adrenergique chez l'homme, impliques dans la reponse lipolytique, acides nucleiques codantpour ces polypeptides et utilisation de ces polypeptides pour le le criblage de substance active sur ces polypeptides
JPH09509314A (ja) 神経ペプチドｙ／ペプチドｙｙ（ｙ２）受容体をコードした核酸、及び該核酸の使用
EP0665885A1 (fr) Polypeptides ayant une activite de recepteur serotoninergique (5ht2c) et utilisations
JP3112936B2 (ja) ドーパミン受容体活性を有するポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸及びこれらのポリペプチドに対して活性な物質をスクリーニングするためのこれらのポリペプチドの使用
JPH10513052A (ja) ヒト・ヒスタミンｈ▲下２▼ レセプターの新規対立遺伝子およびｈ▲下２▼ レセプター変異種の検出方法
WO1994016067A1 (fr) Recepteurs serotoninergiques (5ht6 et 5ht7) et leurs utilisations
EP0651801B1 (fr) Polypeptides ayant une activite de recepteur serotoninergique (5ht5a), acides nucleiques codant pour ces polypeptides et utilisations
EP0507908B1 (fr) Polypeptides ayant une activite de recepteur dopaminergique humain, acides nucleiques codant pour ces polypeptides et utilisation de ces polypeptides pour le criblage de substances actives sur ces polypeptides
FR2697850A1 (fr) Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur opioïde, acides nucléiques codant pour ces polypeptides et utilisations.
FR2701265A1 (fr) Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique, acides nucléiques codant pour ces polypeptides et utilisations.
US6406859B1 (en) DNA encoding a 5-HT 1F receptor and uses thereof
EP0804574A1 (fr) Recepteur opioide kappa humain, acides nucleiques et utilisations
AU703697B2 (en) DNA encoding a human 5-HT1F receptor and uses thereof
FR2693201A1 (fr) Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique, acides nucléiques codant pour ces polyptides et utilisations.
AU667510C (en) DNA encoding a human 5-HT-1F receptor and uses thereof
WO1998036060A1 (fr) Utilisation a des fins de diagnostic et therapeutiques d'un polypeptide a activite de recepteur ob25 exprime par les cellules myelinisantes
FR2806728A1 (fr) Nouvelle famille de canaux humains a cation sodium et leur utilisation
FR2713645A1 (fr) Polypeptides à activité de récepteur aux mélanocortines, médicaments les comprenant, séquences codant pour eux, sondes, vecteurs et hôtes les exprimant et application au criblage de médicaments.
WO2000078948A2 (fr) Clonage, expression et caracterisation d'un adnc codant pour un recepteur gamma-hydroxybutyrate (ghb) de cerveau de rat
FR2759374A1 (fr) Polypeptide a activite de recepteur ob25 specifique des cellules myelinisantes chez le rat, application au criblage de medicaments et medicaments

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA