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WO1994026929A1 - Sequences nucleotidiques caracteristiques des erwinia carotovora - Google Patents

Sequences nucleotidiques caracteristiques des erwinia carotovora Download PDF

Info

Publication number
WO1994026929A1
WO1994026929A1 PCT/FR1994/000598 FR9400598W WO9426929A1 WO 1994026929 A1 WO1994026929 A1 WO 1994026929A1 FR 9400598 W FR9400598 W FR 9400598W WO 9426929 A1 WO9426929 A1 WO 9426929A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
erwinia carotovora
strain
sequences
nucleotide sequences
Prior art date
Application number
PCT/FR1994/000598
Other languages
English (en)
Inventor
Armelle Darrasse
Alain Kotoujansky
Yves Bertheau
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Institut National Agronomique Paris-Grignon (Ina)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Recherche Agronomique (Inra), Institut National Agronomique Paris-Grignon (Ina) filed Critical Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Priority to AU68491/94A priority Critical patent/AU6849194A/en
Publication of WO1994026929A1 publication Critical patent/WO1994026929A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • CHARACTERISTIC NUCLEOTIDE SEQUENCES OF ERWINIA CAROTOVORA.
  • the subject of the present invention is nucleotide sequences derived from the genome of bacteria of the species Erwinia carotovora, and more particularly Erwinia carotovora pathogenic in certain plants, these sequences being usable, in particular as probes and primers, for the detection of these bacteria in hosts likely to be infected with them, or in any environment where these bacteria are likely to survive.
  • Prophylactic measures therefore requiring rapid, sensitive and reliable detection, still constitute one of the most effective and least costly means, both financially and in terms of the environment, of combating diseases, and in particular against bacteriosis for which few means of fight are available, the use of antibiotics being prohibited in the majority of countries.
  • These prophylactic measures essentially consist in producing material, in particular of propagation, healthy, and possibly in destroying the contaminated batches, in sterilization or any other disinfection process of all the materials, premises and culture substrates likely to be in contact with plants and seeds, choosing healthy production locations.
  • isolation and microbiological characterization are generally long and laborious techniques, which may be too costly to consider applying them on a large scale, while immunological methods do not always present the specificity and sensitivity desired.
  • Pectinolytic bacteria of the genus Erwinia are responsible for a large number of pathologies of this type, one of the symptoms of which is the maceration of tissues in a large number of plants and seeds. These bacteria are particularly capable of infecting potatoes, corn, tomatoes, sugar beets, cabbage, chicory, etc., as well as greenhouse plants, such as ornamental plants which are commonly sold. between countries.
  • Erwinia carotovora Erwinia carotovora, and more particularly Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc), Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), Erwinia carotovora subsp. odorifera (Eco), Erwinia carotovora subsp. betavasculorum (Ecb), and Erwinia carotovora subsp. wasabiae, and, on the other hand, Erwinia chrysanthemi (Ech),
  • Erwinia carotovora has been particularly studied because of its pathogenic power on several plants, and especially in potatoes (Pérombelon, 1989).
  • the Erwinia carotovora (Ec) species is currently divided into five subspecies: atroseptica (Eca), carotovora (Ecc), odorifera (Eco) and wasabiae (Ecw) previously mentioned, as well as the betavasculorum subspecies (Ecb).
  • Eca and Ecb appear relatively close taxonomically. Ecb is responsible for beet rot, known as root necrosis (Thomson et al., 1981). The action of Eca is generally limited to the potato in cool temperate climates, at temperatures between about 18 ° C and about 20 ° C (Pérombelon, 1980). Some strains, not isolated from the potato, have been described as "atypical" Eca due to the fact that they have some particular physiological characteristics, such as their capacity to develop at 37 ° C (Lopez et al., 1989).
  • odorifera (Eco) has recently been described as representing "atypical” strains which are pathogenic at least on endive and produce volatile odorous metabolites (Gallois et al., 1992).
  • Other "atypical" Eca strains have been identified as Ecc strains on the basis of phenotypic and genotypic characteristics (S. Priou, ENSAR thesis, Rennes, 1992). Conversely, Ecc is widely distributed in the world and has a large specificity of hosts (Pérombelon and Kelman 1987,
  • the main pathologies of potato caused by these bacteria, and more particularly by Eca, are as follows: failure to emerge, seedling loss, black leg, aerial rot of the stem, drying and rot of the tubers, and aerial wilt (Pérombelon and Kelman
  • Eca is considered the typical agent of the black leg in Europe because of its pathogenicity at low temperatures, and its ability to induce the disease early in vegetation, which increases losses. Most Ecc strains cannot produce typical black leg symptoms at low temperatures. Ecc is seen as an opportunistic agent rather than a primary causative agent of the disease. However, Ecc has an increased pathogenicity at temperatures greater than or equal to about 25 ° C and is the primary causative agent of the black leg of the potato in Arizona and Colorado (Stanghellini and Meneley, 1975).
  • the aim of the present invention is to provide nucleotide sequences making it possible to differentiate the strains (or groups of strains) of the Erwinia carotovora species between them.
  • Another object of the invention is to provide nucleotide sequences capable of differentiating the Erwinia carotovora subspecies from each other.
  • Another object of the present invention is to differentiate the pathogenic strains of Erwinia carotovora from those which are not pathogenic, whether or not these strains belong to the same subspecies of Erwinia carotovora.
  • the present invention also aims to provide reliable methods for specific determination of the presence of pathogenic Erwinia carotovora strains in a host (in particular plants or seeds) capable of carrying such bacteria, or even in the soil and the soil. 'water.
  • the present invention aims to provide a reliable method for specific determination of the presence of Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), and / or Erwinia carotovora subsp. betavasculorum (Ecb), in a host as described above.
  • Eca Erwinia carotovora subsp. atroseptica
  • Ecb Erwinia carotovora subsp. betavasculorum
  • the present invention more specifically aims to make available to potential users, reliable methods of early diagnosis of pathologies caused by bacteria of the species Erwinia carotovora, and more particularly of the black leg of the potato caused. by Eca, or root necrosis caused by Ecb, namely methods making it possible to diagnose the presence of these bacteria and therefore the risk of occurrence of these pathologies, or to identify the bacterial strains responsible for these pathologies.
  • the object of the invention is more precisely to provide new nucleotide sequences which can be used as probes or primers for the implementation of these diagnostic methods, in particular by the techniques proceeding by hybridization between nucleic acids (RNA and / or DNA), optionally followed by amplification of the number of copies of target sequences to be detected, for example according to gene amplification techniques called PCR (Polymerase
  • the invention also aims to make available to potential users, diagnostic kits for implementing the above-mentioned diagnostic and identification methods.
  • the invention is illustrated with the aid of FIGS. 1 to 6 respectively representing the nucleotide sequences A to F described below.
  • the subject of the present invention is nucleotide sequences comprising all or part of the sequences as obtained by genomic subtraction between two different strains of Erwinia carotovora, or comprising all or part of the sequences bordering the latter on the genome of the Erwinia strain carotovora from which the sequences obtained by genomic subtraction are derived, said nucleotide sequences being capable of hybridizing with the genome (or more precisely part of the genome) of at least one bacterial strain belonging to the species Erwinia carotovora, and not being able to not hybridize with the genome of at least one strain belonging to this same species.
  • a more particular subject of the invention is the nucleotide sequences as described above, characterized in that they are capable of hybridizing with the genome of at least one bacterial strain belonging to a determined subspecies of Erwinia carotovora, but not with that of at least one strain belonging to a subspecies of Erwinia carotovora different from the previous one, or capable of hybridizing with the genome of at least one strain belonging to a given subspecies d 'Erwinia carotovora, but not with that of at least one strain belonging to this same subspecies.
  • the invention also relates to the nucleotide sequences as described above, characterized in that they are capable of hybridizing with the genome of at least one pathogenic bacterial strain in a given plant, but not with that of at minus a non-pathogenic strain in this same plant, this non-pathogenic strain belonging or not belonging to the same subspecies of Erwinia carotovora as the previous pathogenic strain.
  • non-pathogenic strain is understood, in the foregoing and what follows, as opposed to a pathogenic strain, any strain not being capable of inducing the appearance of a pathology, and more particularly of a type of rot, in a given plant, under conventional conditions (and the current state of knowledge in this field), in particular climatic and geographic, in which said aforementioned pathogenic strain is capable of inducing the appearance of pathology in this plant.
  • the subspecies Eca can be characterized, in the current state of knowledge, by its ability to cause a symptom known as black leg on potato stem, between 18 and 22 ° C, and in all cases at a temperature below 25 ° C, the ambient relative humidity being sufficient.
  • the genomic subtraction described above between the two strains of Erwinia carotovora is carried out as follows: - the DNA of a first strain of Erwinia carotovora, or target DNA, is cut into small fragments, of approximately 100 at around 1,000 nucleotides, in particular by the action of restriction enzymes,
  • the DNA of a second strain of Erwinia carotovora, or trap DNA is cut into fragments, of approximately 1,000 to approximately 10,000 nucleotides, in particular by sonication, these fragments being subsequently labeled,
  • the target DNA and trap fragments thus mixed are denatured by heating, which leads to the formation of target DNA fragments and single strand trap,
  • the single-stranded DNA fragments obtained in the previous step are placed under hybridization conditions such that they allow the formation of double-stranded DNA fragments consisting of two strands of target DNA (target homoduplex), or of two strands of trap DNA (homoduplex trap), or of a strand of target DNA and of a strand of trap DNA (heteroduplex),
  • the double-stranded DNA fragments obtained in the previous hybridization step are then placed in the presence of a reagent having an affinity for the abovementioned marker, this reagent being immobilized on a solid support so that the homoduplex traps and the labeled heteroduplexes remain fixed on the solid support by bonding between the marker used to mark the trap DNA and the abovementioned reagent,
  • the first strain of Erwinia carotovora is a pathogenic strain in a given plant, while the second strain of Erwinia carotovora is not pathogenic, more particularly in the same conditions (of culture, climatic, etc.) than for the previous strain, in this same plant.
  • the pathogenic strain of Erwinia carotovora is a strain of Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca) responsible for rots in certain plants, in particular the black leg of the potato, and the non-pathogenic Erwinia carotovora strain is a strain of Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc) does not induce rots (and more particularly of the characteristic black leg type) in these same plants.
  • a more particular subject of the invention is the nucleotide sequences as described above, and characterized in that they correspond to one of the nucleotide sequences A (SEQ ID NO 1), B (SEQ ID NO 2), C (SEQ ID NO 4), D (SEQ ID NO 5), E (SEQ ID NO 6), F (SEQ ID NO 7), shown in Figures 1 to 6 respectively, as well as the sequence B 'represented by SEQ ID NO 3, or their complementary sequences, or fragments of these sequences, or any of the above-mentioned sequences modified by substitution and / or addition and / or deletion of one or more nucleotides, said modified fragments or sequences being capable, like the sequences A to F mentioned above, to hybridize with the genome of at least one strain of Erwinia carotovora, in particular a pathogenic strain, and which cannot hybridize with the genome of at least one strain of Erwinia carotovora, including a non-pathogenic strain.
  • the invention relates more particularly to the sequences corresponding to the nucleotide sequences B and B 'represented respectively by SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 3, or to their complementary sequences, or to fragments of these sequences, or to all of the above-mentioned sequences modified by substitution and / or addition and / or deletion of one or more nucleotides, said fragments or modified sequences being capable, like the sequences B and B 'above, of remaining hybridized: - with the genome of the strains of Eca, in particular pathogenic , as well as with the genome of Erwinia carotovora subsp.
  • Ecb betavasculorum
  • the pathogenic strains of Ecb in particular under the hybridization conditions defined below: hybridization in 6 SSC, 0.1% SDS and 0.01% of skimmed milk at 65 ° C overnight , followed more particularly by two washes of 30 minutes at 65 ° C, 0.3 SSC, 0.5% SDS,
  • Eca Erwinia carotovora subsp. atroseptica
  • Eca Erwinia carotovora subsp. atroseptica
  • the pathogenic strains of Eca in particular under the following hybridization conditions: hybridization in 6 SSC, 0.1% SDS and 0.01% skimmed milk at 65 ° C overnight, followed more particularly by two 30-minute washes at 68 ° C, 0.1 SSC, 0.5% SDS.
  • sequences bordering those resulting from the implementation of a genomic subtraction process in the above is meant all sequences as obtained by:
  • this probe consisting of all or part of a denatured nucleotide sequence obtained by genomic subtraction as described above, in particular with all or part of the sequences A to F, and more particularly of the sequences B and B 'mentioned above,
  • step 4) recovery of the DNA fragments obtained in step 4) above, or parts of these DNA fragments, which do not hybridize with the genome of the strain used in the genomic subtraction method and do not contain the sequences obtained by genomic subtraction as described above, in particular with the genome of the non-pathogenic strain, and hybridizing with the genome of the strain from which said sequences obtained by genomic subtraction originate, these DNA fragments representing a bordering sequence of the nucleotide sequence obtained by genomic subtraction and used as a probe during the above-mentioned hybridization step 2) with the denatured DNA of the above-mentioned host cells,
  • bordering sequences according to the invention can also be obtained by lengthening the sequences A to F, or those mentioned above obtained by genomic subtraction, after hybridization of the latter to DNA fragments obtained during step 1) of cloning the aforementioned method, this extension being carried out by nucleotide synthesis (from the 3 ′ side and / or from the 5 ′ side of these sequences) proceeding by pairing of the bases complementary to those appearing on the strands of said genome fragments, with the latter.
  • modified sequence in the foregoing, and below, means in particular any sequence comprising nucleotides such as uracil, inosine, 7 deaza 2 ′ deoxyguanosine triphosphate (cdGTP) etc., and corresponding therefore either to a DNA or to a modified RNA.
  • nucleotides such as uracil, inosine, 7 deaza 2 ′ deoxyguanosine triphosphate (cdGTP) etc.
  • the modified sequences according to the invention have at least about 60% identity with all or part of the above-mentioned nucleotide sequences obtained by genomic subtraction, and more particularly with sequences B and B ′, or with all or part of the bordering sequences mentioned above.
  • the invention relates more particularly to the abovementioned nucleotide sequences in marked form, in particular radioactive, enzymatically, by a fluorescent compound, by a bond to an antigenic molecule (capable of being recognized by antibodies) or to any other molecule capable of '' be directly or indirectly detected using reagents (or even radiation), this linkage possibly being possible via a spacer arm, in particular via a nucleotide sequence consisting of approximately 5 at 100 nucleotides located at least at one of the ends of these sequences.
  • nucleotide sequences according to the invention are advantageously used as nucleotide probes, where appropriate labeled, in particular in the manner indicated above, more particularly for the detection of strains of pathogenic Erwinia carotovora, and more particularly strains of Eca responsible for the black leg, or Ecb strains responsible for the root necrosis of sugar beet.
  • the probes of the invention are capable of hybridizing (in particular under the specific washing conditions defined above) with nucleotide sequences contained in the genome of pathogenic Erwinia carotovora, and more particularly Eca and pathogenic Ecb (the latter sequences being also designated in the foregoing and that which follows, by the expression "specific nucleotide sequences” or “specific sequences"), these specific nucleotide sequences not being contained in the genome of Erwinia carotovora not pathogens, and more particularly in the genome of Erwinia carotovora other than Eca or
  • the probes of the invention consist of sequences of approximately 7 to approximately 300 nucleotides, chosen from within the nucleotide sequences B and B 'mentioned above. Fragments of the abovementioned nucleotide sequences of the invention can advantageously be used in pairs to form what will be called in the remainder of this text pairs of primers, these pairs of primers being used for the amplification of the number of copies of the abovementioned nucleotide sequences, or of the specific nucleotide sequences contained in the genome of the pathogenic strains of Erwinia carotovora, and more particularly of the strains of Eca responsible for the black leg, or of the strains of Ecb responsible for root necrosis.
  • primers allow the amplification (or even the multiplication) of the number of copies of all or part of the specific nucleotide sequences of the genomes of pathogenic Erwinia carotovora, in particular according to the technique
  • the primers according to the invention consist of approximately 5 to approximately 100 nucleotides, and preferably of approximately 15 to approximately 30 nucleotides, and are capable of hybridizing with a region of a nucleotide sequence according to the invention , or a nucleotide sequence according to the invention, or a nucleotide sequence specific for the genome of Erwinia carotovora, and more particularly of Eca and Ecb, this region being different according to the primers within the same pair, so as to allow the amplification of all or part of the above-mentioned nucleotide sequences.
  • These primers can for example be either common to Eca and Ecb, or different depending on the subspecies.
  • primers advantageously consist of approximately 7 to 30 nucleotides derived from the abovementioned nucleotide sequences of the invention, and more particularly from the sequences B and B 'described above, and in particular allow the amplification of fragments from approximately 100 to approximately 300 nucleotides contained in specific nucleotide sequences of the Eca responsible for the black leg.
  • the above-mentioned pairs of primers are chosen so that they hybridize on the 3 ′ side of each of the strands of the abovementioned nucleotide sequences, the 3 ′ ends of each of the primers being directed towards the inside of the sequences to be amplified ( according to the classic PCR technique).
  • a pair of primers from the above-mentioned sequence B is such that the two primers constituting it correspond to the following formulas: B105 5 'TAAGGCAGCATTGAATCGCCACAGAGAGTA 3' (SEQ ID NO 8) B106 5 'ACACGCATTTATCGCTATCAGGCACAACAA 3' (SEQ ID NO 9)
  • the primers B105 and B 106 are capable of specifically hybridizing with the genome of the Eca and / or Ecb mentioned above, for example according to the following steps:
  • the subject of the invention is also any method of detecting and identifying strains of pathogenic Erwinia carotovora possibly present in soil or water, or even in a host, in particular in plants and / or seeds, capable of be a seemingly healthy carrier of such bacteria and being in the latent infection phase, this process comprising the following stages:
  • Triton X100 antioxidant, chelators, alkali, and / or compounds eliminating inhibitors such as polyphenols (polyvinylpyrrolidone for example), or polysaccharides (cetyltrimethylammonium bromide for example), - contacting the sample thus treated with probes, and / or with primers according to the invention,
  • the amplification using pairs of primers according to the invention of the number of copies of the nucleotide sequences specific for pathogenic Erwinia carotovora, and contained in the genome of these bacteria likely to be present in this biological sample, and with which the abovementioned probes or primers are likely to hybridize, and / or the amplification of the number of copies of probes according to the invention,
  • the above-mentioned detection step can be carried out using the aforementioned probes, advantageously labeled, said specific sequences being hybridized with the probes mentioned above.
  • the above-mentioned detection step can be carried out either directly by visualization of the amplification of said specific sequences (for example by visualization of a large mass on gel of electrophoresis corresponding to the amplification carried out, as detailed below), when the primers used are marked, either by hybridization of said sequences thus amplified using the aforementioned labeled probes.
  • a more particular subject of the invention is any method of identifying and detecting pathogenic Eca and / or Ecb which may be present in a host, in particular in plants and seeds, this method being carried out in the manner indicated above, using all or part of a probe consisting of the nucleotide sequence B or B 'mentioned above, optionally labeled, in particular as indicated above, and / or using the pair of primers B105 / B106 above, where appropriate marked, in particular in the manner indicated above.
  • the specific detection of Eca is carried out by hybridization, in particular on the membrane, of said specific sequences, amplified or not, with all or part of the probe B or B 'under the following hybridization conditions: hybridization in 6 SSC, 0.1 % SDS and 0.01% skimmed milk at 65 ° C overnight, followed more particularly by two washes of 30 minutes at 68 ° C, 0.1 SSC, 0.5% SDS.
  • the specific detection of Eca and / or Ecb is carried out either by hybridization of said specific sequences, amplified or not, with all or part of the probe B or B 'under the following hybridization conditions: hybridization in 6 SSC, 0, 1% SDS and 0.01% skimmed milk at 65 ° C overnight, followed more particularly by two washes of 30 minutes at 65 ° C, 0.3 SSC, 0.5% SDS, either directly by viewing the amplification of said specific sequences using primers B105 and B106 labeled.
  • the identification and detection methods of the invention can be carried out from a host showing pathological signs, or advantageously from a host capable of being an apparently healthy carrier of such bacteria and being in phase latent infection.
  • the methods for identifying and detecting Erwinia carotovora, and more particularly Eca or Ecb, according to the invention can also be carried out from any medium in which these bacteria are capable of surviving, in particular in water or soil .
  • the identification methods according to the invention comprise a step of amplifying the number of copies of all or part of the specific nucleotide sequences contained in the genomes of the pathogenic Erwinia carotovora, or of the corresponding RNAs.
  • This gene amplification step can be carried out in vitro or in vivo by any method using conventional techniques of enzymatic amplification of DNA or TARN, such as the LCR (Ligase Chain Reaction) technique. described in particular in the journal PNAS, USA, 88, pp. 189-193 (1991), or the "Q ⁇ Replicase” technique described in the journal Biotechnology (Vol. 6, October 1988), or advantageously the PCR technique as described in particular in the European patent applications of Cetus (n ° 200 362 , 201 184, 229 701 and 258 017), or the 3SR technique described by Fahy et al. in the PCR review
  • the amplification by PCR technique of the number of copies of all or part of the nucleotide sequences contained in the genomes of Erwinia carotovora and / or the amplification of the number of copies of all or part of the probes defined above includes the following steps:
  • the entire procedure can be repeated one or more times from all or part of the medium obtained in the previous step.
  • the sensitivity of the detection can be improved by continuing the method described above by an amplification of the "nested PCR” type, described in "PCR A Practical Approach” edited by MJ McPherson, P. Quirke, GR Taylor, (1991) Oxford University Press, using primers internal to the previously amplified fragment, which leads to the amplification of the copy number of a DNA or RNA fragment shorter than that whose number of copies was initially increased.
  • all the time intervals specified in the methods detailed above can vary among others depending on the apparatus (called cycler or thermocycler) used.
  • the detection of the specific nucleotide sequences is advantageously carried out as follows: - fixation on a solid support (such as a membrane or wells of microtitration plates such as those commonly used in the so-called ELIS A technique, and adapted or not to nucleic acids) of a nucleotide sequence according to the invention, designated below " trap sequence ", with which the above specific nucleotide sequences, or fragments of these sequences, are capable of hybridizing, in particular under the conditions defined above, this fixation being carried out according to usual techniques described in particular by Maniatis et al, 1982 , and by Ausubel et al., 1987,
  • any probes having remained fixed on the solid support after the previous step thus testifying to the presence of specific sequences, or fragments of these sequences in the biological sample, this detection being carried out either directly when the aforementioned probes are radioactively or fluorescently labeled, either indirectly by means of reagents themselves capable of recognizing these probes, in particular using the antibodies or other reagents described above, in the case where these probes are labeled with antigens or molecules capable of being recognized by these antibodies or reagents, respectively.
  • the detection of specific nucleotide sequences which may be present in the sample studied can also be carried out in the following manner:
  • any probes having remained fixed on the solid support after the previous step thus testifying to the presence of specific sequences, or fragments of these sequences in the biological sample, this detection being carried out either directly when the above-mentioned probes are marked in a radioactive or fluorescent manner, either indirectly by means of reagents themselves capable of recognizing these probes, in particular using antibodies or other reagents described above, in the case where these probes are labeled with antigens or molecules capable of being recognized respectively by these antibodies or these reagents.
  • the detection of the specific nucleotide sequences or fragments of these sequences can be carried out by gel electrophoresis of all or part of the reaction medium in which the amplification was carried out.
  • the revelation by visualization of a large (more or less individualized) cluster of sequences at a specific point of the gel, and corresponding to the number of copies of all or part of the specific nucleotide sequences thus amplified, is correlable to the presence of these specific sequences in the sample studied.
  • the amplification of all or part of the aforementioned specific sequences is capable of being detected using probes as described above, in particular according to one of the methods described above.
  • a more particular subject of the invention is the application of the above-mentioned identification and detection methods to the diagnosis of the possible appearance of a pathology caused by Erwinia carotovora, in particular of the black leg caused by Eca, in particular in potato, or root necrosis caused by Ecb, in particular in sugar beet, in a host as defined above.
  • the diagnostic methods according to the invention are carried out by detecting Erwinia carotovora responsible for pathologies, in particular E z responsible for the black leg in Europe, or Ecb responsible for root necrosis in Europe, or any species or sub -species derived later by modification of the current taxonomy.
  • the polymorphism of the nucleotide sequences specific for pathogenic Erwinia carotovora, or fragments of these sequences may be representative of different groups within these erwinias, such as ecotypes, pathotypes (or pathovars) or biotypes of Erwinia carotovora, the polymorphism being in particular demonstrated either by the action of restriction enzymes, by electrophoresis in temperature gradient or denaturing agents, or after hybridization with an RNA fragment by action with RNase A, or by any other method aimed to demonstrate the polymorphism of nucleic acids in solid or liquid phase, in particular by hybridization with probes as described above.
  • the invention also relates to kits for the implementation of a diagnostic method such as described above, characterized in that they comprise at least one probe as defined above, and / or at least a pair of primers such as d written above.
  • kits according to the invention comprise: a solid support, such as a microtiter plate on which is fixed a denatured capture probe represented by an oligonucleotide preferably of about 30 nucleotides, and resulting from a sequence according to the invention,
  • reaction medium which advantageously consists, in the case of the use of the PCR technique, of 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.3, 50 mM
  • kits according to the invention can also include:
  • restriction enzymes one or more restriction enzymes, and, where appropriate, reference restriction fragments characteristic of each of the ecotypes, pathotypes (or pathovars) or biotypes of subspecies of Erwinia carotovora, in particular of Eca or Ecb ,
  • oligonucleotide sequences capable of hybridizing on either side of one (or more) nucleotide (s) located in genes or fragment of genes characteristic (s) of a strain of Erwinia carotovora, and advantageously one (or more) oligonucleotide probe (s) specific (s) to a characteristic region of a determined strain of Erwinia carotovora , in the current state of taxonomy.
  • the invention also relates to the use of the nucleotide sequences defined above for the implementation of a detection method, where appropriate for diagnostic purposes, in a host or in a medium as defined above, of any microorganism or any cell, into the genomes of which the nucleotide sequences according to the invention, have been introduced transiently or definitively. Such a process is advantageously carried out according to one of the methods described above.
  • the invention also relates to the use of the nucleotide sequences defined above, as markers of cells or micro ⁇ organisms genetically modified by the introduction or not into their genome of these nucleotide sequences, or of hosts cells infected (or transformed) by such microorganisms, in particular for monitoring the evolution of these cells, microorganisms and cellular hosts in a determined environment.
  • the invention relates in particular to plant cells (for example protoplasts) transformed with a vector chosen from those derived from the plasmids Ti and Ri of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes respectively, these plasmids containing in one of their non-sites essential for their replication and the transformation of plant cells, a nucleotide sequence according to the invention.
  • the invention also relates to plants regenerated from these transformed cells.
  • the invention also relates to animal cells transformed with a vector derived for example from retroviruses and containing a nucleotide sequence of the invention.
  • the invention also relates to any process for obtaining the abovementioned nucleotide sequences.
  • the preparation of these nucleotide sequences can be carried out either by a chemical process, or by other processes, such as amplification by LCR or PCR or other method of gene amplification.
  • An appropriate mode of preparation of these nucleotide sequences (comprising a maximum of 200 nucleotides, or base pairs when it is a question of double-stranded nucleic acids) of the invention by chemical route (in the current state of the art in this field ) comprises the following steps: - DNA synthesis using for example the automated method ⁇ -cyanethyl phosphoramidite described in Bioorganic Chemistry 4; 274-325, 1986,
  • a method of preparation, by chemical means, of nucleic acids of length greater than 200 nucleotides - or base pairs comprises the following steps:
  • the preparation of the nucleic acids of the invention can also be carried out by biological means, in particular after cloning of cellular hosts whose genome is likely to contain these nucleotide sequences, if necessary, after transformation of the genome of these hosts using suitable vectors containing these nucleotide sequences.
  • the present invention relates to any vector, in particular plasmid, containing in one of its sites not essential for its replication, a nucleotide sequence according to the invention.
  • the invention also relates to any cellular host transformed by a vector according to the invention, and in which said vector, or the nucleotide sequence according to the invention, integrated into the genome of the host, is capable of replicating.
  • the invention relates more particularly to the DH5 ⁇ strain of Escherichia coli transformed by the plasmid pPMV176 itself obtained by insertion of the nucleotide sequence B represented in FIG. 2, into the Bam ⁇ l site of the plasmid pTZ19R described in the article by Mead and al., (1985).
  • the present invention thus relates to a process for obtaining the abovementioned nucleotide sequences, carried out by:
  • the subject of the invention is the use of the nucleotide sequences according to the invention, and more particularly the sequences A, B, B ', C, D, E and F mentioned above, for the implementation the process of specific identification of strains (or groups of strains) or possible pathovars within the different strains of Erwinia carotovora existing.
  • the invention also relates to the use of the above-mentioned sequences for the implementation of the process for the specific identification of Erwinia carotovora subspecies, in particular Eca or Ecb, (or groups of subspecies such as the group formed by Eca and Ecb), within the species Erwinia carotovora.
  • the invention more particularly relates to the use of probes B or B 'and / or primers B105 / B106 for the implementation of methods as described above, for specific identification of the strains of Ec ⁇ and / or Ecb whether pathogenic or not, or of the subspecies Eca and / or Ecb within the Erwinia carotovora.
  • a more particular subject of the invention is also the above-mentioned sequences ⁇ and F, as well as their use for the implementation of a method of specific identification of different strains or pathovars of Eca, in particular according to the techniques described above. .
  • Bacterial strains and plasmids The bacterial strains and plasmids used for the implementation of the genomic subtraction method used to obtain the sequence B are described in Table 1. The microorganisms tested in the context of dot-blot hybridization experiments (spot deposits) with the probes obtained are presented in table 2. The strains of Erwinia and Escherichia coli were cultivated on Luria medium (Miller 1972) at 30 ° C. and 37 ° C respectively. Antibiotics were used at the following concentrations: ampicillin 50 ⁇ g / ml and streptomycin 100 ⁇ g / ml. X-gal (O-nitrophenyl- ⁇ D- galactopyranoside, Sigma) was used at a concentration of 40 ⁇ g / ml.
  • Total genomic DNA was extracted and purified by the method of Klotz and Zimm (1972).
  • the target DNA was digested with Sau3Al according to the manufacturer's recommendations (Boehringer Mannheim). After digestion, the DNA was extracted once with the phenol-chloroform mixture, precipitated, washed and resuspended at 0.1 ⁇ g / ⁇ l in EE buffer pH 8.0 [10 mM N- (2-hydroxyethyl) -piperazine -N '- (3-propanesulfonic acid), 1 mM EDTA].
  • the genomic DNA for the dot-blot tests was extracted as described above with volumes reduced by 10 times. Each DNA was checked by UV spectrophotometry and electrophoresis after digestion with EcoRI (Boehringer Mannheim).
  • the DNA was labeled using the "random primer” DNA labeling kit from Boehringer Mannheim according to the manufacturer's instructions, 4 hours at room temperature.
  • the biotinylated AD ⁇ is extracted four times with 1-butanol (saturated with water), precipitated with ethanol, washed and resuspended at the concentration of 2 , 5 ⁇ g / ⁇ l in 2.5 EE buffer, pH 8.
  • Genomic Subtraction The nucleotide sequences A to F shown respectively in FIGS. 1 to 6, are obtained by genomic subtraction between two strains of Erwinia carotovora, one of these two strains being pathogenic, while the other is not pathogenic (at least under the conditions, in particular climatic conditions, where the previous strain is pathogenic).
  • the pathogenic Erwinia carotovora strain is a strain of Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca) responsible for the black leg in certain plants (in particular in the potato) in the climates where prevails, at least for a certain time, a temperature of approximately 15 ° C to approximately 25 ° C, and the strain non-pathogenic Erwinia carotovora, at least under the temperature conditions mentioned above, is a strain of Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc).
  • Eca Erwinia carotovora subsp. atroseptica
  • This genomic subtraction method is preferably carried out in the manner following: the DNA of the Ec ⁇ strain, or target DNA, is cut into small fragments, of approximately 100 to approximately 1,000 nucleotides, by the action of restriction enzymes,
  • the DNA of the strain of Ecc, or trap DNA is cut into fragments, of approximately 1,000 to approximately 10,000 nucleotides, by sonication, these fragments being subsequently labeled, for example with biotin or other molecule allowing the detection and recovery of nucleic acids (for example by trapping),
  • the above-mentioned fragments of target DNA and of trap DNA are mixed in proportions such that the trap DNA is in excess relative to the target DNA, in particular in a range of trap DNA / target DNA ratios of approximately 2 at 100, and advantageously in a ratio of approximately 40, - the target and trap DNA fragments thus mixed are denatured by heating, in particular at a temperature of approximately 100 ° C., which leads to the formation of fragments of Target DNA and single strand trap,
  • the single-stranded DNA fragments obtained in the previous step are placed in hybridization conditions such that they allow the formation of double-stranded DNA fragments consisting of two strands of target DNA
  • target homoduplex or of two strands of trap DNA (homoduplex trap), or of a strand of target DNA and of a strand of trap DNA (heteroduplex), in particular under relatively few hybridization conditions stringent (not very drastic) at a temperature of around 65 ° C in the presence of 1M NaCl, - the double-stranded DNA fragments obtained in the preceding hybridization step, are then placed in the presence of a reagent having an affinity for the abovementioned marker, for example avidin or streptavidin having an affinity for biotin (dissociation constant of approximately 10 " ⁇ M), this reagent being immobilized on a solid support (such as beads), so that the labeled homoduplexes and heteroduplexes, in particular biotinylated, remain fixed on the solid support by bonding between the marker used to mark the trap DNA and the abovementioned reagent, in particular on the beads coupled to avidin or to streptavidin,
  • ligation of oligonucleotide adapters of known sequences, on either side of the specific nucleotide sequences (target homoduplex), this ligation being carried out in particular by the action of an enzyme of the ligase type, and amplification of the number of these specific nucleotide sequences by implementing a method of amplification (or multiplication or replication) of the number of copies of said specific nucleotide sequences, in particular according to techniques PCR (Polymerase Chain Reaction), 3SR (Self-Sustained Replication Sequence) or any other technique using hybridization between nucleic acids and making it possible to detect an initially low number of nucleic acids determined by multiplying the number of copies of these.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • 3SR Self-Sustained Replication Sequence
  • the aforementioned amplification method can be carried out according to the PCR and 3SR procedures described below.
  • the adapters used can have the following nucleotide sequence: 5 'CACTCTCGAGACATCACCG 3'.
  • the homoduplex fragments of target DNA obtained and amplified by the above methods can be isolated and multiplied in pure form, in particular by cloning in an appropriate vector.
  • the strain of Eca is the strain 86.20 deposited at the National Collection of Culture of Microorganisms (CNCM) of the Institut Pasteur in Paris on March 30, 1993 under the number 11295, and the strain of Ecc is the strain CH26 deposited at the CNCM on March 30, 1993 under the number 11294.
  • 10 ⁇ g of biotinylated trap DNA and 250 ng of digested target DNA were used for the first cycle of genomic subtraction according to the protocol of Straus and Ausubel .
  • the hybridization mixture is then taken up in 100 ⁇ l of EEN buffer, pH 8.0 (0.5 M NaCl, 10 mM N- (2-hydroxyethyl) -pi ⁇ érazine-N '- (3-propane sulfonic acid) (EPPS ), 1 mM EDTA) and vigorously mixed (Nortex).
  • EEN buffer pH 8.0 (0.5 M NaCl, 10 mM N- (2-hydroxyethyl) -pi ⁇ érazine-N '- (3-propane sulfonic acid) (EPPS ), 1 mM EDTA) and vigorously mixed (Nortex).
  • EPPS mM N- (2-hydroxyethyl) -pi ⁇ érazine-N '- (3-propane sulfonic acid)
  • 1 mM EDTA vigorously mixed
  • the mineral oil is gently removed, and 100 ⁇ l of a 5% solution of magnetic beads covered with streptavidin, washed and
  • the mixture is then placed on a filter suitable for the Eppendorf tube, and filtered by centrifugation 6,000 g, 15 s.
  • the hybridization tube is rinsed with 200 ⁇ l of EE ⁇ buffer, and the rinsing liquid is placed on the filter and centrifuged under the same conditions.
  • the whole of the filtrate is precipitated with 1 ml of absolute ethanol, 5 min at -80 ° C., centrifuged for 30 min at 10,000 g.
  • the (invisible) pellet is rinsed with absolute ethanol and dried. The pellet is then resuspended in 4 ⁇ l of biotinylated trap DNA (10 ⁇ g).
  • the resuspension must be thorough and be carried out all along the wall of the tube (outside side, centrifugal force).
  • the resuspended DNA is brought to the boil for 1 min, and 1 ⁇ l of 5 M NaCl is added.
  • the mixture is placed at 65 ° C for 17 hours for a new cycle of subtractive hybridization. After four cycles of subtraction, the precipitated DNA is resuspended in
  • the primers are left to hybridize in the water bath until it has returned to room temperature.
  • the mixture is taken up in 20 ⁇ l of TE buffer pH 8.0 (Tris EDTA) and filtered through mini-column of sepharose CL-6B by centrifugation for 5 min at 2000 g.
  • the filtrate is extracted once with phenol-chloroform and precipitated with absolute ethanol, the dried pellet is resuspended in 5 ⁇ l of TE buffer.
  • the plasmids used for cloning are those described in Table 1.
  • the ligation procedure is the same as described above, with a 1: 1 ratio.
  • the DH5 ⁇ strain of Escherichia coli was transformed by electroporation (Ausubel et al. 1987).
  • the tank is placed in the device and the solution subjected to an electric current (set to 2.5 KV, 25 mF and 400 W).
  • an electric current set to 2.5 KV, 25 mF and 400 W.
  • One ml of SOC medium (0.5% yeast extract, 2% tryptone, 2 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM KgCl2, 10 mM MgS ⁇ 4, 20 mM glucose
  • SOC medium 0.5% yeast extract, 2% tryptone, 2 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM KgCl2, 10 mM MgS ⁇ 4, 20 mM glucose
  • Colonies resistant to the antibiotic are counted, and dilutions are made on the mixtures to obtain a concentration of 300 bacteria per 100 ⁇ l, knowing that approximately half of the bacteria will be dead during their storage at 4 ° C. All the processing mixes are spread out,
  • Nylon membranes (Hybond N + , Amersham), cut to the size of the dishes, are gently applied to the colonies, and membrane / dish position marks are marked. The membranes are then carefully removed and placed on blotting paper impregnated with lysis solution (Tris HC1 50 mM pH 8.0, sucrose 25%, EDTA 10 mM, lysozyme 1.5 ⁇ g / ml), 5 min, side in contact with bacteria up.
  • lysis solution Tris HC1 50 mM pH 8.0, sucrose 25%, EDTA 10 mM, lysozyme 1.5 ⁇ g / ml
  • the membranes are then transferred to a blotting paper impregnated with denaturing solution (NaOH 0.5 N, 1.5 M NaCl, Triton X100 0.2%), 5 min, then on neutralizing solution, twice 5 min (Tris HC1 0 , 5 M pH 8.0, NaCl 2.5 M).
  • denaturing solution NaOH 0.5 N, 1.5 M NaCl, Triton X100 0.2%)
  • the membranes are then dried and baked for 1 hour in an oven at 80 ° C under vacuum, to fix the DNA.
  • the boxes containing the bacteria are stored at 4 ° C.
  • the membranes are prehybridized and hybridized, using as probe labeled with ⁇ ⁇ p all the fragments from PCR.
  • the radioactive labeling and hybridization protocols are described below.
  • the colonies presenting a hybridization signal are identified by the orientation of the membranes, autoradiographs and culture dishes. These colonies are removed with a toothpick, inoculated with 10 ml of medium L, with ampicillin and incubated at 37 ° C. with shaking overnight. The cultures are centrifuged for 10 min at 6000 g. The pellet is included in
  • the DNA purified by electroelution are mixed with an equal amount of vector (50 ng of each).
  • it is the plasmid pTZ19R, carrying the resistance to ampicillin and the ⁇ fragment of the ⁇ -galactosidase gene (lacZ).
  • the plasmid is opened by restriction with the enzyme Bam ⁇ l, the site of which is located in lacZ. Ligation and transformation are carried out as above.
  • the bacteria are then spread on medium containing ampicillin (100 ⁇ g / ml), IPTG (Isopropylthiogalactoside; inducer) and the substrate of the enzyme, X-gal (O-nitrophenyl- ⁇ D-galactopyranoside, 100 ⁇ g / ml).
  • the colonies containing a plasmid are selected by ampicillin, the colonies containing a plasmid with insert are identified by the absence of ⁇ -galactosidase activity: the white colonies are mutated by insertion into lacZ, the blue colonies have a ⁇ - system functional galactosidase.
  • the white colonies are selected and analyzed as above.
  • the volume is made up to 14 ⁇ l with sterile distilled water, brought to the boil for 3 min, and the tube immersed in ice.
  • One ⁇ l of polymerase (Klenow fragment) and 5 ⁇ l of ( ⁇ ⁇ P) dATP (50 ⁇ Ci) are added.
  • the mixture is left to incubate for 4 hours at room temperature.
  • the labeled probe is then purified (stripped of the non-incorporated labeled nucleotides and of short non-specific oligonucleotides) by filtration on Sepharose CL-6B, in a 0.5 ml Eppendorf tube pierced, placed in a 1.5 ml tube, in centrifuging for 5 min at 2,000 g.
  • the effectiveness of the marking is checked with the ⁇ -ray detector.
  • the probe is denatured just before hybridization by boiling for 3 min, and the tube immersed in ice.
  • DNA hybridization in "dot-blot" or deposit in spots The DNA of different microorganisms (Table 2) were denatured and fixed by the alkaline method proposed for Hybond N + membranes (Amersham). The genomic DNA for the Southern method was treated using several endonucleases according to the manufacturer's instructions (Boehringer, Mannheim). The reaction mixtures were run on 0.8% agarose gel using 1 ⁇ g of size marker (1 kb of BRL ladder). The Southern method was carried out on Hybond N + membranes according to the manufacturer's instructions. Preparation of membranes.
  • DNA per sample Two ⁇ g of DNA per sample, in a volume of 1.5 ⁇ l are mixed with an equal volume of a sodium hydroxide solution (0.4 M NaOH, 1 mM EDTA) and deposited on a nylon membrane (Hybond N + , Amersham). When all the samples have been deposited, the membrane is placed, DNA side up, for 5 minutes on blotting paper impregnated with a denaturation solution (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl), then 1 minute on a neutralization solution (Tris HC1 0.5 M pH 7.2, NaCl 1.5 M, EDTA 1 mM), 20 min on a fixing solution (NaOH 0.4
  • Two to three ⁇ g of DNA per sample are digested with restriction enzymes and separated by electrophoresis on a large 0.8% agarose gel (300 ml). After reading, the gel is treated to transfer the DNA to a nylon membrane. The gel is treated twice 15 min in 0.25 M HCl, rinsed with distilled water, incubated twice 15 min in denaturing solution (1 M NaOH, 1.5 M NaCl), rinsed with distilled water and 30 min in neutralizing solution (Tris HC1 0.5 M, NaCl 1.5 M pH 7.5).
  • the membranes are prehybridized, at 65 ° C., with stirring, at least one hour in a solution of 6X SSC, 0.5% SDS, 0.01% skimmed milk.
  • the hybridization is carried out in a volume of 10 ml, in a sealed plastic bag, in a solution of 6X SSC, 0.1% SDS, 0.01% skim milk containing the denatured probe, 17 hours at 65 ° C.
  • the membrane is washed once in 3X SSC, 0.5% SDS, at 65 ° C, twice in 0.3X SSC, 0.5% SDS at 65 ° C, and for stringent conditions twice in 0.1X SSC, SDS 0.5% at 68 ° C.
  • the membrane is then slightly wiped and then placed in plastic film.
  • the membrane depending on the number of strokes / min observed on the ⁇ -ray counter, is placed for a longer or shorter time in the presence of a self-radiography film in a cassette at -80 ° C. Autoradiography is then developed.
  • Sequencing is carried out directly on double-stranded plasmid with two primers chosen from the lacZ gene sequence 150 nucleotides away from the cloning site.
  • the sequence reaction is carried out by the "dideoxychain termination" method of Sanger et al. (1977), using the SequenaseT kit (United States Biochemical Corporation).
  • the direct primer and the reverse primer are used separately.
  • a first elongation step starting from the primer is carried out by DNA polymerase (sequenase) in the presence of a limiting amount of dNTP and ( ⁇ ⁇ P) dATP for 5 min at room temperature.
  • the reaction mixture is then distributed, for each sample, into four wells containing dNTP in non-limiting quantity and for each of these wells one of the dideoxynucleotides (ddATP, ddCTP, ddGTP or ddTTP).
  • This reaction is carried out for 5 min at 37 ° C. and is then stopped by adding EDTA.
  • the samples can be stored at -20 ° C and will be brought to the boil for 2 minutes just before being deposited on gel, their deposition being always carried out in the order of ddATP, ddCTP, ddGTP and ddTTP.
  • the different fragments are separated by electrophoresis in acrylamide gel (6%, urea 460 g / 1 in TBE buffer), 80 cm long, at a constant power of 100 W (duration 3-6 h).
  • the gel is then removed from the mold and fixed in a 10% methanol, 10% acetic acid mixture, transferred to Whatmann 3M paper, covered with plastic film, and the whole is dried by heat and under vacuum in a gel dryer.
  • the gel is then placed with an autoradiography film in a cassette, for a variable duration, according to the number of strokes / min at the ⁇ -ray counter.
  • the sequences are then read and entered on a computer for analysis.
  • the programs used are those of the GCG (University of
  • the number of subtraction cycles was determined using the following two criteria: binding of homologous sequences and enrichment in non-homologous sequences.
  • Two libraries were obtained with the following pairs: (i) 100 ng of fragment ⁇ digested with Sa ⁇ iAl and labeled with ⁇ 32 P, 2 kb of the DNA fragment Sm r / Spc r (Prentki and Krisch 1984), were mixed with 150 ng of the genomic DNA of the strain 3937 digested with Sau Al, and subtracted with the biotinylated DNA of the strain 3937, (ii) 250 ng of DNA of the strain 3937 digested with Sau3Al and labeled with ⁇ 32 P was subtracted with the biotinylated DNA from 3937.
  • target DNA / trap DNA Four cycles of subtraction hybridization were carried out for each of the following pairs (target DNA / trap DNA): (i) positive control strain PMV 4071 / strain 3937 (omega insertion fragment ( ⁇ ) of the mutant 4071 in the strain Ech 3937 as target DNA and strain 3937 as trap DNA), (ii) the library subtracted between 8620 and CH26 (strain 8620 of Ec ⁇ as source of probes and CH26 of Ecc as DNA trap) and (ii) a negative CH26-CH26 control. The results of the subtraction are shown in Figure 1. The positive control shows two amplified fragments of 230 and 300 bp approximately.
  • the restriction enzyme treatment is Sau3Al of the ⁇ fragment generated eight main fragments of 460, 300, 230, 190, 150, 140, 80 and 60 bp. Among all these fragments, only a part (33% of the fragment) was re-isolated by genomic subtraction.
  • the differential library between Eca and Ecc presents 6 main DNA fragments (190, 200, 250, 300, 400 and
  • the cloning vector used in this case was pTZ-19R treated with -B ⁇ HI, the white colonies of transformed E. coli DH5 ⁇ were selected on X-gal medium.
  • This second strategy led to the production of 4 clones containing inserts.
  • the six clones were named A, B, C, D, ⁇ and F respectively in order of decreasing size (see Figure 2, and Table 1). d) hybridization experiments
  • Hybridizations were carried out with the six probes. For most strains, the hybridizations were carried out at least twice on separate membranes. Table 2 illustrates the results.
  • the E and F probes give a signal only for a limited number of Ec ⁇ strains.
  • Probe A gives a positive signal for most of the strains tested, including the Ecc strains, and is absent in certain strains and in that of the trap DNA.
  • the results obtained with probe B are shown in FIG. 3. Under stringent washing conditions, only the typical Ec ⁇ strains are hybridized, and under less stringent washing conditions some cross hybridizations have been observed with strains of Ecb.
  • the B probe is therefore very specific for Eca, as is the B 'probe (which differs from the B probe only by one nucleotide less), the latter making it possible to find the same sequence of 200 nucleotides in strains 88.33, 15.26, CH3 and 88.1 of Ec ⁇ .
  • the C probe all the typical strains of Ec ⁇ present a positive signal and a few strains of Ecc also.
  • Concerning probe D all the strains of Ec ⁇ ("atypical and typical") and some strains of Ecc were hybridized.
  • Ec ⁇ strain 86.20 DNA was digested with several endonucleases
  • probes A, B, C, D, ⁇ and F were obtained. The results are shown in FIG. 5.
  • homologies were sought on the Genbank and ⁇ MBL databases. No significant homology was observed for the sequences with the exception of probe A, which exhibits significant homology with the sequence of the put? of Salmonella typhimurium and E. coli. This gene codes respectively for a proline permease (73.8% homology) and a proline transporter (73.2% homology).
  • TABLE 1 Bacterial and plasmid strains
  • thermosensitive episome bearing transposon Tn 10 Utilization of a thermosensitive episome bearing transposon Tn 10 to isolate Hfr donor strains of Erwinia carotovora subsp. chrysanthemi. J. Bacteriol. 150: 122-131.
  • AAAATCGCAG ACAGCAGAAT GCCGGCAATC CACGGATTGA ACAGCAGCAT AGATAGCTCG 360 ATAAAGACGC GCTCGCTATT TTGCGCCACG TTACCCGCCT GATC 404

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Abstract

La présente invention a pour objet des séquences nucléotidiques caractéristiques du génome de bactéries de l'espèce Erwinia carotovora, responsables de pathologies telles que la jambe noire de la pomme de terre. L'invention vise également l'utilisation de ces séquences nucléotidiques pour la mise en ÷uvre de méthodes d'identification et de détection des Erwinia carotovora, et de diagnostic des pathologies causées par ces bactéries.

Description

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CARACTERISTIQUES DES ERWINIA CAROTOVORA.
La présente invention a pour objet des séquences nucléotidiques issues du génome de bactéries de l'espèce Erwinia carotovora, et plus particulièrement des Erwinia carotovora pathogènes chez certaines plantes, ces séquences étant utilisables, notamment en tant que sondes et amorces, pour la détection de ces bactéries chez des hôtes susceptibles d'être infectés par ces dernières, ou dans tout milieu où ces bactéries sont susceptibles de survivre.
Une étude effectuée en 1988 indiquait que les pertes mondiales dues aux maladies des plantes s'élevaient couramment à 60 milliards de dollars par an. C'est dire l'importance que représente la détection rapide et spécifique des agents phytopathogènes, qui devrait conditionner les pratiques culturales et les choix des produits phytosanitaires, de leur dosage, du moment de leur application, et pour éviter l'agression de l'environnement.
Les mesures prophylactiques, nécessitant donc une détection rapide, sensible et fiable, constituent encore de nos jours un des moyens les plus efficaces et les moins coûteux, tant au niveau financier qu'à celui de l'environnement, de lutte contre les maladies, et en particulier contre les bactérioses pour lesquelles peu de moyens de lutte sont disponibles, l'utilisation d'antibiotiques étant prohibée dans la majorité des pays. Ces mesures prophylactiques consistent essentiellement à produire du matériel, en particulier de propagation, sain, et éventuellement à détruire les lots contaminés, en stérilisation ou tout autre procédé de désinfection de l'ensemble des matériaux, locaux et substrats de culture susceptibles d'être en contact avec les plantes et les semences, en choisissant des lieux de production sains.
Le dépistage des pathologies d'origine bactérienne chez les plantes n'a cependant pas été satisfaisant jusqu'à présent, et des pertes importantes de plantes mono- et di-cotylédones sont fréquemment observées au champ, en serres ou durant leur stockage.
Une des causes principales de ce problème est l'utilisation de semences, au sens large, apparemment saines, mais qui sont en réalité porteuses de bactéries susceptibles d'être à l'origine du développement futur de pathologies chez les plantes obtenues à partir de ces semences. On parlera alors de bactérioses en phase latente d'infection. De nombreuses pathologies de plantes sont caractérisées par une phase latente d'infection. Durant cette phase, le niveau d'infection est généralement inférieur à celui qui pourrait être détecté par inspection visuelle (absence de symptômes apparents) ou par les techniques courantes disponibles actuellement (isolement et caractérisation microbiologique, indexage, immunologie...).
Une autre source importante de contamination des plantes viendrait également de l'environnement naturel ou artificiel, notamment des sols et de l'eau.
Il faut noter également que l'isolement et la caractérisation microbiologique sont en général des techniques longues et laborieuses, susceptibles d'être d'un coût trop élevé pour envisager de les appliquer à grande échelle, tandis que les méthodes immunologiques ne présentent pas toujours la spécificité et la sensibilité désirées.
Les bactéries pectinolytiques du genre Erwinia (encore désignées ci-après erwinias) sont responsables d'un grand nombre de pathologies de ce type, dont l'un des symptômes est la macération des tissus chez un grand nombre de plantes et de semences. Ces bactéries sont notamment capables d'infecter la pomme de terre, le maïs, la tomate, la betterave à sucre, le chou, l'endive, etc., ainsi que les plantes de serres, telles que les plantes ornementales qui sont couramment commercialisées entre pays.
Parmi ces erwinias, on peut citer principalement d'une part Erwinia carotovora, et plus particulièrement Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc), Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), Erwinia carotovora subsp. odorifera (Eco), Erwinia carotovora subsp. betavasculorum (Ecb), et Erwinia carotovora subsp. wasabiae, et, d'autre part, Erwinia chrysanthemi (Ech),
.Erwinia cactecida ...
Ces bactéries produisent plusieurs enzymes extracellulaires capables d'attaquer les composants de la paroi cellulaire; pectinases, cellulases, hémicellulases et protéases (pour une revue détaillée, voir l'article de A. Kotoujansky paru dans Ann. Rev. Phytopathol. 1987, 25 : 405-30).
Erwinia carotovora a été particulièrement étudiée en raison de son pouvoir pathogène sur plusieurs plantes, et surtout chez la pomme de terre (Pérombelon, 1989). L'espèce Erwinia carotovora (Ec) est actuellement divisée en cinq sous- espèces : atroseptica (Eca), carotovora (Ecc), odorifera (Eco) et wasabiae (Ecw) précédemment citées, ainsi que la sous-espèce betavasculorum (Ecb).
Cette classification a été réalisée sur la base de caractéristiques physiologiques et biochimiques, ainsi que sur leur pouvoir pathogène. Eca et Ecb paraissent relativement proches taxonomiquement. Ecb est responsable d'une pourriture de la betterave, dite nécrose racinaire (Thomson et al., 1981). L'action des Eca est généralement limitée à la pomme de terre dans des climats tempérés frais, à des températures comprises entre environ 18°C et environ 20°C (Pérombelon, 1980). Quelques souches, non isolées à partir de la pomme de terre, ont été décrites comme étant des Eca "atypiques" en raison du fait qu'elles présentent quelques caractéristiques physiologiques particulières, comme par exemple leur capacité de se développer à 37°C (Lopez et al., 1989). Une nouvelle sous-espèce, dénommée odorifera (Eco) a été récemment décrite comme représentant des souches "atypiques" qui sont pathogènes au moins sur l'endive et produisent des métabolites volatiles odorants (Gallois et al., 1992). D'autres souches d'Eca "atypiques" ont été identifiées comme étant des souches d'Ecc sur la base de caractéristiques phénotypiques et génotypiques (S. Priou, thèse ENSAR, Rennes, 1992). A l'inverse, Ecc est largement répandue dans le monde et présente une large spécificité d'hôtes (Pérombelon et Kelman 1987,
Smith et Bartz 1990).
Les principales pathologies de la pomme de terre causées par ces bactéries, et plus particulièrement par Eca, sont les suivantes : manque à la levée, fonte de semis, jambe noire, pourriture aérienne de la tige, dessèchement et pourriture des tubercules, et flétrissement aérien (Pérombelon et Kelman
1987). Les pathologies correspondant à la non-levée et à la jambe noire surviennent principalement à partir des tubercules mères et peuvent causer des pertes importantes dans les champs. Eca est considérée comme l'agent typique de la jambe noire en Europe en raison de son pouvoir pathogène à faible température, et de sa capacité à induire la maladie de façon précoce en végétation, ce qui augmente les pertes. La plupart des souches d'Ecc ne peuvent pas produire de symptômes typiques de jambe noire à faible température. Ecc est considérée comme un agent opportuniste plutôt que comme un agent causal primaire de la maladie. Toutefois Ecc présente un pouvoir pathogène accru à des températures supérieures ou égales à environ 25 °C et est l'agent causal primaire de la jambe noire de la pomme de terre en Arizona et dans le Colorado (Stanghellini et Meneley, 1975).
Comme nous l'avons vu précédemment, le contrôle de ces pathologies bactériennes repose essentiellement sur les mesures prophylactiques, et les moyens de détection sont donc particulièrement importants (Lelliott et Stead,
1987). La présente invention a pour but de fournir des séquences nucléotidiques permettant de différencier les souches (ou groupes de souches) de l'espèce Erwinia carotovora entre elles.
L'invention a également pour but de fournir des séquences nucléotidiques susceptibles de différencier les sous-espèces d'Erwinia carotovora entre elles.
Un autre but de la présente invention est celui de différencier les souches pathogènes d'Erwinia carotovora de celles qui ne sont pas pathogènes, que ces souches appartiennent ou non à une même sous-espèce d'Erwinia carotovora. La présente invention a également pour but de fournir des procédés fiables de détermination spécifique de la présence de souches d'Erwinia carotovora pathogènes chez un hôte (notamment plantes ou semences) susceptibles d'être porteur de telles bactéries, ou encore dans le sol et l'eau.
La présente invention a pour but de fournir un procédé fiable de détermination spécifique de la présence d'Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), et/ou d'Erwinia carotovora subsp. betavasculorum (Ecb), chez un hôte tel que décrit ci-dessus.
La présente invention a plus précisément pour but de mettre à la disposition d'utilisateurs potentiels, des méthodes fiables de diagnostic précoce des pathologies causées par les bactéries de l'espèce Erwinia carotovora, et plus particulièrement de la jambe noire de la pomme de terre causée par Eca, ou de la nécrose racinaire causée par Ecb, à savoir des méthodes permettant de faire le diagnostic de la présence de ces bactéries et donc du risque d'apparition de ces pathologies, ou d'identifier les souches bactériennes responsables de ces pathologies. L'invention a plus précisément pour but de fournir de nouvelles séquences nucléotidiques utilisables en tant que sondes ou amorces pour la mise en oeuvre de ces méthodes de diagnostic, notamment par les techniques procédant par hybridation entre acides nucléiques (ARN et/ou ADN), éventuellement suivie par l'amplification du nombre de copies de séquences cibles à détecter, par exemple suivant les techniques d'amplification génique dites PCR (Polymerase
Chain Reaction), LCR (Ligase Chain Reaction) et 3SR (Self-Sustained Séquence Replication).
L'invention a également pour but de mettre à la disposition d'utilisateurs potentiels, des kits de diagnostic pour la mise en oeuvre des méthodes de diagnostic et d'identification susmentionnées.
L'invention est illustrée à l'aide des figures 1 à 6 représentant respectivement les séquences nucléotidiques A à F décrites ci-après. La présente invention a pour objet les séquences nucléotidiques comprenant tout ou partie des séquences telles qu'obtenues par soustraction génomique entre deux souches différentes d'Erwinia carotovora, ou comprenant tout ou partie des séquences bordant ces dernières sur le génome de la souche d'Erwinia carotovora dont sont issues les séquences obtenues par soustraction génomique, lesdites séquences nucléotidiques étant susceptibles de s'hybrider avec le génome (ou plus précisément une partie du génome) d'au moins une souche bactérienne appartenant à l'espèce Erwinia carotovora, et ne pouvant pas s'hybrider avec le génome d'au moins une souche appartenant à cette même espèce.
Les séquences bordantes susmentionnées sont avantageusement obtenues à partir des séquences décrites ci-dessus elles-mêmes obtenues par soustraction génomique (par exemple à l'aide des séquences A à F selon l'invention), notamment selon les méthodes décrites ci-après. L'invention a plus particulièrement pour objet les séquences nucléotidiques telles que décrites ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles de s'hybrider avec le génome d'au moins une souche bactérienne appartenant à une sous-espèce déterminée d'Erwinia carotovora, mais pas avec celui d'au moins une souche appartenant à une sous-espèce d'Erwinia carotovora différente de la précédente, ou susceptibles de s'hybrider avec le génome d'au moins une souche appartenant à une sous-espèce déterminée d'Erwinia carotovora, mais pas avec celui d'au moins une souche appartenant à cette même sous-espèce.
L'invention vise également les séquences nucléotidiques telles que décrites ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles de s'hybrider avec le génome d'au moins une souche bactérienne pathogène chez une plante déterminée, mais pas avec celui d'au moins une souche non pathogène chez cette même plante, cette souche non pathogène appartenant ou non à la même sous- espèce d'Erwinia carotovora que la souche pathogène précédente.
Il convient de signaler que l'on entend par souche non pathogène, dans ce qui précède et ce qui suit, par opposition à une souche pathogène, toute souche n'étant pas capable d'induire l'apparition d'une pathologie, et plus particulièrement d'un type de pourriture, chez une plante déterminée, dans les conditions classiques (et l'état actuel de connaissances dans ce domaine), notamment climatiques et géographiques, dans lesquelles ladite souche pathogène susmentionnée est capable d'induire l'apparition d'une pathologie chez cette plante.
Par exemple, la sous-espèce Eca peut être caractérisée, dans l'état actuel des connaissances, par sa capacité à provoquer un symptôme dit de jambe noire sur tige de pomme de terre, entre 18 et 22°C, et dans tous les cas à une température inférieure à 25 °C, l'humidité relative ambiante étant suffisante.
La soustraction génomique décrite ci-dessus entre les deux souches d'Erwinia carotovora est réalisée de la manière suivante: - l'ADN d'une première souche d'Erwinia carotovora, ou ADN cible, est coupé en petits fragments, d'environ 100 à environ 1 000 nucléotides, notamment par action d'enzymes de restriction,
- l'ADN d'une deuxième souche d'Erwinia carotovora, ou ADN piège, est coupé en fragments, d'environ 1 000 à environ 10 000 nucléotides, notamment par sonication, ces fragments étant par la suite marqués,
- les fragments susmentionnés d'ADN cible et d'ADN piège sont mélangés dans des proportions telles que l'ADN piège soit en excès par rapport à l'ADN cible,
- les fragments d'ADN cible et piège ainsi mélangés sont dénaturés par chauffage, ce qui conduit à la formation de fragments d'ADN cible et piège simple brin,
- puis les fragments d'ADN simple brin obtenus à l'étape précédente sont placés dans des conditions d'hybridation telles qu'elles permettent la formation de fragments d'ADN double brin constitués de deux brins d'ADN cible (homoduplex cible), ou de deux brins d'ADN piège (homoduplex piège), ou encore d'un brin d'ADN cible et d'un brin d'ADN piège (hétéroduplex),
- les fragments d'ADN double brin obtenus à l'étape d'hybridation précédente, sont ensuite mis en présence d'un réactif ayant une affinité pour le marqueur susmentionné, ce réactif étant immobilisé sur un support solide de sorte que les homoduplex pièges et les hétéroduplex marqués demeurent fixés sur le support solide par liaison entre le marqueur utilisé pour marquer l'ADN piège et le réactif susmentionné,
- récupération, notamment par filtration ou sédimentation du support solide, des homoduplex cibles non marqués, et donc restant en solution, constituant les séquences nucléotidiques contenues dans le génome de la première souche d'Erwinia carotovora, mais pas dans le génome de la deuxième souche, et donc susceptibles de s'hybrider avec le génome de la première souche, mais pas avec celui de la deuxième souche.
Selon un mode de réalisation de la soustraction génomique décrite ci- dessus, la première souche d'Erwinia carotovora est une souche pathogène chez une plante déterminée, tandis que la deuxième souche d'Erwinia carotovora n'est pas pathogène, plus particulièrement dans les mêmes conditions (de culture, climatiques, etc.) que pour la souche précédente, chez cette même plante.
Selon un autre mode de réalisation du procédé de soustraction génomique susmentionné, la souche d'Erwinia carotovora pathogène est une souche d'Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca) responsable de pourritures chez certaines plantes, notamment de la jambe noire de la pomme de terre, et la souche d'Erwinia carotovora non pathogène est une souche d'Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc) n'induisant pas de pourritures (et plus particulièrement du type jambe noire caractéristique) chez ces mêmes plantes. L'invention a plus particulièrement pour objet les séquences nucléotidiques telles que décrites ci-dessus, et caractérisées en ce qu'elles correspondent à l'une des séquences nucléotidiques A (SEQ ID NO 1), B (SEQ ID NO 2), C (SEQ ID NO 4), D (SEQ ID NO 5), E (SEQ ID NO 6), F (SEQ ID NO 7), représentées sur les figures 1 à 6 respectivement, ainsi qu'à la séquence B' représentée par SEQ ID NO 3, ou à leurs séquences complémentaires, ou à des fragments de ces séquences, ou à toutes séquences susmentionnées modifiées par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides, lesdits fragments ou séquences modifiées étant capables, tout comme les séquences A à F susmentionnées, de s'hybrider avec le génome d'au moins une souche d'Erwinia carotovora, notamment une souche pathogène, et ne pouvant pas s'hybrider avec le génome d'au moins une souche d'Erwinia carotovora, notamment une souche non pathogène.
L'invention vise plus particulièrement les séquences correspondant aux séquences nucléotidiques B et B' représentées respectivement par SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 3, ou à leurs séquences complémentaires, ou à des fragments de ces séquences, ou à toutes séquences susmentionnées modifiées par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides, lesdits fragments ou séquences modifiées étant capables, tout comme les séquences B et B' susmentionnées, de rester hybridées: - avec le génome des souches d'Eca, notamment pathogènes, ainsi qu'avec le génome des souches d'Erwinia carotovora subsp. betavasculorum (Ecb), notamment les souches d'Ecb pathogènes, notamment dans les conditions d'hybridation définies ci-après: hybridation dans 6 SSC, 0,1 % SDS et 0,01 % de lait écrémé à 65 °C pendant une nuit, suivie plus particulièrement par deux lavages de 30 minutes à 65 °C, 0,3 SSC, 0,5% SDS,
- uniquement avec le génome des souches d'Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment les souches d'Eca pathogènes, notamment dans les conditions d'hybridation suivantes: hybridation dans 6 SSC, 0,1 % SDS et 0,01 % de lait écrémé à 65 °C pendant une nuit, suivie plus particulièrement par deux lavages de 30 minutes à 68°C, 0,1 SSC, 0,5% SDS.
Par séquences bordant celles issues de la mise en oeuvre d'un procédé de soustraction génomique dans ce qui précède, on entend toutes séquences telles qu'obtenues par:
1) clonage du génome de la souche bactérienne utilisée dans la méthode de soustraction génomique, et dont sont issues les séquences obtenues par soustraction génomique telles que décrites ci-dessus, notamment de la souche pathogène, le clonage étant effectué par fragmentation du génome de cette souche, suivie de l'introduction des fragments ainsi obtenus dans des vecteurs de clonage appropriés (tels que des plasmides), ces derniers étant mis en culture dans une cellule hôte appropriée (notamment dans des bactéries telles que Escherichia coli),
2) récupération des cellules hôtes ainsi transformées, lyse de ces cellules, et dénaturation de l'ADN de ces cellules,
3) hybridation, notamment dans les conditions indiquées ci-dessus, de l'ADN susmentionné ainsi dénaturé avec une sonde marquée, notamment de la manière indiquée ci-après, cette sonde étant constituée de tout ou partie d'une séquence nucleotidique dénaturée obtenue par soustraction génomique telle que décrite ci-dessus, notamment avec tout ou partie des séquences A à F, et plus particulièrement des séquences B et B' susmentionnées,
4) sélection des cellules hôtes dont l'ADN dénaturé s 'hybride avec ladite sonde, lyse de ces cellules, récupération des fragments d'ADN de la souche bactérienne dont le génome a été clone à l'étape 1) et introduits dans leur génome par les vecteurs susmentionnés, notamment à l'aide d'enzymes de restriction appropriées, et purification de ces fragments d'ADN,
5) récupération des fragments d'ADN obtenus à l'étape 4) précédente, ou parties de ces fragments d'ADN, ne s 'hy bridant pas avec le génome de la souche utilisée dans la méthode de soustraction génomique et ne contenant pas les séquences obtenues par soustraction génomique telles que décrites ci-dessus, notamment avec le génome de la souche non pathogène, et s 'hy bridant avec le génome de la souche dont sont issues lesdites séquences obtenues par soustraction génomique, ces fragments d'ADN représentant une séquence bordante de la séquence nucleotidique obtenue par soustraction génomique et utilisée en tant que sonde lors de l'étape d'hybridation 2) susmentionnée avec l'ADN dénaturé des susdites cellules hôtes,
6) répétition des étapes précédentes en utilisant en tant que sonde lors de l'étape d'hybridation susmentionnée 2) avec l'ADN dénaturé des susdites cellules hôtes, la séquence bordante obtenue après chacune de ces répétitions d'étapes, jusqu'à l'obtention de fragments d'ADN s 'hy bridant avec le génome des deux souches bactériennes utilisées dans le procédé de soustraction génomique susmentionné, ces derniers fragments d'ADN ne représentant plus des séquences bordantes mais des séquences communes aux deux souches susmentionnées.
Une telle méthode d'obtention des séquences bordantes selon l'invention, est encore désignée par l'expression de "marche sur le chromosome" utilisée de façon classique dans ce domaine technique. Les séquences bordantes selon l'invention peuvent également être obtenues par allongement des séquences A à F, ou de celles susmentionnées obtenues par soustraction génomique, après hybridation de ces dernières à des fragments d'ADN obtenus lors de l'étape 1) de clonage du procédé susmentionné, cet allongement étant réalisé par synthèse nucleotidique (à partir du côté 3' et/ou du côté 5' de ces séquences) procédant par appariement des bases complémentaires de celles figurant sur les brins desdits fragments de génome, avec ces dernières.
A titre illustratif, on entend notamment par séquence modifiée dans ce qui précède, et ce qui suit, toute séquence comprenant des nucléotides tels que l'uracile, l'inosine, le 7 deaza 2' desoxyguanosine triphosphate (cdGTP) etc., et correspondant donc soit à un ADN soit à un ARN modifié.
De préférence, les séquences modifiées selon l'invention présentent au moins environ 60% d'identité avec tout ou partie des séquences nucléotidiques susmentionnées obtenues par soustraction génomique, et plus particulièrement des séquences B et B', ou avec tout ou partie des séquences bordantes susmentionnées.
L'invention concerne plus particulièrement les séquences nucléotidiques susmentionnées sous forme marquée, notamment de manière radioactive, enzymatique, par un composé fluorescent, par une liaison à une molécule antigénique (susceptible d'être reconnue par des anticorps) ou à toute autre molécule susceptible d'être directement ou indirectement détectée à l'aide de réactifs (ou encore de rayonnements), cette liaison pouvant éventuellement être effectuée par l'intermédiaire d'un bras espaceur, notamment par l'intermédiaire d'une séquence nucleotidique constituée d'environ 5 à 100 nucléotides située au moins à l'une des extrémités de ces séquences. A titre d'exemples de molécules directement ou indirectement détectables liées aux séquences nucléotidiques susmentionnées, on peut citer 1'acétylaminofluorène, la biotine (détectée à l'aide de l'avidine, la streptavidine) ou encore la digoxigènine. Les séquences nucléotidiques selon l'invention sont avantageusement utilisées en tant que sondes nucléotidiques, le cas échéant marquées, notamment de la manière indiquée ci-dessus, plus particulièrement pour la détection des souches d'Erwinia carotovora pathogènes, et plus particulièrement des souches d'Eca responsables de la jambe noire, ou encore des souches d'Ecb responsables de la nécrose racinaire de la betterave à sucre. Tout comme les séquences nucléotidiques susmentionnées, les sondes de l'invention sont susceptibles de s'hybrider (notamment dans les conditions de lavage spécifiique définies ci- dessus) avec des séquences nucléotidiques contenues dans le génome des Erwinia carotovora pathogènes, et plus particulièrement des Eca et Ecb pathogènes (ces dernières séquences étant encore désignées dans ce qui précède et qui suit, par l'expression "séquences nucléotidiques spécifiques" ou "séquences spécifiques"), ces séquences nucléotidiques spécifiques n'étant pas contenues dans le génome des Erwinia carotovora non pathogènes, et plus particulièrement dans le génome des Erwinia carotovora autres que les Eca ou
Ecb pathogènes.
Avantageusement les sondes de l'invention sont constituées d'enchaînements d'environ 7 à environ 300 nucléotides, choisis à l'intérieur des séquences nucléotidiques B et B' susmentionnées. Des fragments des séquences nucléotidiques susmentionnées de l'invention peuvent avantageusement être utilisés par paires pour former ce que l'on appellera dans la suite de ce texte des couples d'amorces, ces couples d'amorces étant utilisés pour l'amplification du nombre de copies des séquences nucléotidiques susmentionnées, ou des séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans le génome des souches d'Erwinia carotovora pathogènes, et plus particulièrement des souches d'Eca responsables de la jambe noire, ou des souches d'Ecb responsables de la nécrose racinaire.
Ces amorces permettent l'amplification (ou encore la multiplication) du nombre de copies de tout ou partie des séquences nucléotidiques spécifiques des génomes des Erwinia carotovora pathogènes, notamment selon la technique
PCR qui sera détaillée plus loin, ces amorces étant le cas échéant marquées, notamment de la manière indiquée ci-dessus.
Avantageusement, les amorces selon l'invention sont constituées d'environ 5 à environ 100 nucléotides, et de préférence d'environ 15 à environ 30 nucléotides, et sont susceptibles de s'hybrider avec une région d'une séquence nucleotidique selon l'invention, ou d'une séquence nucleotidique selon l'invention, ou d'une séquence nucleotidique spécifique du génome des Erwinia carotovora, et plus particulièrement des Eca et Ecb, cette région étant différente selon les amorces au sein d'un même couple, de manière à permettre l'amplification de tout ou partie des séquences nucléotidiques susmentionnées. Ces amorces peuvent par exemple être soit communes à Eca et Ecb, soit différentes en fonction des sous-espèces. Ces amorces sont avantageusement constituées d'environ 7 à 30 nucléotides issus des séquences nucléotidiques susmentionnées de l'invention, et plus particulièrement des séquences B et B' décrites ci-dessus, et permettent notamment l'amplification de fragments d'environ 100 à environ 300 nucléotides contenus dans des séquences nucléotidiques spécifiques des Eca responsables de la jambe noire.
Les couples d'amorces susmentionnées sont choisies de manière à ce qu'elles s'hybrident du côté 3' de chacun des brins des séquences nucléotidiques susmentionnées, les extrémités 3' de chacune des amorces étant dirigées vers l'intérieur des séquences à amplifier (selon la technique PCR classique). Un couple d'amorces issues de la séquence B susmentionnée, et particulièrement préféré dans le cadre de la présente invention, est tel que les deux amorces le constituant répondent aux formules suivantes: B105 5' TAAGGCAGCATTGAATCGCCACAGAGAGTA 3' (SEQ ID NO 8) B106 5' ACACGCATTTATCGCTATCAGGCACAACAA 3' (SEQ ID NO 9) Les amorces B105 et B 106 sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec le génome des Eca et/ou des Ecb susmentionnées, par exemple selon les étapes suivantes:
- prédénaturation par chauffage pendant 2 mn à 94°C, suivie de 35 cycles des trois étapes suivantes: . chauffage pendant 30 s à 92°C,
. chauffage pendant 30 s à 65 °C (température d'hybridation), . chauffage pendant 45 s à 72 °C. On obtient ainsi l'amplification d'un fragment de 151 paires de bases du génome des Eca et des Ecb. D'autres couples d'amorces issues de la séquence B susmentionnée, et utilisables dans le cadre de la présente invention, sont les suivants:
- Bl (SEQ ID NO 10) / B44 (SEQ ID NO 11),
- B201 (SEQ ID NO 12) / B202 (SEQ ID NO 13),
- B203 (SEQ ID NO 14) / B204 (SEQ ID NO 15). L'invention a également pour objet tout procédé de détection et d'identification des souches d'Erwinia carotovora pathogènes éventuellement présentes dans le sol ou l'eau, ou encore chez un hôte, notamment chez les plantes et/ou les semences, susceptible d'être un porteur apparemment sain de telles bactéries et se trouvant en phase latente d'infection, ce procédé comprenant les étapes suivantes:
- le traitement d'un échantillon prélevé dans le sol ou l'eau ou sur cet hôte de manière à rendre le génome de ces Erwinia carotovora accessible aux sondes et/ou aux amorces définies ci-dessus (c'est à dire de manière à ce que l'ADN de ces bactéries soit simple brin), et le cas échéant à toute ADN ou ARN polymérase permettant de répliquer les deux brins de l'ADN génomique ou l'ARN en dérivant, ce traitement étant notamment effectué par ébullition, macération (dans un liquide tel que l'eau), broyage, sonication, notamment en présence de détergent (par exemple laurylsulfate, Sodium Dodecyl Sulfate,
Triton X100), d' antioxydant, de chélateurs, d'alcali, et/ou de composés éliminant des inhibiteurs tels que les polyphénols (polyvinylpyrrolidone par exemple), ou les polysaccharides (bromure de cétyltriméthylammonium par exemple), - la mise en contact de l'échantillon ainsi traité avec des sondes, et/ou avec des amorces selon l'invention,
- le cas échéant, l'amplification à l'aide de couples d'amorces selon l'invention, du nombre de copies des séquences nucléotidiques spécifiques des Erwinia carotovora pathogènes, et contenues dans le génome de ces bactéries susceptibles d'être présentes dans cet échantillon biologique, et avec lesquelles sont susceptibles de s'hybrider les sondes ou amorces susmentionnées, et/ou l'amplification du nombre de copies de sondes selon l'invention,
- la détection de la présence éventuelle desdites séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans les génomes des Erwinia carotovora pathogènes, et donc de la présence des Erwinia carotovora pathogènes responsables de cette pathologie dans l'échantillon étudié.
Lorsque le procédé décrit ci-dessus est réalisé sans amplification du nombre de séquences nucléotidiques spécifiques des Erwinia carotovora pathogènes, l'étape de détection susmentionnée peut être réalisée à l'aide des sondes susmentionnées, avantageusement marquées, lesdites séquences spécifiques étant hybridées avec les sondes susmentionnées.
Lorsque le procédé décrit ci-dessus est réalisé avec amplification du nombre desdites séquences spécifiques, l'étape de détection susmentionnée peut être réalisée soit directement par visualisation de l'amplification desdites séquences spécifiques (par exemple par visualisation d'un amas important sur gel d'électrophorese correspondant à l'amplification réalisée, comme cela est détaillé ci-après), lorsque les amorces utilisées sont marquées, soit par hybridation desdites séquences ainsi amplifiées à l'aide des sondes susmentionnées marquées.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé d'identification et de détection des Eca et/ou des Ecb pathogènes éventuellement présentes chez un hôte, notamment chez les plantes et les semences, ce procédé étant réalisé de la manière indiquée ci-dessus, à l'aide de tout ou partie d'une sonde constituée de la séquence nucleotidique B ou B' susmentionnées, le cas échéant marquée, notamment de la manière indiquée ci-dessus, et/ou à l'aide du couple d'amorces B105/B106 susmentionnées, le cas échéant marquées, notamment de la manière indiquée ci-dessus.
Avantageusement, la détection spécifique des Eca est réalisée par hybridation, notamment sur membrane, desdites séquences spécifiques amplifiées ou non, avec tout ou partie de la sonde B ou B' dans les conditions d'hybridation suivantes: hybridation dans 6 SSC, 0,1 % SDS et 0,01 % de lait écrémé à 65 °C pendant une nuit, suivie plus particulièrement par deux lavages de 30 minutes à 68°C, 0,1 SSC, 0,5% SDS.
La détection spécifique des Eca et/ou des Ecb, est réalisée soit par hybridation desdites séquences spécifiques, amplifiées ou non, avec tout ou partie de la sonde B ou B' dans les conditions d'hybridation suivantes: hybridation dans 6 SSC, 0,1 % SDS et 0,01 % de lait écrémé à 65 °C pendant une nuit, suivie plus particulièrement par deux lavages de 30 minutes à 65 °C, 0,3 SSC, 0,5% SDS, soit directement par visualisation de l'amplification desdites séquences spécifiques à l'aide des amorces B105 et B106 marquées.
Les procédés d'identification et de détection de l'invention peuvent être réalisés à partir d'un hôte présentant des signes pathologiques, ou avantageusement à partir d'un hôte susceptible d'être un porteur apparemment sain de telles bactéries et se trouvant en phase latente d'infection.
Les procédés d'identification et de détection des Erwinia carotovora, et plus particulièrement des Eca ou Ecb, selon l'invention peuvent également être réalisés à partir de tout milieu dans lequel ces bactéries sont susceptibles de survivre, notamment dans l'eau ou le sol.
De préférence, les procédés d'identification selon l'invention comprennent une étape d'amplification du nombre de copies de tout ou partie des séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans les génomes des Erwinia carotovora pathogènes, ou des ARN correspondants.
Cette étape d'amplification génique peut être réalisée in vitro ou in vivo par toute méthode utilisant les techniques classiques d'amplification enzymatique de l'ADN ou de TARN, telles que la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite notamment dans la revue P.N.A.S. , USA, 88, pp. 189-193 (1991), ou la technique "Qβ Replicase" décrite dans la revue Biotechnology (Vol.6, octobre 1988), ou avantageusement la technique PCR telle que décrite notamment dans les demandes de brevet européen de Cetus (n° 200 362, 201 184, 229 701 et 258 017), ou encore la technique 3SR décrite par Fahy et al. dans la revue PCR
Meth Appl 1, 25-33 (1991), ou les techmques dérivées de ces dernières et toute méthode visant à amplifier in vitro les acides nucléiques.
Selon un mode de réalisation préféré du procédé décrit ci-dessus selon l'invention, l'amplification par technique PCR du nombre de copies de tout ou partie des séquences nucléotidiques contenues dans les génomes des Erwinia carotovora et/ou l'amplification du nombre de copies de tout ou partie des sondes définies ci-dessus, comprend les étapes suivantes:
- la prédénaturation de l'ADN double brin en ADN mono-brin, de préférence dans un tampon constitué de Tris-HCl 10 mM pH 8,3, 50 raM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,01 % de gélatine, de cofacteurs de l'ADN (ou ARN)- polymérase, notamment d'ions Mg2+ et K+ , des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP), ou des ARN (dCTP, dUTP, dGTP, dTTP), et des couples d'amorces tels que définis ci-dessus, par chauffage entre environ 80°C et environ 110°C, avantageusement à 100°C, - l'amplification proprement dite par addition au milieu obtenu à l'étape précédente d'ADN ou ARN polymérase thermorésistante ou de ligase thermorésistante (dans le cas où ces enzymes n'étaient pas initialement présentes dans le tampon de prédénaturation susmentionné), et
* chauffage (notamment pendant environ 1 minute) à environ 94 °C, ce qui correspond à l'étape de dénaturation proprement dite,
* puis chauffage (notamment pendant environ 1 minute) entre environ 35°C et environ 76°C, ce qui correspond à l'étape d'hybridation des couples d'amorces avec les séquences ou sondes susmentionnées,
* et enfin chauffage (notamment pendant environ 1 minute) entre environ 50°C et environ 76°C, et avantageusement à 72°C, ce qui correspond à l'étape d'élongation (ou d'allongement) des amorces, hybridées à l'étape précédente, l'une vers l'autre, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de tout ou partie des séquences génomiques des Erwinia carotovora ou des sondes susmentionnées, ces séquences ou sondes étant délimitées par les nucléotides s 'hy bridant avec les amorces susmentionnées,
- la répétition de l'étape d'amplification précédente entre environ 20 et environ 50 fois, avantageusement entre 25 et 40 fois, l'ensemble de la procédure pouvant être répété une ou plusieurs fois à partir de tout ou partie du milieu obtenu à l'étape précédente.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la sensibilité de la détection peut être améliorée en poursuivant le procédé décrit ci-dessus par une amplification du type "nested PCR", décrite dans "PCR A Practical Approach" édité par M.J. McPherson, P. Quirke, G.R. Taylor, (1991) Oxford University Press, en utilisant des amorces internes au fragment précédemment amplifié, ce qui conduit à l'amplification du nombre de copies d'un fragment d'ADN ou d'ARN plus court que celui dont le nombre de copies a été initialement amplifié. II va de soi que tous les intervalles de temps précisés dans les méthodes détaillées ci-dessus, peuvent varier entre autres en fonction de l'appareillage (dit cycleur ou thermocycleur) utilisé.
Il va également de soi que si l'on utilise d'autres méthodes d'amplification que celle par PCR, et/ou d'autres enzymes, les conditions d'amplification (tampon, température, etc.) adéquates seront choisies.
Dans le cas où le procédé d'identification et de détection de l'invention est réalisé simplement à l'aide de sondes telles que décrites ci-dessus, la détection des séquences nucléotidiques spécifiques, est avantageusement réalisée de la manière suivante: - fixation sur un support solide (tel qu'une membrane ou des puits de plaques de microtitration comme celles couramment utilisées dans la technique dite ELIS A, et adaptées ou non aux acides nucléiques) d'une séquence nucleotidique selon l'invention, désignée ci-après "séquence piège", avec laquelle les susdites séquences nucléotidiques spécifiques, ou fragments de ces séquences, sont susceptibles de s'hybrider, notamment dans les conditions définies ci-dessus, cette fixation étant réalisée selon des techmques usuelles décrites notamment par Maniatis et al , 1982, et par Ausubel et al., 1987,
- rinçage du support solide,
- saturation des sites réactifs libres du support, - incubation des séquences nucléotidiques pièges, ainsi fixées, avec l'ADN ou ARN génomique provenant de l'échantillon biologique préalablement traité de la manière indiquée ci-dessus, dans des conditions permettant l'hybridation des séquences nucléotidiques spécifiques avec lesdites séquences pièges, notamment dans les conditions d'hybridation définies plus haut, - rinçage du support solide, éventuellement à l'aide de 3 x SSC à 65 °C (ou
0,1 x SSC si nécessaire, à 68°C) pendant 15 ran à deux reprises, ou encore dans des conditions moins stringentes en fonction de la longueur des oligonucleotides utilisés en tant que sondes, - incubation des séquences spécifiques hybridées à l'étape précédente avec les séquences pièges, avec une ou plusieurs sondes selon l'invention, dans des conditions permettant l'hybridation des séquences spécifiques susmentionnées avec lesdites sondes, notamment dans les conditions d'hybridation définies plus haut, ces sondes étant choisies de manière à ce qu'elles ne soient pas complémentaires des séquences pièges susmentionnées,
- rinçage du support solide, notamment à l'aide de 3 x SSC (ou 0,1 x SSC si nécessaire, à 68°C) à 65°C pendant 15 mn à deux reprises, ou encore dans des conditions moins stringentes en fonction de la longueur des oligonucleotides utilisés en tant que sondes,
- détection des éventuelles sondes étant restées fixées sur le support solide après l'étape précédente, témoignant alors de la présence de séquences spécifi¬ ques, ou fragments de ces séquences dans l'échantillon biologique, cette détection étant réalisée soit directement lorsque les susdites sondes sont marquées de manière radioactive ou fluorescente, soit indirectement par l'intermédiaire de réactifs eux-mêmes susceptibles de reconnaître ces sondes, notamment à l'aide d'anticorps ou autres réactifs décrits précédemment, dans le cas où ces sondes sont marquées par des antigènes ou des molécules susceptibles d'être respectivement reconnus par ces anticorps ou ces réactifs. La détection des séquences nucléotidiques spécifiques susceptibles d'être présentes dans l'échantillon étudié, peut également être réalisée de la manière suivante:
- fixation sur un support solide de l'ADN ou ARN génomique provenant de l'échantillon préalablement traité de la manière indiquée ci-dessus, - rinçage du support solide,
- saturation des sites réactifs libres du support,
- incubation de l'ADN ou ARN ainsi fixé avec une sonde, selon l'invention, cette incubation étant réalisée dans des conditions permettant l'hybridation des sondes avec le matériel génomique fixé sur le support solide, notamment dans les conditions d'hybridation définies plus haut,
- rinçage du support solide, notamment à l'aide de 3xSSC (ou 0,lxSSC si nécessaire à 68°C) à 65 °C pendant 15 mn à deux reprises,
- détection des éventuelles sondes étant restées fixées sur le support solide après l'étape précédente, témoignant alors de la présence de séquences spécifiques, ou fragments de ces séquences dans l'échantillon biologique, cette détection étant réalisée soit directement lorsque les susdites sondes sont marquées de manière radioactive ou fluorescente, soit indirectement par l'intermédiaire de réactifs eux-mêmes susceptibles de reconnaître ces sondes, notamment à l'aide d'anticorps ou autres réactifs décrits précédemment, dans le cas où ces sondes sont marquées par des antigènes ou des molécules susceptibles d'être respectivement reconnus par ces anticorps ou ces réactifs.
Dans le cas où le procédé d'identification et de détection de l'invention comprend une étape d'amplification génique à l'aide des amorces décrites ci- dessus, la détection des séquences nucléotidiques spécifiques ou fragments de ces séquences, peut être réalisée par électrophorèse sur gel de tout ou partie du milieu reactionnel dans lequel l'amplification a été effectuée. La révélation par visualisation d'un amas important (plus ou moins individualisé) de séquences en un point spécifique du gel, et correspondant au nombre de copies de tout ou partie des séquences nucléotidiques spécifiques ainsi amplifiées, est corrélable à la présence de ces séquences spécifiques dans l'échantillon étudié.
Avantageusement, l'amplification de tout ou partie des séquences spécifiques susmentionnées, est susceptible d'être détectée à l'aide de sondes telles que décrites ci-dessus, notamment selon un des procédés décrits précédemment.
D'autres méthodes de détection ou de dosage, en phase solide ou liquide, peuvent bien entendu être envisagées dans le cadre de la présente invention.
Ces méthodes sont décrites notamment dans l'article de Bloch, 1991, qui traite de la technique PCR en général et d'une méthode de dosage par co- amplification, ces méthodes pouvant être appliquées à la quantification des erwinias pectinoly tiques présentes dans l'échantillon étudié, ou dans l'article de Barany, 1991, traitant de la LCR et de la PCR, ou encore dans l'article de Gilliland et al. , 1990, traitant d'une méthode PCR par compétition pour la quantification d'ARNm également applicable dans le cadre de la présente invention.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'application des procédés d'identification et de détection susmentionnés au diagnostic de l'éventuelle apparition d'une pathologie causée par les Erwinia carotovora, notamment de la jambe noire causée par les Eca, notamment chez la pomme de terre, ou de la nécrose racinaire causée par les Ecb, notamment chez la betterave à sucre, chez un hôte tel que défini ci-dessus.
Le résultat de ces méthodes de diagnostic susmentionnées permet d'évaluer le risque que présente un hôte susceptible d'être porteur d'Erwinia carotovora, et plus particulièrement d'Eca ou d'Ecb, de développer et le cas échéant, de transmettre, ou non, une pathologie causée par ces bactéries, et plus particulièrement la jambe noire, ou la nécrose racinaire. Par Erwinia carotovora, et plus particulièrement Eca et Ecb, détectées dans le cadre des méthodes de diagnostic et de détection susmentionnées, il faut entendre à la fois les souches naturelles de ces bactéries, ainsi que les souches modifiées, notamment par voie du génie génétique. Les méthodes de diagnostic selon l'invention sont réalisées par détection d'Erwinia carotovora responsables de pathologies, notamment d'E z responsable de la jambe noire en Europe, ou d'Ecb responsable de nécrose racinaire en Europe, ou de toute espèce ou sous-espèce dérivée ultérieurement par modification de la taxonomie actuelle. Le polymorphisme des séquences nucléotidiques spécifiques des Erwinia carotovora pathogènes, ou des fragments de ces séquences, peut être représentatif de différents groupes au sein de ces erwinias, tels que des écotypes, pathotypes (ou pathovars) ou biotypes d'Erwinia carotovora, le polymorphisme étant notamment mis en évidence soit par l'action d'enzymes de restriction, par des électrophorèses en gradient de température ou d'agents dénaturants, ou après hybridation avec un fragment d'ARN par action avec la RNase A, ou par toute autre méthode visant à mettre en évidence le polymorphisme des acides nucléiques en phase solide ou liquide, en particulier par hybridation avec des sondes telles que décrites ci-dessus.. L'invention vise également les kits pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic telle que décrite ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une sonde telle que définie ci-dessus, et/ou au moins un couple d'amorces telles que décrites ci-dessus.
Avantageusement, les kits selon l'invention comprennent: - un support solide, tel qu'une plaque de microtitration sur laquelle est fixée une sonde dénaturée de capture représentée par un oligonucléotide de préférence d'environ 30 nucléotides, et issu d'une séquence selon l'invention,
- une ADN ou ARN polymérase thermorésistante,
- un milieu reactionnel avantageusement constitué, dans le cas de l'utilisation de la technique PCR, de tampon Tris-HCl 10 mM pH 8,3, 50 mM
KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01 % de gélatine, de cofacteurs de l'ADN ou ARN polymérase, notamment d'ions Mg2+ et K+ , et des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) ou des ARN (dCTP, dATP, dGTP, dUTP), - un (ou plusieurs) oligonucléotide(s) marqué(s) de révélation avantageusement constitué(s) d'une (ou plusieurs) séquence(s) dénaturée(s) d'environ 30 nucléotides issue(s) d'une séquence selon l'invention. Les kits selon l'invention peuvent également comprendre:
- une ou plusieurs enzymes de restriction, et, le cas échéant, des fragments de restriction de référence caractéristiques de chacun des écotypes, pathotypes (ou pathovars) ou biotypes de sous-espèces d'Erwinia carotovora, notamment d'Eca ou d'Ecb,
- et/ou une ligase et un (ou plusieurs) couple(s) de séquences oligonucléotidiques susceptibles de s'hybrider de part et d'autre d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) situé(s) dans des gènes ou fragment de gènes caractéristique(s) d'une souche d'Erwinia carotovora, et avantageusement une (ou plusieurs) sonde(s) oligonucléotidique(s) spécifique(s) d'une région carac¬ téristique d'une souche déterminée d'Erwinia carotovora, dans l'état actuel de la taxonomie.
L'invention concerne également l'utilisation des séquences nucléotidiques définies ci-dessus pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection, le cas échéant dans un but de diagnostic, chez un hôte ou dans un milieu tels que définis ci-dessus, de tout micro-organisme ou toute cellule, dans les génomes desquels les séquences nucléotidiques selon l'invention, ont été introduites de façon transitoire ou définitive. Un tel procédé est avantageusement réalisé suivant l'une des méthodes décrites ci-dessus. A ce titre, l'invention a également pour objet l'utilisation des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, en tant que marqueurs de cellules ou micro¬ organismes génétiquement modifiés par introduction ou non dans leur génome de ces séquences nucléotidiques, ou d'hôtes cellulaires infectés (ou transformés) par de tels micro-organismes, notamment pour le suivi de l'évolution de ces cellules, micro-organismes et hôtes cellulaires dans un environnement déterminé.
L'invention concerne notamment les cellules de plantes (par exemple les protoplastes) transformées par un vecteur choisi parmi ceux dérivés des plasmides Ti et Ri d'Agrobacterium tumefaciens et d'Agrobacterium rhizogenes respectivement, ces plasmides contenant en l'un de leurs sites non essentiels pour leur réplication et la transformation des cellules végétales, une séquence nucleotidique selon l'invention.
L'invention vise également les plantes régénérées à partir de ces cellules transformées. L'invention concerne également les cellules animales transformées par un vecteur dérivé par exemple des retrovirus et contenant une séquence nucleotidique de l'invention. L'invention concerne également tout procédé d'obtention des séquences nucléotidiques susmentionnées.
La préparation de ces séquences nucléotidiques peut être effectuée soit par un procédé chimique, soit par d'autres procédés, comme l'amplification par LCR ou PCR ou autre méthode d'amplification génique.
Un mode de préparation approprié de ces séquences nucléotidiques (comportant au maximum 200 nucléotides, ou paires de bases lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) de l'invention par voie chimique (dans l'état actuel des techniques dans ce domaine) comprend les étapes suivantes: - la synthèse d'ADN en utilisant par exemple la méthode automatisée β- cyanéthyl phosphoramidite décrite dans Bioorganic Chemistry 4; 274-325, 1986,
- le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur approprié (plasmide, phage ou cosmide) et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée, ou par électrophorèse, ou par chromatographie, généralement après restriction.
Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques de longueur supérieure à 200 nucléotides - ou paires de bases (lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes:
- l'assemblage, par exemple par aboutage (ou ligation, ou ligature, par action d'une ligase), d' oligonucleotides synthétisés chimiquement, pourvus à leurs extrémités de sites de restriction différents, selon par exemple le principe décrit dans Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80,; 7461-7465, 1983,
- le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur approprié (plasmides, phages ou cosmides), et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée, ou par électrophorèse, ou par chromatographie, généralement après restriction.
La préparation des acides nucléiques de l'invention peut également être réalisée par voie biologique, notamment après clonage d'hôtes cellulaires dont le génome est susceptible de contenir ces séquences nucléotidiques, le cas échéant, après transformation du génome de ces hôtes à l'aide de vecteurs appropriés contenant ces séquences nucléotidiques.
A ce titre, la présente invention a pour objet tout vecteur, notamment plasmidique, contenant en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une séquence nucleotidique selon l'invention. L'invention a également pour objet tout hôte cellulaire transformé par un vecteur selon l'invention, et dans lequel ledit vecteur, ou la séquence nucleotidique selon l'invention, intégrée dans le génome de l'hôte, est susceptible de se répliquer. L'invention vise plus particulièrement la souche DH5α d' Escherichia coli transformée par le plasmide pPMV176 lui-même obtenu par insertion de la séquence nucleotidique B représentée sur la figure 2, dans le site BamΑl du plasmide pTZ19R décrit dans l'article de Mead et al., (1985). Ainsi la présente invention vise un procédé d'obtention des séquences nucléotidiques susmentionnées, réalisé par:
- mise en culture d'un hôte cellulaire tel que décrit ci-dessus, transformé par un vecteur selon l'invention,
- récupération des vecteurs à partir de cet hôte cellulaire, notamment par un traitement de lyse cellulaire approprié,
- récupération des séquences nucléotidiques de l'invention par traitement des vecteurs susmentionnés à l'aide d'enzymes de restriction appropriés (à l'aide par exemple de BamΑl dans le cas du plasmide pPMN176 susmentionné),
- purification des séquences nucléotidiques ainsi obtenues, notamment par électrophorèse sur gel, ou capillaire, ou par chromatographie 1.
Un autre procédé particulièrement avantageux d'obtention des séquences nucléotidiques selon l'invention, comprend les étapes suivantes:
- mise en présence de vecteurs contenant les séquences nucléotidiques susmentionnées, avec des couples d'amorces telles que décrites ci-dessus, dans des conditions permettant l'amplification du nombre de copies de ces séquences nucléotidiques, notamment dans les conditions décrites ci-dessus,
- purification des séquences nucléotidiques ainsi obtenues, notamment par électrophorèse sur gel, ou capillaire, ou par chromatographie .
D'une manière plus générale, l'invention a pour objet l'utilisation des séquences nucléotidiques selon l'invention, et plus particulièrement les séquences A, B, B', C, D, E et F susmentionnées, pour la mise en oeuvre du procédé d'identification spécifique de souches (ou groupes de souches) ou d'éventuels pathovars au sein des différentes souches d'Erwinia carotovora existantes. L'invention vise également l'utilisation des séquences susmentionnées pour la mise en oeuvre du procédé d'identification spécifique de sous-espèces d'Erwinia carotovora, notamment Eca ou Ecb, (ou groupes de sous-espèces tels que le groupe constitué par Eca et Ecb), au sein de l'espèce Erwinia carotovora.
Les procédés d'identification spécifique susmentionnés, sont avantageusement réalisés de manière identique à celle décrite ci-dessus pour les procédés d'identification des Erwinia carotovora pathogènes.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation des sondes B ou B' et/ou des amorces B105/B106 pour la mise en oeuvre de procédés tels que décrits ci-dessus, d'identification spécifique des souches d'Ecα et/ou d'Ecb pathogènes ou non, ou de la sous-espèce Eca et/ou Ecb au sein des Erwinia carotovora.
L'invention a également plus particulièrement pour objet les séquences Ε et F susmentionnées, ainsi que leur utilisation pour la mise en oeuvre d'un procédé d'identification spécifique de différentes souches ou pathovars d'Eca, notamment selon les techniques décrites ci-dessus.
La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention des séquences nucléotidiques A à F selon l'invention, et de leur spécificité vis à vis des souches d'Erwinia carotovora.
I - MATERIELS ET METHODES
a) Souches bactériennes et plasmides Les souches bactériennes et les plasmides utilisés pour la mise en oeuvre de la méthode de soustraction génomique utilisée pour l'obtention de la séquence B, sont décrits sur le tableau 1. Les micro-organismes testés dans le cadre d'expériences d'hybridation en dot-blot (dépôts en taches) avec les sondes obtenues sont présentés sur le tableau 2. Les souches d'Erwinia et d'Escherichia coli ont été cultivées sur milieu de Luria (Miller 1972) à 30°C et 37°C respectivement. Les antibiotiques ont été utilisés aux concentrations suivantes : ampicilline 50 μg/ml et streptomycine 100 μg/ml. Le X-gal (O-nitrophenyl-βD- galactopyranoside, Sigma) a été utilisé à la concentration de 40 μg/ml.
b. Préparation de l'ADN
L'ADN génomique total a été extrait et purifié par la méthode de Klotz et Zimm (1972).
L'ADN cible à été digéré avec Sau3Al selon les recommandations du fabricant (Boehringer Mannheim). Après digestion, l'ADN a été extrait une fois par le mélange phénol-chloroforme, précipité, lavé et resuspendu à 0,1 μg/μl dans le tampon EE pH 8,0 [10 mM N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-(3- propanesulfonic acid), 1 mM EDTA].
Deux cents μg d'ADN piège ont été fragmentés par sonication dans 3 ml de tampon EE. La taille moyenne des fragments d'ADN est de 1 000 pb. L'ADN soniqué est concentré avec 7,5 ml de 2-butanol, précipité à l'éthanol absolu (2 volumes), lavé et resuspendu à 1 μg/μl dans l'eau.
Les concentrations d'ADN génomique utilisés pour la soustraction sont mesurées très précisément au spectrophotomètre (à 260 nm, 1 DO =50 μg/ml d'ADN), et par comparaison d'intensité des bandes contre un standard après électrophorèse sur gel d'agarose 0,8 % pendant 1 heure 30 minutes à 75 V dans le tampon TBE (Tris Borate EDTA), et coloration au bromure d'éthidium (Maniatis et α/., 1982). L'ADN génomique pour les tests de dot-blot a été extrait de la manière décrite ci-dessus avec des volumes réduits de 10 fois. Chaque ADN a été contrôlé par spectrophotométrie UV et électrophorèse après digestion avec EcoRI (Boehringer Mannheim).
Des préparations à grande échelle d'ADN plasmidique ont été réalisées à partir de lysats clairs suivies par deux centrifugations en gradient de densité de chlorure de césium avec du bromure d'éthidium (Maniatis et al, 1982).
Des préparations à petite échelle ont été réalisées par la méthode rapide de Holmes et Quigley (1981).
c) Marquage de l'ADN avec ( 32_ ^ dATP
L'ADN a été marqué à l'aide du kit de marquage "random primer" d'ADN de Boehringer Mannheim selon les instructions du fabricant, 4 heures à température ambiante.
L'élimination des desoxyribonucleotides tri-phosphates non incorporés a été réalisée par chromatographie sur 0,5 ml d'une colonne de Sépharose CL-6B
(Pharmacia). 50 ng d'ADN ont été utilisés par sonde, tandis que 1 μg a été marqué pour suivre l'ADN génomique total.
d) Biotinylation de l'ADN La réaction est effectuée sur des plaques de microtitration disposées sur de la glace, dans une chambre noire. 50 μl d'ADN soniqué, à la concentration de 1 μg/μl sont mélangés à 50 μl d'acétate de photobiotine (Sigma) à la concentration de 2 μg/μl par puits. Le mélange est photoactivé par une lampe UN, 10 mn à 360 irai. Après addition de Tris 1M, pH 9 pour une concentration finale de 100 mM, l'ADΝ biotinylé est extrait quatre fois au 1-butanol (saturé à l'eau), précipité à l'éthanol, lavé et resuspendu à la concentration de 2,5 μg/μl dans du tampon 2,5 EE, pH 8.
e) Soustraction génomique Les séquences nucléotidiques A à F représentées respectivement sur les figures 1 à 6, sont obtenues par soustraction génomique entre deux souches d'Erwinia carotovora, l'une de ces deux souches étant pathogène, tandis que l'autre n'est pas pathogène (du moins dans les conditions, notamment climatiques, où la souche précédente est pathogène).
La souche d'Erwinia carotovora pathogène est une souche d'Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca) responsable de la jambe noire chez certaines plantes (notamment chez la pomme de terre) dans les climats où règne, du moins pendant un certain temps, une température d'environ 15 °C à environ 25 °C, et la souche d'Erwinia carotovora non pathogène, du moins dans les conditions de température susmentionnées, est une souche d'Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc). La soustraction génomique susmentionnée entre les deux souches d'Erwinia carotovora est réalisée selon la méthode de Straus et Ausubel décrite dans la demande de brevet européen n° 372 524 déposée le 6 décembre 1989. Cette méthode de soustraction génomique est de préférence réalisée de la manière suivante: - l'ADN de la souche d'Ecα, ou ADN cible, est coupé en petits fragments, d'environ 100 à environ 1 000 nucléotides, par action d'enzymes de restriction,
- l'ADN de la souche d'Ecc, ou ADN piège, est coupé en fragments, d'environ 1 000 à environ 10 000 nucléotides, par sonication, ces fragments étant par la suite marqués, par exemple à la biotine ou autre molécule permettant la détection et la récupération des acides nucléiques (par exemple par piégeage),
- les fragments susmentionnés d'ADN cible et d'ADN piège sont mélangés dans des proportions telles que l'ADN piège soit en excès par rapport à l'ADN cible, notamment dans une gamme de rapports ADN piège/ ADN cible d'environ 2 à 100, et avantageusement dans un rapport d'environ 40, - les fragments d'ADN cible et piège ainsi mélangés sont dénaturés par chauffage, notamment à une température d'environ 100°C, ce qui conduit à la formation de fragments d'ADN cible et piège simple brin,
- puis les fragments d'ADN simple brin obtenus à l'étape précédente sont placés dans des conditions d'hybridation telles qu'elles permettent la formation de fragments d'ADN double brin constitués de deux brins d'ADN cible
(homoduplex cible), ou de deux brins d'ADN piège (homoduplex piège), ou encore d'un brin d'ADN cible et d'un brin d'ADN piège (hétéroduplex), notamment dans des conditions d'hybridation relativement peu stringentes (peu drastiques) à une température d'environ 65 °C en présence de NaCl 1M, - les fragments d'ADN double brin obtenus à l'étape d'hybridation précédente, sont ensuite mis en présence d'un réactif ayant une affinité pour le marqueur susmentionné, par exemple l'avidine ou la streptavidine ayant une affinité pour la biotine (constante de dissociation d'environ 10"^M), ce réactif étant immobilisé sur un support solide (tel que des billes), de sorte que les homoduplex pièges et les hétéroduplex marqués, notamment biotinylés, demeurent fixés sur le support solide par liaison entre le marqueur utilisé pour marquer l'ADN piège et le réactif susmentionné, notamment sur les billes couplées à l'avidine ou à la streptavidine,
- récupération, notamment par filtration ou sédimentation du support solide, des homoduplex cibles non marqués constituant les séquences nucléotidiques spécifiques de la souche d'Erwinia carotovora pathogène,
- avantageusement, répétition des étapes précédentes entre environ 3 et 5 fois, à partir de la solution obtenue à l'étape précédente en tant que solution d'ADN cible, de manière à éliminer les homoduplex piège et hétéroduplex susceptibles d'être présents dans ladite solution,
- le cas échéant, ligature d'adaptateurs oligonucléotidiques, de séquences connues, de part et d'autre des séquences nucléotidiques spécifiques (homoduplex cibles), cette ligature étant réalisée notamment par l'action d'une enzyme du type ligase, et amplification du nombre de ces séquences nucléotidiques spécifiques par mise en oeuvre d'une méthode d'amplification (ou de multiplication ou de réplication) du nombre de copies desdites séquences nucléotidiques spécifiques, notamment selon les techmques PCR (Polymérase Chain Reaction), 3SR (Self-Sustained Séquence Réplication) ou toute autre technique faisant appel à l'hybridation entre acides nucléiques et permettant de détecter un nombre initialement faible d'acides nucléiques déterminés par multiplication du nombre de copies de ceux-ci.
La méthode d'amplification susmentionnée peut être réalisée suivant les procédures PCR et 3SR décrites ci-après. A titre illustratif, les adaptateurs utilisés peuvent présenter la séquence nucleotidique suivante : 5' CACTCTCGAGACATCACCG 3' .
Les fragments homoduplex d'ADN cible obtenus et amplifiés par les méthodes précédentes, peuvent être isolés et multipliés sous forme pure, notamment par clonage dans un vecteur approprié. la souche d'Eca est la souche 86.20 déposée à la Collection Nationale de Culture des Micro-organismes (C.N.C.M.) de l'Institut Pasteur à Paris le 30 mars 1993 sous le numéro 11295, et la souche d'Ecc est la souche CH26 déposée à la C.N.C.M. le 30 mars 1993 sous le numéro 11294. Pour effectuer cette soustraction génomique, 10 μg d'ADN piège biotinylé et 250 ng d'ADN cible digéré ont été utilisés pour le premier cycle de soustraction génomique selon le protocole de Straus et Ausubel. La procédure n'a pas été changée à l'exception du fait que l'ADN de dépistage et l'ARNt de levure n'ont pas été additionnés dans le mélange reactionnel. La liaison de l'ADN biotinylé a été réalisée avec une solution de streptavidine à 5 % (Dynabeads™ M-280, Dynal A.S. , Oslo, Norvège). A chaque cycle d'hybridation successif, 10 μg d'ADN biotinylé piège ont été additionnés aux échantillons. A la fin du dernier cycle, les échantillons résultants ont été précipités à l'éthanol et resuspendus dans 5 μl de tampon TE pH 8 (Tris EDTA, Maniatis et al, 1982).
Protocole : Dix μg d'ADN piège biotinylé et 250 ng d'ADN cible digéré sont mélangés avec 3 ml de tampon 10 EE, pH 8,0. L'ensemble est porté à ébullition pendant 1 mn. L'ensemble est ensuite séché par évaporation, et resuspendu dans
4 ml d'eau distillée stérile. Un μl de solution de NaCl 5 M est ajouté, mélangé et centrifugé par impulsions. L'échantillon est alors recouvert par 20 μl d'huile minérale (Sigma) et placé dans un incubateur thermique à 65 °C pendant 17 heures.
Le mélange d'hybridation est ensuite repris dans 100 μl de tampon EEN, pH 8,0 (NaCl 0,5 M, 10 mM N-(2-hydroxyéthyl)-piρérazine-N'-(3-propane acide sulfonique) (EPPS), 1 mM EDTA) et mélangé vigoureusement (Nortex). L'huile minérale est enlevée délicatement, et 100 μl d'une solution à 5% de billes magnétiques recouvertes de streptavidine, lavées et resuspendues dans du tampon EEΝ (Dynabeads, Dynalabs), sont ajoutés. Le mélange est laissé à incuber 30 mn à température ambiante.
Le mélange est ensuite placé sur un filtre adapté au tube Eppendorf, et filtré par centrifugation 6 000 g, 15 s. Le tube d'hybridation est rincé avec 200 μl de tampon EEΝ, et le liquide de rinçage est placé sur le filtre et centrifugé dans les mêmes conditions. L'ensemble du filtrat est précipité avec 1 ml d'éthanol absolu, 5 mn à -80°C, centrifugé 30 mn à 10 000 g. Le culot (invisible) est rincé à l'éthanol absolu et séché. Le culot est ensuite resuspendu dans 4 μl d'ADN piège biotinylé (10 μg).
La resuspension doit être minutieuse et être effectuée tout le long de la paroi du tube (côté extérieur, force centrifuge). L'ADN resuspendu est porté à ébullition, pendant 1 min, et 1 μl de NaCl 5 M sont ajoutés. Le mélange est placé à 65 °C pendant 17 heures pour un nouveau cycle d'hybridation soustractive. Après quatre cycles de soustraction, l'ADN précipité est resuspendu dans
5 ml d'eau distillée stérile. ) Ligature des adaptateurs pour l'amplification par PCR
L'amorce oligonucléotidique suivante :
5 ' GAC ACTCTCG AGAC ATC ACCGTCC3 ' , et l'amorce complémentaire phosphorylée en 5' 5 ' GATCGG ACGGTG ATGTCTCGAG AGTG3 ' sont mélangées en proportion égale, 100 ng/μl de chaque, portées à ébullition 1 mn dans un bain-marie. Les amorces sont laissées à hybrider dans le bain-marie jusqu'à ce que celui-ci soit revenu à la température ambiante.
Deux μl et demi de l'ADN résultant de la soustraction génomique sont mélangés à 50 ng (2 μl du mélange précédent) de la solution d'adaptateurs, avec
1 μl de tampon de ligature, 1 μl de ligase (Stratagène) et 3,5 μl d'eau distillée stérile. Le mélange reactionnel est placé à 16°C pendant 12 heures.
Après ligature, le mélange est repris dans 20 μl de tampon TE pH 8,0 (Tris EDTA) et filtré sur minicolonne de sépharose CL-6B par centrifugation 5 mn à 2 000 g. Le filtrat est extrait une fois au phénol-chloroforme et précipité à l'éthanol absolu, le culot séché est resuspendu dans 5 μl de tampon TE.
gl Amplification de la banque soustractive par PCR
L'ensemble de l'ADN lié aux adaptateurs est mélangé à 5 ml de tampon de PCR (Boehringer Mannheim), 100 pmoles de l'amorce
5 'CACTCTCGAGACATCACCG3', 200 mM de chaque dNTP, avec 2,5 unités de Taq polymérase (Boehringer Mannheim) dans un volume complété à 50 μl avec de l'eau distillée stérile. Le mélange est recouvert de 50 μl d'huile minérale. L'amplification est effectuée dans un thermocycleur (Pharmacia) : 1 mn à 94°C, 1 mn à 65°C et 1 mn 30 à 72°C, pendant 25 cycles. Un aliquot de
5 μl est prélevé, après ces 25 cycles, et amplifié à nouveau 25 fois dans des conditions identiques.
Dix μl par échantillon sont analysés par électrophorèse en gel d'acrylamide 6% (Ausubel et al. 1987), 200 V pendant 1 h, et coloration au bromure d'éthidium (2 mg/1).
h) Clonage des fragments issus de la PCR
Les plasmides utilisés pour le clonage sont ceux décrits sur le tableau 1.
La procédure de ligature est la même que celle décrite ci-dessus, avec un rapport 1:1. La souche DH5α de Escherichia coli a été transformée par électroporation (Ausubel et al. 1987).
Clonage du mélange des fragments et protocole d'hybridation sur colonies. Un premier clonage sur l'ensemble des fragments, a été réalisé dans le plasmide pUBS-3 portant la résistance à l'ampicilline. Le plasmide est ouvert par restriction avec l'enzyme BamΗI, générant des extrémités cohésives compatibles avec les séquences palindromiques du site SauiAl. Les différents fragments issus de la PCR sont débarrassés de leurs adaptateurs par digestion avec l'enzyme Sau3Al . Ceci permet d'obtenir des extrémités proéminentes Sau3Al . Le plasmide et les fragments sont mélangés en quantité égale (200 ng d'ADN au total) et ligaturés selon le protocole ci-dessus dans 10 μl de volume reactionnel. Le mélange est utilisé pour transformer la souche DH5α d' Escherichia coli.
Cent cinquante μl d'une suspension de cellules compétentes d' Escherichia coli (20 ml de culture en phase exponentielle de croissance en milieu L, à 37°C, sous agitation, soit à la DO 0,5 à 600 mn, sont incubées 15 mn sur la glace, lavées dans l'eau distillée stérile à 4°C, centrifugées à 4 000 g pendant 20 mn et incubées 10 mn sur un lit de glace, deux fois, et le culot final est resuspendu dans 0,5 ml d'eau distillée stérile à 4°C) sont mélangés à 2,5 μl du mélange de ligature (50 ng d'ADN), dans une cuve d'électroporation. Aussitôt, la cuve est placée dans l'appareil et la solution soumise à un courant électrique (réglé sur 2,5 KV, 25 mF et 400 W). Un ml de milieu SOC (extrait de levure 0,5%, tryptone 2%, NaCl 2 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSθ4 10 mM, glucose 20 mM) est ajouté immédiatement, le mélange transféré en tube Eppendorf de 1,5 ml et mis à incuber 30 mn à 37 °C. Quatre transformations sont ainsi réalisées.
Dix à 100 μl des mélanges de transformation sont étalés sur milieu L gélose contenant 100 μg/ml d'ampicilline. Les boîtes sont incubées à 37°C pendant une nuit. Le reste du mélange est conservé à 4°C.
Les colonies résistantes à l'antibiotique sont comptées, et des dilutions sont effectuées sur les mélanges pour obtenir une concentration de 300 bactéries pour 100 μl, sachant qu'environ la moitié des bactéries seront mortes pendant leur conservation à 4°C. La totalité des mélanges de transformation est étalée,
100 μl par boîte de Pétri sur milieu gélose contenant l'antibiotique et les boîtes incubées à 37 °C, 24 à 48 heures (pour obtenir des colonies de 1 mm de diamètre).
Des membranes de nylon (Hybond N+ , Amersham), taillées à la mesure des boîtes, sont appliquées délicatement sur les colonies, et des repères de position membrane/boîte sont marqués. Les membranes sont alors retirées avec précaution et placées sur papier buvard imprégné de solution de lyse (Tris HC1 50 mM pH 8,0, saccharose 25%, EDTA 10 mM, lysozyme 1,5 μg/ml), 5 mn, côté en contact avec les bactéries vers le haut. Les membranes sont ensuite transférées sur un papier buvard imprégné de solution dénaturante (NaOH 0,5 N, NaCl 1,5 M, Triton X100 0,2%), 5 mn, puis sur solution neutralisante, deux fois 5 mn (Tris HC1 0,5 M pH 8,0, NaCl 2,5 M). Les membranes sont ensuite séchées et cuites 1 heure au four à 80 °C sous vide, pour fixer l'ADN. Les boîtes contenant les bactéries sont conservées à 4°C.
Les membranes sont préhybridées et hybridées, en utilisant comme sonde marquée au α ^p l'ensemble des fragments issus de PCR. Les protocoles de marquage radioactif et d'hybridation sont décrits ci-dessous. Après autoradiographie des membranes, les colonies présentant un signal d'hybridation, sont repérées grâce à l'orientation des membranes, des autoradiographies et des boîtes de culture. Ces colonies sont prélevées avec un cure-dent, inoculées à 10 ml de milieu L, avec ampicilline et incubées à 37 °C sous agitation une nuit. Les cultures sont centrifugées 10 mn à 6 000 g. Le culot est repris dans
50 ml de tampon Tris 50 mM pH 8,0, contenant 25% de sucrose. Un volume de 400 ml de MSTET (saccharose 5%, Triton X100 5%, EDTA 50 mM, Tris HC1 50 mM pH 8,0), additionnés de 7 μl de lysozyme à 40 mg/ml sont ajoutés et l'ensemble est porté à ébullition 45 s et plongé dans la glace. Le mélange est centrifugé à 4°C, 30 mn à 10 000g. Le surnageant est ensuite prélevé délicatement, l'ADN extrait une fois avec le mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique, précipité et resuspendu dans 20 μl de tampon TE pH 8,0.
Cinq μl de chaque préparation sont digérés en présence de 1 μg de RNAse A bouillie, les restrictions sont analysées par électrophorèse en gel d' acrylamide. Les clones contenant un insert sont repérés par comparaison des profils électrophorétiques avec le plasmide de départ.
Clonage des fragments prépurifiés par électroélution et sélection des clones sur milieu X-gsΛ.
Les fragments issus de PCR, débarrassés de leurs adaptateurs (100 ng de chaque fragment), sont séparés par électrophorèse sur gel d' acrylamide. Chaque bande est délicatement découpée au scalpel et récupérée (certaines bandes proches ne peuvent être séparées et sont prélevées ensemble). Chaque bande d' acrylamide est placée dans un boudin de dialyse (Spectrapore) dans de l'eau distillée. Les boudins sont placés dans une cuve d'électrophorese horizontale contenant du tampon TBE dilué au demi. Les bandes d' acrylamide sont orientées dans le sens de la longueur du boudin, côté anode. Deux cents volts sont appliqués pendant 1 heure. Le courant est alors inversé 10 s, pour décoller l'ADN de la membrane de dialyse. On vérifie sous lampe UV que l'ADN est bien sorti de l' acrylamide. La solution est alors homogénéisée, récupérée et l'ADN extrait une fois au phénol-chloroforme-alcool isoamylique, précipité et resuspendu dans 5 μl d'eau distillée.
Les ADN purifiés par électroélution sont mélangés à une quantité égale de vecteur (50 ng de chaque). Dans ce cas, il s'agit du plasmide pTZ19R, portant la résistance à l'ampicilline et le fragment α du gène de la β-galactosidase (lacZ). Le plasmide est ouvert par restriction avec l'enzyme BamΑl, dont le site est situé dans lacZ. La ligature et la transformation sont effectuées comme ci- dessus. Les bactéries sont étalées ensuite sur milieu contenant de l'ampicilline (100 μg/ml), de l'IPTG (Isopropylthiogalactoside; inducteur) et le substrat de l'enzyme, l'X-gal (O-nitrophenyl-βD-galactopyranoside, 100 μg/ml). Les colonies contenant un plasmide sont sélectionnées par l'ampicilline, les colonies contenant un plasmide avec insert sont identifiées par l'absence d'activité β- galactosidase : les colonies blanches sont mutées par insertion dans lacZ, les colonies bleues possèdent un système β-galactosidase fonctionnel. Les colonies blanches sont sélectionnées et analysées comme ci-dessus.
il Hybridations
Marquage des sondes au cχ32p par hybridation d'amorces au hasard ou "Random priming".
Cinquante ng d' insert purifié à partir du plasmide de clonage par digestion, électrophorèse en gel d' acrylamide et électroélution sont utilisés comme sonde. Le marquage est effectué avec le "Random primed DNA labeling kit" (Boehringer Mannheim). Cinquante ng d'ADN sont mélangés à 2 μl de tampon contenant des amorces hexanucléotidiques, 1 μl de chaque dNTP
(excepté le dATP). Le volume est complété à 14 μl avec de l'eau distillée stérile, porté à ébullition 3 mn, et le tube plongé dans la glace. Un μl de polymérase (fragment de Klenow) et 5 μl de (α ^P) dATP (50 μCi) sont ajoutés. Le mélange est laissé incuber 4 heures à température ambiante. La sonde marquée est ensuite purifiée (débarrassée des nucléotides marqués non incorporés et de courts oligonucleotides non spécifiques) par filtration sur Sépharose CL-6B, dans un tube Eppendorf de 0,5 ml percé, placé dans un tube de 1,5 ml, en centrifugeant 5 mn à 2 000 g. L'efficacité du marquage est vérifiée au détecteur de rayons β. La sonde est dénaturée juste avant l'hybridation par ébullition 3 mn, et le tube plongé dans la glace.
Hybridation des ADN en "dot-blot" ou dépôt en taches : Les ADN de différents micro-organismes (tableau 2) ont été dénaturés et fixés par la méthode alcaline proposée pour les membranes Hybond N + (Amersham). L'ADN génomique pour la méthode de Southern a été traité à l'aide de plusieurs endonucléases selon les instructions du fabricant (Boehringer, Mannheim). Les mélanges réactionnels ont été passés sur gel d'agarose 0,8 % en utilisant 1 μg de marqueur de taille (1 kb de ladder BRL). La méthode de Southern à été réalisée sur des membranes Hybond N + selon les instructions du fabricant. Préparation des membranes.
- membranes pour hybridation en "dot Mot"
Deux μg d'ADN par échantillons, dans un volume de 1,5 μl sont mélangés à un volume égal d'une solution de soude (NaOH 0,4 M, EDTA 1 mM) et déposés sur membrane de nylon (Hybond N + , Amersham). Lorsque tous les échantillons sont déposés, la membrane est placée, côté ADN vers le haut, 5 mn sur un papier buvard imprégné d'une solution de dénaturation (NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M), puis 1 mn sur une solution de neutralisation (Tris HC1 0,5 M pH 7,2, NaCl 1,5 M, EDTA 1 mM), 20 mn sur une solution de fixation (NaOH 0,4
M) et rincée 1 mn en 2X SSC (Citrate de sodium 0,03 M, NaCl 3 M). La membrane est ensuite séchée et peut être conservée à température ambiante.
- membrane pour hybridation de Southern.
Deux à trois μg d'ADN par échantillon sont digérés par des enzymes de restriction et séparés par électrophorèse sur grand gel d'agarose à 0,8% (300 ml). Après lecture, le gel est traité pour transférer l'ADN sur membrane de nylon. Le gel est traité deux fois 15 mn en HC1 0,25 M, rincé à l'eau distillée, incubé deux fois 15 mn en solution dénaturante (NaOH 1 M, NaCl 1,5 M), rincé à l'eau distillée et 30 mn en solution neutralisante (Tris HC1 0,5 M, NaCl 1,5 M pH 7,5).
Le montage suivant est ensuite réalisé : 6 feuilles de papier Whatmann 3M découpées à la taille exacte du gel et imbibées de 20X SSC (Citrate de sodium 0,3 M, NaCl 3 M) sont déposées au fond d'un bac. Le gel d'électrophorese est ensuite superposé à ces feuilles, recouvert ensuite de la membrane découpée à la taille du gel. Une feuille de papier Whatmann et une pile de "linges" secs (15 à
20 cm d'épaisseur), à la taille du gel également sont placés par dessus. Enfin une plaque de verre et un poids n'excédant pas un kg sont ajoutés. Le transfert de l'ADN s'effectue par capillarité pendant au minimum 6 heures. La membrane est ensuite récupérée, séchée et cuite au four à 80 °C sous vide. - Hybridation et lavages.
Les membranes sont préhybridées, à 65 °C, sous agitation, au minimum une heure dans une solution de 6X SSC, SDS 0,5%, lait écrémé 0,01 % . L'hybridation est réalisée dans un volume de 10 ml, en sachet plastique soudé, dans une solution de 6X SSC, SDS 0,1 %, lait écrémé 0,01 % contenant la sonde dénaturée, 17 heures à 65 °C.
Après hybridation, la membrane est lavée une fois en 3X SSC, SDS 0,5% , à 65 °C, deux fois en 0,3X SSC, SDS 0,5% à 65 °C, et pour des conditions stringentes deux fois en 0,1X SSC, SDS 0,5% à 68 °C.
La membrane est alors légèrement essuyée puis placée sous film plastique.
La membrane en fonction du nombre de coups/mn observés au compteur de rayons β est placée plus ou moins longtemps en présence d'un film d'autora- diographie dans une cassette à -80°C. L' autoradiographie est ensuite développée.
j) Séquençage direct sur plasmide
Le séquençage est réalisé directement sur plasmide double brin avec deux amorces choisies dans la séquence du gène lacZ à 150 nucléotides de distance du site de clonage. La réaction de séquence est réalisée par la méthode "dideoxychain termination" de Sanger et al. (1977), en utilisant le kit SequenaseT (United States Biochemical Corporation). Pour chaque échantillon, l'amorce directe et l'amorce reverse sont utilisées séparément. Pour chaque échantillon, une première étape d'élongation à partir de l'amorce est réalisée par l'ADN polymérase (sequenase) en présence d'une quantité limitante de dNTP et de (α ^P) dATP pendant 5 mn à température ambiante. Le mélange reactionnel est ensuite réparti, pour chaque échantillon, en quatre puits contenant des dNTP en quantité non limitante et pour chacun de ces puits un des didésoxynucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP). Cette réaction s'effectue pendant 5 mn à 37°C et est ensuite stoppée par ajout d'EDTA. Les échantillons peuvent être conservés à -20 °C et seront portés à ébullition 2 mn juste avant d'être déposés sur gel, leur dépôt étant toujours effectué dans l'ordre ddATP, ddCTP, ddGTP et ddTTP. La séparation des différents fragments est réalisée par électrophorèse en gel d' acrylamide (6% , urée 460 g/1 en tampon TBE), de 80 cm de long, à une puissance constante de 100 W (durée 3-6h).
Le gel est ensuite démoulé et fixé dans un mélange méthanol 10%, acide acétique 10%, transféré sur papier Whatmann 3M, recouvert d'un film plastique, et l'ensemble est séché par chaleur et sous vide dans un sécheur de gel. Le gel est ensuite placé avec un film d' autoradiographie dans une cassette, pendant une durée variable, selon le nombre de coups/mn au compteur à rayons β. Les séquences sont ensuite lues et saisies sur ordinateur pour être analysées. Les programmes utilisés sont ceux du GCG (University of
Wisconsin, Genetics computer Group, Devereux et al. 1984). Les recherches d'homologie de séquences sont réalisées dans les banques de données internationales Genbank et EMBL.
II) Résultais
a^ Détermination des conditions de soustraction Les conditions de biotinylation de l'ADN et de liaisons à la streptavidine ont été testées en même temps : 1 μg d'ADN de la souche 3937 d'Erwinia chrysanthemi coupé marqué au α3^P ont été mélangés avec 49 μg d'ADN de la souche 3937 coupé. Le mélange a été biotinylé de la manière décrite précédemment dans le chapitre des matériels et des méthodes. Dix μg d'ADN biotinylés ont été incubés avec différentes concentrations de billes enduites de streptavidine (0,5%, 1 %, 2,5% et 5%). Pour les solutions de 0,5, 1 et 2,5 % , une certaine radioactivité reste dans la fraction libre. La solution à 5% a été déterminée comme représentant la condition de liaison la plus efficace.
Le nombre de cycles de soustraction a été déterminé à l'aide des deux critères suivants: liaison de séquences homologues et enrichissement en séquences non homologues. Deux bibliothèques ont été obtenues avec les paires suivantes: (i) 100 ng de fragment Ω digéré par SaύiAl et marqués avec du α32P, 2 kb du fragment d'ADN Smr/Spcr (Prentki et Krisch 1984), ont été mélangés avec 150 ng de l'ADN génomique de la souche 3937 digéré par Sau Al, et soustrait avec l'ADN biotinylé de la souche 3937, (ii) 250 ng d'ADN de la souche 3937 digéré par Sau3Al et marqué avec du α32P a été soustrait avec l'ADN biotinylé de 3937. La récupération à chaque cycle de séquences non homologues (fragment Ω du contrôle (i)) dans la fraction libre et la liaison de séquences homologues (ADN de 3937 de contrôle (ii)) ont été estimées par comptage de la répartition de la radioactivité dans les fractions libres et liées. Après quatre cycles de soustraction, le facteur d'enrichissement (rapport entre les séquences hétérologues isolées et les pertes en séquences homologues) est de 14 et la fixation de séquences homologues de 99 % . Toutefois quelques pertes ont eu lieu à chaque cycle pour les séquences hétérologues (approximativement 40 %), et après 4 cycles les pertes sont de 80
%. Pour cette raison, 4 cycles ont été estimés comme étant suffisants pour permettre l'enrichissement en séquences hétérologues et pour éviter des pertes trop importantes. > Soustraction génomique
Quatre cycles d'hybridation de soustraction ont été réalisés pour chacune des paires (ADN cible/ ADN piège) suivantes : (i) contrôle positif souche PMV 4071 /souche 3937 (fragment d'insertion oméga (Ω) du mutant 4071 dans la souche Ech 3937 en tant qu'ADN cible et la souche 3937 en tant qu'ADN piège), (ii) la bibliothèque soustraite entre 8620 et CH26 (souche 8620 d'Ecα en tant que source de sondes et CH26 d'Ecc en tant qu'ADN piège) et (ii) un contrôle négatif CH26-CH26. Les résultats de la soustraction sont présentés sur la figure 1. Le contrôle positif présente deux fragments amplifiés de 230 et 300 pb approximativement. Le traitement par l'enzyme de restriction est Sau3Al du fragment Ω a généré huit fragments principaux de 460, 300, 230, 190, 150, 140, 80 et 60 pb. Parmi tous ces fragments, seule une partie (33% du fragment) a été réisolée par soustraction génomique. La bibliothèque différentielle entre Eca et Ecc présente 6 fragments d'ADN principaux (190, 200, 250, 300, 400 et
410 pb) et une bande double d'environ 450 pb moins claire que les autres. Aucun fragment amplifié n'est présent ni dans le contrôle négatif de soustraction, ni dans le contrôle négatif de contamination PCR. Dans tous les échantillons de soustraction génomique, de l'ADN coupé à été observé sur gels d'électrophorese.
c^ Clonage des sondes à partir de la bibliothèque soustraite Les échantillons provenant de la PCR ont été traités par Sau3Al avant clonage afin de retirer les adaptateurs et de posséder des extrémités BamΑl compatibles. Premièrement, la bibliothèque entière à été utilisée pour un clonage global avec pUBS-3 traité par 2-temHI en tant que vecteur. L'hybridation des colonies (Maniatis et al., 1982) après clonage de la bibliothèque entière, a permis d'isoler deux inserts contenant des clones en utilisant toute la bibliothèque en tant que sonde. Une seconde approche a consisté en le clonage, après séparation de la bibliothèque en quatre fractions sur gel de polyacrylamide à 6% et purification par électroélution (Maniatis et al, 1982). Le vecteur de clonage utilisé dans ce cas a été pTZ-19R traité par -Bα HI, les colonies blanches de E. coli DH5α transformées ont été sélectionnées sur milieu X-gal. Cette seconde stratégie a conduit a l'obtention de 4 clones contenant des inserts. Les six clones ont été dénommés respectivement A, B, C, D, Ε et F dans l'ordre de taille décroissante (voir figure 2, et tableau 1). d) expériences d'hybridation
Les hybridations ont été réalisées avec les six sondes. Pour la plupart des souches, les hybridations ont été réalisées au moins deux fois sur des membranes séparées. Le tableau 2 illustre les résultats. Les sondes E et F donnent un signal seulement pour un nombre restreint de souches d'Ecα. La sonde A donne un signal positif pour la plupart des souches testées dont les sou¬ ches d'Ecc, et est absente dans certaines souches et dans celle de l'ADN piège. Les résultats obtenus avec la sonde B sont représentés sur la figure 3. Dans des conditions de lavage stringentes, seules les souches d'Ecα typiques sont hybridées, et dans des conditions de lavages moins stringentes quelques hybridations croisées ont été observées avec des souches d'Ecb. La sonde B est donc très spécifique des Eca, de même que la sonde B' (qui diffère de la sonde B que par un nucleotide en moins), cette dernière permettant de retrouver la même séquence de 200 nucléotides chez les souches 88.33, 15.26, CH3 et 88.1 d'Ecα. Pour la sonde C, toutes les souches typiques d'Ecα présentent un signal positif et quelques souches d'Ecc également. Concernant la sonde D, toutes les souches d'Ecα ("atypiques et typiques") et quelques souches d'Ecc ont été hybridées. L'ADN de la souche 86.20 d'Ecα a été digéré par plusieurs endonucléases
(-BαmHl, Clal et Sau3Al) et transféré après électrophorèse sur des membranes (technique dite de Southern). Les résultats d'hybridation avec les six sondes sont présentés sur la figure 4. Différents fragments d'ADN obtenus avec différentes endonucléases ont été hybrides avec les 6 sondes, indiquant ainsi que les sondes ne sont pas regroupées dans l'ADN génomique (cluster) de la souche 86.20 d'Ecû. De plus, l'absence de signal d'hybridation avec l'ADN d'Ecc CH26 et la présence de ce signal avec l'ADN d'Ecα 86.20 indique que les sondes correspondent à la bibliothèque de soustraction.
e) Séquençage de l'ADN
Les séquences des sondes A, B, C, D, Ε et F ont été obtenues. Les résultats sont représentés sur la figure 5. Pour chaque sonde, des homologies ont été recherchées sur les bases de données Genbank et ΕMBL. Aucune homologie significative n'a été observée pour les séquences à l'exception de la sonde A, qui présente une homologie importante avec la séquence du gène put? de Salmonella typhimurium et E. coli. Ce gène code respectivement pour une proline perméase (73,8 % d' homologie) et un transporteur de proline (73,2 % d' homologie). TABLEAU 1 : Souches bactériennes et plasmides
caractéristiques source ou référence
E. coli
DH5 endAl hsdR17(rγ_- mγ_+) supE44 Bethesda Research thi-1 λ" recAl gyrA §80dlacZAM15 Laboratories A(lacZYA-argF)U169
Eca
86.20 souche isolée à partir de pomme de B. Jouan (Station de terre (France, 1986) Pathologie Végétale, INRA, Le Rheu, France)
Ecc
CH26 souche isolée à partir de pomme de O. Cazelles terre (Suisse, 1985) (Changins, Suisse)
Ech
3937 souche isolée à partir de Saintpaulia Kotoujansky et al. ionantha (1982)
PMV 3937 peïEr, fragment Ω Smr-Spcr M. Boccara
4071 de R100.1 dans le site de restriction (Laboratoire de
Bgia Pathologie Végétale, INRA INA P-G, Paris, France)
TABLEAU 1 (suite) : Souches bactériennes et plasmides
caractéristiques source ou référence
plasmides pUBS-3 dérivé pUC contenant G. Murphy (IPS, pBLUESCRIPT Norwich, UK) pHP45Ω dérivé pUC contenant un fragment Prentki and Krisch
Smr-Spcr de RlOO.l (1984) pTZ19R dérivé pUC avec un promoteur de Mead et al. (1985) l'ARN polymérase T7 pPMV174 dérivé pUBS-3 contenant la sonde A Collection du dans le site BαmHl (Apr) laboratoire INRA (Pathologie Végétale, Paris) pPMV176 dérivé pTZ19R contenant la sonde
B dans le site BαmHl (Apr) pPM V 177 dérivé pTZ 19R contenant la sonde
C dans le site BamΑl (Ap1*) pPMV175 dérivé pUBS-3 contenant la sonde D dans le site -Bα Hl (Apr) pPMV 178 dérivé pTZ 19R contenant la sonde
E dans le site BamΑl (Apr) pPMV179 dérivé pTZ19R contenant la sonde
F dans le site -BαmHl (Apr)
TABLEAU 2. Résultats de l'hybridation
Souches hôtes pays résultats de l' hybridation année avec : les sondes
A B C D E F
Eca
88.33 pomme France, + + + + + - de terre 19881
88.45 ' France, + + + + + - 19881
88.1 ' France, + + + + - - 19881
88.22a France, + + + + + + 19881
88.24 France, + + + + - - 19881
88.30a ' France, + + + + + - 19881
87.7 ' France, + + + + - - 19871
87.13 ' France, + + + + + + 19871
87.16a ' France, + + + + + - 19871
87.16b France, + + + + + - 19871
86.14.11 France, + + + + - + 19861
86.20 ' France, + + + + + + 19861
511 ' France, + + + + +
19642
SFl. l • Allemagne3 + + + + + 161 Hollande4 + + + + + +
Cipll4 ' Pérou, + + + + + + 19805
Cipl25 ' Pérou, + + + + - - 19805
Cipl31 ' Pérou, + + + + - - 19805
Cip026 ' Pérou, + + + + + + 19805
SH164.4 ' La Réunion, + + + + + + 19883
CH3 ' Suisse, + + + + - - 19856 TABLEAU 2 (suite 1)
CH5 Suisse, + + + + -
19856
CH6 Suisse, + + --- + + -
19856
SF18.296 Suisse, + + + + + +
19583
1329 UK, 19672 + + + + _ +
1330 UK, 19672 + + + + - -
SCRI1043 UK, 19857 + + + + + +
1526 UK, 19572 + + + + - +
1527 USA, 19732 + + + + + +
1525 USA, 19692 + + + + + +
1453 tomate France, + + + + -
19732
1546 France, + + + + - -
19732
89.19* pomme Argentine, + - - --- - - de 19891 terre
1H* eau Espagne, + - - + - -
19898
40H* " Espagne, + - - --- - -
19898
Ecb
2121 betterave USA, 19722 +
2122 USA, 19722 + - - - - -
1520 tournesol Mexico2 . - - . . .
Ecc
SH230.134 banane Cuba3 + - -
CM1 choux Malawi, +
19863
798 carotte USA2 - - - -
(ATCC 495)
CH15 céleri Suisse, - - - + - -
19886
1489 chrys- France, - - - - . . anthème 19712
1458 USA, 19712 + - + - - -
SH230.115 maïs Cuba3 + - - -- - -
1350 con- Italie2 + - + - - - combre
1285 cycla- Grèce2 + - - - - mène
SΕ99.1 chicorée France,
19851 TABLEAU 2 (suite 2)
1488 iris France, -
19732
SB89.7 poireau France, -
19823
2046τ pomme Danemark + - - - de 19522 terre
88.22c France, -
19881
88.29al France, + - - -
19881
88.44 " France, -
19881
87.25 " France, -
19871
86.14.51 France, -
19861
S99 " France, - - - +
19771
S101 France, -
19771
76.26 " France, -
19761
PM2 Malawi, + - - +
19863
194 " Maroc, -
19632
Cip360 Pérou, + - + -
19845
Cip361 Pérou, + - + -
19845
Cip009 Pérou, + -
19775
CH24 Suisse, . . . .
19876
CH26 " Suisse, - . . .
19856
SCRI193 USA7 + - - -
1336 UK, 19672 - -
Si82.1 Vietnam, --- - - -
19893
SG162.6 tournesol France, -
19873 TABLEAU 2 (suite 3) 1403 Yougo- - - - slavie,
19692
797 tabac USA, 19512 + - + - . .
SG39.1 ? La Réunion, 4- - -
19873
La Réunion,
SG39.3 ? 19873 + - + - - -
Eco
1893 céleri France, - - -
19762
CHU Suisse, + - -
19856
2155 endive France, +
19832
2154 France, + - - - -
19822
1892 France, + - -
19812
1959 France, 4-
19802
1878 France, - - -
19792
1879 France, 4-
19792
1880 France, - - - - -
19792
1646.2 poireau France, 4-
19803
1654 France, 4- - - - - 4-
19803
CH4 laitue Suisse, - - _ - - -
19866
Ech
3716 kalen- France, 4- choe 19789
1596 maïs France, 4- - . . . -
19782
EP22 philo¬ Martinique 4- - . . . - dendron 198710
1271 maïs Egypte . - - . . .
19612
SH230-C94 tabac Cuba3 - - . . .
3665 diffenba- France 4- - - - - chia 19749 TABLEAU 2 (suite 4) 3937 saint¬ France 4- paulia 19779
1499 maïs France 19732
1888 pomme France 4- de terre 19782 CH29 pomme Suisse de terre 19886
2267 pomme Australie de terre 19782 1871 banane Côte 4- d'Ivoire
19762
CH36 pomme Suisse de terre 19876
1275 oeillet USA 4-
19712
3805 philo¬ France 4- dendron 19769
2015 pomme France 4- de terre 19752
1236 parth- USA 4- enium 19452
B374 pelar- Comores 4- gonium i9602
2013 dalhia France 4-
19742
2051 diffenba- USA 4- chia 19572
Erwinia aubépine France 11 amylovora [1] Erwinia non France 11 4- herbicola [1] patho¬ gène
Erwinia rhubarbe Suisse6 4- rhapontici[l] Pseudomonas fluoré ail 19763 pv. lomagnae [1] Pseudomonas pomme de USA, 19703 marginalis [1] terre Pseudomonas pomme de Costa Rica3 solanacearum [1] terre TABLEAU 2 (suite 5)
Pseudomonas France 11 syringae pv. phaseoli- co/α[l]
Pseudomonas Pays-Bas4 4- sp. [2]
Pseudomonas chicorée Suisse6 viridiflava
[1]
Rhizobium France 11 meliloti [2]
Azorhizobium Sesbania Sénégal 10 caulinodens rostrata
[1]
Klebsiella FrancelO pneumoniae
[1]
Agrobacterium France 11 tumefaciens
[1]
Xanthomonas France 11 campestris
[2]
Clavibacter pomme USA, michiganensis de terre 19763
[1]
Brucella France 11 melitensis
[1]
Yarrovia France 1 lipolytica
[1]
Yersinia salmo France, ruckeri [1] 1982H
Yersinia patho¬ ATCC- 4- pseudo- gène 23207 tuberculosis humain -29833
[1] bactéries pomme Espagne8 saprophytes de terre
[8]
Escherichia coli [1]
Bacillus pomme France, polymixa de terre 19793
[1] (.) Non effectué. (*) Souche Eca atypique, récemment identifiée en tant que souche Ecc par leurs caractéristiques phénotypiques et génotypiques. (} ) Souche type de l'espèce, [n] Nombre de souches testées. (1) Bernard Jouan, Institut National de la Recherche Agronomique, Rennes, France, collection per¬ sonnelle. (2) CFBP, Collection Française de Bactéries Phytopathogènes, INRA, Angers, France. (3) Régine Samson, Institut National de la Recherche Agronomique, Angers, France. (4) IPO, Research Institute for Plant Protection, Wageningen, Pays Bas. (5) CIP, International Potato Center, Lima, Pérou. (6) Olivier Cazelles, Station Fédérale de Recherches Agronomiques, Changins,
Suisse, collection personnelle. (7) SCRI, Scottish Crop Research Institut, UK. (8) Maria Lopez, Instituto Valenciano De Investigaciones Agrarias, Espagne, collection personnelle. (9) Monique Lemattre, Institut National de la Recherche Agronomique, Versailles, France, collection personnelle. (10) Claudine Elmerich, Institut Pasteur, Paris, France, collection personnelle. (H) CFISM,
Collection Française Informatisée de Souches Microbiennes, Institut National de la Recherche Agronomique, France.
BIBLIOGRAPHIE
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Smith, C , and Bartz, J.A. 1990. Variation in the Pathogenicity and agressivness of strains of Erwinia carotovora subsp. carotovora isolated from différent host. Plant disease. 74 : 505-509.
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Thomson, S.V., Hildebrand, D.C, and Schroth, M.N. 1981. Identification and nutritional differentiation of the erwinia sugar beet pathogen from members of Erwinia carotovora and Erwinia chrysanthemi. Phytopathology. 71 : 1037- 1042.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
(INRA)
(B) RUE: 147 RUE DE L'UNIVERSITE (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75338 CEDEX 07
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE PARIS-GRIGNON (INA P-G)
(B) RUE: 16 RUE CLAUDE BERNARD
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75231 CEDEX 05
(ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CARACTERISTIQUES DES ERWINIA CAROTOVORA, ET LEURS UTILISATIONS POUR LE DIAGNOSTIC DE PATHOLOGIES CAUSEES PAR CES BACTERIES (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 15
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE: (A) NUMERO DE DEPOT: FR 9306072 (B) DATE DE DEPOT: 19-MAY-1993
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 404 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GATCATACCC AGCAGTGCGC CGTTGCGGTC ATACGCGGCC ATAGCAGAGA AATCAAAATC 60
ACCGGTCCGA AGGCGGCACC GAAACCTGCC CAAGCATAGC TCACCAGACC CAGTACACGG 120 TTTTCAGGGT TCAGCGACAG CGCAATAGCA ATGATAGCGA CTAATAGCAC CATCGTGCGG 180
CCCACCCACA CCAATTCTTT CTGACTGGCA TTTTTGCGCA GGAATGGCTT GTACAAATCT 240 TCGGTGATGG CACTGGAGCA CACCAGCAAT TGGCAGCTCA GCGTACTCAT GACAGCAGCT 300
AAAATCGCAG ACAGCAGAAT GCCGGCAATC CACGGATTGA ACAGCAGCAT AGATAGCTCG 360 ATAAAGACGC GCTCGCTATT TTGCGCCACG TTACCCGCCT GATC 404
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GATCGCTCAT TAGATTTCAT ACATCAGAAA TTGAGCAATA TATCCTTAGC AACATAAGGC 60
AGCATTGAAT CGCCACAGAG AGTACAGTTG TCACAATGAA TCCCTACTTA ACACGGAACG 120 CCCGCTGTTC GCTCATTACG GCCTGCCAAA TTTGATTGTA TTCTGTCCGC GAAAATTGTT 180
GTGCCTGATA GCGATAAATG CGTGTTCGAT GGTTTCCAGA TAGGCTTCAG CCCTTTCTTC 240
ATTAAAATGC CGCAGGCATA AAGATAAATG TCTTCCACAC TCTCGAGACA TCACCGTCCG 300
ATC 303
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 302 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GATCGCTCAT TAGATTTCAT ACATCAGAAA TTGAGCAATA TATCCTTAGC AACATAAGGC 60
AGCATTGAAT CGCCACAGAG AGTACAGTTG TCACAATGAA TCCCTACTTA ACACGGAACG 120
CCGCTGTTCG CTCATTACGG CCTGCCAAAT TTGATTGTAT TCTGTCCGCG AAAATTGTTG 180
TGCCTGATAG CGATAAATGC GTGTTCGATG GTTTCCAGAT AGGCTTCAGC CCTTTCTTCA 240 TTAAAATGCC GCAGGCATAA AGATAAATGT CTTCCACACT CTCGAGACAT CACCGTCCGA 300
TC 302 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 290 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GATCCCGTAT GGTGAATATG TTACATACGG AACCGTAGCC AAAGATGTTG CGGCTGTTAT 60 GGGTAAAACC AGCATGTCAG CGCAGGCTAC CGGTGGGGCG GTTGGTCACA ACCCAATATC 120
TATTATCATT CCTTGCCACC GGGTCATAGG CACCAATAAC AGCTTGACCG GGTATGCTGG 180
AGGTATCGCA AAAAAAATTC AGCTACTTGA ACTAGAAGGT GTTAACACCG TGAATATGAG 240
CGTCCCTATC AAAGGGACGG CTTTATGATA ATAATCGTCT CTAGCCGATC 290
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 233 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
GATCACGGCG CTCAGCGGCC TGACTGCCGC ATTGGAAACA GAGCCCCAGC GACCGATACG 60
CAGCCTATCT GTGCTACCGG AATCAGAACG TCAACAATTG CTGATTGGCT TTAACGCCAC 120
CGATACGGAT AGCCTGCCGC ACGCGCTGAT TCACGAGCGC ATCGAACACG TGGCGAGCCA 180
GACGCCGGAT GCCGTTGCGG TTATATTCGG TAAGCACACC CTCAGTTACG ATC 233
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 212 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
GATCAGTAAA GATGAGTGGT TGTTACTTCA ATCTGACCAA AGCAAATCCT ACGCGAGGAC 60 GCCGTAGCAC TGATAATCCT TATAGTGGTC TATTACGCTG TGGATGCGGT GGTGCATTAA 120
TAAAAAGAAA GAGCACGGTA AGAGGGAAAC TGTACGTTTA TCATGGTTGC CTAAACGCCA 180
AAGATGGTCG TTGTTCTCAA AATCTCTCGA TC 212
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 183 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: GATCGCTTCC GGCTTTTATT AACTTAAACA GTCAATGAGC AATGCATCTA ATTCAATCCA 60
AGCGTCTTCT AATCTGAATG CGATTTCAGG CTTATTTTCT TTTCCATCAA AACTCACATA 120
TGCATTTCGT ACCATTTGTG GAATGGTATA TAAATAAAGC GCCAACTTCT TATCAATAAG 180
ATC 183
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
TAAGGCAGCA TTGAATCGCC ACAGAGAGTA 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: ACACGCATTT ATCGCTATCA GGCACAACAA 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
GATCGCTCAT TAGATTTCAT ACAT 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomiçfue) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
TGGAAGACAT TTATCTTTAT GCCT 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12;
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: CGCTCATTAG ATTTCATA 18 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: ATCGGACGGT GATGTCTC 18
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
GCAACATAAG GCAGCATTGA 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomitïue)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CGAGAGTGTG GAAGACATTT 20

Claims

REVENDICATIONS
1. Séquences nucléotidiques comprenant tout ou partie des séquences telles qu'obtenues par soustraction génomique entre deux souches différentes d'Erwinia carotovora, ou comprenant tout ou partie des séquences bordant ces dernières sur le génome de la souche d'Erwinia carotovora dont sont issues les séquences obtenues par soustraction génomique, lesdites séquences nucléotidiques étant susceptibles de s'hybrider avec le génome d'au mois une souche bactérienne appartenant à l'espèce Erwinia carotovora, et ne pouvant pas s'hybrider avec le génome d'au moins une souche appartenant à cette même espèce.
2. Séquences nucléotidiques selon la revendication 1 , caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles de s'hybrider avec le génome d'au moins une souche bactérienne appartenant à une sous-espèce déterminée d'Erwinia carotovora, mais pas avec celui d'au moins une souche appartenant à une sous-espèce d'Erwinia carotovora différente de la précédente, ou susceptibles de s'hybrider avec le génome d'au moins une souche appartenant à une sous-espèce déterminée d'Erwinia carotovora, mais pas avec celui d'au moins une souche appartenant à cette même sous-espèce.
3. Séquences nucléotidiques selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles de s'hybrider avec le génome d'au moins une souche bactérienne pathogène chez une plante déterminée, mais pas avec celui d'au moins une souche non pathogène chez cette même plante, cette souche non pathogène appartenant ou non à la même sous-espèce d'Erwinia carotovora que la souche pathogène précédente.
4. Séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que la soustraction génomique entre les deux souches d'Erwinia carotovora est réalisée de la manière suivante:
- l'ADN d'une première souche d'Erwinia carotovora, ou ADN cible, est coupé en petits fragments, d'environ 100 à environ 1 000 nucléotides, notamment par action d'enzymes de restriction,
- l'ADN d'une deuxième souche d'Erwinia carotovora, ou ADN piège, est coupé en fragments, d'environ 1 000 à environ 10 000 nucléotides, notamment par sonication, ces fragments étant par la suite marqués, - les fragments susmentionnés d'ADN cible et d'ADN piège sont mélangés dans des proportions telles que l'ADN piège soit en excès par rapport à l'ADN cible,
- les fragments d'ADN cible et piège ainsi mélangés sont dénaturés par chauffage, ce qui conduit à la formation de fragments d'ADN cible et piège simple brin,
- puis les fragments d'ADN simple brin obtenus à l'étape précédente sont placés dans des conditions d'hybridation telles qu'elles permettent la formation de fragments d'ADN double brin constitués de deux brins d'ADN cible (homoduplex cible), ou de deux brins d'ADN piège (homoduplex piège), ou encore d'un brin d'ADN cible et d'un brin d'ADN piège (hétéroduplex),
- les fragments d'ADN double brin obtenus à l'étape d'hybridation précédente, sont ensuite mis en présence d'un réactif ayant une affinité pour le marqueur susmentionné, ce réactif étant immobilisé sur un support solide de sorte que les homoduplex pièges et les hétéroduplex marqués demeurent fixés sur le support solide par liaison entre le marqueur utilisé pour marquer l'ADN piège et le réactif susmentionné,
- récupération, notamment par filtration ou sédimentation du support solide, des homoduplex cibles non marqués restant donc en solution et constituant les séquences nucléotidiques contenues dans le génome de la première souche d'Erwinia carotovora, mais pas dans le génome de la deuxième souche, et donc susceptibles de s'hybrider avec le génome de la première souche, mais pas avec celui de la deuxième souche.
5. Séquences nucléotidiques selon la revendication 4, caractérisées en ce que la première souche d'Erwinia carotovora est une souche pathogène chez une plante déterminée, tandis que la deuxième souche d'Erwinia carotovora n'est pas pathogène, dans les mêmes conditions (de culture, climatiques, etc.) que pour la souche précédente, chez cette même plante.
6. Séquences nucléotidiques selon la revendication 5, caractérisées en ce que la souche d'Erwinia carotovora pathogène est une souche d'Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca) responsable de pourritures chez certaines plantes, notamment de la jambe noire de la pomme de terre, et la souche d'Erwinia carotovora non pathogène est une souche d'Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc) n'induisant pas de pourritures chez ces mêmes plantes.
7. Séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles correspondent à l'une des séquences nucléotidiques A à F représentées sur les figures 1 à 6 respectivement, ou à leurs séquences complémentaires, ou à des fragments de ces séquences, ou à toutes séquences susmentionnées modifiées par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides, lesdits fragments ou séquences modifiées étant capables, tout comme les séquences A à F susmentionnées, de s'hybrider avec le génome de souches d'Erwinia carotovora pathogènes.
8. Séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisées en ce qu'elles correspondent à la séquence nucleotidique B représentée sur la figure 2, ou à sa séquence complémentaire, ou à des fragments de ces séquences, ou à toutes séquences susmentionnées modifiées par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides, lesdits fragments ou séquences modifiées étant capables, tout comme la séquence
B susmentionnée, de rester hybridées avec le génome des souches d'Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca) pathogènes, notamment dans les conditions d'hybridation définies ci-après: hybridation dans 6 SSC, 0,1 % SDS et 0,01 % de lait écrémé à 65 °C pendant une nuit, suivie plus particulièrement par deux lavages de 30 minutes à 68°C, 0,1 SSC, 0,5% SDS.
9. Séquences nucléotidiques selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont capables de rester hybridées avec le génome des souches d'Eca pathogènes, ainsi qu'avec le génome des souches d'Erwinia carotovora subsp. betavasculorum (Ecb) pathogènes, notamment dans les conditions d'hybridation définies ci-après: hybridation dans 6 SSC, 0,1 % SDS et 0,01 % de lait écrémé à 65 °C pendant une nuit, suivie plus particulièrement par deux lavages de 30 minutes à 65°C, 0,3 SSC, 0,5% SDS.
10. Séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisées en ce qu'elles sont marquées, notamment de manière radioactive, enzymatique, par un composé fluorescent, par une liaison à une molécule antigénique (susceptible d'être reconnue par des anticorps) ou à toute autre molécule susceptible d'être directement ou indirectement détectée à l'aide de réactifs, cette liaison pouvant éventuellement être effectuée par l'intermédiaire d'un bras espaceur, notamment par l'intermédiaire d'une séquence nucleotidique constituée d'environ 5 à 100 nucléotides située au moins à l'une des extrémités de ces séquences.
11. Séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées en tant que sondes nucléotidiques pour la détection des souches d'Erwinia carotovora pathogènes.
12. Couples d'amorces utilisés pour l'amplification du nombre de copies des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 11 , ou des séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans le génome des souches d'Erwinia carotovora pathogènes, avec lesquelles lesdites séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 11, sont susceptibles de s'hybrider, ces amorces étant avantageusement constituées d'environ 7 à environ 30 nucléotides issus des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 10, et étant le cas échéant marqués notamment de la manière indiquée dans la revendication 10.
13. Couple d'amorces selon la revendication 12, caractérisé en ce que les deux amorces répondent aux formules suivantes: B105 5' TAAGGCAGCATTGAATCGCCACAGAGAGTA 3' (SEQ ID NO 8) B106 5' ACACGCATTTATCGCTATCAGGCACAACAA 3' (SEQ ID NO 9)
14. Procédé de détection et d'identification des souches d'Erwinia carotovora pathogènes éventuellement présentes dans le sol ou l'eau, ou encore chez un hôte, notamment chez les plantes et/ou les semences, susceptible d'être un porteur apparemment sain de telles bactéries et se trouvant en phase latente d'infection, ce procédé comprenant les étapes suivantes:
- le traitement d'un échantillon prélevé dans le sol ou l'eau ou sur cet hôte de manière à rendre le génome de ces Erwinia carotovora accessible aux sondes et/ou aux amorces définies dans les revendications 11 à 13, et le cas échéant à toute ADN ou ARN polymérase permettant de répliquer les deux brins de l'ADN génomique ou l'ARN en dérivant,
- la mise en contact de l'échantillon ainsi traité avec des sondes selon la revendication 11, et/ou avec des amorces selon la revendication 12 ou 13,
- le cas échéant, l'amplification à l'aide de couples d'amorces selon la revendication 12 ou 13, du nombre de copies des séquences nucléotidiques spécifiques des Erwinia carotovora pathogènes, et contenues dans le génome de ces bactéries susceptibles d'être présentes dans cet échantillon biologique, et avec lesquelles sont susceptibles de s'hybrider les sondes ou amorces susmentionnées, et/ou l'amplification du nombre de copies de sondes selon la revendication 11,
- la détection de la présence éventuelle desdites séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans les génomes des Erwinia carotovora pathogènes, notamment à l'aide des sondes susmentionnées avantageusement marquées, lesdites séquences étant hybridées avec les sondes susmentionnées, et donc de la présence des Erwinia carotovora pathogènes responsables de cette pathologie dans l'échantillon étudié.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est réalisé à l'aide de tout ou partie de la sonde constituée de la séquence nucleotidique B représentée sur la figure 2, le cas échéant marquée, notamment de la manière indiquée dans la revendication 10, et/ou à l'aide du couple d'amorces selon la revendication 13, le cas échéant marquées, notamment de la manière indiquée dans la revendication 10.
16. Procédé selon la revendication 14 ou la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est appliqué au diagnostic de l'éventuelle apparition d'une pathologie causée par les Erwinia carotovora, chez un hôte tel que défini dans la revendication 14.
17. Procédé selon la revendication 15 et la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est appliqué au diagnostic de l'éventuelle apparition de la jambe noire causée par les Eca, notamment chez la pomme de terre, ou de la nécrose racinaire causée par les Ecb, notamment chez la betterave à sucre, chez un hôte tel que défini dans la revendication 14.
18. Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon la revendication 11, et/ou au moins un couple d'amorces telles que décrites dans la revendication 12 ou 13.
19. Kit selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une ADN ou ARN polymérase thermorésistante, - un milieu reactionnel avantageusement constitué, dans le cas de la technique PCR, de tampon Tris-HCl 10 mM , pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01 % de gélatine, de cofacteurs de l'ADN-polymérase, notamment d'ions Mg2+ et K+ , et des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) ou des ARN (dCTP, dATP, dGTP, dUTP).
20. Vecteur, notamment plasmidique, contenant en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une séquence nucleotidique selon l'une des revendications 1 à 10.
21. Hôte cellulaire transformé par un vecteur selon la revendication 20, et dans lequel ledit vecteur, ou la séquence nucleotidique selon l'une des revendications 1 à 10, intégrée dans le génome de l'hôte, est susceptible de se répliquer.
22. Procédé d'obtention d'une séquence nucleotidique selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant les étapes suivantes:
- mise en culture d'un hôte cellulaire selon la revendication 21, transformé par un vecteur selon la revendication 19,
- récupération des vecteurs à partir de cet hôte cellulaire, notamment par un traitement de lyse cellulaire approprié,
- récupération de la séquence nucleotidique susmentionnée par traitement des vecteurs récupérés à l'étape précédente, à l'aide d'enzymes de restriction appropriés,
- purification de la séquence nucleotidique ainsi obtenue, notamment par électrophorèse sur gel.
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