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WO1996000299A1 - Fragments d'acides nucleiques, derives du genome de mycobacterium xenopi et leurs applications - Google Patents

Fragments d'acides nucleiques, derives du genome de mycobacterium xenopi et leurs applications Download PDF

Info

Publication number
WO1996000299A1
WO1996000299A1 PCT/FR1995/000831 FR9500831W WO9600299A1 WO 1996000299 A1 WO1996000299 A1 WO 1996000299A1 FR 9500831 W FR9500831 W FR 9500831W WO 9600299 A1 WO9600299 A1 WO 9600299A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fragment
xenopi
sequence
seq
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
PCT/FR1995/000831
Other languages
English (en)
Inventor
Mathieu Picardeau
Véronique VINCENT
Original Assignee
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur filed Critical Institut Pasteur
Publication of WO1996000299A1 publication Critical patent/WO1996000299A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)

Definitions

  • the present invention relates to fragments of nucleic acids, derived from the genome of Mycobacterium xenopi, to their applications in typing and to the specific identification of MycoJbacteriuin xenopi and to screening for Mycobacterium xenopi infections thus believed to be plasmids containing said fragments.
  • M. xenopi represents one of the frequently isolated species, among the pathogenic mycobacteria and constitutes, with M. kansasii and M. avium, the main agent of pulmonary infections due to opportunistic mycobacteria in sero-negative patients against the human immunodeficiency virus.
  • M. kansasii and M. avium the main agent of pulmonary infections due to opportunistic mycobacteria in sero-negative patients against the human immunodeficiency virus.
  • the pulmonary diseases due to these different mycobacteria cannot be distinguished clinically, radiologically or histologically.
  • Nosocomial lung diseases have also been demonstrated and are due to the presence of M. xenopi in the environment and in particular in tap water.
  • the presence or absence of mycobacteria can also be determined by hybridization with probes, preferably non-radioactive, which are either probes specific for the DNA sequences of the different species of mycobacteria; or probes specific to a conserved portion of 16S RNA, which have simplified and reduced the identification time for mycobacteria.
  • probes preferably non-radioactive, which are either probes specific for the DNA sequences of the different species of mycobacteria; or probes specific to a conserved portion of 16S RNA, which have simplified and reduced the identification time for mycobacteria.
  • These probes have shown their interest in the identification of the tuberculosis bacillus, M. avium, M. intracellulare and M. gordonae (M. GOTO et al., J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 2473 -2476; L. LEBRUN et al., 1992, J. Clin. Microbiol., 30, 2476- 24778), but cannot be used
  • Direct sequencing of the amplified product provides a certain means of identification, but requires, for routine application, an automatic sequencer, which is an investment that is far too large for most laboratories.
  • the present invention has, therefore, given itself the aim of providing a specific identification and / or screening method for M. xenopi, allowing rapid identification of a species and / or detection of small quantities of DNA extracted from the germs, themselves in limited number, and revealing the presence of said mycobacteria, directly in the pathological samples.
  • the subject of the present invention is a nucleotide sequence, characterized in that it consists of a nucleotide sequence, specific for M. xenopi, contained in a Pstl-Pstl sequence of 1200 base pairs (bp) of the genomic DNA of M. xenopi or a fragment thereof, and in that it does not hybridize, under stringent hybridization conditions, with any other nucleotide sequence of mycobacterium.
  • nucleotide sequence means both a double-stranded DNA sequence, a single-stranded DNA sequence and the transcripts of said sequences.
  • Such hybridization conditions can in particular be defined as follows: 6 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt solution, 0.5% SDS, 100 ⁇ g of sperm DNA from denatured sau ⁇ my / ml, DNA probe labeled with 32 p ( 10 ⁇ cpm / ml), for 16 h at 68 ° C.
  • This 1200 bp sequence is unexpectedly common to all strains of M. xenopi.
  • the present invention also includes the fragments of this 1200 bp sequence, useful for the identification of the species M. xenopi, and in particular:
  • CACACCGATTGTG - GGAATAGTCAGAGCCCG (XENl) (SEQ n ° 3) and
  • the invention also relates to nucleotide fragments complementary to the previous ones, as well as fragments modified, compared to the previous ones, by removal or addition of nucleotides in a proportion of about 15% relative to the length of the above fragments. above, and / or modified at the level of the nature of the nucleotides, since the modified nucleotide fragments retain a capacity for hybridization with the DNA sequence of M. xenopi, analogous to that presented by the corresponding unmodified fragments .
  • the subject of the present invention is also reagents for identifying M. xenopi, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence or a fragment thereof, as defined above, possibly associated with a appropriate marker.
  • Such a reagent unexpectedly allows the specific identification of M. xenopi, to the exclusion of any other mycobacterium.
  • reagents consist of pairs of primers for the synthesis of a DNA or RNA fragment of M. xenopi, each primer comprising a sequence or a fragment of nucleotide sequence such as defined above.
  • a pair of primers according to the invention consists in particular of the oligonucleotide XEN1 (SEQ No. 3), paired with the oligonucleotide XEN2 (SEQ No. 4).
  • primers allow in particular the synthesis of the sequence SEQ No. 2 defined above and / or of its complementary strand.
  • said reagents consist of a probe for detection and / or identification of a DNA or RNA fragment of M. xenopi.
  • said detection probe is selected from the group consisting of the Pstl-Pstl sequence of 1200 bp of the genomic DNA of M. xenopi, the sequence SEQ No. 1 and the sequence SEQ No. 2, as defined above.
  • the marker is chosen from the group which notably includes radioactive isotopes, suitable enzymes, fluorochromes, appropriate chemical markers, haptens and basic antibodies or analogs such as those described in French Patent 2,518,755 or European Patent Application 0,158,758.
  • Said reagents can be used in a very large number of diagnostic techniques, based on the detection of nucleic acid by hybridization.
  • the present invention also relates to a family of recombinant plasmids, characterized in that they contain at least one nucleotide sequence in accordance with the invention.
  • said plasmid comprises the 1200 bp Pstl-Pstl nucleotide sequence as defined above or a fragment thereof.
  • said plasmid comprises said sequence associated with a vector pBS.
  • said plasmid comprises the nucleotide sequence SEQ No. 1.
  • said plasmid comprises said sequence associated with a vector pUC18.
  • the present invention also relates to a rapid and specific identification method for M. xenopi, characterized in that it comprises: (1) a step in which the nucleic acid of the mycobacterium to be identified is brought into contact with a pair of primers as defined above, in order to amplify a nucleic acid fragment specific for M. xenopi and
  • step (1) a step in which the product obtained in step (1) is detected by any suitable means.
  • step (1) prior to step (1), the mycobacteria are lysed and step (1) is carried out directly on said lysates, constituting the source of DNA, and this , without requiring any other purification.
  • said pair of primers corresponds to the pair XEN1-XEN2, capable of hybridizing the 5 ′ and 3 ′ ends of a specific fragment of M xenopi.
  • step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by detection at using an appropriate dye.
  • step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by membrane transfer (Southern method) and hybridization with a non-radioactive probe as defined above.
  • the present invention also relates to a method for screening for an infection with M. xenopi, in a biological sample, characterized in that it comprises: (1) a step in which the biological sample is brought into contact with at least one diagnostic reagent according to the invention and
  • step (1) a step in which the product obtained in step (1) is detected by any suitable means.
  • the diagnostic reagent of step (1) is a pair of primers in accordance with the invention and makes it possible to obtain amplification products of the nucleotide sequence to be detected .
  • the amplification step is in particular one of the gene amplification techniques, such as the Q ⁇ -replicase method (LIZARDI PM. Et al., Biotechnol., 1988, 6) or the so-called PCR method (Polymerase Chain. Reaction ) described in European Patent Applications 0 200 363, 0 201 184 and 0 229 701 filed by CETUS CO.
  • Q ⁇ -replicase method LIZARDI PM. Et al., Biotechnol., 1988, 6
  • PCR method Polymerase Chain. Reaction
  • the amplification step of the DNA fragment containing the specific sequence of 288 bp is carried out in accordance with the process described in French Patent Application 92 13562, in the name of BIOMERIEUX.
  • step (2) comprises an electrophoretic separation of the amplification products obtained at the end of step (1), followed by detection using an appropriate colourant.
  • step (2) comprises an electrophoretic tion choira ⁇ amplification products obte ⁇ bare at the end of step (1), followed 'by transfer to a membrane (Southern method) and '' hybridization with a non-radioactive probe as defined above.
  • the diagnostic reagent of step (1) is a probe as defined above.
  • the present invention further relates to a kit, ready to use, for implementing the identification process and / or the screening method according to the invention, characterized in that it includes, in addition to useful quantities of appropriate buffers and reagents:
  • kit it comprises: a pair of primers constituted by the sequences SEQ No. 3 (XEN1) and SEQ No. 4 (XEN2) defined above, - the reagents necessary for carrying out a amplification,
  • a component making it possible to verify the sequence of amplified fragments more particularly a nucleic probe having a length of at least 20 bases, capable of hybridizing with part of the sequence SEQ No. 1 or SEQ No. 2 , lying between the two fragments of the above-mentioned primer pair.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the process which is the subject of the present invention.
  • the mycobacteria are cultivated on a Middlebrook 7H9 medium containing glycine at 1.4% (w / v), lysozyme (400 ⁇ g / ml) and D-cycloserine (200 ⁇ g / ml) for 24 h at 37 ° vs.
  • the cultures are then centrifuged at 3000 rpm for 20 min.
  • the pellets are returned to suspension in a TEN buffer (pH 8), comprising 50 mM Tris, 50 mM ⁇ DTA and 10 mM NaCl, treated with proteinase K at 2.25 mg / ml and SDS. (Sodium Dodecyl Sulfate) at 0.6% (w / v) and incubated overnight at 37 ° C.
  • the digestion products are separated for 1 night by electrophoresis on an agarose gel at 0.7% at 1.5 volts / cm. There is thus obtained in particular a Pstl-Pstl fragment of 1200 bp, present in all the M. xenopi strains.
  • 288 bp fragment (SEQ n ° 1): This fragment is obtained by PCR, carried out either from the 1200 bp fragment, or directly from a sample of M. xenopi, under the following conditions: at. Lysis of mycobacteria: Mycobacteria of the species M. xenopi are suspended in distilled water and subjected to 3 cycles of boiling-freezing, each comprising 5 min at 100 ° C and 5 min at -20 ° C; a cell lysate is thus obtained, which is used as a direct source of DNA, without requiring further purification.
  • DNA amplification The amplification is carried out as follows: 100 ⁇ l of a reaction mixture containing:
  • a Taq polymerase buffer 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , gelatin at
  • DKU49 a single primer, called DKU49, of sequence 5 '-CCGCCGACCGAG-3' (P.S. PALITTAPONGARNPIM et al., 1993, J. Infect. Dis., 161,975-978), and
  • FIG. 1 illustrates the specificity of the 288 bp fragment, with respect to the species M. xenopi.
  • FIG. 1A corresponds to a 1.5% agarose gel electrophoresis of the 288 bp sequence, which is then detected by staining with ethidium bromide.
  • the gel obtained is stirred for 20 min in a 0.25 M HCl solution (13 ml HCl + 500 ml distilled water), then rinsed 3 times with distilled water. * Denaturation: The gel is then stirred 20 min with a buffer
  • the membrane is pre-hybridized for 1 h at 42 ° C and at 6 rpm with 30 ml, for a blot of 320 cm * 2 , of a hybridization buffer supplied in the ECL kit Amersham RPN 3001, and preheated to 42 ° C, for 30 min to 1 h);
  • buffer A 1.6 ml of 10% SDS, 1 ml of 20x SSC, 37.4 ml of distilled water per 320 cm 2 , preheated to 55 ° C;
  • 2nd wash identical to the first wash; 3rd wash, carried out with stirring: the mem ⁇ brane is washed for 5 min at room temperature in a campon B (2x SSC);
  • the membrane is hybridized with a buffer comprising 6xSSC (lxSSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate buffer) 5 ⁇ Denhardt reagent a 50 ⁇ stock solution of Denhardt reagent comprises: 5 g of Ficoll, 5 g of polyvinylpyrrolidone, 5 g of bovine albumin serum and 500 ml of I ⁇ O), 0.5% SDS, 100 ⁇ g of denatured salmon sperm DNA / ml, in the presence of a DNA probe labeled with 32 P (10 ⁇ cpm / ml), for 16 h at 68 ° C. . 4 washes are then carried out as follows:
  • 1st wash the membrane is washed for 10 min, at 65 ° C., in a 2xSSC buffer.
  • 3rd wash the membrane is washed 30 min, at 65 ° C, in a buffer comprising 2xSSC and 0.1% SDS.
  • the membranes are then quickly dried.
  • the probe having hybridized (1st protocol) is detected as follows: the membrane is incubated for 1 min in an Amersham detection solution (ECL detection reagent, reference RPN 2105), the excess solution is quickly dried detection and revealed by autoradiography. d. Demonstration of the hybridization of the 288 bp frag ⁇ ment with the 1200 bp sequence:
  • the amplified DNA (sequence of 288 bp) is separated by electrophoresis on 1.5% agarose gel; the frag ⁇ ment thus separated is then recovered by electroelution through a dialysis membrane, immersed in sterile water.
  • the DNA thus obtained is then purified by precipitation with chloroform and ethanol.
  • the probe is then labeled with horseradish peroxidase using the Amersham ECL kit (direct nucleic acid labeling and detection Systems (ref. RPN 3001)).
  • the gels obtained are transferred to nylon mem ⁇ branes by the Southern method and hybridized with the labeled probe according to the invention, as mentioned above in c ..
  • FIG. 3 illustrates the results obtained and shows that under the hybridization conditions specified above, the 288 bp fragment hybridizes exclusively with the strains of the species M. xenopi (28 strains tes- tees) and more particularly with the PstI digestion fragment of about 1200 bp which is found in all strains of M. xenopi, while this probe does not recognize any fragment of other mycobacterial DNAs.
  • the comparison of FIGS. 1A and 3 shows a perfect correlation between the results obtained by the two methods: PCR and Southern blot analysis.
  • tracks 1 to 4 and 11 to 16 correspond to strains of M. xenopi
  • lanes 5 and 8 correspond to strains of M. tuberculosis
  • tracks 6 and 7 correspond to strains of M. avium
  • tracks 9 and 10 correspond to strains of M. bovis and M. celatum respectively.
  • This 288 bp fragment produced by PCR using the primer DKU49 as specified above in 2) b. , was cloned into a vector pUC18, previously digested with the restriction enzyme Smal.
  • the recombinant colonies were selected on LB solid medium supplemented with isopropyl ⁇ -D-thiogalactoside, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (X-gal) and 1 ampicillin at 100 ⁇ g / ml.
  • the pUC18 plasmids which contain the inserts are purified using Qiagen® mini-columns (Qiagen® "Midi” kit, Qiagen Inc, USA).
  • primers are significantly more specific than the primer DKU49. Indeed, the latter although allowing the production of the 288 bp fragment described above and also highly specific for M. xenopi, when used to carry out amplifications, results in the production of an additional fragment of 800 bp ( Figure 1A), for the majority of strains.
  • Both the 288 bp product and the 263 bp product are highly specific for M. xenopi and do not hybridize with any of the strains of other mycobacterial species; even M. DCatum, a new species of mycobacterium recently isolated and which presents phenotypic similarities with M. xenopi does not show cross hybridization with these specific probes.
  • the primers XEN1 and XEN2 which allow the amplification of this 263 bp fragment in all strains of M. xenopi, even in those which additionally accumulate an 800 bp fragment when the primer DKU49 is used (FIG. 4) , are particularly interesting for obtaining a unique PCR profile, shared by all strains of M. xenopi and consisting of a single band.
  • EXAMPLE 2 identification test of M. xenopi.
  • the sensitivity of the PCR tests was determined by an amplification carried out with 10 th dilutions in series, from the template DNA.
  • lanes 1 to 10 correspond to dilutions at lOth, starting with approximately 10 ng of DNA.
  • Lane 11 corresponds to ⁇ DNA digested with the restriction enzyme PstI (control); dilutions were made in sterile water.
  • the 288 bp fragment can be detected by staining with ethydium bromide up to 100 ⁇ g of DNA, while hybridization with the probe increases the sensitivity of detection by a factor of 1000 (FIGS. 2A and 2B ).
  • the detection threshold is as low as 10 ⁇ cells, which is well below the minimum required when considering that a colony contains 10 * ⁇ cells.
  • EXAMPLE 3 Screening test for M. xenopi.

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Abstract

Fragments d'acides nucléiques, dérivés du génome de Mycobacterium xenopi, leurs applications au typage et à l'identification spécifique de Mycobacterium xenopi et au dépistage des infections à Mycobacterium xenopi ainsi que des plasmides contenant lesdits fragments. Une telle séquence nucléotidique est constituée par une séquence nucléotidique, spécifique de M. xenopi qui ne s'hybride, dans des conditions stringentes d'hybridation, avec aucune autre séquence nucléotidique de mycobactérie; elle est, en particulier, contenue dans une séquence PstI-PstI de 1200 paires de bases (pb) ou un fragment de celle-ci tel que le fragment de 288 pb, qui présente la formule (SEQ n°1).

Description

FRAGMENTS D'ACIDES NUCLEIQUES, DERIVES DU GENOME DE MYCO¬ BACTERIUM XENOPI ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention est relative à des frag¬ ments d'acides nucléiques, dérivés du génome de Myco- bacterium xenopi , à leurs applications au typage et à l'identification spécifique de MycoJbacteriuin xenopi et au dépistage des infections à Mycobacterium xenopi ainsi cru'à des plasmides contenant lesdits fragments .
En Europe, M. xenopi représente l'une des espèces fréquemment isolée, parmi les mycobactéries pathogènes et constitue avec M. kansasii et M. avium, 1 ' agent principal des infections pulmonaires dues à des mycobactéries opportunistes chez les patients séro¬ négatifs vis-à-vis du virus de 1 ' immunodéficience humaine. Toutefois, les maladies pulmonaires dues à ces différentes mycobactéries ne peuvent pas être distinguées cliniquement, radiologiquement ou histologiquement.
Chez les patients atteints de SIDA, des infec¬ tions disséminées dues à M. xenopi ont été signalées aussi bien en Europe qu'aux Etats-Unis (V. AUSINA et al., 1988, Ann. Intern. Med. , 109., 927-928 ; R. . SHAFER et al., 1992, AIDS. Clin. Infect. Dis., lu, 161-162) et peuvent être de diagnostic difficile.
Des maladies pulmonaires nosocomiales ont éga- lement été mises en évidence et sont dues à la présence de M. xenopi dans 1 ' environnement et notamment dans 1 'eau du robinet.
L'existence de mycobactérioses pulmonaires dues à plusieurs types de mycobactéries et la difficulté de les distinguer par des signes cliniques, nécessite la mise au point de méthodes rapides de détection et d'iden¬ tification spécifique de chacune de ces mycobactéries, notamment dans la mesure où les traitements applicables sont différents. En outre, dans les différentes infections à mycobactéries, ces dernières sont souvent présentes en faibles quantités, et lorsqu'elles sont en quantités détectables par les méthodes classiquement utilisées, la maladie est déjà en évolution et les malades sont conta¬ gieux pour leur entourage. Plusieurs techniques sont actuellement utili¬ sées en clinique, pour identifier l'espèce impliquée dans une infection mycobacterienne ; on peut citer notamment :
- la détection directe des microorganismes au microscope ; cette technique est rapide mais ne permet pas l'identification de l'espèce mycobacterienne observée et manque de sensibilité, dans la mesure où un grand nombre de microorganismes doit être présent dans l'échan¬ tillon (supérieur à 10^/ml) pour permettre une détection fiable. - les cultures, lorsqu'elles sont positives, ont une spécificité approchant 100.% et permettent l'identification de l'espèce mycobacterienne isolée (tests biochimiques) ,* néanmoins, il s'agit d'un proces¬ sus à long terme qui nécessite au moins 4 semaines pour la formation de colonies et lorsque peu de mycobactéries sont présentes au site de l'infection, des cultures répé¬ tées sont nécessaires pour s'assurer d'un résultat posi¬ tif.
- les techniques sérologiques peuvent s'avérer utiles dans certaines conditions, mais leur utilisation est limitée par leur sensibilité et/ou leur spécificité faible.
- la présence ou l'absence de mycobactéries peut également être déterminée par hybridation avec des sondes, de préférence non-radioactives, qui sont soit des sondes spécifiques des séquences d'ADN des différentes espèces de mycobactéries ; soit des sondes spécifiques d'une portion conservée de l'ARN 16S, qui ont permis de simplifier et de réduire la durée d'identification des mycobactéries. Ces sondes ont montré leur intérêt pour l'identification du bacille de la tuberculose, de M. avium, de M. intracellulare et de M. gordonae (M. GOTO et al., J. Clin. microbiol . , 1991, 29, 2473-2476 ; L. LEBRUN et al., 1992, J. Clin. Microbiol., 3_0, 2476- 24778) , mais ne sont pas utilisables pour M. xenopi .
- plusieurs méthodes ont été récemment déve¬ loppées, utilisant la PCR, pour l'amplification d'un fragment sélectionné pour sa séquence hypervariable dans un gène conservé parmi les mycobactéries ,* il s'agit, en particulier, de fragments correspondant à l'ARN 16S ou au gène codant pour la protéine de 65 kDa (PLIKAYTIS B.B. et al., J. Clin. Microbiol., 1992, 30, 7, 1815-1822) .
Le séquençage direct du produit amplifié assure un moyen d'identification certain, mais nécessite, pour une application en routine, un séquenceur automati¬ que, qui est un investissement bien trop important pour la plupart des laboratoires.
- pour éviter le séquençage du produit ampli- fié, certains Auteurs ont mis au point une analyse des fragments de digestion obtenus à partir des produits de la PCR (A. TELENTI et al., 1993, J. Clin. Microbiol., 3_1,
175-178, PLIKAYTIS B.B. et al., précité) .
Cependant, de telles méthodes nécessitent plu- sieurs digestions et plusieurs enzymes pour établir une identification certaine et sont donc également difficiles à mettre en oeuvre en routine.
Les différentes méthodes de détection de l'Art antérieur ne permettent donc pas d'identifier et/ou de dépister rapidement une infection à M. xenopi ; or une telle identification d'espèce est cruciale, pour donner aux patients, dans les meilleurs délais, le traitement le plus adapté.
La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un procédé d'identification et/ou de dépistage spécifique de M. xenopi , permettant une identification d'espèce rapide et/ou une détection de faibles quantités d'ADN extraits des germes, eux-mêmes en nombre restreint, et de révéler la présence desdites mycobactéries, directement dans les échantillons patholo- giques.
C'est également un but de l'invention de pour¬ voir à des réactifs d'identification et de dépistage spé¬ cifique de M. xenopi .
La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique, spécifique de M. xenopi , contenue dans une séquence Pstl-Pstl de 1200 paires de bases (pb) de l'ADN genomique de M. xenopi ou un fragment de celle-ci, et en ce qu'elle ne s 'hybride, dans des conditions stringentes d'hybridation, avec aucune autre séquence nucléotidique de mycobactérie.
On entend par séquence nucléotidique, dans la présente invention, aussi bien une séquence d'ADN double brin, une séquence d'ADN simple brin que les produits de transcription desdites séquences .
De telles conditions d'hybridation peuvent être notamment définies comme suit : 6xSSC, 5x solution de Denhardt, SDS à 0,5 %, 100 μg d'ADN de sperme de sau¬ mon dénaturé/ml, sonde d'ADN marqué au 32p (10^ cpm/ml) , pendant 16 h à 68°C.
Cette séquence de 1200 pb est, de manière inattendue, commune à toutes les souches de M. xenopi .
La présente invention englobe également les fragments de cette séquence de 1200 pb, utiles pour l'identification de l'espèce M. xenopi , et notamment :
- un fragment de 288 pb, de formule (SEQ n°l) suivante : XEN1 > 50
CCGCCGACCGAGGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTA DKU49 >
100
CCACGATGGACACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCC 150
I
TTTGCCGAAGAGGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGA
200 I
GCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGC
250
I ATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCT
< XEN2
ATAGCTGCTGCCACACCGATTGTGTTCTCGGTCGGCGG < DKU49
- un fragment de 263 pb (SEQ n°2) suivante
50 GGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGAC
100
ACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAG IA
150
GGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGC 200 AAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGCATGGTCGAAC IC
250 |
CTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTATAGCTGCTGC
CACACCGATTGTG, - GGAATAGTCAGAGCCCG (XENl) (SEQ n°3) et
GTGTTAGCCACACCGTC (XEN2) (SEQ n°4) L'invention vise aussi des fragments nucléoti- diques complémentaires des précédents, ainsi que des fragments modifiés, par rapport aux précédents, par enlè¬ vement ou addition de nucléotides dans une proportion d'environ 15 % par rapport à la longueur des fragments ci-dessus, et/ou modifiés au niveau de la nature des nucléotides, dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec la séquence d'ADN de M. xenopi , analogue à celle que présen- tent les fragments correspondants non modifiés.
La présente invention a également pour objet des réactifs d'identification de M. xenopi , caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence nucléoti¬ dique ou un fragment de celle-ci, tels que définis ci- dessus, éventuellement associés à un marqueur approprié.
Un tel réactif permet, de manière inattendue, l'identification spécifique de M. xenopi , à l'exclusion de toute autre mycobactérie.
Selon un mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils sont constitués par des paires d'amorces pour la synthèse d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi , chaque amorce comprenant une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique telle que définie ci- dessus . Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, une paire d'amorces conforme à l'inven¬ tion est notamment constituée par 1 ' oligonucléotide XENl (SEQ n°3) , apparié à 1 ' oligonucléotide XEN2 (SEQ n°4) .
Ces amorces permettent notamment la synthèse de la séquence SEQ n°2 définie ci-dessus et/ou de son brin complémentaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils sont constitués par une sonde de détection et/ou d'identification d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi . Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite sonde de détection est sélection¬ née dans le groupe constitué par la séquence Pstl-Pstl de 1200 pb de l'ADN genomique de M. xenopi , la séquence SEQ n°l et la séquence SEQ n°2, telles que définies ci- dessus .
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le marqueur est choisi dans le groupe qui comprend notam¬ ment les isotopes radioactifs, les enzymes appropriées, les fluorochromes, les marqueurs chimiques appropriés, les haptènes et les anticorps ou les analogues de base tels que ceux décrits dans le Brevet français 2 518 755 ou la Demande de Brevet européen 0 158 758.
Lesdits réactifs peuvent être utilisés dans un très grand nombre de techniques de diagnostic, basées sur la détection d'acide nucléique par hybridation.
La présente invention a également pour objet une famille de plasmides recombinants, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique Pstl-Pstl de 1200 pb telle que définie ci-dessus ou un fragment de celle-ci . Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit plasmide comprend ladite séquence as¬ sociée à un vecteur pBS.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique SEQ n°l.
Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit plasmide comprend ladite séquence as¬ sociée à un vecteur pUC18.
La présente invention a également pour objet un procédé d'identification rapide et spécifique de M. xenopi , caractérisé en ce qu'il comprend : (1) une étape dans laquelle on met en contact l'acide nucléique de la mycobactérie à identifier, avec une paire d'amorces telle que définie ci-dessus, pour amplifier un fragment d'acide nucléique spécifique de M. xenopi et
(2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1) .
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé d'identification, préalablement à l'étape (1) , les mycobactéries sont lysées et l'étape (1) est réalisée directement sur lesdits lysats, constituant la source d'ADN, et ce, sans nécessiter d'autre purifica¬ tion.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé d'identification, ladite paire d'amor¬ ces correspond à la paire XEN1-XEN2, capable d'hybrider les extrémités 5' et 3' d'un fragment spécifique de M. xenopi .
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé d'identification, l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'une détection à l'aide d'un colorant approprié.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé d'identification, l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d' amplifi¬ cation obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'un transfert sur membrane (méthode de Southern) et d'une hybridation avec une sonde non-radioactive telle que définie ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage d'une infection à M. xenopi , dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : (1) une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec au moins un réactif de diagnostic conforme à l'invention et
(2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1) .
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une paire d'amorces conforme à l'invention et permet l'obtention de produits d'amplification de la séquence nucléotidique à détecter.
L'étape d'amplification est notamment l'une des techniques d'amplification géniques, telle que la méthode Qβ-réplicase (LIZARDI PM. et al., Biotechnol., 1988, 6) ou la méthode dite PCR ( Polymerase Chain .Réaction) décrite dans les Demandes de Brevet européen 0 200 363, 0 201 184 et 0 229 701 déposées par CETUS CO.
En variante, l'étape d'amplification du frag¬ ment de l'ADN contenant la séquence spécifique de 288 pb, est réalisée conformément au procédé décrit dans la Demande de Brevet français 92 13562, au nom de BIOMERIEUX.
Conformément au mode de mise en oeuvre pré¬ cité, l'étape (2) comprend une séparation électrophoré¬ tique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'une détection à l'aide d'un colo¬ rant approprié.
En variante, l'étape (2) comprend une sépara¬ tion électrophorétique des produits d'amplification obte¬ nus à l'issue de l'étape (1) , suivie' d'un transfert sur membrane (méthode de Southern) et d'une hybridation avec une sonde non-radioactive telle que définie ci-dessus .
Un tel procédé a 1 ' avantage de fournir un test sensible et spécifique, direct et rapide (moins de 24 h) , de dépistage spécifique d'une infection à Mycobacterium xenopi , à l'exclusion de toute autre infection mycobacte¬ rienne (groupe du bacille de la tuberculose, groupe MAIP {M. avium, M. intracellulare , M. paratuberculosis) ou M. celatum) .
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta¬ geux de ce procédé, le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une sonde telle que définie ci-dessus.
La présente invention a, en outre, pour objet un kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du pro¬ cédé d'identification et/ou du procédé de dépistage conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés :
- des doses appropriées d'au moins une paire d'amorces conforme à l'invention,
- et/ou des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de sonde nucléotidique conforme à
1 ' invention,
- et/ou des réactifs de visualisation de la réaction d'hybridation de ladite sonde et de l'ADN de l'échantillon à tester. ' Selon un mode de réalisation avantageux du kit, celui-ci comporte : une paire d'amorces constituée par les séquences SEQ n°3 (XENl) et SEQ n°4 (XEN2) définies plus haut, - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification,
- éventuellement un composant permettant de vérifier la séquence de fragments amplifiés, plus parti¬ culièrement une sonde nucléique ayant une longueur d'au moins 20 bases, capable de s'hybrider avec une partie de la séquence SEQ n°l ou SEQ n°2, se situant entre les deux fragments de la paire d'amorces susdite.
Outre les dispositions qui précèdent, l'inven¬ tion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti- ront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré¬ sente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : séquences nucléotidiques conformes à l'inven¬ tion.
1) Fragment Pstl-Pstl de 1200 pb (séquence telle que définie ci-dessus) : a. Extraction de l'ADN :
Les mycobactéries sont cultivées sur un milieu Middlebrook 7H9 contenant de la glycine à 1,4 % (p/v) , du lysozyme (400 μg/ml) et de la D-cyclosérine (200 μg/ml) pendant 24 h à 37°C.
Les cultures sont ensuite centrifugées à 3 000 rpm pendant 20 min. Les culots sont remis en sus¬ pension dans un tampon TEN (pH 8) , comprenant du Tris 50 mM, de 1 ΕDTA 50 mM et du NaCl 10 mM, traités avec de la protéinase K à 2,25 mg/ml et du SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) à 0,6 % (p/v) et incubés pendant une nuit à 37°C.
On ajoute ensuite du SDS et les tubes sont à nouveau incubés pendant 30 min à 60°C. L'ADN est purifié avec un mélange phénol-chloroforme, précipité avec 1 ' éthanol et dissous dans un tampon TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) . b. Digestion par l'enzyme PstI :
Environ 1 μg de l'ADN mycobactérien genomique, obtenu en a., est digéré avec l'enzyme de restriction PstI, pendant 16 h à 37°C.
Les produits de la digestion sont séparés pen¬ dant 1 nuit par electrophorese sur un gel d'agarose à 0,7 % à 1,5 volt/cm. On obtient ainsi notamment un fragment Pstl- Pstl de 1200 pb, présent dans toutes les souches M. xenopi .
2) Fragment de 288 pb (SEQ n°l) : Ce fragment est obtenu par PCR, réalisée soit à partir du fragment de 1200 pb, soit directement à par¬ tir d'un échantillon de M. xenopi , dans les conditions suivantes : a. Lyse des mycobactéries : Des mycobactéries de 1 ' espèce M. xenopi sont mises en suspension dans de l'eau distillée et soumises à 3 cycles d' ébullition-congélation, comprenant cha¬ cun 5 min à 100°C et 5 min à -20°C ; on obtient ainsi un lysat cellulaire, qui est utilisé comme source directe d'ADN, sans nécessiter d'autre purification. b. Amplification de l'ADN : L'amplification est réalisée comme suit : 100 μl d'un mélange réactionnel contenant :
- 1 x d'un tampon Taq polymérase (Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, gélatine à
0,01 % (p/v)) ,
- 200 μM de chaque désoxynucléoside triphos- phate,
- 0, 3 μM d'une seule amorce, dénommée DKU49, de séquence 5 ' -CCGCCGACCGAG-3 ' (P.S. PALITTAPONGARNPIM et al., 1993, J. Infect. Dis., 161,975-978) , et
- 2 unités de Taq polymérase, recouvert d'huile minérale et soumis à 35 cycles compre¬ nant chacun 1 min à 95°C, 1 min à 60°C, 1 min à 72°C, puis à une extension de 10 min à 72°C en utilisant un thermocycleur Techné®.
De manière inattendue, l'utilisation de cette amorce DKU49 (PALITTAPONGARNPIM P. et al., J. Infect.
Dis., 1993, 167. 975-978), préalablement utilisée pour l'amplification de M. tuberculosis , permet effectivement d'amplifier, dans des conditions plus stringentes, c'est- à-dire en réalisant l'hybridation à 60°C et non à 40°C, un fragment de 288 pb spécifique de M. xenopi . c. Analyse de la séquence amplifiée : La figure 1 illustre la spécificité du frag¬ ment de 288 pb, vis-à-vis de l'espèce M. xenopi .
En effet, toutes les souches de M. xenopi pro¬ duisent un fragment de 288 pb, lorsque leur ADN est sou¬ mis à une PCR qui utilise l'amorce DKU49, aussi bien après electrophorese sur gel d'agarose des produits amplifiés (figure 1A) , qu'après analyse en Southern blot desdits produits amplifiés (figure 1B) , alors que les souches d'autres espèces ne produisent pas un tel frag¬ ment dans les mêmes conditions : les pistes 1 à 3 et 14 correspondent à des isolats de M. xenopi ,* les pistes 4, 8, 11, 12 et 13 correspondent respectivement à M. celatum, M. chelonae, M. simiae et M. scrofulaceum ,* les pistes 5 et 6 correspondent à des souches de M. avium ; les pistes 7 à 9 correspondent à des souches de M. tuber- culosis . La piste 10 correspond à de l'ADN λ digéré par l'enzyme de restriction PstI, utilisé comme produit de contrôle.
La figure 1A correspond à une electrophorese en gel d'agarose à 1,5 % de la séquence de 288 pb, qui est ensuite détectée par coloration au bromure d'éthi- dium.
La figure 1B correspond à l'analyse du produit d'amplification (fragment de 288 pb) par une méthode de Southern effectuée dans les conditions' suivantes : * Dépurination :
Le gel obtenu est agité 20 min dans une solu¬ tion d'HCl 0,25 M (13 ml HC1 + 500 ml eau distillée) , puis rincé 3 fois avec de l'eau distillée. * Dénaturation : Le gel est ensuite agité 20 min avec un tampon
1 (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M) . * Neutralisation :
Le gel est ensuite rincé rapidement avec un tampon 2 (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 1 M à pH 8) , puis incubé avec ce même tampon 2 pendant 30 min. * Transfert :
Le transfert sur une membrane de nylon Hybond®, humidifiée dans une solution lx SSC (NaCl, citrate de sodium), est effectué pendant une nuit.
* Hybridation : Les séquences obtenues ci-dessus sont soumises aux conditions d'hybridation suivantes :
- 1er protocole :
. la membrane est pré-hybridée pendant 1 h à 42°C et à 6 rpm avec 30 ml, pour un blot de 320 cm*2, d'un tampon d'hybridation fourni dans le kit ECL Amersham RPN 3001, et préchauffé à 42°C, pendant 30 min à 1 h) ;
. on ajoute une sonde telle que préparée comme précisé en d. ci-dessous, à une concentration de 10 ng/ml, puis . la membrane est hybridée à 42°C pendant 1 nuit ,*
. 4 lavages sont ensuite réalisés comme suit :
1er lavage : la membrane est lavée 10 min, à
55°C, dans un tampon A (1,6 ml de SDS à 10 %, 1 ml de 20x SSC, 37,4 ml d'eau distillée pour 320 cm2, préchauffé à 55°C) ;
2ème lavage : identique au premier lavage ; 3ème lavage, réalisé sous agitation : la mem¬ brane est lavée 5 min à température ambiante dans un campon B (2x SSC) ;
4ème lavage : identique au troisième lavage.
- 2ème protocole :
La membrane est hybridée avec un tampon comprenant 6xSSC (lxSSC : NaCl 0,15 M, tampon citrate de sodium 0,015 M) 5x de réactif de Denhardt une solution stock 50x de réactif de Denhardt comprend : 5 g de Ficoll, 5 g de polyvinylpyrrolidone, 5 g de sérum albu¬ mine bovine et 500 ml d'I^O) , SDS à 0,5 %, 100 μg d'ADN de sperme de saumon dénaturé/ml, en présence d'une sonde d'ADN marqué au 32P (10β cpm/ml) , pendant 16 h à 68°C. . 4 lavages sont ensuite réalisés comme suit :
1er lavage : la membrane est lavée 10 min, à 65°C, dans un tampon 2xSSC.
2ème lavage : identique au premier.
3ème lavage : la membrane est lavée 30 min, à 65°C, dans un tampon comprenant 2xSSC et du SDS à 0,1 %.
4ème lavage : la membrane est lavée 10 min, à 65°C, dans un tampon 0,lxSSC.
* Détection :
Les membranes sont ensuite rapidement séchées . La sonde ayant hybridée (1er protocole) est détectée comme suit : on incube la membrane, 1 min, dans une solu¬ tion de détection Amersham (réactif de détection ECL, référence RPN 2105), on sèche rapidement l'excès de solu- tion de détection et on révèle par autoradiographie. d. Mise en évidence de l'hybridation du frag¬ ment de 288 pb avec la séquence de 1200 pb :
- Préparation de la sonde :
L'ADN amplifié (séquence de 288 pb) est séparé par electrophorese sur gel d'agarose à 1,5 % ; le frag¬ ment ainsi séparé est alors récupéré par electroelution à travers une membrane de dialyse, immergée dans de l'eau stérile. L'ADN ainsi obtenu est ensuite purifié par précipitation au chloroforme et à l'éthanol. La sonde est alors marquée avec de la peroxy- dase de raifort en utilisant le kit Amersham ECL { direct nucleic acid labelling and détection Systems (réf. RPN 3001) ) .
- Echantillons d'ADN : On utilise un fragment de 1200 pb tel que pré¬ paré en 1) ci-dessus, ou de l'ADN mycobacterien genomique extrait à partir de souches de M. xenopi et digéré avec l'enzyme de restriction PstI, dans les mêmes conditions que ci-dessus.
Les gels obtenus sont transférés sur des mem¬ branes de nylon par la méthode de Southern et hybrides avec la sonde marquée conforme à l'invention, comme pré¬ cisé ci-dessus en c..
Un test d'hybridation comparatif a été réa¬ lisé, dans les mêmes conditions que ci-dessus, avec 21 différentes espèces de mycobactéries répertoriées, ci- après, au Tableau I.
TABLEAU I
Nombre de souches testées
Espèces Identification Analyse en
PCR Southern blot
M xenopi 38 28
M avium 8 3
M celatum 5 2
M chelonae 5 NF*
M flavescens 5 2
M fortui tum 5 2 g as tri 2 1 _- gordonae 6 2
7 r kansasii 6 1
K malmoense 5 1 r.' marinum 5 NF
11 non chromogenicum 3 1
•*• r scrofulaceum 3 1
1 shimoïdei 1 1
11 simiae 5 1
Λ' smegmatis 1 1
*,f εzulgaï 1 1 lV terrae 5 1
M uicerans 1 1
M vaccae 1 1
M tuberculosis 6 2
TVf bovis 1 1
M bovis BCG 1 1
7,T africanum 1 1
NF : non fait
La figure 3 illustre les résultats obtenus et montre que dans les conditions d'hybridation précisées ci-dessus, le fragment de 288 pb s 'hybride exclusivement avec les souches de l'espèce M. xenopi (28 souches tes- tées) et plus particulièrement avec le fragment de diges¬ tion PstI d'environ 1200 pb que l'on retrouve dans toutes les souches de M. xenopi , alors que cette sonde ne recon¬ naît aucun fragment d'autres ADN mycobactériens . La comparaison des figures 1A et 3 montre une parfaite corrélation entre les résultats obtenus par les deux méthodes : PCR et analyse en Southern blot.
Dans cette figure 3 (analyse en Southern blot de l'ADN digéré par l'enzyme de restriction PstI de dif- ferentes souches mycobacteriennes avec la sonde spécifi¬ que de M. xenopi de 288 pb) , les pistes 1 à 4 et 11 à 16 correspondent à des souches de M. xenopi , - les pistes 5 et 8 correspondent à des souches de M. tuberculosis ; les pistes 6 et 7 correspondent à des souches de M. avium, les pistes 9 et 10 correspondent à des souches de M. bovis et de M. celatum respectivement. e. Séquençage :
Ce fragment de 288 pb, produit par PCR en uti¬ lisant l'amorce DKU49 comme précisé ci-dessus en 2) b. , a été clone dans un vecteur pUC18, préalablement digéré avec l'enzyme de restriction Smal.
Les clones obtenus ont été transformés dans les souches d ' E. coli TG1.
Les colonies recombinantes ont été sélection- nées sur milieu solide LB complémenté avec de 1 ' isopropyl β-D-thiogalactoside, du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactopyranoside (X-gal) et de 1 ' ampicilline à 100 μg/ml.
Les plasmides pUC18 qui contiennent les in- serts sont purifiés en utilisant des mini-colonnes Qiagen® (kit "Midi" Qiagen®, Qiagen Inc, USA) .
Les séquences des inserts mycobactériens de trois souches différentes de M. xenopi ont ainsi été réa¬ lisées par la méthode de SANGER (F. SANGER et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 7_4, 5463-5467) en utilisant de la séquénase.
Dans les 3 souches étudiées, les deux brins ont été séquences. La séquence nucléotidique du fragment amplifié est identique dans les 3 souches et la séquence complète du fragment de 288 pb est représentée à la séquence n°l.
Cette séquence ne présente pas d'homologie significative avec des séquences décrites précédemment. 3) Fragment de 263 pb (SEQ n°2) :
Dans les mêmes conditions que celles de 2), lorsque l'on réalise la PCR avec les amorces conformes à l'invention, XENl (SEQ n°3) et XEN2 (SEQ n°4), on obtient le fragment de 263 pb, qui constitue une sonde hautement spécifique de détection de M. xenopi .
Ces amorces sont significativement plus spéci¬ fiques que l'amorce DKU49. En effet, cette dernière bien que permettant la production du fragment de 288 pb décrit ci-dessus et également hautement spécifique de M. xenopi , lorsqu'elle est utilisée pour réaliser des amplifica¬ tions, entraîne la production d'un fragment additionnel de 800 pb (figure 1A) , pour la majorité des souches.
Aussi bien le produit de 288 pb que le produit de 263 pb sont hautement spécifiques de M. xenopi et n'hybrident avec aucune des souches d'autres .espèces mycobacteriennes ; même M. ceiatum, une nouvelle espèce de mycobactérie récemment isolée et qui présente des similarités phénotypiques avec M. xenopi ne présente pas d'hybridation croisée avec ces sondes spécifiques. Les amorces XENl et XEN2 qui permettent l'amplification de ce fragment de 263 pb dans toutes les souches de M. xenopi , même dans celles qui accumulent en outre un fragment de 800 pb lorsque l'on utilise l'amorce DKU49 (figure 4) , sont particulièrement intéressantes pour obtenir un profil PCR unique, partagé par toutes les souches de M. xenopi et consistant en une seule bande. EXEMPLE 2 : test d'identification de M. xenopi .
1) Ce test est réalisé selon le protocole exposé à l'Exemple 1, à savoir obtention d'un fragment Pstl-Pstl, à partir d'ADN genomique, amplification avec les amorces XENl et XEN2 et détection des fragments amplifiés .
2) Spécificité et de la sensibilité du test conforme à 1 ' invention :
La sensibilité des tests PCR a été déterminée par une amplification réalisée avec des dilutions au lOème en série, à partir de l'ADN matrice.
Les résultats sont illustrés à la figure 2, dans laquelle les pistes 1 à 10 correspondent à des dilu¬ tions au lOè e, commençant à environ 10 ng d'ADN. La piste 11 correspond à de l'ADN λ digéré avec l'enzyme de restriction PstI (contrôle) ; les dilutions ont été effectuées dans de l'eau stérile.
Le fragment de 288 pb peut être détecté par coloration au bromure d'éthydium jusqu'à 100 pg d'ADN, tandis que l'hybridation avec la sonde augmente la sensi¬ bilité de la détection d'un facteur 1000 (figures 2A et 2B) .
Dans la mesure où 10^ cellules correspondent à environ 1 mg, on peut considérer que la limite de détec- tion du produit de la PCR sur gel d'agarose correspond grossièrement à 10^ cellules, qui constitue donc un seuil de sensibilité significativement plus faible que ceux nécessaires pour les tests PCR réalisés dans le but d'identification de souches. Pour déterminer la spécificité de ce test PCR, le fragment de 288 pb a été utilisé comme sonde après son marquage avec de la peroxydase de raifort dans les condi¬ tions de l'Exemple 1, 2) d..
Les autoradiogrammes montrent l'hybridation spécifique de cette sonde avec le fragment de la PCR de 288 pb et il n'existe aucune autre bande, ni avec le pro- duit de 800 pb retrouvé pour certaines souches de M. xenopi , ni avec les souches d'autres espèces (figure IB et Tableau I ci-dessus) .
Le test PCR développé pour la détection de cette cible unique présente une sensibilité suffisante pour un test d'identification (figure 2).
Le seuil de détection est aussi bas que 10^ cellules, ce qui est largement en dessous de minimum requis lorsque l'on considère qu'une colonie contient 10*^ cellules.
EXEMPLE 3 : Test de dépistage de M. xenopi .
Ce test peut être réalisé dans les mêmes con¬ ditions que celles de l'Exemple 2.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, 1'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em¬ brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve¬ nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar- ter du cadre, ni de la portée de la présente invention.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT PASTEUR
(B) RUE: 28 rue du Docteur Roux
(C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75724 PARIS
(ii) TITRE DE L INVENTION: FRAGMENTS D'ACIDES NUCLEIQUES, DERIVES DU GENOME DE MYCOBACTERIUM XENOPI ET LEURS APPLICATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 288 paires de bases (B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CCGCCGACCGAGGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGA 60 CACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAGAGGCGCGGGT 120
TCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAA 180
GCGTGAACAGCACTGTCTGCATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCC 240
GCCTCAGGCTATAGCTGCTGCCACACCGATTGTGTTCTCGGTCGGCGG 288 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 263 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGACACCGCGAGAG 60
ACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAGAGGCGCGGGTTCTTCAGCGCC 120
GGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGC 180
ACTGTCTGCATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTA 240
TAGCTGCTGCCACACCGATTGTG 263 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE SENS"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GGAATAGTCA GAGCCCG 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE ANTI-SENS"
(iv) ANTI-SENS: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GTGTTAGCCA CACCGTC 17

Claims

REVENDICATIONS 1°) Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique, spécifique de M. xenopi , contenue dans une séquence Pstl- PstI de 1200 paires de bases (pb) de l'ADN genomique de M. xenopi ou un fragment de celle-ci, et en ce qu'elle ne s 'hybride, dans des conditions stringentes d'hybridation, avec aucune autre séquence nucléotidique de mycobactérie. 2°) Fragment d'une séquence selon la revendi- cation 1, caractérisé en ce qu'il comprend 288 pb et pré¬ sente la formule (SEQ n°l) suivante :
XENl > 50 CCGCCGACCGAGGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTA D U49 >
100
CCACGATGGACACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCC
150 TTTGCCGAAGAGGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTG IA 200
GCAGGCCGAGCAAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGC
250
ATGGTCGAACCCTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCT
< XEN2 ATAGCTGCTGCCACACCGATTGTGTTCTCGGTCGGCGG
< DKU49 3°) Fragment d'une séquence selon la revendi¬ cation 1, caractérisé en ce qu'il comprend 263 pb et pré¬ sente la formule (SEQ n°2) suivante : 50
I GGAATAGTCAGAGCCCGATGATGACGATGCCGACGCCTACCACGATGGAC
100
I ACCGCGAGAGACACCAAGAGAAAACTGACGAACCTTTCCTTTGCCGAAGA
150
I GGCGCGGGTTCTTCAGCGCCGGAACGGCGAACCCGGTGAGCAGGCCGAGC
200
I AAAAACAAGACCAGGCCAAGCGTGAACAGCACTGTCTGCATGGTCGAACC
250
I
CTATGCGCAGCTGCGGGTCGTGGATTTCCGCCTCAGGCTATAGCTGCTGC
CACACCGATTGTG.
4°) Fragment d'une séquence selon la revendi¬ cation 1, caractérisé en ce qu'il comprend 17 pb et pré- sente la formule (SEQ n°3) suivante : GGAATAGTCAGAGCCCG (XENl) .
5°) Fragment d'une séquence selon la revendi¬ cation 1, caractérisé en ce qu'il comprend 17 pb et pré¬ sente la formule (SEQ n°4) suivante : GTGTTAGCCACACCGTC (XEN2) .
6°) Réactifs d'identification de M. xenopi , caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, éventuellement associés à un marqueur approprié.
7°) Réactifs selon la revendication 6, carac¬ térisés en ce qu'ils sont constitués par des paires d'amorces pour la synthèse d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi , chaque amorce comprenant une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
8°) Réactifs selon la revendication 7, carac¬ térisés en ce que ladite paire d'amorces est constituée par 1 ' oligonucléotide XENl selon la revendication 4, apparié à 1 'oligonucléotide XEN2 selon la revendication 5.
9°) Réactifs selon la revendication 6, carac¬ térisés en ce qu'ils sont constitués par une sonde de détection et/ou d'identification d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi .
10°) Réactifs selon la revendication 9, carac¬ térisés en ce que ladite sonde de détection est sélec¬ tionnée dans le groupe constitué par la séquence Pstl- PstI de 1200 pb de l'ADN genomique de M. xenopi , la séquence SEQ n°l et la séquence SEQ n°2, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
11°) Réactifs selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisés en ce que le marqueur est choisi dans le groupe qui comprend notamment les iso¬ topes radioactifs, les enzymes appropriées, les fluo- rochromes, les marqueurs chimiques appropriés, les haptè- nes et les anticorps ou les analogues de base.
12°) Famille de plasmides recombinants, carac- térisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
13°) Plasmide selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidi- que Pstl-Pstl de 1200 pb ou un fragment de celle-ci, selon la revendication 1.
14°) Plasmide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidi¬ que Pstl-Pstl de 1200 pb associée à un' vecteur pBS . 15°) Plasmide selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidi¬ que SEQ n°l selon la revendication 2.
16°) Plasmide selon la revendication 15, caractérisé en7 ce qu'il comprend la séquence nucléotidi- que SEQ n°l associée à un vecteur pUC18.
17°) Procédé d'identification rapide et spéci¬ fique de M. xenopi , caractérisé en ce qu'il comprend : (1) une étape dans laquelle on met en contact l'acide nucléique de la mycobactérie à identifier, avec une paire d'amorces selon la revendication 7 ou la reven¬ dication 8, pour amplifier un fragment d'acide nucléique spécifique de M. xenopi et
(2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1) .
18°) Procédé d'identification selon la reven¬ dication 17, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape (1) , les mycobactéries sont lysées et l'étape (1) est réalisée directement sur lesdits lysats.
19°) Procédé d'identification selon la reven¬ dication 17 ou la revendication 18, caractérisé en ce que ladite paire d'amorces correspond à la paire SEQ n°3 (XENl) -SEQ n°4 (XEN2) , capable d'hybrider les extrémités 5' et 3 ' d'un fragment spécifique de M. xenopi .
20°) Procédé d'identification selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'une détection à l'aide d'un colorant appro¬ prié.
21°) Procédé d'identification selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'un transfert sur membrane et d'une hybrida¬ tion avec une sonde non-radioactive selon la revendica¬ tion 9. 22°) Procédé de dépistage d'une infection à M. xenopi , dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
(1) une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec au moins un réactif de dia- gnostic selon l'une quelconque des revendications 6 à 11 et (2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1) .
23°) Procédé de dépistage selon la revendica¬ tion 22, caractérisé en ce que le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une paire d'amorces selon la revendi¬ cation 7 ou la revendication 8 et permet 1 ' obtention de produits d'amplification de la séquence nucléotidique à détecter.
24°) Procédé de dépistage selon la revendica- tion 22 ou la revendication 23, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'une détection à l'aide d'un colorant appro¬ prié. 25°) Procédé de dépistage selon la revendica¬ tion 22 ou la revendication 23, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1) , suivie d'un transfert sur membrane et d'une hybrida- tion avec une sonde non-radioactive selon la revendica¬ tion 9.
26°) Procédé de dépistage selon la revendica¬ tion 22, caractérisé en ce que le réactif de l'étape (1) est une sonde selon la revendication 9. 27°) Kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé d'identification et/ou du procédé de dépistage selon l'une quelconque des revendications 17 à 26, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés : - des doses appropriées d'au moins une paire d'amorces la revendication 7 ou la revendication 8,
- et/ou des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de sonde nucléotidique selon la revendication 9 , - et/ou des réactifs de visualisation de la réaction d'hybridation de ladite sonde et de l'ADN de l'échantillon à tester.
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