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WO1996003937A1 - Procede de modification de la surface interne des protheses synthetiques utilisees en chirurgie vasculaire - Google Patents

Procede de modification de la surface interne des protheses synthetiques utilisees en chirurgie vasculaire Download PDF

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Publication number
WO1996003937A1
WO1996003937A1 PCT/FR1995/000962 FR9500962W WO9603937A1 WO 1996003937 A1 WO1996003937 A1 WO 1996003937A1 FR 9500962 W FR9500962 W FR 9500962W WO 9603937 A1 WO9603937 A1 WO 9603937A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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prosthesis
cells
internal surface
arterial
incubation
Prior art date
Application number
PCT/FR1995/000962
Other languages
English (en)
Inventor
Marie Thérèse ZABOT
Jean Michel Zabot
Original Assignee
De Leobardy, Francis
DUGAST, Hervé
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by De Leobardy, Francis, DUGAST, Hervé filed Critical De Leobardy, Francis
Priority to AU30800/95A priority Critical patent/AU3080095A/en
Publication of WO1996003937A1 publication Critical patent/WO1996003937A1/fr

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    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Definitions

  • the present invention relates to a method of modifying the internal surface of synthetic prostheses used in vascular and cardiac surgery by in vitro production of a physiological endothelial matrix.
  • bypass surgery is one of the most used techniques to treat arterial lesions.
  • the ideal is to have an autologous arterial graft or, failing that, an autologous vessel of the venous type: saphenous vein most of the time.
  • this preferential use of autologous vessel comes up against a major obstacle: the absence of a graft, either depending on the site of implantation, or because of the patient's history (saphenous vein stripped, previous use ...) or still because major alterations render the graft unusable.
  • adhesion and platelet aggregation very quickly occur, followed by the development of an inflammatory fibrous tissue on the internal surface (fibrin, fibroblasts, macrophages, leukocytes ).
  • fibrous tissue on the internal surface (fibrin, fibroblasts, macrophages, leukocytes ).
  • the increase in platelet activity also induces the release of mitogens from smooth muscle cells, leading to hyperplasia in the areas of anastomosis with adjacent vessels.
  • a method for manufacturing endo prostheses described in EP-A-0 570 331 treats the synthetic support intended to produce the prosthesis with autologous cells taken from the fatty tissue, the omentum and the implanted prosthesis always includes these cells.
  • the inventors sought to circumvent the crippling limitations caused by intraoperative endothelialization, and they chose to create a synthetic prosthesis whose internal surface is covered with a substrate allowing true endothelialization, in vivo, by endothelial cells. autologous and functional.
  • This extracellular matrix (ECM) secreted by the endothelial cell at its basal pole has an organization and a defined composition in matrix proteins and growth factors.
  • the inventors have therefore endeavored to recreate this natural basement membrane on the internal surface of synthetic prostheses.
  • the inventors have developed an in vitro matrixing of synthetic prostheses with MEC of vascular and in particular arterial cells; this preparation allows rapid and complete colonization of the endoluminal surface by the endothelial cells of the host during the in vivo implantation.
  • the method of modifying the internal surface of synthetic prostheses used in vascular and cardiac surgery according to the invention is characterized in that it consists in producing on said internal surface a physiological endothelial matrix obtained in vitro from vascular cells and in particular arterial . This ensures true endothelialization, in vivo, by autologous and functional endothelial cells.
  • said internal surface is previously coated with human fibronectin.
  • Arterial lines intended for the matrixing and endothelialization stage, were prepared from aortas or femoral arteries of mammals. Each arterial sample obtained, whatever its origin or nature, was treated in the same way, under rigorously controlled biosecurity conditions (sterility, harmlessness). The arterial sample, placed on a tray, is incised longitudinally and then gently rinsed with a saline solution to remove residual blood elements. The endothelial cells are harvested by scraping the entire surface, then sown in a culture well (24-well plate). The culture plate 5 is incubated at least 24 h at 37 ° C before the first change of culture medium.
  • the culture medium for this work is preferably the EGM medium marketed by Clonetics: MCDB 131 medium supplemented with fetal calf serum, hydrocortisone, human recombinant epidermal growth factor 1D (hEGF), bovine brain extract (Bovine Brain Extract BBE) .
  • EGM medium marketed by Clonetics: MCDB 131 medium supplemented with fetal calf serum, hydrocortisone, human recombinant epidermal growth factor 1D (hEGF), bovine brain extract (Bovine Brain Extract BBE) .
  • Endothelial cells can be detached from their support for harvesting or reseeding by the action of a Trypsin-EDTA solution.
  • Ependorf tubes made it possible to produce culture chambers with a surface area of 0.5 cm 2, allowing immobilization of the prosthetic material (PTFE-Dacron); each disc thus formed is autoclave before use.
  • PTFE-Dacron prosthetic material
  • the arterial cells are seeded at a density of 10 5 cells / cm2, on the prosthetic surface previously coated with fibronectin. They are then maintained in culture for approximately 12 days in the EGM culture medium + 4% of Dextran T 40. A regular change of the medium is carried out every
  • Pig aorta arterial cells are seeded, in parallel, on the various supports (bare PTFE, PTFE + human fibronectin, PTFE + human fibronectin + arterial MEC) at the density of 10 5 cells / disc; they are then cultivated for a period of 5 to 7 days in the EGM medium.
  • the endothelialization capacity of each support is determined by the following tests:
  • Figures 1, 2, and 3 are bar graphs of cell counts. In these figures, the number of cells is plotted on the abscissa and the number of days on the ordinate.
  • each endothelialized disc was fixed with 2.5% glutaraldehyde in a phosphate buffer (PBS: Phosphate Buffer Saline solution) for 1 h at room temperature. After 3 washes of 20 min in PBS, a post-fixation is carried out in osmium tetroxide: 1% in 0.3 M cacodylate buffer for 1 h at 4 ° C. Dehydration of the samples is obtained by passage through ethanol baths of increasing concentration: 2 min. in ethanol at 30 °, 50 °, 70 °, 95 °, then 2 times 3 min. in ethanol at 100 °. After drying by rapid stirring in air, the samples are covered with gold by sputtering and examined using a Philips XL20 microscope.
  • PBS Phosphate Buffer Saline solution
  • PTFE discs, matrices by the MEC of arterial cells and heated to 70 ° C and 90 ° C were seeded by pig arterial cells.
  • Cell adhesion and proliferation were evaluated by cell count on days D + 1 and D + 5 of the culture.
  • the step of eliminating arterial cells by the action of a urea solution is followed by a step of heating the prosthesis at 90 ° C for 10 minutes.
  • the pigs were one month old, weighed 20 kg, the sex ratio was 2 males and 2 females.
  • the prostheses were all stamped according to the technique of the invention. These were 4 straight tubes, 3 in PTFE and 1 in Dacron with a diameter of 6 mm, except for 1 PTFE tube with a diameter of 5 mm and 6 cm in length.
  • the pigs were operated under general propofol anesthesia after premedication with ketamine, atropine and midazolam. They were intubated and ventilated with a peripheral venous route.
  • the intervention consisted in the installation, after median laparotomy of a right aorto-aortic tube under renal.
  • the proximal and distal terminal anastomoses were made with an overlock of non-absorbable polypropylene threads.
  • the pigs were operated on heparin therapy 500 IU by intravenous injection before clamping and then 500 IU at closure, combined with 250 mg of lysine acetyl salicylate intravenously.
  • the administration of lysine acetyl salicylate per os was continued at a dose of 500 mg every other day for the 8 postoperative days.
  • the explantations were made for the PTFE prostheses 8 days, 15 days and 1 month after the first intervention and at 1 month for the Dacron prosthesis.
  • the implantation carried out under general anesthesia, consisted in the ablation of the prosthesis with location and removal of the proximal and distal anastomoses; the animals were not sacrificed until after the intervention.
  • the prostheses were rinsed thoroughly in order to remove the residual blood elements and then they were fixed for one hour. in 2.5% glutaraldehyde in PBS at room temperature. They were then studied by scanning electron microscopy according to the preparation protocol described during the in vitro validation.
  • the implantation chronology of 8 days, 15 days and 1 month made it possible to follow the progressive (8 and 15 days) and complete (1 month) endothelialization of the entire internal surface of the prostheses, whether PTFE or Dacron:
  • Prosthetic samples fixed with glutaraldehyde are post-fixed with 1% osmium tetroxide in cacodylate buffer for 1 hour at 4 ° C. They are then dehydrated using a progressive range of ethanol 5 minutes in ethanol at 30 °, 50 °, 70 °, 95 °, 3 times 10 minutes in ethanol at 100 ° then 3 times 10 minutes in propylene oxide. After inclusion of the samples in an epoxy resin, ultrafine sections are made using an ultramicrotome and then contrasted with uranyl acetate and lead citrate before their observation.
  • endoluminal cell layer Observation of the endoluminal cell layer reveals, in the light-wall direction, the successive presence of adjoining and quiescent endothelial cells, cells of macrophagic nature within a fibrin network and a layer of cells.
  • myofibroblastic type which have formed a connective matrix in direct contact with the prosthetic matrixing (highlighting of collagen fibers). This organization anticipates the formation of normal endoluminal tissue.

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Abstract

Ce procédé consiste à réaliser, sur la surface interne des prothèses synthétiques, une matrice endothéliale physiologique obtenue in vitro à partir de cellules artérielles, ladite surface interne étant de préférence préalablement revêtue de fibronectine humaine. Les principales étapes du procédé sont les suivantes: enduction de la surface interne de la prothèse par incubation avec une solution de fibronectine recombinante humaine, lavage avec une solution saline pour élimination de l'excès de fibronectine, ensemencement de la face interne de la prothèse par une suspension de cellules endothéliales artérielles puis culture cellulaire par incubation de la prothèse dans un récipient stérile à 37 °C, élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée 2 M et stockage de la prothèse ainsi matricée à 4 °C dans un environnement stérile.

Description

PROCEDE DE MODIFICATION DE LA SURFACE INTERNE DES PROTHESES SYNTHETIQUES UTILISEES EN CHIRURGIE VASCULAIRE
La présente invention concerne un procédé de modification de la surface interne des prothèses synthétiques utilisées en chirurgie vasculaire et cardiaque par réalisation in vitro d'une matrice endothéliale physiologique
En chirurgie va. culaire et cardiaque, le pontage est l'une des techniques les plus utilisées pour traiter les lésions artérielles. L'idéal est de disposer d'un greffon artériel autologue ou, à défaut, d'un vaisseau autologue de type veineux : veine saphène interne la plupart du temps. Cette utilisation préférentielle de vaisseau autologue se heurte pourtant à un obstacle majeur : l'absence de greffon, que ce soit en fonction du site d'implantation, ou en raison des antécédents du malade (veine saphène strippée, utilisation précédente...) ou encore parce que des altérations importantes rendent le greffon inutilisable.
On s'est donc efforcé de trouver une alternative valable au matériel autologue. C'est ainsi que le développement et l'utilisation, au cours des 30 dernières années, de matériaux synthétiques, en particulier le Dacron (polyéthylène-téréphtalate), tissé ou tricoté, et le PTFE (polytétrafluoroéthylène) ont permis à la chirurgie vasculaire d'avancer de façon considérable. Ces prothèses synthétiques donnent des résultats comparables, en terme de perméabilité, à ceux d'un vaisseau autologue pour les artères de gros et moyens calibres. Mais leur non-adaptation aux artères de petit calibre (inférieur ou égal à 4 mm) est vite devenue évidente. Ceci s'explique, entre autres, par la haute thrombogénéicité de la surface interne synthétique. En effet, après implantation, et lors de l'exposition au flux sanguin, il se produit très rapidement une adhésion et une agrégation plaquettaire, suivies par le développement d'un tissu fibreux inflammatoire sur la face interne (fibrine, fibroblastes, macrophages, leucocytes). L'augmentation de l'activité plaquettaire induit également une libération d'agents mitogènes des cellules musculaires lisses entraînant une hyperplasie aux zones d'anastomoses avec les vaisseaux adjacents.
Chez l'animal, une endothélialisation spontanée de la surface peut parfois apparaître au cours du temps, les cellules endothéliales provenant de capillaires extérieurs, de la circulation sanguine aussi bien que des vaisseaux adjacents. Chez l'homme, par contre, il n'y a pas de colonisation spontanée de la surface endoluminale à l'exception des zones juxta-anastomotiques.
Afin d'améliorer les prothèses synthétiques et pour les rendre utilisables même dans les petits calibres, on a pensé que la prothèse "idéale" devrait, entre autres, reproduire sur sa face interne la paroi vasculaire naturelle avec un revêtement endothelial fonctionnel et stable. En 1978, Herring et al. (Surgery 78 : 498 - 504) ont introduit le concept d'ensemencement des prothèses synthétiques par des cellules endothéliales autologues, afin d'obtenir une surface anti-thrombogénique. Par la suite, le développement des techniques de récolte et de multiplication en culture des cellules endothéliales, telles que celles décrites par Jarrel et al (1984 J. Vase. Surg. 1 : 757-764) ainsi que l'utilisation de facteurs adhésifs : fibronectine, laminine collagène...(Carabasi et al. 1991-Ann. Chir. Vase. 5 : 477-184 et Vohra et al. 1991-Br.J. Surg. 78 : 417-420) ont permis le développement d'essais d'endothélialisation des prothèses vasculaires.
Un procédé de fabrication d'endo prothèses décrit dans EP-A-0 570 331 traite le support synthétique destiné à réaliser la prothèse avec des cellules autologues prélevées dans le tissu graisseux, l'omentum et la prothèse implantée comporte toujours ces cellules.
De nombreux essais ont ainsi pu être réalisés aussi bien chez l'animal que chez l'homme, sur du Dacron ou du PTFE.
Ces techniques permettent :
- la création d'une monocouche cellulaire fonctionnelle uniforme avant l'implantation ; il en résulte une réduction de l'activité plaquettaire et une amélioration de la perméabilité à court et moyen terme
- l'inhibition de la prolifération des cellules musculaires lisses
- une meilleure résistance des prothèses à l'infection. Ces techniques ont pourtant des limites :
- résistance de la monocouche au flux sanguin
- différences de morphologie, de fixation et de potentiel de croissance des cellules endothéliales en fonction de leur origine (cellules veineuses ou artérielles) nécessitant leur réadaptation aux conditions physiologiques d'implantation
- difficulté d'organisation d'une procédure fiable sur le plan clinique et dans le temps : prélèvement, culture cellulaire, nécessité de stérilité absolue tout au long de ces étapes.
- difficultés d'évaluation clinique et recul dans le temps pour juger de la stabilité de la monocouche.
Les inventeurs ont cherché à contourner les limitations rédhibitoires entraînées par l'endothélialisation per-opératoire, et ils ont choisi de créer une prothèse synthétique dont la surface interne soit recouverte d'un substrat permettant l'endothélialisation vraie, in vivo, par des cellules endothéliales autologues et fonctionnelles. On sait que l'adhésion, la prolifération et la migration des cellules endothéliales sont fonction, avant tout, du support sur lequel elles reposent ; c'est ce support qui détermine la polarité, l'orientation, la morphologie et la réponse de la cellule aux facteurs stimulants. Dans l'environnement vasculaire naturel, ce support correspond à la membrane basale sous-endothéliale. Cette matrice extracellulaire (MEC) sécrétée par la cellule endotheliale à son pôle basai possède une organisation et une composition définie en protéines matricielles et en facteurs de croissance.
Les inventeurs se sont donc efforcés de recréer cette membrane basale naturelle sur la surface interne des prothèses synthétiques.
Différents travaux ont mis en évidence les propriétés adhésives de la MEC des cellules endothéliales de cornée ou d'aorte (Gospodarowicz D. 1984 A.R. Liss. Inc. N.Y. 275-293). La MEC, sécrétée par ces cellules en culture et déposée à leur pôle basai, reste fermement attachée au support de culture. Un lavage à l'aide d'un détergent doux de la monocouche cellulaire permet de libérer la matrice intacte et dépourvue d'éléments ou de débris cellulaires.
En utilisant ce principe, les inventeurs ont mis au point un matriçage in vitro de prothèses synthétiques par de la MEC de cellules vasculaires et notamment artérielles ; cette préparation autorise lors de l'implantation in vivo une colonisation rapide et complète de la surface endoluminale par les cellules endothéliales de l'hôte.
Le procédé de modification de la surface interne des prothèses synthétiques utilisées en chirurgie vasculaire et cardiaque selon l'invention est caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser sur ladite surface interne une matrice endotheliale physiologique obtenue in vitro à partir de cellules vasculaires et notamment artérielles. On assure ainsi l'endothélialisation vraie, in vivo, par des cellules endothéliales autologues et fonctionnelles.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite surface interne est préalablement revêtue de fibronectine humaine. La présente invention sera mieux comprise, et ses avantages ressortiront bien de la description qui suit du protocole de validation in vitro.
Préparation de lignées cellulaires Des lignées artérielles, destinées à l'étape, de matriçage et d'endothélialisation, ont été préparées à partir d'aortes ou d'artères fémorales de mammifères. Chaque prélèvement artériel obtenu, quelque soit son origine ou sa nature, a été traité de la même façon, dans des conditions rigoureusement contrôlées de biosécurité (stérilité, innocuité). L'échantillon artériel, déposé sur un plateau, est incisé longitudinalement puis rincé délicatement à l'aide d'une solution saline pour éliminer les éléments sanguins résiduels. Les cellules endothéliales sont récoltées par grattage de toute la surface, puis ensemencées dans un puit de culture (plaque 24 puits). La plaque 5, de culture est incubée 24 h minimum à 37°C avant le premier changement de milieu de culture.
Le milieu de culture pour ce travail est de préférence le milieu EGM commercialisé par Clonetics : milieu MCDB 131 supplémenté en sérum de veau foetal, hydrocortisone, facteur de croissance épidermique recombinant humain 1D (hEGF), extrait de cerveau bovin (Bovine Brain Extract BBE).
Les cellules endothéliales peuvent être décollées de leur support pour récolte ou réensemencement par action d'une solution de Trypsine-EDTA.
Validation du matricaαe sur PTFE
Conformation : Les essais d'endothélialisation in vitro ont été réalisés sur !£ des disques de PTFE + fibronectine humaine + MEC de cellules artérielles comparativement à des disques de PTFE non modifié et de PTFE enduit de fibronectine humaine seule.
Une modification de tubes Ependorf a permis de réaliser des chambres de culture de 0,5 cm2 de surface, permettant une immobilisation du matériau 20 prothétique (PTFE -Dacron) ; chaque disque ainsi formé est autoclave avant son utilisation.
Enduction par la fibronectine humaine - Les disques sont incubés 1 h à
37°C ou une nuit à 4°C avec 5 μg/cm2 de fibronectine de plasma humain. L'excès de gel est aspiré, laissant un film fin à la surface.
Enduction par une couche matricielle artérielle
Les cellules artérielles sont ensemencées à la densité de 105 cellules / cm2, sur la surface prothétique préalablement enduite de fibronectine. Elles sont alors maintenues en culture pendant environ 12 jours dans le milieu de culture EGM + 4 % de Dextran T 40. Un changement régulier du milieu est effectué tous
30 les 3 jours. Au terme de ce temps de culture, les cellules sont décollées par 2 incubations successives de 30 min. dans une solution d'urée 2 M à 37°C, laissant la MEC fermement attachée au disque de PTFE et dépourvue d'éléments cellulaires.
Endothélialisation in vitro
35 Des cellules artérielles d'aorte de porc sont ensemencées, en parallèle, sur les différents supports (PTFE nu, PTFE + fibronectine humaine, PTFE + fibronectine humaine + MEC artérielle) à la densité de 105 cellules / disque ; elles sont ensuite cultivées pendant une période de 5 à 7 jours dans le milieu EGM.
La capacité d'endothélialisation de chaque support est déterminée par les essais suivants :
- numération cellulaire aux jours J + 1 et J + 5 de la culture des cellules détachées par l'action d'une solution de Trypsine -EDTA (compteur de cellule : Coulter ZM). Les résultats, exprimés par la moyenne d'essais réalisés en triplicate pour chaque support, sont illustrés par le dessin schématique annexé dans lequel
Figures 1 , 2, et 3 sont des graphiques-barres de numération cellulaire. Sur ces figures, le nombre de cellules est porté en abscisses et le nombre de jours en ordonnées.
On voit, sur la figure 1 la presque totale absence d'adhésion des cellules endothéliales sur le support PTFE nu (8 % seulement des cellules ont adhéré à J + 1). Ce paramètre est restauré par l'enduction de la surface prothétique par la fibronectine humaine (FNH) : 40 % d'adhésion, et est amélioré de façon significative sur le support PTFE + fibronectine humaine + MEC artérielle (MEC- ART). La numération réalisée à J + 5 met en évidence la prolifération des cellules endothéliales sur ce support : le nombre de cellules est multiplié par 4 entre J + 1 et J + 5. Les propriétés de "réservoir" en facteurs de croissance de la MEC artérielle semblent être conservées permettant ainsi une stimulation de la croissance cellulaire sur ce support.
- examen en microscopie à balavaαe : chaque disque endothélialisé a été fixé au glutaraldéhyde 2,5 % dans un tampon au phosphate (PBS : Phosphate Buffer Saline solution) pendant 1 h à température ambiante. Après 3 lavages de 20 min dans du PBS, on réalise une post-fixation dans du tétroxyde d'osmium : 1 % dans du tampon cacodylate 0,3 M pendant 1 h à 4°C. La déshydratation des échantillons est obtenue par passage dans des bains d'éthanol de concentration croissante : 2 min. dans l'ethanol à 30°, 50°, 70°, 95°, puis 2 fois 3 min. dans l'ethanol à 100°. Après séchage par agitation rapide dans l'air, les échantillons sont recouverts d'or par pulvérisation cathodique et examinés à l'aide d'un microscope Philips XL20.
On constate que la MEC sécrétée sur le PTFE enduit de fibronectine humaine permet une couverture endotheliale homogène et complète. Un ensemencement de cellules artérielles sur les deux autres supports étudiés laisse la surface du matériau apparente en de multiples endroits, même après enduction par la fibronectine. Une éventuelle modification du matriçage a été ensuite étudiée. Par contraste avec l'endothélium, la lame basale sous endotheliale représente une surface hautement thrombogénique et I. Vlodavsky et al (1982 - Thromb.Res. 28 : 179-191) concluent à une interaction spécifique plaquettes - matrice et il propose deux traitements palliatifs :
- fixation légère de la matrice par du glutaraldéhyde : ce traitement est connu pour son action inhibitrice sur la prolifération cellulaire mais également pour sa haute toxicité, ce qui interdit son utilisation lors d'une implantation chez l'homme. - dénaturation des protéines de la matrice par chauffage ; l'adhésion plaquettaire est inhibée par une exposition de la matrice à une température de 90°C pendant 10 min. Cette dénaturation protéique a aussi pour conséquence une diminution de l'adhésion des autres cellules.
C'est cette technique, qui n'est pas toxique pour l'homme, que les inventeurs se sont proposés d'utiliser, en vérifiant toutefois que la diminution de capacité d'adhésion n'influence pas de façon significative la capacité d'endothélialisation.
Traitement de la MEC
Des disques de PTFE, matrices par la MEC de cellules artérielles et chauffés à 70°C et 90°C ont été ensemencés par des cellules artérielles de porc. L'adhésion et la prolifération cellulaire ont été évaluées par numération cellulaire aux jours J + 1 et J + 5 de la culture.
Les résultats, obtenus pour des essais réalisés en triplicate, sont représentés à la figure 2. Ils ne démontrent pas de différence significative pour les deux paramètres considérés entre la MEC chauffée à 90°C et la MEC de contrôle ; on constate par contre une légère diminution pour la MEC chauffée à 70°C. Validation du matriçage sur Dacron
Les mêmes méthodes d'étude ont été appliquées au matériau Dacron et l'on voit, sur la figure 3, la nette amélioration de la capacité d'endothélialisation du Dacron matrice (MEC-ART) par rapport aux autres présentations de ce matériau nu ou enduit de fibronectine humaine (FNH) .
Les résultats exposés ci-dessus ont conduit les inventeurs à proposer un protocole pour le procédé de modification de la surface interne des prothèses synthétiques qui comporte les étapes suivantes : - Enduction de la surface interne de la prothèse par incubation avec une solution de fibronectine recombinante humaine - lavage avec une solution saline pour élimination de l'excès de fibronectine
- ensemencement de la face interne de la prothèse par une suspension de cellules endothéliales artérielles, puis culture cellulaire par incubation de cette prothèse dans un récipient stérile à 37°C
- élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée 2 M
- stockage de la prothèse ainsi matricée à 4°C dans un environnement stérile.
Avantageusement, l'étape d'élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée est suivie d'une étape de chauffage de la prothèse à 90°C pendant 10 minutes
Un protocole précis pour la modification de la surface interne des prothèses synthétiques selon l'invention est décrit ci-après :
- enduction de la surface interne de la prothèse par incubation avec une solution de fibronectine recombinante humaine : 2 à 10 μg /cm2 pendant 1 heure à 37°C.
- lavage avec une solution saline (PBS) pour élimination de l'excès de fibronectine
- ensemencement de la face interne de la prothèse par une suspension de cellules endothéliales artérielles, à une densité comprise entre 0,5.10^ et
2.105 cellules par cm2 et incubation de cette prothèse dans un récipient stérile à 37°C avec rotations régulières, au rythme de 4 par heure pendant 2 à 3 heures.
- culture dans un bain de milieu EGM + 4 % de Dextran T40 pour 10 à 15 jours avec changement du milieu 2 fois par semaine - au terme de cette période, élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée 2 M pendant 30 minutes à 37°C
- chauffage de la prothèse à 90°C pendant 10 minutes
- stockage de la prothèse ainsi matricée à 4°C dans un environnement présentant des garanties de parfaite stérilité pour une période pouvant aller de 3 à 6 mois.
Des essais de validation in vitro ont ensuite été effectués et vont maintenant être décrits.
Protocole opératoire
Au cours de deux mois consécutifs, les inventeurs ont implanté 4 prothèses matricées chez 4 cochons. Cette expérimentation a été précédée de deux essais chez deux cochons pour juger de la faisabilité et mettre au point un protocole reproductible.
Les cochons étaient âgés d'un mois, pesaient 20 kg, le sexe ratio était de 2 mâles et 2 femelles.
Les prothèses étaient toutes matricées selon la technique de l'invention. Il s'agissait de 4 tubes droits, 3 en PTFE et 1 en Dacron de diamètre de 6 mm, sauf pour 1 tube en PTFE de diamètre 5 mm et de 6 cm de longueur implantée.
Les cochons ont été opérés sous anesthésie générale au propofol après une prémédication par la kétamine, l'atropine et le midazolam Ils étaient intubés et ventilés avec une voie veineuse périphérique.
L'intervention a consisté en la mise en place, après laparotomie médiane d'un tube droit aorto-aortique sous rénal. Les anastomoses proximales et distales terminales ont été confectionnées avec un surjet de fils non résorbables en polypropylène. Les cochons ont été opérés sous héparinothérapie 500 Ul en injection intraveineuse avant le clampage puis, 500 Ul à la fermeture, associée à 250 mg d'acétyl salicylate de lysine en intraveineuse. On a poursuivi l'administration de l'acétyl salicylate de lysine per os (introduit directement dans l 'arrière-gorge des cochons) à la dose de 500 mg, un jour sur deux, et ce pendant les 8 jours postopératoires.
Les explantations ont été faites pour les prothèses en PTFE 8 jours, 15 jours et 1 mois après la première intervention et à 1 mois pour la prothèse en Dacron.
Le jour de l'explantation, tous les cochons étaient en bon état général, sans signes fonctionnels, les membres inférieurs étaient chauds et il y avait des pouls périphériques perçus au doigt.
L'explantation, menée sous anesthésie générale, a consisté en l'ablation de la prothèse avec repérage et prélèvement des anastomoses proximales et distales ; les animaux n'ont été sacrifiés qu'après l'intervention.
Résultats
Observation macroscopique
Toutes les prothèses étaient perméables. Elles ont été sectionnées en deux dans le sens longitudinal et l'on n'a pas constaté macroscopiquement de thrombose pariétale importante, ni de dépôts fibrino-plaquettaires. Microscopie électronique à balavaαe
Dès leur retrait, les prothèses ont été rincées soigneusement afin d'éliminer les éléments sanguins résiduels puis elles ont été fixées une heure dans du glutaraldéhyde 2,5 % dans du PBS à température ambiante. On a ensuite procédé à leur étude en microscopie électronique à balayage suivant le protocole de préparation décrit lors de la validation in vitro. La chronologie d'implantation de 8 jours, 15 jours et 1 mois a permis de suivre l'endothélialisation progressive (8 et 15 jours) et complète (1 mois) de toute la surface interne des prothèses que ce soit en PTFE ou en Dacron:
- 8 jours : début de couverture endotheliale en monocouche sur 1 cm environ à partir des anastomoses et apparition de zones cellulaires endothéliales au sein des dépôts de fibrine observés sur toute la partie centrale de la prothèse - 15 jours : la couverture endotheliale est pratiquement achevée ; les macrophages visibles au centre même de la prothèse assurent le nettoyage des zones de fibrine
- 1 mois (PTFE et Dacron) : endothélialisation totale et exclusive de la surface interne de la prothèse.
Microscopie électronique à transmission
Les échantillons prothétiques fixés au glutaraldéhyde sont post-fixes au tetroxyde d'osmium 1 % dans un tampon cacodylate pendant 1 heure à 4°C. Ils sont ensuite déshydratés à l'aide d'une gamme progressive d'éthanol 5 minutes dans l'ethanol à 30°, 50°, 70°, 95°, 3 fois 10 minutes dans l'ethanol à 100° puis 3 fois 10 minutes dans de l'oxyde de propylene. Après inclusion des échantillons dans une résine époxy des sections ultrafines sont réalisées à l'aide d'un ultramicrotome puis contrastées à l'acétate d'uranyl et au citrate de plomb avant leur observation.
L'observation de la couche cellulaire endoluminale révèle, dans le sens lumière-paroi, les présences successives de cellules endothéliales jointives et en voie de quiescence, de cellules de nature macrophagiques au sein d'un réseau de fibrine et d'une couche de cellules de type myofibroblastique qui ont constitué une matrice conjonctive en contact direct avec le matriçage prothétique (mise en évidence de fibres de collagène). Cette organisation anticipe la formation d'un tissu endoluminal normal.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de modification de la surface interne des prothèses synthétiques utilisées en chirurgie vasculaire et cardiaque, caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser sur ladite surface interne une matrice endotheliale physiologique obtenue in vitro à partir de cellules vasculaires, lesdites cellules
5, étant ensuite éliminées de la surface prothétique avant implantation de la prothèse.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les cellules vasculaires sont des cellules artérielles.
3. Procédé selon la revendication 1 et la revendication 2, caractérisé en ce o que ladite surface interne est préalablement revêtue de fibronectine humaine.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
- Enduction de la surface interne de la prothèse par incubation avec une solution de fibronectine recombinante humaine 5 - lavage avec une solution saline pour élimination de l'excès de fibronectine
- ensemencement de la face interne de la prothèse par une suspension de cellules endothéliales artérielles, puis culture cellulaire par incubation de la prothèse dans un récipient stérile à 37°C o - élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée 2 M
- stockage de la prothèse ainsi matricée à 4°C dans un environnement stérile.
5 Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'étape d'élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée est suivie 5 d'une étape de chauffage du segment à 90°C pendant 10 minutes
6. Procédé selon la revendication 4 et la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
- Enduction de la surface interne de la prothèse par incubation avec une solution de fibronectine recombinante humaine : 2 à 10 μg /cm2 pendant 1 heure 0 à 37°C.
- lavage avec une solution saline (PBS) pour élimination de l'excès de fibronectine
- ensemencement de la tece interne de la prothèse par une suspension de cellules endothéliales artérielles, à une densité comprise entre 0,5.105 et 5 2.105 cellules par cm2 et incubation de la prothèse dans un récipient stérile à 37°C avec rotations régulières, au rythme de 4 par heure pendant 2 à 3 heures.
- culture dans un bain de milieu EGM + 4 % de Dextran T40 pour 10 à 15 jours avec changement du milieu 2 fois par semaine
- au terme de cette période, élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée 2 M pendant 30 minutes à 37°C
- chauffage de la prothèse à 90°C pendant 10 minutes
- stockage de la prothèse ainsi matricée à 4°C dans un environnement présentant des garanties de parfaite stérilité pour une période pouvant aller de 3 à 6 mois.
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