[go: up one dir, main page]

WO1996004293A1 - Antitumor indolopyrrolocarbazoles - Google Patents

Antitumor indolopyrrolocarbazoles Download PDF

Info

Publication number
WO1996004293A1
WO1996004293A1 PCT/JP1995/001490 JP9501490W WO9604293A1 WO 1996004293 A1 WO1996004293 A1 WO 1996004293A1 JP 9501490 W JP9501490 W JP 9501490W WO 9604293 A1 WO9604293 A1 WO 9604293A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
amino
compound
lower alkyl
hydroxy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1995/001490
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Katsuhisa Kojiri
Haruki Shimokawa
Mitsuru Ohkubo
Kenji Kawamura
Hisao Kondo
Hiroharu Arakawa
Hiroyuki Suda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MSD KK
Original Assignee
Banyu Phamaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Banyu Phamaceutical Co Ltd filed Critical Banyu Phamaceutical Co Ltd
Priority to AU30864/95A priority Critical patent/AU3086495A/en
Publication of WO1996004293A1 publication Critical patent/WO1996004293A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/052—Imidazole radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Definitions

  • the present invention is useful in the field of medicine, and more specifically, a novel group of compounds having an antitumor effect by inhibiting the growth of tumor cells, a method for producing the same, a use thereof, and a microorganism used for producing the compound. It is about.
  • the present inventors have conducted research on antitumor substances and found that a novel antitumor substance, BE-13793C (12,13-dihydro-1,11-dihydroxy-15H-indolo, 2,3-a] pyro-mouth [3,4-c] potassium-5,7 (6H) dione) and disclosed in the earlier patent application (Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-20277) "The Journal J. Antibiotics, Vol. 4, pp. 73-72
  • BE-13793C was chemically modified to create a compound with even better antitumor activity.
  • the indolopyrrolocarbazole-based compounds disclosed in “The Journal of Antibiotics, Vol. 45, pp. 1797-1798 (1992)” have a monosaccharide group.
  • the present invention provides a disaccharide-based indopyrrololocarbazole derivative having a disaccharide group and exhibiting excellent antitumor properties.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that a novel compound obtained by introducing a disaccharide group into an indolopyrrolocarbazole compound exhibits excellent antitumor activity. completed. That is, the present invention relates to the general formula [1]
  • X ′ and X 2 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, an amino group, a mono-lower alkylamino group, a di-lower alkylamino group, a hydroxy group, a lower alkoxy group, an aralkoxy group, a carboxyl group, a lower alkoxycarbo.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an amino group, a formylamino group, a lower alkyl group, a lower alkanoyloxy group, a hydroxy lower alkyl group or a lower alkyl group which may be substituted with one or two hydroquine groups.
  • Alkanoylamino group mono-lower alkylamino group, di-lower alkylamino group, hydroquine group, lower alkoxy group, aralkoxy group, aralkyl group, lower alkylcarbonyl group, arylcarbonyl group or lower alkyl group (the lower alkanoyl group)
  • Lamino group, mono-lower alkylamino group, di-lower alkylamino , Lower alkoxy, aralkyloxy, aralkyl, lower alkylcarbonyl, arylcarbonyl and lower alkyl are carboxyl, carbamoyl, sulfo, amino, cyano, mono-lower alkylamino , May be substituted by a lower alkylamino group, a hydroxy group, 1 to 3 hydroxy groups or 1 to 3 hydroxy groups! ⁇ , May have a lower alkyl group, t may be a heterocyclic ring
  • R 2 represents a dis
  • lower means that the group or compound to which this term is attached has 6 or less, preferably 4 or less carbon atoms.
  • a lower alkyl group is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, Examples include an isopentyl group, a neopentyl group, and a hexyl group.
  • the mono-lower alkylamino group is an amino group having one linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the di-lower alkylamino group is an amino group having two linear or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • the lower alkoxy group is a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, such as methyloxy, ethyloxy, propyloxy, isopropyloxy, butyloxy, isobutyloxy, sec. —Butyloxy group, tert-butyloxy group, pentyloxy group, isopentyloxy group, neopentyloxy group, hexyloxy group and the like.
  • aralkoxy group examples include a benzyloxy group, a phenethyloxy group, a phenylpropoxy group, a / S-naphthylmethoxy group, a naphthylethoxy group, and a tetrahydronaphthylmethoxy group.
  • a lower alkoxy group is a linear or branched alkoxycarbonyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as methoxycarbonyl, ethoxyquincarbonyl, propoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl, and butoxy.
  • a lower alkoxy group is a straight-chain or branched chain having 1 to 6 carbon atoms. It is a lucanyloxy group.
  • a pentylcarbonyloxy group an isopentylcarbonyloxy group, a neopentylcarboxyloxy group, a hexylcarboxyloxy group, and the like.
  • the lower alkanoylamino group is a linear or branched alkanoylamino group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples include a mino group, a pentylcarbonylamino group, an isopentylcarbonylamino group, a neobentylcarbonylamino group, and a hexylcarbonylamino group.
  • aralkyl group examples include a benzyl group, a phenethyl group, a phenylpropyl group, a / 3-naphthylmethyl group, a naphthylethyl group, and a tetrahydronaphthylmethyl group.
  • the lower alkylcarbonyl group is a carbonyl group having a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • benzylcarbonyl group examples include a benzoinole group and a ⁇ -10-phenylcarbonyl group.
  • a heterocyclic group refers to a 5- to 6-membered heterocyclic group containing 1 to 3 heteroatoms selected from a sulfur atom, a nitrogen atom and an oxygen atom, and includes, for example, a furanyl group, a pyrrolinyl group, an oxazolinyl group, and an imidazolinyl group. Group, chenyl group, thiazolinyl group and the like.
  • Halogen atom means fluorine atom, chlorine atom, bromine atom and iodine atom.
  • the disaccharide group means a substituent in which two pentoses or hexoses are bonded by a glycosyl bond, and the hydroxyl group of these monosaccharide groups is a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkylcarbonyloxy group, a lower alkoxy group.
  • these constituent sugars include ribose, arabinose, xylose, 2 -Deoxyribose and sugars derived from these pentoses, such as sugars derived from arose, altrose, glucose, mannose, growth, idose, galactose, talose and hexoses thereof, and glucose is preferred.
  • the disaccharide group is maltosyl group, Xylobilanosyl ribofura Sill group, glucopyranosylthio Ruri Bofuranoshiru group, easy Tobiranoshiru group, can a child illustrate cellobiose O Vila mannosyl group, maltosyl group is particularly preferred.
  • the compound of the present invention can be prepared by using a microorganism
  • R 3 represents a hydrogen atom, a lower alkyl group, a benzyloxymethyl group or an aralkyl group, and X 1 and X 2 have the above-mentioned meanings.
  • the compound represented by the general formula [1] can be produced by deriving a compound other than a hydrogen atom among the compounds represented by the general formula [1], if necessary, by the following production method.
  • the microorganism that can be used in the present invention may be any microorganism to which a disaccharide group can be added.Examples include Saccharothrixaerocol on igenes ATCC 39243 strain and the like. Can be used.
  • the medium When converting compound [2] to compound [1] -a, the medium is inoculated into a nutrient-containing medium and grown aerobically.
  • a nutrient source a known nutrient source for actinomycetes can be used.
  • a carbon source commercially available glucose, maltose, starch, sucrose, molasses, dextrin, or the like is used alone or as a mixture.
  • Nitrogen sources include commercially available soy flour, corn steep liquor, meat extract, yeast extract, dried yeast, cottonseed flour, peptone, wheat germ, fish meal, meat meal, defatted rice flour, defatted meat-and-bone meal, and inorganic ammonia.
  • Salts or sodium nitrate are used alone or as a mixture.
  • the inorganic salt commercially available calcium carbonate, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfate, sodium bromide, sodium borate, various phosphates and the like can be used.
  • a trace amount of a heavy metal salt such as iron, manganese, zinc, cono-chelate, and molybdic acid can be added.
  • a defoaming agent such as vegetable oils such as soybean oil or linseed oil, higher alcohols such as octadecanol, and various silicon compounds may be appropriately added.
  • any of those which are useful for the growth by utilizing the producing bacteria for example, 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid or sodium borate can be used.
  • the culturing method may be the same as the method for producing general microbial metabolites, and may be either solid culture or liquid culture.
  • any of stationary culture, stirring culture, shaking culture or aeration culture may be performed, but shake culture or deep aeration stirring culture is particularly desirable.
  • the culture temperature is suitably from 20 to 37 ° C, preferably from 25 to 30 ° C.
  • the preferred pH of the medium is in the range of 4 to 8, and the culture period is 2 to 20 days, preferably 4 to 15 days.
  • Culture In order to collect the desired compound represented by the general formula [1] a from the nutrient, a separation means usually used for collecting from metabolites produced by microorganisms is appropriately used.
  • the compound represented by the general formula [1] -a is present in the culture killed liquid and in the cells, a usual separation method from the cultured liquid or the cells, for example, the solvent extraction method, the ion exchange resin method or the adsorption is used.
  • the protein can be purified by a single method or a combination of a method of distribution chromatography and a gel method, and the like.
  • Preferred examples of separation and purification include the following methods. First, the culture solution is filtered to obtain bacterial cells. The obtained cells are extracted with an organic solvent such as methanol or acetone. The compound represented by the general formula [1] 1a can be obtained by subjecting the obtained crude extract to silica gel chromatography or the like.
  • the mutant strain of the microorganism having the ability to add a disaccharide group according to the present invention may be, for example, irradiated with X-ray or ultraviolet light, for example, nitrodine mustard, azaserine, nitrite, 2-aminobulin or N-aminobulin.
  • —Methyl-N ′ nitro—N-2-nitrosoguanidine (NTG) or other disaccharide groups can be obtained by commonly used bacterial species conversion methods such as treatment with a mutagen, phage contact, morphology, transformation transduction, or conjugation.
  • R 1 has the meaning described above]
  • the compound is produced by removing a protecting group as necessary.
  • the compound is converted to a compound [3] or a functional group-protected derivative thereof. Reacting hydrazine to produce a compound represented by the general formula [1] according to claim 1, wherein R 1 is an amino group;
  • It can be produced by aralkylating or alkylating the moiety represented by N-OH and, if necessary, removing a protecting group.
  • a compound in which A is an oxygen atom can be obtained by treating a compound in which A is -NR 3 -with a base, for example, by the method shown in (1) of Example 2.
  • Compound [4] can be a commercially available product, or can be produced by a known method.
  • the reaction between the compound represented by the general formula [3] or the functional group-protected derivative thereof and the compound represented by the general formula [4] is performed by using an imide or an acid anhydride widely known in the field of chemistry. Reaction with hydrazine derivatives, hydroxyylamines, alkoxyamines or lower alkylamines. This reaction is a compound
  • the compound [4] may be reacted directly with the compound [4] without solvent, but a solvent that does not adversely influence the reaction, for example, tetrahydrofuran or the like may be used as a reaction solvent.
  • a solvent that does not adversely influence the reaction for example, tetrahydrofuran or the like
  • the amount of compound [4] to be used in the reaction can be generally used in a small excess to a large excess with respect to compound [3] or a functional group-protected derivative thereof. In such a case, it is preferable to use an excess of 10 to 20 equivalents.
  • the reaction temperature is usually in the range of about 150 to about 50 ° C, and a higher or lower temperature can be selected as necessary.
  • the reaction time is usually in the range of 30 minutes to about 2 days, but a longer or shorter time can be selected as necessary.
  • the formylation of the formula N—NH 2 in the compound represented by the general formula [1] thus obtained can be carried out by a method usually used in formylation of an amino group, for example, formic acid, formamide
  • the reaction can be carried out by heating with dimethylformamide, dimethylformamide or the like, or by reacting a mixture of formic acid and an acid anhydride in a solvent that does not adversely affect the reaction or without a solvent.
  • the reaction temperature is usually about 1% when formylating with a mixture of formic acid and acid anhydride.
  • the reaction is carried out within the range of 5 C to room temperature, but may be carried out in a range of more or less as necessary.
  • the reaction time is usually from 10 minutes to about 5 hours, but if necessary. More or less time may be selected.
  • the lower alkanoylation can be carried out by a method of reacting a corresponding carboxylic acid halide or acid anhydride without a solvent or in a suitable solvent.
  • the reaction temperature is usually in the range of about ⁇ 5 ° C. to the boiling point of the solvent, but may be higher or lower as necessary.
  • the acid halide or acid anhydride is generally represented by the general formula wherein R 1 is an amino group
  • reaction time is usually about 30 minutes to about 2 days.
  • the alkylation reaction of the compound of the general formula [1] in which R ′ is an amino group can be carried out by a known method, for example, a reaction with an alkyl halide, an alkyl mesylate or an alkyl tosylate, or condensation with an aldehyde compound or a ketone compound. It can be performed by a reduction reaction or the like.
  • the aralkylation reaction of the compound of the general formula [1] in which R ′ is an amino group is as follows: It can be carried out in the same manner as in the alkylation reaction.
  • a of the compound represented by the general formula [3], wherein A is —NH— can be aralkylated, alkanoylated, arylcarbonylated or alkylated by a similar method.
  • the compound of the formula [1], wherein R 1 is an aralkyl group, a lower alkanol group, an arylcarbonyl group or a lower alkyl group, can be produced.
  • the product of the above reaction can be purified by a known method in the field of organic chemistry, for example, a precipitation method, a solvent extraction method, a recrystallization, a chromatography method, or the like.
  • a disaccharide group can be introduced into indole rubazole also by applying a method of chemically introducing various monosaccharide groups into indole rubazole. That is, the compound represented by the general formula [2] of the present invention or the compound B- [2] in which the functional group is protected is represented by the general formula [5]
  • Z represents a leaving group and R 2 has the above-mentioned meaning] or a compound B- [5] in which the functional group is protected, and if necessary, is formed. This is achieved by removing protecting groups in the product.
  • a suitable base for example, a solvent such as methanol, ethanol, propanol, acetone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide or a mixture of these solvents can be used.
  • Suitable bases for use in the reaction include, for example, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, etc. Examples include alkali metal hydroxides such as lithium metal carbonate, sodium hydroxide and potassium hydroxide, and alkali metal hydrides such as sodium hydride and lithium hydride.
  • compound [2] or compound B- [2] is usually reacted with compound [ 1 to 3 mol of 5] or B— [5] is used, but the amount of the compound [5] or B— [5] can be less than or more than that if necessary.
  • the amount of the base used in the reaction may be an equimolar amount or an excess amount with respect to the starting compound, but usually 1 to 4 mol.
  • the reaction temperature ranges from 0 ° C to the boiling point of the solvent.
  • the reaction time is not particularly limited, but is usually 30 minutes to 24 hours.
  • nitrogen gas, argon gas, etc. if necessary
  • the introduction and elimination of the protecting group may be carried out by a method commonly used in the field of chemistry [Green, Protective Group Sin Organic Chemistry, John See Weiley and Sons (1991) (see TW Greene, Plective Lr roupsin Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1981).
  • the production method using microorganisms is more industrially advantageous because a disaccharide group can be efficiently introduced into an indololulbazole compound without the steps of protection and deprotection required by a chemical method.
  • the antitumor activity test against mouse leukemia cell P388 was performed by dissolving the sample in dimethylsulfoxide, serially diluting it with dimethylsulfoxide, and placing it in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum (containing 2 OmM 2-mercaptoethanol). In addition, a test solution was prepared.
  • X 1 0 3 cells culture medium containing tumor cells fetal bovine serum 1 0% content P RM I 1 640 medium, containing the 2 Omm 2-mercapto Bok ethanol
  • test sample was dissolved in dimethyl sulfoxide, then serially diluted with dimethyl sulfoxide, and added to RPM11640 medium containing 10% fetal calf serum to prepare a test solution.
  • RPM11640 medium containing 10% fetal calf serum
  • the antitumor activity of the compound of the present invention on human cancer cells was tested in vitro.
  • the cells used were human lung cancer cells PC-13 and human gastric cancer cells MKN-45, and the cell culture medium used was RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum for all cancer cells. It was measured using the same method as the antitumor test for co1on26.
  • the compound of the present invention exhibited a strong growth inhibitory activity against mouse and human cancer cells, and the 50% growth inhibitory concentration (IC 5 ) was as shown in Table 1.
  • IC 5 50% growth inhibitory concentration
  • Table 1 Antitumor activity of the compound of the present invention (50% growth inhibitory concentration (M)) fens QRR * olnn PC-I MKN-45 Compound of Example 1 0.037 0.22
  • the compound of the present invention is commonly used as an indicator of anti-cancer effects
  • the compound exhibited an effect on P388 cancer cells more than that of the control compound having a monosaccharide group.
  • the compound of the present invention is a novel compound showing an excellent effect as an anticancer agent.
  • R 4 is a maltosyl group
  • Solubility Easily soluble in dimethylsulfoxide and tetrahydrofuran, slightly soluble in methanol and acetone, slightly soluble in chloroform and hexane. Distinguishing between acidic, neutral and basic substances: acidic
  • R 4 represents a maltosyl group
  • Example 1 129 mg of the compound obtained in Example 1 was dissolved in 4.5 ml of a 2N aqueous solution of potassium hydroxide, and the mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours. The mixture was partitioned by adding 50 ml of 2N hydrochloric acid saturated with 50 ml of non-salt and sodium chloride. The aqueous layer was extracted with 2-butanone, and the combined organic layers were washed with saturated saline and dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the obtained yellow-brown solid was suspended in methanol, and getyl ether and n-hexane were added. The insoluble material was removed to give 213.6 mg of the title compound.
  • R 4 represents a maltosyl group
  • Example 2 1 mg of the compound obtained in Example 1 was dissolved in hydrazine monohydrate 401 and stirred at room temperature for 1 hour. After adding 1 ml of water and adjusting the pH to 7 with concentrated hydrochloric acid, a precipitate was formed. The precipitate was washed with water and dried.
  • R 5 represents one D-xylobyranosyl-D-ribofuranosyl group.
  • R 6 is a compound of D-xylobyranosyl- ⁇ — D-ribofuranosyl group (1) 2,10-dibenzyloxy 12— [5-0— (2,3,4-tri—0—benzylyl ⁇ —D—xylobilanone) 1,2,3—0—isopropylidene—D—ribofuranosyl ] 1-Methylindolo [2,3-a] Pyro-mouth [3,4-c] Caproluvazole-5,7-dione
  • R 7 is ⁇ -D-glucoviranosyl- ⁇ -D-ribofuranosyl group
  • R 1P represents one D-glucoviranosyl group; one compound having an 8-D-ribofuranosyl group
  • R 11 is a compound of 1 meaning -D-lactoviranosyl group
  • Carbazole-5,7-dione 100 mg, silver oxide 84 Omg and molecular sieve 2 OOmg are suspended in 8 ml of toluene, and the mixture is heated under reflux for 0.5 hour, and then refluxed with 1-chloro-2,3. , 6, 2 ', 3', 4 ', 6' —Hepter 0—Vivaloylue D—Lactobyranoside 1.25 g 2 ml of a toluene solution of was added dropwise. After stirring for 2 hours, the reaction solution was filtered through celite and concentrated.
  • R is a compound of 1 meaning / 3-D-lactoviranosyl group
  • R 8 is / g—D—a maltoviranosyl group
  • Example 11 The compound of Example 11 was produced in the same manner as described in Example 10 using 3 ', 4', 6'-hepter 0-benzyl-5-D-maltoviranose.
  • Example 11 The compound of Example 11 was produced in the same manner as described in Example 10 using 3 ', 4', 6'-hepter 0-benzyl-5-D-maltoviranose.
  • R 8 represents / 3— D—maltoviranosyl group
  • Example 12 One hepter 0-benzyl-1-3-D-cellobiobilanose was used to produce the compound of Example 12 in the same manner as described in Example 10.
  • Example 12
  • R 9 represents -D-cellobiopyranosyl group
  • Rf value 0.05
  • B oc represents a t er t-butoxycarbonyl group; the same shall apply hereinafter).
  • Equation (4)
  • Equation (4) Production of the compound represented by
  • the compounds of the present invention show a remarkable growth inhibitory effect on mouse and human cancer cells. Therefore, the compounds of the present invention are useful as antitumor agents in mammals including humans.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

明 細 書 抗腫瘍性インドロピロロカルバゾール類 技術分野
本発明は、 医薬の分野で有用であり、 より具体的には腫瘍細胞の增殖を阻 害して抗腫瘍作用を有する新規化合物群、 その製造法及びその用途並びに該 化合物を製造するために用いる微生物に関するものである。
背景技術
本発明者らは抗腫瘍性物質の探索研究を行って、 微生物代謝産物中に新規 な抗腫瘍性物質 BE— 13793 C (12, 13—ジヒドロー 1, 1 1ージ ヒドロキシ一 5 H—インドロ [2, 3 - a] ピロ口 [3， 4 - c] 力ルバ ゾールー 5， 7 (6H) ージオン） を見いだし、 先の特許出願 （特開平 3— 20277号） において開示した 「ザ · ジャーナル ·ォブ ·アンチピオティ クス （ J . An t i b i o t i c s) 第 4 4卷、 7 2 3〜 7 2 8頁
( 1991年） 参照」 。 その後、 BE - 13793Cに化学修飾を加えて、 更に優れた抗腫瘍活性を有する化合物を創製することを試み、 先の特許出願
(国際公開 WO 91/18003及び特開平 6 - 128283号） にお いて開示した。
先の特許出願 （国際公開 WO 9 1 / 1 8003及び特開平 6 -
1 28283号） 「ザ ' ジャーナル ·ォブ ·アンチピオティクス （ J. An t i b i o t i c s) 第 45卷、 1797〜 1798頁 （1992年） 参照」 において開示したインドロピロロカルバゾール系の化合物は単糖基を 有する化合物であるが、 本発明は、 二糖基を有することを特徴とする優れた 抗腫瘍性を示す二糖性ィンドロピロロカルバゾール誘導体を提供するもので あ o。
発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決すべく、 鋭意研究した結果、 インドロピロ ロカルバゾール化合物に二糖基を導入することにより得た新規化合物が優れ た抗腫瘍活性を示すことを見出し、 本発明を完成した。 即ち、 本発明は一般式 [ 1 ]
Figure imgf000004_0001
[式中、 X '及び X 2はそれぞれ独立に水素原子、 ハロゲン原子、 アミノ基、 モノ低級アルキルアミノ基、 ジ低級アルキルアミノ基、 ヒドロキシ基、 低級 アルコキシ基、 ァラルコキシ基、 カルボキシル基、 低級アルコキシカルボ二 ル基、 低級アルカノィルォキシ基、 ヒドロキシ低級アルキル基又は 1〜2個 のヒドロキン基で置換されていてもよい低級アルキル基を示し、 R 1は水素 原子、 アミノ基、 ホルミルアミノ基、 低級アルカノィルァミノ基、 モノ低級 アルキルアミノ基、 ジ低級アルキルアミノ基、 ヒドロキン基、 低級アルコキ シ基、 ァラルコキシ基、 ァラルキル基、 低級アルキルカルボニル基、 ァリー ルカルボニル基又は低級アルキル基 （該低級アルカノィルァミノ基、 モノ低 級アルキルアミノ基、 ジ低級アルキルアミノ基、 低級アルコキシ基、 ァラル コキシ基、 ァラルキル基、 低級アルキルカルボニル基、 ァリールカルボニル 基及び低級アルキル基はカルボキシル基、 力ルバモイル基、 スルホ基、 アミ ノ基、 シァノ基、 モノ低級アルキルアミノ基、 ジ低級アルキルアミノ基、 ヒ ドロキシ基、 1〜3個のヒドロキシ基又は 1〜3個のヒドロキシ基によって 置換されていてもよ! ^、低級アルキル基を有していてもよ t、複素環基及びノ、口 ゲン原子からなる群より選ばれる 1〜5個の置換基を有していてもよい） を 示し、 R 2は二糖基を示す] で表される化合物、 その製法及び用途に関する ものである。
本明細書において使用する 「低級」 なる語は、 この語の付された基又は化 合物の炭素数が 6個以下、 好ましくは 4個以下であることを意味する。 低級アルキル基とは炭素数が 1〜 6個の直鎖状又は分岐状のアルキル基で あり、 例えば、 メチル基、 ェチル基、 プロピル基、 イソプロピル基、 ブチル 基、 イソブチル基、 s e c -ブチル基、 t e r t -ブチル基、 ペンチル基、 イソペンチル基、 ネオペンチル基、 へキシル基等が挙げられる。
モノ低級アルキルァミノ基とは炭素数が 1〜 6個の直鎖状又は分岐状のァ ルキル基を 1個有するアミノ基である。 例えば、 メチルァミノ基、 ェチルァ ミノ基、 プロピルアミノ基、 イソプロピルアミノ基、 ブチルァミノ基、 イソ ブチルァミノ基、 s e c—ブチルァミノ基、 t e r t —ブチルァミノ基、 ぺ ンチルァミノ基、 イソペンチルァミノ基、 ネオペンチルァミノ基、 へキシル アミノ基等が挙げられる。
ジ低級アルキルァミノ基とは炭素数が 1〜6個の直鎖状又は分岐状のアル キル基を 2個有するアミノ基である。 例えば、 ジメチルァミノ基、 ジェチル アミノ基、 メチルプロピルアミノ基、 ェチルイソプロピルアミノ基、 メチル ブチルァミノ基、 ェチルイソブチル了ミノ基、 メチル s e c —プチルァミノ 基、 メチル t e r t —プチルァミノ基、 メチルペンチルァミノ基、 メチルイ ソペンチルァミノ基、 メチルネオペンチルァミノ基、 メチルへキシルァミノ 基等が挙げられる。
低級アルコキシ基とは炭素数が 1〜6個の直鎖状又は分岐状のアルコキシ 基であり、 例えば、 メチルォキシ基、 ェチルォキシ基、 プロピルォキシ基、 イソプロピルォキシ基、 ブチルォキシ基、 イソブチルォキシ基、 s e c—ブ チルォキン基、 t e r t —ブチルォキシ基、 ペンチルォキシ基、 イソペンチ ルォキシ基、 ネオペンチルォキシ基、 へキシルォキシ基等が挙げられる。 ァラルコキシ基としては例えばべンジルォキシ基、 フヱネチルォキシ基、 フエニルプロポキシ基、 /S—ナフチルメ トキシ基、 ナフチルエトキシ基、 テ トラヒドロナフチルメ トキシ基等が挙げられる。
低級アルコキシ力ルポニル基とは炭素数が 1〜 6個の直鎖状又は分岐状の アルコキシカルボニル基であり、 例えば、 メ トキシカルボニル基、 エトキン カルボニル基、 プロポキシカルボニル基、 イソプロポオキシカルボニル基、 ブトキシカルボニル基、 イソブチルォキシカルボニル基、 s e c—ブチルォ キシカルボニル基、 t e r t —ブチルォキシカルボニル基、 ペンチルォキシ カルボニル基、 イソペンチルォキシカルボニル基、 ネオペンチルォキシカル ボニル基、 へキシルォキシカルボニル基等が挙げられる。
低級アル力ノィルォキシ基とは炭素数が 1〜 6個の直鎖状又は分岐状のァ ルカノィルォキシ基である。 例えば、 ァセチルォキシ基、 ェチルカルボニル ォキシ基、 プロピルカルボニルォキシ基、 イソプロピルカルボニルォキシ 基、 ブチルカルボニルォキシ基、 イソブチルカルボニルォキシ基、 s e c— ブチルカルボニルォキシ基、 t e r t—ブチルカルボニルォキシ基、 ペンチ ルカルボニルォキシ基、 イソペンチルカルボニルォキシ基、 ネオペンチルカ ルポ二ルォキシ基、 へキシルカルポ二ルォキシ基等が挙げられる。
低級アルカノィルァミノ基とは炭素数が 1〜6個の直鎖状又は分岐状のァ ルカノィルァミノ基である。 例えば、 ァセチルァミノ基、 ェチルカルボニル アミノ基、 プロピルカルボニルァミノ基、 イソプロピルカルボニルァミノ 基、 ブチルカルボニルァミノ基、 ィソブチルカルボニルァミノ基、 s e c— ブチルカルボニルァミノ基、 t e r t —ブチルカルボニルァミノ基、 ペンチ ルカルボニルァミノ基、 イソペンチルカルボニルァミノ基、 ネオベンチルカ ルボニルァミノ基、 へキシルカルボニルァミノ基等が挙げられる。
ァラルキル基としては例えばべンジル基、 フエネチル基、 フヱニルプロピ ル基、 /3—ナフチルメチル基、 ナフチルェチル基、 テトラヒ ドロナフチルメ チル基等が挙げられる。
低級アルキルカルボニル基とは炭素数が 1〜 6個の直鎖状又は分岐状のァ ルキル基を有するカルボニル基である。 例えば、 ァセチル基、 ェチルカルボ ニル基、 プロピルカルボニル基、 イソプロピルカルボニル基、 ブチルカルボ ニル基、 イソブチルカルボニル基、 s e c -ブチルカルボニル基、 t e r t 一ブチルカルボニル基、 ペンチルカルボニル基、 イソペンチルカルボニル 基、 ネオペンチルカルボニル基、 へキシルカルボニル基等が挙げられる。
了リ一ルカルポニル基としては例えばべンゾィノレ基、 β -十つチルカルポ ニル基が挙げられる。
複素環基とは硫黄原子、 窒素原子及び酸素原子より選ばれる 1〜 3個のへ テロ原子を含む 5〜 6員の複素環基を意味し、 例えばフラニル基、 ピロリニ ル基、 ォキサゾリニル基、 イミダゾリニル基、 チェニル基、 チアゾリニル基 等が挙げられる。
ハロゲン原子とはフッ素原子、 塩素原子、 臭素原子及びヨウ素原子を意味 " * o 二糖基とは 2個のペントース又はへキソースがグリコシル結合によって結 合した置換基を意味し、 これらの単糖基の水酸基は水素原子、 低級アルキル 基、 低級アルキルカルボニルォキシ基、 低級アルコキシ基及びアミノ基から なる群から選ばれる同一又は異なる 1〜 3個の基で置換されていてもよく、 また酸化されていてもよく、 これらの構成糖としては例えばリボース、 ァラ ビノース、 キシロース、 2—デォキシリボース及びこれらのペントースから 誘導される糖、 例えばァロース、 アルトロース、 グルコース、 マンノース、 グロース、 ィドース、 ガラク トース、 タロース及びこれらのへキソースから 誘導される糖を例示することができ、 グルコースが好ましく、 二糖基として はマルトシル基、 キシロビラノシルリボフラノシル基、 グルコピラノシルリ ボフラノシル基、 ラク トビラノシル基、 セロビォビラノシル基を例示するこ とができ、 マルトシル基が特に好ましい。
次に本発明の化合物の製造法につ t、て説明する。
本発明の化合物は微生物を用いて、 一般式
Figure imgf000007_0001
[式中、 R3は水素原子、 低級アルキル基、 ベンジルォキシメチル基又はァ ラルキル基を示し、 X 1及び X 2は前記の意味を有する] で表される化合物に 二糖基を付加して一般式
Figure imgf000007_0002
[式中、 R 3、 X 1及び X 2は前記の意味を有し、 R 2は二糖基を示す] で表さ れる化合物を製造し、 次いで必要に応じて後記製造法により、 一般式 [1] で表される化合物のうち R'が水素原子以外の化合物に誘導することにより 製造することができる。 本発明で使用し得る微生物は二糖基を付加すること のできる微生物であればいずれでも良いが、 たとえばサッカロスリクス ェ ァ ロ コ ロ ニ ゲ ネ ス ( S a c c h a r o t h r i x a e r o c o l on i g e n e s) ATCC 39243株等が使用でき る。
化合物 [2] を化合物 [1] - aに変換するに際しては栄養源含有培地に 接種して好気的に発育させる。 栄養源としては、 放線菌の栄養源として公知 のものが使用できる。 例えば、 炭素源としては、 市販されているブドウ糖、 麦芽糖、 デンプン、 庶糖、 糖蜜又はデキストリンなどが単独又は混合物とし て用いられる。 窒素源としては、 市販されている大豆粉、 コーンスティープ リカー、 肉エキス、 酵母エキス、 乾燥酵母、 綿実粉、 ペプトン、 小麦胚芽、 魚粉、 ミートミール、 脱脂米ヌ力、 脱脂肉骨粉、 無機アンモニゥム塩又は硝 酸ナトリウムなどが単独又は混合物として用いられる。 無機塩としては、 市 販されている炭酸カルシウム、 塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 硫酸マグネ シゥム、 臭化ナトリウム、 ホウ酸ナトリウム又は各種リン酸塩などを使用す ることができる。 その他必要に応じて、 鉄、 マンガン、 亜鉛、 コノく'ルト、 モ リブデン酸などの重金属塩を微量添加することもできる。 また、 発泡の激し い場合には消泡剤として、 例えば大豆油又は亜麻仁油などの植物油、 ォクタ デカノールなどの高級アルコール類、 各種シリコン化合物などを適宜添加し てもよい。 これらのもの以外でも、 該生産菌が利用し生育に役立つもの、 例 えば 3— （N—モルホリノ） プロパンスルホン酸又はホウ酸ナトリウムなど であれば、 いずれも使用することができる。
培養方法としては、 一般の微生物代謝産物の生産方法と同様に行なえばよ く、 固体培養でも液体培養でもよい。 液体培養の場合は、 静置培養、 攪拌培 養、 振とう培養又は通気培養などのいずれを実施してもよいが、 特に振逢培 養又は深部通気攪拌培養が望ましい。 培養温度は 20〜37°Cが適当である が、 好ましくは 25~30°Cである。 好ましい培地の pHは 4〜8の範囲 で、 培養期間は 2日間〜 20日間、 好ましくは 4日間〜 15日間である。 培 養物から目的とする一般式 [1] 一 aで表される化合物を採取するには、 微 生物の生産する代謝物から採取するのに通常使用される分離手段が適宜利用 される。
一般式 [1] - aで表される化合物は培養滅液中及び菌体中に存在するの で、 培養濂液又は菌体より通常の分離手段、 例えば溶媒抽出法、 イオン交換 樹脂法又は吸着もしくは分配ク口マトグラフィ一法及びゲル'慮過法などを単 独又は組み合わせて行なうことにより精製できる。
好ましい分離精製の例として次の方法が挙げられる。 まず培養液を濂過 し、 菌体を得る。 得られた菌体をメタノール又はアセトンなどの有機溶媒を 用いて抽出する。 得られた粗抽出物について、 シリカゲルクロマトグラフ ィーなどを行なうことにより、 一般式 [1] 一 aで表される化合物を得るこ とができる。
本発明の二糖基を付加する能力を有する微生物の変異株は、 例えば X線若 しくは紫外線などの照射処理、 例えばナイ トロジヱンマスタード、 ァザセリ ン、 亜硝酸、 2—アミノブリン若しくは N—メチルー N' —ニトロ— N—二 トロソグァ二ジン （NTG) 等の変異誘起剤による処理、 ファージ接触、 形 質、 転換形質導入又は接合などの通常用いられる菌種変換処理方法により二 糖基を付加する能力を有する微生物を変異させた微生物である。
本発明の一般式 [1] で表される化合物は一般式 [3]
Figure imgf000009_0001
[式中、 Aは酸素原子又は一 NR3—を示し、 R2、 R3、 X1及び X2は前記 の意味を有する] で表される化合物又は存在する官能基が保護されたその誘 導体に一般式 NH2 - R1 [4]
[式中、 R1は前記の意味を有する] で表される化合物を反応させ、 必要に 応じて保護基を除去することにより製造するか、 或いは化合物 [3] 又はそ の官能基保護誘導体にヒドラジンを反応させ、 請求項 1記載の一般式 [ 1 ] で表される化合物のうち、 R1がァミノ基である化合物を製造し、 次いで、 この化合物の構造式中、 式
^N-NH2 で表される部分をホルミル化、 低級アルカノィル化、 ァラルキル化、 アルキ ル化するか、 或いは化合物 [3] 又はその官能基保護誘導体にヒドロキシノレ アミンを反応させ、 請求項 1記載の一般式 [1] で表される化合物のうち、 R'がヒドロキシ基である化合物を製造し、 次いでこの化合物の構造式中、 式
： N-OH で表される部分をァラルキル化又はアルキル化し、 更に必要に応じて保護基 の除去を行うことにより製造することができる。
一般式 [3] で表される化合物のうち、 Aが酸素原子である化合物は、 A がー NR3 -である化合物を塩基で処理することにより、 例えば実施例 2の (1) に示す方法によって製造することができる。
化合物 [4] は市販品を用いることができ、 また公知の方法で製造するこ とができる。 一般式 [3] で表される化合物又はその官能基保護誘導体と一 般式 [4] で表される化合物との反応は化学の分野で広く知られたイミ ド又 は酸無水物とヒ ドラジン、 ヒ ドラジン誘導体、 ヒ ドロキシルァミン、 アルコ キシアミン又は低級アルキルァミンとの反応である。 この反応は、 化合物
[3] に化合物 [4] を無溶媒で直接反応させてよいが、 反応に悪影響を及 ぼさない溶媒、 例えばテトラヒドロフラン等を反応溶媒として使用してもよ い。 反応に用いる化合物 [4] の量は化合物 [3] 又はその官能基保護誘導 体に対して通常小過剰から大過剰を用 、て行うことができるが、 無溶媒の場 合には 1 0〜2 0当量の過剰量を用いることが好ましい。
反応温度は通常約一 5 0〜約 5 0 °Cの範囲であり、 必要に応じてこれ以上 又はこれ以下の温度を選択することもできる。 反応時間は通常 3 0分〜約 2 日間の範囲内であるが必要に応じてこれ以上又はこれ以下の時間を選択する こともできる。 このようにして得られる一般式 [ 1 ] で表される化合物中 の、 式 N-NH2 のホルミル化は、 ァミノ基のホルミル化において通常用いられる方法で行う ことができ、 例えばギ酸、 ホルムアミ ド、 ジメチルホルムアミ ド等と加熱す るか、 又は、 反応に悪影響を及ぼさない溶媒もしくは無溶媒でギ酸と酸無水 物との混合物を反応させる方法等により行うことができる。
反応温度はギ酸と酸無水物との混合物でホルミル化する場合は、 通常約一
5 C〜室温の範囲内で行われるが、 必要に応じてこれ以上又はこれ以下の範 囲で行うこともでき、 また、 反応時間は通常 1 0分〜約 5時間であるが必要 に応じてこれ以上又はこれ以下の時間を選択することもできる。
また、 低級アルカノィル化は、 無溶媒又は適当な溶媒中、 対応するアル力 ン酸ハロゲン化物又は酸無水物を反応させる方法等により行うことができ る。
反応温度は、 通常約 - 5 °C〜溶媒の沸点の範囲内で行われるが、 必要に応 じてこれ以上又はこれ以下の範囲で行うこともできる。
酸ハロゲン化物又は酸無水物は、 通常、 R 1がァミノ基である一般式
[ 1 ] の化合物に対して、 小過剰量使用されるが、 必要に応じてこれ以下又 はこれ以上を用いることもできる。 反応時間は、 通常、 約 3 0分間から約 2 日間である。
R 'がァミノ基である一般式 [ 1 ] の化合物のアルキル化反応は、 公知の 方法、 例えばアルキルハライド、 アルキルメシレート又はアルキルトシレー ト等との反応、 又はアルデヒド化合物もしくはケトン化合物と縮合、 還元反 応等により行うことができる。
また R 'がァミノ基である一般式 [ 1 ] の化合物のァラルキル化反応は、 アルキル化反応と同様の方法により行うことができる。
同様の方法によって、 一般式 [3] で表される化合物のうち Aが— NH - である化合物の Aをァラルキル化、 アルカノィル化、 ァリールカルボニル化 又はアルキル化することができ、 請求項 1記載の一般式 [1] の化合物のう ち R1がァラルキル基、 低級アルカノィル基、 ァリールカルボニル基又は低 級アルキル基である化合物を製造することができる。
官能基の保護及び保護基の除去は、 通常化学の分野で広く知られた方法で ラうことができる。
また、 上記反応の生成物は有機化学の分野における公知の方法、 例えば沈 殿法、 溶媒抽出法、 再結晶、 クロマトグラフィー法等により精製することが できる。
なお、 上記の微生物を用いる二糖基を導入する方法に換えて、 先の特許出 願 （国際公開 WO 91/18003) 「ザ ジャーナル ォブ アンチ ビォテイ クス （J . An t i b i o t i c s) 第 45巻、 1 797〜 1798頁 (1992年） 参照」 において開示したィンドロ力ルバゾールに 化学的に各種の単糖基を導入する方法を応用してもィンドロ力ルバゾールに 二糖基を導入することができる。 即ち、 本発明の一般式 [2] で表される化 合物又はその官能基が保護された化合物 B - [2] に一般式 [5]
R2-Z [5]
[式中、 Zは脱離基を示し、 R2は前記の意味を有する] で表される化合物 又はその官能基が保護された化合物 B— [5] を反応させ、 必要に応じて生 成物中の保護基を除去することにより達成される。
化合物 [2] 又は化合物 B— [2] と化合物 [5] 又は B— [5] との反 応は適切な塩基の存在下、 反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。 そ のような溶媒としては例えばメタノール、 エタノール、 プロパノール、 ァセ トン、 テトラヒドロフラン、 ジォキサン、 ァセトニトリル、 N， N—ジメチ ルホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシド等の溶媒又はこれらの溶媒を混合し て用いることができる。 反応に用いる適切な塩基としては、 例えば炭酸水素 ナトリウム、 炭酸水素カリウム、 炭酸ナトリウム、 炭酸カリウム等のアル力 リ金属炭酸塩、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリウム等の水酸化アルカリ金 属、 水素化ナトリウム、 水素化リチウム等の水素化アルカリ金属等が挙げら れる。
化合物 [2] 又は化合物 B— [2] と化合物 [5] 又は B - [5] との反 応に際しては、 通常、 化合物 [2] 又は化合物 B— [2] 1モルに対して、 化合物 [5] 又は B— [5] は 1〜3モルが用いられるが、 必要に応じて化 合物 [5] 又は B— [5] はこれ以下又はこれ以上の量を用いることができ る。 反応に用いる塩基の量は原料化合物に対して等モル又は過剰量が用 t、ら れるが、 通常は 1〜4モルが用いられる。
反応温度は 0°Cから溶媒の沸点の範囲が用いられるが、 通常は 0°Cから
10 (TCの間が用いられる。 反応時間に特に制限はないが、 通常は 30分か ら 24時間の間で行われる。 反応を円滑に行わせるため、 要すれば窒素ガ ス、 アルゴンガス等の不活性ガス気流中で行ってもよい。 保護基の導入及び 脱離は、 化学の分野で常用される方法を用いればよい [グリーン著、 プロテ クティブ グループス ィン オーガ二ック ケミストリー、 ジョン ウイ レイ アン ド ソ ンズ （ 1 9 8 1年） （T. W. G r e e n e , P r o t e c t i v e Lr r o u p s i n O r g a n i c Syn t h e s i s, J ohn Wi l e y & S on s, 1981) 参 照] 。
しかしながら、 微生物を用いる製造法は化学的手法で必要とされる保護、 脱保護の工程を経ずに効率よく二糖基をインドロ力ルバゾール化合物に導入 することができ、 工業的により有利である。
3月ィヒ #1の 乍
本発明の抗腫瘍性物質のマウス実験腫瘍細胞に対する増殖阻止作用を決定 するため、 試験管内で試験を行なった。 マウス白血病細胞 P 388に対する 抗腫瘍作用試験は検体をジメチルスルホキシドに溶解した後ジメチルスルホ キシドで逐次希釈してから、 牛胎児血清 10%含有RPMI 1640培地 (2 OmMの 2—メルカプトエタノールを含む） に加え検液とした。
1 X 1 03個の腫瘍細胞を含む細胞培養培地 （牛胎児血清 1 0 %含有 P RM I 1 640培地、 2 OmMの 2—メルカプ卜エタノールを含む） 50m 1を 96穴マイクロプレートに分注し、 37^で24時間、 5% CO 2下で培養した後に上記の検液 5 Omlを加え、 37 °Cで 72時間、 5 % C02下で培養後、 MTT測定法により対照群と比較した。
マウス大腸癌細胞 c o 1 on 26に対する抗腫瘍試験は、 検体をジメチル スルホキシドに溶解した後ジメチルスルホキシドで逐次希釈してから、 牛胎 児血清 10%含有 RPM 1 1640培地に加え検液とした。 1 x 103個の 腫瘍細胞を含む細胞培養培地 （牛胎児血清 1 0%含有？1¾1^ 1 1640培 地） 100m 1を 96穴マイクロプレートに分注し、 37° で24時間、 5 % CO 2下で培養した後に上記の検液 10 Omlを加え、 37 で72時 間、 5% C02下で培養後、 50%トリクロロ祚酸で固定し、 0. 4%ス ルホローダミン Bで染色後、 1 OmMトリス液を用いて細胞から色素を抽出 した。 45 Onmを対照波長として 550 nmに於ける吸光度を測定して対 照群と比較した。
更に、 本発明化合物のヒト癌細胞に対する抗腫瘍活性を試験管内で試験し た。 細胞は、 ヒト肺癌細胞 PC - 13及びヒト胃癌細胞 MKN— 45を使用 し、 細胞培養用培地は、 全ての癌細胞共に牛胎児血清 1 0 %含有 RPMI 1640培地を用い、 上記のマウス大腸癌細胞 c o 1 o n 26に対 する抗腫瘍試験と同様の手法を用いて測定した。
その結果、 本発明の化合物はマウスおよびヒ卜の癌細胞に対し、 強い増殖 P且止活性を示し、 50%増殖阻害濃度 （I C5。） は第 1表の通りであった。 対照化合物としては先の特許出願 （国際公開 WO 91ノ 18003) において開示された （ 1 2, 13—ジヒドロー 1, 1 1—ジヒドロキン一 12— — D—ダルコピラノシル） 一 5 H—インドロ [2, 3 - a] ピロ 口 [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7 (6H) ージオン） を用いた。 第 1表 本発明化合物の抗腫瘍作用 （50 %増殖阻止濃度 （ M)) fens QRR *olnnク PC- I MKN- 45 実施例 1の化合物 0.037 0.22
実施例 2の化合物 0.065 ― 0.3 0.24 実施例 3の化合物 0.064 0.68 0.65 0.25 実施例 4の化合物 0.007 0.08 0.30 0.10 実施例 5の化合物 0.011 0.14 0.21 実施例 6の化合物 0.017 0.30 0.33 実施例 7の化合物 0.002 0.036 0.073 0.044 実施例 10の化合物 0.027 0.54 0.55 0.43
実施例 11の化合物 0.004 0.074 0.057 0.073
対照化合物 0.1
本試験の結果、 本発明の化合物は制瘙効果の指標として常用される
P 3 8 8癌細胞に対して対照化合物の単糖基を有する化合物を超える効果を 示した。
したがって、 本発明化合物は制癌剤として優れた効果を示す新規な化合物 である。
以下に実施例および参考例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 本 発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
実施例 1
「61
Figure imgf000015_0001
「式中、 R 4はマルトシル基を意味する 1 の化合物の製造法
凍結 した菌液 サ ッ カ ロ ス リ ク ス . エア ロ コ ロニゲネ ス (S a c c h a r o t h r i x a e r o c o l o n i g e n e s) ATCC 39243株 1 m 1をグルコース 3. 0%、 ソーャフラワー 1. 0%、 綿実柏 1. 0%、 および炭酸カルシウム 0. 3%からなる培地 100mlを含む 500ml容の三角フラスコ 2本に接種し、 28°Cで 24 時間、 回転振通機 （毎分 220回転） 上で培養した。 この培養液 150ml を培地 25 Lを含む 50 L容のタンク 1本に接種し、 28°Cで 48時間、 通 気 （0. 5 vvm) 援拌 （毎分 250回転） 培養した。 更にこの培養液 7. 2 Lをグルコース 1. 0%、 デキストリン 6. 0%、 亜麻仁粕 1. 5%、 粉 末酵母 0. 5 %、硫酸第一鉄 7水和物 0. 1 %、 リン酸ニ水素ァンモニゥム 0. 1 %、 硫酸アンモニゥム 0. 1%、 炭酸カルシウム 1. 0%からなる培 地 1. 2 kLを含む 2 kL容のタンク 1本に接種し、 28°Cで通気 （0. 5 vvm) 攪拌 （毎分 250回転） 培養した。 120時間培養した時点で、 BE— 13793 C粉末の 495 gを含むテトラヒドロフラン Zメタノール (1 ： 2) 溶液 330mlを添加した。 更に同上条件下で 24時間培養した 時点で、 BE— 13793C粉末の 990 gを含むテトラヒドロフラン/メ 夕ノール （1 : 2) 溶液 660mlを添加し、 同上条件下で更に 120時間 培養した。 上記培養液にパーライト 100 k gを加えて濂過し、 得られた菌 体を 75%メタノールで 2回 （1 kL、 1 kL) 抽出した。 メタノール抽出 液を約 500mlまで濃縮し、 析出する沈殿物を' 取した。 沈殿物を乾燥 し、 813. 0 gの粉末を得た。 この粉末 400 gをシリカゲルのカラムク ロマグラフィ一 （ 1 1 X 1 10 cm、 ヮコーゲル C— 300、 和光純薬社 製） に付し、 ジクロロメタン メタノールノテトラヒドロフランズ 28%ァ ンモニァ水溶液 （3 : 1 : 3 : 0. 2、 3 : 1 : 3 : 0、 2 : 2 : 3 : 0) で順次洗浄後、 メタノール テトラヒドロフラン Z水 （7 : 7 : 1) で溶出 し、 目的の化合物を含む分画を濃縮乾固した。 これをセフアデックス LH—
20 (9 x 100 cm、 フアルマシア社製） のカラムクロマ卜に付し、 メタ ノールで溶出し、 目的の化合物を含む分画を集めて濃縮乾固した。 更にシリ 力ゲルのカラムクロマトグラフィー （2. 5 x 30 cm、 ヮコーゲル C一
300、 和光純薬社製） に付し、 ジクロロメタン/メタノール テトラヒド 口フラン Z28%アンモニア水溶液 （3 : 1 : 3 : 0. 2, 2 : 1 : 3 : 0. 2、 1 : 1 : 3 : 0. 2、 0. 5 : 1 : 3 : 0. 2、 0. 2 5 : 1 : 3 : 0. 2) で順次溶出し、 目的の化合物を含む分画を濃縮乾固した。 最後 にこれをセフアデックス LH— 20 (9 x 1 00 cm、 フアルマシア社製） のカラムクロマトに付し、 メタノールで溶出し、 溶出液を濃縮乾固して目的 の表題化合物 1 5 mgを得た。
性状：橙赤色アモルファス状固体または結晶
旋光度； 「α」 ¾。： + 1 85° (c = 0. 473, DMF)
分子式： C32H31N30,4
質量分析； HRFAB - MS (m/z) ：
計算値 （M) ， 68 1. 1 806
実測値 （M) + 68 1. 1 826
'Η— NMRスペク トル （C D3OD, 500 MH z) , δ (p pm) ： 3. 37 (1 H, t, J = 9. 4Hz) , 3. 5 1 ( 1 H, d d, J = 3.
6, 9. 4 H z ) , 3. 7 1 ( 1 H, t , J = 9. 4 H z ) , 3. 7 8 (1 H, d d, J = 5. 2, 1 1. 6H z) , 3. 83 (1 H, d d d, J
= 1 . 8 , 5. 2 , 9. 4 H z ) , 3. 9 0 ( 1 H, t , J = 8. 8H z) , 3. 94 (1 H， d d, J = 1. 8, 1 1. 6H z) , 3. 95
(1 H, t, J = 8. 8H z) . 4. 05 ( 1 H, m) , 4. 2 1 (1 H, d d, 3 = 2. 0 , 1 2. 2 H z ) , 4. 2 6 ( 1 H, t , J = 8. 8 H z) ， 4. 34 (1 H, d d, J = 3. 7, 1 2. 2 H z) , 5. 38
( 1 H， d, J = 3. 6 H z) , 6. 9 6 ( 1 H, b r d， J = 8. 0 H z) ， 6. 9 7 ( 1 H, b r d, J = 8. 0 H z ) , 7. 1 2
(1 H, t, J = 8. 0H z) , 7. 1 3 ( 1 H, t, J = 8. 0H z) ,
7. 27 (1 H, d， J = 8. 8H z) , 8. 56 ( 1 H, b r d. J = 8. OH z) , 8. 74 ( 1 H, b r d, J = 8. 0H z)
13C— NMRスペクトル （C D3OD, 1 2 5MH z) , δ (p pm) ： 6 1. 9 (t ) , 6 2. 7 ( t ) , 7 1. 5 (d) , 7 3. 8 (d) , 7 4. 2 (d) , 7 5. 0 (d) , 7 5. 1 (d) , 7 8. 8 (d) , 80. 0 (d) , 80. 5 (d) , 86. 8 (d) , 1 0 3. 3 (d) , 1 1 3. 0 (d) , 1 1 4. 8 (d) , 1 1 7. 7 (d) , 1 1 7. 9 (d) , 1 1 9. 6 (s) , 1 2 1. 0 (s) , 1 2 1. 8 (s) ,
1 22. 3 (d) , 1 22. 7 (d) , 1 23. 1 (s) , 1 25. 1 (s ) , 1 25. 8 (s) , 1 3 1. 0 (s) , 1 3 1. 6 ( s ) .
1 3 1. 9 (s) , 1 32. 5 (s) , 1 44. 4 (s) , 1 45. 1 (s) , 172. 5 (s) , 172. 6 (s)
溶解性： ジメチルスルホキシド、 テトラヒドロフランに溶け易く、 メタ ノール、 アセトンにやや溶け易く、 クロ口ホルム、 へキサンに溶けにくい。 酸性、 中性、 塩基性物質の区別：酸性
R f値； 0. 18 「メルク社製キーゼルゲル 60 F 254使用、 展開溶媒： トルエン Zメタノール Zテトラヒ ドロフラン / 28%アンモニア水溶液 (2 : 3 : 6 : 0. 4) 」
呈色反応；硫酸反応 陽性
実施例 2
弍 LU
Figure imgf000018_0001
[式中、 はマルトシル基を意味する 1の化合物の製造法
(1) 式 [8]
Figure imgf000018_0002
[式中、 R4はマルトシル基を意味する] の化合物の製造
実施例 1において得られた化合物， 129mgを 2規定水酸化カリウム水 溶液 4. 5mlに溶解し、 室温で 1. 5時間攪拌した後、 反応液に 2 -ブタ ノン 50ml、 食塩で飽和させた 2規定塩酸 50m 1を加えて分配した。 水 層を 2 -ブタノンで抽出し、 合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄後、 無水硫 酸ナトリウムで乾燥した。 溶媒を減圧留去し、 得られる黄褐色固体をメタ ノールに懸濁させ、 ジェチルエーテル、 n—へキサンを加えた。 不溶物を澳 取し、 表題の化合物， 213. 6mgを得た。
R f fit： 0. 33 (メルク社製、 キーゼルゲル 60 F 254, 展開溶媒：テ トラヒドロフラン：メタノール： n—へキサン：ギ酸 = 10 : 1. 5 : 4 : 0. 1)
分子式； C32H3。N2015
FAB-MS (m/z) : 682 (M) +
'H— NMRスペク トル （C D3OD. 30 OMH z ) , <5 (p pm) ： 3. 37 (1 H, t, J = 9. 3Hz) , 3. 50 ( 1 H, d d, J = 3. 8, 9. 7 H z) , 3. 69 ( 1 H, d, J = 9. 0Hz) , 3. 72 - 3. 98 (5H) , 4. 06 ( 1 H. m) . 4. 22 ( 1 H, d d, J = 2. 5, 12. 3H z) ， 4. 25 (1 H, t, J = 8. 6 H z) , 4.
35 (1 H, dd, J = 3. 6, 12. 2Hz) , 5. 37 (1 H, d, J =3. 8Hz) , 7. 00 (2H, dd, J = 0. 9, 7. 6Hz) , 7. 1 6 (2 H, t , J = 7. 9 H z) , 7. 28 ( 1 H, d, J = 8. 9H z)
(2) 実施例 2の （1) において得られた化合物 129mgと （2 SR) 一 3—ヒドラジノー 1, 2—プロパンジオール 73 m gを N, N—ジメチル ホルムアミ ド 8mlに溶解し、 80°Cで 2時間攪拌した。 反応液を減圧濃縮 して得られる残渣にメタノールを加え、 不溶物を濾去した後、 メタノールを 減圧留去した。 得られる赤褐色油状物を、 セフアデックス LH— 20 (ジク ロロメタン： メタノール：エタノール：水 = 5 ： 2 ： 2 ： 1 ) により精製 し、 表題の化合物 1 1 lmgを得た。
R f flt： 0. 28 (メルク社製、 キーゼルゲル 60 F264. 展開溶媒；テ トラヒドロフラン：メタノール： n—へキサン：ギ酸 = 10 : 2 : 2 : 0. 1)
分子式； C35H38N4016 FAB-MS (m/z) : 77 1 (M + H) +
' H— NM Rスペク トル （D M S O— d6, 3 0 0 MH z ) , δ
(p pm) ： 2. 9— 3. 2 (3H) , 3. 35 - 3. 50 (4H) , 3. 50— 3. 7 5 (6H) , 3. 90 (2H) , 4. 07 (2H) , 4. 5 - 4. 6 (2 H) , 4. 62 (1 H, d， J = 4. 3H z) , 4. 96 - 5. 03 (2H) , 5. 04 (1 H, d, J = 5. 0H z) , 5. 1 4 (1 H, d, J = 3. 3 H z) , 5. 35 ( 1 H) , 5. 63 ( 1 H) , 5. 7 4
(2 H) , 6. 98 - 7. 1 0 (3H) , 7. 1 8 (2H， d t, J = 1. 1 , 7. 9 H z ) , 8. 5 4 ( 1 H, d, J = 7. 7 H z ) , 8. 7 0
( 1 H, d， J = 7. 9 H z ) , 1 0. 0 0 ( 1 H, s) , 1 0. 4 1
( 1 H, s) , 1 0. 82 ( 1 H, b r s)
実施例 3
式 [9]
Figure imgf000020_0001
[式中、 R4はマルトシル基を意味する] の化合物の製造法
実施例 1にお t、て得られた化合物 2. l mgをヒドラジン 1水和物 40 1に溶解し、 室温で 1時間攪拌した。 水 1 m 1を加えてから、 濃塩酸で p H を 7に調整すると沈殿を生じたので、 これを '慮取して水洗後、 乾燥した。
1¾ £値： 0. 34 (メルク社製、 キーゼルゲル 60 F 254, 展開溶媒； ク ロロホルム： メタノール： テトラヒ ドロフラン = 1 ： 1 ： 0. 5)
分子式： C32H32N40M
FAB-MS (m/z) : 696 (M) 7 1 9 (M+N a"
実施例 4
式 [1 0]
Figure imgf000021_0001
「式中、 R5は 一 D—キシロビラノシルー ー D—リボフラノシル基を意 味する 1 の化合物の製造法
(1) 2. 10—ジベンジルォキシー 12— [5-0- (2, 3, 4—トリ 一 0—べンジルー 3— D—キシロビラノンル） 一 2, 3—0—イソプロピリ デンー 3— D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピロ 口 [3, 4 - c] カルバゾールー 5, 7—ジオンの製造
水酸化力リウム 200 m g及び硫酸ナトリウム 332mgをァセトニトリ ル 4. Omlに懸濁させ、 2， 10—ジベンジルォキシ一 6—メチルインド 口 [2， 3— a] ピロ口 [3, 4— c] 力ルバゾール—5, 7—ジオン [参 考例 4参照） 83mgを加え室温にて 15分攪拌した。 5— 0— （2, 3, 4—トリー 0—ベンジル一 一 D—キシロビラノンル） 一 2, 3— 0—イソ プロピリデンー D—リボフラノース 445mgから HMPT [へキサメチル ホスホラストリアミ ド] 及び四塩化炭素によりクロル化されたクロ口糖をァ セトニトリル 4. 3mlに溶解して滴下した。 室温にて 2時間攪拌した後、 反応液を酢酸ェチルで希釈し、 1 N塩酸、 4%炭酸水素ナトリウム水溶液、 次 、で飽和食塩水で順次洗浄した。 硫酸マグネシゥム上で乾燥後減圧濃縮し た。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー （トルエン一酢酸ェチル = 15 ： 1) を用いて精製し粗固体の 2， 10—ジベンジルォキシー 12— [5-0 - (2, 3, 4—トリー 0—ベンジルー^ー D—キシロビラノシル） 一 2，
3— 0—イソプロピリデン一/ S— D—リボフラノシル] 一 6—メチルインド 口 [2, 3— a] ピロ口 [3. 4— c] カルバゾールー 5, 7 -ジオン 14 Omgを得た。 Rf値： 0. 39 (へキサン：酢酸ェチル = 2 ： 1) 1 H-NMR (300MH z, CDC 1 3) p pm 1. 07 (3 H, s) ， 1. 62 (3 H, s) , 3 2 1 ( 1 H, m) , 3. 30 (3 H, s， N-Me) , 3. 58 (3H, m) , 3. 96 ( 1 H, m) , 4. 04 ( 1 H, m) , 4. 22 ( 1 H, d d, J = 4. 8H z, 6. 7Hz) , 4. 33-4. 83 (9H, m) , 5. 00 ( 1 H, d d， J = 5. 1 H z , , 7. 2H z) , 5. 1 9 (4 H, m) , 6. 23 ( 1 H, d， J = 4. 8Hz, H— 1) , 7. 04-7. , 54 (29H, m) , 9. 09 (1 H, d, J = 9. 0Hz) ， 9. 20 ( 1 H, d, J = 8. 4Hz) , 10. 03 ( 1 H, S, N-H)
(2) 2, 10—ジヒ ドロキシー 12— [5-0- (^一 D—キシロビラノ シル） 一^一 D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2, 3— a] ピ ロロ [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジオンの製造
粗固体の 2, 10—ジベンジルォキシー 12— [5— 0— （2, 3, 4- トリ— 0—べンジルー — D—キンロビラノシル） 一 2, 3— 0—イソプロ ピリデンー ー D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2, 3— a] ピロ口 [3, 4— c] カルバゾールー 5， 7—ジオン 1 37m gを無水 THF 3. 4 ml に溶解し、 10%塩酸メタノール 3. 4ml を加え 室温 2 時間攪拌した。 反応液を酢酸ェチルで希釈し、 4%重曹水ついで 食塩水で洗浄した。 乾燥後減圧濃縮し、 シリカゲルカラムクロマトグラフ ィー （トルエン一酢酸ェチル =3 ： 1) で精製した。 得られた固体 72mg をメタノール一 THF (1 : 1、 6 ml) に溶解し、 10%パラジゥ ム炭素 20mgを加え、 水素雰囲気下 3日間攪拌した。 触媒を ¾過した後濾 液を濃縮し、 残馇を酢酸ェチルに溶解した。 水及び食塩水で洗浄した後、 無 水硫酸マグネシウム上で乾燥し減圧濃縮した。 残渣をメタノール 3 ml に溶解しパラジゥム黒を加え水素雰囲気下 4時間攪拌した。 触媒を濂去した 後减圧濃縮し 2, 10—ジヒドロキン一 12— [5— 0— （ 一 D—キシロ ピラノシル） 一 /3— D—リボフラノシル] — 6—メチルインドロ [ 2 , 3— a] ピロ口 [3, 4 - c] カルバゾールー 5, 7—ジオン 29mgを得た。 Rf値： 0. 49 (クロ口ホルム一メタノール一エタノール一水 = 5 ： 2 ： 2 : 1) 1 H-NMR (50 OMH z, DMS 0-d 6) ： p pm 3. 07— 3. 22 (6 H, m, N— Me, H— 2" , 3" , 5" - a) ,
3. 37 ( 1 Η, m， Η— 4" ) ， 3. 77 (1 Η, m, Η— 5" b) , 3. 92 ( 1 Η, m, H-5' - a) , 4. 18-4. 29 (4H, m, H— 2' , 5' 一 b, 3' , 4' )， 4. 34 ( 1 H, d， J = 7. 3Hz, H— 1" ) , 4. 96 ( 1 H, d, J = 4. 9Hz, 4" 一 OH) ' 5. 00 ( 1 H, d, J = 4. 3 H z, 3" - OH) , 5. 1 4 ( 1 H, d, J = 4. 9H z, 2" 一 OH) , 5. 25 (2H, d, J = 5. 8Hz, 2' -OH, 3 ' 一 OH) , 6. 42 ( 1 H, d, J = 5. 8Hz, H— Γ ) , 6. 79 ( 1 H, d d, J = 1. 8H z,
8. H z) , 6. 86 ( 1 H, d d, J = 1. 8H z, 8. 4 H z ) , 7. 1 2 ( 1 H, d, J = 1. 8H z) , 7. 24
( 1 H, d, J = 1. 8H z) , 8. 83 (1 H, d. J = 8. 4 H z ) , 8 92 ( 1 H, d, J = 8. 4H z) , 9. 79 { (2 H,, mm)) ,， 1 1. 36 ( 1 H, s) 0
(3) 2, 10—ジヒドロキシ一 12— [5-0- ( ?— D—キシロビラノ シル） 一；3— D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2, 3— a] ピ ロロ [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジオン 29 mgを 2 N水酸化力 リゥム水溶液 0. 8mlに溶解し、 室温にて 40分攢拌した。 反応液に 2 N 塩酸 1. 6mlを加えて pH= 2とした後、 水で希釈し HP— 20 (水） の カラムに通過させた。 樹脂を水で洗浄した後、 メタノールで溶出した。 赤色 フラクションを集めて '濃縮した。 残渣をジメチルホルムァミ ド 1 mlに溶 解し、 2—ヒドラジノ— 1, 3—プロパンジオール [参考例 1参照] 40 mg のジメチルホルムアミ ド 0. 5ml溶液を加え室温終夜攪拌した。 反応液を濃縮後セフアデックス LH— 20 (クロ口ホルム一メタノールーェ タノ一ルー水 =5 : 2 : 2 : 1) により精製し、 表題の化合物 14 mgを 得た。
Rf値： 0. 29 (クロ口ホルム一メタノール一エタノール一水 = 5 ： 2 ： 2 : 1)
FABMS (m/z) ： [M + H] + = 71 1
1 H-NMR (30 OMH z , DMS O-d 6) ： p pm 3. 49 (4H, m) , 3. 78 ( 1 H, m, H - 5" - a) , 3. 91 ( 1 H, m, H- 5" - b) . 4. 09 (1 H, b r ) , 4. 1 5-4. 28 (4 H, m) , 4. 33 ( 1 H, d, J = 7. 2 H z, H- 1 " ) . 4. 52 (2 H, m) , 4. 98 (2H, b r) ， 5. 30 (1 H, b r) , 5. 53 ( 1 H, d， J = 2. 4 H z, N— H) , 6. 45 ( 1 H, b r) ， 6. 79
(1 H, d d, J = 1. 8 H z, 8. 7Hz) , 6. 83 (1 H, d d, J = 1. 8H z, 8. 4Hz) , 7. 10 ( 1 H, d, J = 1. 8H z) , 7. 23 (1 H, d, J = 1. 8H z) , 8. 82 ( 1 H, d, J = 9. 0Hz) , 8. 91 (1 H, d, J = 9. OH z)
実施例 5
式 [1 1]
Figure imgf000024_0001
「式中、 R6はな一 D—キシロビラノシルー^— D—リボフラノシル基を意 味する 1 の化合物の製造'法 (1) 2， 10—ジベンジルォキシー 12— [5—0— （2, 3, 4—トリ —0—べンジルー α— D—キシロビラノンル） 一2, 3— 0—イソプロピリ デンー — D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピロ 口 [3, 4 - c] 力ルバゾール -5, 7—ジオンの製造
水酸化力リゥム 6 Omg及び硫酸ナトリウム 20 Omgをァセトニ卜リ ル 2. 3mlに懸濁させ、 2, 10—ジベンジルォキシー 6—メチルインド 口 [2, 3 - a] ピロ口 [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジオン 46mgを加え室温にて 15分攪拌した。 5— 0— （2, 3， 4一トリー 0—ベンジルー α— D—キシロビラノシル） 一 2， 3— 0—イソプロピリデ ンー D—リボフラノース 247mgからHMPT [へキサメチルホスホラ ストリアミ ド] 及び四塩化炭素によりクロル化されたクロ口糖をァセ卜ニト リル 2mlに溶解して滴下した。 室温にて 2時間攪拌した後、 反応液を鲊酸 ェチルで希釈し、 1 N塩酸、 4%炭酸水素ナトリウム水溶液、 次いで飽和食 塩水で順次洗浄した。 硫酸マグネシウム上で乾燥後減圧濃縮した。 残渣をシ リカゲルクロマトグラフィー （トルエンー砟酸ェチル = 15 ： 1) を用いて 精製し粗固体 2, 10—ジベンジルォキシ - 12— [5-0- (2, 3, 4 一トリ一 0—ベンジル一 α— D—キンロビラノシル） 一 2, 3—0—イソプ 口ピリデン一 S— D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2, 3— a] ピロ口 [3, 4 - c] カルバゾールー 5, 7—ジオン 84mgを得た n
R f値： 0. 44 (へキサン：酢酸ェチル = 2 : 1)
1 H-NMR (30 OMH z, CDC 1 3) p pm 1. 19 (3 H, s) 1. 62 (3 H. s) , 3. 30 (3 H, s, N— Me) ， 3. 42 - 3. 52 (3 H, m) . 4. 03-4. 1 7
(2 H, m) , 4. 42 -4. 86 ( 1 0 H, m) , 5. 1 7 (2 H, m) , 5. 23 (2 H, s) ， 6. 33 ( 1 H, d,
J = 3. 3 H z) , 7. 04— 7. 54 (19 H, m) , 9. 06 ( 1 H, d, J = 8. 7Hz) , 9. 17 (1 H, d, J = 8.
7Hz) , 9. 80 (1 H, S， N-H) (2) 2， 10—ジヒ ドロキシー 12— [5-0- (a— D—キシロビラノ シル） 一 — D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピ ロロ [3, 4 - c] 力ルバゾール—5, 7—ジオンの製造
粗固体 2, 10—ジベンジルォキシー 12— [5-0- (2, 3， 4ー ト リー 0—ベンジルー α— D—キンロビラノシル） 一 2， 3-0—イソプロピ リデン一 一 D—リボフラノシル] 一 6-メチルインドロ [2, 3 - a] ピ ロロ [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジオン 81 mgを無水 THF 3 ml に溶解し、 10%塩酸メタノール 1. 5 ml を加え室温 1. 5時間攪拌した。 反応液を酢酸ェチルで希釈し、 4%重曹水ついで食塩水で 洗浄した。 乾燥後減圧濃縮し、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキ サン一 THF=3 ： 2) で精製した。 得られた固体をメタノール 2 ml に溶解し、 10%パラジウム炭素 2 Omgを加え、 水素雰囲気化 3日間攢 拌した。 触媒を慮過した後'慮液を濃縮し、 残渣をセフアデックス LH— 20
(クロ口ホルム一メタノール一エタノール一水 = 5 : 2 : 2 : 1) で精製 し、 2, 10—ジヒ ドロキシー 12— [5-0- (な一 D-キンロビラノシ ル） - 一 D—リボフラノシル] —6-メチルインドロ [2, 3— a] ピロ 口 [3. 4 - c] カルバゾールー 5， 7—ジオン 27mgを得た。
Rf値： 0. 57 (クロ口ホルム一メタノール一エタノール一水 = 5 ： 2 ： 2 : 1)
1 H-NMR (300MH z, DMS 0- d 6) ： p p m 3. 1 4 (3H， s, N— Me) , 3. 30-3. 52 (5H, m, H—
3" , 4" , 5" ) , 3. 83 ( 1 H, m， Η—5' a) ,
4. 03 ( 1 H, m, H— 5' b ) , 4. 1 9 ( 1 H, m.
H— 3' ) , 4. 30 (2H, m, H— 2' , 4' ) , 4. 82 ( 1 H, d, J = 3. OH z, H - 1 " ) , 4. 87 ( 1 H, m) , 4. 97 (1 H, d, J = 4. 8Hz) , 5. 29 (2H, m) , 5. 73 (1 H, b r) , 6. 47 ( 1 H, d, J =
6. 0H z, H— Γ ) , 6. 79 ( 1 H， d d, J = 1. 8Hz, 8. 4Hz) , 6. 83 (1 H, d d， J = 1. 8Hz, 8. 4H z) ， 7. 06 ( 1 H, d, J = 1. 8 H z) , 7. 37 (1 H, d, J = 1. 8Hz) , 8. 83 (1 H, d, J = 8. 4 H z) , 8. 93 ( 1 H. d, J = 8. 4 H z ) , 1 1. 56 (1 H, S, N— H)
(3) 2， 10—ジヒドロキシー 12— [5-0- (な一 D—キシロビラノ シル） 一 /S - D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [ 2 , 3— a ] ピ ロロ [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジオン 25mgを 2 N水酸化力 リゥム水溶液 0. 8m lに溶解し、 室温にて 40分攪拌した。 反応液に 2 N塩酸 1. 6mlを加えて p H = 2とした後、 水で希釈し HP— 20の力 ラムに通過させた。 樹脂を水で洗浄した後、 メタノールで溶出した。 赤色フ ラクシヨンを集めて濃縮した。 残渣をジメチルホルムアミ ド 1 mlに溶解 し、 2—ヒドラジノー 1 , 3—プロパンジオール 60 mgの DMF (0.5ml)溶 液を加え室温終夜攒拌した。 反応液を濃縮後セフアデックス LH— 20 (クロ口 ホルム一メタノール一エタノール一水 =5 :2 :2： 1) により精製し、表題の化 合物 14 ragを得た。
Rf値：0.35 (クロ口ホルム一メタノール一エタノール一水 =5 :2 :2： 1)
FABMS (m/z)： [M+H] +=711
1 H-NMR (30 OMH Z , DMS Ο— d 6) ： ρ pm 3. 8 1 ( 1 H, m, H-5 a) , 4. 02 ( 1 Η, m， Η— 5 b) . 4. 17 ( 1 H, m) , 4. 26 (2H, m) , 4. 53 (2 H, m) , 4. 8 1 ( 1 Η, d, J = 3. 4 H z , H— 1 " ) , 4. 88 (1 Η, m)， 4 - 97 (1 H, m) , 5. 28 (2H, m) , 5. 54 (1 Η, d, 3 = 2. 7 H z, N-H) , 6.
47 (1 H, d, J = 6. 3Hz, H- Γ ) , 6. 80 (1 H. dd, J = 2. 4Hz， 9. 0Hz) , 6. 83 (1 H, d d, J = 2. 4Hz, 9. 0Hz) , 7. 06 (1 H, d, J = 1.
8H z) , 7. 38 (1 H, d, 5 = 2. 1 H z ) , 8. 82
(1 H, d, J = 9. 3Hz) ， 8. 93 ( 1 H, d, J = 8.
7Hz) , 9. 92 (2H, b r) , 1 1. 59 (1 H, S) 実施例 6
式 [12]
Figure imgf000028_0001
[式中、 R7は α— D—グルコビラノシルー α— D—リボフラノシル基を意 味する 1 の化合物の製造法
(1) 2, 10—ジベンジルォキシ— 12— [5—0— (2, 3, 4, 6— テトラー 0—べンジルー α— D—ダルコピラノシル） -2, 3— 0—イソプ 口ピリデン一 α— D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2， 3— a] ピロ口 [3， 4— c] —カルバゾ一ルー 5, 7—ジオンの製造
水酸化力リウム 105 mg及び硫酸マグネシウム 40 Omgをァセトニト リル 8mlに懸濁させ、 2, 10—ジベンジルォキシー 6—メチルインドロ
[2, 3 - a] ピロ口 [3, 4 - c ] 力ルバゾール一 5， 7—ジオン
1 29mgを加え室温にて 1時間攪拌した後 1一クロロー 5— 0— （2, 3, 4, 6—テトラー 0—べンジルー α— D—ダルコピラノシル） 一 2, 3— 0—イソプロピリデンー cr一 D—リボフラノース 50 Omgのァセト 二トリル溶液 6 m 1を滴下した。 室温にて 4時間攪拌した後、 反応液を 1 N 塩酸 5 Om 1に注ぎ込み酢酸ェチル 20 Omlで抽出した。 有機層を水、 飽 和炭酸水素ナトリウム水溶液、 水、 次いで飽和食塩水で洗浄後、 乾燥濃縮し た。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー （トルエン一酢酸ェチル = 10 ：
1) を用いて精製し粗バルク 2. 10—ジベンジルォキシー 12— [5-0 一 （2, 3， 4, 6—テトラー 0—べンジルーな一 D—ダルコピラノシル） 一 2. 3— O—イソプロピリデン一な一 D—リボフラノシル] 一 6—メチル インドロ [2, 3 - a] ピロ口 [3， 4— c] 一力ルバゾールー 5, 7—ジ オン 24 Omgを得た。
Rf値： 0.65 (へキサン ：酢酸ェチル = 2： 1)
1 H-NMR (300MHz, CDC 13) ： ppm 9. 70 (1 H, s ) , 9. 1 6 ( 1 H, d, J = 8. 4 H z ) , 9. 05 (1 H, d， J = 8. 4 H z) , 6. 97 -7. 50 (35 H, m) , 6. 30 (1H， d， J = 3. 6Hz) , 5. 22 (2H， s ) , 5. 1 5 (2 H. d, J = 2. 7 H z ) , 44.. 9 1
( 1 H， d, J = 3. 9 H z ) , 4. 79 (1 H, d, 1 1. 1 H 2 ) 4. 5 1 -4. 7 1 ( 7 H, m) , 4. 36
( 1 H, m, J = 1 1. 1 H z) , 4. 26 (1 H, d. J = 12. 0Hz) ,, 3. 99— 4. 12 (4 H, m) , 3. 53 3. 60 (3H, m) , 3. 45 (1 H, d d, J = 1 1. 1 , 3.
9Hz) , 3. 30 (3 H, s) , 1. 60 (3H, s) , 1. 21 (3H, s)
(2) 2, 10—ジヒ ドロキシ一 12— [5-0- (α— D—グルコピラノ シル） - a— D—リボフラノシル] —6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピ ロロ [3, 4— c] —力ルバゾール—5， 7—ジオンの製造
2, 10—ジベンジルォキシ - 12— [5— 0— (2, 3, 4, 6—テト ラ—0—べンジルー α— D—グルコピラノシル） 一2, 3— 0—イソプロピ リデン一 α— D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2， 3 - a] ピ ロロ [3， 4一 c] 一力ルバゾール—5, 7—ジオン 5 Omgをクロ口ホル ムーメタノール （2 : 1) 5mlに溶解し、 パラジウムブラックを触媒量加 え、 水素雰囲気化 1時間攪拌した。 触媒を濂過した後濾液を濃縮し、 残渣を テトラヒドロフラン一 10%塩酸一メタノール （10 : 3) 1 Omlに溶解 して室温にて 2時間攢拌した。 反応液に塩基性炭酸鉛 5 gを加え中和した 後、 セライ ト濾過した濾液を濃縮した。 残渣をセフアデックス LH— 20 (メタノール） で精製し 2， 1 0—ジヒ ドロキン一 1 2— [5 -0- (a- D一ダルコピラノシル） 一な一 D—リボフラノシル] — 6—メチルインドロ
[2, 3 - a] ピロ口 [3, 4 - c] —力ルバゾールー 5. 7 -ジオン 1 2mgを得た。 （39%)
R f 値： 0. 3 1 (クロ口ホルム一メタノールーテトラヒ ドロフラン =3： 1 ： 1)
1 H-NMR (30 OMH z, DMS 0-d 6) ： p p m 1 1. 57 ( 1 H. s) , 9. 82 ( 1 H, s) , 9. 7 8 ( 1 H, s) .
8. 9 3 ( 1 H, d， J = 8. 4 H z) , 8. 8 3 ( 1 H, d, J = 8. 4 H z ) , 7. 4 0 ( 1 H, s ) , 7. 0 6 ( 1 H, s) , 6. 8 1 (1 H, d, J = 8. 4H z) , 6. 80 ( 1 H, d, J = 8. 4 H z ) , 6. 4 7 ( 1 H, d, J = 5. 9H z) ， 5. 86 ( 1 H, m) , 5. 26 (2 H， d， J = 6. 2H z) , 4. 95 ( 1 H, d， J = 5. 5H z) , 4. 85 (2 H, t, J = 4. 8H z) , 4. 58 ( 1 H， t, J = 4. 8 H z ) , 4. 2 5 - 4. 3 4 (2 H, m) , 4. 1 8 ( 1 H, m) , 4. 0 5 ( 1 H, d d, J = 1 1. 1 , 4. 8 H z) , 3. 8 0 ( 1 H, d, J = 1 1. 1 H z ) , 3. 3 5 - 3. 7 0 (6H, m) , 3. 1 3 (3H, s)
(3) 2, 1 0—ジヒ ドロキシー 1 2— [5 -0- (α— D—ダルコピラノ シル） 一α— D—リボフラノシル] — 6—メチルインドロ [2, 3— a] フ ラノ [3, 4 - c] 力ルバゾール— 5, 7—ジオンの製造
2, 1 0—ジヒ ドロキシ— 1 2— [5—0— (α— D-ダルコビラノシ ノレ） 一 cr一 D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピロ 口 [3, 4— c] —カルバゾールー 5. 7—ジオン 2 Omgを 1 0%水酸化 カリウム水溶液 lm lに溶解し、 室温にて 1時間攪拌した。 反応液に 2 N塩 酸 1 · 5m lを加えて中和した後、 メチルェチルケトン 5 0 m 1で抽出し た。 有機層を飽和食塩水で洗浄後、 乾燥、 澳縮することにより粗バルク 2， 10—ジヒ ドロキシ一 12— [5-0- (な一 D—ダルコピラノシル） 一 α —D—リボフラノシル] —6—メチルインドロ [2， 3— a] フラノ [3, 4— c] カルバゾールー 5， 7—ジオン 2 Omgを得た。
Rf値： 0. 25 (クロ口ホルム： メタノール： テトラヒ ドロフラン =3 ： 1 ： 1)
(4) 2, 10—ジヒ ドロキシ一 12— [5-0- (α— D-グルコピラノ シル） 一 α— D—リボフラノシル] 一 6—メチルインドロ [2, 3— a] フ ラノ [3， 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジオン 2 Omgをジメチルホル ムア ミ ド 2m lに溶解し 2—ヒ ドラジノー 1， 3—プロパンジオール 2 Omgを加え室温にて 3時間攪拌した。 反応液を濃縮後残渣をセフアデッ クス LH20 (メタノール） により精製し表題の化合物 14mgを得た。
(68%) R f値： 0. 25
(トルエン ： ァセトニトリル： テトラヒ ドロフラン ：水：酢酸 = 2 : 4 : 2 : 0. 5 : 0. 1)
FABMS (m/z) ： [M + H] +=741
1 H-NMR (30 OMH z, DMS 0-d 6) ： p pm 1 1. 25 (1 H. s) . 10. 03 (1 H， s) , 9. 82 ( 1 H, s) , 8. 89 (1 H, d, J = 8. 7Hz) ， 8. 81 (1 H, d,
J = 8. 4 H z ) , 7. 42 ( 1 H, d, J = 1. 8 H z ) , 7. 05 ( 1 H, d, J = 1. 8 H z) 6. 78 ( 1 H, t， J = 8. 4Hz) , 6 77 (2H, d, J = 8. 7Hz) , 6. 50 ( 1 H, m) , 5. 53 ( 1 H, d， J = 2. 7H z) , 5. 25 (2 H, d, J = 6. 2 H z) , 4. 85 ( 1 H, d, J = 3. 6H z) , 4 52 (2H, t, J = 4. 5Hz) , 4.
34 ( 1 H, J = 6. 6Hz) , 4. 26 (1 H, d, J = 4. 5 H z ) , 4. 1 8 ( 1 H, d d, J = 3. 6 , 6. 6Hz) , 4. 05 (2 H, dd， J = 8. 4, 10. 8Hz) ,
3. 80 ( 1 H, d， J = 8. 4 H z) , 3. 56-3. 70 (3H, m) , 3. 30-3. 51 (10H， m)
2, 10—ジベンジルォキシー 6—メチルインドロ [2. 3— a] ピロ口
[3, 4一 c] カルバゾールー 5, 7—ジオン及び 1一クロロー 5—0— (2, 3, 4, 6—テトラー 0—べンジルー3— D—ダルコビラノシル） 一 2, 3— 0—ィソプロピリデンー ー D—リボフラノースを用い実施例 6 に記載の方法と同様の方法により実施例 7の化合物を製造した。 実施例 7
式 [13]
Figure imgf000032_0001
[式中、 R 1Pは 一 D—グルコビラノシルー；8— D—リボフラノシル基を意 味する 1 の化合物
Rf値：
(トルエン：ァセトニ ：テトラヒドロフラン：水：酢酸 =2 :4 2： 0.5： 0.1)
FABMS (mZz)： [M+H] += 741
1 H-NMR (30 OMH Z , DMS O-d 6) ： p pm 1 1. 32 (1 H， s) , 9. 81 (1 H, s)， 9. 73 (1 H, s) , 8. 92 (1 H, d, J = 9. 0 H z) , 8. 82 ( 1 H, d, J = 8. 7 H z ) , 7. 23 ( 1 H, d, J = 1. 8 H z ) , 7. 2 1 ( 1 H, d, = J = 1. 8 H z ) , 6. 86 ( 1 H, d d, J = 1. 8， 9. 0Hz) , 6. 80 (1H, d d, J = 1. 8, 8. 7Hz) , 6. 40 (1 H, m) , 5. 54 ( 1 H, d, 3 = 2. 4 H z ) , 5. 2 6 ( 1 H, d, J = 5. 7 H z ) , 5. 1 7 ( 1 H, d, J = 4. 8 H z ) , 5. 1 2 ( 1 H, d, J = 6. 0Hz) , 4. 75 ( 1 H, t, J = 6. 0H z) , 4. 5 1 ( 1 H， m) ， 4. 35 -4. 40 ( 1 H， m) , 4. 27 (2H， m) ， 3. 90-4. 00 ( 1 H, m) ，
3. 70-3. 80 (1 H, m) 3. 50 (1 H, m) 3. 25 (1 H, m)
実施例 8
式 [12]
Figure imgf000033_0001
[式中、 R11は ー D—ラクトビラノシル基を意味する 1 の化合物
( 1 ) 1 , 1 1—ジベンジルォキシー 12— （2, 3, 6, 2' , 3' , 4' , 6' —へプタ一 0—ビバロイルー S— D—ラク トピラノシル） 一6— メチルインドロ [2, 3— a] ピロ口 [3, 4 - c] カルバゾールー 5, 7 ージオンの製造
1, 1 1ージベンジルォキシー 6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピロ口
[3, 4— c ] カルバゾールー 5 , 7—ジオン 1 0 0 m g、 酸化銀 84 Omg及びモレキュラーシーブ 2 O Omgをトルエン 8mlに懸濁さ せ、 0. 5時間加熱還流した後 1一クロロー 2， 3, 6, 2' , 3' , 4' , 6' —ヘプター 0—ビバロイルー D—ラクトビラノシド 1. 25 g のトルエン溶液 2 mlを滴下した。 2時間攢拌した後、 反応液をセライ ト濂 過した後濂液を濃縮した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィ （へキサン一 酢酸ェチル = 1 0 : 1) を用いて精製し 1, 1 1ージベンジルォキシ— 1 2 一 (2, 3, 6, 2' , 3' , 4' , 6' 一ヘプター 0—ビバロイルー/ S— D—ラク トピラノシル） 一6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピロ口 [3, 4 - c] カルバゾールー 5， 7—ジオン 45 mgを得た。
Rf値： 0.70 (へキサン一酢酸ェチル = 2： 1) (2) 1， 1 1ージヒドロキシー 12— （2, 3, 6， 2' . 3' ， 4* ,
6' —ヘプター 0—ビバロイルー ー D—ラクトピラノシル） 一6—メチル インドロ [2. 3— a] ピロ口 [3. 4— c] カルバゾールー 5. 7—ジォ ンの製造
1， 1 1一ジベンジルォキシ一 12— (2, 3, 6, 2' , 3' , 4' , 6' —ヘプター 0—ビバロイル一 3— D—ラクトビラノシル） 一 6—メチル インドロ [2, 3— a] ピロ口 [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジォ ン 45mgを THF5mlに溶解し、 パラジウムブラックを触媒量加え、 水 素雰囲気化 3日間攪拌した。 触媒を濂過した後濾液を澳縮し 1 , 1 1 -ジヒ ドロキシー 1 2— （2, 3， 6, 2' , 3' , 4' , 6' —ヘプタ一 0-ピ ノくロイルー^ー D—ラク トピラノシル） 一 6—メチルインドロ [2, 3— a] ピロ口 [3, 4 - c ] カルバゾールー 5， 7—ジオンの粗バルク 2 Omgを得た。
R f値： 0. 50 (へキサンー酢酸ェチル = 1 : 1)
(3) 1, 1 1—ジヒドロキシ一 12— ( 一 D—ラクトピラノシル） 一 6 一メチルインドロ [2, 3— a] フラノ [3, 4— c] 力ルバゾール— 5， 7 -ジオンの製造
化合物 1， 1 1—ジヒ ドロキシー 1 2— （2, 3, 6, 2' , 3' , 4' , 6' —ヘプター 0—ビバロイル一 /3— D—ラクトピラノシル） 一 6— メチルインドロ [2, 3— a] ピロ口 [3, 4 - c] カルバゾールー 5, 7 ージオン 2 Omgをメタノール 5mlに溶解し 10%水酸化カリウム水溶液 5mlを加え、 室温にて終夜攪拌した。 反応液に 2 N塩酸 5 m 1を加えて中 和した後、 酔酸ェチル 30 Omlで抽出した。 有機層を水ついで飽和食塩水 で洗浄後、 乾燥濃縮した. 残渣をセフアデックス LH— 20を用いて展開し メタノールで溶出し 1, 1 1—ジヒドロキシ一 12— — D—ラクトビラ ノンル） 一 6—メチルインドロ [2, 3 - a] フラノ [3, 4 - c] 力ルバ ゾールー 5, 7—ジオン 7. Omg得た。
R f ： 0. 39 (クロ口ホルム一メタノール一テトラヒドロフラン =2 ： 1 ： 1)
4) 1, 1 1ージヒドロキシ一 12— （S— D—ラク トピラノシル） 一 6— メチルインドロ [2, 3— a] フラノ [3, 4 - c] カルバゾールー 5, 7 ージオン 7. Omgをジメチルホルムァミ ド 2 m 1に溶解し 2—ヒ ドラジ ノ一 1, 3—プロパンジオール 4. 3mgを加え 80°Cにて 1. 5時間攪拌 した。 反応液を濃縮後残渣をセフアデックス LH— 20を用いて展開しメタ ノールで溶出し表題の化合物 1. 3mgを得た。 FABMS (m/z)： [M+H] + = 771
1 H-NMR (30 OMH z, DMS 0-d 6) ： p pm 10. 84
(1 H, s) , 10. 40 (1H, b r s) ， 10. 03 (1 H, b r s) , 8. 74 (1 H, d， J = 13. 2Hz) , 8. 58
( 1 H, d, J = 13. 2 H z) , 7. 1 9 (2 H, t , J = 7. 8 Hz) , 7. 10 ( 1 H, d, J = 8. 8Hz) , 7. 01
(2 H, d d, J = 7. 8, 13. 2Hz) , 5. 58 ( 1 H, d, J = 2. 4 H z) , 5. 45 ( 1 H, b r s) , 5. 27
( 1 H, d, J = 4. 4Hz) , 5. 09 (1 H, d, J = 5.
4 H z ) , 4. 97 ( 1 H, d, J = 2. OH z) , 4. 86 ( 1 H, d, J = 5. 4 H z ) , 4. 64 (2 H, m) , 4. 56 (2H, t, J = 5. 9Hz) , 4. 31 ( 1 H, d, J = 7. 8Hz) , 4. 14 (3H, m) , 3. 85-3. 92 (2 H, m) , 3. 08— 3. 70 (12H、 m)
2, 10—ジベンジルォキシー 6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピロ口
[3, 4一 c] 力ルバゾール— 5, 7—ジオン及び 1一クロロー 2， 3, 6, 2' , 3' , 4' , 6' 一ヘプター 0—ビバロイルー D—ラク トピラノ シドを用 t、実施例 8に記載の方法と同様の方法により実施例 9の化合物を製 造した。 実施例 9
式 [13]
Figure imgf000036_0001
[式中、 R"は /3— D—ラクトビラノシル基を意味する 1 の化合物
Rf値： 0.02 (トルエンーァセトニトリル一 THF—水一酢酸 =2 :4:2 :0. 5 : 0.1)
FABMS (m/z)： [M+H] + = 771
1 H-NMR (300MH z. DMSO-d 6) ： p pm 1 1. 20 (1 H, s) , 9. 77 (2H, b r) , 8. 87 ( 1 H, d, J = 8. 6 H z ) , 8. 79 ( 1 H, d, J = 8. 5 H z ) , 7. 21 ( 1 H, d. J = 2. 0 H z) , 7. 03 ( 1 H, d， 3 = 2. 0Hz) , 6. 82 (2H, m) , 6. 09 ( 1 H, d, J = 9. OH z) ， 5. 98 ( 1 H， t , J = 4. 3 H z ) , 5. 54 ( 1 H, d， 3 = 2. 4 H z) 5. 25 ( 1 H, d, J = 4. 2H z) , 5 1 1 ( 1 H, d, J = 5. 7Hz) , 4. 88 ( 1 H, s ) , 4. 86 ( 1 H. d, J = 6. 6 H z ) , 4. 60 (2 H, t, J = 4. 2 H z) 4. 55 (2 H, t， J = 5. 1 H z) , 4 44 (1 H, d, J = 6. 9H z) , 4. 27 ( 1 H, d d, J = 4. 3, 8. 1 Hz) , 4. 15 ( 1 H, m) , 3. 97-4. 08 (2 H, m) , 3 65-3. 80 (4H, m) , 3. 15-3. 58 (9H, m)
実施例 10
式 [14]
Figure imgf000037_0001
「式中、 R8は/ g— D—マルトビラノシル基を意味する 1の化合物
( 1 ) 1 , 1 1—ジベンジルォキシー 12— （2, 3, 6, 2' ， 3' , 4' , 6' 一ヘプター 0—べンジルー /3— D—マルトピラノシル） 一 6—メ チルインドロ [2, 3 - a] ピロ口 [3, 4 - c] カルバゾールー 5, 7 - ジオンの製造
水酸化カリウム 1. 4 g及び硫酸マグネシウム 5. 0 gをァセトニトリル 100m 1に懸濁させ、 化合物 1， 1 1ージベンジルォキシ— 6—メチル インドロ [2, 3— a] ピロ口 [3, 4 - c] 力ルバゾール—5, 7—ジォ ン 1. 7 gを加え室温にて 1時間攪拌した後 1一クロロー （2， 3, 6, 2' , 3* , 4' , 6' 一ヘプター 0—べンジルー 3— D—マルトビラノー ス 4. 5 gのァセトニトリル溶液 70mlを滴下した。 室温にて一晚攢拌 した後、 反応液を 1 N塩酸 300mlに注ぎ込み 酸ェチル 600m 1で抽 出した。 有機層を水、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、 水、 次いで飽和食塩 水で洗浄後、 乾燥濃縮した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー （トルェ ンー^酸ェチル =30 ： 1) を用いて精製し粗バルク 1， 1 1ージベンジノレ ォキシ一 12— (2, 3, 6, 2' , 3' , 4* , 6' —ヘプター 0—ベン ジル一 3— D—マルトピラノシル） 一6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピ ロロ [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジオン 2. 1 gを得た。
Rf値： 0、 31 (へキサン ：酢酸ェチル =4： 1)
(2) 1, 1 1 -ジヒ ドロキシー 12—） S— D—マルトビラノシル一 6—メ チルインドロ [2, 3 - a] ピロ口 [3, 4 - c] カルバゾールー 5, 7 - ジオンの製造
1 , 1 1ージベンジルォキン一 12— (2, 3， 6, 2' , 3" , 4' , 6' —ヘプ夕— 0—べンジル一 一 D—マルトピラノシル） 一 6—メチルイ ンドロ [2, 3 - a] ピロ口 [3， 4一 c] カルバゾールー 5， 7—ジオン 2. 1 gをクロ口ホルム一メタノールーテトラヒ ドロフラン （2 ： 1 ： 1)
200mlに溶解し、 パラジウムブラックを触媒量加え、 水素雰囲気化 4時 間攪拌した。 触媒を'遽過した後濾液を濃縮し、 残渣をセフアデックス LH— 20 (メタノール） で精製し 1， 1 1ージヒ ドロキシー 12— ー D—マル トピラノシル一 6—メチルインドロ [2， 3— a] ピロ口 [3， 4— c] 力 ルバゾ一ルー 5. 7—ジオン 936mgを得た。 （44%)
1¾ £値： 0， 45 (クロ口ホルム一メタノールーテトラヒ ドロフラン =2 ： 1 ： 1) 1 H-NMR (30 OMH z , DMS O-d 6) ： p p m 1 0. 8 1 (1 H, s) ， 10. 36 (1 H， s) , 9. 95 ( 1 H, s) , 8. 71 (1H, d, J = 8. 4Hz) , 8. 53 (1 H, d, J = 8. 4Hz) ， 7. 18 (2 H, t, J = 8. 1 H z) , 7. 10 ( 1 H, d, J = 8. 4Hz) ， 7. 03 (1 H, d, J = 8. l Hz) ， 6. 99 (1 H, d, J = 8. 4Hz) , 5. 73 (1 H, s) , 5. 61 ( 1 H, d, J = 6. 0Hz) , 5. 33 ( 1 H, t. J = 4. 8Hz) , 5. 14 ( 1 H, d, J = 3. 6 H z) , 5. 05 ( 1 H, d, J = 4. 8 H z ) , 4. 97
(2H, t, J = 5. 1 Hz) , 4. 54 (1 H, t， J = 3. 6Hz) , 4. 1 5 (2 H, m) , 3. 90 (2 H, m) , 3. 7 1 (4 H， m) , 3. 60 (1 H, m) , 3. 42 (3H, m) , 3. 15 (3 H, s)
(3) 1, 1 1ージヒドロキシー 12—/3-D—マルトビラノシル一 6—メ チルインドロ [2, 3— a] フラノ [3， 4一 c] カルバゾールー 5, 7— ジオンの製造
1, 1 1ージヒドロキシ一 12— 一 D—マルトビラノンルー 6—メチル インドロ [2, 3 - a] ピロ口 [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジォ ン 936mgを 10%水酸化カリウム水溶液 3 Omlに溶解し、 室温にて 1 時間攪拌した。 反応液に 2 N塩酸 30 m 1を加えて中和した後、 メチルェチ ルケトン 800 m 1で抽出した。 有機層を飽和食塩水で洗浄後、 乾燥、 '濃縮 し、 残渣をセフアデックス LH— 20 (メタノール） で精製し 1, 1 1ージヒ ドロキシー 12— ^一 D—マルトビラノシル一 6—メチルインドロ [2, 3 - a] フラノ [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジオン 780mgを得た。
(85%)
Rf値： 0，47 (クロ口ホルム：メタノール：テトラヒドロフラン =2： 1： 1)
1 H-NMR (30 OMH z , DMS O-d 6) ： p p m 1 1. 03 (1 H， s) ， 10. 53 ( 1 H, s) , 10. 14 ( 1 H， s) , 8. 5 1 ( 1 H, d, J = 8. 1 H z) , 8. 36 ( 1 H， d， J = 7. 8Hz) , 7. 26 (2H, t, J = 7. 8Hz) , 7. 14 (1 H. d, J = 8. 7 H z ) , 7. 09 ( 1 H, d, J = 8. 1 H z) , 7. 05
(1 H， d, J = 8. 1 Hz) , 5. 76 (1 H, s) . 5. 61 ( 1 H, d, J = 5. 7Hz) , 5. 32 (1 H, t, J = 4. 8Hz) , 5. 14 (1 H, d, J = 3. 9Hz) ， 5. 10 ( 1 H, d, J = 4. 5Hz) , 4. 98 (2 H, t, J = 5. 7Hz) , 4. 54 ( 1 H, t , J = 3. 6 H z ) , 4. 09 (3 H, q, J = 4. 5H z) ， 3. 95 (2H， m) , 3. 72 (3H， m) , 3. 60 ( 1 H, m) , 3. 30-3. 41 (3H, m)
(4) 1, 1 1ージヒ ドロキン一 12— ;3— D—マルトビラノシル一6—メ チルインドロ [2, 3 - a] フラノ [3, 4— c] 力ルバゾール -5, 7 - ジオン 1 Omgを DMF 1mlに溶解し 2—ヒドラジノー 1, 3—プロパ ンジオール 1 Omgを加え室温にて 3時間援拌した。 反応液を濃縮後残渣を セフアデックス LH20 (メタノール） により精製し表題の化合物 8. Omgを得た。 （76%)
R f値： 0. 30
(トルエン ： ァセトニトリル： テトラヒ ドロフラン：水：酢酸 =
2 : 4 : 2 : 0. 5 : 0. 1 )
FABMS (m/z)： [M+H1 += 771
1 H-NMR (50 OMH z, DMS 0-d 6) ： p p m 10. 83 ( 1 H, s) , 9. 80- 10. 10 (2 H, b r) , 8. 70
(1 H, d, J = 8. OHz) , 8. 53 (1 H, d, J = 8. 0 H z ) , 7. 1 9 (1 H, t J = 7. 5H z) , 7. 1 8
(1 H, t, J = 7. 5H z) , 7. 08 (1 H, d, J = 8. 9 H z ) , 7. 04 ( 1 H, d, J = 7. 5 H z) , ' 7. 00
( 1 H, d, J =7. 5H z) , 5. 73 ( 1 H, s) , 5. 61 (1 H, d, J = 6. 4Hz) , 5. 58 (1 H, d, J =
2. 7Hz) , 5. 14 (1 H, d, J = 3. 4H z) , 5 03 ( 1 H, m)， 4. 96 (3 H, q, J = 4. 8H z) , 4. 54 (4 H, t, J = 4. OHz) , 4. 05-4. 07 (3 H, m) , 3. 90-3. 94 (3 H, m)， 3. 70 (4 H, t, J = 4. 8H z) , 3. 45-3. 6 1 (5 H, m) , 3. 1 8 (1 H, m) 2, 10—ジベンジルォキシー 6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピロ口 [3, 4一 c] 力ルバゾール— 5, 7—ジオン及び 1一クロロー 2, 3, 6, 2' , 3' , 4' ， 6' —ヘプター 0—べンジル— 5— D—マルトビラ ノースを用 t、実施例 10に記載の方法と同様の方法により実施例 11の化合物 を製造した。 実施例 11
式 [15]
Figure imgf000041_0001
[式中、 R8は /3— D—マルトビラノシル基を意味する] の化合物
Rf値： 0.25
(トルエン：ァセトニトリル：テトラヒ ドロフラン：水：酢酸 = 2： 4 2： 0.5： 0.1)
FABMS (m/z)： [M+H] +=771
1 H-NMR (300MH ζ , DMS O-d 6) ： p pm 1 1. 17 (1 H, s) , 9. 78 (2H, b r) , 8. 87 ( 1 H, d, J = 8. 7 H z ) , 8. 79 ( 1 H, d, J = 8. 7 H z) , 7. 1 8 ( 1 H, d, J = 1. 2H z) , 7. 03 ( 1 H, d,
J = 1. 8H z) , 6. 83 ( 1 H, d d, J = 1. 2, 8. 7Hz) , 6. 80 ( 1 H, d d, J = 1. 8, 8. 7H z) , 6. 06 (1 H, d, J = 9. 0 H z) , 5. 9 1 ( 1 H, t, J = 3. 6Hz) , 5. 72 (1 H, d, 5 = 2. 7Hz) , 5. 70 ( 1 H, d, J = 6. 3Hz) , 5. 50 ( 1 H, d, J = 2. 7Hz) , 5. 21 (1 H, d, J = 3. 3Hz) , 5. 05 ( 1 H, d， J = 5. 4 H z) , 4. 97 (2 H, d d, J =
5. 4, 7. 2Hz) , 4. 59 ( 1 H, t, J = 5. 1 Hz) , 4. 53 (2 H, t , J = 5. 4H z) ， 4. 1 9 ( 1 H, d d, J = 2. 1 , 9. 9 H z ) , 4. 05-4. 1 1 (3 H, m) ， 3. 70 - 3. 87 ( 3 H, m) , 3. 2 - 3. 65 (1 OH, m)
1， 1 1ージベンジルォキシー 6—メチルインドロ [2, 3 - a] ピロ口 [3, 4— c] カルバゾールー 5, 7—ジオン及び 1—クロロー 2, 3,
6, 2' , 3' , 4' , 6* 一ヘプター 0—べンジル一 3— D—セロビオビ ラノースを用い実施例 10に記載の方法と同様の方法により実施例 12の化合 物を製造した。 実施例 12
式 [16]
Figure imgf000042_0001
[式中、 R 9は ー D—セロビォピラノシル基を意味する] の化合物 Rf値： 0.05
(トルエン：ァセトニトリル：テトラヒ ドロフラン：水：酢酸 = 2： 4 2： 0.5： 0.1)
FABMS (m/z)： [M+H] +=771 1 H-NMR (50 OMH z , DMS O-d 6) ： p pm 10. 82 ( 1 H, s) , 1 0. 37 (1 H, b r ) , 9. 96 ( 1 H, b r) , 8. 70 ( 1 H, d, J = 7. 9 H z ) , 8. 54 ( 1 H, d， J = 8. 4 H z) , 7. 1 9 (2 H, d d， J = 8. 0, 8. 0Hz) , 7. 09 ( 1 H, d, J = 8. 8Hz) ，
7. 0 1 (2 H, d d, J = 7. 9, 7. 9 H z) , 5. 58 (1 H, d, J = 3. 3Hz) , 5. 39 (1 H， d, J = 4. 5Hz) , 5. 39 (1 H， b r) , 5. 08 (2H, t, J = 4. 2Hz) . 5. 03 ( 1 H, d, J = 5. 3 H z) , 4. 93 ( 1 H, d, J = 2. 4 H z ) , 4. 55 (2 H, d d, J =
4. 9, 4. 9Hz) , 4. 36 ( 1 H, d, J = 7. 5Hz) ,
4. 12 (2 H, b r) , 3. 89 (2H, b r) , 3. 67— 3. 7 1 (2 H, m) , 3. 39-3. 60 (6H. m) , 3. 18-3. 34 (3H, m) , 3. 05— 3. 15 (3 H, m) 参考例 1
式： H2NNHCH (CH2OH)2 (17)
で表される化合物の製造。
(1) ジヒドロキシァセトン二量体 10.0g、 カルバジン酸 tert_ブチルエステル 14.7gをエタノール 500mlに溶解し、室温で 15時間攪拌した。 反応液を減圧 濃縮し、残渣を酢酸ェチルより再結晶させ、 2- (tert-ブチルォキシカルボ二 ル） ヒドラゾノ -1.3-プロパンジオールを 18.67g無色固体として得た。 •H-NMR (300MHz, DMSO-d6) , δ (ρ pm) ： 1. 9 (9 Η. s) , 3. 92 (2Η， d. J = 5. 2Hz) , 4. 24 (2Η， d, J = 5. 0 Η ζ) , 4. 88 ( 1 Η, t , J = 5. 8 Η ζ ) , 5. 6 1 ( 1 Η, t , J = 5. 1 Η ζ) , 9. 98
(1 Η, b r s)
(2) 2- (tert-ブチルォキシカルボニル） ヒドラゾノ -1,3-プロパンジオール 5.00gを 0°C下、ボラン-テトラヒドロフラン錯体 50mlを加えた後、室温で 0.5 時間攪拌した。 反応液に 6規定塩酸 25mlを室温で加え、 1.5時間加熱還流し た。 反応液を減圧濃縮し、得られた残留物をダウエックス 50WX4の H+タイ プに吸着させ、水洗した後、 0.5規定アンモニア水で溶出した。 目的物を含む 画分を集めて减圧濃縮し、 得られる油状物を、 IRC-50の NH4 +タイプに吸 着させ水で溶出した。 目的物を含む画分を集めて減圧濃縮し、 2-ヒドラジノ - 1，3-プロパンジオール 2.26gを無色固体として得た。
FAB-MS (m/z)： 107 (M + H) +
Ή-NMR (200MHz,CD3OD).5 (ppm) :2.78 (lH.m), 3.50- 3.75 (4H,m) 参考例 2
式： NH2NHCH2CH (OH) CH2OH
で表される化合物の製造。
( 1 ) D L—グリセルアルデヒ ド二量体 6. 7 3 g、 カルバジン酸 t e r t一ブチルエステル 9. 87 gを 95 %エタノール 50mlに溶解 し、 室温で 15時間攪拌した後、 6 (TCで 30分援拌した。 反応液を減圧濃 縮し、 残渣を酢酸ェチルより再結晶させ、 （2 SR) - 3— （t e r t—ブ チルォキシカルボニル） ヒドラゾノー 1, 2—プロパンジオールを 13. 7 g無色固体として得た。
R f値： 0. 49 (メルク社製、 キーゼルゲル 60 F 254, 展開溶媒； ジ クロロメタン：メタノール = 10 ： 2)
Ή-NMR (300MHz, DMSO-d6) ， δ ( pm) : 1. 41 (9H, s) , 3. 39 (2H, m) , 3. 93 ( 1 H, m) ， 4. 65 (1 H, t, J = 5. 8Hz) , 5. 1 1 ( 1 H, d, J = 5. 0Hz) ,
7. 16 (1 H， d, J = 6. 0Hz) , 10. 52 ( 1 H, b r s) (2) (2 SR) — 3— (t e r t—ブチルォキシカルボニル） ヒドラゾノ - 1 , 2—プロパンジオール 12. 6 gに室温下、 ボランーテトラヒドロフ ラン錯体 52mlを加えた後、 室温で 10分攪拌した。 反応液に 6規定塩酸 26mlを室温で加え、 100 °Cで 15分攪拌した。 反応液を減圧濃縮し、 得られた残留物をダウエックス 5 OWx 4の H +タイプに吸着させ、 水洗し た後、 0. 5規定アンモニア水で溶出した。 目的物を含む画分を集めて減圧 '港縮し、 得られる油状物を、 I RC— 50の NH4+タイプに吸着させ、 水 で溶出した。 目的物を含む画分を集めて減圧濃縮し、 （2 S R) — 3 -ヒド ラジノー 1, 2—プロパンジオール 2. 2 gを無色固体として得た。 R f値： 0. 33 (メルク社製、 キーゼルゲル 60 F254, 展開溶媒； n —ブタノール：醉酸：水 =5 : 2 : 1)
F AB-MS (m/z) : 107 (M + H) +
Ή-N R (300MHz, DMS 0- d6) δ (ρ pm) : 2. 51 (1 H, d d, 3 = 7. 3, 12. 1 H z) , 2 66 (1 Η, d d, J = 4. 3, 12. 1 Hz) , 3. 28 (2H, m) 3. 56 (1 H， m) 参考例 3
式：
Figure imgf000045_0001
(式中、 Bnはベンジル基を示す。 以下、 同じ。） で表される化合物の製造 c (1) 式：
Figure imgf000045_0002
で表される化合物の製造。
7—べンジルォキシインドーノレ 15 gを THF 150mlに溶解し、 リチ ゥムへキサメチルジシラジド （ 1M： THF溶液） 161. 3mlを加え窒 素雰囲気下 0°Cで 30分間攪拌した後、 2. 3—ジブ口モー N—メチルマレ イミ ド 18. 1 gの THF溶液 180mlを 10分かけて滴下した。
滴下終了後、 0¾にて0. 5時間攪拌した後、 反応液を 2 N塩酸 1 Lに注ぎ 込み、 齚酸ェチル 2 Lで抽出した。 有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 ついで飽和食塩水で洗浄後、 乾燥、 濃縮し残渣を酢酸ェチルーへキサンを用 いて再結晶することにより目的化合物 （19) 26. 9 gを得た。 （収率： 97%)
H RMS (m/ z ) ： f o u n d 4 1 0. 0273, c a l c d 410. 0248 [C2。H15N203B rとして]
I R (KB r) ： cm"1 1 705, 1628， 1576， 1 433, 1383, 1259, 1247, 1076, 762, 739
Ή-N R (300MHz, CDC 13) : 5 p pm 9. 03 ( 1 H， b r s) , 7. 94 ( 1 H， d, J = 3. 0H z) , 7. 64 ( 1 H, d, J = 8. 0 H z) , 7. 30 - 7. 53 (5 H, m) , 7. 15 ( 1 H, t, J = 8. 0Hz) , 6, 82 ( 1 H, d, J = 8. 0Hz) , 5. 22 (2 H, s) , 3. 16 (3 H, s)
(2) 式：
Figure imgf000046_0001
(式中、 B o cは t e r t—ブトキシカルボ二ル基を示す。 以下、 同じ。 ） で表される化合物の製造。
参考例 3の （1) で得られた化合物 （19) 29 g、 二炭酸ジー t e r t 一ブチル 169 g及び 4 -N, N—ジメチルァミノピリジン 136mgを THF 200mlに溶解し室温にて 1時間攪拌した。 反応液を '濃縮後、 残渣 をシリカゲルクロマトグラフィー （クロ口ホルム） を用いて精製し、 さらに クロ口ホルム-酢酸ェチル -へキサンを用いて再結晶し目的化合物（20) 32.9g を得た。 （収率： 92 °/o)
I R (KB r ) ： cm- 1 1 765， 17 1 2, 1438, 1369, 1261, 1228, 1 149. 739
HRMS (m/ z ) ： f o u n d 5 1 0. 08 1 5, c a l c d 510. 0790 [C25H23N205B rとして]
Ή-NMR (300 MHz, C D C 13) ： 5ppm 8. 04 ( 1 H, s) , 7. 20 - 7. 62 (7 Η, m) . 6. 95 ( 1 Η. d. J = 7. 9H z) , 5. 2 3 (2 Η, s) , 3. 1 8 (3 Η， s) , 1. 53 (9Η. s)
(3) 式：
Figure imgf000047_0001
で表される化合物の製造。
7-ベンジルォキシインドール 107.2mgを THF3mlに溶解し、 リチウムへキ サメチルジシラジド （1M： THF溶液） 0.48mlを加え窒素雰囲気下 0°Cで 15 分間攪拌した後、 参考例 3の （2) で得た化合物 （20) 102.2mgの THF溶液 2mlを 20分かけて滴下した。 滴下終了後、 室温にて 0.5時間 »拌した後、 反 応液を 2N塩酸 10mLに注ぎ込み、 酢酸ェチル 30mLで抽出した。 有機層を 水、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液ついで飽和食塩水で洗浄後、 乾燥、 濃縮 し残渣をシリカゲルクロマトグラフィ （へキサン—酢酸ェチル = 4 ： 1 ) を 用いて精製し、 目的化合物 （2 1 ) 1 1 2. 7mgを得た。 （収率： 8 6
%)
HR S (m/z ) ： f o u n d 6 5 3. 2 5 2 9, c a c d 653. 2526 [C 4。H35N306として]
I R (KB r) ： cm-' 1 7 59, 1 73 4, 1 5 7 9, 1 4 9 8, 1 430, 1 26 1 , 1 2 1 7， 1 1 49, 752, 733
Ή-NMR (300 MH z. CDC ") : δρ ρπι 8. 78 (1 H, b r s) , 7. 9 0 ( 1 H, s) , 7. 7 5 ( 1 H, s) , 7. 2 9 - 7. 5 2 ( 1 0 H, m) , 6. 5 8— 6. 8 2 (6 H, m) , 5. 1 7 (2 H, s) , 5. 1 5 (2 H, s) ， 3. 1 9 (3H, s) , 1. 53 (9H, s)
(4) 式：
Figure imgf000048_0001
で表される化合物の製造。
参考例 3の （3) で得られた化合物 （2 1 ) 69mgをメチルァミン (40%メタノール溶液） 1mlに溶解し、 室温にて 10分間攪拌した。 反 応溶液を '濃縮後、 残渣を酢酸ェチル-へキサンを用いて再結晶し目的の化合 物 （22) 55. 2mを得た。 （95%)
H RMS (m/z ) ： f o u n d 553. 1 982， c a l c d 553. 2002 [C3BH27N304として]
I R (KB r) ： cm-1 1 691, 1577, 1531, 1423, 1384, 1259, 1083, 752, 715, 694
'H-NMR (300 MHz, C D C 13) ： 5ppm 8. 73 (2H, b r s) , 7. 69 (2 H, d， J = 2. 1 H z) , 7. 30 - 7. 49 (10 H, m) , 6. 60 - 6. 75 (6 H, m) , 5. 16 (4H, s) , 3. 17 (3 H, s)
(5) 参考例 3の （4) で得られた化合物 （22) 30mg及びトリフル ォロ酢酸パラジウム 49. 9mgを加え 90°Cにて 0. 5時間授拌した。 反 応液を酢酸ェチル- 2 N塩酸で分配し、 有機層を水、 飽和炭酸水素ナトリゥ ム水溶液、 水、 次いで飽和食塩水で洗浄後、 乾燥濃縮した. 残渣をセフアデ ックス LH— 20を用いて展開しメタノールで溶出し表題化合物 （18) 14. 6mgを得た。 （収率： 49%)
HRMS (m/z ) ： f o un d 55 1. 1 839， c a l c d 551. 1845 [C35H25N304として]
I R (KB r) ： cm -1 1 742, 1 695, 1 684, 1 577,
1 406, 1 377, 1251, 1 1 03, 776, 737, 696
Ή-NMR (30 OMH z, DMS O- d6) : (5 p pm 1 1. 67 ( 2 H, s ) , 8. 5 2 - 8. 5 5 ( 2 H, m) , 7. 6 2
(4 H, d， J = 7. 1 H z) , 7. 46 (4 H, t , J = 7.
1 H z ) , 7. 40 (2 H, d, J = 7. 1 H z) , 7. 23 -
7. 28 (4H, m) , 5. 37 (4H, s) , 3. 30 (3H, s)
参考例 4
式：
Figure imgf000049_0001
で表される化合物の製造。
(1) 式：
Figure imgf000049_0002
で表される化合物の製造。
6一ベンジルォキシィンドール 284 gを THF 3 Lに溶解し、 リチウム へキサメチルジシラジド （1M： THF溶液） 2. 7Lを加え窒素雰囲気下 一 10°Cで 45分間攪拌した後、 2, 3—ジブ口モー N—メチルマレイミ ド
340 gの THF溶液 3 Lを 1時間かけて滴下した。
滴下終了後、 0°Cにて 15分間攪拌した後、 反応液を 2 N塩酸 10Lに注ぎ 込み、 醉酸ェチル 30 Lで抽出した。 有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶 液ついで飽和食塩水で洗浄後、 乾燥、 濃縮し残渣をメタノールを用いて再結 晶することにより目的化合物 （24) 482 gを得た。 （収率： 93%) HRMS (mZz) ： f o un d 4 1 0. 0292, c a l c d
410. 0266 [C2。H15N203B rとして] I R (KB r) ： cm 1 3330, 33 1 8, 1 762, 1 70 1,
1 606, 1 5 1 1, 1 450， 1 1 65， 1 135, 1041, 794
Ή-NMR (300MHz, C D C 13) : 5 p pm 8. 60 (1 H, b r s) , 7. 96 ( 1 H, d, J = 8. 1 H z ) , 7. 94 ( 1 H, d, J = 2. 5 H z ) . 7. 33 - 7. 47 ( 5 H. m) , 7. 00 (1 H, d d, J = 2. 5, 8. 8H z) , 6. 97 ( 1 H, d, J = 2. 5Hz) , 5. 13 (2 H, s) , 3. 16 (3H, s)
(2) 式：
Figure imgf000050_0001
で表される化合物の製造。
参考例 4の （1 ) で得られた化合物 （24) 1. 00 g、 二炭酸ジー t e r t—ブチル 637mg及び 4一 N, N—ジメチルァミノピリジン 3mgを THF200m 1に溶解し室温にて 1時間攪拌した。 反応液を濃縮 後、 残渣を酢酸ェチルーへキサンを用いて再結晶し目的化合物 （25) 1. 18 gを得た。 （収率： 96%)
I R (KB r) ： cnr' 1740, 17 14, 1614, 1 527, 1487, 1443， 1373, 1227， 1 153
H RMS (m/ z ) ： f o u n d 5 1 0. 077 1 , c a 1 c d 510. 0791 [C25H23N205B rとして]
'H-NMR (300 MHz, C D C 13) : <5p pm 8. 10 (1 H, s) , 7. 91 ( 1 H, d, J = 2. 3Hz) ， 7. 73 ( 1 H, d， J = 8. 9 H z ) , 7. 34 - 7. 50 (5 H， m) , 7. 03 ( 1 H, d d, J = 2. 3, 8. 5Hz) , 5. 16 (2H, s) ， 3. 18 (3H, s) ， 1. 68 (9H, s) (3) 式：
Figure imgf000051_0001
で表される化合物の製造。
6一ベンジルォキシィンドール 2 18. 4mgを THF20m lに溶解 し、 リチウムへキサメチルジシラジド （1M： THF溶液） 2. 35mlを 加え窒素雰囲気下 0°Cで 15分間搜拌した後、 参考例 4の （2) で得られた 化合物 （25) 50 OmgのTHF溶液l 0mlを 10分かけて滴下した。 滴下終了後、 室温にて 0. 5時間攪拌した後、 反応液を 2 N塩酸 10 OmL に注ぎ込み、 酢酸ェチル 40 OmLで抽出した。 有機層を水、 飽和炭酸水衆 ナトリウム水溶液ついで飽和食塩水で洗浄後、 乾燥、 濃縮し残渣をトルエン 一へキサンを用いて再結晶し目的化合物 （26) 580mgを得た。 （収 率： 91 %)
HRMS (m/ z ) ： f o u n d 653. 2556, c a l c d 653. 2526 [C4。H35N3Oeとして]
I R (KB r) ： cm- ' 1740, 170 1, 1646, 1623, 1543, 1445, 1 155
'H-NMR (300 MHz, C D C 13) ： <5ppm 8. 41 (1 H, b r s) , 7. 97 (1 H, s) , 7. 84 ( 1 H, b r s) , 7. 68 (1 H, b r s) , 7. 16-7. 43 (10 H, m) , 6. 9 8 ( 1 H, d, J = 9. 2 H z ) , 6. 85 ( 1 H, b r s) , 6. 74 (1 H, d, J = 9. 2H z) , 6. 58 ( 1 H, d， J = 9. 2H z) , 6. 52 ( 1 H, d. J = 9. 2H z) ， 5. 05 (2H， s) , 5. 02 (2 H, s) , 3. 19 (3H, s) ， 1. 67 (9H, s)
(4) 式：
Figure imgf000052_0001
で表される化合物の製造。
参考例 4の （3) で得られた化合物 （26) 10 Omgをメチルアミン (40%メタノール溶液） 1 Omlに溶解し、 室温にて 30分間攪拌した。 反応溶液を濃縮後、 残渣をジクロロメタン一アセトン一へキサンを用いて再 結晶し目的の化合物 （27) 68. 6mを得た。 （収率： 84 %)
HRMS (m/ z ) ： f o un d 553. 1 982, c a l c d 553. 2002 [C35H27N304として]
I R (KB r) ： cm" 34 19, 3350, 1759, 1697, 1620, 1533, 1454, 1383， 1292, 1 167
'H-NMR (300MH z, DMSO - de) : 5 p pm 1 1. 48 ( 2 H, s ) , 7. 6 2 (2 H, s) , 7. 2 8 - 7. 4 5 ( 1 0 H, m) , 6. 95 (2 H. d. J = 1. 2 H z ) , 6. 70 (2H, d, J = 8. 7Hz) , 6. 39 (2H， dd， J = 1. 2, 8. 7Hz) , 5. 04 (4H, s) , 3. 03 (3H, s)
(5) 参考例 4の （4) で得られた化合物 （27) 1. 01 g及び 2, 3 - ジクロロー 5, 6-ジシァノー 1, 4-ベンゾキノン 456. lmgをトル ェン 50mlに溶解 1 10°Cにて 40分間攪拌した。 反応液を室温に戻した 後不溶物を濂過しメタノール 30mlで洗浄した。 残渣をジメチルスルフォ キシドージクロロメタン一メタノールを用いて再結晶し表題化合物 （23) 98 lmgを得た。 （収率： 98%)
HRMS (mZ z ) ： f o u n d 55 1. 1 829, c a l c d 551. 1845 [C35H25N304として]
I R (KB r) ： cm"1 3257. 1 740, 1675, 1620, 1571, 1402, 1246, 1 178 Ή-NMR (300 MHz, DMSO— d6) : 5 p p m 1 1. 46 (2H， s) , 8. 79 (2 H, d, J = 8. 5H z) , 7. 53 (4 H, d, 8. 5H z) , 7. 35 -7. 44 (8 H, m) , 7. 02 (2 H, d d， 8. 5， 0. 8Hz) , 5. 25 (4 H, s) , 3. 13 (3 H, s)
産業上の利用可能件.
本発明の化合物はマウス及びヒトの癌細胞に対し顕著な増殖阻止作用を示 す。 従って、 本発明の化合物はヒトをはじめとする哺乳動物の抗腫癘剤とし て有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
( 1 ) —般式
Figure imgf000054_0001
[式中、 X 1及び X 2はそれぞれ独立に水素原子、 ハロゲン原子、 アミノ基、 モノ低級アルキルァミノ基、 ジ低級アルキルァミノ基、 ヒドロキン基、 低級 アルコキシ基、 ァラルコキシ基、 カルボキシル基、 低級アルコキシカルボ二 ル基、 低級アルカノィルォキシ基、 又は 1〜2個のヒドロキシ基で置換され ていてもよい低級アルキル基を示し、 R 1は水素原子、 アミノ基、 ホルミル アミノ基、 低級アルカノィルァミノ基、 モノ低級アルキルアミノ基、 ジ低級 アルキルアミノ基、 ヒドロキシ基、 低級アルコキシ基、 ァラルコキシ基、 ァ ラルキル基、 低級アルキルカルボニル基、 ァリールカルボニル基又は低級ァ ルキル基 （該低級アルカノィルァミノ基、 モノ低級アルキルアミノ基、 ジ低 級アルキルアミノ基、 低級アルコキシ基、 ァラルコキシ基、 ァラルキル基、 低級アルキルカルボニル基、 ァリールカルボニル基及び低級アルキル基は力 ルボキシル基、 力ルバモイル基、 スルホ基、 アミノ基、 シァノ基、 モノ低級 アルキルアミノ基、 ジ低級アルキルアミノ基、 ヒドロキシ基、 1〜3個のヒ ドロキシ基又は 1〜3個のヒドロキシ基によって置換されていてもよい低級 アルキル基を有していてもよ t、複素環基及びノヽ口ゲン原子からなる群より選 ばれる 1〜5個の置換基を有していてもよい） を示し、 R 2は二糖基を示 す] で表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
( 2 ) X 1及び X 2がヒドロキシ基であり、 R 'が水素原子、 アミノ基、 ホル ミルアミノ基又は 1〜3個のヒドロキシ基によって置換された低級アルキル アミノ基であり、 R 2がマルトシル基であることを特徴とする請求項 1記載 の化合物。
( 3 ) X 1及び X 2がヒ ドロキシ基であり、 R 1が水素原子、 アミノ基、 ホル ミルアミノ基又は 1〜3個のヒドロキシ基によって置換された低級アルキル ァミノ基であり、 R2がキシロビラノシルリボフラノシル基であることを特 徴とする請求項 1記載の化合物。
(4) X1及び X2がヒ ドロキシ基であり、 R'が水素原子、 アミノ基、 ホル ミルアミノ基又は 1〜3個のヒドロキシ基によって置換された低級アルキル アミノ基であり、 R2がダルコビラノシル基であることを特徴とする請求項 1記載の化合物。
(5) X'及び X2がヒドロキシ基であり、 R1が水素原子、 アミノ基、 ホル ミルアミノ基又は 1〜3個のヒドロキン基によって置換された低級アルキル アミノ基であり、 R2がリボフラノシル基であることを特徴とする請求項 1 記載の化合物。
(6) X'及び X2がヒ ドロキシ基であり、 R1が水素原子、 アミノ基、 ホル ミルアミノ基又は 1〜3個のヒドロキン基によって置換された低級アルキル アミノ基であり、 R2がラク トピラノシル基であることを特徴とする請求項 1記載の化合物。
(7) X'及び X2がヒ ドロキシ基であり、 R'が水素原子、 アミノ基、 ホル ミルアミノ基又は 1〜3個のヒドロキシ基によって置換された低級アルキル アミノ基であり、 R 2がセロビォピラノシル基であることを特徴とする請求 項 1記載の化合物。
(8) 一般式
Figure imgf000055_0001
[式中、 R3は水素原子、 低級アルキル基、 ベンジルォキシメチル基又はァ ラルキル基を示し、 X1、 X2は前記の意味を有する] で表される化合物を、 この化合物に二糖基を付加する能力を有する微生物と培養し、 その培養物か ら一般式
Figure imgf000056_0001
[式中、 R3、 X1及び X 2は前記の意味を有し、 R2は二糖基を示す] で表さ れる化合物の製造法。
(9) X1及び X2がヒドロキシ基であり、 R3が水素原子、 アミノ基又は 1 〜3個のヒドロキン基によって置換された低級アルキルアミノ基である請求 項 8記載の製造法。
(10) 二糖基を付加する能力を有する微生物が、 サッカロスリクス属に属 する微生物又はその変異株であることを特徴とする、 請求項 8又は 9記載の 製造法。
(1 1) 二糖基を付加する能力を有する微生物が、 サッカロスリクス エア ロ コ ロ ニ ゲ ネ ス （ S a c c h a r o t h r i x a e r o c o l on i gen e s) ATCC 39243株又はその変異株 であることを特徴とする、 請求項 8又は 9の製造法。
(12) 請求項 1〜7のいずれか一の請求項に記載の化合物を有効成分とす ることを特徴とする抗腫瘍剤。
PCT/JP1995/001490 1994-08-02 1995-07-26 Antitumor indolopyrrolocarbazoles Ceased WO1996004293A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU30864/95A AU3086495A (en) 1994-08-02 1995-07-26 Antitumor indolopyrrolocarbazoles

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP20011094 1994-08-02
JP6/200110 1994-08-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1996004293A1 true WO1996004293A1 (en) 1996-02-15

Family

ID=16419001

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1995/001490 Ceased WO1996004293A1 (en) 1994-08-02 1995-07-26 Antitumor indolopyrrolocarbazoles

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU3086495A (ja)
WO (1) WO1996004293A1 (ja)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2337702A (en) * 1998-05-29 1999-12-01 Merck Sharp & Dohme The use of staurosporine analogues for enhancing neurotrophin activity
EP0971717A4 (en) * 1996-08-22 2000-04-12 Bristol Myers Squibb Co CYTOTOXIC AMINOSUCRE AND SUGAR DERIVATIVES ASSOCIATED WITH INDOLOPYRROLOCARBAZOLES
US6271370B1 (en) * 1999-05-11 2001-08-07 Pfizer Inc Process for the synthesis of nucleoside analogs
WO2001062769A1 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Process for preparing indolopyrrolocarbazole derivatives, intermediates therefor, and preparation process of the intermediates
EP0760375A4 (en) * 1994-05-09 2002-03-27 Banyu Pharma Co Ltd Antitumor indolopyprolocarbazole derivative
US6605596B2 (en) 2000-10-31 2003-08-12 Advanced Life Sciences, Inc. Indolocarbazole anticancer agents and methods of using them
JP3439470B1 (ja) 2001-03-29 2003-08-25 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド インドロカルバゾールグリコシド類の調製と単離
US6610727B2 (en) 2000-10-06 2003-08-26 Bristol-Myers Squibb Company Anhydro sugar derivatives of indolocarbazoles
US6653290B2 (en) 2000-10-06 2003-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Tumor proliferation inhibitors
US6677450B2 (en) 2000-10-06 2004-01-13 Bristol-Myers Squibb Company Topoisomerase inhibitors
US6703373B1 (en) 1999-09-10 2004-03-09 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Indolopyrrolocarbazole derivatives and antitumor agents
JP3536574B2 (ja) 1997-02-28 2004-06-14 萬有製薬株式会社 抗腫瘍性インドロピロロカルバゾール誘導体
US6855698B2 (en) 2001-03-22 2005-02-15 Bristol-Myers Squibb Company Topoisomerase I selective cytotoxic sugar derivatives of indolopyrrolocarbazoles
WO2005026185A1 (ja) * 2003-09-16 2005-03-24 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. 抗腫瘍性新規インドロピロロカルバゾール誘導体
US7122526B2 (en) 2000-10-31 2006-10-17 Nanosphere, Inc. Indolocarbazole anticancer agents and methods of using same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06128283A (ja) * 1991-11-29 1994-05-10 Banyu Pharmaceut Co Ltd 抗腫瘍性インドロピロロカルバゾール誘導体
JPH06296494A (ja) * 1992-12-14 1994-10-25 Banyu Pharmaceut Co Ltd インドロピロロカルバゾール誘導体の製造法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06128283A (ja) * 1991-11-29 1994-05-10 Banyu Pharmaceut Co Ltd 抗腫瘍性インドロピロロカルバゾール誘導体
JPH06296494A (ja) * 1992-12-14 1994-10-25 Banyu Pharmaceut Co Ltd インドロピロロカルバゾール誘導体の製造法

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0760375A4 (en) * 1994-05-09 2002-03-27 Banyu Pharma Co Ltd Antitumor indolopyprolocarbazole derivative
EP0971717A4 (en) * 1996-08-22 2000-04-12 Bristol Myers Squibb Co CYTOTOXIC AMINOSUCRE AND SUGAR DERIVATIVES ASSOCIATED WITH INDOLOPYRROLOCARBAZOLES
JP3536574B2 (ja) 1997-02-28 2004-06-14 萬有製薬株式会社 抗腫瘍性インドロピロロカルバゾール誘導体
GB2337702A (en) * 1998-05-29 1999-12-01 Merck Sharp & Dohme The use of staurosporine analogues for enhancing neurotrophin activity
US6271370B1 (en) * 1999-05-11 2001-08-07 Pfizer Inc Process for the synthesis of nucleoside analogs
US6703373B1 (en) 1999-09-10 2004-03-09 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Indolopyrrolocarbazole derivatives and antitumor agents
WO2001062769A1 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Process for preparing indolopyrrolocarbazole derivatives, intermediates therefor, and preparation process of the intermediates
US6790836B2 (en) 2000-02-24 2004-09-14 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Process for preparing indolopyrrolocarbazole derivatives, intermediates therefor, and preparation process of the intermediates
US6677450B2 (en) 2000-10-06 2004-01-13 Bristol-Myers Squibb Company Topoisomerase inhibitors
US6653290B2 (en) 2000-10-06 2003-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Tumor proliferation inhibitors
US6686385B2 (en) 2000-10-06 2004-02-03 Bristol-Myers Squibb Company Anhydro sugar derivatives of indolocarbazoles
US6610727B2 (en) 2000-10-06 2003-08-26 Bristol-Myers Squibb Company Anhydro sugar derivatives of indolocarbazoles
US7138377B2 (en) 2000-10-06 2006-11-21 Bristol-Myers Squibb Company Topoisomerase inhibitors
US6605596B2 (en) 2000-10-31 2003-08-12 Advanced Life Sciences, Inc. Indolocarbazole anticancer agents and methods of using them
US7122526B2 (en) 2000-10-31 2006-10-17 Nanosphere, Inc. Indolocarbazole anticancer agents and methods of using same
US6855698B2 (en) 2001-03-22 2005-02-15 Bristol-Myers Squibb Company Topoisomerase I selective cytotoxic sugar derivatives of indolopyrrolocarbazoles
JP3439470B1 (ja) 2001-03-29 2003-08-25 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド インドロカルバゾールグリコシド類の調製と単離
WO2005026185A1 (ja) * 2003-09-16 2005-03-24 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. 抗腫瘍性新規インドロピロロカルバゾール誘導体

Also Published As

Publication number Publication date
AU3086495A (en) 1996-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2083534C (en) Indolopyrrolocarbazole derivatives
WO1996004293A1 (en) Antitumor indolopyrrolocarbazoles
He et al. Creation of 3, 4-bis-triazolocoumarin–sugar conjugates via flourogenic dual click chemistry and their quenching specificity with silver (I) in aqueous media
CA1315775C (en) 4-demethoxy-4-amino-anthracyclines
Wlassoff et al. Synthesis and characterization of (d) NTP derivatives substituted with residues of different photoreagents
US5591842A (en) Indolopyrrolocarbazole derivatives
EP0602597B1 (en) Process for preparation of indolopyrrolocarbazole derivatives
EP0115350B1 (en) Rebeccamycin and process for its preparation
US5589365A (en) Process for producing glycosylated indolopyrrolocarbazole derivatives by culturing certain microorganisms
Marminon et al. Syntheses and antiproliferative activities of rebeccamycin analogues bearing two 7-azaindole moieties
EP0528030B1 (en) Antitumor be-13793c derivative
US5643760A (en) Microbial process for preparation of indolopyrrolocarbazole derivatives
Messaoudi et al. Synthesis of bridged aza-rebeccamycin analogues
Maeba et al. C-nucleosides. 7. Preparation and utility of 6-hydroxy-6-(2, 3, 5-tri-O-benzoyl-. beta.-D-ribofuranosyl)-2H-pyran-3 (6H)-one as a key intermediate of C-nucleoside synthesis
RU2427585C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ N-ГЛИКОЗИДОВ ИНДОЛО[2,3-а]ПИРРОЛО[3,4-с]КАРБАЗОЛ-5,7-ДИОНОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ
RU2548045C1 (ru) N-ГЛИКОЗИДЫ ИНДОЛО[2,3-a]ПИРРОЛО[3,4-c]КАРБАЗОЛОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ
CA1296326C (en) Anthracycline derivatives having cytostatic activity
KR101132945B1 (ko) 카프라졸, 그 유도체 및 이를 포함하는 제약학적 조성물
Henon et al. Synthesis of dipyrrolo [3, 4-a: 3, 4-c] carbazole-1, 3, 4, 6-tetraones bearing a sugar moiety
CN102125578B (zh) 具有抗癌活性的蝴蝶霉素类似物及合成方法
JP3038921B2 (ja) 抗腫瘍性インドロピロロカルバゾール誘導体
Koizumi et al. Synthesis and antimicrobial activity of 2′-deoxypuromycin
Baker et al. An evaluation of certain chain-extended analogs of 9-. beta.-D-arabinofuranosyladenine for antiviral and cardiovascular activity
JP2004518633A (ja) 腫瘍増殖インヒビター
Chu A facile synthesis of 8‐(β‐D‐ribofuranosyl)‐4‐thioxo‐3H‐pyrazolo [1, 5‐a]‐1, 3, 5‐triazine and its α‐anomer

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CA CN JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA