WO1996004366A1 - Procede de culture de bacteries thermophiles et de bacteries hyperthermophiles anaerobies strictes non sulfato-reductrices - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
Definitions
- the subject of the invention is a process for the cultivation of thermophilic bacteria and strict anaerobic hyperthermophilic bacteria, which are not sulfato-reducing. It also relates to the use of this process for producing metabolites, more especially enzymes, and for selecting thermophilic or even hyperthermophilic bacterial strains, in particular strains producing thermostable enzymes.
- thermophilic and more particularly hyperthermophilic bacteria have an important scientific dynamic around thermophilic and more particularly hyperthermophilic bacteria, given the thermostability nature of their enzymes, many of which are of industrial interest, such as xylanases, proteases, cellulases or amylases. .
- thermophilic bacteria are capable of growing at optimal temperatures between 45 ° C and 80 ° C.
- hyperthermophiles Bacteria that grow optimally at higher temperatures, especially between 80 and 110 ° C are called hyperthermophiles.
- thermophilic bacteria of the genus Thermoanaerobacter and hyperthermophilic bacteria of the order of Thermotogales belonging to the Bacteria domain show weak or even slow growth even in the presence of elemental sulfur (in particular in Thermotogales). This slow growth in the presence of elemental sulfur constitutes a limiting factor, in particular for biochemical studies and the industrial production of enzymes.
- the research concerned the isolation of the gene (s) coding for thermostable enzymes in order to clone and express them in Escherichia coli or Bacill us sp.
- thermophilic bacteria and on hyperthermophilic bacteria of the above type enabled them to demonstrate that they were capable of using, during their metabolism, under given culture conditions, a particular sulfur compound. , and that the latter played a role of great interest as a growth-stimulating agent.
- the object of the invention is therefore to provide a new method for cultivating these bacteria which makes it possible to increase cell yields, and thus the quantity of metabolites produced, more especially enzymes.
- the object of the invention is also to apply this culture method to the selection of thermophilic, even hyperthermophilic, anaerobic, thiosulfato-reducing, non-sulfato-reducing, bacterial strains and to the production of thermostable enzymes.
- thermophilic and hyperthermophilic, strict anaerobic, thiosulphate-reducing, non-sulphate-reducing bacteria of the invention is characterized in that it is carried out, under strict anaerobic conditions, in the absence of external supply of hydrogen, a culture medium containing a peptide source and / or amino acids, at a rate of at least 1 g / l of culture medium, at least one sugar and thiosulfate as a growth stimulant, which is recovered and purified, if desired, the metabolites produced, in particular the enzymes.
- the peptide source is advantageously used in an amount of at least 2 g / l of culture medium, or even more than 4 to 5 g / l.
- This stimulation which can also be observed when the bacteria are cultivated on a biological polymer such as xylan, is the result of a metabolic deviation which leads to a greater production of acetate in the presence of thiosulfate, in particular at the expense lactate and / or ethanol, in particular for the species of the genus Thermoanaerobacter, or to phosphorylations not linked to the substrate, in particular in hyperthermophilic bacteria of the order Thermotogales (T. mari tima and T. neapoli tana, respectively deposited with the DSM under N ° 3109 and 4539).
- sugars, peptides and / or amino acids are also used as culture substrate, in accordance with the invention, in an amount of at least 1 g / l of culture medium.
- Their use is improved in the presence of thiosulfate, under the conditions of the invention. An increase in the cell density of the culture medium and / or a higher production of volatile fatty acids is thus observed.
- Bacteria capable of using thiosulfate under the conditions defined above, and thus of being used in the process of the invention, are chosen from Bacteria:
- Thermotogales and the genus Thermoanaerobacter are Thermotogales and the genus Thermoanaerobacter.
- Bacteria of the order Thermotogales advantageously used include in particular the genera Fervidobacterium, Thermosipho and Thermotoga. By extension, the Geotoga bacteria and
- Thermotogales have as their habitat volcanic thermal springs of marine or terrestrial origin, deep hydrothermal systems, large artesian basins and water from petroleum deposits.
- bacteria of the order Thermotogales are capable of reducing thiosulfate to sulfides, which had not been reported in the scientific literature to date. This allows the use of a product more soluble than elemental sulfur and therefore able to be easily separated from the bacterial culture.
- Bacteria of the genus Thermoanaerobacter are thermophilic, heterotrophic, saccharolytic anaerobes and are capable of reducing thiosulfate to sulfide.
- T. finnii T. brockii
- T. ethanolicus T. thermohydrosulfuricus and Thermoanaerobacter SEBR 5268.
- Advantageous conditions for modifying, under the effect of thiosulfate, the metabolism of these bacteria towards more energetic pathways include carrying out the culture at a temperature of the order of 45 to 110 ° C., in particular from 60 to 90 °. C at a pH of 3 to 10, in particular from 6.5 to 8.0 for neutrophilic species, 3 to 6.5 for acidophilic species, and 8 to 10 for alkalophilic species.
- thiosulfate is used in an amount of 1 to 100 mM, in particular 15 to 25 mM.
- the culture medium is inoculated with approximately at least 10% w / v of culture medium.
- the culture method of the invention can be carried out continuously or batchwise.
- the invention also relates to the application of the culture method as defined above to the selection or screening of thermophilic or hyperthermophilic, anaerobic, non-sulfato-reducing bacterial strains from a medium containing them, and more especially the selection of bacteria of the above-mentioned type producing thermostable enzymes.
- thermophilic, even hyperthermophilic bacterial strains is characterized by the culture of strains taken from a given medium, under strict anaerobic conditions, in the absence of external hydrogen supply, in the presence of thiosulfate. , on a support for peptides and / or amino acids, and sugars, under conditions suitable for their growth.
- the strains will be selected from enrichments carried out in a liquid medium under given conditions (pH and temperature corresponding to the properties sought for the strain) on substrates bringing about given enzymatic activities.
- thermophilic or hyperthermophilic alkalotolerant or alkalophilic, or acidotolerant or acidophilic strains, according to the pH conditions chosen.
- the invention makes it possible in particular to have alkalophilic thermotogals, while only neutrophil thermotogals have been described to date.
- the invention thus makes it possible to isolate strictly thiosulfato-reducing, sulfuro-reducing and non-sulfato-reducing bacterial strains, of the order of Thermotogales in particular.
- the screening method of the invention makes it possible to select strictly thiosulfato-reducing, non-sulfuro-reducing, and non-sulfato-reducing bacteria, of the order of Thermotogales in particular.
- the selection process of the invention makes it possible to search for bacterial strains having a given enzymatic activity, in particular bacterial xylanolytic, proteolytic, lipase, amylolytic or cellulolytic strains.
- Thermotogales have been described as being sulfuro-reducing, except for the species Thermotoga thermarum incapable of '' use the sulfur, and whose thiosulfato-reducing properties had not been demonstrated.
- the selection of bacterial strains operated in accordance with the invention is carried out from various biotopes, such as the large artesian, Australian and Indian basins, deep hydrothermal systems, water from petroleum deposits or ecosystems of volcanic, terrestrial or Marine.
- the invention therefore also provides means for obtaining enzymes which are thermostable in high quantities, which makes it possible to envisage industrial exploitation, in the numerous sectors which use enzymatic technologies at high temperature and to meet non-specific needs. satisfied to date.
- thermostable enzymes characterized in that it comprises the culture of thermophilic or hyperthermophilic bacteria endowed with a given enzymatic activity, under strict anaerobic conditions, in the absence of external supply of hydrogen, in the presence of thiosulfate, on peptide substrate and / or amino acids and sugars, so as to obtain the production of the desired enzymes, and the recovery of these enzymes from the culture medium, followed by their purification if desired.
- thermostable enzymes of interest in various sectors.
- these enzymes can be expressed, according to conventional molecular biology techniques in microorganisms, for example mesophilic microorganisms such as Escherichia coli and Bacillus sp.
- the enzymes obtained are advantageously subjected to at least one purification step, with a view to their use.
- the purification of xylanases from cell pellets or supernatants obtained after centrifugation will include the steps of precipitation with ammonium sulphate, passage through DEAE-Sepharose, elution of the xylanase activity by gradient NaCl, passing through an ion exchange column and, where appropriate, passing through a hydroxyapatite column.
- the invention thus provides enzymes, such as amylases, glucoamylases, glucoisomerases and pullulanases, usable for the transformation of starch (starch manufacture and glucosery), xylanases for the bleaching of paper pulp, proteases, pectinases, amylases , cellulases, lipases for detergency, amylases and proteases for desizing in the textile industry and proteases for scouring silk.
- enzymes such as amylases, glucoamylases, glucoisomerases and pullulanases, usable for the transformation of starch (starch manufacture and glucosery), xylanases for the bleaching of paper pulp, proteases, pectinases, amylases , cellulases, lipases for detergency, amylases and proteases for desizing in the textile industry and proteases for scouring silk.
- glucose isomerase xylose isomerase
- cellobio hydrolase pullulanase
- amylosaccharidase hydrogenases
- alcohol dehydrogenases the latter making it possible to modify the chirality of isomers and therefore to lead to active products for example in pharmacy.
- glucose isomerase xylose isomerase
- cellobio hydrolase pullulanase
- amylosaccharidase hydrogenases
- alcohol dehydrogenases the latter making it possible to modify the chirality of isomers and therefore to lead to active products for example in pharmacy.
- enzymes are new products, in particular due to their characteristics of stability at high temperature and, where appropriate, their alkaline or acidic properties. Such enzymes are therefore also part of the invention.
- thermostable enzymes By operating under acidic conditions, acidic thermostable enzymes are isolated, for example acid amylases.
- acidic thermostable enzymes are isolated, for example acid amylases.
- alkaline pH conditions makes it possible, from cultures of alkalotolerant or alkalophilic strains, to have thermostable alkaline enzymes of great interest in certain application sectors.
- the culture, under the conditions of the invention, of alkalophilic thermotogals makes it possible to produce large quantities of alkalophilic xylanases which can be used for bleaching paper pulp or also for the release of simple sugars at C5 in animal feed.
- thermostable enzymes which, if necessary, cannot be expressed in their active form via genetic cloning in other organisms.
- thermophilic organisms studied it has been demonstrated, in the context of the invention, as regards for example the xylanases of the thermophilic organisms studied, that they were largely linked to the bacterial wall, which facilitates their recovery.
- thermophilic and hyperthermophilic bacteria examples of culture of thermophilic and hyperthermophilic bacteria in the presence of thiosulfate.
- FIGS. 1 to 7, respectively represent,
- FIGS. 1 and 2 the growth of T. finnii respectively on glucose and xylose, with or without thiosulfate,
- FIG. 4 the xylanolytic activities of bacteria of the order Thermotogales and of the genus Thermoanaerobacter, and
- Example 1 Culture of bacteria of the genus Thermoanaerobacter on glucose or xylose.
- T. finnii was obtained from the German Collection of Microorganisms DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Braunschweig (Germany).
- Thermoanaeroiacter SEBR 5268 strain was isolated from an oil field water in France using the following culture medium (g / l): NH4CI, 1; K 2 HPO 4 , 0.3; KH 2 PO 4 , 0.3; MgCl 2 , 6H 2 O, 1.3; CaCl 2 . 2H 2 O, 0.1; KCl, 0.2; CH 3 COONa 3H 2 O, 0.5; NaCl, 2; biotrypease R (bioMérieux, France), 5; yeast extract (Difco Lab., Detroit, Mien.), 5; glucose 10
- culture medium g / l
- Resazurin 1 mg; Cysteine-HCl, 0.5; Balch mineral solution, 10 ml.
- the pH was adjusted to 7.0 with a 10 M KOH solution.
- the medium was prepared anaerobically with N2: CO 2 (80/20) in the gas phase. After sterilization (110oC, 40 min), 0.2 ml of Na 2 S. 9H 2 O (2%), 1 ml of NaHCO 3 (10%), 0.1 ml of a solution of Widdel vitamins and 0 , 1 ml of a sodium dithionite solution (0.2%) are added sterile for 20 ml of medium.
- the purification of this strain was carried out using the method of dilution in agar medium developed by Hungate.
- optical density, hydrogen sulfide, hydrogen and volatile fatty acid measurements are analyzed as described in the article by Fardeau et al above.
- FIGS. 1 and 2 which give the optical density at 580 nm as a function of time in hours.
- the curves - - correspond to the use of glucose or xylose with thiosulfate and the curves - - to that of glucose or xylose alone.
- Example 2 Culture of bacteria belonging to Thermotogals.
- the culture is carried out in a medium consisting of 5 g / l of yeast extract, 5 g / l of biotrypcase R, 20 mM / l of glucose and 5g / l of NaCl when using Thermosipho africanus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana and Thermotoga SEBR 2665.
- DSM German collection of microorganisms
- SEBR 2665 isolated from petroleum reservoir water, anaerobically, using the successive dilution techniques in solid medium developed by Hungate.
- FIG. 3 gives the effect of thiosulfate on the growth of T. marltima.
- the curve - ⁇ - corresponds to the use of a base medium containing 5 g / l of yeast extract, 5 g / l of biotrypcase and 20 mmol / l of glucose, the other curves corresponding to the use of this medium added with 2% elemental sulfur for the curve - - of thiosulfate at a rate of 20 mmol / l for the curve - ⁇ - or sulfate at a rate of 20 mmol / l for the curve - - ⁇ -
- the incubation temperature is in each case 70oC.
- Example 3 Study of the effect of the addition of thiosulfate on the enzymatic activity.
- Figure 4 gives the values obtained after 92 hours of culture on xylan at 10 oC, without thiosulfate and with 20 mM thiosulfate with Thermotoga maritima, Thermotoga neapolltana, Thermotoga sp. SEBR 2665, and Thermoanaerobacter brockll.
- Example. 4 Culture of thermophilic bacteria on peptide and / or amino acid substrates.
- thermohydrosulf urlcus (DSM No 567), T. brockll (DSM no 1457), T. flnnli (DSM No 3389) and T. ethanollcus (DSM No 2246) were obtained from DSM.
- the SEBR 5268 strain corresponds to that indicated in Example 1.
- Example 1 The operation is carried out under the conditions reported in Example 1, but the following products have been added: thiosulfate, casamino acids (Difco, EUA), gelatin (Sigma, EUA) and the bio-Trypcase R peptones (bioMérieux, France), peptone pancreatic, (Prolabo, France), bactopeptone R (Difco, EUA), bio-gelytone R (bio Mérieux, France), papain soy peptone (Institut Pasteur, Production, France).
- thiosulfate casamino acids
- gelatin Sigma, EUA
- bio-Trypcase R peptones bioMérieux, France
- peptone pancreatic Prolabo, France
- bactopeptone R Difco, EUA
- bio-gelytone R bio Mérieux, France
- papain soy peptone Institute Pasteur, Production, France
- results correspond to a 3-day incubation at 60oC with the addition of peptides, casamino acids or gelatin at a rate of 5 g per liter.
- the basic medium used contains one gram per liter of yeast extract as indicated above and thiosulfate at a rate of 20 mM.
- Tables 4, 5 and 6 show that all of the isolates are capable of making significant use of peptides and amino acids.
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Abstract
L'invention concerne un procédé de culture de bactéries thermophiles et hyperthermophiles, anaérobies strictes, non sulfato-réductrices, en vue de la production de métabolites, plus spécialement d'enzymes, dans lequel on utilise, dans des conditions d'anaérobiose stricte, en l'absence d'apport extérieur d'hydrogène, un milieu de culture renfermant une source peptidique et/ou d'acides aminés à raison d'au moins 1g/l de milieu de culture, au moins un sucre et du thiosulfate comme agent de stimulation de croissance.
Description
PROCEDE DE CULTURE DE BACTERIES
THERMOPHILES ET DE BACTERIES HYPERTHERMOPHILES ANAEROBIES STRICTES NON SULFATO-REDUCTRICES.
L'invention a pour objet un procédé de culture de bactéries thermophiles et de bactéries hyperthermophiles anaérobies strictes, non sulfato- réductrices. Elle vise également l'utilisation de ce procédé pour produire des metabolites, plus spécialement des enzymes, et pour sélectionner des souches bactériennes thermophiles, voire hyperthermophiles, en particulier des souches productrices d'enzymes thermostables.
Il existe aujourd'hui une dynamique scientifique importante autour des bactéries thermophiles et plus particulièrement hyperthermophiles, étant donné le caractère de thermostabilité de leurs enzymes dont un bon nombre présente un intérêt industriel, comme par exemple les xylanases, les protéases, les cellulases ou les amylases.
On rappelle que les bactéries thermophiles sont capables de se développer à des températures optimales comprises entre 45°C et 80°C.
Les bactéries qui se développent de manière optimale à des températures supérieures, notamment entre 80 et 110°C sont appelées hyperthermophiles.
Le plus souvent, les bactéries thermophiles du genre Thermoanaerobacter et les bactéries hyperthermophiles de l'ordre des Thermotogales appartenant au domaine des Bacteria présentent des croissances faibles, voire lentes même en présence de soufre élémentaire (en particulier chez les Thermotogales). Cette croissance lente en présence de soufre élémentaire constitue un facteur limitant, en particulier pour des études biochimiques et la production industrielle d'enzymes. De
ce fait, les recherches ont concerné l'isolement du ou des gène (s) codant (s) pour les enzymes thermostables afin de les cloner et de les exprimer chez Escherichia coli ou Bacill us sp.
Les travaux des inventeurs sur des bactéries thermophiles et sur des bactéries hyperthermophiles du type ci-dessus leur ont permis de mettre en évidence qu'elles étaient capables d'utiliser au cours de leur métabolisme, dans des conditions de culture données, un composé soufré particulier, et que ce dernier jouait un rôle de grand intérêt comme agent stimulateur de croissance.
L'invention a donc pour but de fournir un nouveau procédé de culture de ces bactéries permettant d'augmenter les rendements cellulaires, et ainsi la quantité de metabolites produits, plus spécialement d'enzymes.
L'invention a également pour but l'application de ce procédé de culture à la sélection de souches bactériennes thermophiles, voire hyperthermophiles, anaérobies strictes, thiosulfato-réductrices, non sulfato-réductrices et à la production d'enzymes thermostables.
Elle vise également les nouvelles souches bactériennes et les enzymes obtenues par mise en oeuvre de ces techniques de culture, sélection et isolement.
Le procédé de culture de bactéries thermophiles et hyperthermophiles, anaérobies strictes, thiosulfato- réductrices, non sulfato-réductrices de l'invention est caractérisé en ce qu'on met en oeuvre, dans des conditions d' anaérobiose stricte, en l'absence d'apport extérieur d'hydrogène, un milieu de culture renfermant une source peptidique et/ou d'acides aminés, à raison d'au moins 1g/l de milieu de culture, au moins un sucre
et du thiosulfate comme agent de stimulation de croissance, qu'on récupère et qu'on purifie, si on le souhaite, les metabolites produits, en particulier les enzymes.
La source peptidique est avantageusement utilisée à raison d'au moins 2 g/l de milieu de culture, voire plus de 4 à 5 g/l.
En opérant dans ces conditions, le thiosulfate est réduit en sulfures lors du métabolisme de ces bactéries.
Cet effet du thiosulfate sur lequel repose l'invention se traduit par une amélioration significative des cinétiques bactériennes ainsi que des rendements cellulaires. On observe ainsi une diminution des temps de génération de l'ordre de 50 à 100 % et des rendements cellulaires améliorés d'environ 100 %.
Les résultats sont toujours très supérieurs à ceux observés en présence de soufre élémentaire.
Cet effet bénéfique se manifeste sur l'ensemble des sucres qu'utilisent ces bactéries, et notamment ceux en C6, tels que les sucres du type glucose (monomère de la cellulose ou de l'amidon), ou ceux en C5, tels le ribose ou du type xylose (monomère du xylane).
Cette stimulation, que l'on peut également observer lorsque les bactéries sont cultivées sur un polymère biologique tel que le xylane, est le résultat d'une déviation métabolique qui conduit à une production plus importante d'acétate en présence de thiosulfate, notamment au détriment du lactate et/ou de l'éthanol, en particulier pour les espèces du genre Thermoanaerobacter, ou à des phosphorylations non liées au substrat, notamment chez les bactéries hyperthermophiles de l'ordre des Thermotogales ( T. mari tima et T. neapoli tana,
respectivement déposées à la DSM sous les N°3109 et 4539).
En général, cette déviation du métabolisme s'accompagne d'une plus grande utilisation du substrat.
De plus, une amélioration notable de la croissance est observée sur glucose en présence de thiosulfate et résulte ici d'une plus grande production d'acétate au détriment de la L-alanine chez Thermosipho africanus (DSM N°5309), Fervido bacteri um islandicum (DSM N°9442), et Thermotoga elfii (DSM N°5733). La production de la L-alanine à partir du glucose chez les Thermotogales et dans le domaine des Bacteria en général a été démontré pour la premier fois par les inventeurs.
En plus, des sucres, on utilise également comme substrat de culture, conformément à l'invention, des peptides et/ou des acides aminés à raison d'au moins lg/1 de milieu de culture. Leur utilisation se trouve améliorée en présence de thiosulfate, dans les conditions de l'invention. On observe ainsi une augmentation de la densité cellulaire du milieu de culture et/ou une production d'acides gras volatils plus importante.
Des bactéries capables d'utiliser le thiosulfate dans les conditions définies ci-dessus, et ainsi d'être mises en oeuvre dans le procédé de l'invention, sont choisies parmi les Bacteria : les
Thermotogales et le genre Thermoanaerobacter.
Des bactéries de l'ordre des Thermotogales avantageusement mises en oeuvre comprennent en particulier les genres Fervidobacterium, Thermosipho et Thermotoga . Par extension, les bactéries Geotoga et
Petrotoga sont susceptibles d'avoir les mêmes propriétés.
Les Thermotogales ont comme habitat les sources thermales volcaniques d'origine marine ou terrestre, les
systèmes hydrothermaux profonds, les grands bassins artésiens et les eaux de gisements pétroliers.
Ces bactéries de l'ordre des Thermotogales, comme démontré selon l'invention, sont capables de réduire le thiosulfate en sulfures, ce qui n'avait pas été rapporté dans la littérature scientifique à ce jour. Ceci permet l'utilisation d'un produit plus soluble que le soufre élémentaire et donc pouvant être séparé aisément de la culture bactérienne.
Parmi les Bacteria, on citera le genre
Thermoanaerobacter.
Les bactéries du genre Thermoanaerobacter sont des anaérobies thermophiles, hétérotrophes, saccharolytiques et sont capables de réduire le thiosulfate en sulfure.
Elles ont comme habitat le sol, les jus d'extraction de betterave à sucre, les jus de canne à sucre, les sources thermales volcaniques et les puits de pétrole.
Parmi ces bactéries, on citera T. finnii, T. brockii, T. ethanolicus T. thermohydrosulfuricus et Thermoanaerobacter SEBR 5268.
L'addition du thiosulfate à des cultures de ces bactéries augmente significativement les rendements cellulaires, et ce d'au moins 50 % et même jusqu'à 300 % selon les souches. De même, les productivités cellulaires, en mg de cellules/litre/heure sont considérablement augmentées.
Des conditions avantageuses pour modifier, sous l'effet du thiosulfate, le métabolisme de ces bactéries vers des voies plus énergétiques, comprennent la réalisation de la culture à une température de l'ordre de 45 à 110°C, notamment de 60 à 90°C à un pH de 3 à 10, notamment de 6,5 à 8,0 pour les espèces neutrophiles, de
3 à 6,5 pour les espèces acidophiles, et de 8 à 10 pour les espèces alcalophiles.
On utilise de préférence le thiosulfate à raison de 1 à 100 mM, en particulier de 15 à 25 mM.
Le milieu de culture est inoculé avec environ au moins 10% p/v de milieu de culture.
Le procédé de culture de l'invention peut être réalisé en continu ou en discontinu.
L'invention vise également l'application du procédé de culture tel que défini ci-dessus à la sélection ou criblage de souches bactériennes thermophiles ou hyperthermophiles, anaérobies strictes, non sulfato-réductrices, à partir d'un milieu les contenant, et plus spécialement à la sélection de bactéries du type sus-indiqué productrices d'enzymes thermostables.
Ce procédé de sélection de souches bactériennes thermophiles, voire hyperthermophiles, est caractérisé par la culture de souches prélevées d'un milieu donné, dans des conditions d' anaérobiose stricte, en l'absence d'apport extérieur d'hydrogène, en présence de thiosulfate, sur support de peptides et/ou d'acides aminés, et de sucres, dans des conditions appropriées pour leur croissance.
Les souches seront sélectionnées à partir d'enrichissements réalisés en milieu liquide dans des conditions données (pH et température correspondant aux propriétés recherchées pour la souche) sur des substrats amenant des activités enzymatiques données.
Ces enrichissements permettent d'effectuer une sélection au sein d'une population bactérienne pour faire émerger un microorganisme donné.
Les colonies récupérées en milieu gélose seront purifiées par les techniques de dilution successives, en
anaérobiose, développées par Hungate R.E., 1969, dans "Methods in Microbiology", J.R. ,Norris et D.W. Ribbons, p.117-132, vol-3B, Académie. Press Inc. New York.
Grâce à ce procédé, il est possible de sélectionner, à partir d'un milieu donné, des souches thermophiles ou hyperthermophiles, alcalotolérantes ou alcalophiles, ou acidotolérantes ou acidophiles, selon les conditions de pH choisies.
L'invention permet en particulier de disposer de Thermotogales alcalophiles, alors que seules des Thermotogales neutrophiles ont été décrites à ce jour.
L'invention permet ainsi d'isoler des souches bactériennes strictement thiosulfato-réductrices, sulfuro-réductrices et non sulfato-réductrices, de l'ordre de Thermotogales en particulier.
Selon un aspect de grand intérêt, le procédé de criblage de l'invention, permet de sélectionner des bactéries strictement thiosulfato-réductrices, non sulfuro-réductrices, et non sulfato-réductrices, de l'ordre de Thermotogales en particulier.
De telles souches sont nouvelles et entrent, en tant que telles, dans le cadre de l'invention.
Selon un autre aspect présentant un intérêt majeur, le procédé de sélection de l'invention permet de rechercher des souches bactériennes ayant une activité enzymatique donnée, en particulier des souches bactériennes xylanolytiques, protéolytiques, lipasiques, amylolytiques ou cellulolytiques.
On notera que l'obtention de telles populations bactériennes se démarque d'autant plus de l'état de la technique que jusqu'à ce jour, les Thermotogales ont été décrites comme étant sulfuro-réductrices, excepté pour l'espèce Thermotoga thermarum incapable d'utiliser le
soufre, et dont les propriétés thiosulfato-réductrices n'avaient pas été mises en évidence.
La sélection de souches bactériennes opérée conformément à l'invention est effectuée à partir de biotopes divers, tels que les grands bassins artésiens, australiens et indiens, les systèmes hydrothermaux profonds, les eaux de gisements pétroliers ou les écosystèmes d'origine volcanique, terrestre ou marine.
D'une manière générale, l'effet stimulant sur la croissance bactérienne, en présence de thiosulfate, rapporté ci-dessus, s'accompagne en outre d'une amélioration de l'activité enzymatique totale.
L'invention fournit donc aussi des moyens d'obtention d'enzymes thermostables en quantités élevées, ce qui permet d'envisager une exploitation industrielle, dans les nombreux secteurs qui ont recours à des technologies enzymatiques à haute température et de répondre à des besoins non satisfaits à ce jour.
L'invention vise donc également un procédé de production d'enzymes thermostables, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de bactéries thermophiles ou hyperthermophiles dotées d'une activité enzymatique donnée, dans des conditions d'anaérobiose stricte, en l'absence d'apport extérieur d'hydrogène, en présence de thiosulfate, sur substrat peptidique et/ou d'acides aminés et de sucres, de manière à obtenir la production des enzymes recherchées, et la récupération de ces enzymes du milieu de culture, suivie de leur purification si on le souhaite.
Avec les systèmes amplificateurs constitués par les milieux de culture renfermant du thiosulfate, il est ainsi possible de produire, en grandes quantités, divers enzymes thermostables d'intérêt dans des secteurs variés.
En variante, ces enzymes peuvent être exprimées, selon les techniques classiques de biologie moléculaire dans des microorganismes, par exemple des microorganismes mésophiles comme Escherichia coli et Bacillus sp.
Les enzymes obtenues sont avantageusement soumises à au moins une étape de purification, en vue de leur utilisation.
A titre d'exemple, la purification de xylanases à partir de culots cellulaires ou des surnageants obtenus après centrifugation, comprendra les étapes de précipitation au sulfate d'ammonium, de passage sur DEAE- Sépharose, d'élution de l'activité xylanase par gradient NaCl, de passage sur colonne échangeuse d'ions et le cas échéant de passage sur colonne d'hydroxyapatite.
Ces étapes seront naturellement modifiées en fonction des propriétés propres de l'enzyme et d'autres méthodes sont aisément accessibles à l'homme de l'art pour purifier les différentes enzymes obtenues.
L'invention fournit ainsi des enzymes, telles que des amylases, glucoamylases, glucoisomérases et pullulanases, utilisables pour la transformation de l'amidon (amidonnerie et glucoserie), des xylanases pour le blanchiment de la pâte à papier, des protéases, pectinases, amylases, cellulases, lipases pour la détergence, des amylases et protéases pour le désencollage dans l'industrie textile et des protéases pour le décreusage de la soie.
On citera également d'autres exemples d'enzymes: glucose isomérase, xylose isomérase, cellobio hydrolase, pullulanase, amylosaccharidase, hydrogénases et alcool deshydrogenases, ces dernières permettant de modifier la chiralité d'isomères et donc de conduire à des produits actifs par exemple en pharmacie.
On mesurera que certaines de ces enzymes sont des produits nouveaux, en raison notamment de leurs caractéristiques de stabilité à haute température et le cas échéant de leurs propriétés alcalines ou acides. De telles enzymes font donc également partie de l'invention.
En opérant dans des conditions acides, on isole des enzymes thermostables acides, par exemple des amylases acides. Au contraire, la mise en oeuvre de conditions de pH alcalines, permet de disposer, à partir de cultures de souches alcalotolérantes ou alcalophiles, d'enzymes alcalines thermostables de grand intérêt dans certains secteurs d'applications.
Ainsi, la culture, dans les conditions de l'invention, de Thermotogales alcalophiles permet de produire de grandes quantités de xylanases alcalophiles utilisables pour le blanchiment de la pâte à papier ou encore pour la libération de sucres simples en C5 dans l'alimentation animale.
L'invention permet notamment la production d'enzymes thermostables qui, le cas échéant, ne peuvent pas s'exprimer sous leur forme active via un clonage génétique chez d'autres organismes.
On notera à cet égard que même si ll clonage est possible, les protéines synthétisées par des microorganismes recombinés pourraient ne plus posséder les propriétés enzymatiques de l'organisme originel.
De plus, il a été démontré, dans le cadre de l'invention, en ce qui concerne par exemple les xylanases des organismes thermophiles étudiés, qu'elles étaient liées en grande partie à la paroi bactérienne, ce qui facilite leur récupération.
Pour illustrer l'invention définie ci-dessus, on rapporte à présent des exemples de culture de
bactéries thermophiles et hyperthermophiles en présence de thiosulfate.
Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 7, qui représentent respectivement,
- les figures 1 et 2, la croissance de T. finnii respectivement sur glucose et xylose, avec ou sans thiosulfate,
- la figure 3, l'effet du thiosulfate sur la croissance de plusieurs bactéries de l'ordre des Thermotogales,
- la figure 4, les activités xylanolytiques de bactéries de l'ordre des Thermotogales et du genre Thermoanaerobacter, et
- la figure 5, les activités xylanolytiques sur xylane et xylose, avec ou sans thiosulfate chez
Thermotoga SEBR 2665, et
- les figures 6 et 7, l'effet du thiosulfate sur l'oxydation de bio-trypcase R par T. brockii et T. ethanolicus, respectivement.
Exemple 1 : Culture de bactéries du genre Thermoanaerobacter sur glucose ou xylose.
On rapporte les résultats obtenus avec les souches T. finnii (DSM nº 3389) et Thermoanaerobacter SEBR 5268.
T. finnii a été obtenu auprès de la Collection allemande de microorganismes DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen à Braunschweig (Allemagne).
La souche Thermoanaeroiacter SEBR 5268 a été isolée d'une eau de gisement pétrolier en France en utilisant le milieu de culture suivant (g/l) : NH4CI, 1 ; K2HPO4, 0,3 ; KH2PO4, 0,3 ; MgCl2, 6H2O, 1,3 ; CaCl2. 2H2O, 0,1 ; KCl, 0,2 ; CH3COONa 3H2O, 0,5 ; NaCl, 2; bio- trypease R (bioMérieux, France), 5; extrait de levure (Difco Lab., Détroit, Mien.), 5; glucose, 10
Resazurine, 1 mg ; Cystéine-HCl, 0,5 ; Solution minérale de Balch, 10 ml. Le pH a été ajusté à 7,0 avec une solution de KOH 10 M. Le milieu a été préparé en anaérobiose avec N2 : CO2 (80/20) dans la phase gazeuse. Après stérilisation (110ºC, 40 mn), 0,2 ml de Na2S. 9H2O (2 %), 1 ml de NaHCO3 (10 %), 0,1 ml d'une solution de vitamines de Widdel et 0,1 ml d'une solution de dithionite de sodium (0,2 %) sont ajoutés stérilement pour 20 ml de milieu.
La purification de cette souche a été réalisée en utilisant la méthode de dilution en milieu gélose développée par Hungate.
Toutes les expériences ont été réalisées à 60ºC dans un milieu de base supplémente en extrait de levure 1 g/l, tel que décrit par Fardeau et al dans FEMS Microbiol. Lett., 1993, 113, 327-332.
Les techniques anaérobies de Hungate ont été mises en oeuvre pour la réalisation de toutes ce expériences. Ces techniques sont décrites dans Methods in
Microbiology (Norris J.R., Ribbons D.W., Eds.) vol 3B, pp 117-132. Académie Press, London.
Après avoir préparé le milieu anaérobie, 5 ml ou 20 ml du milieu liquide sont répartis dans des tubes de Hungate ou dans des flacons sérum de 50 ml respectivement sous courant d'azote dépourvu d'oxygène.
Techniques d'analyse.
Les mesures de densité optique, de sulfure d'hydrogène, d'hydrogène et d'acides gras volatils sont analysés comme décrit dans l'article de Fardeau et al ci- dessus.
On rapporte dans le tableau 1 les temps de division et la densité optique maximale obtenus avec ces
L'examen de ce tableau montre que l'apport de thiosulfate permet de réduire le temps de division chez T. finnii de 6 h à 3 h 30. Les rendements cellulaires du genre Thermoanaerobacter augmentent de 30 à 200 %, avec une moyenne de l'ordre de 100 %.
Cet effet bénéfique est observé avec les deux types de substrats chez le genre Thermoanaerobacter, comme illustré par les figures 1 et 2 qui donnent la densité optique à 580 nm en fonction du temps en heures. Les courbes
- - correspondent à l'utilisation de glucose ou de xylose avec du thiosulfate et les courbes
- - à celle du glucose ou du xylose seuls.
L'étude des metabolites produits dans une culture de T. finnii sur glucose avec ou sans thiosulfate montre les modifications du métabolisme de la bactérie.
Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 2 où "M" dans la première colonne signifie
"milieu de culture" et "Thio", thiosulfate à 20 mM.
La déviation métabolique induite par le thiosulfate conduit à une production plus forte d'acétate au détriment du lactate et/ou de l'éthanol.
Exemple 2. : Culture de bactéries appartenant aux Thermotogales .
La culture est réalisée dans un milieu constitué par 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de biotrypcase R, 20 mM/l de glucose et 5g/l de NaCl lorsqu'on utilise Thermosipho africanus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana et Thermotoga SEBR 2665.
Avec Fervidoiacterium islandicum, on utilise un milieu renfermant 1 g/l de NaCl au lieu de 5 g/l comme précédemment, les autres constituants étant utilisés dans les mêmes proportions.
Toutes ces souches proviennent de la collection allemande de micro-organismes (DSM), excepté Thermotoga
SEBR 2665 isolée d'une eau de gisement pétrolier, en anaérobiose, en utilisant les techniques de dilutions successives en milieu solide développées par Hungate.
On indique dans le tableau 3 suivant la quantité en mM de sulfures produits, les densités optiques maximales et les productivités cellulaires en mg de cellules poids sec.1-1.h -1.
Pour le calcul des productivités cellulaires, on admet qu'une unité D.0. correspond à 0,5 g de cellules poids sec. par litre.
u a u 3 2 2 3 8
L'effet du thiosulfate sur la croissance de T. marltima est illustré par la figure 3 qui donne la variation de la densité optique à 580 nm en fonction du temps en heures.
La courbe
- ■ - correspond à l'utilisation d'un milieu de base contenant 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de biotrypcase et 20 mmole/l de glucose, les autres courbes correspondant à l'utilisation de ce milieu additionné de 2 % de soufre élémentaire pour la courbe -
- de thiosulfate à raison de 20 mmole/l pour la courbe
- ♦ - ou de sulfate à raison de 20 mmole/l pour la courbe -
- ♢ -
La température d'incubation est dans chaque cas de 70ºC.
Cette figure met en évidence l'augmentation des rendements cellulaires. Ces résultats lorsqu'on utilise du thiosulfate sont toujours supérieurs à ceux observés en présence de soufre élémentaire.
Exemple 3 : Etude de l'effet de l'addition de thiosulfate sur l'activité enzymatique.
On rapporte dans cet exemple illustré par les figures 4 et 5 les résultats obtenus avec des bactéries de l'ordre des Thermotogales et du genre rJienπoanaeroiacter.
Ces résultats concernent l'activité xylano- lytique en u/ml de culots remis en suspension.
La figure 4 donne les valeurs obtenues après 92 heures de culture sur xylane à 10 ºC, sans thiosulfate
et avec 20 mM de thiosulfate
avec Thermotoga maritima , Thermotoga neapolltana, Thermotoga sp. SEBR 2665, et Thermoanaerobacter brockll .
Dans la figure 5, les activités xylanolytiques, mesurées à pH 6, 5 et à 75ºC sont données en fonction du temps pour des cultures de Thermotoga SEBR 2665 sur xylose
20 mM
sur xylane ◇
L'examen de ces courbes met en évidence une amélioration de l'activité xylanolytique, exprimée en u/ml de cellules resuspendues de l'ordre de 100 % et même plus pour certaines souches, notamment en ce qui concerne Thermotoga neapolltana.
Ces résultats montrent clairement que l'amélioration des activités enzymatiques, dans le cadre d'études effectuées sur le xylose, est directement liée à celle de la croissance bactérienne.
Exemplp. 4 : Culture de bactéries thermophiles sur substrats peptides et/ou acides aminés.
Souches
Thermoanaerobacter thermohydrosulf urlcus ( DSM Nº 567), T. brockll (DSM nº 1457), T. flnnli (DSM Nº 3389) et T. ethanollcus (DSM Nº 2246) ont été obtenues auprès de la DSM.
La souche SEBR 5268 correspond à celle indiquée dans l'exemple 1.
Milieux de culture
On opère dans les conditions rapportées dans l'exemple 1, mais les produits suivants ont été ajoutés : thiosulfate, casamino acides (Difco, EUA), gélatine (Sigma, EUA) et les peptones bio-Trypcase R (bioMérieux, France), peptone pancréatique, (Prolabo, France), bactopeptone R (Difco, EUA), bio-gélytoneR (bio Mérieux,
France), peptone papaïnique de soja (Institut Pasteur, Production, France).
On rapporte dans les tableaux 4 à 6 les résultats obtenus relatifs à l'effet du thiosulfate sur 1 'oxydation de peptides et d' acides aminés respectivement par les souches SEBR 5268, T. flnnll et Ther moanaero- iacter sp brockll, T. Thermohydrosulfuricus et T. ethanolicus .
Ces résultats correspondent à une incubation de 3 jours à 60ºC avec addition de peptides, de casamino acides ou de gélatine à raison de 5 g par litre. Le milieu de base utilisé renferme un gramme par litre d'extrait de levure comme indiqué ci-dessus et du thiosulfate à raison de 20 mM.
Dans ces tableaux, Thio signifie thiosulfate
20 mM ; Casa, casamino acides, Biot, la bio trypcase R, Pap, une peptone papaïnique de soja, Pan, une peptone pancréatique, Bact, la bactopeptone, Biogel, la biogélytone ; et Gel, la gélatine.
Comme le montrent les résultats rapportés dans les tableaux 4 et 5, les acides aminés et les peptides de différentes sources biologiques sont utilisés de manière plus efficace lorsqu'on ajoute du thiosulfate au milieu.
En présence de thiosulfate, on observe une augmentation de la densité optique et/ou de la production d'acides gras volatils comme l'acétate, le propionate, l'iso-butyrate, et l'iso-valérate. Au contraire, ces activités sont limitées en l'absence de thiosulfate.
Les tableaux 4, 5 et 6 montrent que l'ensemble des isolats sont capables d'utiliser de manière significative les peptides et les acides aminés.
L'examen de ces trois tableaux montre pour ces souches de Thermoanaerobacter, en même temps qu'une croissance améliorée et une augmentation de la production d'acides gras, également une production de sulfure et une diminution des niveaux d'hydrogène.
L'effet du thiosulfate sur l'oxydation de la bio-trypcase R par T. brockll et T. ethanolicus est illustré par les figures 6 et 7. Ces figures donnent respectivement, en fonction du temps en heures, la variation de la production d'acides gras volatils ( acétate☐; isobutyrate ■ ; isovalérate▲; propionate(O) et celle de la production de H2 ( O ) et de H2S
(☐).
Ces résultats mettent donc en évidence pour la première fois, que les membres du genre The rmoanaerobacter font une meilleure utilisation des peptides et des acides aminés en présence de thiosulfate.
Leur aptitude à croître sur des substrats tels que les acides aminés et/ou les peptides en présence de thiosulfate indique qu'ils peuvent croître par mixotrophie, puisque utilisant à la fois l'hydrogène et un substrat organique. Tous les membres du genre
Thermoanaerobacter étudiés sont en effet, stimulés par le thiosulfate et la réduction ultérieure du thiosulfate durant la fermentation des acides aminés et/ou des peptides, qui se traduit par une augmentation en sulfure d'hydrogène. On a de plus déjà rapporté que les membres du genre Thermoanaerobacter sont capables d'oxyder l'hydrogène en présence de thiosulfate, ce qui signifie que les hydrogénases pourraient jouer un rôle dans le procédé de réduction du thiosulfate.
Claims
REVENDICATIONS
1) Procédé de culture de bactéries thermophiles et de bactéries hyperthermophiles, anaérobies strictes, non sulfato-réductrices, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre, dans des conditions d'anaérobiose stricte, en l'absence d'apport extérieur d'hydrogène, un milieu de culture renfermant une source peptidique et/ou d'acides aminés, à raison d'au moins lg/1 de milieu de culture, au moins un sucre, et du thiosulfate comme agent de stimulation de croissance.
2) Procédé de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source peptidique et/ou d'acides aminés est utilisée à raison d'au moins 2 g/l.
3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de récupération des metabolites produits pendant la culture, en particulier des enzymes, suivie le cas échéant d'une étape de purification.
4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise des bactéries choisies parmi les Bacteria avec les membres du genre Thermoanaerobacter ou de l'ordre des Thermotogales.
5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre des Thermotogales, notamment comme celles des genres Fervidobacterium, Thermosipho et Thermotoga, Geotoga et Petrotoga.
6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la culture est réalisée à une température de l'ordre de 45 à 110°C, notamment de 60 à 90°C, à un pH de 3 à 10, notamment de 6,5 à 8 pour les espèces neutrophiles, de 3 à 6,5 pour les espèces acidophiles et de 8 à 10 pour les espèces alcalophiles,
le thiosulfate étant mis en oeuvre à raison de 1 à 100 mM, en particulier de 15 à 25 mM.
7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est réalisé en continu ou en discontinu.
8) Procédé de sélection de souches bactériennes thermophiles ou hyperthermophiles, anaérobies strictes, non sulfato-réductrices, caractérisé par la culture d'un isolât de souches provenant d'un milieu donné, dans des conditions d'anaérobiose stricte, en l'absence d'apport extérieur d'hydrogène, dans un milieu de culture renfermant une source peptidique et/ou d'acides aminés/ au moins un sucre, dans des conditions appropriées pour leur croissance, en particulier telles que définies dans la revendication 6, l'isolement des souches sélectionnées à partir d'enrichissements en milieu liquide sur des substrats amenant des activités enzymatiques données, la récupération des colonies formées, et leur purification si souhaité.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé par l'isolement de souches bactériennes alcalotolérantes ou alcalophiles, ou acidotolérantes ou acidophiles, en fonction du pH du milieu de culture.
10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé par l'isolement de souches du domaine des
Bacteria, en particulier du genre Thermoanaerobacter ou de l'ordre des Thermotogales.
11) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est appliqué à l'isolement de bactéries strictement thiosulfato-réductrices, non sulfuro-réductrices et non sulfato-réductrices, de l'ordre des Thermotogales.
12) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est appliqué à l'isolement de
bactéries strictement thiosulfato-réductrices, sulfuro- réductrices et non sulfato-réductrices, de l'ordre des Thermotogales.
13) Procédé selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisé en ce qu'il est appliqué à l'isolement de souches bactériennes ayant une activité enzymatique telle que xylanolytique, protéolytique, amylolytique, lipasique ou cellulolytique.
14) Procédé de production d'enzymes thermostables, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de bactéries thermophiles ou hyperthermophiles en présence de thiosulfate, sur substrat peptidique et/ou d'acides aminés et de sucres, en l'absence d'apport extérieur d'hydrogène, en particulier, selon les conditions définies dans la revendication 6, le cas échéant à partir de souches bactériennes telles qu'isolées selon le procédé de l'une des revendications 8 à 12, et la récupération de ces enzymes du milieu de culture, suivie de leur purification si on le souhaite.
15) Les enzymes telles qu'obtenues par le procédé selon la revendication 14, le cas échéant purifiées.
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Cited By (1)
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| DE102011114630A1 (de) * | 2011-10-06 | 2013-04-11 | Enamul Hoque | Immun-Stimulation und Wachstumsförderung durch Protein- bzw. Stoffwechselregulation, insbesondere Aktivierung von Entgiftungsenzymen mittels Thiosulfat |
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| FR2143672A1 (fr) * | 1971-05-20 | 1973-02-09 | Merck & Co Inc |
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1994
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- 1995-07-28 WO PCT/FR1995/001022 patent/WO1996004366A1/fr active Application Filing
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| DFPE | Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101) | ||
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