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WO1996006186A2 - FRAGMENTS NUCLEOTIDIQUES CAPABLES DE S'HYBRIDER SPECIFIQUEMENT A L'ADNr ou ARNr DES RICKETTSIA ET LEUR UTILISATION COMME SONDES OU AMORCES - Google Patents

FRAGMENTS NUCLEOTIDIQUES CAPABLES DE S'HYBRIDER SPECIFIQUEMENT A L'ADNr ou ARNr DES RICKETTSIA ET LEUR UTILISATION COMME SONDES OU AMORCES Download PDF

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WO1996006186A2
WO1996006186A2 PCT/FR1995/001114 FR9501114W WO9606186A2 WO 1996006186 A2 WO1996006186 A2 WO 1996006186A2 FR 9501114 W FR9501114 W FR 9501114W WO 9606186 A2 WO9606186 A2 WO 9606186A2
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WO
WIPO (PCT)
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nucleotide
ending
starting
sequence
fragment
Prior art date
Application number
PCT/FR1995/001114
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English (en)
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WO1996006186A3 (fr
Inventor
Claude Mabilat
Didier Raoult
Original Assignee
Bio Merieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Merieux filed Critical Bio Merieux
Priority to CA002174753A priority Critical patent/CA2174753C/fr
Priority to EP95928539A priority patent/EP0724649A1/fr
Priority to US08/632,470 priority patent/US5976791A/en
Publication of WO1996006186A2 publication Critical patent/WO1996006186A2/fr
Publication of WO1996006186A3 publication Critical patent/WO1996006186A3/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Nucleotide fragments capable of specifically hybridizing to the rDNA or rRNA of Rickettsia and their use as probes or primers.
  • the present invention relates to the field of techniques for detecting and / or identifying bacteria of the genus Rickettsia and more particularly to those using a genetic marker.
  • Rickettsiae are gram negative bacteria which belong to the order of Rickettsiales and to the family of Rickettsiaceae including in particular the subfamily of Rickettsieae sub divided into three genera: Coxiella, of which the only known species is Coxiella burnetti; Rickettsia, grouping all the other pathogenic species for humans and animals; and Rochalimea.
  • the genus Rickettsia comprises three subgroups: the typhus group to which R belongs. typhi responsible for endemic typhus, R.
  • prowazekii responsible for epidemic typhus and R.
  • rickettsii R. siberica, R. conorii, R. australis, R. akari, R. montana and R. rhipicephal ⁇ .
  • Rickettsiae are parasitic intracellular bacteria that multiply in the nucleus and cytoplasm of host cells for strains of the eruptive fevers group and in the cytoplasm of these cells for strains of other groups. Transmission of the bacteria to humans takes place via blood-sucking insects such as the tick for R. tsutsugamushi (rickettsia of the group of eruptive fevers), the louse for R. prowazekii or the chip for R. typhi, during a blood meal followed by excrement at the site of the bite. Epidemic typhus due to R. prowazekii characterized by high fever, severe headache, generalized rash has now become a disease rare.
  • Murine typhus, or endemic typhus, caused by R. typhi is widespread worldwide.
  • the rat is the reservoir and its presence conditions the appearance of the disease in humans.
  • the infection is characterized by headache, myalgia and fever, but most often the disease is mild.
  • Some of the rickettsial infections associated with the eruptive fevers group can have a fatal outcome for the patient or at least be accompanied by severe complications such as rayocarditis, phlebitis, meningeal syndrome, encephalitis, myelitis and coma.
  • Bush typhus is an acute febrile illness with the causative agent R. tsutsugamushi.
  • the disease is characterized by a rise in temperature and significant headache, which may be associated with pneumonia during the first week of the disease.
  • the disease can damage the central nervous system, with clinical manifestations such as delirium, stupor and muscle fibrillation.
  • the mortality rate varies from 1 to 60% depending on the geographic region. It is particularly high in Southeast Asia, Korea, Australia, Japan and India.
  • the present invention relates to a technique for diagnosing infections due to bacteria of the genus Rickettsia, and more particularly those due to R. tsutsugamushi, using a genetic marker in a detection method by hybridization of nucleic acids, combining specificity, sensitivity and rapidity.
  • the ribosomal RNA of bacteria is used as a target. Indeed, this molecule is found in abundance in all cells of all living organisms. Furthermore, it presents a particular nucleotide sequence made up of a succession of regions characterized by a variable rate of evolution.
  • RNA molecules referenced rRNA (s) 5S, 16S and 23S. Historically, these names have been chosen by reference to their sedimentation rate which reflects the size of these RNA molecules. However, the actual size of these ribosomal constituents varies considerably, for a given type, from one cellular organism to another. Nevertheless, the terminology rRNA 5S, 16S and 23S is used to designate the RNA molecules constituting the ribosomes in all bacteria.
  • a nucleotide fragment or an oligonucleotide is a sequence of nucleotide patterns assembled together by phosphoric ester bonds, characterized by the informational sequence of natural nucleic acids, capable of hybridizing to a nucleotide fragment under predetermined conditions, the sequence being able to contain monomers of different structures and be obtained from a natural nucleic acid molecule and / or by genetic recombination and / or by chemical synthesis,
  • a motif is derived from a monomer which may be a natural nucleotide of nucleic acid, the constituent elements of which are a sugar, a phosphate group and a nitrogenous base; in DNA the sugar is deoxy-2-ribose, in RNA the sugar is ribose; depending on whether it's DNA or RNA, the nitrogen base is chosen from adenine, guanine, uracil, cytosine, thymine; or the monomer is a nucleotide modified in at least one of the three constituent elements; by way of example, the modification may take place either at the base level, with modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2, 6- purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base capable of hybridization, either at the sugar level, not for example the replacement of at least one deoxyribose by a polyamide (PE Nielsen
  • information sequence means any ordered sequence of nucleotide type patterns, the chemical nature and order in a reference direction of which constitute information of the same quality as that of natural nucleic acids,
  • hybridization is meant the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments, having sufficiently complementary sequences are capable of forming a double strand with stable and specific hydrogen bonds.
  • a nucleotide fragment "capable of hybridizing" with a polynucleotide is a fragment which can hybridize with said polynucleotide under hybridization conditions, which can be determined in each case in known manner.
  • the hybridization conditions are determined by the stringency, that is to say the rigor of the operating conditions. Hybridization is all the more specific as it is performed at higher stringency. Stringency is defined in particular as a function of the base composition of a probe / target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids.
  • the Stringency can also be a function of the parameters of the reaction, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the hybridization temperature.
  • the stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be carried out will depend mainly on the probes used. All these data are well known and the appropriate conditions can be determined by a person skilled in the art. In general, depending on the length of the probes used, the temperature for the hybridization reaction is between about 20 and 65 ° C, in particular between 35 and 65 ° C in saline at a concentration of about 0.8 to 1M.
  • a probe is a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 monomers, in particular from 6 to 35 monomers, having a specificity of hybridization under determined conditions to form a hybridization complex with a nucleotide fragment having, in the present case, a nucleotide sequence included in a ribosomal RNA, the DNA obtained by reverse transcription of said ribosomal RNA and the DNA (here called ribosomal DNA or rDNA) of which said ribosomal RNA is the product of transcription; a probe can be used for diagnostic purposes (in particular capture or detection probes) or for therapy purposes,
  • a capture probe is immobilized or immobilizable on a solid support by any suitable means, that is to say directly or indirectly, for example by covalence or adsorption,
  • a detection probe can be labeled by means of a marker chosen from radioactive isotopes, enzymes (in particular a peroxidase, an alkaline phosphatase, or an enzyme capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate), chemical compounds chromophores, chromogenic compounds, fluorescent or luminescent, analogs of nucleotide bases, and ligands such as biotin,
  • a primer is a probe comprising from 5 to 100 nucleotide units and having a specificity of hybridization under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an amplification technique such as PCR (Polymerase Chain Reaction), in a sequencing process, in a reverse transcription method, etc., - the homology characterizes the degree of similarity of two compared nucleotide fragments,
  • the probes and primers according to the invention are those whose sequences are identified below, as well as the analogs of these probes or primers which are those whose sequences have at least 70% homology, and at least 5 nucleotide units of identical information sequence with the latter. Such sequences are here called "homologous sequences”.
  • the probes according to the invention used for diagnostic purposes can be used in all known hybridization techniques and in particular point-in-time deposition techniques on a filter called "DOT-BLOT” (MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), DNA transfer techniques called “SOUTHERN BLOT” (SOUTHERN. EM, J. Mol. Biol.,, 503 (1975), RNA transfer techniques called “NORTHERN BLOT", or SANDWICH techniques (DUNN AR, HASSEL JA, Cell, 12, 23 (1977)); in particular the SANDWICH technique is used, with a specific capture probe and / or a specific detection probe, it being understood that the capture probe and the detection probe must have at least partially different nucleotide sequences.
  • DOT-BLOT MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982
  • DNA transfer techniques called "SOUTHERN BLOT” (SOUTHERN. EM, J. Mol. Biol.,, 503 (1975),
  • Another application of the invention is a therapy probe for treating infections caused by bacteria of the genus Rickettsia, said probe being capable of hybridizing in vivo to the 16S ribosomal RNA of said bacteria and / or to genomic DNA for block them translation and / or transcription and / or replication phenomena.
  • the appended figure represents the rDNA sequences corresponding to the 16S rRNA of various bacteria of the genus Rickettsia, the list of which appears after the experimental part below.
  • the subject of the present invention is in particular a single-stranded nucleotide fragment capable of hybridizing with the AD r or the rRNA of Rickettsia and not with the AD r or with the rRNA of non-Rickettsia.
  • the single-stranded nucleotide fragment is not capable of specifically hybridizing to the rDNA or rRNA of Cowdria ruminantium, Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma marginalale, Wolbachia pipientis, Ehrlichia risticii, Rochalimea quintana and Coxiella burnatti.
  • the single-stranded nucleotide fragment of the invention has a nucleotide sequence of at least 5 consecutive nucleotides chosen from the following sequences: starting at nucleotide No. 130 and ending at nucleotide No. 170 starting at nucleotide No. 181 and ending at nucleotide No.
  • the invention relates in particular to single-stranded nucleotide fragments having a sequence of at least 8, and in particular of at least 10, consecutive nucleotides chosen from the sequences mentioned above (or from complementary sequences).
  • the invention extends to any nucleotide fragment sufficiently homologous to a fragment as defined above to be able to hybridize specifically with the rDNA or rRNA of Rickettsia.
  • nucleotide sequences of the fragments of the invention are chosen from the sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 22, described at the end of the description, or their complementary sequences.
  • the numbering of the 16S rRNA sequence of R. rickettsii, applied to the sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 22 above, does not always reflect the number of nucleotides or monomers constituting these sequences due to variations in size existing between the sequences and the 16S rRNA sequence of R. rickettsii.
  • the variations are due to natural insertions or deletions in the genetic material.
  • the fragments of the invention are fragments of DNA, but they can also be single-stranded fragments of RNA, or their complementary fragments, as well as single-stranded fragments of genomic DNA whose products of transcription are the aforementioned RNA fragments, or their complementary fragments.
  • the single-stranded nucleotide fragments of the invention can be used in particular as probes, in particular as capture or detection probes, according to known hybridization techniques.
  • the specific probes of the Rickettsia genus are in particular those having a sequence chosen from the sequences: starting at nucleotide No. 181 and ending at nucleotide No. 201 starting at nucleotide No. 284 and ending at nucleotide No.
  • tsutsugamushi are in particular those having a sequence chosen from the sequences: starting at nucleotide N ° 130 and ending at nucleotide N ° 170 starting at nucleotide N ° 241 and ending at nucleotide N ° 272 starting at nucleotide N ° 299 and ending at nucleotide N ° 315 starting at nucleotide N ° 334 and ending at nucleotide N ° 357 starting at nucleotide N ° 460 and ending at nucleotide N ° 481 starting at nucleotide N ° 504 and ending at nucleotide N ° 536 starting at nucleotide N ° 550 and ending at nucleotide N ° 570 starting at nucleotide N c 661 and ending at nucleotide N ° 684 starting at nucleotide N ° 710 and ending at nucleotide N c 739 starting at nucleot
  • Another subject of the invention is a therapy probe for the treatment of infections caused by bacteria of the genus Rickettsia and in particular a therapy probe for the treatment of infections caused by a specific species of Rickettsia, both comprising the following: minus a single-stranded nucleotide fragment as defined above.
  • Another subject of the invention is a primer for the specific reverse transcription into a DNA sequence complementary to a 16S ribosomal RNA sequence of Rickettsia belonging either to a region conserved only among the Rickettsia, or to a specific region of the species R.
  • tsutsugamushi or a primer, in particular for the specific amplification of a DNA or RNA sequence complementary to or homologous to the 16S ribosomal RNA sequence of the Rickettsia, belonging either to a region region conserved only among the Rickettsia, or to a specific region of species R. Tsutsugamushi.
  • a primer comprises or consists of a single-stranded nucleotide fragment as defined above.
  • the invention also relates to a reagent for detecting and / or identifying at least one species of Rickettsia in a biological sample comprising at least one probe of the invention, and in particular a capture probe and / or a detection probe responding to the definition of a probe given above.
  • the reagent can include a mixture of probes.
  • the invention provides a method for detecting and / or identifying at least one Rickettsia species in a biological sample according to which either ribosomal RNA, in particular 16S rRNA, extracted from rickettsiae and possibly denatured, is brought into contact, either the genetic DNA, extracted and denatured, from the bacteria, or else the DNA obtained from the reverse transcription of the 16S ribosomal RNA, with at least one probe of the invention, then any hybridization is detected of said probe, in a manner known per se.
  • ribosomal RNA in particular 16S rRNA, extracted from rickettsiae and possibly denatured
  • hybridization should be carried out under sufficiently discriminating conditions (stringency) so that the hybridization of at least one of the probes is specific. If desired, before exposing the nucleic acid to the probe of the invention, an amplification of this is carried out. nucleic acid in the presence of a suitable enzymatic system and at least one amplification primer of the invention.
  • the invention relates in particular to a method for detecting and / or identifying Rickettsia in a biological sample, characterized in that it comprises: a- bringing said sample into contact with at least one single-stranded nucleotide fragment as defined above above, under predetermined conditions which allow said fragment to hybridize to the rDNA or to the rRNA of a bacteria of the genus Richettsia, if it is present; and b- the detection of said hybrid as an indicator of the presence of Rickettsia in the sample.
  • the predetermined hybridization conditions are those which allow specific hybridization.
  • the amplification products obtained were purified on magnetic beads marked with streptavidin (Dynabead M-280; Dynal Inc., N.Y.) and sequenced using the technique recommended in the commercial kit "Autoread sequencing kit".
  • Hybridization of the ribosomal RNA of a target bacterium was carried out according to the non-radioactive and semi-automated detection method described in French patent n c 90 07249 and modified for the detection of ribosomal RNA by the addition destabilizing.
  • This destabilizer (which is a capture probe, starting at nucleotide No. 940 and ending at nucleotide No. 970 of the sequence of R. Tsutsugamuchi (referenced 23 in the appended figure)) and an oligonucleotide-enzyme detection conjugate (1 ' oligonucleotide corresponding to the probe defined at the beginning of this example) are used.
  • RNA from Gram-positive bacteria described in "Current Protocols in Molecular Biology" 1987, Ausubel FM et al., Wiley interscience, New York.
  • a microtiter plate (Nunc 439454) is deposited a solution of 1 ng / ⁇ l of the capture oligonucleotide whose 5 'end reacted with the reagent Aminolink 2 (Applied Biosystems, Foster city, California) in PBS 3X (0.45 M NaCl 0.15 M sodium phosphate pH 7.0).
  • the plate is incubated for 2 h at 37 ° C. and then washed 3 times with 300 ⁇ l of PBST (PBS lx, Tween 20: 0.5 ° / o ⁇ (Merck 822184)).
  • PBST PBS lx, Tween 20: 0.5 ° / o ⁇ (Merck 822184)
  • the Aminolink 2 reagent makes it possible to add an arm comprising a 6-aminohexyl group to the 5 ′ end of the " probe.
  • the probe thus coupled to a ligand having a polar group (primary amine), and passively attached to the support, provides an improved signal; see application FR 91 09057.
  • the target consisting of 10 ⁇ l of total RNA extract is mixed with 40 ⁇ l of salmon PBS buffer (PBS-3X + salmon sperm DNA 10 ⁇ g / ml (Sigma D 9156)).
  • the whole is added to the well to 50 ⁇ l of a solution of the oligonucleotide-peroxidase conjugate, constituting the detection probe, at a concentration of 0.1 ng / ⁇ l in oligonucleotide in a PBS-horse buffer (PBS 3X + 10% serum horse (BioMérieux 55842)).
  • PBS-horse buffer PBS 3X + 10% serum horse (BioMérieux 55842)
  • OPD substrate ortho-phenylenediamine Cambridge Medical Biotechnology ref / 456
  • a concentration of 4 mg / ml to which 30% hydrogen peroxide diluted 1/1000 is added immediately.
  • the enzymatic activity is blocked with 100 ⁇ l of IN sulfuric acid and the reading is carried out on an Axia Microreader device (AXIA: registered trademark) (bioMérieux) at 492 nm.
  • AXIA registered trademark
  • the capture oligonucleotide is passively attached comprising at its 5 ′ end the ligand Aminolink 2 (Applied Biosyste s-ref. 00808) at a concentration of 1 ng / ⁇ l in a volume of 315 ⁇ l of a 4x PBS solution (200 mM sodium phosphate pH 7.0, 600 mM NaCl). After overnight at room temperature or two hours at 37 ° C., the cones are washed twice with a PBS Tween solution, then dried under vacuum.
  • a 4x PBS solution 200 mM sodium phosphate pH 7.0, 600 mM NaCl
  • the strip contains in cuvettes the reagents necessary for detection, that is to say: 200 ⁇ l of a solution at 0.1 ng / ⁇ l of the oligonucleotide-alkaline phosphatase detection conjugate, twice 600 ⁇ l of PBS washing solution Tween and a substrate bowl.
  • RNA extracted are deposited in the same buffer as for the microplate protocol above. After incubating the cone for 30 minutes with the target mixture plus detection probe, the cone is washed twice with a PBS Tween solution. 250 ⁇ l of MUP substrate (4-methyl umbelliferyl phosphate) in solution in a buffer diethanolamine are aspirated into the cone, then released into a reading bowl. The device measures the fluorescent signal expressed in URF (relative fluorescence units) of the cuvette. The results obtained with this system are the same as those obtained in microplate.
  • lixA NAME / KEY DNA lixB LOCATION: 1199-1213 lixC IDENTIFICATION METHOD: by similarity lixD OTHER INFORMATION:

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Abstract

L'invention concerne des fragments nucléotidiques monocaténaires appartenant à des régions conservées ou variables de l'ARN ribosomique 16S de bactéries du genre Rickettsia. Ces fragments sont capables de s'hybrider dans des conditions prédéterminées à l'ADNr ou l'ARNr d'au moins une bactérie du genre Rickettsia et non à l'ADNr ou l'ARNr des non-Rickettsia. L'invention concerne en outre les sondes, les amorces dont les séquences appartiennent à celles des fragments de l'invention, ainsi qu'un réactif et un procédé pour identifier le genre Rickettsia, ou une espèce du genre Rickettsia.

Description

Fragments nncléotidiqnes capables de s'hyhrider spécifiquement à l'ADNr ou ARNr des Rickettsia et leur utilisation comme sondes ou amorces.
La présente invention relève du domaine des techniques de détection et/ou identification des bactéries du genre Rickettsia et plus particulièrement de celles utilisant un marqueur génétique. Les rickettsies sont des bactéries gram négatif qui appartiennent à l'ordre des Rickettsiales et à la famille des Rickettsiaceae comprenant notamment la sous-famille des Rickettsieae sous divisée en trois genres : les Coxiella, dont la seule espèce connue est Coxiella burnetti ; les Rickettsia, groupant l'ensemble des autres espèces pathogènes pour l'homme et les animaux ; et les Rochalimea. Le genre Rickettsia comprend trois sous groupes : le groupe du typhus auquel appartient R . typhi responsable du typhus endémique, R . prowazekii , responsable du typhus épidémique et R . canada ; le groupe du typhus de brousse auquel appartient R . tsutsuga ushi ; et le groupe des fièvres eruptives auquel appartiennent notamment R . rickettsii, R. siberica, R . conorii , R . australis, R . akari , R . montana et R . rhipicephal± .
Les rickettsies sont des bactéries parasites intracellulaires qui se multiplient dans le noyau et le cytoplasme des cellules hôtes pour les souches du groupe des fièvres eruptives et dans le cytoplasme de ces cellules pour les souches des autres groupes. La transmission à l'homme de la bactérie se fait par l'intermédiaire d'insectes hématophages tels que la tique pour R . tsutsugamushi (rickettsie du groupe des fièvres eruptives) , le pou pour R . prowazekii ou la puce pour R . typhi , lors d'un repas sanguin suivi de déjections à l'endroit de la piqûre. Le typhus épidémique dû à R . prowazekii caractérisé par une fièvre élevée, des céphalées importantes, une éruption généralisée est aujourd'hui devenu une maladie rare. Néanmoins, le risque existe toujours de la survenue d'une épidémie, dès lors que les conditions requises sont réunies, en particulier lorsque la population est dense et que les conditions d'hygiène font défaut. Le typhus murin, ou typhus endémique, dû à R. typhi est répandu dans le monde entier. Le rat est le réservoir et sa présence conditionne l'apparition de la maladie chez l'homme. L'infection se caractérise par des céphalées, des myalgies et de la fièvre mais, le plus souvent, la maladie est bénigne.
Certaines des infections associées aux rickettsies du groupe des fièvres eruptives, et notamment la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses due à R . rickettsii , peuvent avoir une issue fatale pour le malade ou tout au moins s'accompagner de sévères complications telles que rayocardite, phlébites, syndrome méningé, encéphalite, myélite et coma.
Le typhus de brousse est une maladie aiguë fébrile dont l'agent causal est R . tsutsugamushi . La maladie se caractérise par une élévation de la température et des céphalées importantes, auxquelles peut être associée une pneumopathie au cours de la première semaine de la maladie. Par ailleurs, la maladie peut porter atteinte au système nerveux central, avec des manifestations cliniques telles que délire, stupeur et fibrillation musculaire. Le taux de mortalité varie de 1 à 60 % selon les régions géographiques. Il est particulièrement élevé en Asie du Sud-Est, Corée, Australie, Japon et Inde.
Aujourd'hui, aucune technique de détection n'est à la fois assez spécifique, sensible et rapide pour diagnostiquer une infection due aux bactéries du genre Rickettsia dans un échantillon biologique. Le contrôle de l'infection se fait essentiellement soit par diagnostic direct, très lourd à mettre en oeuvre car il suppose l'inoculation à partir d'échantillons biologiques d'animaux ou d'oeufs embryonnnés ; soit par diagnostic sérologique, souvent difficile en raison du manque de spécificité des techniques utilisées ou en raison de l'apparition retardée des anticorps dans les sera des patients.
La présente invention concerne une technique de diagnostic des infections dues aux bactéries du genre Rickettsia, et plus particulièrement celles dues à R. tsutsugamushi, utilisant un marqueur génétique dans un procédé de détection par hybridation d'acides nucléiques, alliant spécificité, sensibilité et rapidité.
Plus particulièrement, l'ARN ribosomique des bactéries est utilisé comme cible. En effet, cette molécule est retrouvée en abondance dans toutes cellules de tous les organismes vivants. Par ailleurs, elle présente une séquence nucléotidiqûe particulière faite d'une succession de régions caractérisées par une vitesse d'évolution variable.
Les ribosomes bactériens contiennent au moins trois molécules d'ARN distinctes référencées ARNr(s) 5S, 16S et 23S. Historiquement, ces dénominations ont été choisies par référence à leur vitesse de sédimentation qui reflète la taille de ces molécules d'ARN. Cependant, la taille réelle de ces constituants ribosomiques varie sensiblement, pour un type donné, d'un organisme cellulaire à un autre. Néanmoins, la terminologie ARNr 5S, 16S et 23S est consacrée pour désigner les molécules d'ARN constitutives des ribosomes chez toutes les bactéries.
La valeur taxonomique des sous-unités 16S et 23S ribosomiques de diverses espèces bactériennes a été mise en évidence dans des procédés d'hybridation pour quantifier des niveaux d'homologies entre ces espèces. Ainsi, Woese et coll., Microbiological Reviews 47 : 621-669 (1983), et Grayet et coll., Nucleic Acids Research 12 : 5837-5852 (1984) montrent, par des comparaisons de séquences d'ARN 16S, que des régions hautement conservées sont intercalées avec des régions de moyenne et basse homologies, même dans le cas d'espèces proches.
A ce jour, seulement six séquences d'ADN correspondant aux ARN ribosomiques 16S (ADNr) de bactéries appartenant à la famille des Rickettsiaceae sont décrites dans la littérature : R . rickettsii, R. prowezekii, R . typhi, Coxiella burnetti, Ehrlichia ristierii et Wolbachia persicae . On a maintenant découvert sur l'ADN codant pour l'ARN ribosomique de la sous-unité 16S certaines zones qui sont conservées pour diverses espèces appartenant au genre des Rickettsia. Par ailleurs, on a maintenant découvert sur l'ADN codant pour l'ARN ribosomique 16S des zones variables au sein du genre Rickettsia. Ces résultats ont permis d'établir des sondes de genre permettant de discriminer le genre Rickettsia des genres taxonomiquement proches, ainsi que des sondes spécifiques d'espèces appartenant au genre Rickettsia. Ces résultats ont été vérifiés notamment sur les espèces suivantes : R . tsutsugamushi, R . canada, R. conorii, R . akari, R . mooseri, R . australis, R . rhipicephali, R . montana, R . bellii , R . japonica, R . parkeri, R . helvetica, R . sibirica, R . massiliae, R . slovaca et R . africae . Avant d'exposer l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont définis ci-après :
- un fragment nucléotidique ou un oligonucléotide est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique dans des conditions prédéterminées, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique,
- un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2, 6-purine, la bromo-5- désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, pas exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991)), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates,
- par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de motifs de type nucléotidique, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information de même qualité que celle des acides nucléiques naturels,
- par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogène stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1M. - une sonde est un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 monomères, notamment de 6 à 35 monomères, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise dans un ARN ribosomique, l'ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN ribosomique et l'ADN (appelé ici ADN ribosomique ou ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de transcrip-tion ; une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection) ou à des fins de thérapie,
- une sonde de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption,
- une sonde de détection peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes (notamment une peroxydase, une phosphatase alcaline, ou une enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent) , des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucleotidiques, et des ligands tels que la biotine,
- une amorce est une sonde comprenant de 5 à 100 motifs nucleotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzy atique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction) , dans un procédé de séquençage, dans une méthode de transcription inverse, etc., -l'homologie caractérise le degré de similitude de deux fragments nucleotidiques comparés,
- les sondes et amorces selon l'invention sont celles dont les séquences sont identifiées ci-après, ainsi que les analogues de ces sondes ou amorces qui sont celles dont les séquences présentent au moins 70 % d'homologie, et au moins 5 motifs nucleotidiques consécutifs de séquence informationnelle identique avec ces dernières. De telles séquences sont appelées ici "séquences homologues".
Les sondes selon l'invention utilisées à des fins de diagnostic peuvent être mises en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépôt ponctuel sur filtre dites "DOT-BLOT" (MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), les techniques de transfert d'ADN dites "SOUTHERN BLOT" (SOUTHERN. E.M., J. Mol. Biol . , , 503 (1975), les techniques de transfert d'ARN dites "NORTHERN BLOT", ou les techniques SANDWICH (DUNN A.R., HASSEL J.A., Cell, 12, 23 (1977)) ; on utilise en particulier la technique SANDWICH, avec une sonde de capture spécifique et/ou une sonde de détection spécifique, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent avoir des séquences nucleotidiques au moins partiellement différentes.
Une autre application de l'invention est une sonde de thérapie pour traiter les infections dues aux bactéries du genre Rickettsia, ladite sonde étant susceptible de s'hybrider in vivo sur l'ARN ribosomique 16S desdites bactéries et/ou sur l'ADN génomique pour bloquer les phénomènes de traduction et/ou de transcription et/ou la réplication.
La figure annexée représente les séquences d'ADNr correspondant à l'ARNr 16S de diverses bactéries du genre Rickettsia, dont la liste figure à la suite de la partie expérimentale ci-après. La numérotation de la séquence nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN ribosomique 16S de R. rickettsii, complètement identifiée par Weisburg et al. (1989, Genbank (M21293) ) , a été utilisée à titre de référence afin de définir les fragments et pour les aligner.
La présente invention a notamment pour objet un fragment nucléotidique monocaténaire capable de s'hybrider avec l'AD r ou l'ARNr des Rickettsia et non à l'AD r ou à l'ARNr des non-Rickettsia.
En particulier, le fragment nucléotidique monocaténaire n'est pas susceptible de s'hybrider spécifiquement à l'ADNr ou l'ARNr de Cowdria ruminantium, Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma marginale, Wolbachia pipientis, Ehrlichia risticii, Rochalimea quintana et Coxiella burnatti.
Le fragment nucléotidique monocaténaire de l'invention présente une séquence nucléotidique d'au moins 5 nucléotides consécutifs choisie dans les séquences suivantes : commençant au nucléotide N° 130 et finissant au nucléotide N° 170 commençant au nucléotide N° 181 et finissant au nucléotide N° 201 commençant au nucléotide N° 241 et finissant au nucléotide N° 272 commençant au nucléotide N° 284 et finissant au nucléotide N° 298 commençant au nucléotide N° 299 et finissant au nucléotide N° 315 commençant au nucléotide N° 334 et finissant au nucléotide N° 357 commençant au nucléotide N° 460 et finissant au nucléotide N° 481 commençant au nucléotide N° 504 et finissant au nucléotide N° 536 commençant au nucléotide N° 550 et finissant au nucléotide N° 570 commençant au nucléotide N° 561 et finissant au nucléotide N° 585 commençant au nucléotide N° 661 et finissant au nucléotide N° 684 commençant au nucléotide N° 710 et finissant au nucléotide N° 739 commençant au nucléotide N° 903 et finissant au nucléotide N° 929 commençant au nucléotide N° 940 et finissant au nucléotide Nc 960 commençant au nucléotide N°1035 et finissant au nucléotide Nc1055 commençant au nucléotide N°1078 et finissant au nucléotide N°1107 commençant au nucléotide N°1199 et finissant au nucléotide N°1213 commençant au nucléotide N°1330 et finissant au nucléotide N°1350 commençant au nucléotide N°1361 et finissant au nucléotide N°1387 commençant au nucléotide Nc1429 et finissant au nucléotide Nc1463 commençant au nucléotide N°1501 et finissant au nucléotide N°1520 commençant au nucléotide N°1555 et finissant au nucléotide N°1576 et leurs séquences complémentaires. L'invention concerne notamment les fragments nucleotidiques monocaténaires ayant une séquence d'au moins 8, et en particulier d'au moins 10, nucléotides consécutifs choisie dans les séquences mentionnées ci-dessus (ou dans des séquences complémentaires). Bien entendu, l'invention s'étend à tout fragment nucléotidique suffisamment homologue d'un fragment tel que défini ci-dessus pour être capable de s'hybrider spécifiquement avec l'ADNr ou l'ARNr des Rickettsia.
Plus particulièrement, les séquences nucleotidiques des fragments de l'invention sont choisies dans les séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 22, décrites en fin de description, ou leurs séquences complémentaires.
La numérotation de la séquence de l'ARNr 16S de R. rickettsii, appliquée aux séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 22 ci-dessus, ne reflète pas toujours le nombre de nucléotides ou monomères constituant ces séquences en raison des variations de taille existant entre les séquences et la séquence de l'ARNr 16S de R. rickettsii. Les variations sont dues à des insertions ou délétions naturelles dans le matériel génétique.
Conformément à la définition ci-dessus les fragments de l'invention sont des fragments d'ADN, mais ils peuvent aussi être des fragments monocaténaires d'ARN, ou leurs fragments complémentaires, ainsi que des fragments monocaténaires d'ADN génomique dont les produits de transcription sont les fragments d'ARN précités, ou leurs fragments complémentaires. Les fragments nucleot idiques monocaténaires de l ' invention sont utilisables en particulier comme sondes notamment comme sondes de capture ou de détection, selon les techniques d ' hybridation connues . Les sondes spécifiques du genre Rickettsia sont notamment celles présentant une séquence choisie parmi les séquences : commençant au nucléotide N° 181 et finissant au nucléotide N° 201 commençant au nucléotide N° 284 et finissant au nucléotide N° 298 commençant au nucléotide N° 561 et finissant au nucléotide N° 585 commençant au nucléotide N° 940 et finissant au nucléotide N° 960 commençant au nucléotide N° 1199 et finissant au nucléotide N° 1213 commençant au nucléotide N° 1429 et finissant au nucléotide N° 1463 et leurs séquences complémentaires , ou leurs analogues . Les sondes d ' espèce R . tsutsugamushi sont notamment celles présentant une séquence choisie parmi les séquences : commençant au nucléotide N° 130 et finissant au nucléotide N° 170 commençant au nucléotide N°241 et finissant au nucléotide N°272 commençant au nucléotide N°299 et finissant au nucléotide N° 315 commençant au nucléotide N° 334 et finissant au nucléotide N° 357 commençant au nucléotide N° 460 et finissant au nucléotide N° 481 commençant au nucléotide N° 504 et finissant au nucléotide N° 536 commençant au nucléotide N° 550 et finissant au nucléotide N° 570 commençant au nucléotide Nc 661 et finissant au nucléotide N° 684 commençant au nucléotide N° 710 et finissant au nucléotide Nc 739 commençant au nucléotide N° 903 et finissant au nucléotide N° 929 commençant au nucléotide N° 1035 et finissant au nucléotide N° 1055 commençant au nucléotide Nc 1078 et finissant au nucléotide N°1107 commençant au nucléotide N° 1330 et finissant au nucléotide N° 1350 commençant au nucléotide N° 1361 et finissant au nucléotide N° 1387 commençant au nucléotide N° 1501 et finissant au nucléotide N° 1520 commençant au nucléotide N° 1555 et finissant au nucléotide N° 1576 et leurs séquences complémentaires , ou leurs analogues .
Un autre objet de l ' invention est une sonde de thérapie pour le traitement des infections dues aux bactéries du genre Rickettsia et notamment une sonde de thérapie pour le traitement des infections dues une espèce déterminée de Rickettsia, l ' une et l ' autre comprenant au moins un fragment nucléotidique monocaténaire tel que défini précédemment . Un autre objet de l'invention est une amorce pour la transcription inverse spécifique en une séquence d'ADN complémentaire d'une séquence d'ARN ribosomique 16S de Rickettsia appartenant soit à une région conservée seulement parmi les Rickettsia, soit à une région spécifique de l'espèce R . tsutsugamushi ; ou une amorce, notamment pour l'amplification spécifique d'une séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire ou homologue de la séquence de l'ARN ribosomique 16S des Rickettsia, appartenant soit à une région région conservée seulement parmi les Rickettsia, soit à une région spécifique de l'espèce R . Tsutsugamushi . Une telle amorce comprend ou est constituée par un fragment nucléotidique monocaténaire tel que défini précédemment. L'invention concerne aussi un réactif pour détecter et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un échantillon biologique comprenant au moins une sonde de l'invention, et en particulier une sonde de capture et/ou une sonde de détection répondant à la définition d'une sonde donnée ci-dessus. Le réactif peut comprendre un mélange de sondes.
Enfin, l'invention apporte un procédé pour détecter et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un échantillon biologique selon lequel on met en contact soit l'ARN ribosomique, en particulier l'ARNr 16S, extrait des rickettsies et éventuellement dénaturé, soit l'ADN géno ique, extrait et dénaturé, des bactéries, soit encore l'ADN obtenu à partir de la transcription inverse de l'ARN ribosomique 16S, avec au moins une sonde de l'invention, puis on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde, de façon connue en soi.
Bien entendu, il convient d'effectuer l'hybridation dans des conditions suffisamment discriminantes (stringence) pour que l'hybridation d'au moins une des sondes soit spécifique. Si désiré, avant d'exposer l'acide nucléique à la sonde de l'invention, on réalise une amplification de cet acide nucléique en présence d'un système enzymatique adapté et d'au moins une amorce d'amplification de l'invention.
L'invention concerne en particulier un procédé de détection et/ou d'identification de Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend: a- la mise en contact dudit échantillon avec au moins un fragment nucléotidique monocaténaire tel que défini ci- dessus, dans des conditions prédéterminées qui permettent audit fragment de s'hybrider à l'ADNr ou à l'ARNr d'une bactérie du genre Richettsia, s'il est présent ; et b- la détection dudit hybride comme indicateur de la présence de Rickettsia dans l'échantillon.
Bien entendu, lés conditions prédéterminées d'hybridation sont celles qui permettent une hybridation spécifique.
Les Exemples suivants illustrent l'invention.
EXEMPLE 1
Détermination de la séquence nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN ribosomique 16S de rickettsies.
La séquence nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN ribosomique 16S des 16 souches suivantes a été déterminée:
R. tsutsugamushi ATCC Gilliam R R.. ccaannaaddaa G Gaammaaleya Research Institute Collection 2678
R. conorii ATCC VR-141
R. akari ATCC VR-148
R. mooseri ATCC VR-144 R R.. aauussttrraalliiss
R. rhipicephali
R. montana
R. bellii
R. japonica
R. parkeri
R. helvetica
R. sibirica ATCC VR-151
R. massiliae
R. slovaca
R. africae G Gaammaaleya Research Institute Collection L'ADN total des souches a été isolé selon la technique décrite par Maniatis et al. (Molecular cloning, Cold Spring Harbor, 1982). Des produits d'amplification PCR ont été générés à partir de l'ADN génomique isolé de ces souches à l'aide d'amorces d'amplification choisies dans des régions conservées dans les séquences connues de R . rickettsii, R . typhi et R . prowazekii .
Les produits d'amplification obtenus ont été purifiés sur billes magnétiques marquées à la streptavidine (Dynabead M- 280 ; Dynal Inc., N.Y.) et séquences en utilisant la technique préconisée dans le kit commercial "Autoread sequencing kit".
EXEMPLE 2
Utilisation d'une sonde spécifique dirigée contre l'ARN ribosomique 16S pour l'identification de R . tsutsugamushi . La sonde commençant au nucléotide N°903 et finissant au nucléotide N°929 de la SEQ ID NO 13, est spécifique pour les souches de R . tsutsugamushi . Une collection de souches de rickettsies a été testée par hybridation sur l'ARN ribosomique 16S et a permis de constater la spécificité de cette sonde. L'hybridation des ARN ribosomiques d'une bactérie-cible a été conduite selon le procédé de détection non-radioactif et semi-automatisé décrit dans le brevet français nc 90 07249 et modifié pour la détection de l'ARN ribosomique par l'addition d'un déstabilisant. Ce déstabilisant (qui est une sonde de capture, commençant au nucléotide N°940 et finissant au nucléotide N°970 de la séquence de R. Tsutsugamuchi (référencée 23 dans la figure annexée) ) et un conjugué de détection oligonucléotide- enzyme (1'oligonucléotide correspondant à la- sonde définie au début du présent exemple) sont utilisés. La manipulation a été conduite dans une plaque de microtitration selon le protocole suivant. L'ARN ribosomique des souches a été extrait selon le protocole de base pour l'extraction de l'ARN des bactéries à Gram positif décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology" 1987, Ausubel FM et al., Wiley interscience, New York. Dans une plaque de microtitration (Nunc 439454) est déposée une solution de 1 ng/μl de 1 'oligonucléotide de capture dont l'extrémité 5' a réagi avec le réactif Aminolink 2 (Applied Biosystems, Foster city , Californie) dans du PBS 3X (0.45 M NaCl 0.15 M phosphate de sodium pH 7.0) . La plaque est incubée 2 h à 37° C puis lavée 3 fois avec 300 μl de PBST (PBS lx, Tween 20 : 0,5 °/oθ (Merck 822184)) . Le réactif Aminolink 2 permet d'ajouter à l'extrémité 5' de la "sonde un bras comportant un groupement 6-aminohexyle. La sonde ainsi couplée à un ligand possédant un groupement polaire (aminé primaire) , et fixée de façon passive sur le support, procure un signal amélioré ; voir la demande FR 91 09057.
La cible constituée par 10 μl d'extrait d'ARN totaux est mélangée avec 40 μl de tampon PBS saumon (PBS-3X + ADN de sperme de saumon 10 μg/ml (Sigma D 9156)) . L'ensemble est ajouté dans le puits à 50 μl d'une solution du conjugué oligonucléotide-peroxydase, constituant la sonde de détection, à la concentration de 0.1 ng/μl en oligonucléotide dans un tampon PBS-cheval (PBS 3X + 10 % sérum de cheval (BioMérieux 55842)) . La plaque est incubée 1 h à 37° C puis lavée par 3 fois avec 300 μl de tampon PBST. Dans chaque puits, on rajoute 100 μl de substrat OPD (ortho-phénylènediamine Cambridge Médical Biotechnology ref/456) dans un tampon 0,055 M acide citrique, 0,1 M monohydrogénophosphate de sodium, pH 4,93) à la concentration de 4 mg/ml, auquel on ajoute extemporanément du peroxyde d'hydrogène à 30 % dilué au 1/1000. Après 20 min de réaction l'activité enzymatique est bloquée par 100 μl d'acide sulfurique IN et la lecture est effectuée sur un appareil Axia Microreader (AXIA : marque enregistrée) (bioMérieux) à 492 nm. Les bactéries-cibles étaient notamment les suivantes : - 30 souches appartenant à l'ordre des Rickettsiale
- 20 souches appartenant au genre des Rickettsia
7 souches appartenant à l'espèce de R tsutsugamushi L'adaptation de la combinaison spécifique sur l'automate VIDAS (marque déposée - commercialisé par la société bioMérieux-VITEK) a été effectuée. La paroi du puits de microplaque est ici remplacée par le SPR (marque de commerce) ("Solid Phase Réceptacle") qui est un support conique réalisé à partir d'un matériau vendu sous la dénomination K résine (copolymère butadiène-styrène) et commercialisé par la société bioMérieux-VITEK (USA) . Les divers réactifs sont disposés dans une barrette à plusieurs cuvettes et les différentes étapes se déroulent dans le SPR qui est capable d'aspirer et de refouler les réactifs et qui fait donc office de pipette. La réaction d'hybridation sandwich décrite dans le protocole ci-dessous se produit sur la paroi interne du cône.
Sur la surface interne du SPR, est fixé passivement 1'oligonucléotide de capture comportant à son extrémité 5' le ligand Aminolink 2 (Applied Biosyste s-réf. 00808) à une concentration de 1 ng/μl dans un volume de 315 μl d'une solution de PBS 4x (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCl 600 mM) . Après une nuit à température ambiante ou deux heures à 37°C, les cônes sont lavés 2 fois par une solution PBS Tween, puis séchés sous vide. La barrette contient dans des cuvettes les réactifs nécessaires à la détection, c'est à dire : 200 μl d'une solution à 0,1 ng/μl du conjugué de détection oligonucléotide-phosphatase alcaline, 2 fois 600 μl de solution de lavage PBS Tween et une cuvette de substrat.
Dans le premier puits de la barrette, sont déposés 10 μl de l'ARN extrait dans le même tampon que pour le protocole microplaque ci-dessus. Après incubation 30 minutes du cône par le mélange cible plus sonde de détection, le cône est lavé 2 fois par une solution de PBS Tween. 250 μl de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl phosphate) en solution dans un tampon diéthanolamine sont aspirés dans le cône, puis relâchés dans une cuvette de lecture. L'appareil mesure le signal fluorescent exprimé en URF (unités relatives de fluorescence) de la cuvette. Les résultats obtenus avec ce système sont les mêmes que ceux obtenus en microplaque.
De façon analogue, on peut vérifier le caractère spécifique de genre ou d'espèces des autres fragments nucleotidiques qui font l'objet de l'invention. Liste et origine des bactéries dont la séquence d'ADNr correspondant à l'ARNr 16S est représentée en annexe.
1 R . rickettsii Genban
14 thai (tick typhus rickettsia)
10 R . slovaca (M-91 isolât différent de R siberica)
11 R.japonica
3 R.conorii
18 astrakan fever rickettsia
13 israeli tick typhus rickettsia
7 R.sibirica
15 R.parkeri
16 R.africae
8 R.massiliae
17 Bar29 (GS isolât différent de R massiliae) 6 R.rhipicephali
9 R.montana
12 R.helvetica
4 R.australis
5 R.akari
31 RSDNAX (EBL bacterium) Genbank
2 R.bellii
21 Coccinelle (AB fciacterium) Genbank
22 R . canada -
19 R. prowazekii Genbank
20 R . typhi Genbank
23 R. tsutsugamushi
26 Cowdria ruminant ium (CRDNA) Genbank
25 Ehrlichia chaffeensis (EHRRRNAF) Genbank
27 Anaplasma marginale (APMRR16SA) Genbank
28 Wolbachia pipientis (WP16SCP) Genbank
24 Ehrlichia risticii (EHRRGBSA) Genbank
30 Rochalimea (Bartonella)quintana ROCRR16SA Genbank
29 Coxiella burnatti COXRRSA Genbank LISTE DES SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM : Société Anonyme dite BIO MERIEUX
(B) RUE: Chemin de l'Orme
(C) VILLE: Marcy l'Etoile (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 69280
(G) TELEPHONE: (33) 78 87 20 00 (H) TELECOPIE: (33) 78 87 20 90
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Fragments nucleotidiques capables de s'hybrider spécifiquement à l'ADNr ou ARNr des Rickettsia et leur utilisation comme sondes ou amorces.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 22
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy dise
(B) ORDINATEUR: PC Compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: DOS #6.2 WINDOWS #3.0
(D) LOGICIEL: Microsoft Word #6.0
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 33 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE:
lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 130-170 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 130-170 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 1
CGAATTAATG CTGAGTTTGC TTAGTATTAA TTA 33 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 2 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 21 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : ' lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 181-201 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 181-201 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 2 GTGAGTAACA CGTGGGAATC T 21 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 3 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 27 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 241-272 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 241-272 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 3 TCACGTATGC CCTCTATAAG GAGGAAA 27 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 4 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 15 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 284-298 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 284-298 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 4 TATCGCTGAT GGATG 15 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 5 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 17 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE :" lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 299-315 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 299-315 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 5 AGCCCGCGGC AGATTAG 17 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 6 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 24 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 334-357 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 334-357 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 6
GCTCACCAAG CCGACGATCT GTAG 24 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 7 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 22 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE :• lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R. rickettsii : 460-481 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 460-481 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 7 CCAGCAATGC CGCGTGAGTG AT 22 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 8 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 21 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : ' lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 504-536 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 504-536 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 8 TCTTTTAGTA GGGATGATAA T 21 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 9 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 21 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE r lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 550-570 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 550-570 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 9 GACAGTACCT ACAGAAAAAG C 21 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 10 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 25 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE :' lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 561-585 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 561-585 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 10
CAGAAAAAGC CCCGGCTAAC TCCGT 25 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 11 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 24 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE :' lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 661-684 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 661-684 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 11 TAATAAGTTA GGAGTGAAAT CCCA 24 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 12 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 30 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 710-739 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 710-739 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 12 AAAACTGTTA GGCTAGAGTA TGGTAGAGGG 30 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 13 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 23 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE :' lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 903-929 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 903-929 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 13 GATATTGGGG GATTTTTCTT TCA 23 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 14 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 21 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 940-960 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 940-960 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 14 TAACGCATTA AGCACTCCGC C 21 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 15 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 21 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1035-1055 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1035-1055 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 15 AATTCGATGA TCCGCGAAAA A 21 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 16 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 30 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1078-1107 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1078-1107 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 16
AGTCGCGAAA AATGGAGACA TTTTTCTTCA 30 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 17 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 15 nucléotides liB TYPE : acide nucléique
5 liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non
10 lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE :' lviC INDIVIDU/ISOLE:
15 lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE:
20 lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME:
25 lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R. rickettsii : 1199-1213 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE:
30. lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1199-1213 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
35 lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 17 ATTCTTATTT GCCAG 15 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 18 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 20 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ' ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE :' lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1330-1350 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1330-1350 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 18 CTACAGAGTG ATGCGATACG 20 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 19 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 26 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE :' lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1361-1387 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1361-1387 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 19 AGCTAATCAT TAAAAGGTAT CTCAGT 26 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 20 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 35 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1429-1463 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1429-1463 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 20 CGCTAGTAAT CGCGGATCAG CATGCCGCGG TGAAT 35 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 21 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 20 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R. sutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1501-1520 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1501-1520 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 21 TGGGAGTCAG TGGTACCTGA 20 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 22 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 22 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN lui HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE : lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE:
IviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1555-1576 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1555-1576 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 22
CACGGTAGAA CTGGTGACTG GG 22

Claims

REVENDICATIONS
1) Fragment nucléotidique monocaténaire capable de s ' hybrider à l ' ADNr ou l ' ARNr d ' au moins une bactérie du genre Rickettsia et non à l ' ADNr ou l ' ARNr des non- Rickettsia, caractérisé en ce que ledit fragment est choisi parmi les fragments d ' au moins 5 nucléotides consécutifs présents dans les séquences nucleotidiques suivantes : commençant au nucléotide N° 130 et finissant au nucléotide N° 170 commençant au nucléotide N° 181 et finissant au nucléotide N° 201 commençant au nucléotide N° 241 et finissant au nucléotide N° 272 commençant au nucléotide N° 284 et f inissant au nucléotide N° 298 commençant au nucléotide N° 299 et finissant au nucléotide N° 315 commençant au nucléotide N° 334 et finissant au nucléotide N° 357 commençant au nucléotide N° 460 et finissant au nucléotide N° 481 commençant au nucléotide N° 504 et finissant au nucléotide N° 536 commençant au nucléotide N° 550 et finissant au nucléotide N° 570 commençant au nucléotide N° 561 et finissant au nucléotide N° 585 commençant au nucléotide N° 661 et finissant au nucléotide N° 684 commençant au nucléotide N° 710 et finissant au nucléotide N° 739 commençant au nucléotide N° 903 et finissant au nucléotide N° 929 commençant au nucléotide N° 940 et finissant au nucléotide N° 960 commençant au nucléotide N° 1035 et finissant au nucléotide N° 1055 commençant au nucléotide N° 1078 et f inissant au nucléotide N° 1107 commençant au nucléotide N° 1199 et finissant au nucléotide N° 1213 commençant au nucléotide N° 1330 et finissant au nucléotide N° 1350 commençant au nucléotide N° 1361 et finissant au nucléotide N° 1387 commençant au nucléotide N° 1429 et finissant au nucléotide N° 1463 commençant au nucléotide N° 1501 et finissant au nucléotide N° 1520 commençant au nucléotide N° 1555 et finissant au nucléotide N° 1576 et leurs séquences complémentaires ou les analogues de ces séquences , les numéros des nucléotides correspondant à leur position par rapport à la séquence nucléotidique de l ' ADN codant pour l 'ARN ribosomique 16S de R. rickettsii, utilisée comme référence .
2) Fragment nucléotidique monocaténaire selon la revendication 1 , caractérisé par le fait que ledit fragment comporte au moins 8, et en particulier au moins 10 nucléotides consécuti fs présents dans lesdites séquences nucleotidiques . 3) Fragment nucléotidique monocaténaire, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il ne s 'hybride pas à l'ADNr ou l'ARNr de Cowdria ruminantium, Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma marginale, Wolbachia pipientis, Ehrlichia risticii, Rochalimea quintana et Coxiella burnatti .
4) Fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente une séquence nucléotidique choisie dans les séquences SEQ ID N01 à SEQ ID N022.
5) Fragment nucléotidique monocaténaire d'ARN, caractérisé en ce qu'il correspond au produit de transcription d'un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 4, ou son fragment complémentaire. 6) Fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN, caractérisé en ce qu'il est obtenu par transcription inverse d'un fragment d'ADN selon le revendication 5, ou son fragment complémentaire.
7) Fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN génomique caractérisé en ce que son produit de transcription est un fragment d'ARN selon la revendication 5, ou son fragment complémentaire.
8) Sonde pour l'identification de bactéries du genre Rickettsia, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de cinq à cent motifs nucleotidiques, en particulier de cinq à trente cinq motifs, appartenant à la séquence d'un fragment tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9) Sonde pour l'identification de bactéries d'espèce R . tsutsugamushi, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de cinq à cent motifs nucleotidiques, en particulier de cinq à trente cinq motifs, appartenant à la séquence d'un fragment tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7. 10) Sonde selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de huit à trente cinq motifs nucleotidiques appartenant à la séquence d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
11) Sonde selon la revendication 8 ou selon la revendication 8 et la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence choisie dans les séquences suivantes: commençant au nucléotide N° 181 et finissant au nucléotide N° 201 commençant au nucléotide N° 284 et finissant au nucléotide N° 298 commençant au nucléotide N° 561 et finissant au nucléotide N° 585 commençant au nucléotide N° 940 et finissant au nucléotide N° 960 commençant au nucléotide N° 1199 et finissant au nucléotide N° 1213 commençant au nucléotide N° 1429 et finissant au nucléotide N°1463 et leurs séquences complémentaires .
12 ) Sonde selon la revendicat ion 9 ou selon la revendicat ion 9 et la revendication 10 , caractérisée en ce qu ' elle présente une séquence choisie dans les séquences suivantes : commençant au nucléotide N° 130 et finissant au nucléotide N° 170 commençant au nucléotide Nc241 et finissant au nucléotide N°272 commençant au nucléotide N°299 et finissant au nucléotide N°315 commençant au nucléotide Nc 334 et finissant au nucléotide N°357 commençant au nucléotide N° 460 et finissant au nucléotide N° 481 commençant au nucléotide N° 504 et finissant au nucléotide N° 536 commençant au nucléotide N° 550 et finissant au nucléotide N° 570 commençant au nucléotide N° 661 et finissant au nucléotide N° 684 commençant au nucléotide N° 710 et finissant au nucléotide N° 739 commençant au nucléotide N° 903 et finissant au nucléotide N° 929 commençant au nucléotide N° 1035 et finissant au nucléotide N° 1055 commençant au nucléotide N° 1078 et finissant au nucléotide N° 1107 commençant au nucléotide N° 1330 et finissant au nucléotide N° 1350 commençant au nucléotide N° 1361 et finissant au nucléotide N° 1387 commençant au nucléotide N° 1501 et finissant au nucléotide N° 1520 commençant au nucléotide N° 1555 et finissant au nucléotide N° 1576
13) Sonde de thérapie pour le traitement des infections dues au genre Rickettsia ou à une espèce déterminée de rickettsies, caractérisée en ce qu ' elle comprend une séquence nucléotidique appartenant à la séquence d ' un fragment selon l ' une quelconque des revendications 1 à 7 .
14) Amorce pour la transcript ion inverse spéci fique d ' une séquence d ' ARN ribosomique 16S des Rickettsia appartenant à une région conservée parmi ce seul genre de rickettsies, en une séquence d'ADN complémentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique d'au moins cinq nucléotides appartenant à la séquence d'un fragment nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 7.
15) Amorce pour l'amplification enzymatique spécifique d'une séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire ou homologue de la séquence de l'ARN ribosomique 16S des Rickettsia caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique d'au moins cinq nucléotides appartenant à la séquence d'un fragment nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 7.
16) Réactif pour détecter et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon l'une des revendications 8 à 13.
17) Réactif selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend comme sonde de capture et/ou de détection au moins une sonde selon l'une des revendications 8 à 13. 18) Réactif selon la revendication 17, caractérisé en ce que la sonde de capture est fixée sur un support solide.
19) Réactif selon la revendication 17, caractérisé en ce que la sonde de détection est une sonde marquée.
20) Réactif selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une amorce selon la revendication
14 et/ou au moins une amorce selon la revendication 15.
21) Procédé de détection et/ou d'identification de Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend: a- la mise en contact dudit échantillon avec au moins un fragment nucléotidique monocaténaire tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans des conditions prédéterminées qui permettent audit fragment de s'hybrider à l'ADNr ou à l'ARNr d'une bactérie du genre Richettsia, s'il est présent ; et b- la détection dudit hybride comme indicateur de la présence de Rickettsia dans l'échantillon.
22) Procédé de détection et/ou d'identification d'au moins une espèce du genre Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met en contact l'ARN ribosomique 16S, extrait des bactéries contenues dans ledit échantillon avec au moins une sonde selon l'une des revendications 8 à 12, et on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde. 23) Procédé de détection et/ou d'identification d'au moins une espèce du genre Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met en contact l'ADN génomique extrait et dénaturé des bactéries contenues dans ledit échantillon avec au moins une sonde selon l'une des revendications 8 à 12, puis on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde.
24) Procédé de détection et/ou d'identification d'une espèce de rickettsie dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met en contact l'ADN obtenu par transcription inverse de l'ARN ribosomique 16S des bactéries contenues dans ledit échantillon avec au moins une sonde selon l'une des revendications 8 à 12, puis on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde.
25) Procédé selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce qu'avant d'exposer l'acide nucléique à ladite sonde, on réalise une amplification dudit acide nucléique en présence d'un système d'amplification enzymatique comprenant au moins une amorce selon l'une des revendications 14 et 15.
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