WO1996012732A1 - Nouveau peptide et agent therapeutique - Google Patents

Description

明 細 書 新規べプチ ドおよび治療剤

技術分野

本発明は新規ペプチ ドに関する ものである。 本発明による 新規べプチ ドはア レルギー性および非ア レルギー性炎症抑制 作用、 抗菌作用、 抗腫瘍作用、 創傷治癒作用などを示し、 炎 症抑制剤、 免疫抑制剤、 抗菌剤、 抗腫瘍剤、 創傷治癒剤、 抗 潰瘍剤などと して有用である。 よって、 本発明はまた、 この よ うな薬理作用を有する治療剤に関する。 背景技術

放線菌ス 卜 レプ 卜マイセス 《 ノ ビリ ス ( St reptomyces nob i l i s、 以下 「 S . ノ ビリ ス」 と略記する） の培養液またはそ の乾固物から有機溶剤によつて抽出されてなる抽出混合物は、 ア レルギー性炎症抑制作用を有する物質を含むこ とが知られ ている （特開平 5 — 2 5 0 5 3号公報参照） 。

しかし、 上記薬理作用を有する物質はいかなる化学構造を なすものであるか解明されていなかった。

本発明の第 1 の目的は、 この物質の構造を明らかに し、 新 規ぺプチ ドを提供する こ とにある。

微生物が生産する抗生物質は、 現在までに 5 , 0 0 0種類 以上報告されている。 このうちス ト レブ トマイセス属に属す る微生物からは、 ス ト レプ トマイ シン、 ァクチノマイ シン C， Dなどが報告されている。

抗生物質の使用においては、 耐性菌の発現が問題になって おり、 新しいタイプの物質が望まれている。 本発明の第 2の目的は、 抗菌活性の強い新規抗生物質を提 供する こ とにある。

また、 抗腫瘍物質についてはすでに多 く の報告がなされて おり、 微生物由来のものにはマイ トマイ シン C、 ブレオマイ シ ン、 ぺプロ マイ シ ン、 ネオカ ルチ ノ ス タ シ ン、 ダウ ノ マイ シ ン、 ア ド リ アマイ シ ン、 ア ク ラ ノ マイ シ ン、 ァ ク チ ノ マイ シ ン Dなどがある。

抗腫瘍物質の使用においては、 その副作用が避けられず、 副作用が少ない、 よ り有効で使用 しやすい抗腫瘍物質が望ま れている。

本発明の第 3の目的は、 よ り有効な新規抗腫瘍物質を提供 する にある。

また、 炎症反応は非ア レルギー性炎症とア レルギー性炎症 に大別される。 力ラゲニン浮腫に代表されるよ うな非ア レル ギ一性炎症には、 アス ピ リ ン （日経サイ エ ンス、 3巻、 7 0 頁、 1 9 9 1年） やイ ン ドメ タ シ ン （Ther. Res. , 3巻、 1 0 5 7頁、 1 9 8 5年） などの非ステロイ ド性抗炎症剤およ びプレ ドニゾロ ンなどのステロイ ド性抗炎症剤が有効である。 一方、 ア レルギー性炎症は 〜 I V型に大別され、 I 型反応は ァ ト ピー性皮廣炎、 喘息、 鼻炎の他様々なア レルギー性疾患 に関わっている。 また、 I I型反応、 I I I 型反応 （免疫複合体 反応 ： ァルサス反応） および I V型反応 （細胞性免疫反応 ： 遅 延型過敏反応） は慢性関節リ ウマチのよ うな自己免疫疾患、 さ らには肝炎、 腎炎、 皮膚炎、 感染症、 溶血性貧血、 イ ンス リ ン依存性糖尿病のよ うな様々な炎症反応性疾患の発症進展 に重要な役割を演じている こ とが明らかとなってきた。 これ らのア レルギー性炎症には、 プレ ドニゾロ ンなどのステロイ ド性抗炎症剤が有効である。

ア レルギー性炎症に有効なステロイ ド性抗炎症剤は感染防 御機能の低下、 消化管障害、 下垂体副腎皮質機能の抑制、 骨 形成の低下など副作用の点で問題がある。 また、 ステロイ ド 剤に比べて安全性が高いと考えられている非ステロイ ド性抗 炎症剤は、 ア レルギー性炎症に対する抑制作用が極めて弱い という問題点がある。 そこで、 よ り有効でかつ毒性の少ない 抗炎症剤が望まれている。

本発明の第 4の目的は、 上記の点に鑑み、 ア レルギー性炎 症および非ア レルギー性炎症に有効で、 有用性の高い新規抗 炎症物質を提供する こ とにある。

さ らに、 創傷は、 外科的切開、 消化管潰瘍、 火傷、 裂傷ま たは皮膚潰瘍 （褥創など） などの表面組織の損傷である。 創 傷の治療法と しては、 受傷部を応急処置したのち、 生体の自 然の回復力によって受傷部が治癒するのを待つのが常法であ る。 しかしながら、 回復までに長期間を要し、 痛みをはじめ と した患者の苦痛は並大抵のものではない。 そこで、 自然治 癒に頼る こ とな く 、 積極的かつ直接的に治癒を促進させる こ とが望まれている。 創傷の治癒は一般に細胞増殖による新し い結合組織および上皮組織の形成に依存し、 創傷の治癒に関 与する細胞の分化、 増殖過程を刺激あるいは促進する薬剤が 有効である と考えられている。

従来、 創傷治癒の促進作用を示すものと しては、 幼牛血液 抽出物 （ソルコセ リ ル） （応用薬理、 2 2巻、 5 6 5 〜 5 7 9頁、 1 9 8 1年） 、 塩化リ ゾチームなどが報告されている。

しかし、 上述の創傷 （表面組織の損傷） は概して難治性で あり、 既存薬では充分な臨床効果が認められないことが多い。 本発明の第 5の目的は、 上記の点に鑑み、 よ り有用性の高 い新規創傷治癒物質を提供する こ とにある。 発明の開示

本発明によ り、

で示される新規ペプチ ド （以下、 本発明ペプチ ドという） が 提供される。

本発明べプチ ドは、 例えば、 放線菌 S . ノ ビリスを培養し、 得られた培養液または同液の乾固物も し く は培養菌体から有 機溶剤によ っ て抽出された抽出物を、 各種カラ ムク ロマ トグ ラ フィ 一に付し、 目的物を含むカラムク ロマ トグラフィ ー画 分を再結晶処理する こ とにより得られる。 本発明ペプチ ドを生産する放線菌 s . ノ ビリ スは、 公的保 存機関から入手可能であり、 たとえば理化学研究所の保存菌

( J C M 4 2 7 4 ) (これは米国において A T C C 1 9 2 5 2およびオラ ンダにおいて C B S 1 9 8. 6 5と しても保存） などの菌が使用できる。

放線菌 S. ノ ビリ スの培養は、 然るべき栄養物を含んだ培 地を用いて行う。 液体培養の場合、 その培地の成分と しては ブ ドウ糖などの糖類、 ペプ ト ンや麦芽エキスなどのタ ンパク 質類、 ビタ ミ ン類、 核酸類、 ア ミ ノ酸類、 複合糖質類の一種 または数種を含んだ水溶液が好適に用いられる。 代表的な培 地例と しては、 澱粉 · アンモニゥム系の液体培地 （可溶性澱 粉、 K₂ Η Ρ 0 ^ 、 N H₄ C 1 を含む） が挙げられる。 液体 培地の ρ Ηは 2〜 9が好ま し く 、 培養温度は 1 5〜 4 2 が 好ま しい。 また液体培養の好ま しい培養時間は 1〜 1 4 日で ある。 こ う して得た S . ノ ビリ スの培養液またはその乾固物 も し く は菌体自体から溶剤を用いて本発明べプチ ドを抽出す る 0

S. ノ ビリ スの培養液またはその乾固物も し く は菌体自体 の抽出液を硫酸アンモニゥム （硫安） 処理し、 得られた沈殿 物を溶媒抽出 してもよい。 硫安処理に際しては、 培養液また はその乾固物も し く は菌体自体の抽出液に添加する硫安は、 固体のままの状態でもよい し、 溶液状態のものでもよい。 硫 安の添加量は好ま し く は飽和濃度の 3 0〜 9 0重量％の範囲 である。 処理時間は特に限定されないが、 好ま し く は 3 0分 〜 5時間の範囲である。 沈殿物を得るための遠心分離に際し ては、 遠心力が 3 , 0 0 0 G ~ 2 0， 0 0 0 Gである こ と力 好ま し く 、 遠心時間は 2〜 6 0分である こ とが好ま しい。 抽出に用いる溶剤と しては有機溶剤が好ま し く 、 その代表 例と しては、 酢酸ェチルなどのエステル類、 メ タ ノ ール、 ェ 夕 ノ ール、 プロ ノ ノ ーノレな どのアルコ ール類、 ェチルェ一テ ル、 ジォキサンなどのエーテル類、 アセ ト ン、 メ チルェチル ケ ト ンな どのケ ト ン類の ほ力、ジ ク ロ ロ メ タ ン、 ク ロ 口 ホルム などが挙げられるが、 使用可能な溶剤はこれらに限定されな い。 また、 上記溶剤の混合物を用いる こ と もでき る。 特に好 適な溶剤は酢酸ェチル、 ジク ロ ロ メ タ ン、 アセ ト ンなどであ る。 抽出時間は溶剤の種類や抽出温度などによ っても異なる が、 好ま し く は 3〜 1 2 0分の範囲である。 ま た抽出中は液 を静置 しても または攪拌してもよい。 好ま し く は、 同一試料 に対して抽出操作を複数回繰り返す。 抽出温度は特に制限さ れない。

次に、 溶剤抽出物に対するカラ ムク ロマ ト グラ フ ィ 一につ いて述べる。

カ ラ ムク ロマ ト グラ フ ィ ーの充填剤と しては、 O D S (ォ ク タデシゾレジメ チノレク ロ ロ シラ ンのよ う なォク タデシルシラ ン類） が好ま しい。 充填量は特に限定されないが、 チ ャ ー ジ する溶剤抽出物に対する重量比 1 0 〜 5 0 0倍量を充填する こ とが好ま しい。 溶剤抽出物をカ ラムにチャ ー ジする際はま ず O D S に吸着させる こ とが好ま しい。 このと き O D Sの量 は特に限定されないが、 好ま し く は吸着させる溶剤抽出物に 対する重量比 0 . 5 〜 2 0 倍量の O D S を用いてこれに抽出 物を吸着させた後、 この抽出物吸着 O D S を少量の溶剤に懸 濁してからカ ラムにチ ャ ー ジする。 溶出溶媒は特に限定され ないが、 好ま し く は極性がメ タ ノ ール ： ァセ トニ ト リ ル = 1 ： 1 混合溶剤を 8 0 %含む水溶液からメ タ ノ ールの間にある溶 剤を用いる。

次に、 本発明ペプチ ドの再結晶による精製について述べる。 再結晶に用いる溶剤は、 本発明べプチ ドを溶かす溶剤であ れば特に限定されないが、 好ま し く はメ タノ ール、 エタノ ー ルなどである。 再結晶の方法と しては、 当該物質を含有する カラム溶出画分を加熱下に少量の溶剤に溶かし、 得られた溶 液を徐々に冷やしてこの物質を再結晶させてもよいし、 当該 物質を含有するカラム溶出画分を当該物質の溶解性の高い溶 剤に溶かし、 そ こ に当該物質の溶解性の低い液 （例えば水） を徐々 に加えてこの物質を再結晶させてもよい。 本発明ペプチ ドは、 後述する薬理試験によって実証された ように、 ア レルギー性および非ア レルギー性炎症抑制作用、 特にグラム陽性菌の増殖阻害に有効である抗菌作用、 抗腫瘍 作用、 創傷治癒作用などを示し、 炎症抑制剤、 免疫抑制剤、 抗菌剤、 抗腫瘍剤、 創傷治癒剤、 抗潰瘍剤などと して有用で め O o

本発明べプチ ドを上記のごと き治療剤に製剤化するには、 通常はこれを製剤用担体と と もに製剤組成物の形態とする。 担体と しては剤形に応じた薬剤を調製するのに通常使用され る充填剤、 崩壊剤、 増量剤、 結合剤、 着色剤、 矯味矯臭剤、 p H調整剤、 可溶化剤、 懸濁化剤、 緩衝剤、 安定化剤、 保存 剤、 付質剤、 界面活性剤、 滑沢剤、 賦形剤、 抗酸化剤、 分散 剤、 噴射剤、 溶解剤、 溶解捕助剤が例示される。 また適当な 溶剤を選定する こ と によ り、 得られた本発明ペプチ ドをその ままの形態で液剤と して使用する こ と もできる。

本発明べプチ ドを用いて製剤化される治療剤の投与単位形 態と しては、 上記のごとき液剤のほか、 錠剤、 丸剤、 飲用液 剤、 散剤、 懸濁剤、 乳剤、 顆粒剤、 エキス剤、 細粒剤、 シロ ッ プ剤、 浸剤、 煎剤、 点眼剤、 ト ローチ剤、 パッ プ剤、 リニ メ ン ト剤、 ロー シ ョ ン剤、 眼軟膏剤、 硬靑剤、 カプセル剤、 坐剤、 注射剤 （液剤、 懸濁剤など） 、 貼付剤、 軟膏剤、 ゼリ 一剤、 パスタ剤、 吸入剤、 ク リーム剤、 スプレー剤、 点暴剤、 エアゾール剤などが例示される。

治療剤中に含有すべき本発明ペプチ ドの量は、 特に限定さ れず広範囲に適宜選択されるが、 好ま し く は治療剤中に 1 0 一⁷〜 1 0重量％の範囲である。

本発明ペプチ ドよ り得られた治療剤は、 その使用に際し各 種形態に応じた方法で投与される。 たとえば外用剤の場合に は、 これを皮膚ない しは粘膜などの所要箇所に直接噴霧、 貼 付または塗布し、 錠剤、 丸剤、 炊用液剤、 懸濁剤、 乳剤、 顆 粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与され、 注射剤の場 合には静脈内、 筋肉内 皮内、 皮下、 関節腔内も し く は腹腔 内投与され、 坐剤の場合には直腸内投与される。

本発明べプチ ドより得られた治療剤の投与量は、 使用目的、 症状などによ り適宜選択されるが、 通常は 1 日当り本発明べ プチ ドと して 1 0 p gZk g〜 1 0 m gZk g程度の範囲で ある。 また上記製剤組成物を 1〜 4回 Z日に分けて投与する こ と も もちろん差し支えない。 図面の簡単な説明

図 1 は、 本発明ペプチ ド 0. 5 m g Z k g、 プレ ドニゾロ ン 2 O m gZk gおよびそのコ ン ト ロールの腹腔内投与によ るラ ッ ト 4 8時間同種 P C A反応における漏出色素量を示す グラフである。

図 2は、 本発明ペプチ ド 0. 5 m g Z k g、 プレ ドニゾロ ン 2 O m gZk gおよびそのコ ン ト ロールの皮下投与による ラ ッ ト 4 8時間同種 P C A反応における漏出色素量を示すグ ラ フである。

図 3は、 本発明ペプチ ド 0. 5 m gZk g、 プレ ドニゾロ ン 2 0 m g / k gおよびそのコ ン ト ロールの腹腔内投与によ るラ ッ ト 4時間異種 P C A反応における漏出色素量を示すグ ラフである。

図 4は、 本発明ペプチ ド 0. 5 m gZk g、 プレ ドニゾロ ン 2 0 m g / k gおよびそのコ ン ト ロールの皮下投与による ラ ッ ト 4時間異種 P C A反応における漏出色素量を示すダラ フである。

図 5は、 本発明ペプチ ド 0. S m gZk g プレ ドニゾロ ン 5 O m gZk gおよびそのコ ン ト ロールの腹腔内投与によ るラ ッ トツベルク リ ン反応における紅斑強度、 皮膚重量を示 すグラ フである。

図 6は、 本発明ペプチ ド 0. 5 m gZk g、 アス ピ リ ン 1 0 O m g/k g、 プレ ドニゾロ ン 5 m gZk gおよびそのコ ン ト ロールの腹腔内投与によるラ ッ トカラゲニン浮腫におけ る右後肢足踱浮腫量を示すグラ フである。

図 7は、 本発明ペプチ ド 0. 5 m g Z k g、 プレ ドニゾロ ン 1 O m gZk gおよびそのコ ン ト ロールの腹腔内投与によ るラ ッ 卜ア ジュバン ト関節炎における足躕浮腫量を示すダラ フである。

図 8は、 本発明ペプチ ド、 コ ン ト ロールおよび対照薬の濃 度と肉芽湿重量との関係を示すグラフである。 図 9は、 本発明ペプチ ド、 コ ン ト ロールおよび対照薬と耐 創張力との関係を示すグラ フである。

図 1 0は、 本発明べプチ ド含有钦青剤およびコ ン ト ロール 钦青についての欠損作成後の日数と欠損面積との関係を示す グラ フである。

図 1 1 は、 本発明ペプチ ド含有軟膏剤および対照薬钦青に ついての欠損作成後の日数と欠損面積との関係を示すグラフ である。 発明を実施するための最良の形態

実施例 1

理化学研究所から入手した放線菌 S . ノ ビリ ス （ J C M 4 2 7 4 ) を、 酵母エキス 0. 2 %添加澱粉 · ア ンモニゥム培 地 1 0 0 m l 中で 4 0時間振燙培養 （前々培養） し、 続いて 同培地 3 リ ッ トルに前々培養菌液 6 0 m 1 を接種し、 2 5時 間振通培養 （種培養） した。 さ らに澱粉 · ア ンモニゥム培地

(蒸留水 1 0 0 m 1 中に可溶性澱粉を 1 g、 リ ン酸水素二力 リ ウムを 0. 0 5 g、 塩化ア ンモニゥ厶を◦ . 0 5 g含む） 2 8 5 リ ッ トルに種培養した全量を接種し、 約 3 0 °Cで 8 日 間振盪培養した。 この培養液を遠心分離し、 得られた上清液 2 5 0 リ ッ トルに硫酸ア ンモニゥムを上清 1 リ ッ トル当たり 6 6 2 g添加 し、 1 時間攪拌 した。 続いて 2 0 , 0 0 0 G

(流速 3 6 0 - 5 0 0 リ ッ トル Z時間） で連続的に遠心分離 を行い、 約 1 2 k gの沈殿物を得た。

上記により得られた沈殿物 1 , 2 k gに水 3. 6 リ ッ トル を添加し、 8 0 °Cで 3 0分間攪拌した。 次に等量の酢酸ェチ ルを添加し、 1 0分間振盪後、 全体を 5 , 0 0 0 Gで 1 0分 間遠心した。 酢酸ェチル相を分離後、 水相について本操作を 数回繰り返し、 溶剤抽出物を得た。

次に、 上記により得られた溶剤抽出物を、 O D S (ォクタ デシルジメ チルク ロ ロ シラ ン） 担体 2 5 gに吸着させた。 つ いで、 0 D S担体 2 7 5 gを充填した径 3. 2 c mのカ ラ ム 内の上記担体上に上記抽出物吸着担体をチャージ し、 O D S カラムを作成した。 この O D Sカラムを用いて下記の条件で 精製を行なった。 溶出溶剤と して a ) メ タノ ール ： ァセ トニ ト リ ル ： 水 = 7 _: 7 ： 6を 1. 5 リ ッ トル、 b ) メ タノール ： ァセ トニ ト リ ル ： 水 = 8 ： 8 ： 4を 1. 2 リ ッ トル、 c ) メ タノ 一ノレ ： ァセ トニ ト リ ル ： 水 = 9 ： 9 ： 2を 1 5 0 m l、 d ) メ タノ ール ： ァセ トニ ト リ ル ： 水 = 1 9 ： 1 9 ： 2を 1 リ ッ トル、 e ) メタノールを 1 リ ッ トル、 この順に流速 1 0. 5 m 1 分で流した。 分画は、 溶剤組成を変更する毎に行い、 特にメ タノ ール ： ァセ トニ ト リル ： 水 = 1 9 ： 1 9 ： 2の溶 出画分は、 適宜フ ラ ク シ ョ ンコ レク タ ーを用いて少量ずつ (2分間ずつ） 分画した。 各溶出画分について、 O D S— 8 0 TM、 内径 4. 6 11111 長さ 2 5. 0 c mの東ソ一社製の カラムを用いた H P L C (日立社製、 ポンプ L— 6 0 0 0 L 一 6 2 0 0、 検出器 L一 3 0 0 0、 カラムオー プン 6 5 5 A - 5 2 ) において、 検出波長 2 1 0 n m、 力ラム温度 4 0 °C、 流速 1 m 1 Z分の条件で、 溶離液と して水 ： ァセ トニ ト リル ： メ タノ ール = 6 : 7 : 7 ( 0分） 〜 0 : 1 : 1 ( 3 0分） を 用いて分析を行った。 上記画分のうち リ テ ン シ ョ ンタイム力く 1 8〜 2 0分のピークを含むもののみを集め、 同一画分と し ( 1 0 0 m g ) 、 メ タノ ール—水を用いて繰り返し再結晶を 行い、 針状結晶 4 5 m gを得た。 この物質の構造は、 種々の機器分析データよ り式 [ I ] で ある と決定した。

実施例 2

実施例 1 と同様に して培養を行い、 得られた菌体 2 1 5 g (湿重量） にジク ロ ロメ タ ン 2. 1 5 リ ッ ト ルを加え、 3 0 分間超音波処理をした後、 さ らにジク ロ ロメ タ ン 8. 6 リ ツ トルを添加し、 全体を室温で 1時間攪拌した。 菌体を據別後、 得られた濾液を濃縮乾固した。 こ の抽出物の乾固物を少量の へキサンに溶解した後、 へキサン相をメ タノ ールで 3回抽出 処理した。 へキサン不溶物とメ タノ ール抽出物をメ タノ ール に再溶解した。

次に、 上記により得られた溶剤抽出物を、 00 5担体 2 8 gに吸着させた。 ついで、 O D S担体 2 7 5 gを充填した径 3. 2 c mのカラム内の上記担体上に上記抽出物吸着担体約 3 0 gをチャージし、 O D Sカラムを作成した。 この O D S カラムを用いて下記の条件で精製を行なった。 溶出溶剤と し て a ) メ タノ ール ： ァセ トニ ト リ ル ： 水 = 7 ： 7 ： 6を 1. 5 リ ツ ト ル、 b ) メ タ ノ ール ： ァセ 卜二 ト リ ノレ ： 水 = 8 ： 8 ： 4を 1. 2 リ ッ ト ル、 c ) メ タ ノ ール ： ァセ トニ ト リ ノレ ： 水 = 9 ： 9 ： 2を 2 0 0 m l、 d) メ タ ノ ール ： ァセ ト ニ ト リ ル ： 水 = 1 9 ： 1 9 ： 2を 1 リ ッ トル、 e ) メ タノ ールを 5 0 0 m 1、 この順に流速 1 0. 5 m l 分で流した。 分画は、 溶剤組成を変更する毎に行い、 特にメ タ ノ ール ： ァセ トニ ト リ ル ： 水 = 1 9 ： 1 9 ： 2の溶出画分は、 適宜フ ラ ク シ ョ ン コ レク ターを用いて少量ずつ （ 2分間ずつ） 分画した。 各溶 出画分について、 O D S— 8 0 TM、 内径 4. 6 mm x長さ 2 5. 0 c mの東ソ一社製のカラムを用いた H P L C (日立 社製、 ポンプ L一 6 0 0 0 L— 6 2 0 0、 検出器 L— 3 0 0 0、 カ ラムオープン 6 5 5 A— 5 2 ) において、 検出波長 2 1 0 n m、 カラム温度 4 0 °C、 流速 l m l Z分の条件で、 溶 離液と して水 ： ァセ トニ ト リ ノレ ： メ タ ノ ール = 6 ： 7 ： 7 ( 0分） 〜 0 ： 1 ： 1 ( 3 0分） を用いて分析を行った。 上 記画分のうち リ テンシ ョ ンタイム力 1 8〜 2 0分のピークを 含むもののみを集め、 同一画分と し （ 8 4 0 m g) 、 メ タノ

—ルー水を用いて繰り返し再結晶を行い、 針状結晶の本発明 ぺプチ ド 3 3 O m gを得た。

この物質の構造は、 実施例 1 と同様に して種々の機器分析 データよ り式 [ I ] である と決定した。 構造分析データ

実施例 1および 2で得られた物質の機器分析データを以下 に示す。

1. M S

+

• E S I - M S : mZz = 9 1 3. 6 (M + H - H₂ 0)

+

9 3 1 6 (M + H )

+

9 5 3 6 (M + N a )

• H R F A B -M S

Found ： m Z z = 9 3. 5 0 79 (M + H -H₂ 〇）

z = 9 1 3 , 9 5 3, 9 3 1

( 9 1 3がメ イ ン， 9 3 1 は非常に小さい） Ca 1 cd for ：

^C45^H69^N8 ⁰12

m / z = 9 1 3. 5 0 5 3 2. I R

-1

I R 3， 4 0 0 c m - O H, - N H ,

-1

2 , 9 0 0 c m アルキル基，

i -1

i 1， 7 5 0 c m 一 C ( = 0 ) 一 0 -，

-1

1， t» 5 0 c m 一 C ( = 0 ) - N H - 3. ァ ミ ノ酸分析

加水分解物と して D—セ リ ン、 L ーァラニンおよび D— N ーメ チルーフヱ二ルァラニンが認められた。

4. 組成式

質量分析と後述する N M Rのデータから新規べプチ ドの組 成式は C ₄₅H _7QN ₈ 0₁₃である とが分かつた。

i υ ο 丄 ο

5. M R

a ) 部分構造 Aについて

H M B Cスぺク トル測定の結果、 ァラニン （A l a ) の力 ルポニル炭素 （ 1 7 3 6 p p m ) と N— C H ₃ —フ エニル ァラニ ン （ P h e ) の C H ₃ ( 3. 0 4 p p m) とにロ ング レンジの相関が観測されたこ とによ り、 Aの部分構造が推定 された。

b ) 部分構造 B、 Cについて

λΗ— ½ COSY, H0HAHA から同様のス ピン系を持つ 2つ の成分が推定された。

i ) N H (4.38ppm)

C H ₂ (46. 1 , 2. 89 3.15ppm )

(21. 3 ' 1. 45 1.63ppm )

^{C H} 2

(24. 2 , 1. 93 2.25ppm )

^{C H} 2

C H (51.7 , 4.90ppm)

N H (3.93ppm ) C H ₂ (47.9 , 2.56 , 3.30ppm )

C H ₂ (21.5 , 1.55 , 1.66ppm )

C H₂ (24. ， 1.67 , 2.58ppm )

C H (52.5 , 5.18ppm) 両者の 1 ^±3^UCシフ トはよ く 一致しているので同じ構造のもの (残基） と考えられる。 さ らに、 C H_Q プロ ト ンが非等価で ある こ とから環状構造と推定できる。

この シフ ト はモナマイ シ ン （Monamycin ) に含まれれる Pi perazic acid (Pip) の ものに合う こ と力、ら、 この成分は P i P (部分構造 Bの左の部分と部分構造 C) と推定された。

また、 セ リ ン （ S e r ) の 6. 4 0 p p mの N Hと P i p の 1 6 8. 9 p p mのカルボニルの間にロ ングレ ン ジが観測 されたこ とにより、 部分構造 Bが推定された。

1) C. H. Hassall, W. A. Thomas, . C. oschidis, J. Chem. S oc. , Perkin Trans. I， 1977, 2371(1977) c ) 部分構造 Dについて

1_T Η_T - 1丄 Ηス ピン結合から （C H_n ) ₂ - C H - C H - C H— N H—なる部分構造が導かれ、 ロ ングレ ンジの — 3C結合によ り この部分構造が確認され、 また、 1 7 0. 6 p p mのカルボニルと 4. 8 8 p mの C Hとのス ピン結合 力ヽら、 ）S— O H—口イ シン （L e u ) の構造がわかり、 5. 4 6 p p mの C Hから /S— O H— L e uがその /3位でエステ ル結合しているこ とが推定された。

½ - ス ピン結合、 ロ ングレ ンジの 丄^1 一 結合お よび N 0 E (Nuclear Overhauser Effect) の測定結果より、 部分構造 Dの側鎖部 （左） の部分構造がわかった。

ロ ングレ ン ジの ¹ 結合から、 ）S - O H— L e uの 4. 8 8 p p mの C Hおよび 8. 3 4 p p mの N Hと側鎖部 の 1 7 7 p p mのカルボニルとにロ ングレンジの相関が観測 されたこ とにより部分構造 Dが推定された。

d ) 新規べプチ ドの化学構造について

ロ ングレ ン ジの H— ¹³ C結合から、 S e rの 1 7 0. 2 p p mの力ノレボニルと /S— O H— L e uの 5. 4 6 p p mの C Hとにロ ングレ ンジ相関が観測されたこ とにより、 部分構 造 Bと部分構造 Dが S e r と ） S— O H— L e uの間でエステ ル結合している こ とがわかった。 また、 ；δ— O H— L e uの 5. 4 6 p p mの C Hと P i p (部分構造 C) の 4. 3 8 p p mの N H ^—〇 H— L e uの 8. 3 4 p p mの N Hと P i p (部分構造 C) の 2. 8 9 p p mの C H₂ , 4. 9 0 p p mの C Hとに N O Eが観測されたこ とから、 部分構造 Cが ;9— O H— L e uの 1 7 0. 6 p p mのカルボニル基に結合 しているこ とがわかった。 残る部分構造 Aの結合方法は一通 りであり、 新規ペプチ ドの化学構造を決定した。

また、 S e rの 6. 4 0 p p mと N Hと N— C H — P h eの 3. 0 4 p p mの C H ₃ の間にも N 0 Eが観測されてい る こ とから、 上記構造が正しいこ とが示唆されている。

e ) N M Rの測定結果は下記の通りである。 表 1 と表 2は¹³ C シ フ ト と炭素タイプ、 および直接結合す る を示し、 表 3〜表 5は 丄11シ フ ト、 スピン結合する H、 ¹³C、 およびロ ングレンジ結合する ¹ Cを示し、 表 6 と 表 7は N 0 E測定結果を示し、 表 8〜表 1 1は ⁱ³Cおよび Hの帰属を示す。

(以下余白）

¹³Cシフトと炭素タイプ、 および結合する ^JH

： No. ¹³Cシフ卜 タイプ 結台する¹ H

1 177.0 >C^O

2 174.3 >oo

3 173.6 >c=o

4 171.9 >c= 一

5 170.6 >c=o

6 170.2 >oo

7 168.9 >c=o

8 136.6 >c=

9 129.4 2 · -CH- 7.25

10 128.3 2 · -CH= 7.26

11 126.7 -CH= 7.20

12 99.2 >c<

13 78.9 >CH- 5.46

14 76.8 >C<

15 71,6 >CH- 3.74

16 60.7 -CH2- 3.49,4.5^ X ^

W t ド

表 3 】Ηシフ ト、 スピン結合する 、 ^{1 3} c、 ロングレンジ結合する^{1 3} c

Ή シフ ト（J) 個数 結合する¹ H^l> 結合する¹³ c Bンク'レン'/結合する 13 _C

1 9.62(s) (OH) 1

2 8.341(d;10.6) 1 H13 CI

3 7.26 2 CIO C8 CIO

4 7 ,25 2 C9 C9 Cl l

5 7.20 1 Cl l C9

6 6.473(d,d;7.0,9.5) I H22A_F22B C20 C4,C27,C28T

7 6.46(br-s) (OH) 1

t 8 6.398(d;7.9) 1 H14 C7

σ 9 5.463(d,d;9.6,1.8) 1 H 13,H27 C13 ' C6.C17.C40.C42

10 5.179(d;d) 1 H25B C19 C7,(C32),(C36)

11 5.027(q;7.2) 1 H34 C22 C3 C43

12 4.90 1 H26B C21 C2,(C34),(C38)

13 4 8 1 H2,H9 C17 Cl,C5,(C29)

14 4.751(d,d;8.4,3.7) 1 H8JK15B C18 C6

15A 4.546(d;11.7) 1 H15B C16 C6

15B 3.494 1 H11.H15A C16

16 4.378(d,d) 1 21B

17 4.28 (br-s) (OH) 1

I.：

ζΖΟ 9EH

ζ£3

て ot 6ΖΌ 0 Ή'8£Η'6Η (ω)Ε6'Τ し τ

££D £6"Ι S

££D (P) て V C

Z£D QieH im'OlH 9 'I S

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8CD 一 (s)0f0*£ it

LZO Vrm'9H (ί·6⁴ΐ Γ·Ρ'Ρ)Ζ0·£ &

(ο'乙' Γί Ψ'ρ π'ε νζζ

VZD sr H⁴vim⁴9TH (£ΐ^)68'Ζ STZ

(Ρ)ίΓ£ VIZ て SOC

ZZD Η0ΖΉ (Γ£Ι'.Ρ)0Ο £ VOZ fID /.£H'9CH (て' 9'S'6''b'p)0ャム '£ 61 一 SO^H

no OCH ί (Γ9:Ρ〉£68Ό 6 zvo L ί (0 ·Ρ)Ζ (Π 8£

9ΖΏ'ζ\0 o 6TH ε (Γ9:Ρ) ^)·1 ί£

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(9*9·Ρ)Ζ-Ζ8Ό

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Zl ^91 ε6·χ

ZI V9Z

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ZtLli ΟΛλ

LS\Z0/S6dT/lDd X

寸 p.

U 寸 6寸，

ex.

CO

寸 9 z. .

£ 6£. 寸 δ.

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9 Z6.

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C

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寸 CO 寸 ^ «η i-ι o r~t οό

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G^)寸

66 Γ δ

I 9.

3 -

0 ΰ)寸

se rts寸

c i ^ N ^ m r

δ寸寸

ss)寸

oe S寸3 9寸 9o) (H.，

部分構造 A 126-7,720

N-OH-Ala N-CH3-Phe

Pip Ser 461 部分構造 C

2·89,3·15

197 U-9, 0-890 101

^— OH— L e u — Side chain

製剤の調製例

製剤例 1 (軟膏剤）

本発明ペプチ ド l m g

プラスチベース （大正製薬社製） l g

本発明べプチ ド 1 m gを乳鉢を用いて細かく 粉砕した後、 プラスチベース 1 gを添加し、 これらを乳鉢上でよ く 混合し て、 軟青剤を調製した。

製剤例 2 (钦靑剤）

本発明ペプチ ド 0. 2 m g メ タノ ール 1 2. 5 /z l プラ スチベース （大正製薬社製） l g

本発明ペプチ ド 0. 8 m gをメ タ ノ ール 5 0 μ 1 に溶解し た後、 得られた本発明ペプチ ド含有メ タノ ールのうち 1 2.

5 1 を乳鉢上でプラスチベース 1 g とよ く 混合して钦青剤 を調製した。

製剤例 3 (液剤）

本発明ペプチ ド 0. 5 m g D M S 0 0. 1 m l

5重量％ァラ ビアゴム水溶液 1. 9 m l 本発明ペプチ ド 0. 5 m gに D M S O 0. 1 m l を添加 して前者を溶解させた後、 得られた本発明ペプチ ド含有 D M

S 0溶液 0. 1 m 1 を少量ずつ攪拌しながら 5重量％ァラ ビ ァゴム溶液 1. 9 m 1 に添加し、 均一に懸濁した液剤を調製 した。

製剤例 4 (液剤）

本発明ペプチ ド 0. 5 m g 生理食塩水 2 m l 本発明ペプチ ド 0. 5 m gに少量の生理食塩水を添加し、 超音波を用いて均一な懸濁液に した後、 生理食塩水を添加し て溶液量を 2 m 】 と し、 液剤を調製した。

製剤例 5 (液剤）

本発明べプチ ド 2 5 m g エタ ノ ール 2. 5 m l ポ リオキシエチ レ ン硬化ヒマシ油 6 0 1 g

生理食塩水 9 6. 5 m l 本発明べプチ ド 2 5 m gをエタ ノ ール 2 5 m 1 に溶解し た後、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 6 0を 1 g加えた。 得られた溶液を少量ずつ攪拌しながら生理食塩水 9 6. 5 m 1 に添加し、 液剤を調製した。

製剤例 6 (液剤）

本発明ペプチ ド 1 0 m g マク ロゴール 4 0 0 5 0 m l 生理食塩水 適量

本発明べプチ ド 1 O m gをマク ロゴール 5 0 m 1 に溶解し た後、 これに生理食塩水を加えて 1 0 O m 1 に し、 液剤を調 製した。 薬理試験

本発明ペプチ ドの抗菌活性を示す試験と して試験例 1、 抗 腫瘍活性を示す試験と して試験例 2、 抗炎症活性を示す試験 と して試験例 3〜 7、 創傷治癒活性を示す試験と して試験例 8〜 1 0、 本発明べプチ ドの急性毒性試験と して試験例 1 1 を挙げる。

試験例 1 抗菌活性 本発明ペプチ ドのメ タノ ール溶液 （ 1 0， 0 0 0 g Zm 1 ) を、 最終濃度がそれぞれ 2 , O O O ^ g /m 5 0 0 / m 1 1 0 0 j g Zm l 、 5 g /m l および

Zm 1 となるよ う に滅菌水で希釈して、 5段階の希釈液を調 製した。 約 5 0 °Cに保った感受性測定用培地 [細菌 ： Muelle r Hinton Broth (Difco 社製） 、 カ ビ ： 1. 5 %寒天加ブ ドウ 糖ペプ ト ン培地 （日水製薬社製） ] に各希釈液をそれぞれ 1 Z 9量加えて十分に混合した後、 この混合液をシャー レに分 注し、 固化させて感受性測定用平板培地 （本発明ペプチ ド 2 0 0 // g Zm l、 5 0 z g Zm l 、 1 0 g /m 1 , 0. 5 g Zm l および 0. l / g /m l ) を作成した。

被験菌と して、 グラム陽性菌である①スタフィ ロコ ッ カス • ァゥ レウス (Staphylococcus aureus) IF0 12732 [黄色ブ ドウ球菌] 、 ②スタ フイ ロ コ ッ カス * ァウ レウス （Staphylo coccus aureus) I ID 1677 ^methici 11 in- resist ant S. aureus; MRSA) [メ チシ リ ン耐性黄色ブ ドウ球菌] 、 ③ェ ンテロ コ ッ カス · フ ァェカ リ ス (Enterocooccus Faecalis) IF0 12964 [腸球菌] および④スタフィ ロコ ッ カス · ェビデルミ ディ ス (Staphylococcus epidermidis) IF0 13889 [表皮ブ ドウ球 菌] と、 グラム陰性菌である⑤シュウ ドモナス * アルギノ サ (Pseudomonas aeruginosa) IF0 13275 [緑膿菌] と、 カ ビ である⑥ ト リ コフ ィ ト ン · メ ンタグロ フ ィ テス （Trichophyt on mentagrophytes) IF0 6202 [白癬菌] を用いた。

各被験菌を表 1 2 に示す培地および条件で培養した。 細菌 ①〜⑤については培地 Muel ler Hinton Brothを用いて菌数が 約 1 0 ^u Zm 1 になるよ う に接種用菌液を調製し、 力 ビ⑥に ついては、 滅菌 0. 0 0 5 %スルホコノヽク酸ジォクチルナ ト リ ウム溶液にこれを浮遊させ、 菌数が約 1 0 ^U Zm l となる よう に接種用菌液を調製した。

こ う して得られた接種用菌液を感受性測定用平板にプラス チッ ク製ループ （内径約 l m m ) で 2 c m程度画線塗抹し、 細菌①〜⑤は 3 5。Cで 1 8〜 2 0時間、 力 ビ⑥は 2 5 °Cで 7 日間培養した。

所定時間培養後、 蘭の発育が阻止される最低濃度をもって 最小発育阻止濃度 （M I C、 g / \ ) と した。 こ う して 得られた結果を表 1 3 に示す。

表 1 2 各披験菌の増殖用培地と培養

表 1 3 各種細菌に対する最小発育阻止濃度 被 験 菌 M I C

{ g / \ )

©Staphylococcus aureus IFO 12732 < 0. 1

©Staphylococcus aureus IID 1677 < 0 . 1

® Enterocooccus Faecalis IFO 12964 < 0 . 1

④ Staphylococcus epidermidis IFO 13889 < 0 . 1

(D Pseudomonas aeruginosa IFO 13275 > 2 0 0

©Trichophyton mentagrophy tes IFO 6202 > 2 0 0 この結果よ り、 本発明ペプチ ドは現在院内感染などの問題 になつている MRSAを含むダラム陽性菌に対しては非常に強い 菌活性を示すこ とが認められた。

試験例 2 腫瘍細胞増殖に対する作用

次の方法で腫瘍増殖に対する本発明べプチ ドの作用を調べ ナ：。

まず、 本発明ペプチ ドをメ タノ ールに溶解し、 各種濃度の 溶液を調製し供試液と した。

試験細胞と して、 マ ウ ス白血病細胞 P 3 8 8 D 1、 マ ウ ス 白血病細胞 L一 1 2 1 0、 およびマ ウ ス黒色腫細胞 B— 1 6 を用い、 これらを 1 0 % F C S含有 R P M I培地にて 5 X 1 0 1 個 Zm l となるよ うに培養した。 9 6穴（well)プレー 卜 に 0. 2 0 m 1 Zwellで細胞懸濁液を添加し、 さ らに供試液 0 , 0 1 m l を添加して C〇 ₂ イ ンキュベーター （ 3 7 °C、 5 % C 0₂ ) 中で 2 4時間培養を行なった。 ト リパンブルー 排除試験により細胞増殖を確認した。 B— 1 6はニュー トラ ルレツ ド染色法にて細胞増殖を確認した。

この試験のコ ン ト ロールと して、 上記供試液含浸液の代わ り に薬物を含まないメ タ ノ ールを用い、 その他の点は上記操 作と同様に行なった。

それぞれの試験はそれぞれ n = 3で行ない、 腫瘍細胞の細 胞増殖に対する最小阻害有効量を決定した。 この試験結果を 表 1 4に示す。 表 1 4 腫瘍細胞の細胞増殖に対する阻害効果

試験細胞 最小有効量

マゥス白血病細胞 P 3 8 8 D 1 0 . 0 0 5 ^ g / ,m 1 マゥス白血病細胞 L 一 1 2 1 0 0 . 0 0 5 ^ g / ,m 1 マゥス黒色腫細胞 B — 1 6 0 . 0 1 0 / g / m 1 この表から明らかなよ う に、 本発明ペプチ ドを含有する供 試液を投与した群では、 コ ン ト ロール群に比べ、 細胞増殖が 明らかに抑制された。 試験例 3 I 型ア レルギー性炎症に対する作用

i ) ラ ッ ト抗 2 , 4 — ジニ ト ロベンゼンスルホ ン酸ー ブ 夕回虫抽出物 （D N P — A s ) 血清の調製

Tada and Okumuraの方法 journal of Immunology 、 1 0 6巻、 1 0 0 2頁、 1 9 7 1年） に準じて D N P — A s を調 製した 0 ブタ回虫 ( Ascaris suum) の抽出物を、 Stre jan an d Campbellの方法 ( Journal of Immunology 、 9 8巻、 8 9 3頁、 1 9 6 7年） に従って調製し、 Eisen らの方法 （Jour na 1 of American Chemical Society、 7 5 、 4 5 8 3頁、 1 9 5 3年） で、 2 , 4 — ジニ ト ロベンゼンスルホ ン酸 （D N P ) と結合させた。 この D N P — A s の l m gを 1 0 ¹⁰個 の百日咳死菌を浮遊させた生理食塩液 l m 1 に溶解し、 体重 2 0 0 g前後の雌性ラ ッ 卜の四肢足踱皮下に注射した。 5 日 後、 D N P — A s の 0. 5 m gを生理食塩液の 0. 5 m l に 溶解し、 左右の背部筋肉内に注射した。 初回注射の 8 日後に 腹部大動脈より採血し、 血清を分離してラ ッ ト抗 D N P — A s血清と して使用 した。 なお、 この抗血清のラ ッ ト 4 8時間 同種 P C A反応の力価は 1 ： 5 1 2であった。

ii) ラ ッ ト 4 8時間同種 P C A反応 （ I型ア レルギー性皮 廣反応） に対する作用

本発明ペプチ ドを 0. 2 5 m g Zm l になるように、 5重 量％アラ ビアゴム水溶液にジメチルスルホキサイ ドを 5重量 %添加してなる溶液に懸濁した。 なお、 対照実験用と してプ レ ドニゾロ ンを 1 O m gZm 1 となるよ うに 5重量％ァラ ビ ァゴム水溶液にジメ チルスルホキサイ ドを 5重量％添加して なる溶液に懸濁した。 このように して得られた懸濁液を供試 液と した。 被験動物と しては体重 1 2 0 g〜 2 0 0 gのウイ ス夕一雄性ラ ッ トを用いた。

まず、 上記抗 D N P— A s血清を生理食塩液で 2 0倍に希 釈してなる注射液 0. 0 5 m l を、 上記ラ ッ 卜の背部皮内に 注射し、 ラ ッ トを上記抗血清で感作した。

次に、 抗血清投与の 4 8時間後に、 対応する抗原と して 2 m g/m 1 の D N P— A sを含む 0. 5重量％ェバン ス ブル 一生理食塩液を 2. 5 m 1 / k g静脈内投与して、 P C A反 応を誘発した。

本発明べプチ ド投与群のラ ッ 卜においては本発明べプチ ド を含有する上記供試液 2 m 1 / k g (本発明ペプチ ド 0. 5 m gZk g) を誘発の 2 4時間前に腹腔内投与も し く は皮下 投与した。 また、 プレ ドニゾロ ン投与群のラ ッ 卜においては プレ ドニゾロ ンを含有する上記供試液 2 m l Zk g (プレ ド 二 ドロ ン 2 0 m gZk g) を誘発の 3時間前に腹腔内投与も し く は皮下投与した。

こ う して皮内反応を惹起した部位の色素漏出を、 Haradaら の方法 （J. Pharm. Pharmacol. 2 3巻、 2 1 8頁、 1 9 7 1年） に従って抽出定量した。 即ち、 抗原注射の 1時間後に ラ ッ トをエーテル麻酔下にて安楽死させ、 P C A反応部の皮 膚を細切し、 これを 0. 3 % (WZV) 硫酸ナ ト リ ウム水溶 液 3容とアセ ト ン 7容の混合液中に 2 4時間浸漬し、 漏出色 素量を求め、 これを抗血清を注射した部位 （site) 当たりの 漏出色素量 （ g) と して表した。 この試験のコ ン ト ロール と して、 薬物を含まない上記ジメ チルスルホキサイ ド含有ァ ラ ビアゴム水溶液を用い、 その他の点は上記操作と同様に行 つて漏出色素量を求めた。

本試験は、 それぞれ 5匹のラ ッ 卜を用いて行い、 漏出色素 量 （ g /site) はこれらラ ッ 卜について得られた値の平均 値を取つた。

腹腔内投与の試験結果を図 1 に、 皮下投与の試験結果を図 2にそれぞれ示す。

これらの図から明らかなよ うに、 本発明ペプチ ドを含有す る供試液を投与した群は、 コ ン ト ロール群に比べ、 ラ ッ ト 4 8時間同種 P C A反応部の皮 1STに漏出する色素量が大幅に減 少し、 顕著な I型ア レルギー性炎症抑制活性を示した。

また、 本発明ペプチ ドを含有する供試液を投与した群では、 プレ ドニゾロ ンを含有する供試液より も少ない投与量で、 コ ン ト ロール群に比べ、 ラ ッ ト 4 8時間同種 P C A反応部の皮 廣に漏出する色素量が大幅に減少した。 すなわち、 本発明に よ り得られたペプチ ドは、 プレ ドニゾロ ン以上の I型ア レル ギー性炎症抑制活性を示す。

試験例 4 III 型ア レルギー性炎症に対する作用

i)ゥサギ抗オボアルブミ ン （Ovalumin) 血清の調整 江田らの方法 （日薬理誌、 6 6巻、 2 3 7頁、 1 9 7 0年） に準じて、 次の手法でゥサギ抗オボアルブミ ン血清を調整し た。 すなわち、 生理食塩液に溶解したオボアルブミ ン （Sigm a 社製） の 2 m g /m l 溶液と完全フ ロイ ン トアジュバン ト (Difco 社製） との等量混合乳化液より なる抗原液を調製し た。 この抗原液の 0. 5 m l ずつを体重 3 k gのニュージー ラ ン ドホワイ ト種の雄性家兎の左右臀筋内に 1週間毎に 4回 注射した。 最終注射の 7 日後に頸動脈から採血し、 血清のみ を分離取得し、 ゥサギ抗オボアルブ ミ ン血清と した。 この抗 血清のラ ッ 卜 4時間異種受身皮膚アナフ ィ ラキ シー （ 4時間 heterologous PCA) 反応の力価は 1 : 3 2であつた。

ii) ラ ッ ト 4時間異種 P C A反応 （III 型ア レルギー性皮 虜反応） に対する作用

本発明べプチ ドを、 最終濃度が 0. 2 5 m g Zm 1 になる よ うに、 5重量％ァラ ビアゴム水溶液にジメ チルスルホキサ ィ ドを 5重量％添加して成る溶液に懸濁した。 なお、 対照実 験用と してプレ ドニゾロ ンを、 最終濃度が 1 O m gZm 1 と なるよ うに、 5重量％ァラ ビアゴム水溶液にジメ チルスルホ キサイ ドを 5重量％添加して成る溶液に懸濁した。 このよう に して得られた懸濁液を供試液と した。 被験動物と しては体 重 1 2 0 g〜 2 0 0 gのウィスター雄性ラ ッ トを用いた。

上記ゥサギ抗オボアルブミ ン血清を生理食塩液で 4倍に希 釈してなる注射液 0. 0 5 m l を、 ラ ッ トの背部皮内に注射 し、 ラ ッ トを上記抗血清で感作した。 次に、 抗血清投与の 4 時間後に、 対応する抗原と して 2 m gZm l のオボアルブミ ンを含む 0. 5重量％ェバンスブルー生理食塩液を 2. 5 m l Zk g静脈注射して、 4時間異種 P C A反応を誘発した。 本発明ペプチ ド投与群のラ ッ トにおいては本発明ペプチ ド を含有する上記供試液 2 m 1 Z k g (本発明ペプチ ド 0 . 5 m g / k g ) を誘発の 2 4時間前に腹腔内投与も し く は皮下 投与した。 また、 プレ ドニゾロ ン投与群のラ ッ トにおいては プレ ドニゾロ ンを含有する上記供試液 2 m 1 k g (プレ ド ニゾロ ン 2 0 m g Z k g ) を誘発の 3時間前に腹腔内投与も し く は皮下投与した。

こ う して皮内反応を惹起した部位の漏出色素を、 Haradaら の方法 （J. Pharm. Pharmacol. 2 3巻、 2 1 8頁、 1 9 7 1 年） に従って抽出定量した。 すなわち、 抗原注射の 1 時間後 にラ ッ トをエーテル麻酔下で安楽死させ、 4時間異種 P C A 反応部の皮膚を細切り し、 これを 0 . 3 % (w Z v ) 硫酸ナ ト リ ゥム水溶液 3容とァセ ト ン 7容の混合液中に 2 4時間浸 漬し、 漏出色素量を求め、 これをゥサギ抗オボアルブ ミ ン血 清を注射した部位 （ s i t e ) 当たりの漏出色素量 （ z g ) と して表した。 この試験のコ ン ト ロールと して、 薬物を含ま ない上記ジメ チルスルホキサイ ド含有アラ ビアゴム水溶液を 用い、 その他の点は上記操作と同様に行なって漏出色素量を 求めた。

本試験はそれぞれ 5匹のラ ッ トを用いて行ない、 漏出色素 量 ( μ gノ s i t e ) はこれらラ ッ 卜について得られた値の 平均値を取つた。

腹腔内投与の試験結果を図 3 に、 皮下投与の試験結果を図 4 にそれぞれ示す。

これらの図から明らかなように、 本発明ペプチ ドを含有す る供試液を投与した群は、 コ ン ト ロール群に比べ、 ラ ッ ト 4 時間異種 P C A反応部の皮膚に漏出する色素量が大幅に減少 し、 顕著なア レルギー性炎症抑制活性を示した。 また、 本発明ペプチ ドを含有する供試液を投与した群では、 プレ ドニゾロ ンを含有する供試液よ り も少ない投与量で、 コ ン ト ロール群に比べ、 ラ ッ ト 4時間異種 P C A反応部の皮； Sf に漏出する色素量が大幅に減少した。 すなわち、 本発明ぺプ チ ドは、 プレ ドニゾロ ン以上の III 型ア レルギー性炎症抑制 活性を示す。

試験例 5 IV型ァ レルギ一性炎症に対する作用

次の方法でラ ッ ト IV型ァ レルギ一性炎症 （ッベルク リ ン反 応） に対する本発明ペプチ ドの作用を調べた。

まず、 本発明ペプチ ドを、 最終濃度が 0. 2 5 m gZm l となるように、 5重量％ァラ ビアゴム水溶液にジメ チルスル ホキサイ ドを 5重量％添加して成る溶液に懸濁した。 なお、 対照実験用と してプレ ドニゾロ ンを 2 5 m gZm l となるよ うに、 5重量％ァラ ビアゴム水溶液にジメ チルスルホキサイ ドを 5重量％添加して成る溶液に懸濁した。 このよう に して 得られた懸濁液を供試液と した。 被験動物と しては体重 1 7 0 g〜 2 5 0 gのウィスター雄性ラ ッ 卜を用いた。

ッベルク リ ン反応は栗山らの方法 （日本薬理学会誌、 9 4 巻、 1 1 3〜 1 1 8頁、 1 9 8 9年） に従って誘発した。 た だし上記供試液 2 m l Zk g (本発明ペプチ ド 0. 5 m g/ k g、 プレ ドニゾロ ン 5 0 m g / k g ) は誘発 1時間前に腹 腔内投与した。 誘発 2 4時間後、 Draizeの判定基準に準じて 紅斑強度の測定を行ない、 直径 1. 8 c mのポンチで反応部 位を打ち抜き皮膚重量を測定した。

この試験のコ ン ト ロ ールと して、 上記供試液含有液の代わ りに薬物を含まない上記ジメ チルスルホキサイ ド含有ァラ ビ ァゴム水溶液を用い、 その他の点は上記操作と同様に行なつ ナ：。

それぞれの試験はそれぞれ 4匹のラ ッ トを用いて行ない、 紅斑強度、 皮廣重量はこれらラ ッ 卜について得られた値の平 均値をと つ ο

この試験結果を図 5に示す。

この図から明らかなよう に本発明べプチ ドを含有する供試 液を投与した群では、 コ ン ト ロール群に比べ、 紅斑強度、 皮 膚重量が明らかに抑制され、 その効果はプレ ドニゾロ ンを投 与した群よ り も強かった。 すなわち、 本発明ペプチ ドは免疫 性炎症である IV型ァ レルギ一性炎症 （ッベルク リ ン反応） に 対してプレ ドニゾロ ン以上の強い抑制活性を示した。

試験例 6 非ア レルギー性炎症に対する作用

次の方法でラ ッ トカラゲニン足踱浮腫反応に対する本発明 ぺプチ ドの作用を調べた。

まず、 本発明ペプチ ドを、 最終濃度が 0. 2 5 m gZm l となるように、 5重量％ァラ ビアゴム水溶液にジメ チルスル ホキサイ ドを 5重量％添加して成る溶液に懸濁した。 なお、 対照実験用と してァスピリ ンを、 最終濃度が 5 O m g Zm 1 となるよ うに、 またプレ ドニゾロ ンを、 最終濃度が 2. 5 m g Zm l となるよう に、 5重量％ァラ ビアゴム水溶液にジメ チルスルホキサイ ドを 5重量％添加して成る溶液に懸濁した。 このよ うに して得られた懸濁液を供試液と した。 被験動物と しては体重 1 2 0 g〜 2 0 0 gのウィスター雄性ラ ッ トを用 いた。

ラ ッ 卜の右後肢の容積を Plethysmometerを用いて測定し、 その後生理食塩液中の力ラゲニンの 1 % ( w / V ) 溶液 0. 1 m 1 をラ ッ 卜の右後肢足躕皮内に注射して力ラゲニ ン足踱 浮腫反応を誘発した。 ラ ッ 卜の右後肢足踱の腫れ度合いを調 ベるため、 足躕浮腫反応誘発後 1 時間毎に 5時間後まで、 ラ ッ 卜の右後肢の容積を P l ethy smometerを用いて測定し、 反応 誘発前の容積との差を求めた。

本発明べプチ ド投与群のラ ッ トにおいては本発明べプチ ド を含有する上記供試液 2 m 1 g (本発明ペプチ ド 0 . 5 m g / k g ) を誘発の 2 4時間前に腹腔内投与した。 ァス ピ リ ン投与群のラ ッ トにおいてはァス ピリ ンを含有する上記供 試液 （アス ピ リ ン 1 O O m g Z k g ) を誘発の 1時間前に腹 腔内投与した。 また、 プレ ドニゾロ ン投与群のラ ッ トにおい てはプレ ドニゾロ ンを含有する上記供試液 2 m 1 Z k g (プ レ ドニゾロ ン 5 m g Z k g ) を誘発の 1 時間前に腹腔内投与 した。

この試験のコ ン ト ロールと して、 薬物を含まない上記ジメ チルスルホキサイ ド含有ア ラ ビア ゴム水溶液を用い、 その他 の点は上記操作と同様に行なってラ ッ 卜の右後肢足摭の腫れ 度合いを調べた。

それぞれの試験は、 それぞれ 5匹のラ ッ トを用いて行ない、 足踱の腫れの度合いはこれらラ ッ 卜について得られた値の平 均値をとつた。

こ の試験結果を図 6 に示す。

こ の図から明らかなように、 本発明ペプチ ドを含有する供 試液を投与した群は、 コ ン ト ロ ール群に比べ、 右後肢足躕の 腫れ度合いが明らかに抑制され、 その効果はア ス ピ リ ンゃプ レ ドニゾロ ンを投与した群より も非常に強かった。 すなわち 本発明べプチ ドはァス ピリ ンゃプレ ドニゾロ ン以上の強い非 ア レルギー性炎症抑制活性を有した。 試験例 7 ァジュバン ト関節炎に対する作用 次の方法でラ ッ トアジュバン ト関節炎に対する本発明ぺブ チ ドの作用を調べた。

まず、 本発明ペプチ ドを、 最終澳度が 0. S S m g Zm l となる よ う に、 5重量％ァラ ビアゴム水溶液にジメ チルスル ホキサイ ドを 5重量％添加して成る溶液に懸濁した。 なお、 対照実験用と してプレ ドニゾロ ンを 5 m g /m 1 となるよう に、 5重量％ァラ ビアゴム水溶液にジメ チルスルホキサイ ド を 5重量％添加して成る溶液に懸濁した。 このよ う に して得 られた懸濁液を供試液と した。 被験動物と しては体重 1 2 0 g〜 2 0 0 gのウィスタールイス雄性ラ ッ トを用いた。

まず、 流動ノ、⁰ラフ ィ ンに懸獨した Mycobacterium tubercul osisH 3 7 R A ( 6 m g /m 1 ) 0. 1 m l をラ ッ ト右後肢 皮下に注射した。 次に上記供試液 2 m l Z k g Z日 （本発明 ペプチ ド 0. 5 m g Z k g Z日、 プレ ドニゾロ ン 1 0 m g / k g 日） を Mycobacterium 注射後 2 2 日間 1 日 1回腹腔内 投与した。 ラ ッ ト左右後肢の容積は Plethysmometerを用いて 測定し、 Mycobacterium 注射前の左右後肢容積との差を求め、 腫れの度合いと した。

この試験のコ ン ト ロールと して、 上記供試液含有液の代わ り に薬物を含まない上記ジメ チルスルホキサイ ド含有ァラ ビ ァゴム水溶液を用い、 その他の点は上記操作と同様に行なつ て、 ラ ッ ト左右後肢の腫れの度合いを調べた。

それぞれの試験はそれぞれ 7匹のラ ッ トを用いて行ない、 腫れの度合いはこれらラ ッ トについて得られた値の平均値を と った。

この試験結果を図 Ί に示す。 この図から明らかなように本発明べプチ ドを含有する供試 液を投与した群では、 コ ン ト ロール群に比べ、 左右後肢足踱 の腫れの度合いが明らかに抑制され、 その効果はプレ ドニゾ ロ ンを投与した群より も非常に強かった。 すなわち、 本発明 ペプチ ドは免疫性慢性炎症であるアジュバン ト関節炎に対し てプレ ドニゾロ ン以上の強い抑制作用を有していた。

試験例 8 肉芽増殖作用

本発明ペプチ ドを、 最終濃度がそれぞれ 5 g Zm l 、 5 0 g m l 、 5 0 0 g Zm l および 5 0 0 0 g /m l になるよ うにメ タノ ールに溶解した。 各濃度のメ タノ ール溶 液の 2 0 / 1 (本発明ペプチ ド 0. 1 /z g Zディ スク〜 1 0 O ju g Zディ ス ク） を直径 8 mmのペー パ ーディ スク （ア ド バンテッ ク社製の抗生物質検定用濾紙） に 2回に分けて染み 込ませた後、 風乾により メ タノ ールを除去した。

被験動物と しては体重 1 2 0〜 2 0 0 gのウィスター雄性 ラ ッ トを用いた。

ラ ッ トをエーテル麻酔下で剃毛し、 背部正中線に沿ってメ スで約 3 c mの切創部を作成した。 作成した切創部よ り上記 ペーパ ーディ スクを皮下に埋め込んだ後、 切創部を縫合した。 1週間後、 ラ ッ トをエーテル麻酔下にて安楽死させ、 皮下か らペー パーディ スクを取り出し、 形成された肉芽の湿重量を 測定した。

コ ン ト ロールと しては、 本発明べプチ ドを含まないメ タノ ール 2 0 β 1 をペーパ ーディ スクに染み込ませついで風乾し たものを用いた。

また、 対照薬と してソルコセ リ ル注射液 （大鹏薬品社製） 2 5 ^ 1 (ソ リ コセ リノレ 1 m g Ζディ スク） をペーパ ーディ スクに染み込ませたものを用い、 その他の点は、 上記と同様 に操作した。 なお、 コ ン ト ロールと しては、 生理食塩液 2 5 μ 1 をペーパーディ スクに染み込ませたものを用いた。

本試験はそれぞれ 5匹のラ ッ トを用いて行い、 肉芽湿重量 はこれらラ ッ 卜について得られた値の平均値を取った。

この試験結果を図 8 に示す。

この図から判るよ うに、 本発明ペプチ ド l g Zディ スク 以上を含有するディ スクを埋め込んだ群では、 コ ン ト ロール 群に比べて明らかに肉芽湿重量が増加し、 ソルコセ リ ル投与 群に比べても肉芽湿重量の著しい増加が認められた。 したが つて、 本発明べプチ ドは細胞増殖作用を有し、 その作用は本 発明べプチ ド 1 iL ディ スクでソルコセ リ ル l m g Zディ スクを上回る ものであるこ とが認められる。

試験例 9 ラ ッ ト切創モデルに対する作用

本発明ペプチ ドを最終濃度が 5 g Zm 1 、 2 0 g /m 1 および 5 0 β g Zm 1 になるように生理食塩液に懸濁し、 本発明べプチ ドの供試液を調製した。

被験動物と しては体重 2 5 0 〜 3 0 0 gのウィ スター雄性 ラ ッ ト ¾r用いた。

ラ ッ トをエーテル麻酔下で剃毛し、 背部正中線に垂直な方 向にメ スで 3 c mの切創部を作成した。 この切創部を等間隔 で 3ケ所で縫合し、 3時間後に上記供試液 0 . 5 m l (本発 明ペプチ ド 2 . 5 ju g 創、 1 0 g 創および 2 5 / g Z 創） を切創部周辺に皮下投与した。 切創翌日よ り 3 日間、 用 時調製した供試液 0 . 5 m l (本発明ペプチ ド 2 . 5 β g / 創、 1 0 g 創および 2 5 g Z創） を 1 曰 1回切創部皮 下に投与した。 切創 4 日後にラ ッ トをエーテル麻酔下にて安 楽死させ、 抜糸後、 切創中央部 2 c mを含む短冊状の皮; »切 片を切り取った。 皮庸切片の結合組織を除去した後、 レオメ 一夕一を用いて切創部の耐釗張力 （gZ c m) を測定した。

コ ン トロールと しては、 生理食塩液を用いた。

また、 対照薬と しては、 ソルコセ リ ル注射液 0. 5 m l (ソルコセ リ ル 2 0 m g 創） （大鵬薬品社製） を用いた。 本試験はそれぞれ 1 5匹のラ ッ トを用いて行い、 耐創張力 ( g / c m) はこれらラ ッ 卜について得られた値の平均値を 取った。

この試験結果を図 9に示す。

この図から判るように、 本発明べプチ ドを投与した群では、 コ ン ト ロール群に比べ、 明らかに耐創張力が増加し、 また、 対照薬のソルコセ リ ル注射液より もさ らに耐創張力が増加し た。 すなわち、 本発明ペプチ ドは、 ソルコセ リ ル注射液より も強力な創傷治癒促進効果を示すこ とが認められた。

試験例 1 0 ラ ッ ト皮庸欠損モデルに対する作用

本発明ペプチ ドと钦青基剤 （大正製薬社製のプラスチベー ス） を混合し、 本発明ペプチ ドを 0. 0 2 %含む钦膏を作成 した。

被験動物と しては体重 2 5 0〜 3 0 0 gのウィ スタ ー雄性 フ ッ ト ¾用 、た o

欠損作成 2 日前から 3 日間、 デキサメ サゾン （ 1 m gZk g ) を腹腔投与したラ ッ 卜をエーテル麻酔下で剃毛し、 横臥 させて引っ張り、 ポンチ （内径 1 6 mm) を用いて背部の正 中線に対照の部位に皮膚欠損部を作成した。 用時調製した軟 膏 5 0 m g (本発明ペプチ ド 1 0 // g含有） を塗布した滅菌 濾紙 （ 2 5 x 2 5 mm) を皮膚欠損部あたり 1枚貼付し、 上 からテガダーム （ 3 M、 ドレッ シング材） で覆い、 さ らに粘 着性伸縮包帯で覆い固定した。 軟青の投与は、 1 日 1回治癒 するまで毎日行った。 欠損作成日から治癒日までノギスを用 いて欠損部の短径、 長径を求め、 欠損部を楕円とみな して欠 損部の面積を求めた。

コ ン ト ロールと しては、 钦膏基剤 （大正製薬社製のプラス チベース） を用い、 その他の点は上記操作と同様に行った。

また、 対照薬と しては、 ォルセノ ン钦青 5 0 m g ( ト コ レ チナ一 ト 1 2 5 欠損創） （日本レグリ ー社製） を用い た。

本試験はそれぞれ 7匹のラ ッ トを用いて行い、 欠損部面積 はこれらラ ッ 卜について得られた計 1 4 ケ所の欠損部の面積 の平均値を取った。 この試験の欠損部面積の経時変化および 治癒日数を図 1 0、 図 1 1 および表 1 5 に示す。 表 1 5

P < 0 . 0 1 コ ン ト ロールに対して有意差あり 図 1 0、 図 1 1 および表 1 5から判るよ うに、 本発明ぺプ チ ドを投与した群では、 コ ン ト ロール群に比べて有意な欠損 部面積縮小効果および平均治癒日数短縮が認められた。 また、 本発明べプチ ドを投与した群では、 対照薬のオルセノ ン钦膏 に比べても顕著な欠損部面積縮小効果および平均治癒日数の 短縮が認められた。 このよ う に、 本発明ペプチ ドは、 顕著な 創傷治癒促進効果を示すこ とが認められた。

試験例 1 1 毒性試験

次の方法でラ ッ トに対する本発明べプチ ドの毒性を調べた。 まず、 本発明ペプチ ドを、 5重量％ァラ ビアゴム水溶液にジ メ チルスルホキサイ ドを 5重量％添加して成る溶液に懸濁し、 供試液と した。 被験動物と しては体重 1 2 0 g〜 2 0 0 gの ウィスター雄性ラ ッ トを用いた。

上記供試液をラ ッ 卜に皮下投与し、 死亡状況を確認した。 その結果、 2 0 m g k g投与でも死亡しなかった。 産業上の利用可能性

本発明によって、 式 [ I ] で示される新規ペプチ ドが提供 せられる。 本発明による新規ペプチ ドはアレルギー性および 非ア レルギー性炎症抑制作用、 抗菌作用、 抗腫瘍作用、 創傷 治癒作用などを示し、 炎症抑制剤、 免疫抑制剤、 抗菌剤、 抗 腫瘍剤、 創傷治癒剤、 抗潰瘍剤などと して有用である。 よつ て、 本発明により、 このよ うな薬理作用を有する治療剤が提 供せられる。

Claims

請求の範囲 下記式 [ I ]

で示される新規べプチ ド。

2. 放線菌 S. ノ ビリ スを培養し、 得られた培養液また は同液の乾固物も し

く は培養菌体から有機溶剤によって抽出された抽出物を、 各種カ ラムク ロマ ト グラ フ ィ ーに付し、 目的物を含むカラ ムク ロマ 卜グラ フィ 一画分を再結晶処理する こ とによ り得 られた請求項 1記載のペプチ ド。

3. 放線菌 S . ノ ビリ スが理化学研究所の保存菌 （ J C M 4 2 7 4 ) 、 米国における保存菌 A T C C 1 9 2 5 2ま たはオラ ンダにおける保存菌 C B S 1 9 8. 6 5である請 求項 2記載のぺプチ ド。

4. S . ノ ビリ スの培養液またはその乾固物も し く は菌 体自体の抽出液を硫

安処理し、 得られた沈殿物を溶媒抽出する請求項 2または 3記載のぺプチ ド。

5. カラムク ロマ トグラフィ ーの充填剤がォクタデシル シラ ン類からなる請

求項 2から 4のうち 1記載のぺプチ ド。

6. 請求項 1記載の式 [ I ] で示されるペプチ ドからな る抗生物質。

7. 請求項 1記載の式 [ I ] で示されるペプチ ドからな る 菌剤 0

8. 請求項 1記載の式 [ I ] で示されるペプチ ドからな る抗腫瘍物質。

9. 請求項 1記載の式 [ I ] で示されるペプチ ドからな る抗腫瘍剤。

1 0. 請求項 1記載の式 [ I ] で示されるペプチ ドからな る抗炎症物質。

1 1. 請求項 1記載の式 [ I ] で示されるペプチ ドからな る抗炎症剤。

1 2. 請求項 1記載の式 [ I〕 で示されるペプチ ドからな る創傷治癒物質。

3. 請求項 1記載の式 [ I ] で示されるペプチ ドからな る創傷治癒剤。

4. 請求項 1記載の式 [ I ] で示されるペプチ ドからな る抗潰瘍剤。