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WO1996017251A1 - Procede de determination quantitative de bilirubine - Google Patents

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Publication number
WO1996017251A1
WO1996017251A1 PCT/JP1995/002445 JP9502445W WO9617251A1 WO 1996017251 A1 WO1996017251 A1 WO 1996017251A1 JP 9502445 W JP9502445 W JP 9502445W WO 9617251 A1 WO9617251 A1 WO 9617251A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bilirubin
measuring
kit
oxidizing agent
sample
Prior art date
Application number
PCT/JP1995/002445
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ryo Kojima
Katsuhiro Katayama
Yoshikiyo Sasagawa
Original Assignee
Nitto Boseki Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18161399&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO1996017251(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Nitto Boseki Co., Ltd. filed Critical Nitto Boseki Co., Ltd.
Priority to US08/849,080 priority Critical patent/US5872009A/en
Priority to DE69534877T priority patent/DE69534877T2/de
Priority to JP51858696A priority patent/JP3216138B2/ja
Priority to EP95938616A priority patent/EP0795753B1/en
Publication of WO1996017251A1 publication Critical patent/WO1996017251A1/ja

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
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    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring bilirubin contained in biological body fluids such as plasma, serum, and urine.
  • a method for measuring bilirubin by measuring the optical change of a biological body fluid sample by using nitrous acid as an oxidizing agent, and the optical change of the biological body fluid sample by applying an oxidizing agent to the biological body fluid sample The present invention relates to a method for directly measuring pyrilrubin with high sensitivity by allowing an oxidizing agent to act in the presence of a specific nonionic surfactant in measuring the concentration of pyrilvin.
  • Pyrirubin is a metabolite of hemoglobin derived from aged erythrocytes and is a major component of bile pigments.
  • pyrilvin in blood There are two types of pyrilvin in blood: direct pyrilvin (conjugated) and indirect bilirubin (free).
  • direct bilirubin the propionic acid group in the side chain is enzymatically linked to glucuronic acid mainly in the liver in the liver, and is highly water-soluble and directly reacts with the diazo reagent to form an azo dye.
  • Indirect pyrilvin has a propionate group in a free state, has low water solubility, and reacts with a diazo reagent for the first time in the presence of a reaction accelerator such as alcohol to form an azo dye.
  • Measurements obtained by measuring bilirubin in blood include total pyrirubin and direct bilirubin.
  • the total pyrilvin value is a value obtained by reacting a diazo reagent in the presence of a reaction accelerator and measuring the total of the conjugated form and the free form.
  • the direct pyrilvin value is a value obtained by reacting a diazo reagent in the absence of a reaction accelerator and measuring only the conjugated form. From these values, the conjugated and free bilirubin concentrations can be separately measured to diagnose various liver diseases and distinguish jaundice. Therefore, measurement of pyrirubin is an important item in clinical tests.
  • the diazo method for measuring the color intensity of azobilirubin produced by the reaction between bilirubin and a diazo reagent is a conventional mainstream and widely used for diagnosis of various liver diseases.
  • the diazo method has problems that the measurement reagent is unstable such that it can be used only for about 5 days after preparation, and that the measurement value is interfered by ascorbic acid or hemoglobin coexisting in the sample.
  • the BOD method has the problems that the cost of measurement is inevitably high due to the use of the enzyme, and that it is difficult to stabilize the enzyme, so that it can be used for only about two weeks after preparation.
  • the chemical oxidation method uses highly toxic metal ions and the like as an oxidizing agent, it has a drawback inevitably having to deal with wastewater treatment and environmental pollution.
  • the high-performance liquid chromatography-film method which has good measurement values, requires a dedicated measurement device, and can process many samples at the same time as other items in clinical laboratory chemistry. It has the disadvantage of lacking general versatility.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned situation, has good correlation with the conventional enzyme method, has excellent stability of the measurement reagent, and has little interference with measured values due to coexisting substances in the sample. It is an object of the present invention to provide a safe method for measuring bilirubin, which can be measured at a low cost and at a low cost, and has a low risk of environmental pollution.
  • a method for measuring bilirubin that can directly and selectively measure bilirubin with high sensitivity Its purpose is to provide.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve these objects, and as a result, using nitrous acid as an oxidizing agent, a reaction accelerator which promotes the oxidation of pyrilvin by nitrous acid, particularly the oxidation of indirect pyrilvin, or such an oxidizing agent.
  • nitrous acid as an oxidizing agent
  • a reaction accelerator which promotes the oxidation of pyrilvin by nitrous acid, particularly the oxidation of indirect pyrilvin, or such an oxidizing agent.
  • the surprising fact was that it was possible to directly quantify pyrilrubin and total bilirubin by selecting reaction conditions such as the addition of a reaction inhibitor that suppresses CO2.
  • the present invention has been achieved with power and knowledge.
  • the present invention provides a method for measuring total bilirubin or direct bilirubin by measuring nitric acid as an oxidizing agent on a biological body fluid sample and measuring the optical change of the sample.
  • This is a direct bilirubin measurement method in which nitrous acid acts as an oxidizing agent on a biological fluid sample in the presence of a reaction inhibitor that suppresses oxidation, and the optical change of the sample is measured.
  • the present invention relates to a method for measuring total bilirubin, in which nitrous acid is allowed to act as an oxidizing agent on a biological fluid sample in the presence of a reaction accelerator that promotes indirect pyrilrubin oxidation, and the optical change of the sample is measured. is there.
  • the present invention provides a kit for measuring pyrilrubin in a biological body fluid sample, wherein i) an acidic solution, and
  • the present invention provides a kit for directly measuring bilirubin in a biological body fluid sample, and i) an acidic solution containing a reaction inhibitor;
  • kits that contains. Further, the present invention provides a kit for measuring total pyrilrubin in a biological body fluid sample, and i) an acidic solution containing a reaction accelerator, and
  • the present invention is selected from polyoxyethylene (n-alkyl or iso-alkyl) ether having an HLB value of 12 or more and less than 15 and polyoxyethylene (n-alkylphenyl) ether having an HLB value of 12 or more and 19 or less.
  • This is a direct bilirubin measurement method in which an oxidizing agent is allowed to act on a biological fluid sample in the presence of at least one nonionic surfactant, and the optical change of the sample is measured.
  • the present invention provides a kit for directly measuring pyrilrubin in a biological body fluid sample
  • FIG. 1 shows specific conditions when the method for measuring pyrilrubin of the present invention is performed using an automatic analyzer.
  • FIG. 2 shows the results of measuring pyrylvin directly or indirectly by the nitrite oxidation method of the present invention in the presence of thiourea as a reaction inhibitor. This is a change in absorbance observed with a change in reaction time.
  • the horizontal axis represents the measurement point (0.3 min. Z point), and the vertical axis represents the absorbance at 450 nm.
  • FIG. 3 shows the correlation between the nitrite oxidation method of the present invention in the presence of thiourea and the BOD method in direct bilirubin measurement.
  • the horizontal axis shows the direct bilirubin concentration (mg / d 1) measured by the BOD method, and the vertical axis shows the direct pyrilvin concentration (mgZd 1) measured by the nitrite oxidation method of the present invention in the presence of thiourea.
  • Figure 4 shows the results in the presence of the reaction accelerator cetyltrimethylammonium bromide.
  • 4 shows the results of measuring direct bilirubin or indirect bilirubin by the nitrite oxidation method of the present invention. This is a change in absorbance observed over time.
  • the horizontal axis represents the measurement point (0.3 min. Z point), and the vertical axis represents the absorbance at 450 nm.
  • FIG. 5 shows the correlation between the nitrite oxidation method of the present invention in the presence of cetyltrimethylammonium bromide and the BOD method in the total pyrilvin measurement.
  • the horizontal axis represents the total pyrilvin concentration (mg / d 1) measured by the BOD method, and the vertical axis represents the total bilirubin concentration (mg / d 1) measured by the nitrite oxidation method of the present invention in the presence of cetyltrimethylammonium bromide. ).
  • FIG. 6 shows a calibration curve obtained by directly measuring bilirubin by the method for directly measuring bilirubin using vanadic acid as an oxidizing agent in the presence of a specific nonionic surfactant of the present invention.
  • FIG. 7 shows a calibration curve obtained by directly measuring bilirubin by the direct bilirubin measurement method using bilirubin oxidase as an oxidizing agent in the presence of the specific non-ionic surfactant of the present invention.
  • total pyrylrubin or direct bilirubin is measured by allowing nitrous acid to act as an oxidizing agent on a biological body fluid sample and measuring the optical change of the sample.
  • a kit for measuring pyrylvin in a biological body fluid which contains an acidic solution and a nitrite solution, is used.
  • a biological body fluid sample is a sample that can be obtained from a body fluid in a living body, and mainly refers to plasma, serum, urine, and the like.
  • nitrous acid when allowed to act on a biological body fluid sample as an oxidizing agent, usually, an acidic solution in which citrate or the like is dissolved is added to the biological body fluid sample, and a nitrite solution is further added thereto.
  • the acidic solution and the nitrite solution are usually both aqueous solutions.
  • the acidic solution added to the biological body fluid sample preferably contains an acid such as citric acid, lactic acid, acetic acid, and phthalic acid, and is preferably an acidic solution having a pH of 2 to 6 when combined with a nitrite solution.
  • the nitrite used to prepare the nitrite solution is used for the purpose of the present invention.
  • alkali metal salts are preferred.
  • sodium and potassium salts are preferable in view of availability.
  • the concentration of nitrite during pyrilrubin measurement is not particularly limited as long as it is a concentration that can oxidize bilirubin in a force sample that varies depending on the amount of the sample.
  • the concentration in the final reaction solution is usually in the range of 0.01 to 201 1 1110 1/1, preferably 0.05 to 4 mmol Zl.
  • the method for measuring direct bilirubin of the present invention it is preferable to use a reaction inhibitor that can be added to a reaction reagent for the purpose of preventing indirect bilirubin from being oxidized by nitrous acid.
  • the method for measuring direct pyrilvin of the present invention is directed to a kit for directly measuring pyrilrubin in a biological body fluid sample, the kit comprising an acidic solution containing a reaction inhibitor that suppresses indirect pyrilvin oxidation, and a kit containing a nitrite solution.
  • a kit for directly measuring pyrilrubin in a biological body fluid sample the kit comprising an acidic solution containing a reaction inhibitor that suppresses indirect pyrilvin oxidation, and a kit containing a nitrite solution.
  • Examples of such indirect pyrilvin reaction inhibitors include thiourea, thiourea having a lower alkyl at the N-position, quaternary lower alkylammonium salts, N-lower alkylpyridinium salts, and lower alkyl at the N-position. Vividium salt or the like can be used.
  • lower alkyl refers to alkyl having 1 to 6 carbon atoms. In the present invention, the lower alkyl is preferably a straight-chain lower alkyl in view of availability.
  • Thiourea having a lower alkyl at the N-position means 1,1,3,3-tetramethylthiourea, 1,1,3-trimethylthiourea, 1,3-dimethylthiourea, N- Methylthiourea is preferred.
  • Quaternary lower alkylammonium salts include N-lower alkyl-N, N, N-trimethylammonium salt, N-lower alkyl-1-N, N, N-triethylammonium salt, —Lower alkyl mono-N, N, N-tripropylammonium salt. These salts are preferably chloride, bromide, etc. because of their availability.
  • reaction inhibitors include, for example, hydrazines such as hydrazine, phenylhydrazine, and salts thereof; hydroxyquinamines such as hydroxylamine, phenylhydroxylamine, and salts thereof; acetoxime, diacetyl monoamine; Oximes such as oxime and salicylaldoxime: tetraethylenepentamine, triethyl Aliphatic polyvalent amines such as lenttetramine; phenols such as phenol, p-chlorophenol, and mononaphthol;
  • reaction inhibitors are effective even if used alone, but the suppression effect may be further improved by combining two or more kinds. Therefore, they may be appropriately selected and used according to the situation.
  • the reaction can usually be carried out by adding an acidic solution containing the reaction inhibitor to a biological body fluid sample, and then further adding a nitrite solution.
  • the acidic solution used here is prepared by adding a reaction inhibitor to the above-mentioned acidic solution, and the same nitrite solution as described above can be used.
  • the pH range of the reaction solution when directly reacting bilirubin and nitrous acid in the presence of a reaction inhibitor is preferably from 2 to 6, and more preferably from pH 3.5 to 4.5. If the pH is too high, the oxidation reaction power is hard to progress. If the pH is too low, the effect of suppressing the reaction to indirect bilirubin is reduced, and the reaction selectivity is likely to be lost.
  • the concentration of the reaction inhibitor used is not particularly limited as long as it can suppress the oxidation of free pyrilrubin in the sample, and varies depending on the type of the reaction inhibitor. Usually, the concentration of the final reaction solution is 0.01 to 1%. 0 V% range.
  • the measurement time can be shortened by coexisting a reaction accelerator that promotes the oxidation reaction of indirect pyrilvin with an oxidizing agent, which is a commonly used direct reagent, in the reaction reagent.
  • an oxidizing agent which is a commonly used direct reagent
  • the method for measuring total bilirubin according to the present invention is a kit for measuring total bilirubin in a biological body fluid sample, the kit comprising an acidic solution containing a reaction accelerator for promoting the oxidation of indirect pyrilvin, and a kit containing a nitrite solution.
  • the reaction accelerator used in the present invention may be an anionic surfactant such as sodium lauryl sulfate, sodium laurylbenzene sulfonate, sodium cholate, or cetyltrimethylammonium bromide, cetylpyridinium chloride.
  • anionic surfactant such as sodium lauryl sulfate, sodium laurylbenzene sulfonate, sodium cholate, or cetyltrimethylammonium bromide, cetylpyridinium chloride.
  • examples thereof include those usually used for this kind of purpose in this field, such as cation-type surfactants such as amides and amphoteric surfactants such as alkylbetaine.
  • force-ion type surfactants and amphoteric type surfactants are more preferable under acidic conditions since they have little interaction with proteins.
  • reaction accelerator When direct bilirubin and indirect bilirubin are reacted in the presence of a reaction accelerator, an acidic solution containing the reaction accelerator is added to a biological fluid sample in the same manner as described above, and then a nitrite solution is added. Can be implemented.
  • the pH range of the reaction solution is preferably from 1.5 to 6, and more preferably from 2.5 to 4. If the pH is too high, the oxidation reaction will be slow and will tend to give a negative error to the measured value. If the pH is too low, a non-specific reaction is likely to occur and a positive error is likely to be given to the measured value.
  • the concentration of the reaction accelerator used is not particularly limited as long as it can promote the oxidation of bilirubin in the sample, but is usually 0.01 to 1 OwZv%, preferably 0, as the concentration in the final reaction solution.
  • the range is 1 to 5 wZ v%.
  • polyoxyethylene having an HLB value of 12 or more and less than 15 is used as a method for directly measuring pyrilrubin.
  • polyoxyethylene having an HLB value of 12 or more and less than 15 is used as a method for directly measuring pyrilrubin.
  • N-alkyl or iso-alkyl) ethers and at least one non-ionic surfactant selected from polyoxyethylene (n-alkyl fuunyl) ethers having an HLB value of 12 or more and 19 or less there is provided a method for directly measuring pyrilrubin, in which an oxidizing agent is allowed to act on a biological body fluid sample, and the optical change of the sample is measured.
  • oxidizing agent When an oxidizing agent is applied to a biological fluid sample in the presence of a specific nonionic surfactant as described above, the oxidizing agent easily reacts directly with pyrirubin and, on the other hand, reacts with indirect bilirubin. Thus, the selectivity of the reaction between the oxidizing agent and the direct bilirubin is improved. In addition, bilirubin can be accurately measured directly from a biological fluid sample directly containing pyrirubin at a high temperature.
  • Such a method for directly measuring bilirubin can be carried out by using an acidic solution containing the above-mentioned specific non-ionic surfactant and a kit containing an oxidizing agent solution.
  • Polyoxyethylene (n-alkyl or is 0-alkyl) ethers having an HLB value of 12 or more and less than 15 which is one of specific nonionic surfactants include, for example, Adeletol SO—14 5 (Polyoxyethylene (iso-alkyl) ether, Asahi Denka Co., Ltd. trade name), Addetitol SO-135 (Polyoxyethylene (iso-alkyl) ether, Asahi Denka Co., Ltd.
  • Adekitoru SO— 120 polyoxyethylene (iso-alkyl) ether, Asahi Denka Co., Ltd., trade name
  • Emulgen 707 polyoxyethylene (n-alkyl) ether, Kao, trade name
  • Emulgen 709 Polyoxyethylene (n-alkyl) ether, Kao Corporation (trade name), and the like.
  • Nonionic surfactants having an HLB value of less than 12 are preferred because the solution has a low astigmatism and the solution tends to become cloudy at the temperature at which the measurement is performed, that is, at room temperature to 37 ° C. Absent.
  • the absorbance of bilirubin directly in the solution tends to be low, so that a sufficient color strength is obtained at the time of measurement. It is not preferable, and a negative error is likely to occur in the measured value of bilirubin directly, which is not preferable, and the HLB value is particularly preferably in the range of 12 to 14.5, particularly preferably in the range of 12 to 14.
  • the surfactant include Adekin Thor SO-135, Emulgen 707, and Adekin Thor SO-145.
  • nonionic surfactants used in the present invention are polyoxyethylene (n-alkylphenyl) ethers having an octane value of 12 or more and 19 or less, such as Adeletol NP-675. (Polyquinethylene (n-nonylphenyl) ether, Asahi Denka Co., Ltd.)
  • Adekitoru Toll NP-700 polyoxyethylene (n-nonylphenyl) ether; Asahi Denka Co., Ltd.)
  • Adder Toll NP-7 720 polyoxyethylene (n-nonylphenyl) ethereol, trade name of Asahi Denka Co., Ltd.).
  • the HLB value is in the range of 12 to 14.8, especially in the range of 12 to 14.5. Boxes are preferred, such as Adeletor NP-695.
  • oxidizing agents include, for example, chemical oxidizing agents such as vanadate ion, trivalent manganese ion, divalent copper ion, and the like, and enzymatic oxidizing agents such as pyrylvinoxidase.
  • a nonionic surfactant In order to directly measure bilirubin in a biological fluid sample in the presence of the above-mentioned specific non-ionic surfactant, a nonionic surfactant, and further, if necessary, a reaction inhibitor and polyvinyl This can be done by adding an acid solution containing pyrrolidone and then adding an oxidizing agent solution.
  • the working concentration of the nonionic surfactant is usually in the range of 0.01 to 5%, preferably 0.1 to 1%, as the concentration in the final reaction solution.
  • concentration used when a reaction inhibitor is used is the same as in the case of the direct pyrilvin measurement method described above.
  • concentration of polyvinylpyrrolidone used is usually in the range of 0.01 to 5, preferably 0.1 to 1% as the concentration in the final reaction solution.
  • the concentration of the oxidizing agent varies depending on the type of the oxidizing agent used, the amount of the biological fluid sample, and the like.
  • the concentration in the final reaction solution includes vanadate ion, trivalent manganese ion, divalent copper ion, and the like.
  • chemical oxidants it is usually in the range of 0.1 to 2 OmM, preferably in the range of 0.4 to 4 mM, and in the case of enzymatic oxidants such as bilirubin oxidase it is usually 0.1. 220 KU /, preferably in the range of 0.5-5 K UZ.
  • nitrous acid is used as the oxidizing agent, use the same concentration as above. Can be used with
  • reagents such as buffer species, preservatives, chelating agents, surfactants, and the like are known in the measurement reagents. Can be appropriately selected and used according to the above method. These reagents can be usually used by adding to the above-mentioned acidic solution.
  • a chelating agent used for such a purpose include, for example, ethylenediaminetetracarboxylic acid (EDTA), ditristrisuccinic acid (NTA), cyclohexanediaminetetraacetic acid (CyDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid
  • EDTA ethylenediaminetetracarboxylic acid
  • NTA ditristrisuccinic acid
  • CyDTA cyclohexanediaminetetraacetic acid
  • DTP A hydroquinethylethylene diamine triacetic acid
  • EDTA-OH hydroquinethylethylene diamine triacetic acid
  • TTHA triethylene tetrimine hexaacetic acid
  • HI DA hydroxyethyliminoniacetic acid
  • concentration of these chelating agents used in the measurement of pyrilrubin is not particularly limited as long as the concentration does not interfere with the measurement of pyrilrubin.
  • the concentration in the final reaction solution is usually from 0.02 to 5 OmM, preferably from 0.1 to 30 mM, more preferably from 1 to 20 mM.
  • the following method may be performed. That is, in order to measure the total bilirubin concentration, an acidic solution containing a reaction accelerator is used as the first reagent, and this is mixed with a biological fluid sample containing pyrilvin, such as plasma, serum, and urine, and the pyrilvin in this solution is mixed.
  • a biological fluid sample containing pyrilvin such as plasma, serum, and urine
  • absorbance A The absorbance in the wavelength range (430 to 460 nm) is measured based on the above, and the measured value is referred to as absorbance A.
  • a second reagent solution containing nitrite is added to the solution, and the oxidation reaction of bilirubin is performed at 25 to 40 for 3 to 15 minutes, and then a wavelength range based on pyrilvin in the solution (430 to 460 nm) is again obtained. )), Measure the absorbance, and determine the measured value as absorbance B. After subjecting the obtained absorbance A and absorbance B values to liquid volume correction, etc., determine the change in absorbance before and after the oxidation reaction. From this value and a calibration curve prepared based on the absorbance change amount obtained by the same operation using a standard solution with a known bilirubin concentration in advance, the total pyrilvin in the biological body fluid sample was determined. The concentration can be determined.
  • an acidic solution containing a reaction inhibitor, or the above-mentioned specific non-ionic surfactant and, if necessary, a reaction inhibitor and polyvinylpyrrolidone are used instead of the reaction accelerator.
  • the acidic solution is used as the first reagent, and the second reagent is the same as that used to determine the total pyrirubin concentration, and the operation is performed in the same manner as in the case of determining the total bilirubin concentration.
  • the measurement method of the present invention can be applied to a general-purpose automatic analyzer commercially available for biochemical tests.
  • What can be used as an automatic analyzer in the present invention is, for example, Hitachi 750, Hitachi 705, Hitachi 736, Hitachi 715 , Hitachi 71170, Hitachi 720, and the like, but are not limited to the exemplified models, and may be any of similar models.
  • total or direct bilirubin levels in many biological fluid samples can be measured in a short time.
  • the first reagent which was an acidic solution, used an aqueous solution containing the following components and adjusted to pH 4.00 with NaOH.
  • Cyclohexaneaminetetraacetic acid (CyDTA) 1 mM
  • the first reagent which was a nitrite solution
  • an aqueous solution containing the following components was used.
  • indirect pyrilvin sample a 20 mM tris bite solution containing free pyrilvin equivalent to indirect pyrilvin 4 Omg / d1 was used.
  • the measurement was performed under the conditions shown in Fig. 1 using a Hitachi 7170 automatic analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd.). Under these conditions, pyrirubin preparation 61 and the first reagent 180 ⁇ 1 were mixed, and the mixture was left at 37 ° C for 5 minutes. Then, the resulting mixture was mixed with the second reagent 45 ⁇ Add 1 to start the reaction. These operations are performed automatically when parameters are set. Note that the absorbance (450 nm) of the mixed solution is automatically measured every 0.3 minutes after mixing the pyrilrubin sample and the first reagent. Figure 2 shows the results.
  • the same reagents as in Example 1 were used for the first reagent and the second reagent.
  • the standard serum for pyrirubin for determining the calibration curve used was Nescort BIL ⁇ standard serum (manufactured directly by Nihon Shoji Co., Ltd., containing 7.8 mg Zd1 of pyrirubin and 12.1 mgZdl of total pyrirubin directly). The operation was performed in the same manner as in Example 1, except that a new human serum was used instead of the pyrilrubin sample.
  • the concentration of pyrilvin was determined directly as follows. The first reagent and new human serum were mixed, and the absorbance at 450 nm in this solution was measured. The measured value was taken as absorbance A. Next, the second reagent was added to the solution, an oxidation reaction was carried out, and the absorbance of the reaction solution was measured again. After subjecting the obtained absorbance A and absorbance B values to liquid volume correction, determine the change in absorbance before and after the oxidation reaction. The concentration of direct bilirubin in neonatal human serum was determined from this value and a calibration curve created based on the absorbance change obtained by the same operation using a standard solution with a known direct bilirubin concentration in advance. .
  • Nescort D—BIL—VE Nehon Shoji Co., Ltd.
  • Fig. 3 shows a graph of the correlation results.
  • Example 3
  • the first reagent used was an aqueous solution containing the following components and adjusted to pH 300 with NaOH.
  • an aqueous solution containing the following components was used as the second reagent.
  • Example 3 As the first and second reagents, the same reagents as in Example 3 were used.
  • a standard serum for pyrirubin for obtaining a calibration curve Nescort BIL standard serum (directly containing 7.8 mg Zd1 of bilirubin and 12.1 mg / dl of total pyrilrubin) manufactured by Nihon Shoji Co., Ltd. was used. The operation was performed in the same manner as in Example 3, except that a new human serum was used instead of the pyrilrubin sample.
  • the concentration of total bilirubin was determined as follows. The first reagent and new human serum were mixed, and the absorbance at 450 nm in this solution was measured. Next, the second reagent was added to the solution, an oxidation reaction was carried out, and the absorbance of the reaction solution was measured again. After subjecting the obtained absorbance A and absorbance B values to liquid volume correction, calculate the change in absorbance before and after the oxidation reaction.c Use this value and the standard solution with a known total bilirubin concentration in advance ⁇ From the calibration curve created based on the change in absorbance obtained by the same operation, the concentration of total pyrylrubin in the new human serum was determined.
  • Total bilirubin was measured using a measurement kit of Nescort T—BIL—VE (manufactured by Nihon Shoji Co., Ltd.) according to the manual.
  • Figure 5 shows a graph of the correlation results.
  • the present invention has revealed that the concentration of total bilirubin in human serum can be accurately measured.c Examples 5 to 13 and Comparative Examples 1 to 3
  • Non-ion type selected from polyoxyethylene (n-alkyl or iso-alkyl) ether with HLB 12 to less than 15 and polyoxyethylene (n-alkylphenyl) ether with HLB 12 to 19 or less
  • a surfactant and, if necessary, a reaction inhibitor for indirect bilirubin and polyvinylpyrrolidone are added and processed, and the mixture is treated with nitrous acid, and the optical change of the sample is measured at 450 nm.
  • direct pyrilvin or indirect bilirubin was measured.
  • a similar experiment was performed simultaneously without the presence of such a non-ionic surfactant.
  • the first reagent contained the following components and used an aqueous solution adjusted to pH 370 with force, NaOH.
  • an aqueous solution containing the following components was used as the second reagent.
  • a solution of ditauropyrilvin 10 md 1 or 50 mg / ⁇ 1 was used for the direct measurement of bilirubin.
  • 5 OmgZd ⁇ A Rubin solution was used for the direct measurement of bilirubin.
  • serum with a direct pyrilrubin concentration of 2.3 mg / d1 and a total pyrilrubin concentration of 12.1 mg / d1 was used for the direct measurement of bilirubin.
  • the measurements were performed using the Hitachi Model 710 Automatic Analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd.) under the conditions shown in Table 1. Under these conditions, the sample 6 ⁇ 1 was mixed with the first reagent 1801, and the mixture was left at 37 ° C for 5 minutes. Then, the resulting mixture was mixed with the second reagent 45 To start the reaction. These operations are all performed automatically once the parameter 1 is set. Note that the absorbance (450 nm) of the mixture is automatically measured every 0.3 minutes after the sample and the first reagent are mixed.
  • the concentration of pyrilvin was determined directly as follows. The first reagent and the sample were mixed, and the absorbance at 450 nm in this solution was measured. Then, the second reagent was added to the solution, an oxidation reaction was performed, and the absorbance of the reaction solution was measured again. After the obtained absorbance A and absorbance B values were subjected to liquid volume correction, the change in absorbance before and after the oxidation reaction was determined. From this value and a calibration curve created based on the absorbance change obtained by the same operation as above using a standard solution whose bilirubin concentration was directly known in advance, the concentration of direct pyrilubiine in the sample was determined. .
  • Table 1 shows the obtained results. As is evident from the results in Table 1, bilirubin can be directly measured very selectively and with high sensitivity by measuring in the presence of Addetitol SO-135 and Addetitol NP-720. Table 1: Direct pyrilvin in sambres (direct pyrilvin, indirect pyrilvin and serum) according to the assay of the present invention. Measurement
  • Component 1 Reagent X Direct pilirubin Indirect bilirubin (50ng / dl)
  • Serum ⁇ Contains direct bilirubin 2.3 mg Zd 1 and total pyrirubin 12. lmg / dl.
  • Non-ionic interface selected from polyoxyethylene (n-alkyl or is0-alkyl) ether of HLB 12 to less than 15 and polyoxyethylene (n-alkylphenyl) ether of HLB 12 to 19
  • Additive control SO-135 as an activator treat the mixture with vanadate or pyrilrubin oxidase (BOD), and measure the optical change of the sample at 450 nm.
  • BOD vanadate or pyrilrubin oxidase
  • the first reagent used an aqueous solution containing the following components and adjusted to pH 3.70 with NaOH.
  • a physiological saline containing 3 mM of vanadic acid or a physiological saline containing 200 UZ bilirubin oxidase was used as the second reagent.
  • Ditauropyrilvin was used as a sample.
  • the calibration curves obtained by the vanadic acid method and the BOD method are shown in FIGS. 6 and 7, respectively.
  • the calibration curves shown in FIGS. 6 and 7 show good linearity, indicating that direct pyrilvin using vanadic acid or B 0 D as an oxidizing agent in the presence of a specific non-ionic surfactant according to the present invention.
  • the present invention is characterized by using nitrite as an oxidizing agent for bilirubin, using an indirect pyrirubin reaction inhibitor when measuring direct bilirubin, and measuring total bilirubin. It is characterized in that it uses a reaction accelerator. Further, the present invention is characterized in that pyrilubiine is directly measured in the presence of a specific nonionic surfactant. Such a method of the present invention has good correlation with the BOD method, which has been used as a conventional method and has high accuracy, and has extremely good stability of the measurement reagent. Further, the method of the present invention can measure pyrilrubin with an automatic analyzer, and thus greatly contributes to clinical laboratory measurement.

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Description

明 細 書 ピリルビンの測定方法 技術分野
本発明は、 血漿、 血清、 尿等の生体体液中に含まれるビリルビンの測定方法に 関する。
更に詳細には、 生体体液試料に亜硝酸を酸化剤として作用させて該試料の光学 的変化を測定するビリルビンの測定方法、 並びに生体体液試料に酸化剤を作用さ せて該試料の光学的変化を測定するに際して、 特定の非イオン型界面活性剤の存 在下に酸化剤を作用させて、 直接ピリルビンを高感度に測定する方法に関する。 背景技術
ピリルビンは老化赤血球由来のへモグロビンの代謝産物で胆汁色素の主成分で ある。 血液中のピリルビンには、 直接ピリルビン （抱合型） と間接ビリルビン (遊離型） とがある。 直接ビリルビンは、 側鎖のプロピオン酸基が肝臓で酵素的 に主にグルクロン酸とエステル結合し、 水溶性が高く直接にジァゾ試薬と反応し てァゾ色素を生成する。 間接ピリルビンは、 プロピオン酸基が遊離の状態であり 水溶性が低くアルコール等の反応促進剤の存在下において初めてジァゾ試薬と反 応してァゾ色素を生成する。
血液中のビリルビンを測定して得られる測定値には、 総ピリルビン値と直接ビ リルビン値とがある。 総ピリルビン値は、 反応促進剤の存在下にジァゾ試薬を反 応させ抱合型及び遊離型の合計を測定した値である。 直接ピリルビン値は、 反応 促進剤の非存在下にジァゾ試薬を反応させ抱合型のみを測定した値である。 これ らの値から抱合型及び遊離型の各ビリルビン濃度を分別測定し各種肝疾患の診断、 黄だんの鑑別を行うことができる。 そのため、 ピリルビンの測定は、 臨床検査に おける重要な項目となっている。
ビリルビンの測定法としては、 上記したようにビリルビンとジァゾ試薬との反 応により生成するァゾビリルビンの呈色強度を測定するジァゾ法が従来の主流で あり各種肝疾患の診断に広く使用されてきた。 他の測定法としては、 生体試料中のビリルビンに酸化剤を作用させてビリルビ ンを酸化しビリルビンの吸光度変化に基づき測定する方法がある。 このような酸 化剤を用いる測定法としては、 酸化剤としてピリルビンォキシダーゼ （B O D) を用いる B O D法、 B O Dの代わりに酸化剤としてフヱリシアン化イオン、 銅ィ オン、 バナジン酸イオン等を用いる化学的酸化法などが挙げられる。
その他の測定法としては、 高速液体クロマトグラフィー法による高速液体クロ マトグラフィ一法、 媒染剤をコーティングしたフィルムを用いて測定するフィル ム法などがある。
これらのいずれの方法も以下に述べる通り一長一短があり満足できる方法とは 言い難い。
すなわちジァゾ法においては測定試薬が調製後 5日程度しか使用できないほど 不安定であることや、 試料中に共存するァスコルビン酸やへモグロビンにより測 定値が干渉を受けるといつた問題点を有する。 B 0 D法は酵素を使用するため測 定に要する費用がどうしても高くなり、 また、 酵素の安定化が困難なため調製後 2週間程度しか使用できないと言った問題点を有する。 化学的酸化法では、 毒性 が強い金属イオン等を酸化剤として使用するため、 廃水処理、 環境汚染の問題を 必然的に抱えざるを得ない欠点を有する。 高速液体クロマトグラフィ一法ゃフィ ルム法は、 測定値に関しては良好なものの、 専用の測定装置が必要であり、 臨床 検査化学における他の項目のように多数の検体を同時多項目測定に処し得るとい つた汎用性に欠ける欠点を有する。
このような現状から汎用型自動分析装置への適合が可能で、 従来法、 特に特異 性に優れる酵素法との相関性が良好であり、 測定試薬が安定かつ安全なビリルビ ンの測定方法の出現が望まれている。
発明の開示
本発明は、 上記した現状に鑑みなされたもので、 従来法である酵素法との相関 性が良好であり、 しかも測定試薬の安定性に優れ、 試料中の共存物質による測定 値への干渉が少なく、 安価に測定可能であり、 環境汚染に対して危険性の少ない 安全なビリルビンの測定方法を提供することをその目的とする。
更には、 直接ビリルビンを選択的に高感度で測定できるビリルビンの測定方法 を提供することをその目的とする。
本発明者は、 これらの目的を達成せんがため鋭意検討した結果、 亜硝酸を酸化 剤として用い、 亜硝酸によるピリルビンの酸化、 特に間接ピリルビンの酸化を促 進する反応促進剤またはそのような酸化を抑制する反応抑制剤の添加等の反応条 件の選定により、 直接ピリルビン及び総ビリルビンの定量が可能であるという驚 くべき事実を発見した。 本発明は、 力、かる知見により達成されたものである。 更には、 かかる知見に基づき更に研究を進めた結果、 亜硝酸を酸化剤として生 体体液試料に作用させる際に、 H L B 1 2以上 1 5未満のポリオキシエチレン ( n—アルキルもしくは i s 0—アルキル） エーテル及び H L B 1 2以上 1 9以 下のボリォキシエチレン （n—アルキルフヱニル） エーテルから選ばれる非ィォ ン型界面活性剤の存在下に亜硝酸を作用させることにより、 特に直接ピリルビン を選択的に高感度で測定できること、 そしてこの方法は亜硝酸以外の他の酸化剤 を用いた測定法にも広く適用できることを見出し、 本発明を完成した。
しかして、 本発明は、 生体体液試料に、 亜硝酸を酸化剤として作用させ、 該試 料の光学的変化を測定する総ビリルビンまたは直接ビリルビンの測定方法である c 更に本発明は、 間接ピリルビンの酸化を抑制する反応抑制剤の存在下、 生体体 液試料に、 亜硝酸を酸化剤として作用させ、 該試料の光学的変化を測定する直接 ビリルビンの測定方法である。
更に本発明は、 間接ピリルビンの酸化を促進する反応促進剤の存在下、 生体体 液試料に、 亜硝酸を酸化剤として作用させ、 該試料の光学的変化を測定する総ビ リルビンの測定方法である。
更に本発明は、 生体体液試料中のピリルビン測定用キッ 卜であって、 かつ、 i ) 酸性溶液、 及び
i i ) 亜硝酸塩溶液、
を含むキッ トである。
更に本発明は、 生体体液試料中の直接ビリルビン測定用キッ トであって、 かつ、 i ) 反応抑制剤を含有する酸性溶液、 及び
i i ) 亜确酸塩溶液、
を含むキッ 卜である。 更に本発明は、 生体体液試料中の総ピリルビン測定用キッ 卜であって、 かつ、 i ) 反応促進剤を含有する酸性溶液、 及び
i i ) 亜硝酸塩溶液、
を含むキッ トである。
更に本発明は、 HLB値が 12以上で 15未満のポリオキンエチレン （n—ァ ルキルもしくは i s o—アルキル） エーテル及び HLB値が 12以上で 19以下 のポリオキシエチレン （n—アルキルフヱニル） エーテルから選ばれる少なくと も一種の非イオン型界面活性剤の存在下、 生体体液試料に酸化剤を作用させ、 該 試料の光学的変化を測定する直接ビリルビンの測定方法である。
更に本発明は、 生体体液試料中の直接ピリルビンの測定用キッ 卜であって、 か つ、
i ) }1し8値が12以上で 15未満のポリオキシエチレン （n—アルキルもしく は i so—アルキル） エーテル及び HLB値が 12以上で 19以下のポリオキン エチレン （n—アルキルフヱニル） エーテルから選ばれる少なくとも一種の非ィ オン型界面活性剤を含有する酸性溶液、 及び
i i ) 酸化剤溶液、
を含むキッ トである。
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のピリルビン測定方法を自動分析装置を用いて実施する場合の 具体的な条件を示す。
図 2は、 反応抑制剤であるチォ尿素存在下の本発明の亜硝酸酸化法による、 直 接ピリルビンまたは間接ピリルビンの測定結果を示す。 反応時間変化に伴う、 吸 光度の変化を観測したものである。 横軸に測定ポイント （0. 3mi n. Zボイ ント） 、 縦軸に 450 nmでの吸光度を表わす。
図 3は、 直接ビリルビン測定における、 チォ尿素存在下の本発明の亜硝酸酸化 法と B O D法との相関性を示す。 横軸に B 0 D法で測定した直接ビリルビン濃度 (mg/d 1) 、 縦軸に、 チォ尿素存在下の本発明の亜硝酸酸化法で測定した直 接ピリルビン濃度 （mgZd 1) を示す。
図 4は、 反応促進剤であるセチルトリメチルアンモニゥムブロマイ ド存在下の 本発明の亜硝酸酸化法による、 直接ビリルビンまたは間接ビリルビンの測定結果 を示す。 時間変化に伴う、 吸光度の変化を観察したものである。 横軸に測定ボイ ント （0 . 3 m i n . Zボイント） 、 縦軸に 4 5 0 n mでの吸光度を表わす。 図 5は、 総ピリルビン測定における、 セチルトリメチルアンモニゥ厶ブロマイ ド存在下の本発明の亜硝酸酸化法、 と B O D法との相関性を示す。 横軸に B O D 法で測定した総ピリルビン濃度 （m g / d 1 ) 、 縦軸に、 セチルトリメチルアン モニゥムブロマイド存在下の本発明の亜硝酸酸化法で測定した総ビリルビン濃度 (m g/ d 1 ) を示す。
図 6は、 本発明の特定の非イオン型界面活性剤存在下で酸化剤としてバナジン 酸を用いた直接ビリルビンの測定方法によつて直接ビリルビンを測定して得られ た検量線を示す。
図 7は、 本発明の特定の非ィォン型界面活性剤存在下で酸化剤としてビリルビ ンォキシダ一ゼを用いた直接ビリルビンの測定方法によつて直接ビリルビンを測 定して得られた検量線を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明では、 生体体液試料に、 亜硝酸を酸化剤として作用させ、 該試料の光学 的変化を測定することにより総ピリルビンまたは直接ビリルビンを測定する。 そ のような測定を実施するには、 生体体液中のピリルビン測定用キッ卜であって、 酸性溶液及び亜硝酸塩溶液を含むキットを用いる。
本発明において、 生体体液試料とは、 生体中の体液から入手できる試料で、 主 に、 血漿、 血清、 尿等をいう。
本発明において、 亜硝酸を酸化剤として生体体液試料に作用させるときは、 通 常、 生体体液試料に、 クェン酸などを溶解した酸性溶液を加え、 これに更に亜硝 酸塩溶液を加えることにより実施する。 ここで酸性溶液及び亜硝酸塩溶液とは、 通常、 いずれも水溶液である。
生体体液試料に加える酸性溶液は、 クェン酸、 乳酸、 酢酸、 フタル酸などの酸 を含有し、 亜硝酸塩溶液と合せたときの P Hが 2〜 6の酸性溶液となることが好 ましい。
亜硝酸塩溶液を調製するために用いる亜硝酸塩としては、 本発明の目的に使用 できるものであれば特に限定されないが、 アルカリ金属塩が好ましい。 特に、 入 手のしゃすさから、 ナトリウム、 カリウム塩が好ましい。
亜硝酸塩のピリルビン測定時の濃度は、 試料の量により異なる力 試料中のビ リルビンを酸化し得る濃度であれば特に限定されない。 最終反応液中の濃度とし て通常 0 . 0 1〜2 0 11 1110 1 / 1、 好ましくは0 . 0 5〜4 mm o l Z lの範 囲が挙げられる。
本発明の直接ビリルビンの測定方法においては、 亜硝酸により間接ビリルビン が酸化されることを防ぐ目的で反応試薬中に添加し得る反応抑制剤を用レ、るのが 好ましい。 本発明のこのような直接ピリルビンの測定方法は、 生体体液試料中の 直接ピリルビン測定用キッ トであって、 間接ピリルビン酸化を抑制する反応抑制 剤を含む酸性溶液、 及び亜硝酸塩溶液を含むキッ トにより実現できる。
その様な間接ピリルビンの反応抑制剤としては、 チォ尿素、 N位に低級アルキ ルを有するチォ尿素、 4級の低級アルキルアンモニゥム塩、 N—低級アルキルピ リジニゥム塩、 N位に低級アルキルを有するビビリジニゥム塩等を使用できる。 なお、 本明細書では、 低級アルキルとは、 炭素数 1〜6のアルキルをいうものと する。 本発明では、 低級アルキルは、 入手のしゃすさから、 直鎖低級アルキルが 好ましい。
N位に低級アルキルを有するチォ尿素とは、 入手のしゃすさから、 1 , 1， 3 , 3—テトラメチルチオ尿素、 1， 1， 3—トリメチルチオ尿素、 1， 3—ジメチ ルチオ尿素、 N—メチルチオ尿素が好ましい。
4級の低級アルキルアンモニゥム塩とは、 N—低級アルキル— N， N, N—ト リメチルアンモニゥム塩、 N—低級アルキル一 N， N, N— トリェチルアンモニ ゥム塩、 N—低級アルキル一 N， N, N—トリプロピルアンモニゥム塩を例示で きる。 これらの塩は、 入手のしゃすさから、 クロライ ド、 ブロマイ ド等が好まし い。
他の反応抑制剤としては、 例えばヒドラジン、 フヱニルヒドラジン、 これらの 塩などのヒ ドラジン類； ヒ ドロキシルアミ ン、 フエニルヒ ドロキシルアミ ン、 こ れらの塩などのヒ ドロキンルァミン類；ァセトキシム、 ジァセチルモノォキシム、 サリチルアルドキシムなどのォキシム類：テトラエチレンペンタミン、 トリエチ レンテトラミンなどの脂肪族多価ァミン類；フヱノール、 p—クロルフヱノール、 一ナフトールなどのフ ノール類等が挙げられる。
これらの反応抑制剤は単独でも有効であるが、 2種以上を組み合わせることに より抑制作用がより向上する場合もあるので、 状況に合わせて適宜選択して用い れば良い。 反応抑制剤存在下の条件で、 直接ピリルビンと亜硝酸とを反応させる 場合には、 通常、 反応抑制剤を含む酸性溶液を生体体液試料に加え、 次いで更に 亜硝酸塩溶液を加えることによって実施できる。 ここで用いる酸性溶液は、 前述 した酸性溶液に反応抑制剤を添加することにより調製され、 亜硝酸塩溶液は前述 したと同様のものを用いることができる。
反応抑制剤存在下での直接ビリルビンと亜硝酸とを反応させる際の反応溶液の p H範囲は、 好ましくは 2〜6であり、 さらに好ましくは p H 3 . 5〜4 . 5で ある。 p Hが高すぎると酸化反応力《進行しにく く、 低すぎると、 間接ビリルビン に対する反応抑制効果が低下し、 反応選択性を失いやす L、からである。
反応抑制剤の使用濃度は、 試料中の遊離ピリルビンの酸化を抑制できる濃度で あれば特に制限されず、 反応抑制剤の種類により異なるが、 通常、 最終反応液の 濃度として 0 . 0 1〜 1 0 V %の範囲が挙げられる。
本発明の総ピリルビンの測定方法においては、 通常用いられる間接ピリルビン の酸化剤による酸化反応を促進する反応促進剤、 いわゆる直接化剤を反応試薬中 に共存させておくと、 測定時間が短縮できるので好ましい。 本発明のこのような 総ビリルビンの測定方法は、 生体体液試料中の総ビリルビン測定用キットであつ て、 間接ピリルビンの酸化を促進する反応促進剤を含む酸性溶液、 及び亜硝酸塩 溶液を含むキッ卜により実現できる。
本発明で使用される反応促進剤は、 ラウリル硫酸ナトリウム、 ラウリルべンゼ ンスルホン酸ナトリウム、 コール酸ナトリウム等のァニオン型界面活性剤あるい はセチルトリメチルアンモニゥムブロマイ ド、 セチルピリジニゥムクロライ ド等 のカチォン型界面活性剤あるいはァルキルべタィン等の両性型界面活性剤など、 通常この分野においてこの種の目的で使用されるものが挙げられる。 中でも、 力 チオン型界面活性剤と両性型界面活性剤は酸性条件において、 蛋白質と相互作用 が少ないのでより好ましい。 反応促進剤存在下の条件で、 直接ビリルビン及び間接ビリルビンとを反応させ る場合には、 前記したと同様の方法により、 反応促進剤を含む酸性溶液を生体体 液試料に加え、 次いで亜硝酸塩溶液を加えることによって実施できる。 反応溶液 の p H範囲は、 好ましくは 1 . 5〜6であり、 さらに好ましくは 2 . 5〜4であ る。 p Hが高すぎると、 酸化反応が遅くなり、 測定値に負誤差を与えやすくなる。 p Hが低すぎると、 非特異的な反応を発生しやすくなり、 測定値に正誤差を与え やすくなる。
反応促進剤の使用濃度は、 試料中のビリルビンの酸化を促進し得る濃度であれ ば特に制限されないが、 通常、 最終反応液中の濃度として 0 . 0 1〜1 O wZ v %、 好ましくは 0 . 1〜5 wZ v %の範囲が挙げられる。
更に本発明によれば、 直接ピリルビンの測定方法であって酸化剤として亜硝酸 以外の他の酸化剤も使用することのできる測定方法として、 H L B値が 1 2以上 で 1 5未満のポリオキシエチレン （n—アルキルもしくは i s o—アルキル） ェ —テル及び H L B値が 1 2以上で 1 9以下のポリオキシエチレン （n—アルキル フユニル） エーテルから選ばれる少なくとも一種の非ィォン型界面活性剤の存在 下、 生体体液試料に酸化剤を作用させ、 該試料の光学的変化を測定する直接ピリ ルビンの測定方法が提供される。
上記の如き特定の非イオン型界面活性剤の存在下に生体体液試料に酸化剤を作 用させた場合には、 酸化剤が直接ピリルビンと反応しやすくなり、 他方、 間接ビ リルビンに反応しにく くなり、 従つて酸化剤と直接ビリルビンとの反応の選択性 が良くなる。 また、 高澳度で直接ピリルビンを含有する生体体液試料であっても、 直接ビリルビンを正確に測定することができる。
このような直接ビリルビンの測定方法は、 上記の特定の非ィォン型界面活性剤 を含む酸性溶液、 及び酸化剤溶液を含むキッ トを使用することにより実施できる。 特定の非イオン型界面活性剤の 1つである H L B値が 1 2以上で 1 5未満のポ リオキシエチレン （n—アルキルもしくは i s 0 —アルキル） エーテルとしては、 例えばアデ力トール S O— 1 4 5 (ポリオキシエチレン （ i s o—アルキル） ェ 一テル、 旭電化 （株） 商品名） 、 アデ力トール S O— 1 3 5 (ポリオキシェチレ ン （ i s o—アルキル） エーテル、 旭電化 （株） 商品名） 、 アデ力トール S O— 1 2 0 (ポリオキンエチレン （ i s o—アルキル） エーテル、 旭電化 （株） 商品 名） 、 ェマルゲン 7 0 7 (ポリオキシエチレン （n—アルキル） エーテル、 花王 (株） 商品名） ェマルゲン 7 0 9 (ポリオキシエチレン （n—アルキル） エーテ ノレ、 花王 （株） 商品名） などが挙げられる。 HLB値が 1 2未満の非イオン型界 面活性剤の場合には、 その溶液の暴点が低く、 測定を行う温度、 即ち室温ないし 37 °Cの温度範囲でその溶液が白濁しやすいので好ましくない。 1"1し8値が1 5 以上の非ィォン型界面活性剤の場合には、 その溶液中での直接ビリルビンの吸光 度が低くなる傾向になり、 従って測定の際に十分な呈色強度が得られず、 直接ビ リルビンの測定値に負誤差が起こりやすく好ましくない。 特に HLB値は 1 2〜 1 4. 5、 なかでも 1 2〜 1 4の範囲が好ましい。 このような好ましい非イオン 型界面活性剤としては、 アデ力トール SO— 1 3 5、 エマルゲン 7 0 7、 アデ力 トール SO— 1 4 5などが挙げられる。
本発明で用いられる他の非イオン型界面活性剤は、 ^^し8値が1 2以上で 1 9 以下のポリオキシエチレン （n—アルキルフヱニル） エーテルであり、 例えば、 アデ力トール NP— 67 5 (ポリオキンエチレン （n—ノニルフヱニル） エーテ ル、 旭電化 （株） 商品名） 、
アデ力 トール NP— 6 8 3 (ポリオキシエチレン （n—ノニルフヱニル） ェ一テ ノレ、 旭電化 （株） 商品名） 、
アデ力 トール NP— 6 9 0 (ポリオキシエチレン （n—ノニルフヱニル） エーテ ル、 旭電化 （株） 商品名） 、
アデ力トール NP— 6 9 5 (ポリオキシエチレン （n—ノニルフェニル） ェ一テ ノレ、 旭電化 （株） 商品名） 、
アデ力 トール NP— 7 0 0 (ポリオキンエチレン （n—ノニルフエニル） エーテ ル、 旭電化 （株） 商品名） 、
アデ力 トール NP— 7 20 (ポリオキシエチレン （n—ノニルフエニル） エーテ ノレ、 旭電化 （株） 商品名） などが挙げられる。 これらの非イオン型界面活性剤の 場合にも、 1^し8値が1 2未満の時には前述したと同様の理由で好ましくなく、 また HLB値が 1 9を越える時には前述した HLB値が 1 5以上の場合と同様に 好ましくない。 特に HL B値は、 1 2〜1 4. 8、 なかでも 1 2〜1 4. 5の範 囲が好ましく、 このようなものとしては、 アデ力トール N P— 6 9 5が挙げられ る。
以上に述べた特定の非ィォン型界面活性剤の存在下で直接ビリルビンを測定す る場合には、 酸化剤が間接ピリルビンと反応しにく くなる。 さらに、 より選択的 に直接ピリルビンを測定するために、 前述したと同様の反応抑制剤を使用するこ とが好ましい。 また、 反応抑制剤とともにポリビニルピロリ ドンを用いると、 酸 化剤と直接ビリルビンとの反応性が一層増すので直接ビリルビンの測定にはポリ ビニルピロリ ドンを使用するのが特に好ましい。
上記した特定の非ィォン型界面活性剤の存在下で生体体液試料に酸化剤を作用 させて直接ピリルビンを測定する場合には、 酸化剤としては亜碓酸以外に他の酸 化剤を用いてもよい。 そのような酸化剤としては、 例えばバナジン酸イオン、 三 価のマンガンイオン、 二価の銅イオンなどの化学的酸化剤、 及びピリルビンォキ シダーゼなどの酵素的酸化剤が挙げられる。
上記した特定の非ィォン型界面活性剤の存在下で生体体液試料中の直接ビリル ビンを測定するには、 生体体液試料に、 非イオン型界面活性剤、 更に必要に応じ て反応抑制剤及びポリビニルピロリ ドンを含有する酸性溶液を加え、 次いで酸化 剤溶液を加えることによって実施できる。
非イオン型界面活性剤の使用濃度は、 通常、 最終反応液中の濃度として 0 . 0 1〜5 %、 好ましくは 0 . 1〜1 %の範囲である。 反応抑制剤を使用する場合の 使用濃度は、 前述した直接ピリルビンの測定方法の場合と同様である。 反応抑制 剤とともにポリビニルピロリ ドンを併用する場合のポリビニルピロリ ドンの使用 濃度は、 通常、 最終反応液中の濃度として 0 . 0 1〜 5、 好ましくは 0 . 1〜 1 %の範囲である。
酸化剤の使用濃度は、 使用する酸化剤の種類、 生体体液試料の量などによって 変動し、 通常最終反応液中の濃度として、 バナジン酸イオン、 三価のマンガンィ オン、 二価の銅イオンなどの化学的酸化剤の場合には通常、 0 . 0 1〜2 O mM 好ましくは 0 . 0 4〜 4 mMの範囲であり、 ビリルビンォキシダーゼなどの酵素 的酸化剤の場合には通常、 0 . 1〜2 0 K U/ 、 好ましくは 0 . 5〜5 K UZ の範囲である。 酸化剤として亜硝酸を用いる場合には、 前述したと同様の濃度 で使用することができる。
以上に述べた本発明の直接ビリルビンまたは総ビリルビンの測定方法にお 、て は、 測定試薬中に、 他の試薬類、 例えば緩衝種、 防腐剤、 キレート化剤、 界面活 性剤等を、 公知の方法に準じて適宜選択して使用することができる。 これらの試 薬は、 通常、 前述した酸性溶液に添加して用いることができる。
例えば、 キレート剤を共存させておくと、 試薬盲検値が低下して分析精度が向 上し、 該試薬の安定化が図れると共に、 ピリルビンの酸化反応が促進されるので 好ましい。 このような目的で使用されるキレート剤の好ましい具体例としては例 えばエチレンジアミン四酌酸 （EDTA) 、 二トリ口三酔酸 （NTA) 、 シクロ へキサンジァミン四酢酸 （CyDTA) 、 ジエチレントリアミン五酢酸
(DTP A) 、 ヒドロキンェチルエチレンジァミン三酢酸 （EDTA— OH) 、 トリエチレンテトライミン六酢酸 (TTHA) 、 ヒドロキシェチルイミノニ酢酸 (H I DA) , 1—ヒドロキシェタン一 1， 1—ジホスホン酸、 あるいはこれら のアル力リ金属塩 （例えば、 リチウム塩、 ナトリウム塩、 力リウム塩等） ゃァン モニゥム塩等が挙げられる。 これらのキレート剤のピリルビン測定時の使用濃度 としては、 ピリルビンの測定を妨害しない濃度であれば特に限定されない。 最終 反応液中の濃度として通常 0. 02〜5 OmM、 好ましくは 0. 1〜 30 mM、 さらに好ましくは 1〜 20 mMの範囲が挙げられる。
本発明の測定方法を実際に実施するには、 例えば以下のように行えばよい。 即 ち、 総ビリルビン濃度の測定を行うには、 反応促進剤を含む酸性溶液を第 1試薬 とし、 これと血漿、 血清、 尿等のピリルビンを含む生体体液試料を混合し、 この 溶液中のピリルビンに基づく波長域 （430〜 460 n m) における吸光度を測 定し、 得られた測定値を吸光度 Aとする。 ついで、 該溶液に亜硝酸塩を含む第 2 試薬液を添加して 25〜 40 で、 3〜 1 5分間ビリルビンの酸化反応を行つた 後、 再度溶液中のピリルビンに基づく波長域 （430〜 460 n m) における吸 光度を測定し、 得られた測定値を吸光度 Bとする。 得られた吸光度 A及び吸光度 Bの値に液量補正等を処した後、 酸化反応前後での吸光度変化量を求める。 この 値と、 予めビリルビン濃度既知の標準液を用し、て上記と同様の操作により得られ た吸光度変化量に基づいて作成した検量線から、 生体体液試料中の総ピリルビン 濃度を求めることができる。
直接ピリルビン濃度の測定を行うには、 反応促進剤の代わりに、 反応抑制剤を 含む酸性溶液、 あるいは前述した特定の非ィォン型界面活性剤及び必要に応じて 反応抑制剤並びにポリビニルピロリ ドンを含む酸性溶液を第 1試薬とし、 第 2試 薬としては上記の総ピリルビン濃度を求める場合と同じものを用い、 以下、 総ビ リルビン濃度を求める場合と同様にして操作を行えばよ L、。
本発明の測定方法は、 生化学検査用に市販されている汎用の自動分析装置へも 応用可能である。 本発明において自動分析装置として用いることのできるものは、 具体的に機種を挙げて例示すれば、 日立 7 0 5 0型、 日立 7 0 5型、 日立 7 3 6 型、 日立 7 1 5 0型、 日立 7 1 7 0型、 日立 7 0 2 0型などであるが、 例示の機 種に限定されず、 これらに類するものであればいずれでもよい。
したがつて、 多数の生体体液試料中の総ビリルビンまたは直接ビリルビン値を 短時間で測定できる。
以下に実施例を挙げ本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はこれらによ り何等限定されるものではない。
実施例 1 .
チォ尿素存在下の亜硝酸酸化法による直接ビリルビンの測定
i ) 目的
亜硝酸酸化法によりピリルビンを測定する場合、 反応抑制剤チォ尿素を加える ことにより、 間接ピリルビンを酸化させずに、 直接ピリルビンを選択的に酸化で きることを確認するため以下の実験を行つた。
i i) 用いた試薬
第 1試薬
酸性溶液である第 1試薬は、 以下の成分を含み、 かつ、 N a O Hで p H 4 . 0 0にした水溶液を用いた。
クェン酸 1水和物 2 0 O mM,
シクロへキサンアミン四酢酸 （C y D T A) 1 mM,
チォ尿素 1 2 O mM,
界面活性剤 0 . 3 % 第 2試薬
亜硝酸塩溶液である第 1試薬は、 以下の成分を含む水溶液を用いた。
亜硝酸ナトリウム 5 mM, 塩化ナトリウム 1 50 mM,
直接ピリルビン標品
直接ピリルビン標品は、 直接ピリルビン 4 Omg/d 1相当のジタウロビリル ビンを含む水溶液を用いた。
間接ピリルビン標品
間接ピリルビン標品は、 間接ピリルビン 4 Omg/d 1相当の遊離ピリルビン を含む 2 0 mMトリス緩銜液を用いた。
iii) 操作法
日立 7 1 7 0型自動分析装置 （日立製作所 （株） 製） を用い、 図 1に示す条件 で測定を行った。 この条件では、 ピリルビン標品 6 1と第 1試薬 1 8 0〃 1と を混合し、 この混合液を 37 °Cで 5分放置し、 ついで、 得られた混合液に、 第 2 試薬 4 5〃 1を加え反応を開始させる。 これらの操作は、 パラメーターを設定し ておくとすべて自動的に行われる。 なお、 ピリルビン標品と第 1試薬とを混合し てから、 0. 3分ごとに、 混合液の吸光度 （4 5 0 nm) は、 自動的に測定され る。 その結果を図 2に示す。
iv) 結果
図 2から明らかなように、 反応抑制剤チォ尿素の存在下で、 酸性溶液中、 間接 ピリルビンと亜硝酸ナ卜リウムを加えると、 液量希釈による吸光度の低下は起こ る力 間接ビリルビンに基づく吸光度を変化させない。 一方、 この条件では、 直 接ビリルビンに基づく吸光度を選択的に低下させる。 すなわち、 この条件では、 間接ビリルビンを酸化させず、 直接ビリルビンのみを選択的に酸化させることが できる。
実施例 2.
直接ビリルビン測定における、 チォ尿素存在下の亜硝酸酸化法、 と BOD法と の相関性
i) 目的 チォ尿素存在下の方法で、 検体中の直接ビリルビンが正確に測定できるかどう かを示す。 対照として、 BOD法を用い、 2つの方法に相関性があるかどうかを 調べた。
ii) チォ尿素存在下の方法による直接ピリルビンの測定
第 1試薬、 第 2試薬は実施例 1と同様なものを用いた。 検量線を求めるための ピリルビン標準血清は、 日本商事株式会社製のネスコート B I L檩準血清 （直接 ピリルビンを 7. 8mgZd 1、 総ピリルビンを 1 2. lmgZd l含有） を用 いた。 操作は、 実施例 1の操作法において、 ピリルビン標品の代わりに、 新蛘ヒ ト血清を用いて行った。
直接ピリルビンの濃度は、 つぎのようにして求めた。 第 1試薬と新鲜ヒト血清 とを混合し、 この溶液中の 450 nmにおける吸光度を測定し得られた測定値を 吸光度 Aとした。 ついで、 該溶液に第 2試薬を添加し、 酸化反応を行った後、 再 度、 反応液の吸光度を測定し得られた測定値を吸光度 Bとした。 得られた吸光度 A及び吸光度 Bの値に液量補正を処した後、 酸化反応前後での吸光度変化量を求 める。 この値と、 予め直接ビリルビン濃度既知の標準液を用いて上記と同様の操 作により得られた吸光度変化量に基づいて作成した検量線から、 新蛘ヒト血清中 の直接ビリルビンの濃度を求めた。
iii) BOD法による直接ビリルビンの測定
ネスコート D— B I L— VE (日本商事株式会社） の測定キットを用い、 その マニュアルに従い、 直接ピリルビンを測定した。
iv) チォ尿素存在下の亜硝酸酸化法と BOD法との相関性
新蛘ヒト血清 44検体をチォ尿素存在下の方法及び BOD法により、 直接ピリ ルビンの濃度を求め、 相関性を検討した。
V) 結果
相関結果のグラフを図 3に示す。 相関係数は 0. 997、 回帰式は丫=0. 9 96 X+ 0. 023であった。 極めて良好な相関があることが判明した。 本発明 により、 正確にヒト血清中の直接ピリルビンの濃度を測定できること力く判明した。 実施例 3.
セチルトリメチルアンモニゥムブロマイド存在下の亜硝酸酸化法による総ピリ ルビンの測定
i ) 目的
亜硝酸酸化法によりピリルビンを測定する場合、 反応促進剤セチルトリメチル アンモニゥムブロマイドを加えることにより、 間接ピリルビン及び直接ピリルビ ンの両方を酸化でき、 総ビリルビンを測定できることを示すため以下の実験を行 つた o
ii) 用いた試薬
第 1試薬
第 1試薬は以下の成分を含み、 かつ、 NaOHでpH3 00にした水溶液を 用いた。
クェン酸 1水和物 200 mM,
C y DTA 1 mM,
セチルトリメチルアンモニゥムブロマイド 1 %,
界面活性剤 0. 3 %,
第 2試薬
第 2試薬は以下の成分を含む水溶液を用いた。
亜硝酸ナトリウム 5 mM,
塩化ナトリウム 1 50 mM, iii) ピリルビン標品
直接ピリルビン標品及び間接ピリルビン標品は、 実施例 1と同様なものを用い た。
iv) 操作法
実施例 1と同様にして、 行った。 ピリルビン檫品と第 1試薬とを混合してから、 0. 3分ごとに、 混合液の吸光度 （450 nm) は、 自動的に測定される。 その 結果を図 4に示す。
V) 結果
本実施例においては、 直接ピリルビンに基づく吸光度同様に、 間接ビリルビン に基づく吸光度も完全に消滅させることが示される。 すなわち、 本実施例におい ては、 直接ビリルビンと同様に間接ビリルビンも完全に酸化され得ることが判明 した。
実施例 4.
総ピリルビン測定における、 セチノレトリメチルァンモ二—ゥムブ口マイ上存在下 の亜硝酸酸化法、 と BOD法との相関性
i) 目的
セチルトリメチルアンモニゥムブロマイド存在下の亜硝酸酸化法で、 検体中の 総ビリルビンが正確に測定できることを示す。 対照として、 BOD法を用い、 2 つの方法に相関性があるかどうかを調べた。
ii) セチルトリメチルアンモニゥムブロマイ ド存在下の方法による総ビリルビン の測定
第 1試薬、 第 2試薬は実施例 3と同様なものを用いた。 検量線を求めるための ピリルビン標準血清は、 日本商事株式会社製のネスコート B I L標準血清 （直接 ビリルビンを 7. 8mgZd 1、 総ピリルビンを 12. lmg/d l含有） を用 いた。 操作は、 実施例 3の操作法において、 ピリルビン標品の代わりに、 新鲜ヒ ト血清を用いて行った。
総ビリルビンの濃度は、 つぎのようにして求めた。 第 1試薬と新鲜ヒト血清と を混合し、 この溶液中の 450 nmにおける吸光度を測定し得られた測定値'を吸 光度 Aとした。 ついで、 該溶液に第 2試薬を添加し、 酸化反応を行った後、 再度、 反応液の吸光度を測定し得られた測定値を吸光度 Bとした。 得られた吸光度 A及 び吸光度 Bの値に液量補正を処した後、 酸化反応前後での吸光度変化量を求める c この値と、 予め総ビリルビン濃度既知の標準液を用 ^、て上記と同様の操作により 得られた吸光度変化量に基づいて作成した検量線から、 新鲜ヒト血清中の総ピリ ルビンの濃度を求めた。
iii) BOD法による総ビリルビンの測定
ネスコート T— B I L— VE (日本商事株式会社製） の測定キッ トを用い、 そ のマニュアルに従い、 総ビリルビンを測定した。
iv) セチルトリメチルアンモニゥムブロマイ ド存在下の亜硝酸酸化法と BOD法 との相関性
新鲜ヒト血清 44検体をセチルトリメチルアンモニゥムブロマイド存在下の方 法及び BOD法により、 総ビリルビンの濃度を求め、 相関性を求めた。
V) 結果
相関結果のグラフを図 5に示す。 相関係数は 0. 999、 回帰式は Y= l. 0 1 3Χ+ 0. 1 862であった。 極めて良好な相関があることが判明した。 本発 明により、 正確にヒト血清中の総ビリルビンの濃度を測定できることが判明した c 実施例 5〜 1 3及び比較例 1〜 3
非ィォン型界面活性剤存在下及び非存在下での直接ビリルビンの測定
i) 目的
試料に、 HLB 1 2〜 1 5未満のポリオキシエチレン （n—アルキルもしくは i s o—アルキル） エーテル及び HLB 1 2〜1 9以下のポリオキシエチレン ( n—アルキルフエニル） エーテルから選ばれる非ィォン型界面活性剤及び必要 に応じて間接ビリルビンの反応抑制剤並びにポリビニルピロリ ドンを、 添加し処 理し、 その混合液に、 亜硝酸を作用させ、 該試料の光学的変化を 450 nmで測 定することにより直接ピリルビン又は間接ビリルビンを測定した。 そのような非 ィォン型界面活性剤を存在させな 、で同様の実験も同時に実施した。
il) 用いた試薬
第 1試薬
第 1試薬は以下の成分を含み、 力、つ、 NaOHでpH3 70にした水溶液を 用いた。
クェン酸 1水和物 1 00 mM,
EDTA 1 mM, 以下に示す表 1に記載された第 1試薬含有成分
第 2試薬
第 2試薬は以下の成分を含む水溶液を用いた。
亜硝酸ナトリウム 5 mM, 塩化ナトリウム 1 50 mM,
試料
直接ビリルビンの測定では、 ジタウロピリルビン 1 0 m d 1又は 50 m g /ά 1の溶液を用いた。 間接ピリルビンの測定では、 5 OmgZd〗の間接ピリ ルビン溶液を用いた。 生体体液試料の測定では、 直接ピリルビンが 2. 3mg/ d 1、 かつ、 総ピリルビンが 1 2. 1 mg/d 1の血清を用いた。
検
ジタウロピリルビン 1 OmgZd 1、 2 0 mg/d 1. 3 Omg/d 1. 4 0 mg/d 1及び 5 Omg/d 1を含む試料を用いて操作法に記載した方法に従い 測定して検量線を求めた。 この検量線の相関係数 rを表 1に示す。
iii) 操作法
日立 7 1 7 0型自動分析装置 （日立製作所 （株） 製） を用い表 1に示す条件で 測定を行った。 この条件では、 試料 6〃 1と第 1試薬 1 8 0 1とを混合し、 こ の混合液を 3 7てで 5分放置し、 ついで、 得られた混合液に、 第 2試薬 4 5 1 を加え反応を開始させる。 これらの操作は、 パラメータ一を設定しておくとすべ て自動的に行われる。 なお、 試料と第 1試薬とを混合してから、 0. 3分ごとに、 混合液の吸光度 （4 5 0 nm) は、 自動的に測定される。
直接ピリルビンの濃度は、 つぎのようにして求めた。 第 1試薬と試料とを混合 し、 この溶液中の 4 50 nmにおける吸光度を測定し得られた測定値を吸光度 A とした。 ついで、 該溶液に第 2試薬を添加し、 酸化反応を行った後、 再度、 反応 液の吸光度を測定し得られた測定値を吸光度 Bとした。 得られた吸光度 A及び吸 光度 Bの値に液量補正を処した後、 酸化反応前後での吸光度変化量を求めた。 こ の値と、 予め直接ビリルビン濃度既知の標準液を用 、て上記と同様の操作により 得られた吸光度変化量に基づいて作成した検量線とから、 試料中の直接ピリルビ ンの濃度を求めた。
iv) 結果
得られた結果を表 1に示した。 表 1の結果から明らかなように、 アデ力トール SO- 1 3 5及びアデ力トール NP— 7 2 0の存在下で測定することにより直接 ビリルビンを極めて選択的にかつ高感度で測定できる。 表 1 ：本発明の剷定法によるサンブル （直接ピリルビン、 間接ピリルビン及び血清） 中の直接ピリルビン «の »|定桔果 第 1試薬含有成分 直接ビリルビンの 3W定 間接ビリルビン (50mg/(M) 血清 · の測定
の刺定
相関係数 1 Omg/d 1 5 Omg/d 1
比校例 1. なし 0. 99 9. 4 33. 0 2 1. 9 6. 0 実施例 4. 1. 00%アデ力トール SO - 1 35 0. 998 1 1. 5 5 0. 0
(HLB 1 3. 5) 実施例 5. 1. 0 0%アデ力トール SO— 1 3 5 > 0. 999 1 0. 4 9. 9 1 1, 4. 2 及び 2 OmMチォ尿素 実旌例 6. 1. 0 0%アデ力トール SO— 1 3 5及び > 0. 999 1 1. 2 50. 5 1 0. 1 4. 0
2 OmM二塩化ヒ ドラジニゥ厶 実施例 7. 1. 00%アデ力トール SO— 1 3 5及び > 0. 999 1 1. 3 4 9. 8 1 . 5 4. 9
1 %P VP 2 5 実拖例 8. 1. 00%アデ力トール SO— 1 35 > 0. 999 1 0. 8 50. 3 3. 9 2. 7
2 OmMチォ尿素
及び 2 OmM二塩化ヒドラジニゥム
表 1： (铳き) 第 1試薬含有成分 直接ピリルビンの M定 間接ピリルビン (50mg/dl) 血清 · の澜定 の ill定
相関係数 10mg/d l 5 Omg/d
実施伊 j9. 1. 00%アデ力トール SO— 135 >0. 999 10. 4 50. 3 6. 1 3. 1
2 OmMチォ尿素
及び 1%PVP25 実施例 10. 1. 00%アデ力トール SO— 135 >0. 999 10. 9 50. 1 9. 5 3. 8 及び 2 OmM二塩化ヒ ドラジニゥム 実施例 11. 1. 00%アデ力トール SO— 135 >0. 999 10. 4 49. 3 2. 4 2. 3
2 OmMチォ尿素
2 OmM二塩化ヒドラジニゥム
及び 1%PVP25 比铰例 2. 2 OmMチォ尿素 0. 995 10. 7 40. 0 6. 8 3. 3
2 OmM二塩化ヒドラジニゥム
及び 1%PVP25
表 1 ： (挠き)
第 1試薬含有成分 X 直接ピリルビンの制定 間接ビリルビン (50ng/dl) 血消' の刺定
の測定
相関係数 1 Omjj/d 1 5 Omg/d
比皎例 3. 1. 00%トリ トン X 4 05 0. 998 1 0. 8 2. 6 2. 5
(HL B 1 7. 9)
2 OmMチォ尿素
及び 2 OmM二塩化ヒドラジニゥム
及び 1 %P VP 2 5 実施例 12. 1. 0 0%アデ力トール NP - 7 20 > 0. 999 1 0. 3 50. 0 2. 8 2. 4
(HLB 1 4. 1 )
2 OmMチォ尿素
及び 2 OmM二塩化ヒドラジニゥ厶
及び 1 %PVP 25 実施例 13. 1. 0 0%アデ力トール NP— 69 5 > 0. 999 1 0. 2 4 9. 2 2. 8 2. 4
(HLB 1 3. 0)
2 OmMチォ尿素
2 OmM二塩化ヒドラジニゥム
及び 1 %PVP 25
血清 · ：直接ビリルビン 2. 3mgZd 1及び総ピリルビン 1 2. l mg/d lを含む。
実施例 1 4
非ィォン型界面活性剤存在下でのバナジン酸法及び B 0 D法による直接ビリル ビンの測定
i ) 目的
試料に、 HLB 1 2〜1 5未満のポリオキシエチレン （n—アルキルもしくは i s 0—アルキル） エーテル及び HLB 1 2〜 1 9のポリオキシエチレン （n— アルキルフ ニル） エーテルから選ばれる非イオン型界面活性剤としてアデ力ト —ル SO— 1 35を添加処理し、 その混合液に、 バナジン酸またはピリルビンォ キシダーゼ （BOD) を作用させて、 該試料の光学的変化を 4 50 nmで測定す ることによって直接ピリルビンを測定し、 検量線を作成した。
ii) 用いた試薬
第 1試薬
第一試薬は以下の成分を含み、 かつ、 NaOHで pH3. 70にした水溶液を 用いた。
クェン酸 1水和物 l O OmM, EDTA 1 mM, アデ力トール S 0_ 1 35 1. 00 %
第 2試薬
第 2試薬として、 バナジン酸 3 mMを含む生理食塩水、 あるいは 200 UZ ビリルビンォキシダーゼを含む生理食塩水を用いた。
試料
試料としてジタウロピリルビンを用いた。
量線
ジタウロピリルビン 1 OmgZd 1、 20mg/d 1 , 30 mg/d 1 , 40 mg/d I及び 5 Omg/d 1を含む試料を用いて、 実施例 5〜 1 3及び比較例 1〜3において記載した操作法に従い測定して検量線を求めた。
iii)結果
バナジン酸法及び B OD法によって得られる検量線を、 それぞれ図 6及び図 7 に示した。 図 6及び図 7に示した検量線は良好な直線性を示しており、 本発明による特定 の非ィォン型界面活性剤の存在下でのバナジン酸または B 0 Dを酸化剤として用 いる直接ピリルビンの測定法により、 高感度で高濃度の直接ビリルビンを測定で きること力、'判る。
産業上の利用可能性
以上述べたことから明らかなように、 本発明は、 亜硝酸をビリルビンの酸化剤 として用いる点、 直接ビリルビンを測定する際には間接ピリルビンの反応抑制剤 を用いる点、 及び総ビリルビンを測定する際には反応促進剤を用 、る点に特徴が ある。 また、 本発明は特定の非イオン型界面活性活性剤の存在下で直接ピリルビ ンを測定する点に特徴がある。 このような本発明方法は、 従来法として精度に儍 れた B O D法と、 相関性が良く、 かつ、 測定試薬の安定性が極めて良い。 更に本 発明方法は、 自動分析装置でピリルビンを測定可能なので、 臨床検査測定に寄与 すること大である。

Claims

請求の範囲
1 . 生体体液試料に、 亜硝酸を酸化剤として作用させ、 該試料の光学的変化を 測定する総ビリルビンまたは直接ビリルビンの測定方法。
2 . 間接ピリルビンの酸化を抑制する反応抑制剤の存在下、 生体体液試料に、 亜硝酸を酸化剤として作用させ、 該試料の光学的変化を測定する直接ピリルビン の測定方法。
3 . 間接ビリルビンの酸化を促進する反応促進剤の存在下、 生体体液試料に、 亜硝酸を酸化剤として作用させ、 該試料の光学的変化を測定する総ビリルビンの 測定方法。
4 . ^1し8値が1 2以上で 1 5未満のポリオキシエチレン （n—アルキルもし くは i s o—アルキル） エーテル及び H L B値が 1 2以上で 1 9以下のポリオキ シエチレン （n—アルキルフヱニル） エーテルから選ばれる少なくとも一種の非 イオン型界面活性剤の存在下、 生体体液試料中に酸化剤を作用させ、 該試料の光 学的変化を測定する直接ビリルビンの測定方法。
5 . 非ィォン型界面活性剤とともに間接ビリルビンの反応抑制剤を用いる請求 の範囲第 4項記載の測定方法。
6 . 更にポリビニルピロリ ドンを用いる請求の範囲第 5項記載の測定方法。
7 . 酸化剤が亜硝酸である請求の範囲第 4項から第 6項のいずれかに記載の測 定方法。
8 . 生体体液試料中のピリルビン測定用キットであって、 かつ、
i ) 酸性溶液、 及び
i i ) 亜确酸塩溶液、
を含むキット。
9 . 生体体液試料中の直接ピリルビン測定用キットであって、 かつ、
i ) 反応抑制剤を含有する酸性溶液、 及び
i i ) 亜碓酸塩溶液、
を含むキット。
1 0 . 生体体液試料中の総ピリルビン測定用キッ卜であって、 かつ、 i )反応促進剤を含有する酸性溶液、 及び
i i )亜硝酸塩溶液、
を含むキッ ト。
1 1. 生体体液試料中の直接ビリルビンの測定用キッ 卜であって、 かつ、 i ) HLB値が12以上で 15未満のポリオキシエチレン （n—アルキルもしく は i so—アルキル） エーテル及び HLB値が 12以上で 19以下のポリオキシ エチレン （n—アルキルフヱニル） エーテルから選ばれる少なくとも一種の非ィ オン型界面活性剤を含有する酸性溶液、 及び
i i )酸化剤溶液、
を含むキッ ト。
12. 酸性溶液が更に反応抑制剤を含有する請求の範囲第 1 1項記載のキッ ト c
13. 更にポリビニルピロリ ドンを含有する請求の範囲第 12項記載のキッ ト(
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