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WO1996031529A1 - Peptides et medicaments contre les maladies auto-immunes contenant ces peptides - Google Patents

Peptides et medicaments contre les maladies auto-immunes contenant ces peptides Download PDF

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Publication number
WO1996031529A1
WO1996031529A1 PCT/JP1996/000917 JP9600917W WO9631529A1 WO 1996031529 A1 WO1996031529 A1 WO 1996031529A1 JP 9600917 W JP9600917 W JP 9600917W WO 9631529 A1 WO9631529 A1 WO 9631529A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ala
lys
gly
thr
peptide
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/000917
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nobuyuki Yamagata
Kenji Ogata
Masako Wagatsuma
Hitoshi Takanashi
Original Assignee
Hoechst Pharmaceutical & Chemicals Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Pharmaceutical & Chemicals Kk filed Critical Hoechst Pharmaceutical & Chemicals Kk
Priority to NZ304437A priority Critical patent/NZ304437A/xx
Priority to US08/930,741 priority patent/US6034064A/en
Priority to DE69629559T priority patent/DE69629559T2/de
Priority to EP96908337A priority patent/EP0821003B1/en
Priority to CA002217679A priority patent/CA2217679C/en
Priority to AU51622/96A priority patent/AU704656B2/en
Priority to AT96908337T priority patent/ATE247664T1/de
Publication of WO1996031529A1 publication Critical patent/WO1996031529A1/ja
Priority to NO974566A priority patent/NO974566L/no
Priority to MXPA/A/1997/007662A priority patent/MXPA97007662A/xx

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to peptides or derivatives thereof.
  • the peptide of the present invention or a derivative thereof is useful not only for the treatment of non-antigen-specific suppression of an abnormally enhanced immune response in an autoimmune disease, but also a peptide or a derivative thereof of the present invention has an anti-inflammatory effect. It is also useful for treating inflammation.
  • the present invention relates to the field of peptides and derivatives thereof, and the field of medicine using the same.
  • Sun and moon
  • An autoimmune disease is a disease caused by the continuous production of antibodies or lymphocytes that react with the constituents of the own tissue. More specifically, autoimmune diseases result in the breakdown of immunological tolerance, resulting in an increase in the immune response to their own biological components, and the generated autoantibodies or autoreactive ⁇ cells react with the corresponding autoantigens and cells. It is a disease that causes abnormal cell function and tissue damage. Currently, more than 50 types of autoimmune diseases are known, and they are classified into organ-specific autoimmune diseases and non-organ-specific autoimmune diseases according to the spread of affected organs.
  • Examples of the former include insulin-dependent diabetes mellitus whose lesions are caused by the selective destruction of B cells in the islets of Langerhans; There are myasthenia gravis, in which antibodies against striated acetylcholine receptor pigs decrease muscle contraction, and autoimmune hemolytic anemia, in which antibodies against erythrocytes cause hemolysis of erythrocytes.
  • Examples of the latter include rheumatoid arthritis, DNA and DNA, which are thought to cause the aggregation of IgG and anti-IgG antibodies (rheumatic factors) to trigger bone and cartilage tissue throughout the body.
  • Antibodies against nucleus components are sensible, impaired reactions appear by depositing on joints and skin moes, etc.Function by infiltration of lymphocytes into systemic erythematosus, salivary glands, lacrimal glands, etc.
  • Siegren's syndrome which causes insufficiency and, more frequently, systemic organ involvement such as interstitial nephritis; diffuse demyelinating foci and gliosis in the white matter of the central nervous system; There are multiple sclerosis with paralysis, eye symptoms, paresthesia, etc.
  • T cells recognize the antigen itself during the reaction with the antigen
  • T cells recognize the combination of the MHC molecule on the surface of the antigen-presenting cell and the antigen peptide contained in the groove.
  • MHC molecules vary from individual to individual, and human T cells with MHC that are compatible with an antigen respond well to that antigen. This is partly because certain humans are more susceptible to specific antigens.
  • the antigen receptor of T cells T ⁇ antigen receptor, T cell receptor: T c R
  • the T cells bind to several go to the one without There are substances that activate it and are called superantigens.
  • Superantigens activate larger amounts of T cells than normal immune responses, which can cause a large response and cause disease.
  • T cells Activation of T cells requires not only antigen recognition but also the binding of a partner molecule (ligand) to surface adhesion molecules. Therefore, blocking the adhesion molecule can block the T cell response, and increasing the expression of the partner cell's ligand can amplify the reaction.
  • ligand partner molecule
  • T cells that suppress the immune response so-called suppressed T cells
  • suppressed T cells exist in the T cell group
  • T cells have been shown to produce soluble immunosuppressive factors that suppress antibody production in an antigen-specific manner (Tada, et al., J. Immnul., Vol. Ill, p952, 1973).
  • TcR alpha chain has been reported (Dorf, et al., J. Immunol., Vol. 145, pp 2809-2819, 1990).
  • mice a model of multiple sclerosis EAE
  • TcR T cell antigen receptor
  • a treatment method using an antibody against a disease-specific TcR or a TcR peptide vaccine was developed (Howell, et al., Science, vol. 251, p P430-432, 1991; Vandenbrk, et al.). , Nature, vol.341, pp541-544, 1989).
  • TcR peptide fragment of T cells is administered to suppress the onset of EAE (WO 9 0/1 1 2 9 4) is disclosed.
  • Mohapatra and colleagues also demonstrated that a synthetic peptide consisting of a 15-residue amino acid containing CDR3 (Complementarity Determining Region), which is a specific antigen recognition site for T cell-derived TcR, is immunosuppressive. It has been shown to have an effect (J. Immunol., Vol. 151, pp. 688-98, 1993).
  • An object of the present invention is to overcome the disadvantages or drawbacks of the conventional method as described above and to have an antigen-specific immunosuppressive effect that can be used for the treatment of autoimmune diseases whose antigens have not been elucidated.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for an autoimmune disease.
  • Another object of the present invention is to provide a therapeutic agent for an autoimmune disease, which can be used for treating an autoimmune disease accompanied by inflammation.
  • the object of the present invention is that it is a low-molecular peptide as compared with the conventional method, the peptide can be produced at low cost, and the side effects such as the occurrence of antigenicity in frequent administration are greatly reduced. And derivatives thereof.
  • the present inventors have been diligently examining the correlation between proteins such as CDR3 of TcR derived from suppressed T cells and amino acid sequences such as peptide fragments thereof and therapeutic agents for autoimmune diseases. It has been found that some peptides have an IgG non-specific inhibitory activity nonspecifically.
  • the present inventors have found that the peptide consisting of 9 amino acids of amino acid shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing can be used not only to produce anti-ovalbumin (Ovalbumin: ⁇ VA) antibody but also to produce anti-keyhole limpet.
  • the inventors have also found that the production of Keyhole Lympet Hemocyanin (KLH)) antibody is also suppressed in vivo, and thus completed the present invention.
  • KLH Keyhole Lympet Hemocyanin
  • 0 VA and KLH are typical antigens used as immunizing antigens (Immunology Encyclopedia, 1993, Tokyo Kagaku Dojin, p. 101 and p. 130).
  • the TcRs of suppressor T cells specifically correspond one-to-one to a variety of antigens.
  • the peptide of the present invention has an immunosuppressive activity characterized by being non-antigen-specific by suppressing the production of antibodies against different antigens such as OVA and KLH.
  • the peptide consisting of the 9-amino acid amino acid shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is an experimental cerebrospinal cord that is a model of multiple sclerosis, which is one of the autoimmune diseases involving T cells.
  • a peptide consisting of the 9 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 1 suppresses edema and has an anti-inflammatory effect in a carrageenan-induced paw edema model. I also found this.
  • the peptide of the present invention suppresses the activity of T cells and has an immunosuppressive activity having an anti-inflammatory effect.
  • the present inventors have worked diligently to develop low-molecular-weight peptides that are less antigenic and easy to synthesize, and have obtained the 8-residue amino acid shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Consisting of anti-KLH suppresses not only anti-VA antibody production but also anti-KLH production in vivo I found this. In addition, the present inventors have determined that, among peptides having a certain universal amino acid sequence, those having IgG-inhibitory activity in a non-antigen-specific manner can be determined by the alanine substitution method ( Geysen HM, et al., (1987), J. Immunol, methods, 102; 259-274).
  • the present inventors have found that peptides having these universal amino acid residues can produce anti-ovalbumin (OVA) as well as anti-keyhole limpet hemocyanin (KLH) antibody antibodies. Were also found to be suppressed in vivo, and the present invention was completed.
  • OVA anti-ovalbumin
  • KLH anti-keyhole limpet hemocyanin
  • amino acid sequence represented by the following formula:
  • Xaal and Xaa4 each independently represent an amino acid residue which may be substituted with a hydroxy group, an amino group or a guanidyl group, and which may have an alkyl or heteroalkyl side chain.
  • Xaa2 and Xaa6 each independently represent an amino acid residue which may be substituted by a hydrogen group or may have an alkyl or heteroalkyl side chain;
  • Xaa3 and Xaa5 are independently amino acid residues which may have a hydrophobic side chain;
  • n 1 or 0.
  • the present invention relates to a peptide having the following or a derivative thereof, a pharmaceutical composition containing the peptide, a method for treating a disease using the same, and the like.
  • FIG. 1 shows a chart of a chromatogram of the peptide (I). The purity of the obtained peptide (I) was 100%.
  • FIG. 2 shows a chart of a chromatogram of the peptide (II). The purity of the obtained peptide (II) was 99.6%.
  • FIG. 3 shows a chart of a chromatogram of the peptide (III). The purity of the obtained peptide (III) was 98.8%.
  • FIG. 4 shows a chart of a chromatogram of a peptide (IV). The purity of the obtained peptide (IV) was 97.2%.
  • FIG. 5 is a chart showing a chart of a chromatogram of the peptide (V). Get The purity of the obtained peptide (V) was 98.5%.
  • FIG. 6 is a chart showing a chart of a chromatogram of the peptide (VI). The purity of the obtained peptide (VI) was 98.4%.
  • FIG. 7 is a chart showing a chart of a chromatogram of a peptide (V I I). The purity of the obtained peptide (VII) was 97.9%.
  • FIG. 8 is a chart showing a chart of a chromatogram of a peptide (VIII). The purity of the obtained peptide (VIII) was 98. 1%.
  • FIG. 9 is a chart showing a chart of a chromatogram of the peptide (IX). The purity of the obtained peptide (IX) was 97.5%.
  • FIG. 10 is a diagram showing a chart of a chromatogram of the peptide (X). The purity of the obtained peptide (X) was 98.2%.
  • FIG. 11 is a diagram showing a chart of a chromatogram of the peptide (XI). The purity of the obtained peptide (XI) was 97.6%.
  • FIG. 12 is a diagram showing a chart of a chromatogram of the peptide (XII). The purity of the obtained peptide (XII) was 97.5%.
  • FIG. 13 is a diagram showing a chart of a chromatogram of a peptide (XIII). The purity of the obtained peptide (XIII) was 98.2%.
  • the purity of the peptide is a diagram that shows the chart of the chroma bets grams (XIV) c resulting peptide (XIV) was 9 8.6%.
  • FIG. 15 shows a chart of a chromatogram of the peptide (XV). The purity of the obtained peptide (XV) was 100%. Disclosure of the invention
  • the present invention provides an amino acid sequence represented by the following formula:
  • Xaal and Xaa4 each independently may be substituted with a hydroxy group, an amino group or a guanidyl group, and may have an alkyl or heteroalkyl side chain.
  • Xaa2 and Xaa6 each independently represent an amino acid residue which may be substituted with a hydroxy group and may have an alkyl or heteroalkyl side chain;
  • Xaa3 and Xaa5 each independently represent an amino acid residue which may have a hydrophobic side chain;
  • n 1 or 0.
  • XaaK Xaa4 is an amino acid residue which may be independently substituted with a hydroxy group, an amino group or a guanidyl group, and which may have an alkyl or heteroalkyl side chain. , Lys, Arg, His or Ala.
  • Xaa2 and Xaa6 each independently represent an amino acid residue which may be substituted with a hydroxy group and which may have an alkyl or heteroalkyl side chain; for example, any of Thr or Ala You may.
  • Xaa3 and Xaa5 are independently amino acid residues which may have a hydrophobic side chain, and may be, for example, either Gly or Ala.
  • alkyl j refers to a linear or branched, primary, secondary or tertiary saturated alkyl group having 1 to 15, preferably 1 to 10 carbon atoms.
  • heteroalkyl also refers to groups containing 1 to 15, preferably 1 to 10 carbon atoms, wherein one or more of the above “alkyl” groups has 1 to 10 carbon atoms.
  • a group (usually in the form of a (thio) ester or (thio) ether) replaced by a heteroatom such as an atom (S) or an oxygen atom (0).
  • n 1 or 0.
  • the peptide derivative of the present invention all or a part of the amino acid may be in the D-form, or the functional group having active hydrogen in the peptide may be substituted with an appropriate protecting group.
  • the C-terminal lipoxyl group of the peptide may be a lipoquine derivative such as an amide or an ester.
  • the appropriate protecting group to be substituted for the amino or carboxyl group in the peptide, as long as it is commonly used in peptide chemistry, but the acetyl group (A c) And a butoxycarbonyl group (tBoc) are preferred.
  • Amide is preferred as the C-terminal carboxy derivative.
  • the present invention provides the following amino acid sequence:
  • Xaa2 and Xaa6 are each independently Thr or Ala;
  • Xaa3 and Xaa5 are each independently Gly or Ala
  • n 1 or 0.
  • the present invention provides the following amino acid sequences:
  • the present invention relates to any one peptide selected from the group consisting of or a derivative thereof.
  • An amino acid sequence represented by the following formula of the present invention represented by the following formula of the present invention.
  • Xaal and Xaa4 each independently may be substituted with a hydroxy group, an amino group or a guanidyl group, or an amino acid residue which may have an alkyl or heteroalkyl side chain.
  • Xaa2 and Xaa6 are each independently an amino acid residue which may be substituted with a hydroxy group and which may have an alkyl or heteroalkyl side chain;
  • Xaa3 and Xaa5 are independently amino acid residues which may have a hydrophobic side chain;
  • n 1 or 0.
  • the physicochemical properties of the peptides of the present invention are preferably soluble. Further, since the peptide of the present invention is characterized by being a low molecular weight peptide, side effects such as the occurrence of antigenicity during frequent administration are greatly reduced and its own toxicity is small.
  • amino acid sequence represented by the following formula:
  • Xaal and Xaa4 each independently represent an amino acid residue which may be substituted with a hydroxy group, an amino group or a guanidyl group, and which may have an alkyl or heteroalkyl side chain.
  • Xaa2 and Xaa6 each independently represent an amino acid residue which may be substituted with a hydroxy group and may have an alkyl or heteroalkyl side chain;
  • Xaa3 and Xaa5 are each independently an amino glare residue which may have a hydrophobic side chain
  • n 1 or 0.
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide or a derivative thereof, or a pharmaceutical composition comprising the peptide or a derivative thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides the following amino acid sequence:
  • Xaal and Xaa4 are each independently Lys, Arg, His or Ala;
  • Xaa2 and Xaa6 are each independently Thr or Ala
  • Xaa3 and Xaa5 are each independently Gly or Ala
  • n 1 or 0.
  • the present invention provides the following amino acid sequence:
  • a pharmaceutical composition comprising a peptide having any one of the amino acid sequences selected from the group consisting of: or a derivative thereof, or the peptide or a derivative thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier. And a pharmaceutical composition comprising:
  • a pharmaceutical composition comprising any one peptide or a derivative thereof selected from the group consisting of: or a pharmaceutical composition comprising the peptide or a derivative thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the peptide derivative used in the pharmaceutical composition of the present invention all or a part of the amino acid may be in D-form, or a functional group having active hydrogen in the peptide is suitable.
  • a protecting group, or the carboxy derivative at the C-terminal of the peptide may be a carboxy derivative such as an amide or an ester.
  • the appropriate protecting group to be substituted for the amino group or hepoxyl group in the peptide is not particular limitation, but the acetyl group (A c) And t-butoxycarbonyl group (tBoc) are preferred.
  • amides are preferred as the C-terminal lipokin derivative.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition of the present invention is particularly useful for treating an autoimmune disease. Therefore, the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating an autoimmune disease.
  • the pharmaceutical composition for treating an autoimmune disease of the present invention is characterized by being non-antigen-specific.
  • the present invention relates to multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus comprising the above-mentioned peptide or its derivative. It also relates to a pharmaceutical composition for treating one or more diseases selected from the group consisting of Todes, Siegren's syndrome, Basedow's disease, Hashimoto's disease, and autoimmune hemolytic anemia.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition of the present invention is useful for the prevention and treatment of rejection reactions associated with organ transplantation. Therefore, the present invention is intended to prevent or prevent rejection associated with armpit transplantation. It also provides a pharmaceutical composition.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition of the present invention has an anti-inflammatory effect, and is also useful as an anti-inflammatory agent. Accordingly, the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating inflammation.
  • the present invention also relates to a method for treating an autoimmune disease, which comprises administering a therapeutically effective amount of the above-described peptide or its derivative.
  • the present invention relates to a method for administering a therapeutically effective amount of the above-described peptide or its derivative, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Ziegren's syndrome, Basedow's disease, Hashimoto's disease
  • the present invention also relates to a method for treating one or more diseases selected from the group consisting of autoimmune hemolytic anemia.
  • the present invention also relates to a method for preventing and treating rejection associated with organ transplantation by administering a therapeutically effective amount of the above-described peptide or its derivative.
  • the present invention relates to a method for treating inflammation, which comprises administering a therapeutically effective amount of the above-described peptide or a derivative thereof of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of the above-mentioned peptide or a derivative thereof for the production of a pharmaceutical composition for an autoimmune disease.
  • the present invention relates to the use of the above-mentioned peptide or a derivative thereof as a method for treating multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Schizogren's syndrome, Passeig's disease, Hashimoto's disease, and autoimmune disease.
  • the present invention also relates to the use for producing a pharmaceutical composition for treating one or more diseases selected from the group consisting of hemolytic anemia.
  • the present invention also relates to the use of the above-mentioned peptide or a derivative thereof for the production of a pharmaceutical composition for preventing and / or treating rejection associated with organ transplantation.
  • the present invention relates to the use of the above-mentioned peptide or a derivative thereof of the present invention for the production of a pharmaceutical composition for treating inflammation.
  • the daily dose of the peptide of the present invention in clinical practice for an adult varies depending on the administration method, the patient's age, body weight, symptoms, etc., usually 0.05 to 500 mg, preferably 0 to 500 mg. The range is from l to 100 mg.
  • intravenous administration is possible.
  • intravenous drip infusion is possible.
  • the preparation for injection can be, for example, a powder preparation for injection.
  • suitable water-soluble excipients such as mannitol, sucrose, lactose, maltose, glucose, and fructomonosugar, dissolve in water, and dispense into pials or ambles It can be lyophilized and sealed to form a preparation.
  • it can be administered nasally or pulmonary as aerosol formulation of fine particles as systemic administration.
  • Oral administration is also possible by adding an appropriate excipient.
  • the inhibitory effects of anti-0VA antibody production and anti-KLH antibody production in mice were measured by ELISA.
  • the peptide of the present invention Compared with the non-administration-treated group, the peptide of the present invention had an extremely high antibody production inhibitory activity when compared with the non-administered group. In comparison, the peptide of the present invention had a clearly higher antibody production inhibitory activity, and the anti-KLH antibody production inhibitory effect was clearly higher in the antibody production inhibitory activity when compared to the non-administered group.
  • the peptide of the present invention had an extremely high antibody production inhibitory activity when compared with the non-administered group.
  • the peptide of the present invention had a clearly higher antibody production inhibitory activity, and the anti-KLH antibody production inhibitory effect was clearly higher in the antibody production inhibitory activity when compared to the non-administered group.
  • mice In addition, the effect of suppressing the development of experimental encephalomyelitis (EAE) in mice was measured. The AE onset suppression effect was significantly suppressed when compared with the non-administration group.
  • EAE experimental encephalomyelitis
  • the edema-suppressing effect of the rat on the rat was examined using a force-lagenin-induced paw edema model. The edema-suppressing effect was extremely high compared to the non-administration group.
  • a peptide derived from the TcR alpha chain J region and which can be synthesized by a small molecule and has an immunosuppressive effect non-specifically has not been reported so far. Its derivatives are used as therapeutic agents for autoimmune diseases, especially for multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic erythematosus, Ziegren's syndrome, Basedow's disease, Hashimoto's disease, and autoimmune hemolytic anemia.
  • Peptide (I) was produced by a solid phase synthesis method (Fmoc) using a peptide synthesizer (Applied Biosystems Inc., Model 430 ⁇ ).
  • the amino acid on the resin was deprotected using 20% viridin / N-methylbiethylene lid (Niethylpyrrolidone (NMP)) at room temperature for 30 minutes.
  • NMP N-methylbiethylene lid
  • DCM dichloromethane
  • Peptides (11), (11), (IV), (V) and (VI) were produced by solid phase synthesis (tBoc) using a peptide synthesizer (Beckman 990c peptide synthesizer). .
  • the purity of the produced peptide was assayed by a reversed-phase HPLC method using a C18 column (Vydac). A linear gradient from 5% to 25% of acetonitrile / purified water was set as the mobile phase, and the elution beak was detected by measuring the absorbance at 215 nm.
  • Figure 1 shows the chart of the chromatogram of the peptide (I). The purity of the obtained peptide (I) was 100%.
  • Fig. 2 shows a chromatogram of the peptide (II). The purity of the obtained peptide (II) was 99.6%.
  • Figure 3 shows the chart of the chromatogram of the peptide (III). The purity of the obtained peptide (III) was 98.8%.
  • Figure 4 shows the chart of the chromatogram of the peptide (IV). The purity of the obtained peptide (IV) was 97.2%.
  • Figure 5 shows the chart of the peptide (V) chromatogram. The purity of the obtained peptide (V) was 98.5%.
  • Figure 6 shows the chart of the chromatogram of the peptide (VI). The purity of the obtained peptide (VI) was 98.4%.
  • Example 2 Measurement of Anti-OVA Antibody Production Inhibitory Effect in Mice Using Peptide (I)
  • the peptide (I) consisting of the amino acid having 9 residues shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing of the present invention, clone 17 reported by Mohapatra et al. 2
  • Dissolve 100 / g of each of the synthetic peptides 15 consisting of 15 amino acids from the TCR in 200 ml of physiological saline, and subcutaneously subcutaneously administer them to 9-week-old Balb / c mice. was administered.
  • a group to which the same amount of physiological saline was administered was regarded as a non-administration group.
  • 100 g of ⁇ VA (Signia) was dissolved in 200 1 physiological saline and administered subcutaneously. Blood was collected 21 days after the antigen administration, and the antibody titer was measured by the method described below.
  • the plate was washed three times with T-PBS, and then diluted with anti-mouse IgG-peroxididase-labeled antibody (TAG0 Co., Ltd.) diluted 400-fold with 0.5% casein TBS. ) was dispensed in 501 to each of the 6 and allowed to react at room temperature for 1 hour (secondary reaction).
  • the plate is washed three times again, and a substrate solution / color former (Chromogen Substrate: Behringwerke) is dispensed into each well in a quantity of 501 and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
  • a substrate solution / color former Chromogen Substrate: Behringwerke
  • each of the peptides (I) to (VI) of the present invention consisting of 9 amino acid residues of SEQ ID NO: 1 of 100> ug It was dissolved in physiological saline and administered subcutaneously to 9-week-old Balb / c mice.
  • a group to which the same amount of physiological saline was administered was used as a non-administration group.
  • an antigen 25 g of KLH was dissolved in a physiological saline solution of 201 and administered subcutaneously. Blood was collected 21 days after the antigen administration, and the antibody titer was measured by the method described below.
  • KLH was diluted to 10 g / ml with phosphate buffered saline (PBS), dispensed into 96-well microplates by 5 OI, and left at 4 ° C for 1 ⁇ .
  • PBS phosphate buffered saline
  • T-PBS PBS containing 0.05% Tween 20
  • casein Lithium buffered saline
  • Lithium buffered saline (Casein TBS) was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed three times with T-PBS and diluted 200-fold with casein TBS. The reaction was performed for 1 hour (primary reaction).
  • TAG0 anti-mouse IgG-peroxididase-labeled antibody
  • Example 4 Inhibitory Effect of Peptide (I) on EAE Model Mice Guinea pig spinal cord homogenate was used as the antigen. Guinea pig spinal cord homogene
  • onset was suppressed at a significant level of 5% on the 25th and 28th days as compared with the physiological saline administration group.
  • suppression was observed at a significant level of 5% from day 22 onward, compared with the physiological saline administration group, and the level of significance was 1% from day 25. Suppression of the onset was observed.
  • Example 4 shows that the peptide of the present invention has a therapeutic effect on multiple sclerosis.
  • Example 5 Inhibitory Effect of Peptide (I) on Rat Carrageenin-Induced Foot Edema Model
  • Human-power lagenin (PICNIN-A, manufactured by Zushi Chemical Laboratories) was added to physiological saline at a concentration of 1 w / v%, heated in a boiling water bath to completely dissolve, and left at room temperature. Before the start of the test, the solution was heated in a boiling water bath to completely dissolve, and then left to stand in a water bath at about 60 ° C until administration.
  • a physiological saline (non-injected ⁇ group) 501 to a Splague-Dawley rat (6 weeks old, male) The same site was administered with a 1% strength lagenin solution 501. Thereafter, until 5:00 p.m.
  • the administration of the peptide (I) of the present invention showed a tendency to suppress the occurrence of edema 1 hour after the administration of tyrageenin.
  • the occurrence of edema was suppressed at a significant level of 5% after 2 hours from the administration of ikilagenin, and the occurrence of edema tended to be suppressed after 5 hours from the administration of ikilagenin. From the above, it was found that the peptide of the present invention has an anti-inflammatory effect.
  • Figure 7 shows the chart of the peptide (VII) chromatogram. The purity of the obtained peptide (VII) was 97.9%.
  • Figure 8 shows the chart of the peptide (VIII) chromatogram. The purity of the obtained peptide (VIII) was 98. 1%.
  • Fig. 9 shows a chart of the chromatogram of the peptide (IX). The resulting peptide
  • Figure 10 shows the chart of the chromatogram of the peptide (X). The resulting peptide
  • Figure 11 shows the chart of the chromatogram of the peptide (XI). The purity of the obtained peptide (XI) was 97.6%.
  • Fig. 12 shows the chart of the chromatogram of the peptide (XII). The purity of the obtained peptide (XII) was 97.5%.
  • FIG. 14 A chart of the chromatogram of the peptide (XIV) is shown in FIG. 14-The purity of the obtained peptide (XIV) was 98.6%.
  • Fig. 15 shows the chart of the chromatogram of the peptide (XV). The purity of the obtained peptide (XV) was 100%.
  • Example 7 Antibodies in Mice Using Peptides (I), (VII)-(XV)
  • mice to which the peptides (VII), (IX), (X), (XII) and (XIII) were administered the antibody production was clearly suppressed as compared with the non-administered group and the peptide (I).
  • the mice to which the peptides (XII), (XIII), (XIV), and (V) were administered did not inhibit the antibody production as compared with the peptide (I). This test was performed with one group consisting of eight animals.
  • the amino acids that constitute the peptide that suppresses the production of non-antigen-specific antibodies are Ala at the first position, Leu at the third position, and Phe at the fifth position. It was found to be essential for suppressing production.

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Description

明 細 書 ぺブチ ド及びそれからなる 自己免疫疾患治療剤 発明の枝術分野
本発明は、 ペプチ ドまたはその誘導体に関する。 本発明のペプチ ドまたはその 誘導体は、 自己免疫疾患において異常に昂進した免疫反応を抗原非特異的に抑制 する治療に有用なばかりでなく、 本発明のぺブチ ドまたはその誘導体は抗炎症作 用を有し炎症の治療にも有用である。
したがって、 本発明は、 ペプチ ド及びその誘導体に関する分野、 及び、 それを 用いた医薬の分野に関する。 日月の
自己免疫疾患は自己の組織を構成する成分と反応する抗体またはリ ンパ球が持 続的に産生されることによ り惹起される疾患である。 詳しく は、 自己免疫疾患は 免疫学的寛容に破綻をきた した結果、 自己の生体成分に対する免疫応答が高ま り、 産生された自己抗体あるいは自己反応性 τ細胞が対応する自己抗原や細胞と反応 し、 細胞の機能異常や組織陣害を引き起こす疾患である。 現在 5 0種類以上の自 己免疫疾患が知られており、 病変のみられる臓器の広がり によって臓器特異的自 己免疫疾患と臓器非特異的自己免疫疾患に分類される。
前者の例と して病変が脬ランゲルハンス島の B細胞の選択的破壊によ り生ずる イ ンス リ ン依存性糖尿病、 甲状腺刺激ホルモ ン レセブターに対する抗体によって 甲状腺機能異常を示すバセ ドウ病及び橋本病、 横紋筋のァセチルコ リ ン レセブタ 一に対する抗体によって筋肉の収縮する働きが低下する重症筋無力症及び赤血球 に対する抗体によって赤血球の溶血が引き起こされる 自己免疫性溶血性貧血など がある。
後者の例と して、 I g Gと抗 I g G抗体 （リ ウマチ因子） の凝集が引き金とな つて全身の骨や軟骨組織を障害される と考え られている慢性関節リ ウマチ、 D N Aや核の成分に対する抗体が賢、 関節及び皮萌などに沈着して障害反応が現れる 全身性ェリテマ ト一デス、 唾液腺 · 涙腺等に リ ンパ球が浸潤するこ とによ り機能 不全を生じ、 さ らにある頻度で間質性腎炎などの全身臓器病変を併発する シ ー グレ ン症候群、 中枢神経の白質に散在性の脱髄巣とグリオ一シスが出現し、 全身 の運動麻痺、 眼症状、 知覚異常等がみられる多発性硬化症などがある。
従来の 術
現在行われている自己免疫疾患の治療方法と しては糖質ステロイ ド剤、 シクロ スポリ ン Aあるいは F K 5 0 6などに代表される免疫抑制剤の投与がある。 しか し、 上記の薬剤を用いた治療では広範な免疫抑制の結果と しての、 感染症、 薬物 自体の持つ臂毒性あるいは発癌等の重篤な副作用が問題となっている （柏崎禎夫、 総合臨床、 1994、 vol.43, No.9， ppl725-1729)0
近年、 前記のような広範な免疫抑制剤を用いない自己免疫疾患の治療方法がい くつか試みられている。
抗原との反応に際して B細胞は抗原そのものを認識するのに対し、 T細胞は抗 原提示細胞表面の MH C分子とその溝に収まった抗原ペプチ ド との組合わせを認 識する。 MH C分子には個体ごとの多様性があり、 ある抗原と相性のよい MH C をもつヒ トの T細胞はその抗原に良好な応答をする。 このこ とは特定のヒ トが特 定の抗原に反応しやすいこ との一因になっている。 一方、 T細胞の抗原受容体 (T綑胞抗原受容体、 T cell receptor: T c R ) はい くつかのファ ミ リーにわけ られる力5、 その一つないしいく つかに結合して T細胞を活性化する物質があり、 スーパー抗原と呼ばれている。 スーパー抗原は、 通常の免疫反応の場合よ り も大 量の T細胞を活性化するため、 大きな反応が生じ病気を起こすこ とがある。 T細 胞の活性化には、 抗原を認識するこ との他に、 表面の接着分子に相手分子 （ リガ ン ド） が結合するこ とも必要である。 したがって、 接着分子を遮断すれば T細胞 の反応を阻止できる し、 相手細胞のリガン ドの表出を高めれば反応を増幅できる。
T細胞群のなかに免疫反応を抑制する T細胞、 いわゆる抑制 T細胞が存在する ことが報告されている（Tada and Takemori, J. Exp. Med. , vol .140, p239, 1974)。 これらの T細胞は抗原特異的に抗体産生を抑制する可溶性の免疫抑制因子を産生 するこ とが明らかになつている（Tada, et al . , J. Immnul . , vol . Ill, p952, 19 73)。 また、 可溶性免疫抑制因子と T c Rアルフ ァ鎖との関連が報告された（Dorf, et al. , J. Immunol. , vol.145, pp2809-2819, 1990 )。 多発性硬化症のモデルで ある実験的ア レルギー性脳脊 ffi炎 ( experimental allergic encephalomyelitis; E A E )は塩基性ミエリ ン蛋白質の投与によって引き起こされる。 この E AEでは 病原リ ンパ球上に特異的に発現される T細胞抗原受容体（疾患特異的 T c R )の存 在が知られている。 そこで疾患特異的 T c Rに対する抗体、 あるいは T c Rぺブ チ ドワクチンによる治療法が開発された（Howell , et al . , Science, vol .251, p P430-432, 1991； Vandenbrk, et al . , Nature, vol.341, pp541-544, 1989)。 こ のようなアブローチを用いた自己免疫疾患の治療法には糖質ステロィ ド剤ゃシク ロスポリ ン Aなどの免疫抑制剤によるものに較べて重篤な副作用はないと考えら れている。 しかし、 疾患の原因となる T細胞あるいは抗原が極めて限局された場 合にのみ上記の方法が適用可能であるために例えば抗原が不明でなおかつ病原リ ンパ球が複数種存在する慢性関節リ ウマチのような自己免疫疾患には上記方法を 応用するこ とは難しいと考えられる。 この方法では全ての抗原に特異的に対応す る抑制 T細胞を樹立し、 その T c Rを各々解析を しな くてはならない。 その上、 ヒ ト 由来の抑制 T細胞の樹立が難しい現状では上記の T c Rの免疫抑制剤と して の開発はきわめて困難である。
一方、 抗原由来のア ミ ノ酸配列をもったぺブチ ドを用いて免疫寛容を誘導する '例も報告されている（Greenstein, et al., Proc. Natl . Acad. Sci . USA, vol.9 0, pp7608-7612, 1993 )。 T c Rのペプチ ド断片からなる免疫抑制剤と しては、 T c Rベータ鎖由来ポリペプチ ド （最小でも 1 3残基のアミ ノ酸からなる） を自己 免疫疾患、 特に慢性関節リ ウマチの治療に使用する方法 （特表平 6— 5 1 1 2 4 1号） 、 多発性硬化症を引き起こす病因 T細胞の T c Rペプチ ド断片を投与し、 E A Eの発症を抑制する方法 （WO 9 0 / 1 1 2 9 4 ) が開示されている。 さ ら にモハパ トラ らは抑制 T細胞由来の T c Rの特異的抗原認識部位である CD R 3 ( Complementarity Determining Region)を含む 15残基のァ ミ ノ酸からなる合成べ ブチ ドが免疫抑制作用を有するこ とを証明した（J. Immunol., vol.151, pp688-6 98, 1993)。
しかし、 いずれのぺブチ ド断片においても抗原特異的であるこ とを特徴とする 免疫抑制剤の域を越えないため、 全ての自己免疫疾患の治療に使用不可能である 問題点を残している。 発明の概.略 本発明の目的は上に示したような従来法の不利益ないしは欠点を克服し、 抗原 が解明されていない自己免疫疾患の治療にも使用できる抗原非特異的に免疫抑制 効果を有するこ とを特徴とする自己免疫疾患治療剤を提供するこ とにある。
また、 本発明の目的は炎症を併発した自己免疫疾患の治療にも使用できるこ と を特徴とする 自己免疫疾患治療剤を提供する こ とにある。
さ らに本発明の目的は従来法に比べて低分子ペプチ ドであるこ とを特徴とする ため、 安価に製造でき、 かつ、 頻回投与における抗原性発生等の副作用が大幅に 低減されるペプチ ド及びその誘導体を提供するこ とにある。
本発明者らは抑制 T細胞由来の T c Rの C D R 3などの蛋白質やそのペプチ ド 断片などのァ ミ ノ酸配列と 自己免疫疾患治療剤との相関関係について鋭意検討し ていたところ、 ある種のペプチ ドの中に抗原非特異的に I g G産生抑制活性を有 するものが存在するこ とを見い出した。 本発明者らは配列表配列番号 1 に示され る 9残基のァ ミ ノ酸からなるペプチ ドが抗卵白アルブミ ン （Ovalbumi n ： 〇 V A ) 抗体産生のみならず抗キーホールリ ンペッ トへモシァニン （Keyho l e Lympet Hem ocyanin ( K L H ) ) 抗体産生をもイ ンビポ （in vi vo ) で抑制することを見い出 し、 本発明を完成した。 尚、 0 V A及び K L Hは免疫抗原と して使われる代表的 な抗原である （免疫学事典， 1993 , 東京化学同人， 第 1 0 1 頁及び第 1 3 0頁） 。 通常は抑制 T細胞の T c Rは多種の抗原に対し、 一対一で特異的に対応する。 本 発明のペプチ ドは O V Aおよび K L Hの如く 異なる抗原に対する抗体産生を抑制 するこ とによ り、 抗原非特異的であるこ とを特徴とする免疫抑制活性を有する。 さ らに、 配列表配列番号 1 に示された 9残基のアミ ノ酸からなるペプチ ドが T 細胞の関与する自己免疫疾患の一つである多発性硬化症モデルである実験的脳脊 髄炎 （ E A E ) の発症を抑制するこ とを見い出した。 さ らに、 驚くべき事に配列 表配列番号 1 に示された 9残基のァ ミ ノ g変からなるぺブチ ドがカラ ゲニ ン誘発足 浮腫モデルにおいて浮腫を抑制し抗炎症作用を冇するこ とも見いだ した。 本発明 のぺブチ ドは T細胞の活性を抑制し、 抗炎症作用を併せ持つ免疫抑制活性を有す る。
さ らに、 本発明者らは抗原性のよ り少なく しかも合成が容易である低分子べブ チ ドの開発に鋭意努力 し、 配列表配列番号 2 に示される 8残基のァ ミ ノ酸からな るぺブチ ドが抗 O V A抗体産生のみならず抗 K L H産生をもィ ン ビポで抑制する こ とを見出した。 さ らに、 本発明者らはある種の普遍的なア ミ ノ酸配列を有する ペプチ ドの中に抗原非特異的に I g G産生抑制活性を有するものが存在する事を ァラニン置換法（Geysen H. M. , et al. , ( 1987), J. Immunol, methods, 102;25 9-274)によ り見いだ した。 本発明者らはこれら普遍的なァ ミ ノ酸残基を有するぺ プチ ドが抗卵白アルブミ ン （O VA) のみならず抗キ一ホールリ ンペッ トへモシ ァニン (Keyhole Lympet Hemocyanin( K L H )) 抗体産生をもイ ンビボ (in vivo) で抑制するこ とを見い出し、 本発明を完成した。
したがって、 本発明は次式で示されるア ミ ノ酸配列、
Ala-Xaal-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n
(式中、 Xaal、 Xaa4はそれそれ独立してヒ ドロキシ基、 アミ ノ基又はグァニジル 基で置換されてもよい、 アルキル又はへテロアルキル側鎖を有 してもよいア ミ ノ 酸残基であり、
Xaa2、 Xaa6はそれそれ独立してヒ ド πιキシ基で置換されてもよい、 アルキル又 はへテロアルキル側鎖を有 してもよいアミ ノ酸残基であり、
Xaa3、 Xaa5はそれそれ独立して疎水性の側鎖を有してもよいア ミ ノ酸残基であ り、
n は 1又は 0である。 ）
を有するペプチ ドまたはその誘導体、 それらを含有 してなる医薬組成物、 及び、 それらを用いた疾患の治療方法などに関する。
[^面の簡単な説明
図 1は、 ペプチ ド （ I ) のク ロマ ト グラムのチャー トを示した図である。 得ら れたペプチ ド （ I ) の純度は 1 0 0 %であった。
図 2は、 ペプチ ド （ I I ) のクロマ トグラムのチャー トを示した図である。 得 られたペプチ ド （ I I ) の純度は 9 9. 6 %であった。
図 3は、 ペプチ ド （ I I I ) のク ロマ トグラムのチャー ト を示した図である。 得られたペプチ ド （ I I I ) の純度は 9 8. 8 %であった。
図 4は、 ペプチ ド （ I V ) のクロマ ト グラムのチャー ト を示 した図である。 ί られたペプチ ド （ I V) の純度は 9 7 . 2 %であった。
図 5は、 ペプチ ド （V) のク ロマ ト グラムのチャー トを示した図である。 得ら れたペプチ ド （ V ) の純度は 9 8. 5 %であった。
図 6は、 ペプチ ド （V I ) のクロマ ト グラムのチャー トを示した図である。 得 られたペプチ ド （V I ) の純度は 9 8. 4 %であった。
図 7は、 ペプチ ド （V I I ) のクロマ ト グラムのチャー トを示した図である。 得られたペプチ ド （ V I I ) の純度は 9 7. 9 %であった。
図 8は、 ペプチ ド （V I I I ) のクロマ ト グラムのチャー トを示した図である。 得られたぺブチ ド （V I I I ) の純度は 9 8. 1 %であった。
図 9は、 ペプチ ド （ I X) のクロマ ト グラムのチャー トを示した図である。 得 られたペプチ ド （ I X) の純度は 9 7. 5 %であった。
図 1 0は、 ペプチ ド （X) のクロマ トグラムのチャー トを示した図である。 得 られたペプチ ド （X) の純度は 9 8. 2 %であった。
図 1 1は、 ペプチ ド （X I ) のク ロマ ト グラムのチャー ト を示した図である。 得られたペプチ ド （X I ) の純度は 9 7. 6 %であった。
図 1 2は、 ペプチ ド （X I I ) のクロマ ト グラムのチャー トを示した図である。 得られたペプチ ド （ X I I ) の純度は 9 7. 5 %であった。
図 1 3は、 ペプチ ド （X I I I ) のクロマ ト グラムのチャー トを示した図であ る。 得られたペプチ ド （ X I I I ) の純度は 9 8. 2 %であった。
図 1 4は、 ペプチ ド （X I V) のクロマ ト グラムのチャー トを示 した図である c 得られたペプチ ド （X I V) の純度は 9 8. 6 %であった。
図 1 5は、 ペプチ ド （X V) のクロマ ト グラムのチャー ト を示した図である。 得られたペプチ ド （X V) の純度は 1 0 0 %であった。 発明の開示
本発明は次式で示されるア ミ ノ酸配列、
Al -Xaal-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n
(式中、 Xaal、 Xaa4はそれそれ独立してヒ ドロキシ基、 ア ミ ノ基又はグァニジル 基で置換されてもよい、 アルキル又はへテロアルキル側鎖を有 してもよいア ミ ノ
Βδ残基であり、
Xaa2、 Xaa6はそれぞれ独立してヒ ドロキシ基で置換されてもよい、 アルキル又 はへテロアルキル側鎖を有 してもよいア ミ ノ酸残基であり、 Xaa3、 Xaa5はそれそれ独立して疎水性の側鎖を有してもよいア ミ ノ酸残基であ 、
n は 1又は 0である。 ）
を有するペプチ ドまたはその誘導体に関する。
XaaK Xaa4はそれそれ独立してヒ ドロキシ基、 アミ ノ基又はグァニジル基で置 換されてもよい、 アルキル又はへテロアルキル側鎖を有してもよいア ミ ノ酸残基 であ り、 例えば、 Lys、 Arg、 His又は Alaのいずれであってもよい。
Xaa2、 Xaa6はそれそれ独立してヒ ドロキシ基で置換されてもよい、 アルキル又 はへテロアルキル側鎖を有 してもよいア ミ ノ酸残基であり、 例えば、 Thr又は Alaのいずれあってもよい。
Xaa3、 Xaa5はそれそれ独立して疎水性の側鎖を有してもよいア ミ ノ酸残基であ り、 例えば、 Gly又は Alaのいずれであってもよい。
ここに、 本発明における 「アルキル j の用語は 1〜 1 5、 好ま し くは 1〜 1 0 の炭素原子を有する直鎖又は分鎖した第一、 第二または第三級の飽和アルキル基 を含む基を意味する。 また、 「ヘテロアルキル」 の用語は 1〜 1 5、 好ま しくは 1〜 1 0の炭素原子を有する前記 「アルキル」 基のうちの 1又は 2以上の炭素原 子が硫黄原子 （ S ) 、 酸素原子 （ 0 ) などのへテロ原子で置き換えられた （通常 は （チォ） エステルまたは （チォ） エーテルの形態で） 基を意味する。
n は 1又は 0である。
本発明のぺブチ ド誘導体と しては、 ア ミ ノ酸の全部又は一部が D体となってい てもよいし、 ペプチ ド中の活性水素を有する官能基が適当な保護基で置換されて いてもよいし、 ペプチ ドの C末端の力ルポキシル基がア ミ ド、 エステルなどの力 ルポキン誘導体となっていてもよいものを挙げるこ とができる。 ぺブチ ド中のァ ミ ノ基やカルボキシル基に置換する適当な保護基と しては、 ぺブチ ド化学におい て通常使用されるものであれば特に制限はないが、 ァセチル基 （A c ) や t ーブ トキシカルボニル基 （ t B o c ) などが好ま しい。 また、 C末端のカルボキシ誘 導体と してはア ミ ドが好ま しい。
ペプチ ド誘導休にするこ とによ り、 安定化の改菩を図るこ ともできる。
詳細には、 本発明は、 以下のア ミ ノ酸配列、
Ala-Xaal-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6 )n (式中、 Xaal、 Xaa4はそれそれ独立して Lys、 Arg、 His又は Alaのいずれかで あ り、
Xaa2、 Xaa6はそれそれ独立して Thr又は Alaであり、
Xaa3、 Xaa5はそれそれ独立して Gly又は Alaであ り、
n は 1又は 0である。 ）
を有するペプチ ドまたはその誘導体に関する。
よ り詳細には、 本発明は、 以下のアミ ノ酸配列、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr,
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gl -Lys-Gl ,
Ala-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly- Lys- Gly、
Ala-Lys-Leu-Ala-Phe-Gl -Lys-Gl ,
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-Gl ,
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Glys 及び、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala
からなる群から選ばれるいずれかひとつのァ ミ ノ酸配列を有するべブチ ドまたは その誘導体に関する。
さ らに詳細には、 本発明は次式 （ I ) 〜 （ X I I ) 、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gl -Lys-Gly-Thr ( I ) ゝ
DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr (II)
Ac-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr (in) tBoc-Al -Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr ( ιν) 、
Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr (V) 、 Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr-NH2
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly
Ala-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly ( VI 11 )、
Ala-Lys-Leu-Ala-Phe-Gl y-Lys-Gl ( IX)、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-Gl (χ)、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gl (XI )、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gl -Lys-Ala (XII) (式中、 Dは D体であるこ とを、 A cはァセチル基を、 t B o cは tーブト キ シカルポ二ル基を示す。 ）
からなる群から選ばれるいずれかひとつのペプチ ド又はその誘導体に関する。 本発明の次式で示されるアミ ノ酸配列、
Ala-Xaal-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n
(式中、 Xaal、 Xaa4はそれそれ独立してヒ ドロキジ基、 ア ミ ノ基又はグァニジル 基で置換されてもよい、 アルキル又はへテロアルキル側鎖を有 してもよいア ミ ノ 酸残基であり、
Xaa2、 Xaa6はそれぞれ独立してヒ ドロキシ基で置換されてもよい、 アルキル又 はへテロアルキル側鎖を有 してもよいア ミ ノ酸残基であ り、
Xaa3、 Xaa5はそれそれ独立して疎水性の側鎖を有してもよいア ミ ノ酸残基であ り、
n は 1 又は 0である。 ）
を有するペプチ ド又はその誘導体の製造法は特に制限はないが、 例えば、 ぺブチ ド合成機を用い通常の合成方法に従って固相合成法（Fmoc)によ り合成し、 逆相 H P L Cカラムによ り精製するこ とができる。 ペプチ ド （II) 〜 （XII) もペプチ ド 合成機を用い合成するこ とができ、 必要に応じてそれらを化学的に変換するこ と ができる。
本発明のペプチ ドの物理化学的性質は可溶性であるこ とが好ま しい。 さ らに本 発明のペプチ ドは低分子ペプチ ドであるこ とを特徴とするため頻回投与における 抗原性発生等の副作用が大幅に低減される上それ自身の毒性は少ない。
また、 本発明は次式で示されるア ミ ノ酸配列、
Ala-Xaal-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n
(式中、 Xaal、 Xaa4はそれそれ独立 してヒ ドロキシ基、 アミ ノ基又はグァニジル 基で置換されてもよい、 アルキル又はへテロアルキル側鎖を有 してもよいア ミ ノ 酸残基であり、
Xaa2、 Xaa6はそれそれ独立してヒ ドロキシ基で置換されてもよい、 アルキル又 はへテロアルキル側鎖を有 してもよいア ミ ノ酸残基であ り、
Xaa3、 Xaa5はそれそれ独立して疎水性の側鎖を有してもよいア ミ ノ眩残基であ ゥ、
n は 1 又は 0である。 ） を有するペプチ ド又はその誘導体を含有 してなる医薬組成物、 又は、 当該ぺブチ ド又はその誘導体、 及び、 製薬上許容される担体とからなる医薬組成物に関する。 詳細には、 本発明は、 以下のアミ ノ酸配列、
Ala-Xaal-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n
(式中、 Xaal、 Xaa4はそれそれ独立して Lys、 Arg、 His又は Alaのいずれかで あり、
Xaa2、 Xaa6はそれそれ独立して Thr又は Alaであ り、
Xaa3、 Xaa5はそれそれ独立して Gly又は Alaであ り、
n は 1又は 0である。 ）
を有するぺブチ ドまたはその誘導体に関する。
よ り詳細には、 本発明は、 以下のア ミ ノ酸配列、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr,
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly,
Ala-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly,
Ala- Lys-Leu- Ala-Phe-Gly- Lys-Gly、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-Gly,
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gl , 及び、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala
からなる群から選ばれるいずれかひとつのア ミ ノ酸配列を有するペプチ ドまたは その誘導体を含有してなる医薬組成物、 又は、 当該ペプチ ド又はその誘導体、 及 び、 製薬上許容される担体とからなる医薬組成物に関する。
さ らに詳細には、 本発明は次式 （ I ) 〜 （X I I ) 、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr ( I ) 、
DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gl -DLys-Gly-DThr (Π) 、
Ac-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr
tBoc-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr
Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr (V ) 、
Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gl -DLys-Gly-DThr-NH: (VI) 、 Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly (VU )、
Ala- Ala-Leu- Thr- Phe-Gly-Lys- Gly (VIII), Ala-Lys-Leu-Ala-Phe-Gly-Lys-Gly (IX), Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-Gl (X)、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gly (XI )、
Ala-Lys- Leu-Thr- Phe-Giy- Lys- Ala (XII) (式中、 Dは D体であるこ とを、 A cはァセチル基を、 t B o cは t ーブトキ シカルポ二ル基を示す。 ）
からなる群から選ばれるいずれかひとつのペプチ ド又はその誘導体を含有してな る医薬組成物、 又は、 当該ペプチ ド又はその誘導体、 及び、 製薬上許容される担 体とからなる医薬組成物に関する。 本発明の医薬組成物に用いられるペプチ ドの誘導体と しては、 ア ミ ノ酸の全部 又は一部が D体となっていてもよい し、 ペプチ ド中の活性水素を有する官能基が 適当な保護基で置換されていてもよいし、 ペプチ ドの C末端の力ルポキシル基が アミ ド、 エステルなどのカルボキシ誘導体となっていてもよい。 ペプチ ド中のァ ミ ノ基や力ルポキシル基に置換する適当な保護基と しては、 ぺブチ ド化学におい て通常使用されるものであれば特に制限はないが、 ァセチル基 （A c ) や t ーブ トキシカルポニル基 （ t B o c ) などが好ま しい。 また、 C末端の力ルポキン誘 導体と してはアミ ドが好ま しい。 本発明のペプチ ドをその誘導体とするこ とによ り、 安定化の改善を図るこ とができる。 本発明の前記した医薬組成物は、 特に、 自己免疫疾患の治療に有用である。 し たがって、 本発明は自己免疫疾患の治療用の医薬組成物を提供するものでもある, 本発明の自己免疫疾患治療用医薬組成物は抗原非特異性であるこ とを特徴とす る。 さ らに本発明のぺブチ ド又はその誘導体は T細胞の活性を抑制するこ とから. 本発明は前記したペプチ ド又はその誘導体からなる多発性硬化症、 慢性関節リ ウ マチ、 全身性エリテマ トーデス、 シ エ ーグレ ン症候群、 バセ ドウ氏病、 橋本病、 及び、 自己免疫性溶血性貧血からなる群から選ばれる 1種又は 2種以上の疾患の 治療用医薬組成物剤にも関する。
また、 本発明の前記した医薬組成物は、 臓器移植に伴う拒絶反応の予防 . 治療 に有用である。 したがって、 本発明は脇器移植に伴う拒絶反応の予防 . 治療用の 医薬組成物を提供するものでもある。
さ らに、 本発明の前記した医薬組成物は、 抗炎症作用を有し、 抗炎症剤と して も有用である。 したがって、 本発明は炎症の治療用の医薬組成物を提供するもの でもある。
本発明は、 前記したペプチ ド又はその誘導体を治療上、 有効な量を投与してな る自己免疫疾患の治療方法にも関する。 本発明は、 前記したペプチ ド又はその誘 導体を治療上、 有効な量を投与してなる多発性硬化症、 慢性関節リ ウマチ、 全身 性エリテマ トーデス、 シヱーグレ ン症候群、 バセ ドウ氏病、 橋本病、 及び、 自己 免疫性溶血性貧血からなる群から選ばれる 1種又は 2種以上の疾患の治療方法に も関する。
また、 本発明は、 前記したペプチ ド又はその誘導体を治療上、 有効な量を投与 してなる臓器移植に伴う拒絶反応の予防 · 治療方法にも関する。
さらに、 本発明の前記したペプチ ド又はその誘導体を治療上、 有効な量を投与 してなる炎症の治療方法にも関する。
本発明は、 前記したペプチ ド又はその誘導体を、 自己免疫疾患用の医薬組成物 の製造のための使用にも関する。 本発明は、 前記したペプチ ド又はその誘導体を、 多発性硬化症、 慢性関節リ ウマチ、 全身性エリテマ トーデス、 シヱ一グレ ン症候 群、 パセ ドウ氏病、 橋本病、 及び、 自己免疫性溶血性貧血からなる群から選ばれ る 1種又は 2種以上の疾患の治療用医薬組成物の製造のための使用にも関する。 また、 本発明は、 前記したペプチ ド又はその誘導体を、 臓器移植に伴う拒絶反 応の予防 · 治療用医薬組成物の製造のための使用にも関する。
さ らに、 本発明の前記したペプチ ド又はその誘導体を、 炎症の治療用医薬組成 物の製造のための使用にも関する。 本発明のペプチ ドの臨床における成人 1 日当た りの投与量は、 投与法、 患者の 年齢、 体重、 症状等によって異なる力 通常は 0 . 0 5 ~ 5 0 0 m g、 好ま し く は 0 . l 〜 1 0 0 m g、 の範囲である。
投与方法と しては、 静脈内投与が可能であ り、 通常の静脈内注射の他、 点滴静 注が可能である。
注射用製剤と しては、 例えば注射用粉末製剤とするこ とが出来る。 その場合は 適当な水溶性賦形剤例えばマンニ トール、 シ ョ糖、 乳糖、 マル トース、 ブドウ糖、 フルク ト一ス糖の 1種又は 2種以上を加えて水で溶解し、 パイアル又はアンブル に分注した後、 凍結乾燥し、 密封して製剤とすることができる。 その他にも全身 性投与と して、 微粒子のエアロゾル製剤と して、 経鼻または絰肺的に投与するこ とができる。 また適当な賦形剤等を添加するこ とによ り、 経口投与も可能である ( 本発明ではマウスにおける抗 0 V A抗体産生抑制効果および抗 K L H抗体産生 抑制効果を E L I S A法を用いて測定した。 抗 O V A抗体産生抑制効果を無投与 処理群と比較する と、 本発明のベプチ ドは極めて抗体産生抑制活性が高かった。 C D R 3のア ミ ノ酸 1 5残基からなるべプチ ド断片と比較しても、 本発明のぺブ チ ドは、 明らかに抗体産生抑制活性が高かった。 また、 抗 K L H抗体産生抑制効 果を無投与処理群と比較すると、 明らかに抗体産生抑制活性が高かった。
さ らに、 マウスにおける実験的脳脊髄炎 （ E A E ) の発症の抑制効果を測定し た。 E A E発症抑制効果を無投与群と比較すると有意に抑制効果を示した。 さ ら に、 ラ ッ トにおける力ラゲニン誘発足浮腫モデルにおける浮腫抑制効果を測定し た。 浮腫抑制効果は無投与群と比較する と極めて高かった。
このように、 T c Rアルファ鎖 J領域由来の低分子で合成も可能なペプチ ドが 抗原非特異的に免疫抑制作用を有するこ とは今まで報告されておらず、 本発明の ペプチ ド又はその誘導体は、 自己免疫疾患治療剤、 特に、 多発性硬化症、 慢性関 節リ ウマチ、 全身性エ リテマ トーデス、 シヱーグレ ン症候群、 バセ ドウ氏病、 橋 本病、 及び、 自己免疫性溶血性貧血からなる群から選ばれる 1 種又は 2種以上の 疾患の治療用医薬組成物と して と して有効である。 さ らには、 抗炎症作用を兼ね そなえることによ り、 自己免疫疾患のうち特に、 慢性関節リ ウマチ等炎症作用を 伴う 自己免疫疾患治療剤と して有用である。 更に抗体産生抑制作用を有するこ と から本ペプチ ドは I g Eが関与する I型アレルギー ： 例えば、 花粉症、 ア ト ビー 性皮膚炎、 喘息、 アナフィ ラキシーショ ック、 枯草熱または薬物アレルギー等の 予防 · 治療剤と しても有用である。 以下に実施例によ り、 本発明を詳述する。 なお、 本発明はこれらの実施例によ り限定されるものではない。 実施例 1 ペプチ ドの製造
ペプチ ド （ I ) の製造
ペプチ ド合成機（Applied Biosystems Inc. , Model 430Α)を用いて固相合成法（ F moc)にてペプチ ド （ I ) を製造した。
N-末端が 9 -フルォレニルメチルォキシカルボニル （ 9-fluorenylinethyloxy carbonyl(Fmoc)) 基で保護されたァ ミ ノ酸を用い、 以下の方法によ り p—ヒ ドロ キシメチ レフ エノ キシメチ 1レポリスチレ ン ( -hydroxyme thy lphenoxyme thy 1 poly styrene(HMP)) レジン上にカツプリ ングした。
最初に 2 0 %ビぺリ ジン /N—メチルビ口 リ ド ン （Niethylpyrrolidone(NMP)) を用いて、 3 0分間、 室温にてレジン上のア ミ ノ酸の脱保護を行った。 次に NM P、 5 0 %ジクロ ロメ タン （Dichloromethane(DCM)) /メタ ノールを用い、 それ それ 2回洗浄を行った。 洗浄後、 5 0 % o—べンゾ ト リアゾール— 1 ーィルー N, N, N ' ， N ' ーテ ト ラメチルゥロニゥムへキサフルオローホスフェー ト （0- be nzotriazol-l-yl-Ν,Ν,Ν' ,Ν' -tetrameth luroniumhexaf luoro-phosphate(HBTU; J /D CMに希釈したペプチ ドを加え、 6 0〜 1 2 0分、 室温にてカップリ ング反 応を行った。 このステップを繰り返し、 全てのア ミ ノ酸のカ ツプリ ング反応終了 後、 5 0 % H B T U/D C Mを用いて、 N末端の Fmoc基を除去した後、 9 5 %ト リ フルォロ齚酸 (trif luoroacetic acid(TFA)) を用いてレジンから遊離のぺブチ ドを回収した。 回収されたペプチ ドを 5 %酢酸溶液に希釈し、 逆相 H P L C法に て精製した。 ペプチ ド （ 1 1 ) 、 （ 1 1 1 ) 、 （ I V ) 、 （V) 及び （V I ) の製造
ペプチ ド合成機（Beckman 990c peptide synthesizer)を用いて固相合成法（tBo c)にてペプチ ド （ 1 1 )、 （ 1 1 1 )、 （ I V )、 （V ) 及び （ V I ) を製造した。
N -末端が t一ブチルォキシカルボニル （ tBoc ) 基で保護されたアミ ノ酸を用 い、 以下の方法によ り レジン上にカ ップリ ングした。 尚、 C末端がカルボキシル 基のペプチ ドの合成には、 フエ二ルァセタ ミ ドメチル （phenyiacetamidomethyl ( Pam ) ) レジン、 C末端がア ミ ド基のペプチ ドの合成には 4—メチルベンズヒ ド リ レァ ミ ン (4-methylbenzhydryl amine (MBHA)) レ ジ ンを用！^た。
最初に 5 0 % T F A/D CMを用いて、 2 5分問、 室温にて レ ジ ン上のア ミ ノ 酸の脱保護を行った。 次にイ ソブロパノ ール、 D I P E A、 D CMを用い、 それ それ 2回洗浄を行った。 洗浄後、 5 0 %DM F/D CMに希釈したペプチ ドを加 え、 6 0 ~ 1 2 0分、 室温にてカップリ ング反応を行った。 このステップを繰り 返し、 全てのアミ ノ酸のカ ップリ ング反応を終了させた。 ペプチ ド （ I V) につ レ、ては H F法 (J.M.Stewart et al . , Pierce chemical Co. Rockf ord, Illinois,
1984) にてレジンから遊離のペプチ ドを回収し、 5 %齚酸溶液で希釈し、 逆相 H P L C法にて精製した。 ペプチ ド （ I I ) については、 5 0 % T F A/D CMを 用いて N末端の t B 0 c基を除去後、 H F法にて遊離のペプチ ドを回収し、 5 % 酢酸溶液で希釈後、 逆相 H P L C法にて精製した。 また、 ペプチ ド （ 1 1 1 ) 、
(V) 及び （V I ) については、 2 0 %無水酢酸 （Acetic anhydride) を用いて N末端ヘアセチル基 （A c ) を付加した後、 H F法にて遊離のペプチ ドを回収し、
5 %酢酸溶液で希釈後、 逆相 H P L C法にて精製した。 製造されたペプチ ドの純度の検定
製造されたペプチ ドについて C一 1 8カラム （V y d a c社） を用いて逆相 H P L C法にて純度を検定した。 移動相と してァセ トニ ト リル /精製水 5 %から 2 5 %のリニアグラジェン ト を設定し、 2 1 5 nmの吸光度を測定して溶出ビーク を検出した。
ペプチ ド （ I ) のク ロマ トグラムのチャー トを図 1 に示す。 得られたペプチ ド ( I ) の純度は 1 0 0 %であった。
ペプチ ド （ I I ) のクロマ 卜 グラムのチヤ一 卜 を図 2に示す。 得られたぺブチ ド （ I I ) の純度は 9 9. 6 %であった。
ペプチ ド （ I I I ) のクロマ トグラムのチャー トを図 3に示す。 得られたぺブ チ ド （ I I I ) の純度は 9 8. 8 %であった。
ペプチ ド （ I V) のクロマ ト グラムのチャー ト を図 4に示す。 得られたぺブチ ド （ I V ) の純度は 9 7. 2 %であった。
ペプチ ド （V) のクロマ トグラムのチャー ト を図 5に示す。 得られたペプチ ド ( V ) の純度は 9 8. 5 %であった。
ペプチ ド （V I ) のクロマ ト グラムのチャー ト を図 6に示す。 得られたぺブチ ド （V I ) の純度は 9 8. 4 %であった。 実施例 2 ペプチ ド （ I ) を用いたマウスにおける抗 O V A抗体産生抑制効果の 測定
抗原投与 5 日前及び 3 日前に、 本発明の配列表配列番号 1 に示される 9残基の アミ ノ酸からなるペプチ ド （ I ) 、 前述のモハパ ト ラ らによって報告されたクロ ーン 1 7 . 2 T C R由来のアミ ノ酸 1 5残基からなる合成ペプチ ド 1 5 を各々 1 0 0 / gを 2 0 0 1の生理食塩水に溶解し、 9週齢の Balb/cマウスの皮下に投与 した。 対照と しては生理食塩水を同量投与した群を非投与群と した。 1 0 0 g の〇 V A (Signia社）を 2 0 0 1 の生理食塩水に溶解し、 皮下投与した。 抗原投与 2 1 日後に血液を採取し以下に示した方法にて抗体価を測定した。
〇 V Aを リ ン酸緩衝生理食塩水（PBS)にて 1 0 /ig/mlに希釈し、 9 6穴マイ クロ ブレー トに 5 0 JU 1 ずつ分注し 4 °Cにて 1晚コーティ ング操作を行った。 次に本 マイ クロブレー トを 0 . 0 5 %Tween 2 0 (T-PBS)を含む PBSにて 3回洗浄を行った 後、 各穴に 2 0 0 1 ずつ 0 . 5 %カゼイ ン含有 ト リス緩衡化生理食塩水（カゼィ ン TBS)を分注し、 1時間室温にて放置した。 さらに、 本プレー トを T-PBSにて 3回 洗浄し、 0 . 5 %カゼィ ン TBSにて 2 0 0倍に希釈した前記の採取した血液のマウ ス血清を 5 0 1ずつ各穴に分注し 1時間放置した （ 1次反応） 。
1 次反応終了後、 本プレー トを T-PBSで 3回洗浄した後、 0 . 5 %カゼイ ン TBSで 4 0 0 0倍に希釈した抗マウス I g G—ペルォキシダ一ゼ標識抗体（TAG0社） を各 六に 5 0 1 ずつ分注し、 室温にて 1時間反応させた （ 2次反応） 。 2次反応終 了後、 再度 3 回の洗浄を行い、 基質液/発色剤 （クロモゲンサブス ト レー ト ： Be hringwerke社） を各穴に 5 0 1ずつ分注し、 室温にて 3 0分反応させた。 反応 終了後 0 . 5 N希硫酸にて反応を停止させ、 比色計（BEP-II ： Behringwerke社/ ド イ ツ） にて 6 5 O n mを対照と して 4 5 O n mの吸光度を測定した。 この結果を 表 1 に示す。 表 1 本発明のペプチ ド （ I ) のマウスにおける
抗〇 V A抗体産生抑制効果
Figure imgf000019_0001
ク ローン 17.2由来合成ペプチ ド 1 5及び本発明のペプチ ド （ I ) を投与したマ ウスでは、 非投与群に較べ明らかに抗体産生が抑制された。 なお、 1群を 8匹と してこの試験を行った。 実施例 3 ペプチ ド （ I ) 〜 （VI) のマウスにおける抗 K L H抗体産生抑制効果 の測定
抗原投与 5 日前及び 3 日前に、 1 0 0 >u gの配列表配列番号 1 のア ミ ノ酸 9残 基からなる本発明のペプチ ド （ I ) 〜 （VI) 各々を 2 0 0 〃 1 の生理食塩水に溶 解し、 9週齢の Balb/cマウスの皮下に投与した。 対照と しては生理食塩水を同量 投与した群を非投与群と した。 抗原と して 2 5 gの K L Hを 2 0 0 1の生理 食塩水に溶解し、 皮下投与した。 抗原投与 2 1 日後に血液を採取し、 以下に示し た方法にて抗体価を測定した。
K L Hを リ ン酸緩衝生理食塩水（PBS)にて 1 0 g /m l に希釈し、 9 6穴マイ クロブレー ト に 5 O Iずつ分注し 4 °Cにて 1晚放置 した。 次に本マイ ク ロブレ — ト を 0 . 0 5 %Tween 2 0 を含む PBS(T-PBS)にて 3回洗浄を行った後、 各穴に 2 0 0 1 ずつ 0 . 5 %カゼイ ン ト リ ス緩衡化生理食塩水（カゼイ ン TBS)を分注し、 1時間室温にて放置した。 さ らに、 本プレー トを T-PBS で 3 回洗浄しカゼイ ン TB Sにて 2 0 0倍に希釈した前記で採取した血液のマウス血清を 5 0 j 1 ずつ分注し 1時間反応させた （ 1次反応） 。
本ブレー ト を T-PBSで 3回洗浄後、 カゼィ ン TBSで 4 0 0 0倍に希釈した抗マウ ス I g G—ペルォキシダ一ゼ標識抗体（TAG0社） を各穴に 5 0〃 1ずつ分注し、 室 温にて 1時間反応させた （ 2次反応） 。 2次反応終了後、 再度 3回の洗浄を行い、 基質液/発色剤 （クロモゲンサブス ト レー ト ： Behringwerke社） を各穴に 5 0 n 1ずつ分注し、 室温にて 3 0分反応させた。 反応終了後 0.5 N希硫酸にて反応を 停止させて、 比色計（BEP-II ： Behringwerke社/ ドイ ツ） にて 6 5 0 n mを対照 と して 4 5 Onmの吸光度を測定した。 この結果を表 2に示す。 表 2 本発明のペプチ ドの抗 K L H抗体産生に対する抑制効果
Figure imgf000020_0001
本発明のペプチ ド （ I ) 〜 （VI) を投与した群は、 生理食塩水を投与した非投 与群に較べ明らかに抗体産生が抑制された。 なお、 1群を 8匹と してこの試験を 行った。
実施例 2および実施例 3の結果から本発明のぺブチ ドは抗原非特異的な免疫抑 制作用をもつこ とがわかった。 実施例 4 ペプチ ド （ I ) の E A Eモデルマウスにおける発症抑制効果 抗原と して、 モルモ ッ ト脊髄ホモジネー ト を用いた。 モルモ ッ ト脊髄ホモジネ
— トを 6. 6 mg/mlになるよう P B Sで希釈したのち等量のフロイ ン ト完全アジュ バン トを加え、 超音波破砕機を用いェマルジヨ ンを作った。 このェマルジヨ ンを 側腹皮下の 2点に計 3 0 0 1投与した。 抗原投与 5 日前、 3 日前及び抗原投与後. 週 5日、 4週間ペプチ ド （ I ) を 1 0 0〃1の生理食塩水に溶解し、 1 4週齢の S J Lマウスの皮下に投与した。 尚、 発症率を上げるため、 抗原投与当日及び 2 日 後、 ェンハンサーと して百日咳毒素 （P T X) 4 0 0〃g/ 1 0 0 ^1を静脈内投与 した。 観察は初回免疫 1 4日後から 2 8日後まで行い、 以下に示す基準でスコア 化を行った （Pettinelli, C. B. , Fritz, D. E. , and McFarlin, D. E. J. Immu nl. ( 1982) 129 No.3, 1024-1028) 。 表 3に初回免疫 2 2日後、 2 5 日後及び 2
8日後の、 各投与群における平均スコア ±標準偏差 （ S D ) を示す。 尚、 実験は
1群を 8匹と して行い、 統計解析は Steelの 2 tail法を用いた。
スコア 0 ： 異常な し
スコア 1 ： 尾の衰弱を伴う軽い後肢の麻痺
スコア 2 ： 尾の衰弱を伴う中程度の後肢の麻痺
スコア 3 ： 後肢の完全な麻痺
スコア 4 ： 後肢の完全な麻痺を伴う前肢の軽い麻痺
スコア 5 ： 四肢の完全な麻痺
スコア 6 ： 麻痺による死亡
この結果を表 3に示す。
表 3 本発明のペプチ ド （ I ) の E A Eモデルマウス
における発症抑制効果 （平均スコア土 S D )
Figure imgf000022_0001
本発明の合成ペプチ ド （ I ) の投与によ り、 E A E発症の抑制が認められた。 特に 5〃 g/body投与群では、 2 5 日及び 2 8 日で生理食塩液投与群と比較して有 意水準 5 %で発症が抑制された。 さ らに、 2 5 g/body投与群では、 2 2 日目以 降生理食塩液投与群と比較して有意水準 5 %で抑制が認められ、 また、 2 5 日目 よ り有意水準 1 %で発症の抑制が認められた。
実施例 4よ り、 本発明のぺブチ ドは多発性硬化症に対する治療効果を有するこ とがわかった。 実施例 5 ペプチ ド （ I ) のラ ッ トカラゲニン誘発足浮腫モデルにおける浮腫抑 制効果
人-力ラゲニン （PICNIN- A、 逗子化学研究所製） を生理食塩水に 1 w/v%になる ように加え、 沸騰水浴中で加温して完全に溶解後、 室温に放置した。 試験開始前 に、 沸騰水浴中で加温して完全に溶解後、 投与時まで、 約 6 0 °Cの湯浴中に加温 放置した。 本発明のペプチ ド （ I ) 、 も し く は生理食塩液 （無投^群） 5 0 1を Splague-Dawley系ラ ッ ト （ 6週齢、 雄性） の^足摭皮下に投与後、 直ちに、 同一 部位に 1 %力ラゲニン溶液 5 0 1を投与 した。 以後、 投与 5時閣後まで、 1時間 ごとに足容積をラ ッ ト用足容積測定装置 （ビーェム機器社製） を月いて測定した。 尚、 実験は 1群を 1 0匹と して行い、 統計解析には Dunnetの 2 taii法を用いた。 二の結果を表 4 に示す, 表 4 本発明のペプチ ド （ I ) の浮腫抑制効果 （％)
Figure imgf000023_0001
本発明のペプチ ド （ I ) の投与によ り、 力ラゲニン投与 1 時間後の浮腫発生に 対する抑制傾向が認められた。 また、 1 0 〃g/site投与群では、 力ラゲニン投与 2時間目以降の浮腫発生が有意水準 5 %で抑制され、 力ラゲニン投与 5時間目で は浮腫発生に抑制傾向が見られた。 以上のこ とから、 本発明のペプチ ドは抗炎症 作用を有する こ とがわかった。
さらに、 本発明者らは有効な低分子ペプチ ドを見出すため、 以下の実験を行つ た。 実施例 6 ペプチ ド合成
ぺブチ ド合成機 （A B I社、 M o d e l 4 3 0 A ) を用いて実施例 1 と同様 な方法によ りペプチ ド （V I I ) 、 （V I I I ) 、 （ I X ) 、 （X ) 、 ( X I ) ( X I 1 ) 、 （X I 1 1 ) 、 （ X I V ) および （ X V ) を合成 ' 精製した。
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly ( V I I )
Ala-Al -Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly ( V I I I )
Ala-Lys-Leu-Ala-Phe-Gly-Lys-Gly ( I X )
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-gly ( X )
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gl (X I )
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala ( X I I )
Ala-Lys-Ala-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly ( X I I I ) Ala-Lys-Leu-Thr-Ala-Gly-Lys-Gly (X I V)
Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly ( V )
製造されたぺブチ ドの純度の検定
合成されたペプチ ドについて実施例 1 と同様の方法で純度を検定した。
ペプチ ド （V I I ) のク ロマ ト グラムのチャー ト を図 7に示す。 得られたぺブチ ド （V I I ) の純度は 9 7. 9 %であった。
ペプチ ド （V I I I ) のク ロマ トグラムのチャー トを図 8に示す。 得られたぺブ チ ド （V I I I ) の純度は 9 8. 1 %であった。
ペプチ ド （ I X) のクロマ トグラムのチヤ一 卜を図 9に示す。 得られたペプチ ド
( I X) の純度は 9 7. 5 %であった。
ペプチ ド （X) のクロマ ト グラムのチャー ト を図 1 0に示す。 得られたペプチ ド
( X ) の純度は 9 8. 2 %であった。
ペプチ ド （X I ) のクロマ トグラムのチャー トを図 1 1に示す。 得られたぺプチ ド （X I ) の純度は 9 7. 6 %であった。
ペプチ ド （X I I ) のクロマ ト グラムのチャー ト を図 1 2に示す。 得られたぺブ チ ド （X I I ) の純度は 9 7. 5 %であった。
ペプチ ド （X I I I ) のクロマ ト グラムのチャー トを図 1 3に示す。 得られたぺ ブチ ド （X I I I ) の純度は 9 8. 2 %であった。
ペプチ ド （X I V) のクロマ ト グラムのチャー ト を図 1 4に示す- 得られたぺブ チ ド （X I V ) の純度は 9 8. 6 %であった。
ペプチ ド （XV) のク ロマ トグラムのチャー トを図 1 5に示す。 得られたぺブチ ド （XV) の純度は 1 0 0 %であった。 実施例 7 ペプチ ド （ I ) 、 （ V I I ) 〜 （ X V ) を用いたマウスにおける抗
K L H抗体産生抑制効果の測定
ペプチ ド （ I ) 、 （V I I ) 〜 （X V ) を用い、 実施例 3 と冋様な方法にてマ ウスにおける抗 K L H抗体産生抑制効果の測定を行った。 この結果を表 5に示す ( 表 5
Figure imgf000025_0001
ペプチ ド （V I I ) 、 （ I X) 、 （X) 、 （X I I ) 、 および （X I I I ) を 投与したマウスでは、 非投与群およびペプチ ド （ I ) に較べ明らかに抗体産生が 抑制された。 また、 ペプチ ド （X I I ) 、 （X I I I ) 、 （X I V ) 、 および ( V) を投与したマウスではペプチ ド （ I ) に較べ抗体産生が抑制されなかつ た。 なお、 1群を 8匹と してこの試験を行った。
以上のことよ り抗体産生を抑制する最小のぺブチ ドは配列表配列番号 2に記載 の 8残基のア ミ ノ酸からなるこ とが判明した。 実施例 8 ペプチ ド （ I ) 、 （V I I ) 〜 （X I V) を用いたマウスにおける 抗 0 V A抗体産生抑制効果と効果を示すぺブチ ドの最小単位と必須アミ ノ酸の同 定。
ペプチ ド （ I ) 、 （V I I ) 〜 ( I V) を用い、 突施例 2 と同様な方法にて マウスにおける抗 O VA抗体産生抑制効果の測定を行った。 この結果を表 6に示 す。 表 6
Figure imgf000026_0001
ペプチ ド （V I I ) 、 ( I X) および （X I ) を投与したマウスでは、 非投与 群およびペプチ ド （ I ) に較べ明らかに抗体産生が抑制された。 また、 ペプチ ド (X I I I ) 及び （X I V) を投与したマウスではペプチ ド （ I ) に較べ抗体産 生が抑制されなかった。 なお、 1群を 8匹と してこの試験を行った。
実施例 7および実施例 8よ り抗原非特異的抗体産生抑制作用を^するペプチ ド を構成するア ミ ノ酸は、 第 1位の Ala、 第 3位の Leu、 第 5位の Pheが抗体産生抑制 に必須であるこ とが判明した。
般情報
(i) 出願人 ： へキス ト ジャパン株式会社
(ii) 発明の名称 ： ペプチ ド及びそれからなる 自己免疫疾患治療剤 (iii) 配列数 ： 7
(iv) 連絡先 ：
(A) 宛名 ： へキス ト ジャパン株式会社
(B) 番地 ： 赤坂 8丁目 1 0番 1 6号
(C) 巿 ： 港区
(D) 州 ： 東京都
(E) 国 ： 日本国
(F) ZIP ： 1 0 7
(v: 現行出願データ
(A) 出願番号 J P
(B) 出願曰 1 9 9 6年 4月 3日
(C) 分類
(vi 優先権主張出願データ
(A) 出願番号 特願平 7 — 1 1 7 5 9 2号
(B) 出願日 1 9 9 5年 4月 7 日
(C) 出願番号 特願平 7 - 3 4 4 6 4 9号
(D) 出願日 1 9 9 5年 1 1 月 2 4 曰
(vii) 代理人/事務所情報
(A) 名前 ： 佐伯 憲生
(B) 登録番号 ： 1 0 2 2 6
(viii) 通信情報
(A) 電話番号 ： 0 3 - 5 6 8 8 - 5 1 3 6
(B) フ ァ ク シ ミ リ番号 ： 0 3 - 5 6 8 8 - 5 1 3 7 ( 2 ) 配列番号 1 の配列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ ： 9
(B) 配列の型 ： アミ ノ酸
(C) 鎖の数 ： 一本鎖
(D) トポロジー ： 直鎖状
(ii) 配列の種類 ： タ ンパク質
( i i i ) 起源 ： なし
(A) 生物名 なし
(B) 株名 な し
(iv) 配列の特徴 ペプチ ド （
： v) 配列 ： SEQ ID N0:1:
Ala - Lys - Leu - Thr - Phe - Gly - Lys - Gly - Thr 1 5 9
( 2 ) 配列番号 2の配列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ 8
(B) 配列の型 アミ ノ酸
(C) 鎖の数 一本鎖
(D) トポロ ジー 直鎖状
(ii) 配列の種類 タ ンノ ク質
(iii ) 起源 な し
(A) 生物名 な し
(B) 株名 な し
(iv) 配列の特徴 ペプチ ド （ V I I )
( V ) 配列 SEQ ID N0:2: Ala - Lys - Leu - Thr - Phe - Gly - Lys - Gly 1 5 8
) 配列番号 3の配列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ 8
(B) 配列の型 ア ミ ノ酸
(C) 鎖の数 一本鎖
(D) トポロジー 直鎖状
(ii ) 配列の種類 タンパク質
(iii ) 起源 な し
(A) 生物名 なし
(B) 株名 な し
(iv) 配列の特徴 ペプチ ド （V I I
(V) 配列 ： SEQ ID N0:3:
Ala - Ala - Leu - Thr - Phe - Gly - Lys - Gly 1 5 8
) 配列番号 4の配列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ 8
(B) 配列の型 ア ミ ノ酸
(C) 鎖の数 一本鎖
(D) トポロジー 直鎖状
(ϋ ) 配列の種類 ： タ ンノ ク K
(iii) 起源 ： な し
(A) 生物名 ： な し (B) 株名 ： な し
(iv) 配列の特徴 ： ペプチ ド （ I X )
(V) 配列 ： SEQ ID NO :4:
Ala - Lys - Leu - Ala - Phe - Gly - Lys - Gly 1 5 8
( 2 ) 配列番号 5の配列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ 8
(B) 配列の型 アミ ノ酸
(C) 鎖の数 一本鎖
(D) トポロジー 直鎖状
(ii) 配列の種類 タンパク質
(iii) 起源 なし
(A) 生物名 なし
(B) 株名 なし
(iv) 配列の特徴 ペプチ ド （ X )
(V: 配列 ： SEQ ID NO :5:
Ala - Lys - Leu - Thr - Phe - Ala - Lys - Gly 1 5 8
( 2 ) 配列番号 6の配列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ 8
(B) 配列の型 ア ミ ノ酸
(C) 鎖の数 一本鎖 (D) トポロジー ： 直鎖状
(ϋ ) 配列の種類 タ ンパク質
(iii) 起源 な し
(A) 生物名 な し
(B) 株名 なし
(iv) 配列の特徴 ペプチ ド （X I
(V) 配列 ： SEQ ID NO :6
Ala - Lys - Leu - Thr - Phe - Gly - Ala - Gly 1 5 8
列番号 7の配列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ 8
(B) 配列の型 アミ ノ酸
(C) 鎖の数 一本鎖
(D) トポロ ジー 直鎖状
(ϋ) 配列の種類 タンパク質
(iii) 起源 な し
(A) 生物名 なし
(B) 株名 なし
(iv) 配列の特徴 ペプチ ド （X
(V) 配列 ： SEQ ID NO :7:
Ala - Lys - Leu - Thr - Phe - Gly - Lys - Ala 1 5 8

Claims

請 求 の 範 囲 . 以下のア ミ ノ酸配列、
Ala-Xaal-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n
(式中、 Xaal、 Xaa4はそれそれ独立してヒ ドロキシ基、 アミ ノ基又はグァニジ ル基で置換されてもよい、 アルキル又はへテロアルキル側鎖を有してもよい ァミ ノ酸残基であ り、
Xaa2、 Xaa6はそれそれ独立してヒ ドロキシ基で置換されてもよい、 アルキ ル又はへテロアルキル側鎖を有してもよいア ミ ノ酸残基であり、
Xaa3、 Xaa5はそれそれ独立して疎水性の側鎖を有してもよいアミ ノ酸残基 であ り、
n は 1又は 0である。 ）
を有するベプチ ド又はその誘導体。
2. n は 1又は 0であ り、
Xaal、 Xaa4はそれそれ独立して Lys、 Arg、 His又は Alaのいずれかであり、 Xaa2、 Xaa6はそれそれ独立して Thr又は Alaであ り、
Xaa3、 Xaa5はそれそれ独立して Gly又は Alaである、
特許請求の範囲第 1項に記載のぺブチ ド又はその誘導体。
3 . 以下のァ ミ ノ酸配列、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gl -Lys-Gl -Thr,
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly
Ala-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly,
Ala-Lys-Leu-Al -Phe-Gl -Lys-Gl ,
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-Gly,
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gly, 及び、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala,
からなる群から選ばれるいずれかひとつのア ミ ノ酸配列を有する特許請求の範 囲第 1から 2項のいずれか 1項に記載のべブチ ド又はその誘導体。
4. ァ ミ ノ酸の一部又は全部が D体である特許請求の範囲第 1 〜 3項のいずれか 1項に記載のぺブチ ド又はその誘導体。
5. N末端のァミ ノ基が保護基で置換されている特許請求の範囲第 1〜 4項のい ずれか 1項に記載のぺブチ ド又はその誘導体。
6. N末端のア ミ ノ基の保護基がァセチル基又は t一ブトキシカルポニル基であ る特許請求の範囲第 5項に記載のぺブチ ド又はその誘導体。
7. C末端の力ルポキシル基がカルポキシ誘導体である特許請求の範囲第 1〜 6 項のいずれか 1項に記載のぺブチ ド又はその誘導体。
8. C末端の力ルポキシル基のカルボキシ誘導体がア ミ ド基である特許請求の 範囲第 7項に記載のぺブチ ド又はその誘導体。
9. 次式 （ I ) 〜 （X I I ) 、
Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr ( I ) 、
DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr (II) 、
Ac-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr (III) 、 tBoc-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr (IV) 、
Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr (V) 、
Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr-NH2 (VI) 、 Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly (VII), Ala-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly (VII I )、
Ala-Lys-Leu-Ala-Phe-Gly-Lys-Gl (IX), Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-Gly (X)、 Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gl (XI )、
Ala- Lys-Leu- Thr- Phe-Gly- Lys-Ala (XII )
(式中、 Dは D体であるこ とを、 A cはァセチル基を、 t B o cは t —ブ ト キシカルポ二ル基を示す。 ）
からなる群から選ばれるいずれかひとつのペプチ ド又はその誘導体である特許 請求の範囲第 1〜 8項のいずれか 1 ¾に記載のペプチ ド又はその誘導体。
1 0. 特許請求の範囲第 1 ~ 9項のいずれか 1項に記載のペプチ ド又はその ί秀 導体の 1種または 2種以上を含有 してなる医薬組成物。
1 1 . 特許請求の範囲第 1 〜 1 0項のいずれか 1項に記載のペプチ ド又はその誘 導体の 1種または 2種以上を含有 してなる 自己免疫疾患治療用医薬組成物。
1 2. 自己免疫疾患が多発性硬化症、 慢性関節リ ウマチ、 全身性エリテマ トーデ ス、 シェ一グレ ン症候群、 バセ ドウ氏病、 橋本病、 及び、 自己免疫性溶血性貧 血からなる群から選ばれる 1 種又は 2種以上の疾患の治療用である特許請求の 範囲第 1 1項に記載の自己免疫疾患治療用医薬組成物。
3 . 臓器移植に伴う拒絶反応の予防 · 治療用である特許請求の範囲第 1 0又は
1 1項に記載の医薬組成物。
4 . 炎症の治療用である特許請求の範囲第 1 0項に記載の医薬組成物。
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