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WO1996033263A1 - Nouveaux micro-organismes capables de produire des acides gras hautement insatures et procede de production d'acides gras hautement insatures utilisant ces micro-organismes - Google Patents

Nouveaux micro-organismes capables de produire des acides gras hautement insatures et procede de production d'acides gras hautement insatures utilisant ces micro-organismes Download PDF

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Publication number
WO1996033263A1
WO1996033263A1 PCT/JP1996/001049 JP9601049W WO9633263A1 WO 1996033263 A1 WO1996033263 A1 WO 1996033263A1 JP 9601049 W JP9601049 W JP 9601049W WO 9633263 A1 WO9633263 A1 WO 9633263A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oil
fat
acid
strain
dha
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/001049
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshihiro Yokochi
Toro Nakahara
Takanori Higashihara
Satohiro Tanaka
Toshiaki Yaguchi
Original Assignee
JAPAN, represented by DIRECTOR-GENERAL OF AGENCY OF INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY
Nagase Biochemicals Ltd.
Suntory Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JAPAN, represented by DIRECTOR-GENERAL OF AGENCY OF INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY, Nagase Biochemicals Ltd., Suntory Limited filed Critical JAPAN, represented by DIRECTOR-GENERAL OF AGENCY OF INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY
Priority to AU53462/96A priority Critical patent/AU5346296A/en
Priority to US08/945,226 priority patent/US6582941B1/en
Priority to EP96910187A priority patent/EP0823475B1/en
Priority to DE69637953T priority patent/DE69637953D1/de
Publication of WO1996033263A1 publication Critical patent/WO1996033263A1/ja

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Definitions

  • the present invention relates to a Schizochytrium SR21 strain capable of producing an oil or fat containing (n-3) docosahexanoic acid and (n-6) docosapentaenoic acid, and belongs to the same species as the SR21 strain.
  • n-3 docosahexaenoic acid and / or (n-6) docosapentaenoic acid
  • the present invention relates to fats and oils produced by the microorganisms, various feeds and foods to which the fats and oils are added, and methods of using the fats and oils as additives for various feeds and foods.
  • highly unsaturated fatty acids such as docosahexaenoic acid (DHA) and docosapentaenoic acid (DPA) are considered to have various physiological activities. It is known that these highly unsaturated]! Fatty acids can be divided into (n-3) and (n-6) systems depending on the difference in the position fi of the unsaturated bond. In the body, highly unsaturated fatty acids (n-3) and (n-6) are in different metabolic pathways), and animals require both as essential fatty acids.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • DPA docosapentaenoic acid
  • (n-3) polyunsaturated fatty acids include, for example, eicosapentaenoic acid [20: 5 (n-3)] and docosahexaenoic acid [22: 6 (n-3)].
  • eicosapentaenoic acid 20: 5 (n-3)
  • docosahexaenoic acid 22: 6 (n-3)].
  • physiological activities such as anti-inflammatory activity and antithrombotic activity. It is attracting attention as a material for functional foods and pharmaceuticals.
  • (n-6) polyunsaturated fatty acids include, for example, 7-linolenic acid [18: 3 (n-6)], dihomo-7-linolenic acid [20: 3 (n-6)] > Includes arachidonic acid [20: 4 (n-6)], which is attracting attention as an intermediate metabolite to one or two groups of eicosanoids such as brostaglandins and leukotrienes called local hormones .
  • the final metabolites of the (n-3) system are docosahexaenoic acid, and the [ ⁇ -6] system is arachidonic acid, depending on the composition.
  • the fatty acid composition of phospholipids in human erythrocytes is (n-3): eicosaventaenoic acid 0.70%, docosapentaenoic acid 2.09%, and docosahexaenoic acid 4.37%
  • (n-6) ) System is 12.67% of linoleic acid, 0.62% of dihomo- ⁇ -linolenic acid, 16.93% of arachidonic acid and 0.86% of docosapentaenoic acid [Hardy et al., Biochen, J., vol.274.pl33 (1991)], ( The amount of docosapentaenoic acid in the n-6) system is extremely low.
  • This (n-3) type DHA is contained in fish oil (which is contained in breeding fish), and in particular, around 20% is contained in blue tuna-derived oil.
  • raw materials containing high concentrations of DHA, such as tuna ophthalmic fat have been discovered, and technologies for refining S-degrees of fatty acids have been developed. It is being advanced.
  • DHA's physiological activities include cholesterol-lowering, anticoagulant, anti-coagulant, and memory-learning abilities linked to the brain metabolic system, prevention of senile dementia, treatment of Alheimer's disease, The essential fatty acids for the growth of fry have been clarified, and they are used as health food and baby milk.
  • DPA docosapentaenoic acid
  • the fatty acid composition of the optic choroid plexus of the third generation of rats fed a diet containing safflower oil which is extremely abundant in the (n-6) system, is a decrease in the DHA of the (n-3) system to 1 Z3.
  • the (n-6) -system DP A quadrupled [Honayoun et al., J. Neurochen., Vol.51. P.45 C1988)] 0
  • the sensitivity of vitamin A deficiency rats (N-6) system DPA composition jumps from 0.9% of normal value to 10.5% in microsomes [Hamm et al., Biochei. J .. vol.245.
  • ( ⁇ -6) -based DPA include the use of a tranquilizer as a base to facilitate transport to the brain (Japanese Patent Publication No. 61-204 136), and ( Diseases in which the unsaturated fatty acids of charcoal purple number 22 of the n-6) series are lower than normal, such as infections by viruses, especially wort virus: leukemia, milk and other species.
  • Pre-menopausal syndrome and benign chest diseases 3 ⁇ 4 blood pressure, hyperlipidemia and obesity, dry eye syndrome; scleroderma, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, hampered adenitis and other forms
  • Autoimmune and inflammatory diseases Infertility: Diabetes: and schizophrenia and psychotic diseases including alcoholism (including the effects of both moderate and abstinence).
  • docosatetraenoic acid JP-A-60-38324.
  • the content of (n-6) DPA in fish oil is as small as about 1% And contains many highly unsaturated fatty acids with similar structures such as arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid, and the (n-3) -based DPA is several times higher than the (n-6) -based DPA Because of its content, efficient separation and S reduction are difficult, such as the necessity of multiple stages of chromatographic treatment.
  • fish oil has notable physiological functions (n-3> type DHA and (n-6) type DPA, but (n-3) type DHA and (n-6) type.
  • Oil containing a large amount of DP A is not yet known, and in the case of fish oil, it is difficult to become a stable supply source due to the migratory properties of fish, etc., and it also has disadvantages such as the peculiar smell of fish oil
  • Fish oils also contain highly unsaturated fatty acids such as arachidonic acid (AA) and eicosapentaenoic acid (EPA), making it easy to oxidize and difficult to obtain stable quality oils and fats.
  • AA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • n-3) -based DHA or (n-6) -based DPA high-purity (n-3) -based DHA or (n-6) -based DPA, especially when it is added to infant milk. It is desirable that the content of acid is low, but when the supply source is fish oil, only eicosapentaenoic acid can be used efficiently. It is extremely difficult that support.
  • N-3) Docosahexaenoic acid-producing organisms include the bacteria Vibrio oarinus (AT)
  • Cyclotella cryptica (Crypthecodinium cohniiX special table 5-503425), Thraustochytriurium flagellate fungus (Thraustochytri urn aureum) (ATC C 34304) [Kendrick, Lipids, vol.27, pl5 (1992)] ⁇ Japonochytrium '(Japonochytriuni sp.) (AT CC 28207) (JP-A-1-199588) and the like are known. However, according to the method using these microorganisms, the amount of docosahexaenoic acid produced per liter (liter) of the culture medium remains at an extremely low level of several tens to 50 mg.
  • some microalgae produce docosapentaenoic acid-containing lipids, all of which are (n-3) -based docosapentaenoic acids.
  • Thraustochytrium alloys ATC C 34 304
  • javonokitorium esb AT CC 28207
  • docosapentaenoic acid is also (n-3) -based That is, it is not known that (n-6) docosaventaenoic acid is present at a sufficient ft in fats and oils produced by these microorganisms.
  • the present inventors have found that the content of the above (n-3) docosahexaenoic acid (DHA) and Z or (n-6) docosapentaenoic acid (DPA) is high and that eicosapentaene Microorganisms that produce high levels of fats and oils with low acid (EPA) content have been widely sought from marine microorganisms.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • DPA docosapentaenoic acid
  • the present invention relates to a Schizochytrium strain SR21 having an ability to produce an oil or fat containing (n-3) docosahexaenoic acid (DHA) and (n-6) docosapentaenoic acid (DPA), It provides a microorganism belonging to the same species as the SR21 strain or having substantially the same mycological properties.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • DPA docosapentaenoic acid
  • the present invention provides a method for producing an oil or fat containing (n-3) DHA and (n-6) DPA, which comprises culturing the microorganism and collecting the oil or fat from the culture. Provide a way.
  • the present invention further comprises a step of isolating (n-3) DHA or (n-6) DPA from the fat or oil, wherein the (n-3) DHA or ( II-6) To provide a method for producing system DPA.
  • Kamikaki oils and fats are useful as a source of (n-3) DHA and / or (n-6) DPA for various feeds and foods. .
  • FIG. 1 is an optical microscopic Si photograph showing the morphology of zoospores of Schizochytrium JSSR 21 strain.
  • FIG. 2 is a transmission S electron micrograph showing the flagella structure of zoospores of Schizochytrium II SR 21 strain.
  • FIG. 3 is an optical micrograph showing a network of vegetative cell clusters and cytoplasm of the Schizochytrium JRSR21 strain.
  • Figure 4 shows the ( ⁇ -6) docosapentae derived from Schizochytrium SR21. 4 is a chart showing the results of measuring the GC / MS spectrum of the acid.
  • FIG. 5 is a chart showing the results of separation of triglycerides in neutral fats and oils derived from Schizochytrium JSSR21 strain by liquid chromatography.
  • Figure 6 shows the triglyceride (molecular species 1) derived from Schizochytrium) SSR21 strain.
  • oil and fat used in the present specification have the same meaning.
  • the marine microorganism SR21 strain of the present invention was isolated from seawater along the coast of Yap Island, Federated States of Micronesia. This strain was initially thought to be a microorganism of Thraustochytriua II. However, a close examination of its bacteriological properties revealed that this strain was a microorganism that was recognized as a new species of Schizochy triuol R. The bacteriological properties of this Schizochytrium SR21 strain were as follows. It is as follows.
  • the mycological properties of the SR21 strain were determined by culturing it in a nutrient medium and seawater.
  • a nutrient medium containing 2 g of glucose, 0.2 g of yeast extract, and 0.5 g of sodium glutamate added to 1 L of artificial seawater (tropic marine) is placed in a small dish, and a drop of the pre-flask culture of SR 21 strain in the same medium is inoculated. Then, the cell morphology was monitored by inverted microscope. In this case, release of amoeboid amorphous cells was observed.
  • Glutaraldehyde was added at 10% by volume to the sample where zoospores were frequently released, and the zoospores were observed with an optical microscope.
  • FIG. 1 is an optical micrograph showing the morphology of zoospores of the SR21 strain, showing two flagella with different lengths.
  • FIG. 2 is a transmission type S micrograph showing the structure of the trichomes of the zoospores of the SR21 strain, and shows a three-part structure consisting of the base, the axis, and the apical hair of the mascotonema of the trichomes.
  • FIG. 3 is an optical micrograph showing a network of the SR 21 strain vegetative cell mass and the prototype g.
  • the colony formed by the SR21 strain on the agar plate has the same smooth ocher color as the yeast colony.
  • this SR21 strain was cultured in a liquid medium, zoospores having two flagella with different lengths were observed in the early stage (Fig. 1), and the zoospores of two pilus
  • a hair-like structure has a three-part structure consisting of a base, a shaft, and a hair (Fig. 2). Based on these facts, SR21 strain is distributed in Kingdom Chromista. Phylum Heterokonta.
  • the SR21 strain Jl enters the Labyrinthulida ass Labyrinthulea (Order Labyrinthulida). And, because the vegetative cells are spherical or ridge-shaped and there is no gliding hunt in the protoplasmic network, It is clear that the R21 strain is associated with the family Thraustochytriidae.
  • the vegetative cells of the SR 21 strain repeat two divisions to form 8 to 32 Sakae tie cells. After that, amoeba-shaped amorphous cells are released from some cells, gradually become crowded from the cell mass, and become spherical cells after 1-2 hours. These spherical cells then differentiate as zoospores into 8 to 16 zoospores. At this time, no zoospore S film was observed. Furthermore, there are also cells that differentiate directly from vegetative cells to zoospores S without dividing into two, or differentiate into zoospores without passing through amorphous cells after dividing into two vegetative cell clusters. Yes, has a complex life style.
  • the throat kittle consists of 7) R30 species. Then, Corallochytrium [Raghukumar, S.
  • the characteristics of these eight species of Thraustochytridium are as follows.
  • the vegetative cells of Labyrinthuk> ides g are globular, but glide irregularly on the protoplasmic network.
  • Aplanochytriun JS is propagated by immobilized spores, ie, spores without flagella.
  • Althornia) S does not form a protoplasmic network and is planktonic.
  • Japonochytriun3 ⁇ 4 produces extracellular vesicles S (apophysis). ⁇ Ulkenia JS differentiates into zoospores after the release of ameba-like amorphous cells from zoospores S.
  • Thraustochytriun JS In Thraustochytriun JS, one zoospore turns into one elite cell, which transforms one zoospore S. Form. Schizochytrium II undergoes two divisions after one zoospore has settled, forming a plurality of vegetative cell masses, each of which becomes a zoospore S. Corallochytriun forms slime-like spores and does not form flagellar zoospores.
  • SR21 forms amoeba-shaped amorphous cells, it is considered that IS will be present in Ulkenia when its shape K is marked.
  • Ragkouma is the Thraustochytrium of Thraustochytrium 'Striatum (Thraustoc hytrium striatum) has been reported to form amoebic amorphous cells that prey on bacteria in nutrient media [Baghukumar, S., Marine Biology, 113: 165 (1992)].
  • Schizochytrium niangrovei a new species of Schizochytrium ⁇ , formed amoebic amorphous cells in a nutrient medium, or sparsely added pine pollen to seawater. It was shown that when cultured in a medium, amoebic amorphous cells were not formed [Baghukumar. S., Trans. Br. Mycol. Soc., 80: 627 (1988)].
  • Thraustochytrium 'Striatum and Schizochytrium' mangrove eyes form amoeba-shaped amorphous cells in nutrient medium as described above, but do not form amoeba-shaped amorphous cells in seawater / pine pollen medium. Not classified as genus Ulkenia. Based on the above, SR21 strain formed amoebic amorphous cells in the nutrient medium, but this was not observed in the seawater-only medium, so it would not be appropriate to classify it into Ulkenia II. .
  • the vegetative cells form clumps of many cells that adhere to each other through successive divisions, and three to four or more of the cell roses are zoospores. It separates into S.
  • one zoospore S forms 16 to 64 zoospores, and no zoospore release is observed from 2Li cells [Goldste in .S. And Belsky.M .. Am. J. Bot .. 51: 72 (1964), Booth. T. and Mi 11 er. CB. Can. J. Bot .. 47: 2051 (1969)] 0
  • Schizochytrium minutum (Schizochytriun minutun), like Schizochytridium aggregatam, divides vegetative cells, forms 4 to 8 or hundreds of cell clusters, and produces two zoospores from each zoospore S. discharge.
  • the zoospores are bean-shaped and the length of the two flagella is about 8.5 and 3.0 / £ B [Gaertner. Verof f. Inst. Meerestorsch. Bremer .. 19:61 (1981) ⁇ .
  • Schizochytrium octosporum differs from Schizochytrium 'minutum in that eight zoospores are released from one zoospore S [Raghukumar.S., Trans. Br. Mycol. Soc., 90: 2
  • Table 1 Search table for four species of Schizochytrium (according to Ragkumar).
  • Diameter of zoospore S is 15-2
  • Offspring S form 16 to 64 zoospores S. agsregatuiD
  • the diameter of the zoospore S is 14 m or less.
  • the zoospore S forms eight zoospores. S. octosporuin 3.
  • the zoospore S forms two zoospores. S. minutuiD
  • Table 1 The search table shown in Table 1 and the source of four known species And the mycological properties of the SR21 strain.
  • the Schizochytrium JR SR 21 strain is different from Schizochytrium 'mangrove eye' in which divided vegetative cells become individual zoospores without taking the form of zoospore S.
  • the diameter of the zoospores S is 14 m or less and two zoospores are formed from each zoospore S, if eight zoospores are also formed in Schizochytrium minutum, However, the forces attributed to Schizochytrium 'octosbolum, respectively, are different from the SR 21 strains, as they differentiate into 8 to 16 zoospores.
  • Schizochytrium when the diameter of the zoospores 15 is 15 to 2 and 16 to 64 zoospores are formed from the zoospores S (however, the original report has many expressions), Schizochytrium ⁇ Although it is considered to be agregatam, the SR21 strain is different from this because no amoeboid amorphous cells have been observed in this species. In addition, in the SR21 strain, there are vegetative cells that do not divide and cells that differentiate into zoospores without passing through amorphous cells. From the above, it was confirmed that SR21 strain did not correspond to the existing four species of Schizochytrium and was a new species of Schizochytrium.
  • This Schizochytrium JSSR 21 strain was deposited with the Research Institute of Biotechnology, Industrial Science and Technology under the name "Marine Bacteria SR21 Strain” on March 6, 1995, and received the accession number FERM BP-5034. are doing. In addition, it was deposited with the Fermentation Research Institute of Japan on March 17, 1995, and obtained the accession number IFO32693.
  • the post-organism used in the method for producing the fats and oils containing DHA and DPA of the present invention is not limited to KFERM BP-5034 or IFO 32693, but may be the SR21 strain in view of the mycological properties of the aforementioned Schizochytrium ISSR21 strain. Any strain can be used as long as it is a strain that is identified as having the same species or having substantially the same bacteriological properties.
  • microorganism used herein includes a wild-type strain, a mutant strain, and a recombinant microorganism.
  • One of the features of the present invention is the recognition of the ability to produce fats and oils having special lipid characteristics of microorganisms, and the accompanying stable and reliable economical provision of fats and oils having such high functions and high added ffi values. This is a solution to the problem of maintaining resources.
  • mutants or recombinant microorganisms have the (n-3) docosahexaenoic acid and Z in oils and fats compared to i produced by the original wild-type strain when cultured on the same substrate. Or, those designed with the intention of increasing the amount of (n-6) -based docosapentaenoic acid, or increasing the total fats and oils, or both.
  • a microorganism capable of producing an oil or fat containing the ( ⁇ -3) docosahexanoic acid and the (n-6) docosapentaenoic acid of the present invention can be selected, for example, according to the following screening method. It can. That is, the collected port water is filtered and collected using a sterile filter of 0.4, and the filter is stuck on an agar medium consisting of 90% natural seawater, glucose, yeast extract, and peptone, and cultured at 20 to 30. The colonies formed on the filter of the agar plate medium are cultivated on an agar medium having the same composition as above, and the obtained cells are collected with a spatula, and fatty acids are directly methyl-esterified from the cells according to a conventional method.
  • composition is analyzed by gas chromatography, and strains producing (n-3) docosahexaenoic acid and (n-6) docosapentaenoic acid are selected.
  • oils and fats accumulate in the cells at an amount of 10% by weight or more, preferably 20% by weight or more per dry cell, and / or less than 1% by weight of eicosapentaenoic acid in total fatty acids, preferably 0.5% by weight.
  • Strain that is less than wt% can be selected.
  • the Schizochytrium IRSR21 strain of the present invention can deposit 20% by weight or more of fats and oils per dried cell. In addition, 25-45% of (n-3) type osahexaenoic acid per total fatty acid in fats and oils and (n-6) type of docosapen It contains 6-11% by weight of taenoic acid, and the content of eicosapentaenoic acid is less than 1% by weight.
  • the fat or oil of the present invention contains 98% S% or more ( ⁇ -3) docosahexaenoic acid in the (n-3) fatty acid.
  • strains belonging to the same species or having substantially the same bacteriological properties as the Schizochytrium SR21 strain within the scope of the present invention preferably accumulate 10% by weight or more of fats and oils per dry cell. More preferably, 20% by weight or more, and most preferably, 30% by weight or more of i%.
  • the amount of (n-3) docosahexaenoic acid is preferably 15% by weight or more, more preferably 20% by weight or more, and most preferably 35% by weight or more of the total fatty acids in the fat or oil. .
  • the amount of the (n-6) docosapentaenoic acid is preferably 4% by weight or more, more preferably 5% by weight or more, and most preferably 6 to 11% by weight, based on the total fatty acids in the fat or oil. .
  • the content of eicosaventaenoic acid in the fat or oil is preferably less than 2% by weight, more preferably less than 1% by weight, and * also preferably less than 0.5% by weight.
  • the fat or oil of the present invention contains (n-3) docosahexaenoic acid in an (n-3) fatty acid in an amount of 90% by weight or more, preferably 95% by weight or more.
  • oils and fats of the present invention can be obtained by inoculating the above-mentioned living organisms into a suitable medium produced using natural seawater or artificial seawater, and culturing them in a conventional manner.
  • Carbon sources added to the culture medium include carbohydrates such as glucose, fructose, kindulose, sucrose, maltose, and soluble starch, oils and fats such as oleic acid and soybean oil, molasses, glycerol, mannitol, and the like. Examples include sodium acetate, but are not limited thereto. These carbon sources can be used, for example, at a concentration of 20 to 12 Og per liter of medium.
  • Murosushi examples include natural nitrogen sources such as peptone, yeast extract, malt extract, meat extract, casamino acid, corn steep liquor, organic nitrogen sources such as sodium glutamate and urea, and ammonium acetate and ammonium sulfate.
  • natural nitrogen sources such as peptone, yeast extract, malt extract, meat extract, casamino acid, corn steep liquor
  • organic nitrogen sources such as sodium glutamate and urea
  • ammonium acetate and ammonium sulfate examples include inorganic nitrogen sources such as ammonium, ammonium chloride, ammonium nitrate, and sodium sulfate, but are not limited thereto.
  • inorganic salts such as phosphates such as potassium phosphate and dihydrogen phosphate, ammonium sulfate, sodium sulfate, magnesium sulfate, sulfuric acid, sulfate network, magnesium chloride, calcium chloride, etc.
  • Vitamins can also be used as a source of nutrients. These medium components are not particularly limited as long as they do not impair the growth of microorganisms.
  • the cultivation of the bacterium is carried out at 10 to 35, preferably at 17 to 30 ° C., usually 3 to 7;
  • (n-3) docosahexanoic acid and Z or (n-6) docosapentaenoic acid in order to promote the production of (n-3) docosahexanoic acid and Z or (n-6) docosapentaenoic acid, (n-3) docosahexanoic acid and / or (n-6)
  • the pre-IE form of the system docosapentaenoic acid can be added to the medium.
  • the precursor examples include hydrocarbons such as tetradecane, hexadecane, and octadecane; fatty acids such as tetradecanoic acid, hexadecanoic acid, octadecanoic acid, and oleic acid; or fatty acids thereof (for example, sodium clay or lithium salt); fatty acids Fats and oils containing esters or fatty acids as constituents (eg, olive oil, soybean oil, real oil, coconut oil), etc. It is not limited to these.
  • the conditions for producing the oil and fat of the present invention in a commercially viable yield include the following conditions.
  • the SR21 strain and strains having the same species or having substantially the same bacteriological properties were found to be in natural seawater or artificial seawater.
  • the medium grew well at a pH of 3.5 to 6.0, preferably pH 4.0 to 4.5 in a medium containing one-half concentration of natural seawater or artificial seawater.
  • the carbon source and nitrogen source to be added to the medium may be those commonly used as described above.
  • the nitrogen source may be either organic nitrogen or inorganic nitrogen, and if the nitrogen concentration is kept constant, it will affect the growth rate of bacterial cells and the accumulation of fats, including J6, DHA, and DPA.
  • the ratio between organic nitrogen * and inorganic nitrogen can be changed without the need. When these are added at the concentration used for ordinary microorganism culture, good growth can be obtained. Good growth can be achieved by using phosphate at the level of normal microbial culture.
  • the cultivation under the above conditions can be carried out by using a conventional fermentation plant. Further, a bubble tower type tie apparatus can also be used. Normal conditions for aeration and agitation culture Can be used. In aeration and agitation culture, when the number of rotations was increased and the amount of dissolved acid was increased, a remarkable increase in growth rate and bacterial cell yield was observed as compared with flask culture.
  • the cells accumulating the (n-3) docosahexaenoic acid and the (n-6) docosapentaene K-containing oil vesicles in the culture are added in an amount of 1 Og or more per liter of medium, preferably It can be produced at a high concentration of 2 Og or more, more preferably 4 Og or more.
  • the fats and oils are satisfactorily collected in the cells from the middle stage of the culture, and can be 30% by weight or more, preferably 50% by weight, more preferably 60% by weight or more per dry cell.
  • a conventionally used method such as a centrifugal separation method or a conventional method can be used.
  • the collected cells are crushed by, for example, dyno mill or ultrasonic wave, and then subjected to solvent extraction with chloroform, hexane, methanol, ethanol, etc. to obtain (n-3) docosahexanoic acid and (N-6) -based docosapentaenoic acid-containing fats and oils can be obtained.
  • the amount of the fat containing the (n-3) docosahexaenoic acid and the (n-6) docosapentaenoic acid is preferably about 0.3 g or more, more preferably 0.6 g or more per lg of the dried cells.
  • the present invention relates to fats and oils obtained from the Schizochytrium JKSR21 strain or strains belonging to the same species or having substantially the same bacteriological properties as described above. Usually, it is as follows.
  • the proportion of neutral lipids is very high, accounting for more than 90% by weight of total fat K.
  • the fatty acid composition in the neutral fat K is: palmitic acid 45-55% by weight, (n-3) docosahexaenoic acid 30-40% by weight, (n-6) docosapentaenoic acid 5-10% by weight, (n-3) eicosapentaenoic acid 0-1% i%, arachidonic acid 0-0.6% by weight, and other fatty acids 10-20% by weight.
  • the ratio of DPA to DHA is 3 to 6 parts by weight of DHA per 1 part of DPA.
  • the obtained neutral lipid contains about 85% by weight or more, preferably 90% by weight or more of triglyceride, and contains little diglyceride and monoglyceride. It also contains free sterols and sterol esters at 2-3%.
  • the molecular species of triglycerides in fats and oils having the above fatty acid composition are mainly 14: 0—16: 0—16: 0, 16: 0-16: 0—16: 0, and 14: 0—16: 0—22: 6, 16: 0—16: 0—22: 5, 16: 0—1 6: 0—22: 6, 16: 0—22: 5—22: 6, 16: 0—22: 6 — 22: 6 (the binding position of the fatty acid residue is not limited).
  • 14 represents the number of carbon atoms in the fatty acid
  • 0 represents the number of 2S bonds that the fatty acid waits for.
  • "16: 0" represents 16 carbon atoms in the fatty acid. Represents fatty acids without heavy bonds.
  • the triglycerides include those in which (n-3) -type DHA is bound only to position 2 of glycerin, or (n-3) -type DHA binds to positions 1 and 2 or 1 of glycerin. And those linked to position 3.
  • polar lipids are phosphatidylcholine, and also include phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, and the like.
  • the fats and oils of the present invention can be used as a source of (n-3) -based DHA and / or (n-6) -based DPA in SJ products such as various feeds or foods.
  • fats and oils collected from cultured cells or (n-3) type DHA and / or (n-6) type DPA obtained by purifying the same may be used.
  • a culture solution in the process of producing the fat or oil using a cell culture tie or a sterilized culture solution, a culture solution at the end of the culture or a sterilized culture solution, or a culture bacterium collected from each of them A body or a dried product thereof, or a supernatant obtained after collecting the fat or oil from a culture solution or cells can also be used.
  • the present invention relates to an animal feed prepared by mixing the oil and fat of the present invention.
  • animal feed of the present invention include dog food such as cat food, feed for poultry such as fish, feed for livestock such as pigs and cattle, and feed for fish farming.
  • dog food such as cat food
  • poultry such as fish
  • livestock such as pigs and cattle
  • feed for fish farming can be (N-3)
  • the cells or cultured cells of the microorganism of the present invention that produced and stored oils and fats containing the DHA- and ( ⁇ -6) -based DPA must have the oils and fats protected in the cells. Oxidation is prevented by this, and it is also preferable because it is stable to heat sterilization.
  • the present invention also relates to an extraction residue after extracting fats and oils containing ( ⁇ -3) -based DHA and (n-6) -based DPA from the microorganism cells.
  • Animal feed This extraction residue is preferable because it contains proteins, ash, and carbohydrates in addition to (n-3) DHA and (n-6) DPA.
  • the present invention relates to a feed for a rescue feed organism, comprising a cultured bacterial cell or a culture solution which has produced and accumulated the oil and fat of the present invention.
  • a rescue feed organism comprising a cultured bacterial cell or a culture solution which has produced and accumulated the oil and fat of the present invention.
  • the production of seeds uses microprey organisms (animal blank tons, such as water beetles and brine shrimps).
  • the feed given to small prey organisms is determined in view of the S-requirement of the larvae that later ingest them as feed.
  • the microbial organisms By feeding the microbial organisms with the culture cells or culture solution containing the oil and fat of the present invention, the nutrient requirements of the larvae containing (n-3) DHA and (n-6) DPA can be satisfied. A fine prey organism can be obtained.
  • the present invention further includes a feed for horns and shellfish containing the above-mentioned microprey organism.
  • the present invention provides the use of the oil or fat of the present invention for production of poultry eggs enriched with (n-3) DHA and / or (n-6) DPA, and (n-3) DHA and Or (n-6) based DPA for the production of enriched egg yolk oil.
  • Poultry eggs enriched with (n-3) -type DHA and / or (n-6) -type DPA of the present invention are produced by feeding the above-mentioned animal feed to egg-collecting poultry, particularly 3 ⁇ 4, and rearing them. You. Further, by extracting fats and oils from such poultry eggs, particularly egg yolks, according to a conventional method, the yolk oil enriched with (n-3) type DHA and / or (n-6) type DPA of the present invention can be obtained.
  • Can be The present invention also includes the addition of the yolk oil to infant milk, premature infant IS milk, infant food, and maternity brick food.
  • the present invention relates to a milk product for infants and a S® product for premature infants, which contain the oil or fat of the present invention.
  • Milk, food for infants, and foods for pregnant women In particular, attempts have been made for a long time to make the ingredients of human milk powder as close as possible to human milk as much as possible, and for each of the major components of milk, such as protein, fat, and sugar, It is an important issue to be similar to.
  • fats the problem is that polyunsaturated fatty acids originally contained in breast milk are lacking in conventional infant formula.
  • RJJPENJ [Vol. 13. No. 9. pp. 765-772 (1991)] shows that the degree of unsaturated fatty acids in human, European and affirmed breast milk is low. The fatty acid composition is described.
  • a fat and oil for adding milk to infants which is a combination of a cell cooking oil containing DHA and a cell cooking oil containing arachidonic acid, which are low in EPA.
  • a cell cooking oil containing DHA and a cell cooking oil containing arachidonic acid, which are low in EPA.
  • it is completely impossible to use fats and oils containing (n-3) DHA and (n-6) DPA which are originally contained in breast milk. was not known.
  • the oil and fat derived from the Schizochytrium SR21 strain of the present invention or a strain belonging to the same species or having substantially the same bacteriological properties is expressed as n-3) Since it contains 3 to 6 parts by weight of DHA and almost no EPA, and more than 85% is triglyceride, it is necessary to produce infant formula similar to breast milk. Suitable for.
  • the present invention relates to foods such as dietary supplements, geriatric foods, health foods and the like containing the oil and fat of the present invention.
  • the food of the present invention is used for maintaining health, for the purpose of capturing (n-3) DHA and / or (n_6) DPA.
  • the form may be either a solid or liquid food or a food product.
  • oils and fats examples include natural foods such as meat, fish, and nuts, foods to which oils and fats are added during processing such as Chinese food, ramen, and soups, and heat carriers such as tempura, fried, fried, fried rice, donut, and sugar sugar.
  • Examples of such foods include fats and oils mist-applied or applied at the time of finishing the processing of biscuits and anpans.
  • the food of the present invention is not limited to foods containing fats and oils, such as bread, noodles, rice, confectionery (candies, chewing gum, gummy, tablet confections, Japanese confectionery), tofu and processed products thereof.
  • Agricultural foods such as sake, medicinal liquor, mirin, vinegar, S oil, fermented foods such as Ajii, livestock foods such as yogurt, ham, bacon, sausage, etc., marine foods such as kamaboko, fried heaven, and starch, fruit juice Beverages, soft drinks, sports drinks, Alcoholic beverages, beverages such as tea and the like can also be mentioned.
  • the food of the present invention can be processed and manufactured by a general manufacturing method by blending a predetermined i of the fats and oils of the present invention with food ingredients.
  • the compounding amount varies depending on the dosage form and the morphological properties of the food, and is not particularly limited.
  • the present invention relates to a functional food (including a food for specified health use) containing the oil or fat of the present invention.
  • the functional food of the present invention aims to exert the physiologically active function of the (n-3) DHA and the (n-6) DPA, and restores the state of reduced function to a healthy state. It is a food to maintain, maintain, or prevent loss of function.
  • the form may be in the form of a pharmaceutical preparation.For example, proteins (proteins such as milk protein, soy protein, egg albumin, etc., with a high amino acid balance and a high nutritional value as a protein source are widely used.
  • egg white oligopeptides in addition to these decomposed products, egg white oligopeptides, soybean hydrolysates, etc., mixtures of amino acids alone are also used), saccharides, fats, trace elements, vitamins, emulsifiers, fragrances, etc. It can be processed into natural liquid foods, semi-condensed tie foods and nutritious foods, and drinks and enteral nutrients mixed with oils and fats. There may be.
  • the functional foods and dietary supplements of the present invention use the fats and oils of the present invention to provide powders, granules, tablets, capsules, troches, liquids for internal use, conceivables, emulsions, syrups, drinks, It can be manufactured as a food or drink having a form such as a natural liquid diet, a semi-digestive nutritional diet, a component nutritional diet, or a nutritional supplement. At this time, a slipping or withering component or a functional component may be blended together with the fat or oil of the present invention.
  • the fats and oils of the present invention are added to the food of the patient during the networking of hospital meals, and the prepared meal is prepared on the spot, and the ( ⁇ -3) DHA and Or it can be given to patients with reduced (n-6) DPA Monkey
  • the present invention relates to the use of the oil or fat of the present invention for the production of a single drug. That is, the present invention is directed to the production of (n-3) -based DHA or (n-6) -based DPA or their conductors using the fats and oils of the present invention as a starting material.
  • the (n-3) -based DHA or (n-6) -based DPA or a mixture thereof may be in free form or as a pharmaceutically acceptable salt, such as a sodium salt, a potassium salt, a lithium salt, or Other forms of metal salts, such as alkali metal salts, zinc clay, calcium salts, magnesium salts, monoglycerides, diglycerides, triglycerides, esters of lower alcohols, phospholipids, glycolipids, It may be in various forms such as amides.
  • a pharmaceutically acceptable salt such as a sodium salt, a potassium salt, a lithium salt, or Other forms of metal salts, such as alkali metal salts, zinc clay, calcium salts, magnesium salts, monoglycerides, diglycerides, triglycerides, esters of lower alcohols, phospholipids, glycolipids, It may be in various forms such as amides.
  • the lower alcohol refers to a monohydric alcohol having a nitrogen number of 6 or less, and examples thereof include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, pentanol, and hexanol.
  • the present invention relates to a cosmetic containing the fat or oil of the present invention.
  • the cosmetic of the present invention can be prepared by blending the oil or fat of the present invention with various types of bases known as ordinary cosmetics in accordance with a conventional method.
  • bases include, but are not particularly limited to, cosmetics such as emulsions, creams, lotions, packs, dispersions, and cleaning agents.
  • Cosmetic bases include bases according to the form of the cosmetic, such as purified water, lower alcohols, polyhydric alcohols, oils and fats, surfactants, various cosmetic ingredients, ultraviolet absorbers, and thickeners. , Dyes, preservatives, fragrances and the like can be used.
  • the present invention relates to a detergent containing the fat or oil of the present invention.
  • the detergent of the present invention whether medicinal or non-medical, includes stones, shambhus, fuyucial creams, rinses, etc., which are generally used to keep the body clean, as well as bath salts. There are also utensils used in everyday households such as tableware Any detergent may be used.
  • Example 1 Production of fats and oils by Schizochytrium JR SR 21 strain
  • 1 L of artificial seawater (trobic marine) having a concentration of 50% was placed in a flask, and then the amount of carbon source (glucose) shown in Table 2 was added.
  • Or glycerol) and a nitrogen source (corn steep liquor; hereinafter may be abbreviated as CSL) was added to prepare a medium.
  • CSL nitrogen source
  • oils and fats were directly extracted from the dried cells and fatty acid methyl esters were produced according to a conventional method. That is, the dried cells were placed in a screw-mouth test tube, 10% hydrochloric acid methanol and dichloromethane were added thereto, and the mixture was reacted by heating in a 60 temperature bath for 3 hours. Next, the fatty acid methyl ester component was extracted with hexane, the fatty acid composition of the fatty acid methyl ester component was determined by gas chromatography analysis, and the content ratio of docosahexaenoic acid (DHA) was determined.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the total fatty acids contained in the cells were determined from the fatty acid methyl esters detected by gas chromatography analysis. D and DHA-producing children were determined by detecting S and docosahexaenoic acid methyl ester *. Like this Then, the total fatty acid amount per 1 L of the medium, the fatty acid content ratio per dried cell, the DHA content ratio in the total fatty acids, and the DHA amount per 1 L of the medium were determined. Table 2 shows the results.
  • DHA was determined by gas chromatograph mass spectrometry comparing with a standard substance.
  • Example 2 Production of fats and oils by Schizochytrium II SR 21 strain (2)
  • 1 L of 50% -concentrated artificial seawater 60 g of glucose as a carbon source, 4.0 g of monolithium phosphate, 1.0 g of yeast extract, and 1.0 g of organic nitrogen source
  • a medium was prepared by adding 1.0 g of corn steep liquor and further adding ammonium nitrate in an amount shown in Table 3 as a nitrogen-free nitrogen source. This was inoculated with Schizochytrium «SR21 strain, and cultured at 25 ° C for 4 weeks with shaking.
  • Medium (A) consisting of 60 g of glucose, 20 g of boliviton, 1 Og of yeast extract and 1 L of 50% concentrated artificial seawater, or 90 g of glucose, 10 g of boribeptone, 1 Og of corn steep liquor and 50% concentrated artificial seawater Using the medium (B) consisting of 1 L, culture was performed in a jar fermenter (culture tank capacity 5 L, medium i3 L). Culture is performed at a culture temperature of 25 and aeration of 0.5w. m, the stirring speed was 20 Orpm.
  • Table 5 shows the results of analyzing the fatty acid composition of the DHA-containing fats and oils by gas chromatography. Table 5. Composition of Fatty Acids I (Weight) Experiment 14: 0 15: 0 16: 0 17: 0 18: 0 20: 4 20: 5 22: 5 22: 6
  • Schizochytrium SR21 strain shows good growth even in the practical agitating culture, which is a practical culture method. It was shown to accumulate well.
  • Production of DHA The ft is up to 7.2 g / L medium and the productivity is very good.
  • DHA docosahexanoic acid
  • DPA docosapentaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • each (n-3) fatty acid such as docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) contained in the fats and oils obtained in Examples 1 to 3, and the total (n-3: Table 6 shows the ratio of DHA to the fatty acids.
  • DHA-containing fats and oils obtained from Schizochytrium JR SR 21 strain have an EPA content of 1.0% by weight or less in fish oil, and a DHA content of 98% by weight or more based on all (n-3) 8S fatty acids. It is.
  • Table 7 shows that DHA was produced by culturing using Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) as a microorganism [P.Bajapai. PK Bajapai and O.Pjard. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35 : 706 (1991), A. Kendric and C. Eatledge, Lipids 27: 15 (1992), and PK Bajapai, P. Bajapai and OPffard. J. Am. Oil Chem. Soc., 68: 509 (1991). ], When DHA was produced by cultivation using Javonokitorium sp.
  • the SR21 strain has an extremely high DHA-producing ability. Furthermore, according to known microorganisms, fats and oils having an EP A content of a few weight% are obtained, whereas according to Schizodium strain JSSR21, fats and oils having an extremely low content of less than 0.5 wt% are obtained. You can see that it can be done. Cold example 5_ Production of fats and oils by Schizochytrium JRSR 21 strain (4)
  • urea was added to remove saturated fatty acids according to a conventional method. That is, 20 g of urine and 20 Oml of methanol were added to about 9 g of the crude extracted fatty acid prepared by the method shown in Example 5, heated at 60 ° C. for 3 hours, and then gradually cooled to 10 °. After filtering out the precipitated urea crystals, the non-crystalline solution was concentrated in a concentrated box to obtain about 4 g of urine non-adduct.
  • the fatty acid composition of this non-urinary cord adduct was docosapentaenoic acid 17.7%, docosahexaenoic acid 77.9%, and the mixing ratio of other fatty acids was 5% or less.
  • fat K was converted to piconyl ester ⁇ conductor according to a conventional method, and analyzed by GCZ IS. That is, 1 OOjl of thionyl chloride was added to 20 / ig of the non-urea-added fatty acid obtained above, left at room temperature for 1 minute, and dried under a nitrogen stream. To this, 10% 3-pyridylcarbonyl 101 was added, left at room temperature for 1 minute, and analyzed by GC ZMS. As a result, as shown in Fig.
  • the docosapentaenoic acid (22: 5) produced by the SR21 strain has an (n-6) unsaturated bond with an unsaturated bond at the position of ⁇ 4.7.10.1 3.16. It was identified as a fatty acid.
  • Example 7 Fatty acid analysis of Schizochytrium «SR 21 strain
  • Example 5 As the crude extracted oil and fat, the one obtained in Example 5 was used.
  • the crude extracted oil and fat was subjected to liquid partitioning with hexane and 90% methanol according to a conventional method to separate the neutral lipid and polar finger substance.
  • the obtained lipid amounts were 1.8 g of polar fat K and 32.9 g of neutral lipid, respectively. After hydrolyzing this lipid, it was converted to methyl ester, and the fatty acid composition was analyzed by gas chromatography.
  • the neutral lipids and polar lipids obtained in Example 7 were analyzed by thin-layer chromatography according to a conventional method. The color was developed using sulfuric acid, and the resulting spots were identified by the Rf value with each standard lipid. More than 90% of neutral fats were triglycerides.
  • the polar lipids were mostly phosphatidylcholine, followed by phosphatidylethanolamine and phosphatidylinositol.
  • the tridaliceride (molecular species 16: 0—16: 0—22: 6) fractionated in Example 8 was dried, treated with a lipase specific to the 1.3 position, and the resulting 2-monoglyceride was trimethylsilylated. After that, fatty acid residues were determined by GCZMS.
  • the lipase treatment was performed with 2 ml of 50 mM acetate buffer (pH 5.5), lipase 1000 units, 35, and 30 minutes.
  • 2-monoglyceride was extracted with ether and trimethylsilylated 2-monoglyceride using a commercially available trimethylsilylating agent. As a result, as shown in FIG.
  • ammonium sulfate was added at a concentration shown in Table 11 to a half-concentrated artificial seawater medium containing 60 g of glucose, 3 g of potassium dihydrogen phosphate, and 0.5 g of corn steep liquor, 3 L of this medium was placed in a 5 L-volume Jafermenter.
  • 60 ml of a preculture solution prepared in the same manner as in Example 5 was added and cultured.
  • the concentration of murine sources was set in a half-concentrated artificial seawater medium containing 6 Og of glucose, 3 g of potassium dihydrogen phosphate, and 0.5 g of corn steep liquor per liter of medium.
  • corn steep liquor (CSL) was added as an organic chamber source, and ammonium sulfate was added in two different proportions as an inorganic source.
  • 3 L of this medium was placed in a jar fermenter having a volume of 5 L, and 6 OJDI of a preculture solution prepared in the same manner as in Example 5 was added thereto, followed by culturing under the same conditions as in Example 5.
  • Glucose, corn steep liquor, and ammonium sulfate were added at the concentrations shown in Table 13 to a half-concentrated artificial seawater medium to which 3 g of dihydrogen phosphate medium was added per 1 L of the medium. 3 L of this medium was placed in a 5 L-jar fermenter, and cultured under the culture conditions shown in Example 5. After the consumption of glucose, 1 O ODI of the culture solution was collected, and the cells were collected by centrifugation. The cells were washed, and dried cells were obtained using a freeze dryer. The weight of the dried cells was measured to determine the amount of cells per 1 L of medium, and then the amount of cells per 1 L of medium and total fat per 1 L of medium were determined in the same manner as in Example 5.
  • the culture solution produced according to Example 12 was collected, the solution was removed with a filter breath and dried to obtain 1 Okg of cells containing 10% of water.
  • the cells were extracted with hexane according to a conventional method to remove hexane, and 5.9 kg of an oil or fat was obtained. After the hexane extraction, the cells were dried to remove hexane, and 3.9 kg of oil-extraction residual cells were obtained.
  • the fat contained 35% DHA and 8% DPA.
  • the oil-extracted cells contained 1.2% DHA and 0.3% DPA.
  • One group was a control group and 5 birds were bred on a normal diet for 25 days. The remaining group had 3 birds as a group.
  • the normal feed was reduced by 50 g from the control group, and 50 g of the oil-extracted residual bacterial cells obtained in Example 14 was added to supplement the amount by 25 g. .
  • the egg weight, egg yolk weight, DHA concentration, DPA concentration, egg yolk shine, and egg yolk taste of three 25th eggs were measured. Table 16 shows the results. By rearing the cells with residual oil extract cells, the DHA and DPA contents in the yolk clearly increased. In addition, the yolk was bright and melted.
  • Table 16 Control group
  • Example 7 The crude extracted oil and fat obtained in Example 7 was separated into neutral fat and polar lipid by liquid-liquid partitioning with hexane and 90% methanol according to a conventional method, and the (n-6) docosapentaene A neutral lipid containing an acid and DHA [( ⁇ -6) -based docosapentaenoic acid 7.9, containing 33.7% DHA] was obtained.
  • this oil By mixing 0.6 g of this oil with 100 g of powdered milk, milk containing (n-6) -based docosapentaenoic acid and DHA was produced.
  • Example 12 A total of 00% was obtained in Example 12 in a soft capsule made of -6) A microbial oil containing docosapentaenoic acid and DHA was filled with 30 Omg by a conventional method to obtain a soft carbose preparation.
  • Example 20 Production of beverage containing (n-6) -based docosapentaenoic acid and DHA
  • Example 21 Production of Micro-Feed Biological Feed Containing DHA and DPA
  • the culture solution produced according to Example 5 was collected, and the solution was removed with a filter breath to obtain bacterial cells.
  • the obtained cells were heated and dried at 105 for 3 hours and powdered with a coffee mill. Using the obtained powder or ban yeast as a control, cultivation of pemphides and brine shrimp was performed.
  • the marine microorganism of the present invention is excellent in aquaculture and oil / fat properties, has a high (n-3) DHA and (n-6) DPA production ability, and has very little EPA production. Therefore, when the microorganism of the present invention is used, the content of (n-3) type DHA and (n-6) type DPA which are useful in the fields of foods and pharmaceuticals is high, and
  • Oil can be produced in high yield with low PA content.
  • a highly pure (n-3) type DHA or (n-6) type DPA can be separated from this oil.
  • the fat and oil composition of the present invention contains (n-3) -based DPA having various physiological activities and (n-6) -based DPA in a specific ratio.
  • animal feed, animal feed additives, and micro-feeds for living organisms are very economical because the residual S of cultured cells containing DHA and DPA can be used.
  • by feeding the poultry feed to the poultry it is possible to obtain poultry eggs or yolk oil enriched with DHA and Z or DPA, which has never been obtained before.

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Description

明 細 害 高度不飽和胆肪酸生産能を有する斩規微生物および 該微生物を利用する高度不飽和脂肪酸の S3造方法 技術分野
本発明は、 （n-3)系ドコサへキサェン酸および（n-6)系ドコサペンタ ェン酸を含む油脂を生産する能力を有するシゾキトリウム厲 SR21株お よび該 SR 21株と同一の種に属するかもしくは実質的に同一の菌学的性 質を有する微生物、 ならびに、 該微生物を利用する（n-3)系ドコサへキ サェン酸および または（n-6)系ドコサペンタエン酸の製造方法に関す る。
さらに、 本発明は、 上記微生物が産生する油脂、 該油脂を添加した種々 の飼料および食品、 ならびに、 該油脂を種々の飼料および食品のための添 加物として利用する方法に関する。
背聚技術
動物体内において、 ドコサへキサェン酸（DHA)やドコサペンタエン酸 (D P A)などの高度不飽和脂肪酸は、 種々の生理活性を有するものと考え られている。 これら高度不飽和]!旨肪酸は、 その不飽和結合の位 fiの相違に より（n-3)系および（n-6)系に分けられることが知られている。 勳物体 内では（ n - 3 )系と（ n - 6 )系の高度不飽和) ¾肪酸は別の代謝経路に) »して おり、 動物は両者を必須脂肪酸として要求する。
(n-3)系の高度不飽和脂肪酸には、 例えばエイコサペンタエン酸 [20 ： 5(n-3)]やドコサへキサェン酸 [22 ： 6(n-3)]などが含まれ、 こ れらは抗炎症活性、 抗血栓活性などの生理活性を有することが知られてお り、 機能性食品や医薬品の素材として注目されている。
—方、 （n- 6)系の高度不飽和脂肪酸には、 例えば 7-リノレン酸 [18 ： 3(n-6)]、 ジホモ- 7-リノ レン酸 [20： 3(n-6)]> ァラキドン酸 [2 0 ： 4 (n- 6)]などが含まれ、 これらは局所ホルモンと呼ばれるブロスタ グランジン、 ロイコ トリエンなどのエイコサノィ ドの 1群あるいは 2群へ の中間代謝物質として注目されている。
動物体内においては、 組繳により変わるものの、 （n-3)系はドコサへ キサェン酸が、 そして〔η-6)系はァラキドン酸が最終代謝産物となって いる。 例えば、 ヒ ト赤血球のリ ン脂質の脂肪酸組成は、 〔n-3)系はエイ コサベンタエン酸 0.70%、 ドコサペンタエン酸 2.09%、 ドコサへキ サェン酸 4.37%であり、 一方、 （n-6)系はリノール酸 12.67%、 ジホモ- γ-リノ レン酸 0.62%、 ァラキドン酸 16.93%、 ドコサペン タエン酸 0.86%であり [Hardyら， Biochen, J. , vol.274. pl33 (1991)]、 (n-6)系のドコサペンタエン酸は極めて少ない。
(n-3)系の最終代謝産物である（n-3)系ドコサへキサェン酸（D H A) は、 動物の脳や網膜に特異的に存在し、 これら器官において何らかの機能 を果たしていると考えられている。 この（n-3)系 DHAは、 育魚に) Sす る魚油に含まれ、 特にィヮシゃマグロ由来の油には 20%前後含まれてい る。 近年、 マグロの眼寫脂肪などの DHAを高濃度に含有する原料が発見 され、 また脂肪酸の S度精製技術が発達したことなどから、 DHAの生理 活性機能の解明や笑用化の研究が活発に進められている。 DHAの生理活 性機能としてコレステロール低下作用、 抗血液凝固作用、 制 S作用、 さら には脳代謝系に 連して記憶学習能力の向上、 老人性痴呆症の予防、 アル ッハイマー疾病の治療薬、 稚魚の成長必須脂肪酸などが明らかとなり、 ま た健康食品やべビーミルク等の衆材として使用されている。 一方、 動物体内で（n-6)系ドコサペンタエン酸（D PA)の組成が大き くなる場合は、 （n-3)系必須脂肪酸の欠乏に対する代值と考えられる。 例えば、 （n-6)系が極めて多いサフラワー油を含む食餌を与え铳けた 3 世代目のラッ 卜の視神経脈絡膜叢の脂肪酸組成は、 （n-3)系 DHAが 1 Z3に減少するカ、 その一方で、 （n-6)系 DP Aが 4倍になった [Honayo unら， J. Neurochen. , vol.51. p.45 C1988)]0 さらに、 ビタミン A欠乏症 ラッ 卜の肝敏ミクロソー厶において（n-6)系 DP A組成が正常値の 0.9 %から 10.5%へ急增すること [Hammら. B iochei. J.. vol.245. p907 (1987)]、 および、 （n-3)系の少ないパー厶油を与えたラッ トにおいて（n -3 )系 D HAが弒少し、 （n-6)系 0?八が¾加すること[1?€1)^118ら. Bio sci. Biotech. Biochem.. vol.58. p314 (1994)]などが報告されている。 このように、 動物の脳や網膜において何らかの機能を果たしていると考 えられる（n-3)系 DH Aの代償として（n-6)系 DP Aが生体内で作られ ることは、 （n-6)系 DP Aが何らかの生理的役割を有していることを示 唆し、 また、 ァラキドン酸のアンタゴニストとしても期待できる。
さらに、 現在知られている（π-6)系 DPAの利用法としては、 精神安 定剤を脳へ運びやすくする基剤として使用すること（特関昭 61-204 136号）、 ならびに、 （n-6)系の炭紫数 22の不飽和脂肪酸が正常値よ りも減少している疾患、 例えば、 ウィルス、 特にワート（wart)ウィルスに よる感染： 白血病、 乳瘙および他の種の瘙；月经前症候群および良性胸部 疾患： ¾血圧、 高脂血症および肥満症、 ドライ ·アイ（dry eye)症候群； 強皮症、 リューマチ性関節炎、 クローン病、 濱痛性大腺炎および他の形の 自己免疫および炎症性疾患：不妊症：糖尿病：および精神分裂病およびァ ルコール中毒 (適度および禁酒の両方の影響を含む）を含む精神病的疾患な どの治療に（n-6)系 DP Aを（n-6)系ドコサテトラェン酸と組み合せて 使用すること（特開昭 60— 38324号)が挙げられる。
この（π -6)系 DP Aは、 一般的に供給される油脂の中には全く存在せ ず、 魚油の中に（n- 3)系 DP Aとともにわずかに含まれているにすぎな 、。 魚油から（ n - 6 )系 D P Aを分雌濃縮する方法が特許出 されている 力 < [特開平 1-180849]、 魚油中の（n-6)系 DP Aの含量が 1 %程度 と微量であり、 ァラキドン酸、 エイコサペンタエン酸、 ドコサへキサェン 酸などの構造の類似した高度不飽和脂肪酸を多く含み、 さらに（ n - 3 )系 DP Aが（n-6)系 DP Aより数倍高い含量で含まれるため、 多段のクロ マト処理が必要であるなど効率の良い分離 · S縮が困難である。
以上のように、 魚油には注目すべき生理機能を有する（n- 3〉系 DH A および（n-6)系 DPAが存在するが、 （n-3)系 DHAおよび（n-6)系 DP Aを多量に含んでいる油 ½は未だ知られていない。 さらに、 魚油の場 合、 魚類の回遊性等から安定な供耠源となりにくいことや、 魚油特有の異 臭があるなどの欠点がある。 また、 魚油にはァラキドン酸（AA)やエイコ サペンタエン酸（EPA)などの高度不飽和 ½肪酸も含まれるため、 酸化さ れ易く、 安定した品質の油脂を得ることが困難である。 さらに、 高純度の (n -3)系 DH Aまたは（n-6)系 DP Aを得ようとする場合、 その分離精 製が困難である。 特に、 乳児用ミルクに添加する場合、 エイコサペンタエ ン酸の含有割合が低いものが望ましいが、 供辁源が魚油の場合にはエイコ サペンタエン酸のみを効率的に除去することは極めて困難である。
魚油以外の（n-3)系ドコサへキサェン酸の供給源として、 （n-3)系ド コサへキサェン酸生産能を有する微生物の培 *菌体中に蓄積した油脂が知 られている。 （n-3)系ドコサへキサェン酸生産能を有する撖生物として は、 深海から分離された細菌ビブリオ ·マリナス（Vibrio oarinus)(AT
CC 15381)や深海魚の腸内から分離されたビブリオ厲細菌、 微細藻 類であるシク口テラ ·クリブティ力（Cyclotella cryptica)ゃクリブテコ アイニゥ厶 · コーニー (Crypthecodinium cohniiX特表 5— 50342 5)、 鞭毛菌類であるスラウストキトリウム 'ァウレゥ厶（Thraustochytri urn aureum)(ATC C 34304) [Kendrick, Lipids, vol.27, pl5 (199 2)〕ゃジャボノキトリウム 'エスピー（Japonochytriuni sp. )(AT C C 2 8207) (特開平 1-199588)などが知られている。 し力、し、 これら の微生物を用いる方法によると、 培地 1 L (リッ トル）当たりのドコサへキ サェン酸の生産量は、 数 10mg〜50 Omg程度と極めて低い水準に止どまつ ている。
一方、 微細藻類の一部には、 ドコサペンタエン酸を含む脂質を生産する ものが存在するが、 これはいずれも（n-3〉系のドコサペンタエン酸であ る。 また、 鞭毛菌類のスラウストキトリウム 'ァゥレゥム（ATC C 34 304)ゃジャボノキトリウム ·エスビー（AT CC 28207)などにも ドコサペンタエン酸が含まれることか知られているが、 これらも（n-3) 系であると報告されている。 即ち、 これら微生物によって生産された油脂 中に（n-6)系ドコサベンタエン酸が十分 ftで存在することは知られてい ない。
発明の関示
本発明者らは、 上記のような（n-3)系ドコサへキサェン酸（DHA)お よび Zまたは（n-6)系ドコサペンタエン酸（DPA)の含有量が高く、 か つエイコサペンタエン酸（EPA)の含有量が低い油脂を高生産する微生物 を広く海洋性微生物に求めた。
この結果、 ある種の海洋性微生物（シゾキトリウム Bに JRする新種)が、 (n-3)系 DH Aを高含有するだけでなく、 （n-6)系 DP Aをも含有し、 さらに E P Aの含有量の低い油脂を高生産することを見い出し、 本発明を 完成するに至った。
即ち、 本発明は、 （n-3)系ドコサへキサェン酸（DHA)および（n-6) 系ドコサペンタエン酸（DP A)を含む油脂を生産する能力を有するシゾキ トリウム厲 SR21株および垓 SR21株と同一の種に属するかもしくは 実質的に同一の菌学的性質を有する微生物を提供するものである。
また、 本発明は、 上記微生物を培養し、 その培養物から上記油脂を採取 することを特徴とする、 （n -3)系 DH Aおよび（n-6)系 DP Aを含む油 脂の製造方法を提供する。
また、 本発明は、 上記油脂から（n-3)系 DHAまたは（n-6)系 DPA を単離する工程をさらに包含することを特徴とする、 （n-3)系DHAま たは（II -6)系 DP Aの製造方法を提供する。
さらに、 本発明者らは、 上杞油脂が種々の飼料および食品のための（n- 3)系 DHAおよび/または（n-6)系 DP Aの供耠源として有用であるこ とを見い出した。
即ち、 本発明は、 上記油脂を添加した種々の飼料および食品を提供する <= また、 本発明は、 上記油脂を種々の飼料および食品のための添加物とし て利用する方法を提供する。
図面の簡単な説明
図 1は、 シゾキトリウム JSSR 21株の遊走子の形態を示す光学顕微 Si 写真である。
図 2は、 シゾキトリウム厲 SR 21株の遊走子の鞭毛の構造を示す透過 型 S子顕微鏟写真である。
図 3は、 シゾキトリウム JRSR21株の栄養細胞塊と原形質とのネッ ト ワークを示す光学顕微鏡写真である。
図 4は、 シゾキトリウム ¾SR21株由来の（π -6)系ドコサペンタエ ン酸の GC/MSスぺク トルを測定した結果を示すチヤ一トである。
図 5は、 シゾキトリウム JSSR21株由来の中性油脂中のトリグリセリ ドを液体クロマトグラフィーにより分離した桔果を示すチヤ一トである。 図 6は、 シゾキトリウム) SSR21株由来のトリグリセリ ド（分子種 1
6 : 0— 16 : 0— 22 : 6)をリパーゼ処理し、 次いでトリメチルシリ ル化した後に G C ZM Sで測定した結果を示すチヤー卜である。
発明を実施するための最良の形態
以下において、 本発明を詳しく説明する。
なお、 本明細書中に記載した 「油脂」 、 「脂質」 、 および 「オイル Jな る用語は同じ意味で使用した。
本発明の海洋性微生物である SR 21株は、 ミクロネシァ連邦のヤップ 島沿岸の海水から分離したものである。 当初、 この菌株は、 スラウストキ トリウム（Thraustochytriua)厲の微生物であると考えられた。 しかし、 そ の菌学的性質を詳しく調べた桔果、 この菌株はシゾキトリウム（Schizochy triuo lRの新種と認められる微生物であることがわかった。 このシゾキト リウム ¾ S R 21株の菌学的性質は下記の通りである。
SR21株の菌学的性質は、 栄養培地および海水中で培養することによつ て SSベた。
まず、 人工海水（トロピックマリン） 1 Lにグルコース 2g、 酵母エキス 0.2 gおよびグルタミン酸ナトリウム 0.5gを加えた栄養培地を小シヤー レに入れ、 同じ培地による SR 21株のフラスコ前培養液を 1滴接種し、 倒立顕徼鏟により細胞形態を追钫した。 この場合、 アメーバ状の不定形細 胞の放出が見られた。
次に、 同様の追跡をフィルター滅菌した天然海水中で行った。 この場合 にはアメーバ状の不定形細胞の放出は見られず、 2分裂を繰り返した後の 栄養細胞塊のいくつかの細胞から、 遊走子の放出が観察された。 また、 2 分裂をせずに 1個の栄養細胞から直接遊走子へと分化したものも観察され た。
遊走子放出が多く認められたサンブルにグルタルアルデヒ ドを 1 0容量 %加え、 光学顕微鏡により遊走子の観察を行った。
図 1は、 S R 2 1株の遊走子の形態を示す光学顕微銪写真であり、 2本 の長さの異なる鞭毛を示している。
さらに酢酸ウランを用いたネガティブ染色法により、 鞭毛の 子顕微瘐 観察を行った。 図 2は、 S R 2 1株の遊走子の韈毛の構造を示す透過型 S 子顕微镜写真であり、 韈毛のマスチゴネマの基部、 軸、 頂毛からなる三部 構造を示している。
また、 上記 2通りの倒立顕微镜による細胞形態観察において、 栄養細胞 が 2分裂を操り返し、 細胞塊および原形質のネッ トワークを形成するもの が見られた。 図 3は、 S R 2 1株の栄養細胞塊と原形 gとのネッ 卜ワーク を示す光学願微 «写真である。
S R 2 1株が寒天平板培地上で形成するコロニーは、 酵母のコロニーと 同様の滑らかな黄土色を呈する。 また、 この S R 2 1株を液体培地で增《 させると、 その初期に 2本の長さの異なる鞭毛を持つ遊走子が観察され (図 1 )、 2本の韈毛のうちの長鞭毛にある毛状構造（マスチゴネマ）が基部、 軸、 頂毛の三部榱造をとる（図 2 )。 これらのことから、 S R 2 1株は、 ク Dミスタ界（Kingdom Chromista). 不等毛門（Phylum Heterokonta)に県す る。 さらに原形質のネッ トワーク形成性、 ゴルジ体由来の鳞片から、 S R 2 1株は、 ラビリンチユラ網（ ass Labyrinthulea)ラビリンチユラ目（Or der Labyrinthulida)に Jlする。 そして、 栄養細胞が球形または棟円形で あること、 および原形質のネッ トワーク中の滑走運勳がないことから、 s R 2 1株がスラウストキトリウ厶科（Family Thraustochytriidae)に厲す ることは明らかである。
さらに、 S R 2 1株の栄養細胞は 2分裂を繰り返し、 8 ~ 3 2個の栄餮 細胞瑰を形成する。 その後、 いくつかの細胞からアメーバ状の不定形細胞 が放出され、 細胞塊から徐々に雜れ、 1〜2時間後に球形細胞になる。 こ の球形細胞はその後遊走子囊として 8ないし 1 6個の遊走子へ分化する。 その際、 遊走子 Sの膜は観察されない。 さらに、 2分裂をせずに 1個の栄 養細胞から直接遊走子 Sへ分化したり、 2分裂をして栄養細胞塊となった 後に不定形細胞を経ないで遊走子へ分化する細胞もあり、 複雑な生活現を 有する。
スラウストキトリゥ厶枓は、 ボーター [D. Porter, "Handbook of Protoc tista", Jones and Bartlett Publishers (1990)]によれば 7 )R 3 0種よ りなる。 その後、 コラロキトリウム（Corallochytrium) [Raghukumar, S. .
Botanica Marina, 30： 83 (1987)]が加えられ、 モス [Moss. S. T. . "The 6 iology of Free-living Heterotrophic Iagellates , Oxford University
Press (1991)]によれば 8厲 3 3種とされる。
これらスラウストキトリゥ厶科 8厲の特徴は次の通りである。 ラビリン チュロイデス（Labyrinthuk>ides)gの栄養細胞は球状であるが、 原形質ネッ トワーク上を不規則に滑走する。 アブラノキトリウム（Aplanochytriun)JS は不動胞子、 即ち鞭毛を持たない胞子によって增殖する。 ァルソーニァ（A lthornia))Sは原形質ネッ トワークを形成せず、 浮遊性である。 ジャボノ キトリウ厶（Japonochytriun)¾は細胞外に胞 S(apophysis)を生じる。 ゥ ルケニア〔Ulkenia)JSは遊走子 Sからァメーバ状の不定形細胞が放出され た後にそれが遊走子へ分化する。 スラウストキトリウ厶（Thraustochytriu n JSは 1個の遊走子から 1個の栄綦細胞となり、 それが 1個の遊走子 Sを 形成する。 シゾキトリウム（Schizochytrium)厲は 1個の遊走子が着生した 後に 2分裂を行い、 複数個の栄養細胞塊を形成し、 それぞれが遊走子 Sと なる。 コラロキトリゥ厶（Corallochytriun)厲はコゥラナメクジ状の胞子 を形成し、 鞭毛を持った遊走子を形成しない。
尚、 上記 8厲のうちウルケニア厲については、 ゲルトナー [Gaertner. A. . Verof f . Inst. Meeresf orsch. Bremerh. , 16： 139 (1977)]は、 遊走子 Sか ら裸の原形質瑰（アメーバ状の不定形細胞)が放出された後に遊走子へ分化 する形質を厲の分類基準に用い、 それまでスラウストキトリウム厲に分類 されていたスラウストキトリウム · ヴィサージュンス（Thraustochytriun visurgense) [Ulken, A. , Veroff. Inst. Meeresf orsch. Bremerh. . 9 : 289 (1 965)]およびスラウストキトリウム 'ァモェボイダム（Thraustochytrium a noeboidust) [Bahnweg. 0.および Sparrow, F. K. , Jr. Am. J. Bot. . 61： 754 (19 74)]の 2種をウルケニア Bに移し、 それらにラグクーマ一による新種ウル ケニア · ミヌータ (Ulkenia ainuta) [Raghukumar, S. . Veroff. Inst. eeres f orsch. Bremerh. , 16： 158 (1977)]とさらに 3種の新種を併せてウルケニ 了諷 6種として新厲ウルケニア厲を提唱した。
し力、し、 それ以後にウルケニア厲の新しい種について記載した《文はみ られない 0 カーリング [Karring. J. S. . "Predominantly Holocarpic and E ucarpic Simple Biflagellate Phycoiycetes". J. Cramer (1981)]は、 ゥ ルケニア JRが独立した ¾として成立するかどうかについては疑問としてお り、 暫定的なものとして掲げた。 ただし、 ボーターおよびモスの文献には 前述の記載がされている。
S R 2 1抹はアメーバ状の不定形細胞を形成するので、 その形 Kを璽視 するとウルケニア ¾に ISするとも考えられる。 し力、し、 ラグクーマ一はス ラウス トキトリゥム厲のスラウストキトリウム ' ス トリアタム（Thraustoc hytrium striatum)が、 栄養培地ではバクテリアを捕食するアメーバ状の 不定形細胞を形成することを報告している [Baghukumar, S. , Marine Biolo gy, 113： 165 (1992)]。 さらに、 ラグクーマ一は、 シゾキトリウム厲の新 種としたシゾキ卜リウム ·マングローヴアイ (Schizochytrium niangrovei) は栄養培地ではアメーバ状不定形細胞を形成するか、 海水に松花粉のみを 添加した栄養の希薄な培地で培養した場合はァメーバ状不定形細胞を形成 しないことを示した [Baghukumar. S. , Trans. Br. Mycol. Soc. , 80： 627 (19 88)]。
そこでラグクーマ一は、 アメーバ状の不定形細胞を形成するという形質 が培地組成や培養条件によって影 *を受けることから、 基準となる培地を 使ってこの形質を绸査する必要があるとした。 その基準培地としては、 従 来から伝統的によく用いられており、 また、 これまでの厲ゃ種の原記載の 中で形態形質を観察する際に用いられることの多かった前述の海水/松花 粉培地を挙げている。 ウルケニア厲に分類されている 6種はすべて、 この 海水 Z松花粉培地中でアメーバ状不定形細胞を形成することが知られてい る。 一方、 スラウストキトリウム 'ストリアタムとシゾキトリウム 'マン グローヴアイは、 栄養培地では前述のようにァメーバ状不定形細胞を形成 するが、 海水/松花粉培地ではァメーバ状不定形細胞を形成しないことか ら、 ウルケニア属に分類されていない。 以上に基づくと、 S R 2 1株は栄 養培地ではアメーバ状不定形細胞を形成するが、 海水のみの培地ではこれ が観察されなかったので、 ウルケニア厲に分類するのは適当ではないと思 われる。
—方、 1個の遊走子が着生した後の栄養細胞が 2分裂を操り返し、 複数 個の栄養細胞塊を形成し、 それぞれが遊走子 Sとなる形質は、 培地組成に よらず安定であり、 S R 2 1株の生活環の中で常に観察される形質である。 この形質およびその他の SR21株で観察される性質は、 ゴールドシユタ インら [Goldstein. S.および Belsky, 11. , Am. J. Bot. , 51： 72 (1964)]およ びブーツら ooth.T.および liiller.C.E.. Can. J. Bot. , 47： 2051 (1969)] により報告されているシゾキトリウ厶厲の記載に矛盾することがない。 よ- て、 SR21株はシゾキトリウム厲に分類するのが妥当であると判断され る β
現在、 シゾキトリウム «微生物としては、 次の 4種が文献に記載されて いる。
シゾキ卜リウム ·ァグレガタ厶（Schizochytrium aggregatun は、 その 栄養細胞が、 連続する分裂によって多数の細胞が互いに接着した塊を形成 する。 その細胞瑰のうち、 3〜4個またはそれ以上の細胞が遊走子 Sへ分 化する。 また、 1個の遊走子 Sは 16~64個の遊走子を形成する。 さら に、 2儷の細胞からは遊走子放出は見られないと記載されている [Goldste in.S.および Belsky.M.. Am. J. Bot.. 51： 72 (1964)、 Booth. T.および Mi 11 er. C. B.. Can. J. Bot.. 47： 2051 (1969)] 0
シゾキトリウム ' ミヌータム（Schizochytriun minutun)は、 シゾキトリ ゥ厶 ·ァグレガタムと同様に栄養細胞の分裂の桔果、 4~8個または数百 の細胞塊を形成し、 各遊走子 Sから 2個の遊走子を放出する。 遊走子は豆 型であり、 2本の鞭毛の長さは 8.5 と 3. 0 /£B程度である [Gaertner. に Verof f . Inst. Meerestorsch. Bremer.. 19 : 61 (1981)〗。
また、 シゾキトリウム ·ォク トスポラム（Schizochytrium octosporum) は、 1個の遊走子 Sから 8個の遊走子が放出される点でシゾキトリウム ' ミヌータムと異なっている [Raghukumar.S. , Trans. Br. Mycol. Soc. , 90 : 2
73 (1988)]。
さらに、 1987年にラグクーマ一がゴァ（ィンド）のマングローブの «朽萁 より分離したスラウストキトリウム科の微生物は、 栄養細胞が速锈する分 裂によって細胞塊を形成することからシゾキ卜リウム JSに分類された。 し かし、 それまでに記載されていた上記 3種の遊走子はいずれも遊走子 Sと いう袋の中で形成されるのに対して、 この微生物では栄養細胞の連梡的な 2分裂により、 4、 6、 8または 1 2個の細胞となり、 それぞれの細胞が 直接遊走子となる過程をとり、 遊走子 Sの形態をとらなかった。 ラグクー マーはこの特徴に注目し、 新種シゾキトリウム ·マングローヴアイ（Schiz ochytrium mangrovei)を設けた [Baghukumar, S. , Trans. Br. ilycol. Soc. , 9 0： 627 (1988)]。 .
ラグクーマ一は同じ文献において、 それまで知られていたシゾキ卜リゥ ム厲の検索表を提案した (表 1 )。
表 1. シゾキトリウム の 4種の検索表（ラグクーマ一による） 着生した遊走子は緣り返し行われる 2分裂
によって細胞塊を形成し、 それぞれの細胞
は遊走子 Sに分化する · · · 2
着生した遊走子は繰り返し行われる 2分裂
によって細胞塊を形成し、 それぞれの細胞
は遊走子に分化する · · · S. mangrove ί
2. 遊走子 Sの直径は 1 5〜2 で遊走
子 Sは 1 6〜6 4個の遊走子を形成する S. agsregatuiD
2. 遊走子 Sの直径は 1 4 m以下で遊走子
囊は 2または 8個の遊走子を形成する 3
3. 遊走子 Sは 8個の遊走子を形成する S. octosporuin 3 . 遊走子 Sは 2個の遊走子を形成する S. minutuiD 表 1に示した検索表および既知の 4種を記載した原報と、 S R 2 1株の 菌学的性質を比較してみる。 まず、 シゾキトリウム JR S R 2 1株は、 分裂 した栄養細胞が遊走子 Sの形憨をとらずに、 ひとつひとつの遊走子になる シゾキトリウム 'マングローヴアイとは異なる。 また、 遊走子 Sの径が 1 4 m以下であつて、 各遊走子 Sから 2個の遊走子が形成される場合は、 シゾキトリウム ' ミヌータムに、 同じく 8個の遊走子が形成される場合は, シゾキトリウム 'ォク トスボラムにそれぞれ帰 ¾される力 <、 S R 2 1株は 8ないし 1 6個の遊走子へ分化することからこれらのどちらとも異なる。 さらに、 遊走子囊の径が 15〜2 であって遊走子 Sから 16ないし 64個の遊走子（ただし、 記載のある原報には多くのという表現のみ）が形 成される場合は、 シゾキトリウム ·ァグレガタムとされるが、 この種にお いてはアメーバ状の不定形細胞は観察されていないため、 SR21株はこ れとも異なる。 さらに SR21株では、 2分裂をしない栄養細胞また 不 定形細胞を経ないで遊走子へ分化する細胞も見られる。 以上のことから、 SR21株はシゾキトリウム«の既存の 4種には該当せず、 シゾキ卜リウ 厶厲の新種であると認められた。
尚、 このシゾキトリウム JSSR 21株は、 工業技術院生命工学工業技術 研究所に 「海生菌 SR21菌株」 の名称で平成 7年 3月 6日付けで寄託さ れ、 受託番号 FERM BP— 5034を取得している。 さらに、 財団法 人発酵研究所に平成 7年 3月 17日付けで寄託され、 受入番号 I FO 3 2693を取得している。
本発明の DH Aおよび DP A含有油脂の製造方法に用いる後生物は、 前 KFERM BP— 5034または I FO 32693に限らず、 上述した シゾキトリウ厶 ISSR21株の菌学的性質に照らして該 SR21株と同一 の種に ¾するかもしくは実質的に同一の菌学的性質を有すると Iめられる 菌株であればいずれの菌株も使用することができる。
また、 ここで用いられる微生物には、 野性株、 変異株あるいは組換え型 の微生物が含まれる。 本発明の特¾の一つは、 微生物の特殊な脂質特性を 有する油脂産生能力の認雜と、 それに伴うこのような高機能および高付加 ffi値を有する油脂の安定かつ信頼できる経済的な供辁源の維持の問翻の解 決である。 従って、 （n-3)系ドコサへキサェン酸および（n-6)系ドコサ ペンタエン酸を高水準で産生する野性株、 ならびに、 これら高度不飽和脂 肪酸を ¾水準で産生するように投計された変異株および組換え微生物はす ベて本発明の範囲内にある。 このような変異株または組換え微生物には、 同じ基質を用いて培養したときに、 元の野性株が産生する iと比べて、 油 脂中の（n-3)系ドコサへキサェン酸および Zまたは（n-6)系ドコサペン タエン酸の量が多くなるように、 または総油脂 »が多くなるように、 ある いはその両方を意図して設計されたものが含まれる。
さらに、 费用効果の優れた基質を効率よく用いて、 匹敵する野性型と同 量の（n-3)系ドコサへキサェン酸および（n-6)系ドコサベンタエン酸を 含有する油脂を産生するように設計された微生物も含まれる。
本発明の（π-3)系ドコサへキサェン酸および（n-6)系ドコサペンタエ ン酸を含有する油脂を生產することができる微生物は、 例えば、 次のよう なスクリーニング法に従って ¾択することができる。 即ち、 採取した港水 を 0.4 の滅菌フィルターを用いて濾過および集菌し、 このフィルター を 90%天然海水、 グルコース、 酵母エキス、 ペプトンよりなる寒天培地 上に張り付け、 20〜30でで培養する。 この寒天平板培地のフィルター 上に形成したコロニーを、 上記と同じ組成の寒天培地上で培餐し、 得られ た菌体をスパーテルで採取し、 常法に従って菌体から脂肪酸を直接メチル エステル化し、 その組成をガスクロマトグラフィーで分析し、 （n-3)系 ドコサへキサェン酸および（n-6)系ドコサペンタエン酸を産生している 菌株を選択する。 さらに、 菌体内に油脂を乾燥菌体あたり 10重量％以上、 好ましくは 20重 i%以上の箭で蓄積し、 そして /または全 ½肪酸中にェ _ィコサペンタエン酸が 1重量 未満、 好ましくは 0.5重量％未満である 菌株を: ¾択することができる。
本発明のシゾキトリウム IRSR21株は、 乾燥菌体あたり油脂を 20重 量％以上 ¾積することができる。 また、 油脂中の総脂肪酸あたり（n-3) 系 コサへキサェン酸を 25〜45童量％、 および（n-6)系ドコサペン タエン酸を 6〜11重 i%含有し、 エイコサペンタエン酸の含有割合は 1 重量％未満である。 また、 本発明の油脂は、 （n-3)系脂肪酸中に（π-3) 系ドコサへキサェン酸を 98重 S%以上含有している。
従って、 本発明の範囲内にあるシゾキトリウム厲 SR21株と同一の種 に属するかもしくは実質的に同一の菌学的性質を有する菌株は、 乾燥菌体 あたり油脂を 10重量％以上蓄積するのが好ましく、 さらに好ましくは 2 0重量％以上、 最も好ましくは 30重 i%以上蓄積する。 また、 油脂中の 全脂肪酸あたり、 （n-3)系ドコサへキサェン酸は、 15重量％以上であ るのが好ましく、 さらに好ましくは 20重量％以上、 最も好ましくは 35 重 S%以上である。 また、 油脂中の全脂肪酸あたり、 （n-6)系ドコサぺ ンタエン酸は、 4重量％以上であるのが好ましく、 さらに好ましくは 5重 量％以上、 最も好ましくは 6〜11重量％である。 さらに、 油脂中のエイ コサベンタエン酸の含有割合は、 2重量％未癎であるのが好ましく、 さら に好ましくは 1重量％未満、 *も好ましくは 0.5重量％未満である。 さ らに、 本発明の油脂は、 （n-3)系脂肪酸中に（n-3)系ドコサへキサェン 酸を 90重量％以上、 好ましくは 95重量％以上含有しており、 また、 （n -3)系ドコサへキサェン酸と（n-6)系ドコサペンタエン酸を、 （n-6)系 ドコサペンタエン酸 1重量部に対して（n-3)系ドコサへキサェン酸が 3 〜 6重量部の比率で含有している。
本発明の油脂は、 前述の徼生物を、 天然海水または人工海水を用いて调 製した ¾当な培地に接種し、 常法に従って培養を行うことにより得ること ができる。
培地に添加する炭素源としては、 グルコース、 フルク トース、 キンロー ス、 サッカロース、 マルトース、 可溶性デンプンなどの炭水化物の他、 ォ レイン酸、 大豆油などの油脂類や、 糖密、 グリセロール、 マンニトール、 酢酸ナトリウムなどが例示できるが、 これらに限られるものではない。 こ れらの炭素源を、 例えば、 培地 1 リッ トル当たり 2 0〜1 2 O gの濃度で 使用することができる。
室紫涿としてはペプトン、 酵母エキス、 麦芽エキス、 肉エキス、 カザミ ノ酸、 コーンスチープリカーなどの天然窒素源の他に、 グルタミン酸ナト リウム、 尿素などの有機窒素源、 または酢酸アンモニゥ厶、 硫酸アンモニ ゥム、 化アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム、 硫酸ナトリウムなどの無機 窒素源などが例示できるが、 これらに限られるものではない。
この他、 必要に応じてリン酸カリゥ厶、 リン酸ニ水素力リゥムなどのリ ン酸塩、 硫酸アンモニゥム、 硫酸ナトリウム、 硫酸マグネシウム、 硫酸轶、 硫酸網、 塩化マグネシウム、 塩化カルシウムなどの無機塩およびビタミン 類も歉量栄養源として使用できる。 これらの培地成分は微生物の成育を害 しない濃度であれば特に制限はない。
培地を網製した後、 適当な酸または塩基を用いて PHを 4 . 0〜6. 5の 範囲に 38整し、 ォー卜クレーブにより殺菌する。 菌の培養は、 1 0 ~ 3 5 て、 好ましくは 1 7〜3 0 °Cにて通常 3〜7曰 13、 通 51搜拌培餮、 振蓬培 養あるいは静 培養などによって行う。
また、 （n - 3 )系ドコサへキサェン酸および Zまたは（n - 6 )系ドコサぺ ンタエン酸の産生を促進するため、 （n- 3 )系ドコサへキサェン酸および /または（n - 6 )系ドコサペンタエン酸の前 IE体を培地に添加することが できる。 前駆体としては、 テトラデカン、 へキサデカン、 ォクタデカンな どの炭化水素、 テトラデカン酸、 へキサデカン酸、 ォクタデカン酸、 ォレ イン酸などの脂肪酸、 またはその ¾〔例えば、 ナトリウム埴または力リウ ム塩)、 脂肪酸エステル、 または脂肪酸を構成成分として含む油脂 (例えば、 ォリーブ油、 大豆油、 铕実油、 ヤシ油）などを挙げることができる力 こ れらに限られるものではない。
本発明の油脂を商品化が可能な収率で産生するための条件として、 次の ような条件が挙げられる。 シゾキトリウム« 3 1¾ 2 1株の培餮条件の検討 により、 該 S R 2 1株およびこれと同一の種に «するかもしくは実質的に 同一の菌学的性質を有する菌株は、 天然海水もしくは人工海水または 2分 の 1濃度の天然海水もしくは人工海水を含む培地において、 PH 3 . 5〜6 . 0、 望ましくは pH 4. 0〜4. 5で良好に生育することがわかった。
培地に添加する炭素源および窒素源は、 上記のような通常用いられるも のであつてよい。 窒素源は有機窒素または無機窒素のいずれであつてもよ く、 窒紫瀠度として一定になるようにすれば、 菌体の生育量、 脂 含 J6、 D H A、 D P Aの蓄積 Sに影響を与えずに有機窒 *と無機窒素の比率を変 えることができる。 これらを通常の微生物培養に用いる濃度で添加して良 好な生育が得られる。 リン酸塩を、 通常の微生物培養に用いられる湲度で 用いて良好な生育を達成することができる。
培地中の炭索源濃度とともに室素源濃度も同じ割合で增加させることで、 «濃度培養が可能である。 炭素源、 窒衆源の增加割合に応じて乾洪菌体量、 脂質量も增加し、 D HA、 D P Aの生産量も增加する。
高濃度培菜の際には、 培餮開始時に、 炭素源、 例えばグルコースの «度 のみを增加させておき、 窒素源、 例えばコーンスチープリカー/硫酸アン モニゥムについては通常の量を添加し、 グルコース消費量に応じて後から 不足する量を添加する方法を用いることもできる。 また、 高濃度培養の際 には、 培髮開始時に、 炭素源、 窒素源を低い濃度にしておき、 グルコース の消 «に応じて、 後から、 炭紫源、 窒索源を增加することもできる。
上記条件での培養は通常の搜拌式発酵植を用いて実施できる。 また、 気 泡塔型培餮装置も用いることもできる。 通気搜拌培養の条件としては通常 の微生物の培養条件を用いることができる。 通気撹拌培養においては、 回 転数を上昇させ、 溶存酸索量 'を增加させるとフラスコ培養に比べて、 翻著 な生育速度および菌体収量の増加が観察される。
培養初期においては、 特に溶存酸素量を高く維持することが生育速度の 增加に重要である。
このようにして、 培養物中に（n- 3)系ドコサへキサェン酸および（n- 6)系ドコサペンタエン K含有油胞を蓄積した菌体を、 培地 1 Lあたり 1 Og以上、 好ましくは 2 Og以上、 更に好ましくは 4 Og以上の高い濃度で 生産させることができる。 また、 この油脂は、 培養中期以降、 良好に菌体 内に蓄穣され、 乾燥菌体あたり 30重量％以上、 好ましくは 50重 上、 より好ましくは 60重量％以上とすることができる。
培養物から ffi体を集める方法は、 従来から用いられている遠心分離法や «：通などの方法が使用できる。
集められた菌体は、 例えば、 ダイノ ミルや超音波などにより破砕した後、 クロ口ホルム、 へキサン、 メタノール、 エタノールなどによる溶媒抽出を 行うことにより、 （n-3)系ドコサへキサェン酸および（n-6)系ドコサぺ ンタエン酸含有油脂を得ることができる。 乾燥菌体 lgあたり（n-3)系ド コサへキサェン酸および（n-6)系ドコサペンタエン酸含有油脂は約 0.3 g以上が好ましく、 0.6 g以上が更に好ましい。
本発明は、 このようにしてシゾキトリウム JKSR21菌株またはこれと 同一の種に属するかもしくは実質的に同一の菌学的性質を有する頃株から 得られる油脂に関するものであり、 該油脂の脂質特性は、 通常は次の通り である。 中性脂質の割合が Sめて高く、 全脂 K中の 90重量％以上を占め る。 中性脂 K中の脂肪酸組成は、 パルミチン酸 45〜55重量 、 (n-3) 系ドコサへキサェン酸 30〜40重量％、 （n-6)系ドコサペンタエン酸 5〜10重量％、 （n-3)系エイコサペンタエン酸 0〜1重 i%、 ァラキ ドン酸 0〜0.6重量％、 その他の脂肪酸 10〜20重量％程度である。 なおこの時、 DPAと DHAの比率は DPA1重 It部に対し、 DHAが 3 〜6重量部である。
また得られる中性脂質は、 約 85重 fi%以上、 好ましくは 90重量％以 上がトリグリセリ ドであり、 ジグリセリ ド、 モノグリセリ ドはほとんど含 まれていない。 また、 遊離ステロール、 ステロールエステルが 2〜3%含 まれている。 また、 上記脂肪酸組成を有する油脂中のトリグリセリ ドの分 子種は、 主に 14:0— 16:0— 16:0、 16:0-16:0— 16:0、 14:0— 16:0— 22:6、 16:0— 16:0— 22:5、 16:0— 1 6:0 - 22:6、 16:0 -22:5— 22:6、 16:0— 22:6— 22: 6である（脂肪酸残基の結合位置は限定されない)。 上記の 「14:0」 な る記載は、 14が脂肪酸の炭素数を、 0が脂肪酸の待つ二 S結合の数を表 すものであり、 例えば、 「16:0」 は炭素数 16で二重結合を持たない 脂肪酸を表す。
また、 該トリグリセリ ドには、 （n-3)系DHAがグリセリンの 2位の みに結合しているもの、 または、 （n-3)系 DHAがグリセリンの 1およ び 2位、 または 1および 3位に結合しているものが含まれている。
極性脂質としては、 フォスファチジルコリンが大部分を占め、 他にフォ スファチジルエタノールアミ ン、 フォスファチジルイノシトールなどを含 む。
(n-3)系ドコサへキサェン酸および（π-6)系ドコサペンタエン酸含有 油脂から（n-3)系ドコサへキサェン酸または（n_6)系ドコサベンタエン 酸を分離するには、 混合脂肪酸あるいは脂肪酸エステルの状態で、 常法に より、 例えば、 尿紫付加法、 ^却分雜法、 カラムクロマトグラフィ一法な どにより馕縮採取することにより行う。 また、 培養菌体などから採取した 油脂からの（n-3)系ドコサへキサェン酸および/または（n-6)系ドコサ ペンタエン酸含有卜リグリセリ ドの分離は、 常法により、 例えば冷却分離 法、 カラムクロマ卜グラフィ一法などにより行う。 本発明のシゾキトリウ ム ISSR21株を用いた場合、 不飽和脂肪酸としてァラキドン酸、 EPA がほとんど含まれていないため、 （n-3)系ドコサへキサェン酸と（n-6) 系ドコサペンタエン酸の濃維採取が容易に行え、 高濃度生産には好都合で のる。
本発明の油脂は、 種々の飼料または食品などの SJ品に（n -3)系 DH A および/または（n-6)系 DP Aの供給源として利用することができる。 本発明の油脂を製品に利用するにあたっては、 培養菌体から採取した油脂 またはそれを精製して得られる（n -3)系 DH Aおよび/または（n-6)系 DPAを使用することもできるが、 例えば、 該油脂を菌体培餮によって製 造する途中の培養液もしくはその殺菌した培養液、 または培養終了時の培 養液もしくはその殺菌した培養液、 またはそれぞれから集菌した培養菌体 もしくはその乾燥物、 または培養液もしくは菌体から該油脂を採取した後 の残澄も使用することができる。
さらに本発明は、 本発明の油脂を E合した動物用飼料に関する。 本発明 の動物用飼料としては、 ドッグフードゃキヤッ トフ一ドなどのぺッ トフ一 ド、 ¾などの家禽のための飼料、 豚や牛などの家畜のための飼料、 養魚用 飼料などが举げられる。 （n-3)系DHAぉょび（π-6)系DPAを含有す る油脂を産生、 蓄種した本発明の微生物の菌体または培養細胞は、 油脂が 菌体内に保護されていることによって酸化が防止され、 また加熱殺菌にも 安定であるため好ましい。 また、 微生物の培髮菌体から（π-3)系 DHA および（n-6)系 DP Aを含有する油脂を抽出した後の抽出残渣も本発明 の動物飼料に使用できる。 この抽出残澄は、 （n-3)系 DHAや（n-6)系 DP Aの他に、 蛋白質や灰分、 炭水化物を含んでいるため好ましい。 さらに本発明は、 本発明の油脂を産生、 蓄積した培養菌体または培養液 を含んでなる救小餌料生物用餌料に閲する。 従来、 魚貝類や甲殻類の養殖 において、 種苗（稚仔魚)生産には、 微小餌料生物（シォミズッボヮムシ、 ブラインシュ リンブなどの動物ブランク トン）が用いられており、 稚仔魚 の養殖には先ず れらの微小生物を養 ¾する必要がある。 これらの微小生 物を培養する場合には、 後にそれを餌料として摂取する稚仔魚の栄 S要求 性を考えて 小餌料生物に与える餌料が決められる。 本発明の油脂を含有 する培養菌体または培養液を微小餌料生物に与えることにより、 （n-3) 系 DHAおよび（n-6)系 DPAを含有し、 稚仔魚の栄養要求性を満足で きる微小餌料生物が得られる。
さらに本発明には、 上記の微小餌料生物を含有する角、貝類用餌料も含ま れる。
さらに本発明は、 本発明の油脂を、 （n-3)系 DHAおよびノまたは（n -6)系 DP Aを強化した家禽卵の生産に利用すること、 ならびに（n-3) 系 DHAおよびノまたは（n-6)系 DP Aを強化した卵黄油の製造に利用 することに関する。 本発明の（n-3)系 DH Aおよびノまたは（n-6)系 D PAを強化した家禽卵は、 上述の動物用飼料を採卵用家禽、 特に ¾に与え て飼育することによって産生される。 また、 このような家禽卵、 特に卵黄 から常法に従って油脂を抽出することによって、 本発明の（n-3)系 DH Aおよび/または（n-6)系 DP Aを強化した卵黄油が得られる。 また、 この卵黄油を乳児用雜製乳、 未熟児用 IS製乳、 幼児用食品、 妊産磚用食品 に添加することも本発明に含まれる。
さらに本発明は、 本発明の油脂を含有する乳児用绸製乳、 未熟児用 S®製 乳、 幼児用食品、 妊産綽用食品に関する。 特に育児用粉乳に関しては、 そ の成分をできるだけ人乳に近似させようとする試みが古くから行われてお り、 入乳中の主要成分である蛋白質、 脂肪、 糖質などのそれぞれに関して 入乳に類似化することが重要锞題となっている。 特に脂肪に関しては本来 母乳に含まれている高度不飽和脂肪酸が、 従来の育児用粉乳に欠乏してい ることが問題となっている。 なお、 母乳中の不飽和脂肪酸の組成について は、 種々の報告があり、 例えば、 Γ INFORM J [Vol. 6. No. 8. pp. 940-946 (1 995年 8月）]にはァメリ力人、 ヨーロッパ人およびァフリ力入の母乳中の髙 度不飽和脂肪酸組成が、 rJJPENJ [Vol. 13. No. 9. pp. 765-772 (1991)]に は日本人の母乳の鬲度不飽和脂肪酸組成が記載されている。
*近ではァラキドン酸および D H Aは同じく入乳中に含まれており、 乳 児の発育に役立つとの報告がある [ 「Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Research J , Elsevier Science Publishers, pp. 261-264. (1993)] 0 さらに、 胎児の身長や の発育における重要性が報告されている [Proc. Na tl. Acad. Sci. USA, 90, 1073-1077 (1993)、 Lancet. 344. 1319-1322 (19
94)]。
そこで、 人乳と IS製粉乳の脂肪酸組成の大きな違いであるァラキドン酸 および D H Aを調製粉乳に添加しょうとする動きがある。 このように D H Aを添加する目的で、 魚油添加の調製粉乳が上市されてきているが、 本来、 母乳中には魚油に含まれる E P Aはほとんど含まれていない。 最近の研究 により E P Aは未熟児の成育には不都合であることが明らかとなり [ 「Adv ances in Polyunsaturated Fatty Acid ResearchJ , Elsevier Science P ublishers, pp. 261-264. (1993)]、 米国特許第 5 3 7 4 6 5 7号には、 E P Aが少ない D H A含有細胞食用油とァラキドン酸含有細胞食用油を組み 合わせた幼児用 製乳添加用の油脂が開示されている。 しかし、 従来知ら れている调製乳や IS製乳添加用油脂において、 本来母乳に含まれている（n -3 )系 D HAおよび（n -6)系 DP Aを含有する油脂を使用することは全 く知られていなかった。
本発明のシゾキトリウム厲 SR21株またはこれと同一の種に ¾するか もしくは実質的に同一の菌学的性質を有する菌株由来の油脂は、 （n-6) 系 DP A IS量部に対して（n-3)系 DH Aを 3〜 6重量部含有しており、 E P Aをほとんど含有していないため、 さらに 85%以上がトリグリセリ ドであるため、 母乳に類似した育児用調製乳を製造するのに適している。 さらに本発明は、 本発明の油脂を配合した栄養補助食品、 老人用食品、 健康食品などの食品に関する。 本発明の食品は、 （n-3)系 DHAおよび または（n_6)系 DP Aを捕うことを目的とし、 健康維持などに用いら れる。 その形態は、 固形または液状の食品または喀好品のいずれであって もよい。 油脂を含む食品として、 例えば、 肉、 魚、 ナッツ等の天然食品、 中華料理、 ラーメン、 スープ等の调理時に油脂を加える食品、 天ぶら、 フ ライ、 油揚げ、 チャーハン、 ドーナッツ、 かりん糖等の熱媒体として油脂 を用いた食品、 バター、 マーガリン、 マヨネーズ、 ドレッシング、 チョコ レート、 即席ラーメン、 キャラメル、 ビスケッ ト、 クッキー、 ケーキ、 ァ イスクリーム等の油脂食品または加工時に油脂を加えた加工食品、 おかき、 ハードビスケッ ト、 あんパン等の加工仕上げ時に油脂を頃霧または塗布し た食品等を挙げることができる。 しかし、 本発明の食品は油脂を含む食品 に限定されるわけではなく、 例えば、 パン、 めん類、 ごはん、 菓子類（キヤ ンデ一、 チューインガム、 グミ、 錠菓、 和菓子)、 豆腐およびその加工品 などの農産食品、 澝酒、 薬用酒、 みりん、 食酢、 S油、 味唯などの発酵食 品、 ヨーグルト、 ハム、 ベーコン、 ソーセージなどの畜産食品、 かまぼこ、 揚げ天、 はんぺんなどの水産食品、 果汁飲料、 清涼飲料、 スポーツ飲料、 アルコール飲料、 茶などの飲料等も挙げることができる。
本発明の食品は、 所定 iの本発明の油脂を、 食品原料とともに配合し、 一般の製造法により加工製造することができる。 その配合量は剤形、 食品 の形態性状により異なり、 特に限定されるものではないが、 一般には食品 全量に対して 0. 0 0 1〜5 0重量％が好ましい。
さらに本発明は、 本発明の油脂を配合した機能性食品 (特定保健用食品 を含む）に関する。 本発明の機能性食品は、 （n - 3 )系 D H Aおよびノまた は〔 n - 6 )系 D P Aの有する生理活性機能を発揮することを目的とし、 機 能低下した状態を健康な状態に戻し、 維持するための、 または機能低下を 予防するための食品である。 形態としては医薬製剤の形態であってもよい し、 また、 例えば蛋白質 (蛋白質源としてはアミノ酸バランスのとれた栄 養価の高い乳蛋白質、 大豆蛋白質、 卵アルブミン等の蛋白質が *も広く使 用されるが、 これらの分解物、 卵白のオリゴペプチド、 大豆加水分解物等 の他、 アミノ酸単体の混合物も使用される）、 糖類、 脂肪、 微量元素、 ビ タミン類、 乳化剤、 香料等に本発明の油脂が配合された自然流動食、 半消 化態栄餮食および成分栄養食や、 ドリンク剤、 絰腸栄養剤等の加工形態を 筝げることができるが、 前記の飲食品の形態であってもよい。
本発明の機能性食品、 栄養補助食品は、 本発明の油脂を用いて、 散剤、 頼粒剤、 錠剤、 カプセル剤、 トローチ、 内用液剤、 想 »剤、 乳剤、 シロッ ブ剤、 ドリンク剤、 自然流動食、 半消化態栄養食、 成分栄養食、 経 §8栄養 剤等の形態を有する飲食品として製造することができる。 この際、 本発明 の油脂とともに 、ずれの栄萎成分あるいは機能性成分を配合してもよい。 また、 医師の指示に基づく栄養士の管理下に、 病院給食の網理の際に任患 の食品に本発明の油脂を加え、 その場で调整した食事を、 （π - 3 )系 D H Aおよびノまたは（n - 6 )系 D P Aが低下している患者に与えることもで さる。
さらに本発明は、 本発明の油脂を、 医薬品単体の製造に利用することに 関する。 即ち、 本発明の油脂を出発原料として、 （n - 3 )系 D H Aもしく は（n -6 )系 D P Aまたはこれらの绣導体を製造することに閻する。 （n - 3 )系 D H Aもしくは（n - 6 )系 D P Aまたはそれらの混合物は、 遊離の形 であっても、 また薬剤として許容されうる塩、 例えばナトリウム塩、 カリ ゥム塩、 リチウム塩、 または他のアルカリ金厲塩、 亜鉛埴、 カルシウム塩、 マグネシウム塩のような他の金厲の塩の形態や、 モノグリセライ ド、 ジグ リセライ ド、 卜リグリセライ ド、 低級アルコールのエステル、 リン脂質、 糖脂質、 アミ ド等の種々の形態であってもよい。 ここで低級アルコールと は戾素数 6以下の一価アルコールを指し、 メタノール、 エタノール、 プロ パノール、 イソブロパノール、 ブタノール、 ペンタノール、 へキサノール などを例示することができる。
さらに本発明は、 本発明の油脂を含有する化粧品に関する。 本発明の化 粧品は、 常法に従い本発明の油脂を、 通常の化粧料として知られる種々の 形態の基剤に配合して调製することができる。 化粧料の形態の例としては、 特に限定されないが、 例えば、 乳液、 クリーム、 化粧水、 パック、 分散液、 洗浄料等の化粧品とすることができる。 化粧料の基剤としては、 化粧料の 形態に応じた基剤、 例えば、 精製水、 低級アルコール類、 多価アルコール 類、 油脂類、 界面活性剤、 各種美容成分、 紫外線吸収剤、 增粘剤、 色素、 防腐剤、 香料等を用いることができる。
さらに本発明は、 本発明の油脂を含有する洗浄剤に関する。 本発明の洗 浄剤としては、 薬用、 非薬用にかかわらず、 身体を清浄に保っために一般 に用いられる石鹼、 シャンブー、 フユイシアルクリーム、 リンスなどの他、 入浴剤なども含むものであり、 また食器などの日常の家庭で用いる器具な どの洗剤であってもよい。 実施例
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく ¾έ明するが、 本発明はこれ ら実施例に限定されるものではない。
実施例 1 シゾキトリウム JR S R 2 1株による油脂の生産（1 ) フラスコに 5 0 %濃度の人工海水（トロビックマリン） 1 Lを入れ、 次い で、 表 2に示した量の炭素源（グルコースまたはグリセロール）および窒素 源（コーンスチープリカー ；以下、 C S Lと略記することもある）を添加し て培地を調製した。 これに、 シゾキトリウム R S R 2 1株を接種して、 2 6 で 5日間、 振蚤培養を行った。
得られた培養物 2 mlを採取して遠心分離法で菌体を集めた。 この菌体を 洗浄し、 オーブン中、 1 1 0てで 5時間乾燥することにより乾燥菌体を得 た。 この乾煥菌体の重量を測定して、 培地 1 L当たりの菌体量を求めた。 この桔果を表 2に示す。
次いで、 常法に従って、 乾燥菌体から直接的な油脂の抽出および脂肪酸 メチルエステルの绸製を行った。 即ち、 乾燥菌体をねじ口試験管に入れ、 これに 1 0 %塩酸メタノールおよびジクロロメタンを加え、 6 0 の温浴 中で 3時間加熱して反応させた。 次いで、 へキサンにて脂肪酸メチルエス テル成分を抽出し、 ガスクロマトグラフ分析により脂肪酸メチルエステル 成分の脂肪酸組成を求めて、 ドコサへキサェン酸（D H A )の含有割合を求 めた。 また、 前記の反応の際に既知量の内部標準物質を添加することによ る内部標準法にて、 ガスクロマ卜グラフ分析により検出された脂肪酸メチ ルエステル置から菌体中に含まれていた全脂肪酸 Sを、 また、 ドコサへキ サェン酸メチルエステル検出 *から D H A生成童を求めた。 このようにし て、 培地 1 L当たりの全脂肪酸量、 乾燥菌体当たりの脂肪酸含有割合、 全 脂肪酸中の DHA含有割合、 および培地 1 L当たりの DHA量を求めた。 これらの結果を表 2に示す。
なお、 DHAは、 ガスクロマトグラフ質量分析法により標準物質との比 較を行って確 Ιδした。
表 2 ま験 炭素源 炭素源 CSL 菌せ畺 全 dbfl flgSoW/Ji 脂肪酸 DHA Γ) H A
N "oリ《 添加量 添加量 m wl JEL 含有 含有 醫
割合 割合
(g) (ε) (o)
iSノ Sノ (重量％) (重量％) 、fcン
*1) *1) *2) *3) *1)
101 ダルコ-ス 60 10 24.2 14.1 58.0 26.8 3.77
102 グルコ-ス 90 10 28.0 13.2 47.0 25.7 3.38
103 グ A3-ス 120 10 27.7 10.5 37.7 29.0 3.03
104 グルコース 60 20 26.9 8.2 30.3 29.7 2.43
105 グルコース 90 20 35.9 14.1 39.3 29.7 4.20
106 グリセ D-A 60 10 24.2 12.9 53.2 26.8 3.45
107 グリセ 0-ル 90 10 21.9 11.9 54.3 25.5 3.04
108 グリセ 60 20 28.3 11.3 39.9 28.0 3.16
109 グリセ 0-ル 90 20 35.4 13.9 39.3 26.5 3.68
110 グリセ D—ル 120 20 35.6 14.6 41.0 28.4 4.15
*1) 培地 1 L当たりの量
*2) 乾燥菌体当たりの含有割合
*3) 全脂肪酸中の含有割合 培地 1 L当たりの炭紫源量が 60〜12 Ogと高い場合であっても、 良 好な菌体増殖が行われ、 21.9〜35.9g/Lの菌体が得られた。 また、 培地 1 L当たりの脂肪酸量は 8.2〜14.6gであり、 乾燥菌体当たり 3 0.3〜58.0重量％の高い含 Sで DH A含有脂肪酸が蓄積されているこ とが示された。 さらに、 全脂肪酸中の DHAの含量は、 25.5〜29.7 重量％と高く、 培地 1 L当たりの DHAの生産量が 2.43-4.20gと Sいことが示された。 実施例 2 シゾキトリウム厲 SR 21株による油脂の生産（2) フラスコに、 50%濃度の人工海水 1L、 炭素源としてグルコース 60 g、 リン酸一力リウム 4.0g、 酵母エキス 1.0g、 有機窒素源としてコー ンスチープリカー 1.0gを入れ、 さらに無璣窒紫源として硝酸アンモニゥ ムを表 3に示した量で添加することにより培地を調製した。 これにシゾキ トリウム «SR21株を接種し、 25°Cで 4曰間、 振 »培養を行った。 実施例 1と同様の方法で培養後の培地 1 L当たりの菌体量、 培地 1 L当 たりの全脂肪酸 fi、 乾燥菌体当たりの脂肪酸含有割合、 全脂肪酸中の DH A含有割合、 および培地 1 L当たりの DHA量を求めた。 これらの結果を 表 3に示す。
表 3 実験 窒素源 窒素源 菌体量 全脂肪 脂肪酸 DHA DHA
No. 添加量 酸量 含有 含有 A
割合 割合
(g) (g) (g) (重量 ）（重量 ） (g)
*1) *1) *2) *3) *1)
201 硝酸了ンモニゥム 0.6 14.6 7.6 51.8 30.7 2.32
202 硝酸了ンモニゥム 1.0 19.2 7.4 38.8 30.0 2.24
203 酢酸了ンモニゥム 0.7 17.8 8.1 45.3 29.1 2.35
204 酢酸了ンモニゥム 1.2 23.0 9.2 40.1 32.9 3.03
*1) 培地 1L当たりの量
♦2)乾燥菌体当たりの含有割合
*3) 全脂肪酸中の含有割合 これらの桔果から、 SR21株は窒紫源として無機窒衆を使用しても良 好に增殖できること、 および SR21株は高い DHA生産性を有すること が示された。 実施例 3 シゾキトリウム JSSR 21株による油脂の生産（3)
グルコース 60g、 ボリぺブトン 20g、 酵母エキス 1 Ogおよび 50% «度の人工海水 1 Lからなる培地（A)、 またはグルコース 90g、 ボリべ プトン 10g、 コーンスチープリカー 1 Ogおよび 50%濃度の人工海水 1 Lからなる培地（B)を用いて、 ジャーファーメ ンター（培養槽容量 5 L、 培地 i3 L)での培 Sを行った。 培養は、 培 *温度 25て、 通気量 0.5w m、 搜拌速度 20 Orpmとして行った。
培養後、 遠心分離法により菌体を集めて凍桔乾燥し、 重量法により培地 1L当たりの菌体 Jtを求めた。 その結果を表 4に示す。
次いで、 この乾煉菌体にクロ口ホルムノメタノール（2： 1、 Vノ V)混合 液を加え、 ガラスビーズの存在下でホモジナイズすることにより、 菌体の 破砕と油脂の抽出を行った。 抽出液を Folch法により洗浄した後、 溶媒を 留去して精製油脂を得、 その重量を求めた。 得られた油脂の一部について 常法により脂肪酸メチルエステルを調製し、 ガスクロマトグラフ法により 油脂 iおよび全油脂中の DHA含有割合を求めた。 DHA生成量は、 油脂 生成量に DH A含有割合を乗じた値として求めた。 これらの結果を表 4に 示す。 表 4 実験 培地 培養曰數 菌体 i 全油脂 油 ½ DHA DHA
No. 含有割合 含有割合 量
(曰） ω (g) (重量 ） （重 (g)
*1) *1) *2) *3) *1)
301 (A) 7 35.0 8.7 24.8 43.7 3.8 302 (B) 14 39.6 21.2 53.5 34.0 7.2
*1)培地 1 L当たりの量
*2)乾燥菌体当たりの含有割合
*3) 全脂肪酸中の含有割合 また、 この DH A含有油脂の脂肪酸組成をガスクロマトグラフ法により 分析した結果を以下の表 5に示す。 表 5. I 肪酸組成 (重量 ） 実験 14:0 15:0 16:0 17:0 18:0 20:4 20:5 22:5 22:6
No. (AA) (EPA) (DPA) (DHA)
301 1.6 10.1 25.0 1.8 1.0 0.4 11.1 43.7
302 2.8 6.7 44.6 1.6 1.3 0.4 8.5 34.0 以上の結果から、 シゾキトリウ厶厲 SR21株は、 実用的な培養法であ る通¾搜拌培養でも良好な増殖を示すとともに、 DH A含量の高い油脂を 効率よく蓄積することが示された。 DH Aの生産: ftは、 最大で培地 1 L当 たり 7.2gに違し、 その生産性はきわめて優れている。
また、 表 5から、 高度不飽和脂肪酸としては、 ドコサへキサェン酸（D HA)が極めて高い濃度で含有され、 さらにドコサペンタエン酸（DP A) も含有されている力く、 ァラキドン酸（AA)およびエイコサペンタエン酸（E PA)をほとんど含まないことが示された。 從つて、 それらの脂肪酸を 1 0重量％前後含んでいる魚油と比べて、 DH Aの濃縮分離操作が容易であ るということが示された。 実施例 4
実施例 1〜3により得られた油脂に含まれるドコサへキサェン酸（DH A)、 エイコサペンタエン酸（EPA)などの（n- 3)系脂肪酸それぞれの含 有割合と、 全（ n - 3：)系脂肪酸に対する D H Aの割合を表 6に示す。 シゾキトリウム JR S R 21株より得られる D H A含有油脂は魚油に多く 含まれる EPAの含有割合が 1.0重量％以下であり、 また、 全（n-3)系 8S肪酸に対する DHA含有割合が 98重量％以上である。 これらのことは, 魚油が EPAを 10重量％前¾含んでいることに比ぺると、 該菌株が DH Aの濃縮、 分離および精製の操作を容易にする利点を持っていることを示 すものである。
表 6. (n-3)系脂肪酸組成 (重量 ） 実験 Ε Ρ A D Ρ A DHA 全（η-3)系脂肪酸に
No. 対する DHAの割合
101 0. 3 0. 1 26. 8 π o
, 5
102 0. 2 Τ r 25. 7 y y .
103 0. 2 0.1 29. 0 98. 9
104 0. 1 0.1 29. 7 y y . δ
105 0. 3 丁 r 29. 7 98. 9
106 0. 3 0.1 26. 8 98. 7
107 0. 1 0.1 25. 5 99. 2
108 o o
0. 3 0. 1 28. 0 5
109 0. 1 0. 1 26. 5 99. 4
110 0. 3 0.1 28. 4 98. 8
201 0. 3 0. 1 30. 7 98. 7
202 0. 5 0.1 30. 0 98. 0
203 0. 2 0. 1 29. 1 99. 0
204 0. 2 0.2 32. 9 98. 8
301 0. 4 0.2 43. 7 98. 6
302 0. 4 0.1 34. 0 98. 6
Tr ： 0.05 %未満 参考例 既知微生物との比較
既知の微生物と、 本発明のシゾキトリウム厲 SR21株との DHA生産 能の比铰を行った。 表 7に、 微生物としてスラウストキトリウム 'ァウレゥム（ATCC 3 4304)を用いて培養を行って DHAの生産を行った塲合 [P.Bajapai. P. K. Bajapaiおよび O.Pjard. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35： 706 (1991)、 A. Kendricおよび C.Eatledge, Lipids 27： 15 (1992)、 および P. K. Bajapai, P.Bajapaiおよび O.P.ffard. J. Am. Oil Chem. Soc. , 68： 509 (1991)を引用]、 微生物としてジャボノキトリウム sp. (ATC C 28207)を用いて培養 を行って DHAの生産を行った場合（特開平 1一 199588号公報を引 用）、 および徼生物としてシゾキトリウム，ァグレガタム（ATCC282 09 )を用いて培養を行つて DHAの生産を行つた場合 [A. Kendricおよび C. fiatledge. Lipids 27： 15 (1992)を引用]、 ならびに、 本発明のシゾキ卜 リゥム JSSR21株を用いて培養を行って DHAの生産を行った上記の実 験 No.105、 204および 302の、 培地 1 L当たりの菌体量、 乾燥菌 体当たりの油脂または脂肪酸含有割合、 全脂肪酸中の DH A含有割合およ び培地 1 L当たりの DH A量を示す。
表 7. 既知微生物との D HA生産能の比較
¾∑生物 引用文献 菌体量 油脂また DHA EPA Ή TJ Λ
U∑± i または は脂肪酸 含有 含有 逢 実験 No. 含有割合 割合 割合
(E) (重 S%) (重 ¾%) (重量％) 、Dlgノ
*1) *2) *3) *3) *丄 ノヤ^ / τ Γリソ o .
tAlしレ iJ U \ ) (a) 1.7 8.2 30.0 6.4 An スラウストキトリウム ·了ウレゥム
Λ1しし d4dU4 (b) 5.0 20.2 51.0 記載な CI 1 し ΰ丄丄 スラウストキ μ)クム ·τウレゥム
CO 3.8 16.5 48.5 3.6
Aフワ At Tトリクム · fヮレヮム
(ATCC34304) (d) 4.0 10.0 24.1 9.3 96 シゾキ り アグレガタム
(ATCC28209) (d) 1.4 1.7 6.0 6.1 1
//キトリウム厲 SE21株 No.105 35.9 39.3 29.7 0.3 4200 シ ·/キトリウム JRSR21株 No.204 23.0 40.1 32.9 0.2 3030 シ '/キトリウム) KSB21株 No.302 39.6 53.5 34.0 0.4 7200
*1)培地 1L当たりの S
*2)乾燥菌体当たりの含有割合
( S R 21株：脂肪酸含有割合；他の菌株：油 13旨含有割合）
*3) 全脂肪酸中の含有割合
(a) 特開平 1-199588号公報 (b) P. .Bajapai. P. Bajapaiおよび 0. P. Ward, J. Am. Oil Chera. Soc.. 68： 509 〔1991)
(c) P. Bajapai. P. K. Bajapaiおよび 0. P. Ward, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 35： 706 (1991)
〔d) A.Kendricおよび C.Batledge, Lipids 27: 15 (1992) 表 7に示したように、 本発明のシゾキトリウム SR21株を用いて培養 を行うと既知の微生物と比較して培地当たりの菌体量が非^に多く、 SR 21株は增殖性が優れるということがわかる。 また、 本発明のシゾキトリ ゥム S R 21株は既知の欲生物と比較して油脂の含有割合も非常に高い。 また、 本発明によれば、 全脂肪酸中の DHA含有割合も 30重量％と高い ことから、 培地 1 L当たりの DHA量は、 従来公知の微生物を用いた埸合 と比較して 10〜100倍程度と高い値となり、 SR21株はきわめて高 い DHA生産能を有することが明らかである。 さらに、 既知の微生物によ れば、 EP A含有割合が数重量％の油脂が »られるのに対し、 シゾキトリ ゥム JSSR21株によれば、 £ 八含有割合が0.5重量％以下と極めて 低い油脂が谆られることがわかる。 寒施例 5_ シゾキトリウム JRSR 21株による油脂の生産（4)
グルコース 60g/L、 コーンスチープリカー 0.5gZL、 リン酸カリ ゥム 3gZL、 硫酸アンモニゥム 2 gZLおよび 50%人工海水からなる培 地を用いて、 ジャーフアーメンター（5L容量、 培地量 3L)により約 60 時間培養を行った。 培養条件は、 培養 a度 28°C、 通気量 1· Ον.ν.η.、 撹拌速度 30 Orpin, 10%水酸化ナトリウムにより pH 4にコントロール して亍つた。 培養終了後、 遠心分離により集菌し、 凍結乾燥後に秤量することにより、 培地 1 Lあたり約 2 Ogの乾燥菌体を得た。
油脂の抽出は、 常法に従い、 乾燥菌体にクロ口ホルム メタノール（2： 1、 vZv)を混合し、 ガラスビーズの存在下でホモジナイズすることによ り行った。 6 Ogの乾燥菌体より得られた粗抽出油脂は 36gであった。 こ の粗抽出油脂を、 常法に従い、 メチルエステル化し、 ガスクロマトグラフィ 一により脂肪酸組成を調べたところ表 8に示す組成であつた。 表 8. 粗抽出油脂中の脂肪酸組成 脂肪酸 14:0 15:0 16:0 17:0 18:0 20:4 20:5 22:5 22:6 n-6 n-3
AA EPA DPA DBA
含有割合 (X) 2.3 5.8 44.6 2.0 1.4 0.6 0.8 8.4 34. Q 実施例 6 ドコサペンタエン酸の単離および [S]定
粗抽出脂肪酸の高度不飽和脂肪酸の濃度を上昇させるため、 常法に従い、 尿素付加を行って飽和 肪酸を除去した。 即ち、 実施例 5に示した方法で ίδ製した粗抽出脂肪酸約 9gに尿 ¾20g、 メタノール 20 Omlを加え、 6 0てで 3時間加熱した後、 10てまで徐冷した。 析出した尿素結晶を ¾過 後、 非結晶溶液分を濃箱し、 尿 ¾非付加物約 4 gを得た。 この尿索非付加 物の脂肪酸組成は、 ドコサペンタエン酸 17.7%、 ドコサへキサェン酸 77.9%であり、 その他の脂肪酸の混入率は 5%以下であった。
上記処理によって得た尿索非付加物につき、 液体クロマトグラフィー（0 DSカラム、 移動相 ァセトニトリル：水 =97.5 ： 2. 5、 検出 UV) を行ってドコサペンタエン酸を分取した。 これにより、 純度 99%以上の ドコサペンタエン酸を約 3.2g得た。
また、 ドコサペンタエン酸の二重結合位置を決定するため、 常法に従い, 脂肪 Kをピコニルエステル锈導体にした後、 GCZ ISで解析した。 即ち、 上記で得られた尿素非付加脂肪酸 20 /igにチォニルクロライ ド 1 OOj l を加え、 1分間室温に放置した後、 窒素気流下で乾燥させた。 これに 10 % 3-ピリジルカルボニル 10 1を加え、 1分間室温に放置した後、 GC ZMSで分析を行った。 この結果、 図 4に示したように、 SR21株が生 産するドコサペンタエン酸（22 ： 5)は、 不飽和結合を Δ4.7.10.1 3.16の位置に持つ（n-6)系不飽和脂肪酸であると同定された。 実施例 7 シゾキトリウム « S R 21株の脂肪酸分析
粗抽出油脂は、 実施例 5により得られたものを用いた。 この粗抽出油脂 を、 常法に従い、 へキサンと 90%メタノールによる液ノ液分配により、 中性脂質と極性指質を分離した。 得られた脂質量はそれぞれ極性脂 K1. 8g、 中性脂質 32.9gであった。 この脂質を加水分解後、 メチルエステ ル化し、 ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した。
分析桔果は下記の通りである。
表 9. 粗抽出油脂中の極性/中性脂質組成
t t 極性脂質（％) 中性脂質（％)
14:0 1.3 3.2
15:0 0.6 1.0
16:0 32.4 49.2
0.2 0.6
0.6 0.8
10.6 7.9
Figure imgf000043_0001
実施例 8 シゾキトリウ厶厲 SR21株の脂質分析
実施例 7で得られた中性脂質と極性脂質を、 常法に従い、 薄層クロマト グラフィ一により分析を行った。 発色は硫酸を用いて行い、 得られるスボッ 卜の同定は各標準脂質との Rf値により決定した。 中性脂 は 90%以上 がトリグリセリ ドであった。 また、 極性脂質は、 大部分がフォスファチジ ルコリ ンであり、 次いでフォスファチジルエタノールアミ ン、 フォスファ チジルイノシトールであった。
また中性脂質中のトリグリセリ ドを、 常法に従い、 液体クロマ卜グラフィ 一（0DSカラム、 移動相アセトン：ァセトニ卜リル =3 :2、 示差屈折検 出計）により分子種を分離し (図 5)、 分取後、 加水分解メチルエステル化 し、 ガスクロマトグラフィーにより胙肪酸残基を決定した。
桔果は下妃の通りである。 表 10. 中性) !SS中のトリグリセリ ドの分析 一— *ク 分子種 t比（％)
No.
1 14 ：0 -16:0-16 :0 3. 4
2 16 :0 -16:0-16 :0 8. 0
Figure imgf000044_0001
7 16 :0 -22:6-22 :6 16. 9 この 7種類のトリグリセリ ドが、 全トリグリセリ ド中の 70重量％以上 を占めた。 このトリグリセリ ドの β大分子種は、 16:0— 16:0— 22 :6であり、 全トリ リセリ ドの約 27重量％を占めていた。 実施例 9 トリグリセリ ドの)! &肪酸残基結合位置決定
実施例 8で分画したトリダリセリ ド (分子種 16:0— 16 :0— 22:6) を、 乾燥後、 1.3位に特異的なリパーゼで処理し、 得られる 2—モノグ リセリ ドをトリメチルシリル化した後に GCZMSにより脂肪酸残基を決 定した。 リパーゼ処理は、 50mM酢酸緩衝液 (pH5.5)2ml、 リパーゼ 1000単位、 35 、 30分間行った。 反応終了後、 エーテルにより抽 出し、 市販のトリメチルシリル化剤を用いて、 2—モノグリセリ ドをトリ メチルシリル化した。 結果は図 6に示したように、 22:6が桔合したモ ノグリセリ ドの分子量に相当するフラグメントビークが得られ、 本トリグ リセリ ドは 22:6の脂肪酸残基がグリセ口ール骨格の 2位に桔合してい る、 16:0— 22:6— 16:0であった。 実施例 10 窒素濃度の影 W
培地 1L当たり、 60gのグルコース、 3 gのリン酸二水素カリウム、 0. 5gのコーンスチープリカーを加えた 2分の 1濃度の人工海水培地に表 1 1に示す濃度で硫酸アンモニゥムを添加し、 この培地 3 Lを 5 L容«のジャ 一ファーメンターに入れた。 この培地に、 実施例 5と同様に調製した前培 養液 60mlを添加し、 培養を行った。 培養は 28eC、 1ν.ν.ι、 30 Orp m、 pH 4.0の条件で行った。
グルコースの消 S後に、 培養液 100 mlを採取して遠心分離法で菌体を 集めた。 この菌体を洗浄し、 凍結乾洪装置によって乾燥菌体を得た。 この 乾燥菌体の重量を測定して、 培地 1L当たりの菌体量を求めた。
次いで、 実施例 5と同様の方法で培地 1L当たりの菌体量、 培地 1L当 たり全脂肪酸含有割合、 および培地 1 L当たりの DHA量、 DPA量を求 めた。 その結果を表 11に示す。
表: 分析結果
(NH SO* 菌体量 全脂肪 脂肪酸 DHA含有 DHA量 DPA含有 DPA量 酸量 含有割合 割合 割合
(g) (g) (重量 X) (重量 X) (g) (重 iX) (g)
0.5 6.5 4.8 74.5 31.4 1.5 7.9 0.38
1.0 8.6 6.0 69.8 32.0 1.9 8.0 0.48
2.0 15.3 9.1 59.6 35.0 3.2 8.8 0.81
3.0 20.5 10.7 52.2 35.8 3.8 8.9 0.90 硫酸アンモニゥム濃度を 2.0〜3. OgZLとした場合に良好な生育を 示した。 また、 琉酸アンモニゥム濃度を 0.5〜1. Og/Lとすると脂肪 酸含有割合が 70%以上に增加していた。 実施例 11 有機窒素源と無 *窟紫源の影 W
培地 1 L当たり、 6 Ogのグルコース、 3gのリン酸二水素カリウム、 0. 5 gのコーンスチープリカーを加えた 2分の 1濃度の人工海水培地に、 表 12に示す濃度で室索源の «Κを一定にして、 有機室索源としてコーンス チープリカー（C SL)と無機窆衆源として硫酸アンモニゥ厶の 2つの割合 を変えて添加した。 この培地 3Lを 5L容積のジャーファーメンターに入 れ、 実施例 5と同様に S3製した前培養液 6 OJDIを添加し、 実施例 5と同一 の条件で培養を行った。
グルコースの消黄後に、 培養液 10 Onlを採取して遠心分離法で ¾体を 集めた。 この菌体を洗浄し、 凍桔乾燥装 Bによって乾燥菌体を得た。 この 乾 »苗体の重量を測定して、 培地 1 L当たりの菌体量を求めた結果を表 1 2に示す。
次いで、 実施例 5と同様の方法で培地 1 L当たりの菌体量、 培地 1 L当 たりの全脂肪酸含有割合、 および培地 1 L当たりの DHA量、 DPA量を 求めた。 その桔果を表 12に示す。 表 12. 分析結果 実験 CSし 硫酸 菌体 全脂肪 脂肪酸 DHA含 DHA DPA含 DPA
No. アンモニ 量 酸量 含有割 有割合 量 有割合 量
(g) ゥム (g) (g) (g) 合 (X) (重 SX) (g) (重量 X) (g)
501 0.7 2.0 21.0 14.8 70.5 31.8 4.7 8.1 1.2
502 2.0 1.7 20.0 13.7 68.5 31.7 4.3 7.3 1.0
503 3.3 1.3 23.2 14.5 62.4 30.7 4.5 6.9 1.0
504 5.3 0.7 21.0 13.7 68.5 29.9 4.3 8.0 1.1
505 8.0 0 20.6 13.4 65.2 27.9 3.8 6.7 0.9 いずれの組成比においても良好な生育を示し、 本菌は有機窒素、 無機窒 素の区別なく消 βして生育する。 また、 DHA、 DPAの生産性にもあま り変化は見られない。 実施例 12 高濃度培養
培地 1 L当たり、 3 gのリン酸ニ水素力リゥムを加えた 2分の 1濃度の 人工海水培地に、 表 13に示す濃度でグルコース、 コーンスチープリカー, 硫酸アンモニゥ厶を添加した。 この培地 3 Lを 5 L容ジヤーファーメンタ 一に入れ、 実施例 5に示す培養条件で培養を行った。 グルコースの消費後に、 培養液 1 O ODIを採取して遠心分離法で菌体を 集めた。 この菌体を洗浄し、 凍桔乾燥装置によって乾燥菌体を得た。 この 乾燥菌体の重量を測定して、 培地 1 L当たりの菌体量を求め、 次いで、 実 施例 5と同搛の方法で培地 1 L当たりの菌体量、 培地 1 L当たりの全脂肪 酸量、 乾燥菌体当たりの脂肪酸含有割合、 全脂肪酸中の DHA、 DPA含 有割合、 および培地 1 L当たりの DHA、 DPAiを求めた。 その結果を 表 13に示す。 表 13. 分析結果 実驗 1 CSL硫酸 培養 乾燥 全脂 脂肪酸 DHA DHA DPA DPA No. コ-ス 量 : 時間 菌体 肪酸 含有 含有 量 含有 量
量 ゥム量 量 i 割合 割合 （g) 割合 （g)
(g) (g) (時間) (g) (g) (S量 X) (重量 X) (重量
601 60 0.7 2.0 60 21.9 14.8 67.6 34.5 5.11 6.8 1.01 602 80 0.93 2.7 84 32.0 21.9 68.6 34.7 7.62 7.1 1.55 603100 1.17 3.3 92 37.7 31.1582.6 33.3 10.37 6.3 2.03 60 120 1.4 4.0 108 48.1 37.3 77. δ 35.6 13.26 7. 2.76 605150 1.75 5 120 59.2 41.6 70.3 37.3 15.52 8.2 3.43 これらの桔果から、 本菌は炭索源と窒素源濃度を增加させることにより、 グルコース濃度の增加に応じて、 DHA、 DP Aの生産量も增加すること が明らかとなった。 実施例 13 搜拌数の影響
実施例 5と同一の培地組成および培養条件で、 培養槽の攬拌數を 100 rpDiおよび 30 Orpmにして培養を行った。 グルコース消 g時間が、 100 rpmでは 100時間程度かかっていたのが、 300 rpraでは約半分の 50〜 60時間となった。 一方、 培地 1 L当たりの脂肪酸量、 DHA量、 D_PA 量については 30 Orpmの方がわずかに多かった（表 14)。 表 14. 分析桔果 回耘数 菌体 * 全脂肪 脂肪酸 DHA含 DHA量 DPA含 DPA量
酸量 含有割 有割合 有割合
(rpm) (g) (B) 合 0 (X) (g) (X) (8)
100 15.3 9.1 59.6 35.0 3.2 8.4 0.76
300 20.5 10.7 52.2 35.8 3.9 8.5 0.91 実施例 14
実施例 12に従って製造した培養液を集め、 フィルターブレスにて液を 除去し乾燥させ、 水分 10%含有の菌体 1 Okgを得た。 この菌体を常法に 従いへキサン抽出し、 へキサンを除去した後、 5.9kgの油脂を得た。 ま たへキサン抽出後の菌体を乾通させへキサンを除去した後、 3.9kgの油 抽出残菌体を得た。 この油脂には、 35%の DHAと 8%の DP Aを含有 していた。 また油抽出残菌体には、 1.2%の DHAと 0.3%の DPAを 含有していた。 実施例 15
ィザブラウン種 200食日の採卵珐 1群 5羽として 2群にわけた。 1群 は対照群として通常の飼料で 25日間飼宵した。 残りの群は実験群として、 実施例 14により得られた油脂を毎日 5gを通常の飼料に加え 25日間飼 育した。
25日目の卵 3個分の卵の重量、 卵黄重量、 DHA濃度、 DPA濃度、 卵黄の照り、 卵黄の味を測定した。 桔果を表 15に示す。 油脂を加えて飼 育することにより、 明らかに卵黄中の DHA、 DPA含有率は增加した。 また、 照りがよく、 とろける感じの卵黄を得ることができた。 表 15 実驗群 対照群
卵の重 i(3個分) g 213 211
卵黄！:量 s 55 52
DHA(%) 3.5 1.5
DPA(¾) 0.8 痕跡量
卵黄の照 照りが良い ざらざらした感じ 卵黄の味 とろける感じ 水っぽい 実施例 16
ィザブラウン種 200食日の採卵 »を 2群にわけた。 1群は対照群とし て 5羽を通常の飼料で 25日間飼育した。 残りの群は実 «群として 3羽を. 通常の飼料を対照群より 50g減じ、 その分を補うために実施例 14によ り得られた油抽出残菌体 50gを加え 25曰間飼育した。 25曰目の卵 3個分の卵の重量、 卵黄重量、 DHA濃度、 DP A濃度、 卵黄の照り、 卵黄の味を測定した。 結果を表 16に示す。 油抽出残菌体を 加えて飼育することにより、 明らかに卵黄中の DHA、 DPA含有率は增 加した。 また、 照りがよく、 とろける感じの卵黄を得ることができた。 表 16 対照群
卵の重量（3個分) g 212 2
卵黄重貴 g 53 52
DHA ) 2.1 5
DP A(%) 0.2 痕跡量
卵黄の照 照りが良い ざらざらした感じ 卵黄の味 とろける感じ 水っぽい 実施例 17 (n-6)系ドコサペンタエン酸および DHA含有ミルクの绸 製
粉末ミルク 100 gに、 実施例 15で得られた卵黄から常法に従つて抽 出した (n-6)系ドコサペンタエン酸および DHA含有卵黄油 [(n-6)系ド コサペンタエン酸 0.8、 DHA3.5%含有] 6gを S合することにより（n -6)系ドコサベンタエン酸および DH A含有ミルクを S3製した。 このミル クの全脂肪酸に対する（n-6)系ドコサペンタエン酸の割合は 0.19%、 DHAの割合は 0.84¾となり、 従来の IS製乳に不足していた（n-6)系 ドコサペンタエン酸および DH Aを母乳に近づけることかできた。 塞施例 18 (n-6)系ドコサペンタエン酸および DH A含有ミルクの 调製
実施例 7で得られた粗抽出油脂を、 常法に従い、 へキサンと 90%メタ ノールによる液ノ液分配により、 中性脂 と極性脂質とに分離し、 （n-6) 系ドコサペンタエン酸および DHAを含有する中性脂質 [(π-6)系ドコサ ペンタエン酸 7.9、 DHA33.7%含有]を得た。 この油 0.6gを、 粉 末ミルク 100gに混合することにより（n-6)系ドコサペンタエン酸およ び D H A含有ミルクを綢製した。 このミルクの全脂肪酸に対する（ n - 6 ) 系ドコサペンタエン酸の割合は 0.19¾、 011八の割合は0.80%とな り、 従来の綢製乳に不足していた（n-6)系ドコサペンタエン酸および D H Aを母乳に近づけることができた。 実施例 19 (n-6)系ドコサペンタエン酸および DHA含有セブセル の 製 表 17. カプセル ゼラチン 70.0%
グリセリン 22.9%
パラォキシ安息香酸メチル 0.15%
パラォキシ安息番酸ブ口ピル 0.51%
水 ■
計 00% 上 I己成分からなるソフ トカブセル剤皮の中に、 実施例 12で得られた（π -6)系ドコサペンタエン酸および DHA含有微生物オイルを 30 Omgを常 法により充填し、 ソフ トカブセル剤を得た。 実施例 20 (n-6)系ドコサペンタエン酸および DHA含有飲料の调 製
容器中に市販のブレーンョーグル卜 5 Ogと実施例 12で得られた（n- 6)系ドコサペンタエン酸および DHA含有微生物オイル 50%と^ーシ クロデキストリン lgを入れ、 これを約 3分間扰拌して乳化させ、 WZO ZW、 OZWZO型などが混在するェマルジヨンを得た。 実施例 21 DH Aと DP Aを含有する微小餌料生物用餌料の製造 実施例 5に従つて製造した培養液を集め、 フィルターブレスにて液を除 去し菌体を得た。 得られた菌体を 105でで 3時間、 加熱乾煤し、 コーヒ 一ミルにより、 パウダー化した。 得られたパウダーまたはコントロールと してバン酵母を用いて、 ヮムシ、 およびブラインシュリンプの培養を行つ た。
培養方法は、 海水 200Lを 300Lの水槽に入れ、 通気条件下、 23 で、 ヮムシは lnlあたり 100個体、 ブラインシュリンプは lmlあたり 20個体放養し、 飼料として、 それぞれ lg/10β個ヮムシ 1曰、 lg/ 10s個ブラインシュリンブ 1曰になるように上 Kの ¾体パウダーまたは パン眯母を与えた。 ヮムシまたはブラインシユリンプにこれらを摂取して 生育し、 3曰目にサンプリングして構成 肪酸組成を ¾ベた桔果、 表 18 および表 19のようになった。
結果が示す通り、 ヮムシにおいてもブラインシュリンブにおいても、 D HA、 DPAの蓄積がパン醉母より好成練であった。 表 18. ヮムシ
½肪酸組成 （％)
DHA DP A
コン卜 σール (パン眯母) 0 0
驗 (SR21株） 26 δ 表 19. ブラインシュ Vンプ
脂肪酸組成 （％)
DHA DP A
コン卜口ール （パン酵母） 0 0
試 験 (SR21株） 23 4 産業上の利用可能性
本発明の海洋性微生物は、 增殖性および油脂 ««性に優れ、 （n-3)系 D H Aおよび（n -6)系 DP Aの生産能が高く、 かつ EP Aの生産が極め て少ない。 従って、 本発明の微生物を用いると、 食品および医薬品の分野 で有用な（n-3)系 DH Aおよび（n- 6)系 DP Aの含有量が高く、 かつ E
P Aの含有量が低い油胙を高収率で製造することができる。 また、 この油 ½から純度の高い（n-3)系 DH Aまたは（n- 6)系 DP Aを分雜すること もできる。
また、 本発明の油脂組成物は、 種々の生理活性を有する（n-3)系 DH Aとともに（ n - 6 )系 D P Aを特定の比率で含有するため、 垓油脂組成物 を各種 !¾品 (乳児用調製乳、 未熟児用调製乳、 幼児用食品、 老人用食品、 栄養楠助食品、 機能性食品、 絰腸栄餮剤、 動物用飼料または動物用飼料添 加物、 微小餌料生物用餌料など）に添加して、 （η-3)系 DHAおよび（η- 6)系 DP Αを必要とする対象にこれら高度不飽和脂肪酸を安定的かつ効 率的に供給することができる。 特に、 動物用飼料または動物用飼料添加物、 微小餌料生物用餌料では、 DH Aおよび DP Aを含有する培養菌体の抽出 残 S等を使用できるため、 非常に経済的である。 また、 上記の勳物用飼料 を家禽に与えることによって、 今までになかった DH Aおよび Zまたは D P Aを強化した家禽卵または卵黄油を得ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. (n-3)系ドコサへキサェン酸および（n -6)系ドコサペンタエン酸 の生産能を有するシゾキトリウム厲 SR 21株（FERM BP— 5034) または該 SR21株と同一の種に «するかもしくは実質的に同一の菌学的 性質を有する徼生物。
2. (n-3)系ドコサへキサェン酸および（n-6)系ドコサペンタエン酸 の生産能を有するシゾキトリウム SSSR21抹（FERM BP— 5034) または該 SR21株と同一の種に属するかもしくは実貧的に同一の菌学的 性質を有する微生物を培地中で培養し、 培養物から油脂を採取することを 特徴とする、 （n-3)系ドコサへキサェン酸および（n_6)系ドコサペンタ ェン酸を含む油脂の製造方法。
3. »求項 1または 2に記載の（n-3)系ドコサへキサェン酸および（n -6)系ドコサペンタエン酸を含む油脂から（π-3)系ドコサへキサェン酸 を単雌することを特徵とする、 （n-3)系ドコサへキサェン酸の製造方法。
4. ffif求項 1または 2に K載の（n-3)系ドコサへキサェン酸および（π -6)系ドコサペンタエン酸を含む油脂から（n-6)系ドコサペンタエン酸 を単離することを特微とする、 （n-6)系ドコサペンタエン酸の製造方法。
5. (n-6)系ドコサペンタエン酸および（n-3)系ドコサへキサェン酸 の生産能を有するシゾキトリウム «SR 21株（FERM BP— 5034) または KSR 21株と同一の種に JSするかもしくは実質的に同一の菌学的 性 を有する ¾生物を培地中で培養して得られる油脂。
6. 前記油) ISが、 （n-3)系ドコサへキサェン酸および（n-6)系ドコサ ペンタエン酸の生産能を有するシゾキトリウム厲 SR 21株（FERM B P— 5034)または该 SR 21株と同一の種に厲するかもしくは実質的 に同一の菌学的性質を有する微生物を培地中で培養し、 その培 ¾物から採 取することによって得られる油脂または該油脂を精製して得られる油脂で ある請求項 5に記載の油脂。
7. 前記油脂が、 該油脂を菌体培萎によって製造する途 Φの培養液もし くはその殺菌した培養液、 または培養終了時の培養液もしくはその殺菌し た培養液、 またはそれぞれから集菌した培養菌体もしくはその乾燥物、 ま たは该油脂を培養液から採取した後の残渣に含まれるものであることを特 徴とする請求項 5に記載の油脂。
8. 前記油脂が、 （n -6 )系ドコサペンタエン酸を全脂肪酸重量に対し 少なくとも 1 %含有することを特徴とする S求項 5〜7のいずれかに記載 の油脂。
9. 前 IB油脂が、 （n -3 )系エイコサペンタエン酸を全脂肪酸重量に対 し多くても 2 %しか含有しないことを特徴とする ¾求項 5〜 8の t、ずれか に記載の油脂。
1 0. 前記油胙が、 （n-6 )系ドコサペンタエン酸 1重量部に対し（n - 3 )系ドコサへキサェン酸を 3〜6重量部含有することを特徴とする請求 項 5〜 9のいずれかに記載の油脂。
1 1 . 前記油脂が、 中性脂貧であることを特徴とする請求項 5〜1 0の いずれかに記載の油脂。
1 2. 前圮油脂において、 （n -3 )系ドコサへキサェン酸が、 グリセリ ンの 2位のみに結合しているグリセリ ドを含有することを特徴とする請求 項 5 ~ 1 1のいずれかに圮載の油脂。
1 3. 前 K油) !Sにおいて、 （π-3 )系ドコサへキサェン酸が、 グリセリ ンの 1および 2.位、 または 1および 3位に結合しているグリセリ ドを含有 することを特徼とする請求項 5〜1 1のいずれかに圮載の油脂。
14. 前記中性脂質がその 85重量％以上がトリグリセリ ドであること を特敏とする 求項 11に記載の油脂。
15. 請求項 5〜14のいずれかに記載の油脂を含有することを特徴と する栄養補助食品。
16. 前記油脂をゼラチンカブセルに封入して成ることを特徴とする請 求項 15に記載の栄養補助食品。
17. 前圮栄養補助食品が、 前記油脂組成物を含有するドリンク剤また は顆粒剤もしくは錠剤の形態を有する飲食品であることを特徴とする請求 項 15に記載の栄養補助食品。
18. 請求項 5〜14のいずれかに §己載の油脂を含有する乳児用绸製乳 c
19. 講求項 5〜14のいずれかに記載の油脂を含有する未熟児用調製 乳。
20. 請求項 5〜14のいずれかに記載の油脂を含有する幼児用食品。
21. 請求項 5〜14のいずれかに記載の油 を含有する老人用食品。
22. 請求項 5〜14のいずれかに記載の油 ½を含有する経鳩栄養剤。
23. 請求項 5〜14のいずれかに記載の油脂を含有する動物用飼料。
24. 請求項 5〜14のいずれかに記載の油 β&を含有する動物用飼料添 加物。
25. 請求項 5〜14のいずれかに記載の油脂を含有する撖小餌料生物 用餌料。
26. 請求項 5〜14のいずれかに Κ載の油脂を与えて飼育することに より得られる家禽卵。
27. (η-3)系ドコサへキサェン酸生産能を有するシゾキトリウム厲 SR21株（FERM BP— 5034)または該 SR 21株と同一の種に 18するかもしくは実 的に同一の菌学的性質を有する微生物。
28. (n-3)系ドコサへキサェン酸生産能を有するシゾキトリゥム厲 SR21株（FERM B P— 5034)または該 S R 21株と同一の種に 属するかもしくは実質的に同一の菌学的性質を有する微生物を培地中で培 養し、 培養物から油脂を採取することを特微とする、 （n-3)系ドコサへ キサェン酸を含む油脂の製造方法。
29. (n-6)系ドコサペンタエン酸生産能を有するシゾキトリゥ厶属 SR21株（FERM BP-5034)または該 SR 21株と同一の種に 属するかもしくは実質的に同一の菌学的性質を有する微生物。
30. (n-6)系ドコサペンタエン酸生産能を有するシゾキトリウ厶 « SR21株（FERM BP— 5034)または該 S R 21株と同一の種に 厲するかもしくは実質的に同一の菌学的性質を有する微生物を培地中で培 養し、 培養物から油脂を採取することを特徴とする、 （n-6)系ドコサぺ ンタエン酸を含む油脂の製造方法。
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