WO1996033217A1 - Proteine d'adhesion de cellules, agent immunosuppresseur contenant cette proteine et agent immunosuppresseur renfermant des cellules ainsi induites - Google Patents

Description

明 糸田 » 細胞接着 タ ン パ ク 質、 そ れを 含む免疫抑制剤、 な ら び に そ れ に よ り 誘導 さ れ た細胞を含む免疫抑制剤 技術分野

本発明 は、 種 々 の 免疫反応の抑制作用 を有す る 新規細 胞接着 タ ン パ ク 質お よ びそ の類似体、 そ れ ら の製造法お よ び そ れ ら を含んで な る 免疫抑制剤、 な ら び に ヒ ト 細胞 を細胞接着 タ ン パ ク 質存在下で培養す る こ と に よ り え ら れ る 免疫抑制性細胞を 、 有効成分 と し て含む免疫抑制剤 に 関す る 。 背景技術

一般に、 免疫機能抑制剤 は、 免疫機能の異常亢進に よ つ て惹起 さ れ る 疾患、 た と え ば慢性関節 リ ウ マ チ 、 全身 性エ リ テ マ ト ー デ ス 、 慢性 g炎、 慢性 甲状腺炎、 自 己免 疫性溶血性貧血な どの い わ ゆ る 自 己免疫疾患 の治療な ら び に臓器移植時の拒絶反応の抑制 の た め に用 い ら れ る 。 従来か ら 用 い ら れて い る 免疫抑制剤 と し て は 、 ス テ ロ イ ド ホ ルモ ン 、 ァ ザ チ ォ プ リ ン 、 シ ク ロ ホ ス フ ア ミ ド な ど があ げ ら れ る 。

し か し な が ら 、 従来の免疫抑制剤 は、 免疫細胞だ け で な く 、 非選択的 に広 い範囲の細胞 に も 作用 し て そ の機能 お よ び / ま た は增殖 に 対 し て影響を与え る た め、 顆粒球 減少症、 胃機能障害 な どの 重篤な 副作用 が問題 と な っ て い る 。 し た が っ て、 免疫抑制活性が ¾ く 、 かつ副作用 が で き る だ け少な い薬剤 の 出現が望 ま れて い る 。 T 細胞 は 免疫反応の 中心的役割 を な し て い る 細胞で あ り 、 本発明 者 は こ れを タ ー ゲ ッ ト と す る 選択的薬剤の 開発を検討 し た o

C D 2 分子 は T細胞 に特異的 に 発現 し て い る 表面マ ー カ ー の代表的分子 と し て知 ら れて い る 。 ヒ ト T細胞 に発 現 し て い る C D 2 抗原 （ T 1 1 抗原 と も 呼ばれ る ） に対 す る 受容体 は一般に L F A — 3 と 呼ばれて い る 。 こ れ ま で に ヒ ト L F A — 3 の遗伝子が ク ロ ー ニ ン グ さ れ、 そ の 塩基配列か ら ア ミ ノ 酸配列が推定 さ れて い た。 ビ ー ピ 一 ウ ォ ル ナ ー （B. P. 冒 allner) ら 、 1 9 8 7 年 ジ ャ ー ナ ル ォ ブ ェ ク ス ペ リ メ ン タ ル メ デ イ シ ン （ J. E xp. Med. ) 1 6 6 卷、 9 2 3 頁 ： ビ ー シ ー ド （ B. See d) ( 1 9 8 7 年） 、 ネ イ チ ヤ ー （ Nature) 3 2 9 卷、 8 4 0 頁参照。 L F A — 3 お よ び そ の 天然の リ ガ ン ドで あ る C D 2 抗原 は と も に抗原提示や キ ラ ー T 細胞の活性 化 な ど の 免疫反 応 に 関与 す る 細胞 接着 タ ン パ ク 質 で あ り 、 免疫 グ ロ ブ リ ン ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー に 属す る 細胞接 着 タ ンパ ク 質 と し て分類 さ れて い る 。 エ ー エ フ ウ イ リ ア ム ズ （ A. F. Williams) と エ ー ェ ヌ ノ 一 ク レ イ ( A. N. Barclay) ( 1 9 8 8 年） ァ ニ ュ ア ル レ ビ ュ 一 ォ プ ィ ム ノ ロ ジ ー ( Annu. Rev. Immunol. ) 6 卷、 3 8 1 頁参照。 現在一般的 に知 ら れて い る L F A — 3 分子は、 N 末端か ら 免疫 グ ロ ブ リ ン 様 ド メ イ ン 1 ( D 1 領域） 、 免疫 グ ロ プ リ ン 様 ド メ イ ン 2 ( D 2 領域） 、 疎水性ア ミ ノ 酸 に富む腆貫通領域 （ T M領域） お よ び比 校的短 い細胞 K領域 （ C 領域） か ら 構成 さ れ て い る こ と が知 ら れて い る （前記 の ジ ャ ー ナ ル ォ ブ ェ ク ス ペ リ メ ン タ ル メ デ イ シ ン 1 6 6 卷、 9 2 3 頁参照） 。 本 明細害中で は こ の分子を ヒ ト T M型 L F A — 3 と 呼ぶ。 ま た、 D 1 領域 お よ び D 2 領域 を 有 し 膜 と グ リ コ シ ル * フ ォ ス フ ァ チ ジ ルイ ノ シ ト ー ルを 介 し て結合 し て い る ヒ ト L F A — 3 分子 も 知 ら れて い る （前記の ネ イ チ ヤ ー 3 2 9 卷、 8 4 0 頁参照） 。 本明細嘗中で は こ れを ヒ ト P I 結合型 L F A — 3 と 呼ぶ。 ま た前記の ヒ ト T M型 L F A — 3 分子か ら D 2 領域を欠 い た 構造を有す る L F A — 3 分子が天然に存在す る こ と が本発明者の 以前の 研究で 明 ら か に な つ て い る （平成 3 年特 許願第 1 5 1 7 9 2 号） 。 本明細害中で は そ の 分子を D 2 領域欠失型 ヒ ト L F A — 3 様 タ ン パ ク 質 と 呼ぶ。

—方、 ヒ ッ ジ に お い て も 、 ヒ ト T細胞の C D 2 抗原 に 対す る 高 い親和性を有す る タ ン パ ク 質で あ る ヒ ッ ジ赤血 球の C D 2 抗原受容体の 存在が知 ら れて い る 。 現在で は ヒ ト T細胞 の特異的 な 反応の ひ と つ と さ れて い る ヒ ッ ジ 赤血球 と ヒ ト T細胞 と の ロ ゼ ッ ト 形成 は、 ヒ ト T細胞の C D 2 抗原 と ヒ ッ ジ 赤血球の C D 2 抗原受容体 と の高 い 親和性 に 起因す る 結合反応 と 理解 さ れて い る 。 ヒ ッ ジ赤 血球の C D 2 抗原受容体の構造 は、 本発明者の こ れま で の 研究 に よ り 遺伝子 レ ベルお よ び ア ミ ノ 酸 レ ルで明 ら か に さ れて い る （欧州 特許 出願公開第 5 1 7 1 7 4 号明 細害参照） 。 こ の と き ク ロ ー ニ ン グ さ れた分子 は N末端 か ら D 1 領域、 D 2 領域、 T M領域 お よ び C 領域を有す る も の 、 D 1 領域お よ び D 2 領域 を有 し 膜 と グ リ コ シ ル • フ ォ ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル を 介 し て 結 合 す る も の 、 な ら び に D 1 領域 お よ び D 2 領域を有 し T M領域 と C 領域を欠失 し た構造の も の の 3 種類であ る （各 々 本明 钿害中で は T M型 ヒ ッ ジ L F A — 3 、 P I 型 ヒ ッ ジ L F A - 3 お よ び T M領域欠失型 L F A — 3 と 呼ぶ） こ れ ら の ヒ ト T細胞の C D 2 抗原 に対す る 高 い親和性 を有す る タ ン パ ク 質 は 、 前記の よ う な 副作用 の 少な い免 疫抑制剤 と し て き わ め て有用 と 考え ら れ る が、 こ の用途 の た め に は量産を可能 に す る こ と が必要で あ る 。

そ れ ま で も 、 ヒ ッ ジ 赤血球の ヒ ト C D 2 抗原受容体お よ びそ の 類似体の生産法 と し て は、 ヒ ッ ジ 赤血球か ら 界 面活性剤 に よ っ て タ ン パ ク 質を可溶化 さ せ、 抗体 に よ る ァ フ ィ 二 テ ィ · ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に よ つ て精製す る 方 法 （特開昭 6 3 — 1 5 0 2 2 8 号公報参照） お よ び ヒ ッ ジ 赤血球か ら ト リ プ シ ン に よ っ て可溶化 さ せ る 方法 （ テ ィ 一 キ タ ォ （ T. Kitao) ら （ 1 9 7 6 年） ジ ャ ー ナ ル ォ プ ィ ム ノ ロ ジ ー （ J. Immunol. ) 1 1 7 巻、 3 1

0 頁参照） な どが知 ら れて い たが、 量産 に は適当 な方法 で は な "、 つ た o

本発明者 は以前 、 そ の よ う な タ ン パ ク 質の遠伝子工学 的手法 に よ る 量産可能 な 生産法を 開発 し た。 さ ら に、 大 腸菌 を宿主 と し た遺伝子工学的手法 に よ る ヒ ト ま た は ヒ ッ ジ 由来の D 2 領域 お よ び T M領域を欠失 さ せ た L F A 一 3 分子 （本明細害中 で は各々 ヒ ト D 1 H C 、 ヒ ッ ジ D 1 H C と 呼ぶ） が同 じ く 大腸菌 を宿主 と し た遺伝子工学 的手法で作製 し た ヒ ト ま た は ヒ ッ ジ 由 来の D 1 領域お よ び D 2 領域を有 し、 T M領域お よ び C 領域を欠失 し た L F A - 3 分子 と 同等の ロ ゼ ッ ト 形成阻害能、 す な わ ち 同 等の ヒ ト T細胞 に対す る 親和性を保持 し て い る こ と を確 認 し た。 さ ら に ま た前記の ヒ ト D 1 H C ま た は ヒ ッ ジ D 1 H C の C 末端 に シ ス テ ィ ン 残基 を 一個 付加 し た も の (本明細害中で は各 々 ヒ ト D l H C c y s タ ン パ ク 質、 ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質 と 呼ぶ） を担体 に固定 ィ匕 し た も の が ジ ャ ル カ ッ ト （ Jurkat) 細胞 に 親和性を示 す こ と も 確認 し て い る (特開平 5 — 2 7 1 2 9 2 号公報 参照） 。 し か し なが ら 、 一層効果的 な 免疫抑制剤が望 ま れて い る 。

L F A - 3 分子の 二量体あ る い は 多量体 と し て、 こ れ ま で ア ー ル ビ ー ぺ ビ ン ス キ ー ( 8. B. Pepinsky) ら が L F A — 3 分子の フ ォ ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル基ま た は糖鎖を利用 し て L F A - 3 分子を多重化 し た例 （ ジ ヤ ー ナ ル ォ ブ バ イ ォ ロ ジ カ ル ケ ミ ス ト リ ー （ J . B. C. ) 2 6 6 卷 、 〕 . 8 2 4 4 頁 （ 1 9 9 1 年 ） 参 照） 、 な ら び に ジ ー テ ィ ー ミ ラ ー （ G. T. Miller) ら が抗体の F c 領域 と の キ ヌ ラ 構造を も つ L F A — 3 分 子を作製す る こ と に よ り 二量体を作製 し た例 （ ジ ャ ー ナ ル ォ ブ ェ ク ス ペ リ メ ン タ ル メ デ イ シ ン （ J. Exp.

Med. ) 1 7 8 卷、 2 1 1 頁 （ 1 9 9 3 年） 参照） が知 ら れて い る 。 前者の例 で示 し た分子で は、 ロ ゼ ッ ト 形成阻 害 に お い て多重化度 に比例 し た著 し い 向上がみ ら れて い る 。 ま た後者の例で も 二量体化 に よ っ て ロ ゼ ッ ト 形成阻 害能の 向上が観察 さ れて い る O

と こ ろ が、 こ れ ら の 分子を よ り 直接的 な 免疫抑制能の 観点か ら み る と 、 前者の P I 結合型 L F A — 3 は M L R に お い て ほ と ん ど抑制活性を示 し て い な い。 一方後者の 分子 は ロ ゼ ッ ト 形成阻害能で は さ ほ どで は な いが、 M L R や抗原特異的 T 細胞活性化の抑制系 に お い てす ぐ れた 抑制活性を 示 し て い た 0 こ の抑制 メ カ ニ ズ ム と し て ジ ー ア ー ル マ ジ ェ ゥ （ G. R. Hajeau) は、 後者の分子が 有す る F c 領域 と の キ メ フ 構造 と N K細胞が有す る F c レ セ プタ ー と の結合 に よ る 傷害あ る い は A D C C 活性が 考え ら れ る と さ れて い る （ ジ ャ ー ナ ノレ ォ ブ ' ィ ム ノ ロ ジ ー （J. Immunol. ) 1 7 6 卷、 2 7 5 3 頁 （ 1 9 9 4 年） 参照） 。 こ の よ う な メ カ ニ ズ ム で は生体 に お い て T 細胞の非特異的傷害 に よ る 全体的 な 免疫系 の 機能低下 に 伴 う 種々 の 感染症な ど の 副作用 が予想 さ れ る 。 ま た、 種 々 の免疫抑制効果が報告 さ れて い る 抗 C D 2 抗体 に お い て も 同様の こ と がい え る 。

—方、 サ ブ レ ッ サ ー T細胞の量的 あ る い は 質的 な異常 に よ り 自 己免疫疾患が起 こ る 例が い く つ か知 ら れて い る ( マ ッ キ ン ト ッ シ ュ （ Mcintosh) お よ び ド ラ ク マ ン （ Dr achman) 、 サ イ エ ン ス （ Science) 2 3 2 巻 、 4 0 1 頁 ( 1 9 8 6 年） 参照） 。 バ ラ シ ョ フ （ Balashov) ら の報 告 （ノ、 * ラ シ ョ フ ら 、 ジ ャ ー ナ ル . ォ ブ · ク リ ニ カ ル · ィ ン べ ス テ ィ ゲ ー シ ヨ ン ( Journal of Clinical Invest ig ation) 9 5 巻、 2 7 1 1 頁 （ 1 9 9 5 年 ） 参 照 ） で は、 M S (多発性硬化症） 患者 に お い て は 自 己混合 リ ン バ球反応に よ る サ ブ レ ッ サ ー T細胞の誘導効率に 著 し い 低下がみ ら れ、 そ れ に よ り 、 同 T細胞の サ ブ レ ッ サ ー機 能因子で あ る 7 イ ン タ ー フ ロ ン （ I F N ) の産生低下 が指摘 さ れて い る 。 す な わ ち 患者 に お い て は サ ブ レ ッ サ 一 T誘導不全 に よ る サ ブ レ ッ サ ー 因子 7 I F N の産生低 下に よ り 、 T h 活性が相対的 に亢進 し 、 そ の た め に傷害 性細胞誘導 T細胞、 そ し て 自 己傷害性 T細胞が誘導、 活 性化 さ れて い る も の と 思わ れ る 。 こ れ ま で、 サ ブ レ ッ サ 一 T細胞の 誘導例 と し て は フ レ ズ ノ （ Fresno) ら （ フ レ ズ ノ ら 、 ジ ャ ー ナ ル · ォ ブ · ェ ク ス ペ リ メ ン タ ル · メ デ ィ シ ン （" Journal of Experimental Medicine) 1 ο 3 卷、 1 2 4 6 頁 （ 1 9 8 0 年） 参照） を は じ め マ ウ ス な どの動物を 用 い た系 で い く つ か報告 さ れて い る 。 ま た ヒ 卜 で の誘導例 と し て、 最近報告 さ れ た前記文献の 自 己混 合 リ ン パ球反応を利用 し た方法があ る が、 P H A や C o n A 処理 し た ヒ ト 血清 を添加 し て培養す る 必要があ り 、 操作が煩雑で、 処理 に 用 い た レ ク チ ン な どの 異物の混入 の危険性 も あ り 、 決 し て望 ま し い方法 と は い え な い。 発明 の 開示

本発明 は 、 ヒ ト T 細胞の C D 2 抗原 に対す る 高 い親和 性を有 し 、 かつ よ り 副作用 の少な い メ カ ニ ズ ム で強 い免 疫反応抑制活性を発揮す る L F A — 3 タ ン パ ク 質類似体 の二量体お よ びそ の製造法な ら び に免疫抑制剤を提供す る も の で あ る 。 さ ら に 詳 し く は、 ヒ ト ま た は ヒ ッ ジ の L F A — 3 の D 1 領域の C 末端あ る い は そ の近傍 に シ ス テ イ ン残基を導入 し た構造の タ ン パ ク 質、 導入 し た シ ス テ イ ン 残基の S H 基を利用 し て二量体化す る 方法、 お よ び そ の二量体化 し た タ ン パ ク 質を含ん で な る 免疫抑制剤を 提供す る も の で あ る 。

す な わ ち 、 本発明 は、 E列番号 1 に 示す ア ミ ノ 酸配列 中 の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ア ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配列 を有す る タ ン パ ク 質 ま た は そ の類似体同士が、 そ の C 末 端あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て 結合 し て な る タ ン パ ク 質二量体お よ び前記 タ ン パ ク 質 ま た は そ の類似体を 自 然酸化 さ せ る こ と を含ん で な る 前記 二量体の製造法な ら び に前記二量体を含ん で な る 免疫抑 制剤 に 関す る 。 好ま し く は、 前記類似体が、 C 末端あ る い は そ の 近傍の シ ス テ ィ ン の 直前 に N 末側か ら ダ リ シ ン ー セ リ ン ー グ リ シ ン ー セ リ ン ー セ リ ン が挿入 さ れて い る か、 も し く は C 末端あ る い は そ の 近傍の シ ス テ ィ ン の 直 前 に N 末側 か ら グ リ シ ン ー セ リ ン が揷入 さ れ、 かつ 、 該 シ ス テ イ ン の 直後 に N 末側 か ら グ リ シ ン 一 プ ロ リ ン が挿 入 さ れて い る も の で め 4> o

ま た、 本発明 は配列番号 7 に示す C 領域 を欠失 し た可 溶性 D 2 領域欠失型 ヒ 卜 L F A — 3 の C 末端あ る い は そ の 近傍 に シ ス テ ィ ン 残基が 1 つ 付加 さ れた タ ン パ ク 質を コ ー ドす る D N A も 提供す る 。 前記可溶性 D 2 領域欠失 型 ヒ ト L F A 一 3 は、 ヒ ト 由来の D 2 領域 お よ び T M領 域を欠失 さ せ た ヒ ト L F A - 3 分子を意味す る （以下、 ヒ 卜 D 1 H C と 呼び、 前記 ヒ ト D 1 H C よ り C 領域を欠 失 さ せ シ ス テ イ ン残基を一個付加 し た も の を ヒ ト D 1 H c y s と 呼ぶ ) o

ま た、 本発明 は £列番号 4 に 示す ア ミ ノ 酸配列 中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ア ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配列を有す る タ ン パ ク 質同士が、 そ の C 末端 あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基 を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質 二量体お よ び前記 タ ン パ ク 質を 自 然酸化 さ せ る こ と を含 ん で な る 前記二量体の 製造法な ら び に前記二量体を含ん で な る 免疫抑制剤 も 提供す る 。

さ ら に 、 本発明 は配列番号 5 ま た は 6 に 示す ア ミ ノ 酸 配列 を有す る 夕 ン パ ク 質同士が、 そ の C 末端あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ イ ン の S H 基 を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質ニ量体お よ び前記 タ ン パ ク 質を 自 然酸化 さ せ る こ と を含ん で な る 前記二量体の 製造法な ら び に前記二 量体を含ん で な る 免疫抑制剤 も 提供す る 。

ま た、 本発明 は、 ヒ ト 細胞を細胞接着 タ ン パ ク 質存在 下で培養す る こ と に よ り え ら れ る 免疫抑制性細胞を、 有 効成分 と し て含む免疫抑制剤 も 提供す る 。 免疫抑制活性 を有す る 細胞、 と く に 免疫抑制性 （サ ブ レ ッ サ ー ） T 細 胞を ヒ ト が本来持つ分子 に き わ め て近 い構造を持つ分子 の み で簡便 に作製す る こ と が で き る 本発明 は、 免疫性疾 患 と く に 自 己免疫疾患治療や臓器移植時の 拒絶抑制 に き わ め て重要 な手段を提供す る も の で あ る 。

ま た、 本発明 は細胞接着 タ ン パ ク 質を有効成分 と し て 含む免疫抑制剤 に 関す る 。

前記免疫抑制剤 に お い て 、 前記細 胞接 着 タ ン パ ク 質 が、 配列番号 1 に示す ア ミ ノ 酸配列 を 有す る タ ン パ ク 質 ま た は そ の 誘導体同士が、 そ の C 末端あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質ニ量体で あ る ばあ い、 前記細胞接着 タ ン パ ク 質が、 配列番号 1 の ア ミ ノ 酸配列 中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ァ ミ ノ 酸が欠落 し て い る も の で あ り 、 かつ ま た は

C 末端の シ ス テ ィ ン の 直前 に ダ リ シ ン ー セ リ ン ー ダ リ シ ン ー セ リ ン ー セ リ ン が挿入 さ れて い る か、 も し く は

C 末端の シ ス テ ィ ン の 直前 に グ リ シ ン ー セ リ ン ー セ リ ン が挿入 さ れ、 かつ前記 シ ス テ ィ ン の 直後に グ リ シ ン ー プ 口 リ ン が挿入 さ れて い る も の 同士が、 そ の C 末端あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質二量体で あ る ばあ い 、 前記細胞接着 タ ン パ ク 質が、 配列番号 4 に 示す ア ミ ノ 酸配列 を 有す る タ ン パ ク 質 ま た は そ の ア ミ ノ 酸配列 中 の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ア ミ ノ 酸が欠落 し て い る 誘導体同士が、 そ の C 末端あ る い はそ の 近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る タ ンパ ク 質二量体であ る ばあ い、 前記細胞接着 タ ン パ ク 質が、 配列番号 5 ま た は 6 に 示す ア ミ ノ 酸配列 を有す る タ ン パ ク 質同士が、 そ の C 末端あ る い は そ の近 傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質二量体で あ る ば あ い、 前記 ヒ ト 細胞が、 ヒ ト 末梢 血細胞で あ り 、 前記免疫抑制性細胞が該 ヒ ト 末梢血細胞 を細胞接着 タ ンパ ク 質以外 に、 1 L 一 2 お よ び Z ま た は G M - C S F を添加 し て培養す る こ と に よ っ てえ ら れ る も の であ る ばあ い、 前記免疫抑制性細胞が、 血清を含む 培地を用 い た培養に よ り え ら れ る も の であ る ばあ い、 な ら び に前記血清が、 自 己血清で あ る ばあ い が好 ま し い。 図面の 簡単 な説明

図 1 は P iS L F A 3 — 1 の作製手順を示す 図で あ る 。 図 2 は p S V L F A 3 — 1 の 作製手睏 を 示 す 図 で あ る o

図 3 は ポ ジ テ ィ ブ コ ン 卜 ο ー ル ぉ よ び仮の ス タ ン ダ ー K と し て J Y 細胞 よ り 精製 し た天然型 L F A - 3 分子、 つ ン 卜 ロ ー ル と し て P S V 2 d h f r の形質転換体の無 血清培養上清を用 い て、 実施例 1 で え ら れた ϊ> β L F A 3 - 1 (図 3 A ) ま た は p S V L F A 3 - 1 (図 3 B ) の形質 Ικ換 の無血清培養上清 に つ H E し I S A ア ツ セ ィ を行な い、 測定 さ れた吸光度 を示す グ ラ フ でめ る 。

図 4 は ヒ ト L F A - 3 の ァ ミ ノ 酸配列 を 、 ヒ ッ ジ Δ D 2 タ ン パ ク 質の ァ ミ ノ 酸配列 に対比 さ せ た 図で あ る 。 図 中 の番号 は 、 ヒ 卜 L F A - 3 の N 末端力、 ら の ア ミ ノ 酸番 号で あ る o - は片方の配列 に は な い ァ ミ ノ 酸を示す。 配 列 間で相 同 な ア ミ ノ 酸 は コ ロ ン で示 し た。 下線を 引 い た 部分の 配列 の 9 4 番か ら 1 8 1 番 は D 2 領域で あ V 、 ヒ ッ ジ 厶 D 2 タ ン パ ク 質 は、 こ の下線を ひ い た 部分の配列 を有 さ な い 0

図 5 は p ;9 L T l d h f r の 作 製手順 を 示 す 図 で あ る 0

図 6 は P P D抗原 と と も に P B S 、 ヒ ト D l H c y s 夕 ン パ ク 質ー量体、 ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体 ま た ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ン パ ク 質二量体 を加え て ヒ ト 末梢血細胞の ³ H — チ ミ ジ ン 取 り 込 み を 測定 し た 結果 を示す グ ラ フ で あ る 。

図 7 は ヒ ト 末梢 血細 胞 を P B S を 加 え て 培 養 し た の ち 、 蛍光標識 し た C D 3 抗体を用 い て行 っ た フ ロ ー サ イ 卜 メ 卜 リ ー の パ タ ー ン を示す。

図 8 は ヒ ト 末梢血細胞を ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質 二量体を加 え て培養 し た の ち 、 蛍光標識 し た C D 3 抗体 を 用 い て 行 っ た フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー の パ タ ー ン を 示 す。

図 9 は ヒ ト 末梢血細胞を ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質 一量体を加え て培養 し た の ち 、 蛍光標識 し た C D 3 抗体 を 用 い て 行 っ た フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー の パ タ ー ン を 示 す。

図 1 0 は ヒ ト D l H c y s 二量体 ま た は ヒ ッ ジ D 1 H C c y s 二量体で処理 さ れ た ヒ ト T 細胞の 免疫抑制活性 を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 1 1 は ヒ ト D l H c y s 、 I L 一 2 お よ び G M — C S F 、 な ら び に そ れ ら の組み 合わせ で処理 し た ヒ ト 末梢 血細胞の 免疫抑制活性を示す ダ ラ フ で あ る 。 発明 を実施す る た め の最良の形態 本発明の タ ン パ ク 質 は、 ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質 ま た は そ の 類似体 ま た は ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ンパ ク 質が C 末端あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H基 を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質二 i体で あ る 。 動物培 養細胞で生産 さ れた ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質の ア ミ ノ 酸配列 を 配列 番号 1 に 、 塩基 列 を 配列 番号 7 に 示 す。 ま た、 動物培養細胞で生産 さ れ た ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ン パ ク 質の ア ミ ノ 酸配列 を配列番号 4 に、 塩基配 列 を配列番号 1 0 に示す。 た だ し 、 ヒ ト D 1 H c y s お よ び ヒ ッ ジ D l H C c y s は、 細胞外 に分泌 さ れ る と き に 自 然に 2 8 番 目 と 2 9 番 目 の ア ミ ノ 酸の あ い だで切断 さ れ る 。

こ こ で類似体 と は、 も と の タ ン パ ク 質の ア ミ ノ 酸 E列 に ひ と つ ま た は複数の ァ ミ ノ 酸が付加お よ び ま た は挿 入お よ び Zま た は 置換お よ び Zま た は削除 さ れた タ ン パ ク 質で あ っ て、 も と の タ ン パ ク 質 と 実質的 に 同 じ タ ンノ、' ク 質を い う 。 具体的 に は、 ヒ ト D l H c y s タ ンパ ク 質 の類似体の 例 と し て、 配列番号 1 の ア ミ ノ 酸配列 中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ア ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配列 を有す る も の で C 末端あ る い は そ の近傍 の シ ス テ ィ ン の 直前 に N 末端側 か ら ダ リ シ ン ー セ リ ン ー ダ リ シ ン ー セ リ ン ー セ リ ン が挿入 さ れて い る か、 も し く は C 末端あ る い は そ の 近傍の シ ス テ ィ ン の 直前 に N 末端側 か ら ダ リ シ ン ー セ リ ン ー セ リ ン が挿入 さ れ、 かつ前記 シ ス テ ィ ン の 直後に N 末端側か ら グ リ シ ン 一 プ ロ リ ン が挿入 さ れて い る も の が あ げ ら れ る 。 具体例 と し て配列番号 2 お よ び 3 に ァ ミ ノ 酸配列 を 、 配列 番号 8 お よ び 9 に 各 々 の 塩基配列 を 示 す。 C 末娌 あ る い は そ の近傍の シ ス テ ィ ン の 直前 に N 末 側 か ら グ リ シ ン ー セ リ ン 一 グ リ シ ー セ リ ン ー セ リ ン を 挿入す る ば あ い、 疎水性 ァ ミ ノ 酸 導入 に よ り 、 二量体 形成効率の 向上、 あ る い は二量体 成後の 分子内立体阻 害の軽減 に よ る 結合能の 向上が期 さ れ る 。 ま た、 C 末 端 あ る い は そ の近傍の シ ス テ ィ ン 前後 に グ リ シ ン ー セ リ ン ー セ リ ン お よ び グ リ シ ン ー プ リ ン を挿入す る ばあ い、 プ ロ テ ア ー ゼ に よ る C 末端あ い は そ の 近傍 シ ス テ ィ ン 残基の 分解、 脱落 を 防 ぐ 効果 期待 さ れ る 。 ま た、 大腸菌で生成 さ れた ヒ ッ ジ D 1 H c y s タ ン パ ク 質の 例 と し て、 配列番号 5 お よ び 6 に ミ ノ 酸配列を、 配列 番号 1 1 お よ び 1 2 に 各 々 の塩基配天組て明が形待ァののる口 Cン列 を示す。

こ れ ら の タ ン パ ク 質―量体 は、 然の材料か ら 抽出 · 精製に よ っ て え ら れた も の であ つ も か ま わ な い が、 本 願の実施例 に示 し た よ う に遺伝子 み換え の 方法に よ つ て え る こ と がで き る 。 ま た、 本発 に 関連す る 配列表 に 示 し た塩基配列お よ び / ま た は ァ ノ 酸配列 に も と づ い て化学合成の 方法 に よ つ て え る こ も 可能で あ る Ο

こ う し て え ら れた 夕 ン パ ク 質ー 体、 す な わ ち ヒ 卜 D

1 H c y s 夕 ン パ ク 質 ま た は そ の 類似体 ま た は ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン ノ ク 質を 自 然酸化 さ せ る こ と に よ り 、 本発明の二量体を え る こ と がで き る 。 自 然酸化 は 、 た と え ば還元剤 を含む緩街液 に 溶解 し て い る 夕 ン ノ、 ^β ク 質一量 体を ¾元剤 を 含 ま な い緩衝液 に対 し て透析す る こ と に よ つ て行な う こ と がで き る 0 具体的 に は 、 タ ン パ ク 質一量 体を透析膜 に い れ、 5 0 m M ト リ ス埴酸緩銜液 、 2 m

M E D T A ( P H 8 . 5 ) に対 し て、 2 5 〜 3 0 で で —晚透析す る こ と に よ つ て行な う と がで さ る Ο ま た、 同様 に S H 基を利用 す る こ と に よ て種 々 の 多量体を作 製す る こ と も 可能で あ る 。

本発明 の 免疫抑制剤 は、 前記の 本発明の タ ン パ ク 質二 量体を有効成分 と し て含有す る 。 そ の ほ か に 、 製剤化 に 必要な成分 を任意に 含む こ と がで き る 。 そ の よ う な成分 と し て は、 た と え ば注射用 蒸留水、 食塩、 リ ン 酸、 ヒ ト 血清ア ル ブ ミ ン 、 カ ル シ ウ ム塩、 マ グ ネ シ ウ ム埴な どが あ げ ら れ る 。 本発明 の 免疫抑制剤の投与経路 は限定 さ れ な いが、 注射剤 と し て全身 ま た は局所 に投与 さ れ る の が 好 ま し い。

本発 明 の 免疫抑制剤 は 、 す ぐ れ た 免疫 抑制作 用 を 有 し 、 かつ 副作用 が少な い。 し たが っ て、 免疫機能の異常 亢進に よ っ て お こ る 疾患の 治療、 た と え ば慢性関節 リ ウ マ チ、 全身性エ リ テ マ ト ー デス 、 «性 g炎、 慢性甲状腺 炎、 自 己免疫性溶血性貧血な どの 自 己免疫疾患の治療、 ま た は臓器移植時の拒絶反応抑制、 さ ら に ア レ ルギー疾 患の 治療な ど に有効で あ る 。 投与量 は、 投与の 目 的、 す な わ ち疾病の種類お よ び投与す る 患者の症状の程度に よ つ て も 異な る が、 成人 に対 し て 1 日 あ た り 一般的 に 1 〜 l O O m g 、 好 ま し く は 1 〜 ： L 0 m g 、 と く に好 ま し く は 1 m g で あ る 。

ま た、 本発明 の ヒ ト 細胞を細胞接着 タ ン パ ク 質存在下 で培養す る こ と に よ り え ら れ る 免疫抑制剤 に つ い て説明 す る 。

ヒ ト 細胞 と は、 ヒ ト の体を構成す る 細胞お よ び こ れ に 由来す る 細胞で あ る 。 本発明 に お い て用 い ら れ る ヒ ト 細 胞 と し て は 、 た と え ば ヒ ト 末梢血細胞、 ヒ ト 腹腔細胞、 ヒ ト 胸腺細胞、 ヒ ト 骨 «細胞、 ヒ ト 胖臓細胞、 ヒ ト 株化

T 細胞な どがあ げ ら れ る 。 細胞移入 と い う 方法で実際 に 患者の治療を行な う ば あ い、 免疫 の拒絶反応 あ る い は抑 制効果を考 え て も そ の 患者 自 身の細胞を用 い る こ と が最 も 望 ま し く 、 そ の な かで も ヒ ト 末梢血細胞が採取の容易 さ の点で好 ま し い。 末梢血細胞 は 、 ヒ ト か ら の採血 に よ り え た静脈血を 5 0 m l の ポ リ ス チ レ ン チ ュ ー ブ に入れ た フ イ コ ー ル （ フ イ コ ー ゾレノヽ' ッ ク ( Ficol 1 -Paque) ： フ ア ル マ シ ア 社製） の う え に 重層 し 、 1 分間 1 5 0 0 回転 で 2 0 分間遠心す る こ と に よ り 、 境界面 に 形成 さ れ る リ ン パ球、 単球画分を分離 し 、 R P M l — 1 6 4 0 培地で 3 回洗浄す る こ と に よ り え ら れ る ( フ ィ コ ー ル遠心分離 法） 。 T細胞 は、 こ う し て え ら れ た ヒ ト 末梢血細胞を培 養液中 に 播種 し て一晩培養 し た の ち 、 浮遊細胞を集め る こ と に よ り え ら れ る 。

ヒ ト 細胞 を培養す る 際 に用 い る 、 ま た は有効成分 と し て免疫抑制剤 に含有 さ れ る 細胞接着 タ ン パ ク 質 と は、 細 胞 と 細胞の 接着を媒介す る 機能を有す る タ ン ノ、 ^β ク 質を い う が、 た と え ば免疫 グ ロ ブ リ ン ' ス ー パ 一 · フ ア ミ U 一 、 イ ン テ グ リ ン ， ス ー パ ー * フ 、 力 ドヘ リ ン な どがあ げ ら れ る 。 好 ま し く は、 免疫 グ ロ ブ リ ン • ス 一 パ ー · フ ァ ミ リ ー、 と く に好 ま し く は 、 ヒ ト Τ細胞 の C

D 2 抗原 に対す る 高 い親和性を有す る L F Α - 3 タ ン パ ク 質お よ びそ の類似体で あ る 。 さ ら に好ま し く は 、 L F A - 3 タ ン パ ク 質類似体で あ る ヒ ト D 1 H C タ ン パ ク 質 ま た は そ の 誘導体の二量体、 ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質 ま た は そ の誘導体の二量体 本発明の タ ン パ ク 質二量体があ げ ら れ る 。 以下 に こ れ り の タ ン パ ク 質 に つ い て説明す る 。

ヒ ト L F A — 3 タ ン ノ、' ク 質の ァ ミ ノ 酸配列 を配列番号 2 2 に示す。 ヒ ト L F A — 3 タ ン ノ、。 ク 質 は、 免疫 グ ロ プ リ ン 様 ド メ イ ン 1 ( D 1 領域） 、 免疫 グ ロ プ リ ン 様 ド メ イ ン 2 ( D 2 領域） 、 膜貫通領域 （ T M領域） お よ び钿 胞質領域 （ C 領域） か ら 構成 さ れて い る （ ビ ー · ピ ー ， ウ ォ ル ナ ー ら 、 ジ ャ ー ナ ル · ォ ブ · エ キ ス ペ リ メ ン タ ル

* メ デ ィ シ ン 1 6 6 巻 、 9 2 3 頁 （ 1 9 8 7 年 ） 参 照） 。 こ の タ ン パ ク 質か ら D 2 領域お よ び T M領域の 欠 失 し た タ ン パ ク 質 （ ヒ ト D 1 H C ) か ら 、 さ ら に C 領域 を欠失 さ せ、 C 末端 に シ ス テ ィ ン 残基を 1 つ 付加 し た 夕 ン パ ク 質が ヒ ト D l H c y s で あ る 。 ま た、 シ ス テ ィ ン 残基を 1 つ 付加す る の は、 必ず し も C 末端で な く と も そ の 近傍で あ れば よ い。 動物培養細胞 に よ り 生産 さ れた ヒ ト D l H c y s の ア ミ ノ 酸配列 を 列番号 1 に、 こ れを コ ー ドす る D N A の塩基配列 を配列番号 7 に 示す。 た だ し 、 ヒ ト D l H c y s は、 細胞外 に分泌 さ れ る と き に 自 然に 2 8 番 目 と 2 9 番 目 の ア ミ ノ 酸の あ い だで切断 さ れ る た め、 細胞外 に分泌 さ れた と き に は、 配列番号 1 に示 す ア ミ ノ 酸配列 中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ア ミ ノ 酸を欠 く 配列を有す る 。 本発明の タ ン パ ク 質二量体 は、 前記説 明の と お り であ る 。

動物培養細胞 に よ り 生産 さ れ た ヒ ッ ジ D 1 H C c y s の ア ミ ノ 酸配列 を配列番号 4 に、 こ れを コ ー ドす る D N A の 塩基配列を配列番号 1 0 に 示す。 た だ し 、 ヒ ッ ジ D l H C c y s は、 細胞外 に 分泌 さ れ る と き に 自 然 に 2 8 番 目 と 2 9 番 目 の ア ミ ノ 酸の あ い だで切断 さ れ る た め、 細胞外 に分泌 さ れた と き に は、 配列番号 4 に 示す ア ミ ノ 酸配列中 の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ア ミ ノ 酸を欠 く E列を 有す る 。 こ れ ら の タ ン パ ク 質 は、 天然の 材料か ら 抽 出 ， 精製 に よ っ て え ら れ た も の で あ っ て も か ま わ な い が、 本願の実 施例 に示 し た よ う に遗伝子組み換え の方法 に よ っ て え る こ と がで き る 。 ま た、 配列表に示 し た塩基配列 お よ び Z ま た は ァ ミ ノ 酸配列 に も と づい て化学合成の方法によ つ て え る こ と も 可能で あ る 。

本発明 に お い て用 い る 細胞接着 タ ン パ ク 質 と し て好 ま し い タ ン パ ク 質の二量体 は、 前記 タ ン パ ク 質単量体がそ の C 末端あ る い は そ の 近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H基を 介 し て結合 し て形成 さ れ る も の で あ る 。 そ の よ う な タ ン パ ク 質の二量体 は、 前記の よ う に し て え ら れ る タ ン パ ク 質単量体を 自 然酸化 さ せ る こ と に よ り え ら れ る 。 自 然酸 化 は、 た と え ば還元剤を含む緩衝液 に 溶解 し て い る タ ン パ ク 質単 i体を還元剤 を含 ま な い緩衝液に 対 し て透析す る こ と に よ っ て行な う こ と がで き る 。

免疫抑制性細胞 と は 、 免疫応答 を抑制す る 能力 を有す る 細胞を い う 。 こ の免疫応答抑制活性の測定 は、 た と え ば異な る 2 つ あ る い は そ れ以上の数の 個体か ら 諝製 し た 末梢血細胞を混合す る 反応系 （ M L R ) 、 あ る い は あ る 抗原 に対す る 反応性を 有す る T細胞 （ メ モ リ ー T細胞） を有す る 個体の 末梢血細胞 と そ の 抗原を混合す る 反応系 な ど を用 い て行な う こ と がで き る 。 以下の試験例 2 に説 明す る よ う に、 ィ ン ビ ト 口 に お い て 同一人か ら 新た に え た ヒ ト 末梢血細胞 （以下、 P B L と 呼ぶ） に 、 免疫抑制 性を有す る と 思わ れ る 細胞を加え 、 さ ら に P P D や T T ( テ タ ヌ ス · ト キ ソ ィ ド （ tetanus toxoid) ) な どの抗 原 を加え て 3 7 で、 5 % C 0 ₂の 条件下 で数 日 間培養 し た の ち 、 [ ³H ] チ ミ ジ ン を 添加 し 、 さ ら に 5 〜 ： L 6 時 間培養 し た の ち 、 細胞 中 の放射活性を シ ン チ レ ー シ ヨ ン カ ウ ン タ ー で測定す る こ と に よ り 行 な う こ と がで き る 。

ヒ ト 細胞を前記細胞接着 タ ン パ ク 質の存在下で培養す る こ と に よ り 、 免疫抑制性細胞がえ ら れ る 。 細胞接着 タ ン パ ク 質の 培地への添加量 は、 用 い る タ ン パ ク 質 に よ つ て異な り 、 と く に 限定 さ れな い が、 0 . 1 〜 ： L O /u g Z m 1 が好 ま し い。 少な す ぎ る ばあ い に は、 免疫抑制活性 の誘導が行な わ れな い お そ れがあ り 、 多す ぎ る ばあ い に は、 細胞 に傷害を与え る 可能性が あ る 。 用 い る こ と がで き る 培地 と し て は、 た と え ば動物培養細胞用 培地、 D — M E Mや R P M I — 1 6 4 0 があ げ ら れ る 。 培地 に は、 さ ら に I L 一 2 、 G M — C S F な ど の リ ン ホ カ イ ン を、 単独 ま た は組み 合わせ て添加 し て も よ い。 こ れ ら を添加 す る こ と に よ り 、 細胞接着 タ ン パ ク 質単独で培養す る ば あ い よ り も 、 一般に、 よ り 強い免疫抑制活性を有す る 細 胞がえ ら れ る 。 添加す る 量 は と く に 限定 さ れな い が、 G M — C S F で は 0 〜 ； L O O n g Z m l 1 し ー 2 で は 0 〜 5 0 0 ュ ニ ッ ト Z m 1 が好ま し い。 多す ぎ る ば あ い に は、 や は り 細胞 に傷害を与え る 可能性があ る 。 ま た、 培 地 に血清を 含有 さ せ て も よ い。 好 ま し く は、 自 己血清を 用 い る 。 自 己血淸を用 い る と 細胞增殖性が よ く 、 非特異 的免疫反応 も お こ り に く く 、 最 も の ぞ ま し い。 血清の添 加量 は と く に 限定 さ れ な い が、 2 〜 1 0 %が一般的であ る 。 多す ぎ る ば あ い に は、 細胞 に 傷害を お よ ぼ し 、 增殖 能の 低下や サ ブ レ ッ サ ー 機能の誘導 に低下を き た す。 ヒ ト 細胞を こ の よ う な培地中、 通常 3 7 、 5 % C 0 ₂の 条件下で 1 〜 7 日 間培養す る こ と に よ り 、 免疫抑制性細 胞がえ ら れ る 。 自 己血清 と は、 培養 に 用 い る ヒ ト 細胞 と 同 じ 個体 よ り え ら れ た血清を い う 。

本発明 の 免疫抑制剤 は、 前記の 免疫抑制性細胞を有効 成分 と し て 含む も の で あ る 。 そ の ほか に、 製剤化 に必要 な成分を任意 に 含む こ と がで き る 。 そ の よ う な成分 と し て は、 た と え ば注射用 蒸留水、 食塩、 リ ン 酸、 ヒ 卜 血清 ア ル ブ ミ ン 、 カ ル シ ウ ム 塩、 マ グ ネ シ ウ ム 塩 な どがあ げ ら れ る 。 本発明 の免疫抑制剤の 投与経路 は 限定 さ れな い が、 カ テ ー テ ル な どの 医療器材を用 い、 全身 ま た は局所 に 投与 さ れ る の が好 ま し い。

本発 明 の 免疫 抑制 剤 は 、 す ぐ れ た 免疫 抑制作 用 を 有 し 、 かつ 副作用 が少な い。 し た が っ て、 免疫機能の異常 亢進 に よ っ て お こ る 疾患の治療、 た と え ば谩性関節 リ ウ マ チ、 全身性エ リ テ マ ト ー デス 、 慢性賢炎、 侵性甲状腺 炎、 自 己免疫.性溶血性贫血な どの 自 己免疫疾患の 治療、 ま た は臓器移植時の拒絶反応抑制、 さ ら に ア レ ルギー疾 患 の治療な ど に 有効で あ る 。

投与量 は 、 投与の 目 的、 す な わ ち 疾病の種類お よ び投 与す る 患者の症状の 程度 に よ っ て も 異な る が、 体外で処 理 し た細胞 を加 え る 治療法の ばあ い 、 成人一 日 あ た り 細 胞数 と し て 1 0 ⁶〜 5 X 1 0 ⁸儷 、 好 ま し く は 1 0 ⁶〜 1 0 ⁸個、 と く に 好 ま し く は 1 0 ⁶個で あ る 。

ま た細胞接着 タ ン パ ク 質を有効成分 と し て含む免疫抑 制剤を投与す る 治療法の ばあ い、 成人 に対 し て一 曰 あ た り 一般的 に 1 〜 ： L 0 0 m g 、 好 ま し く は 1 〜 ： L 0 m g 、 と く に好 ま し く l m g であ る 。

[実施例 ]

以下に実施例 を あ げて本発明を さ ら に詳 し く 説明す る が、 本発明 は かか る 実施例の み に 限定 さ れ る も の で は な い o

実施例 1 ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体 の製造

①動物培養細胞での ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質一量体 の生産

a ) ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質産生動物培養細胞形 質転換体の 分離

(発現ベ ク タ ー の作製）

P /8 L F A 3 — 1 の 作製 ：

図 1 に 示す よ う に 、 ヒ ト L F A — 3 ( h L F A - 3 ) を コ ー ド す る c D N A を 、 ヒ ト T 細胞株 M O L T — 4 ( A T C C N o . C R L — 1 5 8 2 ) よ り 調製 し た ポ リ A ( + ) R N A を 用 い て作製 し た 。 こ の c D N A に 対 し 、 そ れぞれ配列番号 1 3 お よ び 1 4 に示す プ ラ イ マ ー A お よ び B を用 い て P C R ( Polymerase Chain Beactio n) を行な い C 末端に シ ス テ ィ ン 残基 を 1 個 付加 し た D 2 領域 、 T M領域 お よ び C 領域 を 欠失 さ せ た L F A — 3 、 す な わ ち h D l H c y s タ ンノ、。 ク 質を コ ー ドす る c D N A (配列番号 7 ) を調製 し た。 こ の c D N A を制限 酵素 H i n d i I I 、 S a 1 I で切断 し た の ち 、 同 じ く 制限酵素 H i n d i I I 、 S a i l で切断 し た プ ラ ス ミ ド p U C 1 9 (宝酒造 （株） 製） と 結合 さ せ て、 プ ラ ス ミ ド p L F A 3 — 1 を作製 し た。 つ ぎに、 こ の プ ラ ス ミ ド を E c o R I で 部分消 化 し 、 さ ら に N c o l で 切 断 し 、 L F A — 3 断片を 回収 し た。

プ ラ ス ミ ド p S L T l d h f r は以下の よ う に し て作 製 し た。 ヒ ト L T発現ベ ク タ ー で あ る プ ラ ス ミ ド p yS L T 1 d h f r の構造を 図 5 に示す。 発現ベ ク タ ー の構築 に お い て は、 ま ず ヒ ト L T遗伝子の 開始部位 に N c 0 I 部位の導入 を行 な い、 ヒ ト iS — ァ ク チ ン 遺伝子の 1 . 2

K b の S a 1 I 一 N c o I 断片を ヒ ト L T遺伝子の 開始 部位 に結合 し た （図 5 ) 。 後述の よ う に 5 ' 側の 翻訳 さ れ な い 領域 、 約 1 . 2 K b の ヒ ト ^ ー ア ク チ ン 遺 伝 子 の 、 介在配列 （ イ ン ト ロ ン） 1 を 含む 5 ' 側 の 隣接配列 の すベて の 有用 な配列 を用 い た。 こ う し て プ ラ ス ミ ド p iS L T l の構築 と D N A の調製を行 な い、 す べて の ブ ラ ス ミ ドを大腸菌 H B 1 0 1 で增幅 し た。 p yS L T l は 5 ' 末端で ヒ ト ー ァ ク チ ン 遺伝子 プ ロ モ ー タ ー お よ び 3 ' 末端で S V 4 0 の ポ リ ア デニ ル化配列 に フ ラ ン キ ン グ し た ヒ ト ゲ ノ ム L T遺伝子を含有す る 。 ま た選択マ ー カ 一 と し て、 S V 4 0 の 初期 プ ロ モ ー タ ー に つ な が る 細菌 性の g p t 遗伝子を有す る 。 つ ぎ に、 ア デ ノ ウ イ ルス の 主 な 後期 プ ロ モ ー タ ー の転写制御下マ ウ ス の d h f r の c D N A遺伝子を含む X h o I Z S a l I 断片を、 p /8 L T 1 の S a 1 I 部位 に ク ロ ー ニ ン グす る こ と に よ り p L T 1 d h f r を構築 し た （ ァ グ リ カ ルチ ュ ラ ル ， ァ ン ド ， バ イ オ ロ ジ カ ル · ケ ミ ス ト リ ー （ Agricultural a nd Biological Chemistry) 5 5 卷 、 2 号 、 5 0 1 頁 ( 1 9 9 1 年） 中川 ら 参照） 。

前記の よ う に し て作製 し た P /S L T 1 d h f r を S a 1 I · E c o R I 消化 し 、 選択マ ー カ ー遺伝子を含む断 片を回収 し た。 同 じ く p S L T l d h f r を S a l I · N c o I 消化 し 、 プ ロ モ ー タ ー を含む断片を 回収 し た。 こ れ ら 2 断片 お よ び前記の L F A — 3 断片 を D N A リ ガ ー ゼで結合 さ せ、 大腸菌 J M 1 0 9 に形質転換す る こ と に よ り 、 目 的 の 発現 ベ ク タ ー P S L F A 3 — 1 を え た (図 1 ) 。 P S V L F A 3 — 1 の 作製 ：

図 2 に 示す よ う に 前記ベ ク タ ー P L F A 3 一 1 を制限 酵素 H i ri d l I I 、 B 1 I I で切断 し 、 L F A — 3 断片 （ h D l H c y s ) を え た。 つ ぎ に、 p S V 2 d h f r ( A T C C N o . 3 7 1 4 6 ) を 同 じ く H i n d i I I 、 B g 1 I I で切断 し 選択マ ー カ ー を含む断片を え た。 こ れ ら の 断片を結合 し プ ラ ス ミ ド p S V — L F A 3 を作製 し た。 こ のベ ク タ ー の制限酵素 B a m H I 切断箇 所 に、 p S V 2 d h f r を P v u l I お よ び B a m H I で切断 し て B a m H I リ ン カ 一を 付 け る こ と に よ り 調製 し た 断片 を挿入 し て、 発現ベ ク タ ー P S V L F A 3 — 1 を作製 し た。

( D N A の 細胞への導入お よ び形質転換株の 選択）

こ の よ う に し て作製 し た ベ ク タ ー P 9 L F A 3 — 1 あ る い は P S V L F A 3 — 1 ( 1 g ) お よ び C a C l 。 を 0 . 2 5 Mの濃度で含む溶液 2 5 0 # 1 を H E P E S 緩街食塩水 （ 2 8 0 m M N a C l 、 1 . 5 m M N a ₂ P 0 ₄、 5 0 m M H E P E S 、 p H 7 . 1 ) に 添 加 し 、 室温で 3 0 分間放置 し た の ち 、 直径 1 0 0 m mの プ ラ ス チ ッ ク 製培養皿中 で增殖 し て い る 培養細胞 （播種時 の 濃度 2 x 1 0 ⁵/ m l ) に こ の 溶 液 を 加 え る こ と に よ り ト ラ ン ス フ ヱ ク シ ヨ ン を 行 な っ た 。 培 養細胞 と し て は、 C H O - K l ( A T C C o . C R L 9 6 1 8 ) 、 C H O - D G 4 4 ( 米 国 コ ロ ン ビ ア 大学 の チ ェ イ ス ン

( Chasin) 教授 よ り 供与） 、 C H O — D H F R マ イ ナ ス 一 D U X — B 1 1 (米国 コ ロ ン ビ ア 大学の チ イ ス ン 教 授 よ り 供与） お よ び B H K ( A T C C N o . C R L 8 5 4 4 ) 細胞を使用 し 、 培養皿中 の 培養液 と し て は そ れぞ れ の 宿主細 胞 に 適 し た も の を 1 O m 1 用 い た 。 す な わ ち 、 C H 0 - K 1 、 B H K 細胞 に つ い て は、 5 % ゥ シ 血 清、 1 0 0 g / m 1 の ぺ ニ シ リ ン お よ び 1 0 0 μ g / m 1 の ス ト レ ブ ト マ ィ シ ン を補充 し た ダルべ ッ コ 変法 M E M培地 （ D — M E M、 日 水社製） を、 C H O - D G 4 4 お よ び C H 0 一 D H F R マ イ ナ ス 一 D U X — B 1 1 钿 胞 に つ い て は 、 先 と 同 様 の 補充 を し た ア ル フ ァ M E M (核酸含有） 培地を用 い た。

ト ラ ン ス フ エ ク シ ヨ ン の 3 〜 ： 1 6 時間後、 培地を除去 し 、 リ ン 酸緩衝食塩水 （ P B S 、 p H 7 . 2 ) で洗浄 し た。 培養皿 に 同 じ 組成の 培地を加え、 3 7 で で さ ら に 2 日 間細胞を培養 し た ο

そ の の ち 、 選択用試薬を含む新 し い培地 に 交換 し て培 養を铳 け た。 選択用試薬を含む培地 と し て は、 C H 0 - K 1 お よ び B H K 細胞 に は 2 5 8 111 1 の ミ コ フ エ ノ ー ル酸、 2 5 # g Z m l の ア デニ ン 、 2 0 0 # g / m \ の キ サ ン チ ン 、 S /i g Z ni l の チ ミ ジ ン お よ び 0 . 1 U g / m 1 の ア ミ ノ ブテ リ ン を含む D — M E M培地を、 C H 0 - D G 4 4 お よ び C H O — D H F R マ イ ナ ス ー D U X — B 1 1 細胞 に は核酸不含の 5 %透析 ゥ シ血淸含有ァ ル フ ァ M E M培地を用 い た。 プ ラ ス ミ ドを取 り 込み、 ミ コ フ エ ノ ー ル酸耐性遺伝子 g p t あ る い は d h f r 遠伝 子を 発現す る 細胞か ら 生 じ る コ ロ ニ ー は約 2 通間で観察 さ れ た。 ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質を産生す る 形質転 換体 を モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 T S 2 Z 9 を用 い た E L I S A 法 に よ り 同定 し た。 前記 T S 2 / 9 は ノ、 イ ブ リ ド ー マ H B 2 0 5 ( A T C C N o . H B 2 0 5 ) を マ ウ ス腹腔 内 で增殖 さ せ、 そ の 腹水中の抗体 T S 2 / 9 を、 プ ロ テ イ ン A を ァ ガ ロ ー ス ゲ ル に 固定 し た カ ラ ム （ ァ フ ィ ゲル プ ロ テ イ ン A、 バ イ オ ラ ッ ド社製） を用 い て精製 し て え た。 具体的 な 精製法 は、 ハ イ プ リ ド ー マ培養上清液を等 量の結合用 緩衝液 （ P H 9 . 0 ) (バ イ オ ラ ッ ド社製） と 混合 し 、 前記 カ ラ ム に ア プ ラ イ し た。 カ ラ ム 容量の 1 5 倍量の前記結合用緩衝液で洗浄後、 溶出用 緩衝液 （ p H 3 . 0 ) (バ イ オ ラ ッ ド社製） で溶出 し た 。 溶 出液は た だ ち に 1 M ト リ ス 塩酸 （ p H 9 . 0 ) で 中和 し た。 b ) E L I S A法に よ る ヒ ト D l H c y s タ ンパ ク 質産 生株の 同定

前記形質転換体の無血淸培養上淸 5 0 β 1 を マ イ ク 口 タ イ タ ー ゥ ヱ ル に 入 れ、 1 2 〜 1 6 時 間 4 で に 放 置 し た。 吸着後の 上清を ァ ス ピ レ ー タ ー で ゥ ヱ ルか ら 除去 し た の ち 、 0 . 0 5 % ッ ウ ィ ー ン 2 0 を含ん で い る P B S で 2 回洗浄 し 、 1 %ゼ ラ チ ン Z P B S 溶液 を加 え、 3 7 で で 1 時間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た。 イ ン キ ュ ベ ー ト し た の ち 0 . 0 5 % ッ ウ ィ ー ン 2 0 を含ん で い る P B S で洗浄 し 、 の T S 2 Z 9 溶液 （ P B S ) 5 0 1 を加え、 3 7 で で 1 時間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た。 そ の の ち 0 . 0 5 % ッ ウ ィ ー ン 2 0 を含む P B S で 3 回 洗浄 し 、 西洋 ヮ サ ビペ ルォ キ シ ダ ー ゼ一標識化 ゥ サ ギ抗 マ ウ ス I g G ( P B S 中） 5 0 # 1 を加え、 3 7 で で 1 時間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た。 ゥ エ ル を 0 . 0 5 % ッ ウ イ 一 ン 2 0 を含む P B S で 5 回洗浄後、 0 . l m g の オ ル ト フ ヱ ニ レ ン ジ ア ミ ン Z m 1 を含有す る ク ェ ン 酸 リ ン酸緩 衝液 （ p H 5 ) 1 0 m l に 3 0 % H _nO ₂水溶液 を 加え た も の を 1 0 0 # 1 を各 ゥ エ ル に加え た。 ゥ エ ルを

3 0 分間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 、 2 . 5 M 硫酸 1 0 0 / 1 で反応を停止 さ せ、 4 9 2 n m に お け る 吸光度を マ ル チ ス キ ャ ン （ タ イ タ ー テ ッ ク 社製） で測定 し た。 前記の p S L F A 3 一 1 あ る い は p S V L F A 3 — 1 の形質転換 体 の ア ツ セ ィ 結果を 図 3 に 示 し た。 お も な 、 ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル お よ び仮の ス タ ン ダ ー ド と し て、 ェ ム ェ ル ダ ス チ ン （ M. L. Dust in) ( ジ ャ ー ナ ル ， ォ ブ * ェ ク ス ぺ リ メ ン タ ル * メ デ ィ シ ン 1 6 5 卷、 6 7 7 頁 （ 1

9 8 7 年） 参照） ら の 方法で J Y細胞 よ り 精製 し た天然 型 L F A - 3 分子を使用 し た。 ま た コ ン ト ロ ー ル群 と し て前記の p S V 2 d h f r で形質転換 し た株を数株 E L I S A ア ツ セ ィ に供 し た。

c ) 動物培養細胞産生 ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質の抗 体 力 ラ ム に よ る 精製

モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 T S 2 Z 9 を分泌す る マ ウ ス の セ ル ラ イ ン H B 2 0 5 ( A T C C N o . H B 2 0 5 ) を マ ウ ス 腹腔内 で增殖 さ せ、 そ の腹水中 の抗体 T S 2 Z 9 を 前記 と 同様 に し て プ ロ テ イ ン A固定化 カ ラ ム に よ り 精製 し た 。 つ い で カ ラ ム 溶 出物を、 N — ノヽ イ ド 口 キ シ サ ク シ ニ ミ ド エ ス テ ル を リ ガ ン ド と す る ァ フ ィ ゲル 1 0 ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム （ バ イ オ ラ ッ ド社製） に 、 3 m g Z m 1 (樹脂） の 濃度で カ ッ プ リ ン グ さ せ た 。 こ の カ ラ ム （ 5 m 1 ) を P B S 、 溶出用緩衝液 5 0 m M グ リ シ ン 一 H C 1 ( p H 3 . 0 ) 、 0 . 2 5 M N a C l 、 そ し て最 後 に P B S で順次平衡化 さ せ た。

前記 b ) で、 E L I S A で陽性 と 判断 し た株の無血清 培養上淸を 1 時間 に 4 0 m 1 の割合で前記 カ ラ ム に付 し た。 P B S で よ く 洗浄 し た の ち 、 前記溶出用 緩銜液で特 異的 に結合 し た物質を 溶離 し 、 た だ ち に 等量の 1 M ト

造①作実で後②一析ルで mおを合cン aHし 8リリc C

ス ー H C 1 ( p H 8 . 5 ) で p H を 中性 に 戻 し 、 4 保存 し た o

ヒ 卜 D 1 H c y s タ ン ⁰ ク 質二量体の作製

前記①で え ら れた ヒ ト D 1 H c y s タ ン パ ク 質画分 5 1 ( 1 m g / m 1 ( 5 0 m M ダ リ シ ン 一 H C 1 ( p 3 . 0 ) と 1 M ト リ ス 塩酸 （ P H 8 . 5 ) の等量混 液中） ：) に 5 0 m M ト リ ス塩酸、 2 m M E D T A よ び 5 0 m M 2 — メ ル カ ブ ト エ タ ノ ー ル 8 0 m l 加え、 全量を 8 5 m 1 に し た。 こ の 液を 5 0 m M ト ス塩酸、 2 m M E D T A ( P H 8 . 5 ) 5 L に対 し 晚透析 し た。 こ の 間 に徐 々 に二量体形成が お こ り 、 透 液を分子量 カ ツ h 3 0 0 0 の 限外滅 ½膜を 用 い て濃縮 、 5 0 m M ト リ ス 塩酸、 2 m M E D T A ( p H . 5 ) で平衡化 し た 直径 2 . 2 c m、 3 2 0 m 1 の ゲ 滅過 カ ラ ム セ フ ア ク リ ル ( S e p h a c ryl) S - 2 0 0 フ ァ ノレ マ シ ア 社 よ り 購入） に 流速 5 7 m 1 h r で付 た。 同流速で前記緩衝液を流 し 、 ヒ 卜 D 1 H c y s タ パ ク 質二量体 と一量体の 分離を行な つ た。 収量 は全体 6 7 0 g であ つ た 0

施例 2 ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質二量体の製 大腸菌で の ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ンパ ク 質一: ft体の 製

. 可溶化 D 2 領域欠失型 ヒ ッ ジ L F A — 3 タ ン パ ク 質 以下、 ヒ ッ ジ Δ D 2 タ ン パ ク 質 と 呼ぶ） c D N A の P R用 プ ラ イ マ ー の 合成

ヒ ッ ジ 厶 D 2 タ ン ク 質の c D N A の P C R用 プ ラ イ マ 一 と し て、 制限酵素 B a m H I の認識配列 を含む配列 と 引 き 続 く E列番号 1 5 に 示す L F A — 3 の 1 番か ら 7 番の ア ミ ノ 酸 列か ら 予想 さ れ る D N A E列 と を有す る 配列番号 1 6 で示 さ れ る 混合 プ ラ イ マ ー 、 お よ び制限酵 素 P s t I の 認識配列 を含む配列 と 引 き 続 く E列番号 1 5 の 2 2 番か ら 2 7 番の ア ミ ノ 酸配列か ら 予想 さ れる D N A 配列 と を有す る 配列番号 1 7 で示 さ れ る プ ラ イ マ ー を D N A 合成機 （ モ デ ル 3 8 1 A 、 ア プ ラ イ ド バ イ オ シ ス テ ム ズ社） を使用 し 合成 し た。

b . ヒ ッ ジ細胞 由来二重鎖 c D N A の 調製

ヒ ッ ジ か ら 血液 1 0 0 m l を へパ リ ン採血 し 、 3 5 0

G , 1 0 分の 遠心 に よ り バ フ ィ 一 コ ー ト 画分を え た。 赤 血球溶解液で赤血球を溶解後、 等張 リ ン酸緩衝液で 2 回 洗浄 し ヒ ッ ジ 白血球細胞 を え た。 つ ぎに ヒ ッ ジ 白血球細 胞 か ら チ オ シ ア ン 酸 グ ァ ニ ジ ン 法 に よ り R N A を 抽 出 し 、 さ ら に オ リ ゴ （ d T ) セ ル ロ ー ス カ ラ ム に よ り ポ リ

A ( + ) R N A を 精製 し た （ ラ ボ マ ニ ュ ア ル遠 伝 子 ェ 学、 村松正実編、 丸善 （ 1 9 8 8 年） 参照） 。 ポ リ A ( + ) R N A か ら の 二重縝 c D N A の 合成 は市販の キ ッ ト （ユ ー 一 プ リ ム （ You-Prime) c D N A 合成 キ ッ ト 、 フ ア ル マ シ ァ 社製） を 用 い て合成 し た。

C . ヒ ッ ジ Δ D 2 タ ン パ ク 質の D N A 配列の P C R 法 に よ る 增幅 と ク ロ ー ニ ン グ

ヒ ッ ジ △ D 2 タ ン ノ、' ク 質の c D N A を P C R 法 に よ つ て試験管内 で増幅 し た。 す な わ ち 1 O m M ト リ ス塩酸 ( p H 8 • 3 ) 、 1 0 0 m M 塩化 カ リ ウ ム 、 1 . 5 m M 塩化マ グ ネ シ ウ ム 、 0 . 0 1 % ゼ ラ チ ン 、 前記 a で 合成 し た 2 種類の混合 プ ラ イ マ ー 各 々 1 0 μ M、 前記 b で調製 し た ヒ ッ ジ 白血球 c D N A 1 0 n g 、 0 . 2 m M 4 種の デォ キ シ リ ボ ヌ ク レ オ チ ド三 リ ン 酸、 T a q D N A ポ リ メ ラ ー ゼ 2 . 5 単位を含む反応混合物 1 0 0 /z 1 を 9 4 で 1 分、 3 7 で 2 分、 7 2 で 2 分の 反応条件で 3 5 サ イ ク ソレの P C R を行な っ た。 反応後、 P C R生成 物の 大 き さ を ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル電気泳動 に よ り 測 定 し た結果、 約 1 0 0 塩基対の D N A が増幅 さ れて い る こ と を認め た。 こ の約 1 0 0 塩基対の D N A を ゲルか ら 抽 出 し 、 制 限酵素 B a m H I 、 P s t I 処理後、 M 1 3 m p l 9 フ ァ ー ジ ベ ク タ ー （宝酒造 （株） 製） の B a m H I — P s t l 部位 に 組み込み、 大腸菌 J M 1 0 9 を宿 主 と し て用 い て ク ロ ー ニ ン グ し た。

d . P C R に よ っ て增幅 さ れた遺伝子の配列決定

前記 c で え ら れた II性 ク ロ ー ン か ら 調製 し た約 1 0 0 塩基対の D N A の配列 を ダイ デォ キ シ ヌ ク レ オ チ ド三 リ ン 酸を用 い た常法に よ り 決定 し た。 そ の結果、 P C R に 用 い た 2 種の プ ラ イ マ ー 間の E列 は、 配列番号 1 8 で示 さ れ る D N A の 配列の 1 9 番か ら 6 5 番 ま で の塩基配列 で あ る と 決定 さ れた。 こ の配列 は の ち に決定 さ れた ヒ ッ ジ 厶 D 2 タ ン パ ク 質の ア ミ ノ 酸配列で あ る 配列番号 1 9 の 7 番の グ リ シ ン （ G 1 y ) か ら 2 2 番の プ ロ リ ン （ P r 0 ) に 対応 し て お り 、 ヒ ッ ジ Δ D 2 タ ン ノ、 · ク 質の c D N Aが前記の塩基 E列 を有す る こ と を示 し て い る 。 こ の D N A配列 は配列番号 1 9 の 7 番か ら 2 2 番の ア ミ ノ 酸 を コ ー ド し て い る 。

e . ヒ ッ ジ A D 2 タ ン ノ、。 ク 質の c D N A の 取得

ヒ ッ ジ A D 2 タ ン パ ク 質の全長の c D N A を ク ロ ー 二 ン グす る た め に、 前記 d で決定 し た ヒ ッ ジ A D 2 タ ン パ ク 質の N 末端の c D N A配列を プ ロ ー ブ と し て ヒ ッ ジ c D N A ラ イ ブ ラ リ ー を ス ク リ ー ニ ン グ し た。 す な わ ち 、 前記 b で作 つ た ヒ ッ ジ 白血球由 来の二重鎖 c D N A を D N A ポ リ メ ラ ー ゼ処理で平滑末端 に し 、 E c 0 R I リ ン カ ー （ フ ア ル マ シ ア 社製） を接続 し 、 さ ら に E c o R I で切断 し 、 ァ ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ処理 し た ； L g t 1 1 ( ス ト ラ タ ジ ー ン社製） の左右の ア ー ム を接蜣 し た。 イ ン ビ ト ロ パ ッ ケ ー ジ ン グを行 な い c D N A ラ イ ブ ラ リ 一を作製 し た。 ヒ ッ ジ Δ ϋ 2 タ ン パ ク 質の N 末端近傍の c D N A配列を有す る プ ロ ー ブ、 配列番号 2 0 お よ び配 列番号 2 1 を 合成 し た 。 約 2 0 万 の組換え フ ァ ー ジ を こ れ ら の プ ロ 一 ブで ス ク リ ー ニ ン グ し た結果、 1 . O k b (キ ロ ベ ー ス ) 〜 1 . 2 k b の イ ン サ ー ト c D N Aを含 有す る 3 株の 隔性 ク ロ ー ン （ S L — 6 、 S L — 4 0 、 S L 一 4 3 ) を え た。 こ れ ら の »性 ク ロ ー ン の う ち 、 S L 一 4 0 の c D N A配列 を M l 3 フ ァ ー ジ を用 い た ダイ デ ォ キ シ法に よ り 決定 し た結果、 ヒ ッ ジ A D 2 タ ン パ ク 質 は配列番号 1 8 に示 し た塩基配列 に よ り コ ー ド さ れ、 ま た配列番号 1 9 に示 し た ア ミ ノ 酸配列を有す る こ と がわ か っ た。 ま た メ チォ ニ ン （ M e t ) か ら 始 ま る 2 8 ア ミ ノ 酸残基の シ グ ナ ルぺ プチ ドを有す る こ と も わか っ た。 こ の え ら れ た ヒ ッ ジ A D 2 タ ン パ ク 質の c D N A塩基配 列 の情報 に も と づ き 天然型の ヒ ッ ジ Δ D 2 タ ン パ ク 質お よ び誘導体を、 遺伝子工学的 に組換え体で生産で き る 。

E列番号 2 2 は、 ウ ォ ル ナ ー ら （ ビ ー ， ピ ー · ゥ オ ル ナ 一 ら 、 ジ ャ ー ナ ル · ォ ブ · ェ ク ス ペ リ メ ン タ ル * メ デ ィ シ ン 1 6 6 卷、 9 2 3 頁 （ 1 9 8 7 年） 参照） に よ っ て 報告 さ れて い る ヒ ト L F A — 3 の ア ミ ノ 酸配列、 配列番 号 2 8 は そ の D N A配列で あ る 。 ま た、 図 4 は配列番号 2 2 の ヒ ト L F A — 3 の ア ミ ノ 酸配列 と 配列番号 1 9 の ヒ ッ ジ 厶 D 2 タ ン パ ク 質の ア ミ ノ 酸配列 と 対応 さ せ た 図 であ る 。 図 4 よ り 、 ヒ ッ ジ △ D 2 タ ン パ ク 質が ヒ ト L F A - 3 に あ る D 2 領域 （下線を 引 い た部分） を欠 い て い る こ と が理解 さ れ る 。

f . ヒ ッ ジ Δ D 2 タ ン パ ク 質の大腸菌の発現べ ク タ 一 の 作製

ヒ ッ ジ 厶 D 2 タ ン パ ク 質を大腸菌で発現す る た めの発 現ベ ク タ ー を構築 し た。

す な わ ち 、 前記 e で え ら れ た c D N A ク ロ ー ン S L —

4 0 に含 ま れ る ィ ン サ ー ト D N A を制限酵素 E c 0 R I で切 り 出 し 、 プ ラ ス ミ ド p U C 1 8 の E c o R I 部位に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し た。 つ ぎに、 こ の プラ ス ミ ド につ い て P C R を行な っ た。 使用 し た 5 ' 側 プ ラ イ マ ー は配列 番号 2 3 に 示 さ れて い る 。 こ の プ ラ イ マ ー は B a m H I 認識配列、 N c 0 I 認識配列 お よ び配列番号 1 8 の 1 番 か ら 7 番の ァ ミ ノ 酸配列か ら 予想 さ れ る D N A配列 と か ら 構成 さ れて い る 。 使用 し た 3 ' 側 プ ラ イ マ ー は配列番 号 2 4 に 示 さ れて い る 。 こ の プ ラ イ マ ー は P s t I 認識 配列、 終止 コ ド ン の配列、 配列番号 1 8 の 3 0 1 番か ら 2 7 7 番ぉ よ び 3 7 1 番か ら 3 5 8 番の塩基配列 と か ら 構成 さ れて い る 。 配列番号 2 3 と 2 4 の プ ラ イ マ ー を用 い て P C R を行な い 、 増幅 さ れた D N A断片を制限酵素 B a m H I ： P s t l で切断 し M 1 3 m p l 9 フ ァ ー ジ ベ ク タ ー の B a m H I — P s t I 部位に挿入 し 、 ダ イ デ ォ キ シ 法 に よ り 導入 さ れ た D N A の 塩基配列 を 確 認 し た。 つ ぎ に M l 3 フ ァ ー ジ ベ ク タ ー か ら ヒ ッ ジ D 1 H C タ ン パ ク 質の遺伝子を制限酵素 N c 0 I お よ び P s t I で切 り だ し 、 発現用 ベ ク タ ー P K K 2 3 3 — 2 ( フ ア ル マ シ ア 社製） の N c o I — P s t I 部位 に 接統 し 、 発現 ベ ク タ ー を作製 し た。 こ の発現ベ ク タ ー を p K S L D l H C と 呼ぶ。 p K S L D l H C に 含 ま れ る ヒ ッ ジ D 1 H C タ ン パ ク 質誘導体を コ ー ドす る 開始 コ ド ン か ら 終止 コ ド ン ま で の 塩基配列 を配列番号 2 5 に 示 し た。

g . シ ス テ ィ ン 残基 を 含 む ヒ ッ ジ D 1 H C タ ン ノ、。 ク 質 (以下、 ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ン パ ク 質 と 呼ぶ） 誘導 体の 大腸菌用発現べ ク タ ー の作製

シ ス テ ィ ン残基を カ ル ボキ シ 末端 に 有す る ヒ ッ ジ D 1 H C タ ン パ ク 質を大腸菌で発現す る た め の 発現べ ク タ 一 を構築 し た。 前記 ί でえ ら れた ヒ ッ ジ D 1 H C タ ンノ、 ' ク 質の c D N A を有す る プ ラ ス ミ ド p K S L D l H C の D N A を錄型 に し て P C R を行な っ た。 使用 し た 5 ' 側 プ ラ イ マ ー は前記 f で使用 し た も の で あ り 、 配列番号 2 3 に 示 さ れて い る 。 使用 し た 3 ' 側 プ ラ イ マ ー は配列番号 2 6 に示 さ れて い る 。 こ の プ ラ イ マ ー は、 H i n d i I I 認識配列、 P s t I 認識配列、 終止 コ ド ン 配列、 シ ス テ ィ ン残基の 配列、 統 い て配列番号 2 5 の 3 1 8 番か ら 2 9 5 番の塩基配列 と か ら構成 さ れて い る 。 配列番号 2 3 と 2 6 の プ ラ イ マ ー を用 い て P C R を行な い、 增幅 さ れ た D N A 断片を制限酵素 B a m H I と P s t I で切断 し M l 3 m p 1 9 フ ァ ー ジ ベ ク タ ー の B a m H I 一 P s t I 部位 に 挿入 し、 ダイ デォ キ シ 法 に よ り 導入 さ れた D N A の塩基配列を確認 し た。 つ ぎ に M l 3 フ ァ ー ジ べ ク タ ー か ら 、 ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質の ¾伝子を 制限酵素 N c o I お よ び P s t I で切 り だ し 、 発現用 べ ク タ 一 P K K 2 3 3 — 2 ( フ ア ル マ シ ア社製） の N c o I 一 P s t I 部位に 接続 し 、 発現ベ ク タ ー p K S L D l H C c y s を作製 し た。 p K S L D l H C c y s に含 ま れ る ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン ノ、。 ク 質を コ ー ドす る 開始 コ ド ン か ら 終止 コ ド ン ま での塩基配列 を配列番号 2 7 に 示 し た。

h . ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ン パ ク 質一量体の作製

ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ンノ、。 ク 質の 発現ベ ク タ ー p K S L D l H C c y s を 含有す る 大腸菌 J M 1 0 9 (宝酒 造 （株） 製） を前培養後、 1 0 m g の ア ン ピ シ リ ン を含 む 1 0 0 m l の L B 培地 （ 0 . 5 %イ ー ス ト エ キ ス （デ ィ フ コ 社 製 ） 、 1 % パ ク ト ト リ プ ト ン （ デ ィ フ コ 社 製） 、 l % N a C l ) に 播種 し 、 5 0 0 m l の坂 ロ フ ラ ス コ で （株） 日 立製作所製 ス ぺ ク ト ロ フ ォ ト メ ー タ ー U 一 2 0 0 0 に よ り 波長 6 0 0 n mで の 吸光度が 0 . 3 に な る ま で 3 7 でで振 と う 培養 し た。 つ ぎに I P T G を終 濃度 I m Mで加え、 さ ら に 6 時間培養 し た。 培養 し た菌 体 を 遠心 （ 1 0 0 0 x g 、 1 0 分 間、 4 ） に よ り 集 め、 5 0 m M E D T A、 5 % ト リ ト ン X — 1 0 0 お よ び 8 % シ ョ 糖 を 含有 す る 5 0 m M ト リ ス 塩酸 （ p H 8 . 0 ) 1 0 m l に 懸菊 し 、 リ ゾチ ー ム を終濃度 0 . 1 %加え た。 こ の 菌体懸濁液を氷上で充分冷却 し た の ち 、 超音波破砕機 （ ブ ラ ン ソ ン 社製） を用 いて 1 0 分間超音 波処理を行 な っ た。 こ の操作を 3 回繰 り 返 し た の ち 、 遠 心分離 （ 6 0 0 0 x g 、 1 0 分間、 4 で） し 不溶性の沈 殿画分を え た。 こ の 沈殿を 5 0 % グ リ セ ロ ー ル、 ェ タ ノ ー ルで洗浄 し 、 生産 さ れた D l H C c y s タ ン パ ク 質の 顆粒体を え た。

② ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ン パ ク 質顆粒体の 可溶化、 再 構成 と 二量体化

前記の よ う に し て え ら れ た顆粒体 1 2 . 5 m g を 8 M 尿素、 5 0 m M ト リ ス 、 2 m M E D T A、 5 0 m M 2 — メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル （ P H 8 . 5 ) 8 0 m l 5 に溶解 し 、 4 で一晩撹拌後遠心 （ 6 0 0 0 x &、 1 0 分間、 4 で） し 、 上淸を採取 し た。 上澝 8 0 m l に 5 0 m M ト リ ス 、 2 m M E D T A お よ び 5 0 m M 2 — メ ノレ カ プ ト エ タ ノ ー ル 1 7 0 m l を加え、 全量を 2 5 0 m l に す る 。 こ の 液を 5 0 m M ト リ ス 、 2 m M E it) D T A ( p H 8 . 5 ) 1 0 L に 対 し 一晚透析す る 。 え ら れ た透析液を分子量 力 ッ ト 3 0 0 0 の 限外 過膜を用 い て濃縮後、 実施例 1 と 同様 に 5 0 m M ト リ ス 、 2 m M E D T A ( p H 8 . 5 ) で平衡化 し た ゲル »過 カ ラ ム (セ フ ア ク リ ル S — 2 0 0 ) ( フ ア ル マ シ ア 社製） に か s け 、 ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ン ノ、。 ク 質ニ量体 画 分 を え (収量全体 と し て 5 5 0 # g ) 、 濃縮後精製品 と し た。 試験例 1 ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質分子 （一量体、 二量体） お よ び ヒ ッ ジ D l H C c y s (—量体 、 二 量 体） の免疫抑制効果

0 免疫反応の イ ン ビ ト ロ の モ デル系 と し て一般的 に用 い ら れ る P P D (精製 タ ン パ ク 誘導体 （ Purified Protein Derivative) ) 抗原 に よ る T 細胞 の 活性化反 応 に 対 し て、 本発明 の ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体お よ び ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質二量体が ど の程度の抑5 制 を示す か、 そ の T 細胞の表面抗原 の 発現 に どの よ う な 変化を も た ら す の かを調べ る こ と に よ り 免疫抑制効果を 検討 し た。

( P P D 活性化反応） 1 0 % の ォ ー ト ロ ー ガ ス 血清お よ び 0 ^_6M の 2 — メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル を 含む R P M I — 1 6 4 0 ( シ グマ 社製） で 1 X 1 0 ⁶Z m l の 濃度 に 調 製 し た 正常 ヒ ト 末 梢血細胞を 9 6 ゥ エ ル平底 プ レ ー ト に 1 0 0 μ 1 ずつ分 注 し た 。 各 ゥ エ ル に P P D ( 日 本 ビ ー シ ー ジ 一 製 造 (株） 製） を終濃度 l # g Z m l に な る よ う に加え、 同 時 に ヒ ト D l H c y s タ ン ノ、。 ク 質ニ量体お よ び ヒ ト D 1 H e y s タ ン パ ク 質一量体を そ れぞれ約 5 μ g / m 1 、 6 0 g Z m 1 の終濃度 に な る よ う に 加え 5 日 間培養 し た （ イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中、 S ^ C O ^ 3 7 ） 。 そ の の ち 、 1 /i C i の ³ H を各 ゥ ヱ ル に 添加 し 、 5 時 間培養 し た の ち に細胞を セ ルノヽ 一 べ ス タ ー （ ラ ボマ ッ シ ュ （ LA

BO MASH) 、 ラ ボサ イ エ ン ス ( LABO SCIENCE) 社製） を 用 い て集め 、 そ の細胞中 に 取 り 込 ま れ た ³ H の 放射活性 を シ ン チ レ ー シ ヨ ン カ ウ ン タ ー L S C — 7 0 0 (ァ ロ カ

( Aloka) 社製） を用 い て 測 定 し た 。 コ ン ト ロ ー ル と し て細胞の み 、 タ ン パ ク 質を加え る かわ り に 等量 （ 1 0 //

1 ) の P B S を細胞 に加え た も の 、 ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体の み、 ヒ ト D l H c y s タ ン ノ、' ク 質ー量 体の み を加 え た ゥ エ ル も 測定対象 と し た。 ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質分子 に つ い て も 同様 の 測定 を 行 つ た o

そ の結果、 図 6 に示 し た よ う に 、 ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体 は約 5 β g / 1 の 終濃度で 8 5 % の抑 制活性を示 し た。 そ れ に対 し て、 一量体 は 6 0 / g Z m 1 で も 3 0 %程度の抑制で あ っ た。 ま た、 ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質二量体 は 同 じ く 約 5 / g Z m 1 で 9 0 % の抑制、 図 に は示 さ な いが、 一量体で 3 3 % の抑制 活性を示 し た。

(表面抗原 の フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解析）

ヒ ト T 細胞表面抗原 と し て C D 3 分子の 発現 に対す る ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体の影響を 調べ た

0 % の ォ ー ト ロ ー ガ ス 血淸 0 "M (D 2 — メ ルル %カ ブ ト エ タ ノ ー ル を含む R P M I 一 1 6 4 0 で 1 X 1 0 6 / m 1 の 濃度 に調製 し た正常 ヒ ト 末梢血細胞 を 9 6 ゥ ェ ル平底プ レ ー ト に 1 0 0 # 1 ずつ 分注 し た。 ヒ ト D 1 H c y s タ ン パ ク 質二量体を終濃度 5 μ g / m 1 に な る よ う 加え、 3 7 、 C 0 ₂イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中 で 8 日 間培 養す る 。 コ ン ト ロ ー ル と し て等量の P B S を加え た も の を 同条件で培養 し た。 培養終了後細胞を集め 、 蛍光榡識 し た抗 C D 3 抗体 （オ ル ソ ダイ ァ グ ノ ス テ イ ク ス シ ス テ ム ズ ( Ortho Diagnostics Systems) 社製） を 用 い て、 エ ピ ッ ク ス エ リ ー ト （ EPICS ELITE) ( コ ー ル タ ー ( Coulter) 社製） に よ り フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解析 を 行 っ た。 ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ンパ ク 質二量体 に つ い て も 同様の 解析を行 な っ た。

そ の結果、 ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体 と イ ン キ ュ ペ ー ト し た ヒ ト T 細胞上 の C D 3 分子 の 発 現 （ 図 8 ) が無処理群 （図 7 ) と 比べて有意 に低下 し て い た。 図 9 は一量体 D l H c y s タ ン パ ク 質で処理 し た と き の フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー の ノ タ ー ン を示す。 ま た、 ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質二量体 に つ い て も 同様の結果 がえ ら れ た。

以上の結果か ら 、 C D 3 分子 は P P D な ど の抗原 に よ る T 細胞の 活性化 に必須の も の で あ り 、 こ の 発現抑制 は 活性化の抑制 に つ な が る た め、 ヒ ト D 1 H c y s タ ンノ、' ク 質ニ量体分子 お よ び ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質 二量体分子 は C D 3 分子の 発現抑制 に よ り 免疫抑制を も た ら す こ と が強 く 示唆 さ れ る 。 し た が っ て、 そ の免疫抑 制の メ カ ニ ズ ム は、 抗 C D 2 抗体の 免疫抑制 メ カ ニ ズム と は 明 ら か に異なる も の であ る。 ま た、 ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体お よ び ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質ニ量体 は抗体の F c 領域を も た な い の で、 N K細胞 な ど に よ る 細胞障害反応を 引 き お こ す こ と も あ り えず、 副作用 の少な い理想的 な免疫抑制作用 を発現す る 。

本発明 の二量体分子の免疫抑制 メ カ ニ ズム に つ い て、 以下の よ う な 考察を行 な っ た。 す な わ ち 、 自 己免疫疾患 や臓器移植時 に お け る 拒絶反応 は基本的に は 自 己あ る い は外来の抗原 に対す る T細胞の反応で あ り 、 そ れ は そ れ ら の 抗原を 提示す る マ ク ロ フ ァ ー ジ ゃ榭状細胞 と T細胞 と の接触 に 起因 し て い る 。 そ の 接触反応に 関与 し て い る 細胞上の 分子 は抗原提示側 の抗原 と M H C (主要組繳適 合抗原 ( Major HistoCompatible antigen) ) 分子 と の 複合体 と T 細胞側の T C R ( T細胞受容体 （ T Cell Rec eptor) ) と の結合を 中心 に そ の ほ か ア ク セ サ リ ー 分子 と 呼ばれ る C D 2 — L F A — 3 や C D 2 8 — B 7 の結合 が一般的 に知 ら れて い る 。 ピ ー ブ レ ツ チ ヤ ー （ P. Bre tscher) (サ イ エ ン ス （ Science) 1 6 9 卷、 1 0 4 2 頁 （ 1 9 7 0 年） 参照） ら の報告に よ る と T細胞の活性 化 は （ M H C + 抗原） 一 T C R結合 に起因す る シ グナ ル と そ れ以外 の結合ペ ア に よ る 別の シ グナ ルが必須で あ る と さ れて い る 。 こ の 考え に も と づ き 、 本発明 の タ ン パ ク 質二量体の 免疫抑制 メ 力 二 ズム と し てつ ぎの 2 つ が考え ら れ る 。 1 ) C D 2 — L F A — 3 結合が前記 2 シ グ ナ ル説の セ カ ン ド シ グ ナ ル と し て必須の も の で あ り 、 本発明の タ ン パ ク 質二量体が こ の結合を阻害す る こ と で （ M H C + 抗原） 一 T C R結合か ら の シ グ ナ ルの み と な り 、 T钿 胞は不応答状態 と な る 。

こ れ は抗原特異的 な T細胞の 不応答化を導 く も の で あ り 、 副作用 を考慮す る と 、 最 も 理想的 な 免疫抑制で め ) o

2 ) 本発明 の タ ンパ ク 質二量体の C D 2 分子への結合が T細胞機能を抑制す る 何 ら かの シ グ ナ ルを生み 出す。 こ れ は抗原特異的で な く 、 T細胞 に対 し 非運択的に 働 く 可能性が高 い。 し か し な が ら 、 F c 領域 を有す る 分 子 の よ う な 傷害 は起 ら な い の で、 副作用 は比較的軽 い も の で め る と ^^ り れ ¾) θ

本発明の 夕 ン パ ク 質二量体 は前記 い ずれか ま た は両方 の メ カ 二 ズ ム に よ り 免疫抑制活性 を示す と 考え ら れ る 。 実施例 3

a . ヒ 卜 末梢血細胞の τ 細胞の比率を高め た 画分か ら の 免疫抑制性 T細胞の作製

1 0 %の ォ ー ト ロ ー ガ ス血淸を含む R P M I 一 1 6 4 0 ( シ グ マ社製） で 1 X 1 0 ⁶/ m 1 の 濃 度 に 翻製 し た 正常 ヒ ト 末梢血細胞を 2 5 c m ²の 培 養 フ ラ ス コ に 1 0 m 1 播種 し た。 一晚培養後、 浮遊細胞を含む培養液を 回 収 し 、 1 2 ゥ エ ル プ レ ー ト 中 の ゥ ヱ ル に 各 2 m 1 移 し た o 前記 ゥ エ ル に ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体あ る い は ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ンメ、 ' ク 質二量体を 0 . 5 fi g / m 1 の 終濃度 に な る よ う に 加 え 7 日 間培 養 し た ( イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中、 5 % C O _n、 3 7 で ） 。 コ ン ト ロ ー ル と し て P B S の み を 2 0 0 1 加え た細胞の培養 系を用 い た 。 そ の の ち 、 細胞を血清を含 ま な い R P M I 一 1 6 4 0 培地で 3 回洗浄 し 、 1 0 %オ ー ト ロ ー ガ ス血 清を含む R P M I — 1 6 4 0 培地 中 に 3 . 3 x 1 0 ⁶/ m l に な る よ う に懸濁 し た。 さ ら に こ れを 同 じ 培地で 2 倍、 4 倍希釈 し た細胞懸濁液を作製 し た。

b . ヒ ト 末梢血細胞全体画分か ら の 免疫抑制性 T細胞の 作製

1 0 %の ォ ー ト ロ ー ガ ス血清を 含む R P M I 一 1 6 4 0 ( シ グマ 社製） で l x l 0 ⁶Z m l の 濃度 に 調製 し た 正常 ヒ ト 末梢血細胞を 1 2 ゥ ヱ ル プ レ ー ト の 各 ゥ ヱ ル に 各 2 m l 播種 し た。 前記 ゥ ヱ ルの 一部 に ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体あ る い は ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ン パ ク 質二量体を 0 . 5 g Z m l の終濃度 に な る よ う に 加え、 7 日 間培養 し た （イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中、 5 % C O ₂、 3 7 ） 。 同時 に前記 の 添加 さ れ た ゥ エ ル お よ び 別 の ゥ エ ル に G M — C S F ( ア ー ル デ ィ ー シ ス テ ム ズ ( BD systens) 社製 （終濃度 1 0 n g Z m l ) 、 I L - 2 (べ ク ト ン · デ ィ ッ キ ン ソ ン社製） （終濃度 2 0 ュニ ッ ト ク m l ) を単独あ る い は両方添加 し た系 を加え、 同 じ く 7 日 間培 養 し た （ イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中 、 5 % C O ₂、 3 7 で） o そ の の ち 、 細 胞 を 血清 を 含 ま な い R P M I 一 1 6 4 0 培地で 3 回洗浄 し た。 細胞を 1 0 %オ ー ト ロ ー ガ ス 血清を含む R P M I — 1 6 4 0 培地中 に 0 . 8 2 5 X 1 0 ⁶ 111 1 に な る よ う に懸濁 し た。

c . 本発明 の免疫抑制剤の調製

前記 a と 同様に ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 二量体あ る い は ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質二 i体を添加 し て培養 し た 細胞を遠心分離 に よ り 回収 し 、 生理食塩水で 3 回洗浄 し 、 最終的 に 生理食塩水でえ ら え た細胞を 1 0 ⁶〜 1 0 ⁷ 111 1 に な る よ う に懸濁 し て、 本発明の免疫抑 制剤 を調製 し た。

試験例 2

a . ヒ ト 末梢血細胞 T細胞画分 よ り え ら れ た免疫抑制性 T細胞 に よ る 抗原 （ P P D ) 特異的 T細胞活性化反応 の 抑制

1 0 %の ォ ー ト ロ ー ガ ス血清を 含む R P M I — 1 6 4 0 ( シ グ マ 社製） で l x l 0 ⁶m l の 濃度 に 調製 し た 正 常 ヒ ト 末梢血細胞を 9 6 ゥ ヱ ル丸底 プ レ ー ト に 1 0 0 # 1 ずつ分注 し た。 各 ゥ ヱ ル に P P D ( 日 本 ビ ー シ ー ジ一 製造 （株） 製） を 終濃度 l # g Z m l に な る よ う に 加 え、 同時 に 、 実施例 1 一 a でえ ら れ た 3 と お り の 濃度の ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体処理済み の細胞懸濁 液各 3 0 # 1 を 同 ゥ ル に添加 し 、 5 日 間培養 し た （ ィ ン キ ュ ベ ー タ 一 中、 5 % C 0 ₂、 3 7 ） o そ の の ち 、 l # C i の [ ³H ] チ ミ ジ ン を 各 ゥ ヱ ル に 添加 し 、 1 5 時間培養 し た の ち に脂肪を セ ルハ ー べ ス タ ー （ ラ ボ マ ツ シ ュ （LABO MASH) 、 ラ ボ サ イ エ ン ス （ LABO SCIENCE) 社製） を用 い て集め、 そ の 細胞 中 に 取 り 込 ま れ た ^ΰΗ の 放射活性を シ ン チ レ ー シ ヨ ン カ ウ ン タ ー L S C — 7 0 0 ( ァ ロ カ （ aloka) 社製） を 用 い て 測定 し た 。 コ ン ト 口 ー ル と し て、 実施例 3 の細胞を加 え る かわ り に、 3 0 1 の 1 0 %の オ ー ト ロ ー ガ ス血清を含む R P M I — 1 6 4 0 培地を加え た ゥ ヱ ルを測定対象 と し た 。 ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質二量体処理済み細胞 に つ い て も 同 様の測定を行な っ た。 か く サ ン プ ル と も n = 4 で測定 し た o

そ の結果、 図 1 0 に 示 し た よ う に、 P P D — T钿胞活 性化系 に供せ ら れた ヒ ト 細胞 に対 し て、 そ の 四分の一量 の ヒ ト D l H c y s タ ン パ ク 質二量体処理済み細胞を加 え る こ と に よ り 、 約 8 0 % 二分 の一量、 等量で そ れぞ れ 9 5 %を越え る 抑制 を示 し た。 ま た ヒ ッ ジ D l H C c y s タ ン パ ク 質二量体処理済み細胞で も 同様 の結果がえ ら れた。

b . ヒ ト 末梢血細胞全体を処理 し て え ら れ た免疫抑制性 T細胞 に よ る 抗原 （ P P D ) 特異的 T細胞活性化反応 の抑制

1 0 %の ォ ー ト ロ ー ガ ス血淸を 含む R P M I — 1 6 4 0 ( シ グマ 社製） で 1 x 1 0 " m l の 濃度 に 調製 し た 正常 ヒ ト 末梢血細胞を 9 6 ゥ エ ル丸底 プ レ ー ト に 1 0 0 μ 1 ずつ 分注 し た。 各 ゥ ュ ル に P P D ( 日 本 ビ ー シ ー ジ 一製造 （株） 製） を終濃度 l g Z m l に な る よ う に加 え 、 同時 に 、 実施例 3 — b でえ ら れた ヒ ト D l H c y s 二量体、 G M — C S F 、 I L 一 2 を種 々 組み 合わせ た条 件で処理 し た細胞液 3 0 # 1 を 同 ゥ エ ル に 添加 し 、 5 曰 間培養 し た （ イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中 、 5 % C 0 ₂、 3 7 V ) o そ の の ち 、 l # C i の [ ³H ] チ ミ ジ ン を 各 ゥ ェ ル に添加 し 、 1 5 時間培養 し た の ち に細胞を セ ルハ ー べ ス タ ー （ ラ ボマ ッ シ ュ （ LABO MASH) 、 ラ ボ サ イ エ ン ス ( LABO SCIENCE) 社製） を用 い て集め、 そ の 細胞中 に取 り 込 ま れ た ³ H の 放射活性 を シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ 一 L S C — 7 0 0 ( ァ ロ カ （ aloka) 社製） を 用 い て 測 定 し た。 コ ン ト ロ ー ル と し て、 実施例 3 の細胞を加え る かわ り に、 3 0 ίί 1 の 1 0 %の オ ー ト ロ ー ガ ス血清を含 む R P M I - 1 6 4 0 培地を加 え た ゥ ュ ルを 測定対象 と し た。 ヒ ッ ジ D 1 H C c y s タ ン パ ク 質二量体処理済み 細胞に つ い て も 同様の 測定を行 な っ た

そ の結果、 図 1 1 に 示 し た よ う に、 P P D - T 細胞活 性化系 に ヒ 卜 D 1 H c y s 二量 * 独 ¾ニ:6体 I L 一 2 お よ び G M - C S F の 共存、 そ し て I L 一 2 お よ び G M - C S F の 共存下で処理 し た ヒ ト 細胞を加え た と こ ろ 、 ヒ ト D 1 H c y s タ ン パ ク 質二量体単独処理細胞で は ほ と ん ど抑制効果 は 認め ら れ な か つ た が、 ヒ ト D 1 H c y s タ ン パ ク 質二量体、 G M - C S F お よ び I L 一 2 を 同時 に添加 し て培養 し た細胞を加え た系 に お い て最 も 強 い抑制がみ ら れた ( 8 0 % ) 。 ま た G M - C S F お よ び I L 一 2 の組み 合わ せ の処理細胞で は ほ と ん ど抑制 は み ら れな か つ た o 産業上 の 利用 可能性

本発明 に よ れば、 免疫抑制作用 が強 く 副作用 の少な い 免疫抑制剤が提供 さ れ る 。

配列表

配列番号 ： 1

配列の長さ ： 1 2 8

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： タンパク質 生物名 ： ホモ サピエンス （H o m o s a p i e n s ) 細胞の種類 ： M 0 L T— 4細胞

配 列

Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser

1 5 10 15

Val Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe lie Ser Cys Phe Ser

20 25 30

Gin Gin lie Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val

35 40 45

Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gin Lys

50 55 60

Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser

65 70 75

Ser Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu

80 85 90

Thr lie Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met

95 100 105

Glu Ser Pro Asn lie Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val

110 115 120

Leu Gly His Ser Arg His Arg Cys

125 E列番号 ： 2

配列の長さ ： 1 3 3

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： タンパク質

起 源

生物名 ： ホモ サピエンス (H o m o s a p i e n s 細胞の種類 ： M 0 L T— 4細胞

£ 列

Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser 1 5 10 15

Val Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe lie Ser Cys Phe Ser

20 25 30

Gin Gin lie Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val

35 40 45

Pro Ser Asn Val Pro し eu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gin Lys

50 55 60

Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser

65 70 75

Ser Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu

70 85 90

Thr lie Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met

95 100 105

Glu Ser Pro Asn lie Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val

110 115 120

Leu Gly His Ser Arg His Arg Gly Ser Gly Ser Ser Cys

125 130 081 92ΐ

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6£0I0/96df/IOd LIZ££96 ΟΛλ 配列番号 ： 4

E列の長さ ： 1 34

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロジー ： 直鎖型

配列の種類 ： タ ンパク質

起 源

生物名 ： ォーヴイ ス （O v i s )

細胞の種類 ： 白血球細胞

配 列

Met Ala Ala Gly Ser Ala Pro Gly Cys Ala Leu Gly Ala Leu Gly

5 10 15

Leu Val Cys Leu Phe Leu Lys Leu Asp Phe lie Ser Cys Val Ser

20 25 30

Gin Asp lie Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr Val

35 40 45

Ser Glu Ser Gin Pro Phe Thr Glu lie Met Trp Lys Lys Gly Lys

50 55 60

Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gin Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe

65 70 75

Gin Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp lie Val Ser Gly Asn

80 85 90

Leu Thr lie Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu

95 100 105 lie Glu Ser Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gin Phe His Leu Arg

110 115 120

Val lie Asp Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr Ser Cys

125 130 配列番号 ： 5

配列の長さ ： 1 07

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロジー ： 直鎖型

配列の種類 ： タンパク質

起 源

生物名 ： ォーヴイ ス （O v i s )

細胞の種類 ： 白血球細胞

配列の特徴

配列中、 2番目の V a 1 および 3番目の S e rはそれぞれ配列番 号 1 1に記載された核酸配列中、 2番目のコ ドン G T Tおよび 3番 目のコ ドン T C Cからえられたア ミ ノ酸である。

配 列

Met Val Ser Gin Asp lie Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr

5 10 15

Phe Tyr Val Ser Glu Ser Gin Pro Phe Thr Glu lie Met Trp Lys

20 25 30

Lys Gly Lys Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gin Thr Ser Gly Leu

35 40 45

Glu Ala Phe Gin Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp lie Val

50 55 60

Ser Gly Asn Leu Thr lie Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp

65 70 75

Val Tyr Glu lie Glu Ser Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gin Phe

80 85 90

His Leu Arg Val lie Asp Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr

95 100 105 Ser Cys

E列番号 ： 6

配列の長さ ： 1 0 7

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロジー ： 直鎖型

配列の種類 ： タンパク質

起 源

生物名 ： ォーヴイ ス （O v i s )

細胞の種類 ： 白血球細胞

配列の特徴

E列中、 2番目の V a 1 および 3番目の S e rはそれぞれ配列番 号 1 2に記載された核酸配列中、 2番目のコ ドン G T Aおよび 3番 目のコ ドン A G Tからえられたア ミ ノ酸である。

配 列

Met Val Ser Gin Asp lie Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr

5 10 15

Phe Tyr Val Ser Glu Ser Gin Pro Phe Thr Glu lie Met Trp Lys

20 25 30

Lys Gly Lys Asp Lys Val Yal Glu Trp Asp Gin Thr Ser Gly Leu

35 40 45

Glu Ala Phe Gin Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp lie Val

50 55 60

Ser Gly Asn Leu Thr lie Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp

65 70 75

Val Tyr Glu lie Glu Ser Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gin Phe

80 85 90 His Leu Arg Val He Asp Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr

95 100 105

Ser Cys

配列番号 ： 7

E列の長さ ： 3 8 7

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

1St 源

生物名 ： ホモ サピエンス （H o m o s a p i e n s ) 細胞の種類 ： MO L T— 4細胞

E 列

ATGGTTGCTG GGAGCGACGC GGGGCGGGCC CTGGGGGTCC TCAGCGTGGT CTGCCTGCTG 60 CACTGCTTTG GTTTCATCAG CTGmTTCC CAACAAATAT ATGGTGTTGT GTATGGGAAT 120 GTAACTHCC ATGTACCAAG CAATGTGCCT nAAAAGAGG TCCTATGGAA AAAACAAAAG 180 GATAAAGHG CAGAACTGGA AAATTCTGAA nCAGAGCTT TCTCATCTTT TAAAAATAGG 240 GTTTATTTAG ACACTGTGTC AGGTAGCCTC ACTATCTACA ACTTAACATC ATCAGATGAA 300 GATGAGTATG AAATGGAATC GCCAAATATT ACTGATACCA TGAAGTTCTT TCT TATCTG 360 CTTGGTCATT CAAGACACAG ATGHGA 387

【 0 0 6 43

配列番号 ： 8

配列の長さ ： 4 0 2

配列の型 ： 核酸 鎖の数 ： 一本鎖

トポロ ジー ： 直鎮状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

起 源

生物名 ： ホモ サピエンス （H o m o s a p i e n s ) 細胞の種類 ： MO L T— 4細胞

配 列

ATGGHGCTG GGAGCGACGC GGGGCGGGCC CTGGGGGTCC TCAGCGTGGT CTGCCTGCTG 60 CACTGCTTTG GTTTCATCAG CTGTTTTTCC CAACAAATAT ATGGTGTTGT GTATGGGAAT 120 GTAACTTTCC ATGTACCAAG CAATGTGCCT HAAAAGAGG TCCTATGGAA AAAACAAAAG 180 GATAAAGHG CAGAACTGGA AAAHCTGAA HCAGAGCTT TCTCATCTTT TAAAAATAGG 240 GmAT TAG ACACTGTGTC AGGTAGCCTC ACTATCTACA ACTTAACATC ATCAGATGAA 300 GATGAGTATG AAATGGAATC GCCAAATATT ACTGATACCA TGAAGTTCTT TCTTTATGTG 360 CTTGGTCAn CAAGACACAG AGGAA6T6GA AGTACTTG GA 402

配列番号 ： 9

E列の長さ ： 4 0 2

配列の型 ： 核酸

鎮の数 ： 一本趙

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 DN A

源

生物名 ： ホモ サピエンス （H o m o s a p i e n s ) 細胞の種類 ： MO L T— 4細胞

配 列

ATGGHGCTG GGAGCGACGC GGGGCGGGCC CTGGGGGTCC TCAGCGTGGT CTGCCTGCTG 60 CACTGCTTTG GTTTCATCAG CTGTTTTTCC CAACAAATAT ATGGTGTTGT GTATGGGAAT 120 GTAACTTTCC ATGTACCAAG CAATGTGCCT TTAAAAGAGG TCCTATGGAA AAAACAAAAG 180

GATAAAGHG CAGAACTGGA AAATTCTGAA nCAGAGCTT TCTCATCTTT TAAAAATAGG 240

CTTTATTTAG ACACTGTGTC AGGTAGCCTC ACTATCTACA ACTTAACATC ATCAGATGAA 300

GATGAGTATG AAATGGAATC GCCAAATAH ACTGATACCA TGAAGTTCTT TCTHATGTG 360

CTTGGTCAH CAAGACACAG AGGAAGTAGT TGTGGCCCAT GA 402

【 0 0 6 6 3

配列番号 ： 1 0

配列の長さ ： 4 0 5

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鑌状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

起 源

生物名 ： ォーヴイ ス （O v i s )

細胞の種類 ： 白血球細胞

配 列

ATGGCCGCAG GGAGTGCCCC TGGGTGTGCC CTGGGGGCCC HGGACTGGT CTGCCTCTTC 60 CTCAAAnGG ATTTCATCAG CTGTGTTTCC CAAGATATTT ATGGAGCTAT GAATGGGAAT 120 GTAACCTTTT ACGTTTCAGA GTCTCAACCG TTTACAGAGA HATGTGGAA GAAGGGGAAG 180 GATAAAGHG TAGAATGGGA TCAAACATCT GGACTCGAAG CTTTTCAGTC ΤΤΠΑΑΑΑΑΤ 240 AGAGHCAH TAGACAHGT GTCAGGTAAC CTCACCATCA CCGGGHAAC AAAAHAGAT 300 GAAGATGTGT ATGAAAHGA ATCCCCAAGT GHAAAAAGA GCTCCCAGH CCACCTCAGA 360 GTGAnGAH ATGCAAGGCA TAGGTTTTCT GGGACGTCGT GHAG 405 配列番号 ： 1 1

配列の長さ ： 3 2 4

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロ ジー ： 直鎖状

E列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

起 源

生物名 ： ォーヴイ ス （ O v i s )

細胞の種類 ： 白血球細胞

配 列

ATGGTTTCCC AAGATATTTA TGGAGCTATG AATGGGAATG TAACCTT TA CGT TCAGAG 60 TCTCAACCGT HACAGAGAT TATGTGGAAG AAGGGGAAGG ATAAAGTTGT AGAATGGGAT 120 CAAACATCTG GACTCGAAGC TTTTCAGTCT ΓΓΤΑΑΑΑΑΤΑ GAGTTCAHT AGACATTGTG 180 TCAGGTAACC TCACCATCAC CGGGHAACA AAAHAGATG AAGATGTGTA TGAAAHGAA 240 TCCCCAAGTG HAAAAAGAG CTCCCAGTTC CACCTCAGAG TGAHGAHA TGCAAGGCAT 300 AGG1TTTCTG GGACGTCGTG HAG 324

配列番号 ： 1 2

配列の長さ ： 3 2 4

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロ ジー ： 直趙状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

起 源

生物名 ： ォーヴイ ス （ O v i s )

細胞の種類 ： 白血球細胞

配 列 ATGGTAAGTC AAGATATTTA TGGAGCTATG AATGGGAATG TAACCTTTTA CGTTTCAGAG 60 TCTCAACCGT HACAGAGAT TATGTGGAAG AAGGGGAAGG ATAAAGHGT AGAATGGGAT 120 CAAACATCTG GACTCGAAGC TTTTCAGTCT Π ΑΑΑΑΑΤΑ GAGTTCATTT AGACA GTG 180

TCAGGTAACC TCACCATCAC CGGGHAACA AAAHAGATG AAGATGTGTA TGAAATTGAA 240

TCCCCAAGTG TTAAAAAGAG CTCCCAGTTC CACCTCAGAG TGATTGA A TGCAAGGCAT 300

AGGTTTTCTG GGACGTCGTG TTAG 324

配列番号 ： 1 3

配列の長さ ： 4 2

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鑌

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

配 列

TTTCTGCAG AAGCTTCCAT GGTTGCTGGG AGCGACGCGG GG 42

配列番号 ： 1 4

配列の長さ ： 4 7

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

配 列

TTTGTCGAC AGATCTATCA ACATCTGTGT CTTGAATGAC CAAGCAC 47 配列番号 ： 1 5

配列の長さ ： 2 9

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロジー ： 不明

配列の種類 ： ペプチ ド

ハイポセティ カル配列 ： Y e s

フラグメ ン ト型 ： N末端べプチ ド

配列の特徴

配列中、 1 2番目および 2 8番目の X a aは天然に存在するァ ミ ノ酸を表わし、 こ こで 1 2番目の X a a は好ま し く はセ リ ンであ る ₀

1番目のア ミ ノ酸はバリ ンまたはフエ二ルァラニン、 3番目のァ ミ ノ酸はグルタ ミ ンまたはセ リ ンである。

配 列

Val/Phe Ser Gln/Ser Asp lie Tyr Gly Ala Met Asn Gly Xaa Val Thr Phe Tyr

1 5 10 15

Val Ser Glu Ser Gin Pro Phe Thr Glu lie Met Xaa Lys

20 25

配列番号 ： 1 6

配列の長さ ： 2 9

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鑌

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

ハイポセティ カル配列 N 0

配 列 GnGGATCCT TYfSNCARGA YATHTAYGG 29

配列番号 ： 1 7

配列の長さ ： 2 7

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

ハイポセティ カル配列 N o

ア ンチセ ンス ： Y e s

配 列

ACACTGCAGC ATDATYTCNG TEAANGG 27

E列番号 ： 1 8

配列の長さ ： 3 9 3

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鑌

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： c D N A t o m R N A

ハイポセティ 力ル配列 ： N 0

起 源

生物名 ： ォーヴイ ス （ 0 V s )

細胞の種類 ： 白血球細胞

配 列 GH TCC CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT TAC 48 Val Ser Gin Asp lie Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15

Gn TCA GAG TCT CAA CCG ΓΓΤ ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG AAG 96 Val Ser Glu Ser Gin Pro Phe Thr Glu lie Met Trp Lys Lys Gly Lys

20 25 30

GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT CAG 144 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gin Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gin

35 40 45

TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT ΊΊΚ GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC ACC 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp lie Val Ser Gly Asn Leu Thr

50 55 60

ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA TCC 240 lie Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu lie Glu Ser

65 70 75 80

CCA ACT GH AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ΚΊΊ GAT TAT 288 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gin Phe His Leu Arg Val lie Asp Tyr

85 90 95

GCA AGG CAT AGG TAT GTG CTT TTT GCC ATA CTG CCA GCA GTA ATA TGT 336 Ala Arg His Arg Tyr Val Leu Phe Ala lie Leu Pro Ala Val lie Cys

100 105 110

GGC nG CTG TTT ΊΊΚ AAA TGT TTT CTG GGA CGT CGT AGC CAA CGA AAC 384 Gly Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu Gly Arg Arg Ser Gin Arg Asn

115 120 125

TCA GGG CCC 393 Ser Gly Pro

130 配列番号 ： 1 9

配列の長さ ： 1 3 1

配列の型 ： ア ミ ノ酸 生物名 ： ォーヴイ ス （0 V i s )

細胞の種類 ： 白血球細胞

配 列

Val Ser Gin Asp lie Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr

1 5 10 15

Val Ser Glu Ser Gin Pro Phe Thr Glu lie Met Trp Lys Lys Gly Lys

20 25 30

Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gin Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gin

35 40 45

Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp lie Val Ser Gly Asn Leu Thr

50 55 60

lie Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu lie Glu Ser 65 70 75 80

Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gin Phe His Leu Arg Val He Asp Tyr

85 90 95

Ala Arg His Arg Tyr Val Leu Phe Ala lie Leu Pro Ala Val lie Cys

100 105 110

Gly Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu Gly Arg Arg Ser Gin Arg Asn

115 120 125

Ser Gly Pro

130 配列番号 ： 2 0

配列の長さ ： 2 4

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本饋

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

ハイポセティ カル配列 ： N o

配 列

AGCTATGAAC GGGAATGTAA CCTT 24

配列番号 ： 2 1

配列の長さ ： 2 4

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鑌

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

ハイポセティ 力ル配列 ： N o

配 列

ACCTTTTACG TTTCAGAGTC TCAA 24

配列番号 ： 2 2

配列の長さ ： 2 2 2

配列の型 ： ア ミ ノ酸

ハイポセティ 力ル配列 ： N 0

起 源

生物名 ： ホモ サピエンス （H o m o s a p 1 e n s ) 細胞の種類 ： P B L (末梢血リ ンパ球（Peripheral Blood Lympho 配 列

Phe Ser Gin Gin lie Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His

1 5 10 15

Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val し eu Trp Lys Lys Gin Lys

20 25 30

Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser

35 40 45

Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr lie

50 55 60

Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro 65 70 75 80

Asn He Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu

85 90 95

Pro Ser Pro Thr Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser He Glu Val

100 105 110

Gin Cys Met lie Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu lie Met

115 120 125

Tyr Ser Trp Asp Cys Pro Met Glu Gin Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser

130 135 140

lie Tyr Phe Lys Met Glu Asn Asp Leu Pro Gin Lys lie Gin Cys Thr 145 150 155 160

Leu Ser Asn Pro Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser lie lie Leu Thr Thr

165 170 175

Cys lie Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu lie Pro

180 185 190 He Pro Leu Ala Val l i e Thr Thr Cys l ie Val Leu Tyr Met Asn Gly

195 200 205

l ie Leu Lys Cys Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn

210 215 220

配列番号 ： 2 3

配列の長さ ： 3 2

配列の型 ： 核酸

趙の数 ： 一本鎖

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

ハイポセティ カル配列 N o

配 列

TGGGGATCCA TGGTAAGTCA AGATAHTAT GG 32

配列番号 ： 2 4

配列の長さ ： 5 1

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロ ジー ： 直鑛状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

ハイポセティ カル配列 N o

アンチセンス ： Y e s

配 列

CAACTGCAGC TACGACGTCC CAGAAAACCT ATGCCTTGCA TAATCAATCA C 51 配列番号 ： 2 5

配列の長さ ： 3 2 1

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直鎮状

ハイポセティ 力ル配列 ： N 0

配 列

ATG GTA AGT CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC ΓΓΤ 48 Met Val Ser Gin Asp He Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe

1 5 10 15

TAC CTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG 96 Tyr Val Ser Glu Ser Gin Pro Phe Thr Glu lie Met Trp Lys Lys Gly

20 25 30 AAG GAT AAA GH GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT ΓΓΤ 144 Lys Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gin Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe

35 40 45

CAG TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ΑΠ GTG TCA GGT AAC CTC 192 Gin Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp lie Val Ser Gly Asn Leu

50 55 60

ACC ATC ACC GGG TTA ACA AAA ΠΑ GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA 240 Thr lie Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu He Glu 65 70 75 80

TCC CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT 288 Ser Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gin Phe His Leu Arg Val lie Asp

85 90 95 TAT GCA AGG CAT AGG ΤΠ TCT GGG ACG TCG TAG 321 Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr Ser

100 105

配列番号 ： 2 6

E列の長さ ： 4 6

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A

ハイポセティ カル配列 N o

アンチセンス ： Y e s

配 列

TTTTTTCGAA CTGCAGCTAA CACGACGTCC CAGAAAACCT ATGCCT 46

配列番号 ： 2 7

配列の長さ ： 3 2 4

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 両形態

トポロ ジー ： 直趙状

ハイポセティ カル配列 ： N o

配 列

ATG GTA AGT CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC ΓΓΤ 48 Met Val Ser Gin Asp lie Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe

1 5 10 15 TAC GH TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG 96 Tyr Val Ser Glu Ser Gin Pro Phe Thr Glu lie Met Trp Lys Lys Gly

20 25 30

AAG GAT AAA GH GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT 144 Lys Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gin Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe

35 40 45

CAG TCT TTT AAA AAT AGA ΟΤΪ CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC 192 Gin Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp lie Val Ser Gly Asn Leu

50 55 60

ACC ATC ACC GGG TTA ACA AAA ΠΑ GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA 240 Thr He Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu lie Glu

65 70 75 80

TCC CCA ACT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT 288 Ser Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gin Phe His Leu Arg Val lie Asp

85 90 95

TAT CCA AGG CAT AGG TTT TCT GGG ACG TCG TGT TAG 324 Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr Ser Cys

100 105

E列番号 ： 2 8

配列の長さ ： 7 5 3

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 両形態

配列の種類 ： c D N A t o m R N A

ハイポセティ カル配列 ： N o 起 源

生物名 ： ホモサピエンス （H o m o s a p i e n s ) 配 列

ATG (ΠΤ GCT GGG AGC GAC GCG GGG CGG GCC CTG GGG GTC CTC AGC GTG 48 Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val -28 -25 -20 -15

GTC TGC CTG CTG CAC TGC ΠΤ GGT TTC ATC AGC TGT TTT TCC CAA CAA 96 Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe lie Ser Cys Phe Ser Gin Gin

-10 -5 1

ATA TAT GGT Gn GTG TAT GGG AAT GTA ACT TTC CAT GTA CCA AGC AAT 144 He Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn

5 10 15 20

GTG CCT m AAA GAG GTC CTA TGG AAA AAA CAA AAG GAT AAA GTT GCA 192 Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gin Lys Asp Lys Val Ala

25 30 35

GAA CTG GAA AAT TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA TCT Π AAA AAT AGG 240 Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg

40 45 50

GH TAT TU GAC ACT GTG TCA GGT AGC CTC ACT ATC TAC AAC ΠΑ ACA 288

Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr lie Tyr Asn Leu Thr

55 60 65

TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG CCA AAT ΑΠ ACT GAT 336 Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn lie Thr Asp

70 75 80

ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTG H GAG TCT CTT CCA TCT CCC ACA 384 Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr

85 90 95 100 CTA ACT TGT GCA TTG ACT AAT GGA AGC ΑΠ GAA GTC CAA TGC ATG ATA 432 Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser lie Glu Val Gin Cys Net lie

105 110 115

CCA GAG CAT TAC AAC AGC CAT CGA GGA CTT ATA ATG TAC TCA TGG GAT 480 Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu lie Met Tyr Ser Trp Asp

120 125 130

TGT CCT ATG GAG CAA TGT AAA CGT AAC TCA ACC ACT ATA TAT TTT AAG 528 Cys Pro Met Glu Gin Cys Lys Arg Ans Ser Thr Ser lie Tyr Phe Lys

135 140 145

ATG GAA AAT GAT CTT CCA CAA AAA ATA CAG TGT ACT CTT AGC AAT CCA 576 Met Glu Asn Asp Leu Pro Gin Lys lie Gin Cys Thr Leu Ser Asn Pro

150 155 160

m ΤΓΤ AAT ACA ACA TCA TCA ATC ΑΠ HG ACA ACC TGT ATC CCA AGC 624 Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser lie lie Leu Thr Thr Cys lie Pro Ser

165 170 175 180

AGC GGT CAT TCA AGA CAC AGA TAT GCA CTT ATA CCC ATA CCA ΠΑ GCA 672 Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu lie Pro lie Pro Leu Ala

185 190 195

GTA ΑΠ ACA ACA TGT ΑΠ GTG CTG TAT ATG AAT GGT ΚΊΊ CTG AAA TGT 720 Val lie Thr Thr Cys lie Val Leu Tyr Met Asn Gly lie Leu Lys Cys

200 205 210

GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGA 753 Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn

215 220

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 配列番号 1 に示す ア ミ ノ 酸配列 中 の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ァ ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配列 を有す る 夕 ン パ ク 質 ま た は そ の類似体同士が、 そ の C 末端あ る い は そ の 近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質ニ量体。

2. 配列番号 1 に示す ア ミ ノ 酸配列 中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ァ ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配列 を有す る 夕 ン パ ク 質の類似体が

C 末端あ る い は そ の近傍の シ ス テ ィ ン の 直前 に N 末側 か ら グ リ シ ン ー セ リ ン ー グ リ シ ン ー セ リ ン ー セ リ ン が 挿入 さ れて い る か、 ち し く は

C 末端あ る い は そ の近傍の シ ス テ ィ ン の 直前 に N 末側 か ら グ リ シ ン ー セ リ ン ー セ リ ン が挿入 さ れ、 かつ、 該 シ ス テ イ ン の 直後 に N 末側か ら グ リ シ ン 一 プ ロ リ ン が 挿入 さ れて い る も の で あ る 請求の 範囲第 1 項記載の 夕 ン パ ク 質二量体。

3. 配列番号 7 に示す C 領域を欠失 し た可溶性 D 2 領域 欠失型 ヒ 卜 L F A - 3 の C 末端あ る い は そ の 近傍 に シ ス テ ィ ン 残基が 1 つ 付加 さ れ た タ ン パ ク 質を コ ー ドす る D N A 0

4. E列番号 1 に示す ア ミ ノ 酸配列中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ァ ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配列を有す る 夕 ンパ ク 質 ま た は そ の類似体を 自 然酸化 さ せ る こ と を含ん で な る タ ン パ ク 質二量体の 製造法。

5. 配列番号 1 に示す ア ミ ノ 酸配列 中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ァ ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配列を有す る タ ン パ ク 質ま た は そ の類似体同士が、 そ の C 末端 あ る い は そ の 近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質二量体を含ん で な る 免疫抑制剤。

6 . 配列番号 4 に示す ア ミ ノ 酸配列中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ァ ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配列 を有す る タ ン パ ク 質同士が、 そ の C 末端 あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ イ ン の S H 基 を 介 し て 結 合 し て な る タ ン パ ク 質 二 量 体。

7 . 配列番号 4 に示す ア ミ ノ 酸配列 中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ァ ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配列 を有す る タ ン パ ク 質を 自 然酸化 さ せ る こ と を含ん で な る タ ン パ ク 質二量 体の製造法 O

8 . 配列番号 4 に示す ア ミ ノ 酸配列中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ァ ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配列 を有す る タ ン パ ク 質同士が、 そ の C 末端 あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ イ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質二量体 を含ん で な る 免疫抑制剤。

' 9 . 配列番号 5 ま た は 6 に示す ァ ミ ノ 酸配列 を有す る 夕 ン パ ク 質同士が、 そ の C 末端あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質 二； ¾体。

1 0 . 配列番号 5 ま た は 6 に 示す ァ ミ ノ 酸配列 を有す る 夕 ン パ ク 質を 自 然酸化 さ せ る こ と を 含んで な る タ ン パ ク 質二量体の製造法。

1 1 . 配列番号 5 ま た は 6 に 示す ア ミ ノ 酸配列 を有す る タ ン パ ク 質同士が、 そ の C 末端あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質 二量体を含んでな る 免疫抑制剤。

1 2. ヒ ト 細胞を細胞接着 タ ン パ ク 質存在下で培養す る こ と に よ り え ら れ る 免疫抑制性紬胞を、 有効成分 と し て 含む免疫抑制剤。

13. 前記細胞接着 タ ン パ ク 質が、 配列番号 1 に 示す ア ミ ノ 酸配列 を 有す る タ ン パ ク 質 ま た は そ の 誘導 体 同 士 が、 そ の C 末端あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る 夕 ン パ ク 質二量体であ る 請求の 範囲第 1 2 項記載の免疫抑制剤。

14. 前記細胞接着 タ ン パ ク 質が、 配列番号 1 の ア ミ ノ 酸 配列中 の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ア ミ ノ 酸が欠落 し て い る E列 を有す る も の で あ り 、 かつ Z ま た は

C 末端の シ ス テ ィ ン の 直前 に ダ リ シ ン ー セ リ ン ー ダ リ シ ン ー セ リ ン ー セ リ ン が挿入 さ れて い る か、 も し く は C 末端の シ ス テ ィ ン の 直前に グ リ シ ン ー セ リ ン ー セ リ ン が挿入 さ れ、 かつ 前記 シ ス テ ィ ン の 直後 に グ リ シ ン 一 プ ロ リ ン が挿入 さ れて い る も の 同士が、 そ の C 末端 あ る い は そ の近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て 結合 し て な る タ ンパ ク 質二量体で あ る 請求の 範囲第 1 2 ま た は 1 3 項記載の 免疫抑制剤。

1 5 . 前記細胞接着 タ ン パ ク 質が、 配列番号 4 に示す ア ミ ノ 酸配列 を 有す る 夕 ン パ ク 質 ま た は そ の ァ ミ ノ 酸配列 中の 1 番 目 か ら 2 8 番 目 の ア ミ ノ 酸が欠落 し て い る 配 列 を有す る 誘導体同士が、 そ の C 末端あ る い は そ の近 傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H 基を介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質二量体で あ る 請求の 範囲第 1 2 項記載の免疫 抑制剤。

16. 前記細胞接着 タ ン パ ク 質が、 配列番号 5 ま た は 6 に 示す ア ミ ノ 酸配列 を有す る タ ン パ ク 質同士が、 そ の C 末端あ る い は そ の 近傍 に あ る シ ス テ ィ ン の S H基を 介 し て結合 し て な る タ ン パ ク 質二量体であ る 請求の 範囲 第 1 2 項記載の免疫抑制剤。

17. 前記 ヒ ト 細胞が、 ヒ ト 末梢血細胞であ り 、 前記免疫 抑制性細胞が該 ヒ ト 末梢血細胞を細胞接着 タ ン パ ク 質 以外 に 、 1 L 一 2 お よ び Zま た は G M — C S F を添加 し て培養す る こ と に よ っ てえ ら れ る も の で あ る 請求の 範囲第 1 2 、 1 3 、 1 4 、 1 5 ま た は 1 6 項記載の 免 疫抑制剤。

18. 前記免疫抑制性細胞が、 血清 を 含む培地 を用 い た培 養 に よ り え ら れ る も の で あ る 請求 の 範囲 第 1 2 、 1 3 、 1 4 、 1 5 、 1 6 ま た は 1 7 項記載 の 免 疫 抑 制 剤。

19. 前記血清が、 自 己血清で あ る 請求の範囲第 1 8 項記 載の免疫抑制剤。

20. 細胞接着 タ ン パ ク 質を有効成分 と し て含む免疫抑制 剤。