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WO1996033733A1 - Nouveau remede pour affections cutanees - Google Patents

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Info

Publication number
WO1996033733A1
WO1996033733A1 PCT/JP1996/001108 JP9601108W WO9633733A1 WO 1996033733 A1 WO1996033733 A1 WO 1996033733A1 JP 9601108 W JP9601108 W JP 9601108W WO 9633733 A1 WO9633733 A1 WO 9633733A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
therapeutic agent
skin
agent according
tissue inhibitor
wound
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/001108
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tamotsu Kanzaki
Akira Shinagawa
Hidekuni Shima
Takanori Aoki
Shin-Ichi Yoshida
Takashi Shinya
Original Assignee
Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha filed Critical Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha
Publication of WO1996033733A1 publication Critical patent/WO1996033733A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8146—Metalloprotease (E.C. 3.4.24) inhibitors, e.g. tissue inhibitor of metallo proteinase, TIMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans

Definitions

  • the present invention is characterized in that at least one tissue inhibitor selected from the group consisting of tissue inhibitors metabolic proteases (tissue inh ibitorof metalallproteases: TIMPs) is used as an active ingredient.
  • TIMPs tissue inhibitors metabolic proteases
  • a therapeutic agent for skin deficiency particularly a therapeutic agent for skin fulminant applied to the affected area of a patient with skin bruises and a therapeutic agent for a wound applied to the affected area of a wound patient.
  • the present invention relates to a therapeutic agent that is effective for reducing surgical scars and trauma scars by preventive treatment of wounds and wounds.
  • the present invention relates to a tissue inhibitor 1 (TIs) or tissue inhibitor 1 (TIMP-1) or issue 2 nh ibitorofmata 1 l prorotei na ses—2: A preparation containing TIMP-2) as the main active ingredient, effective for the treatment of skin * ulcers and wounds, and various surgical operations.
  • TIs tissue inhibitor 1
  • TIMP-1 tissue inhibitor 1
  • TIMP-2 tissue inhibitor 1
  • issue 2 nh ibitorofmata 1 l prorotei na ses—2 A preparation containing TIMP-2
  • the present invention relates to a group of recombinant tissue inhibitors of metallo-oral proteases (rTIMPs), which are characterized by reduction of surgical scars and trauma scars by preventive treatment of wounds and wounds.
  • rTIMPs recombinant tissue inhibitors of metallo-oral proteases
  • Therapeutic agent for skin deficiency comprising at least one tissue inhibitor selected from the group consisting of an active ingredient, particularly a recombinant tissue inhibitor Meta-oral protease 1 (r TIMP-1) and recombinant tissue
  • a therapeutic agent for skin deficiency which further comprises at least an active ingredient selected from the group consisting of inhibitors of meta-oral protease _2 (rTIMP-2);
  • the present invention relates to a medicament for the prevention and treatment of cutaneous slides such as ulcers such as decubitus ulcers, inflammatory fistulas and simple hammers.
  • the healing process of wounds and waves goes through (1) inflammation, (2) cell proliferation, and (3) reconstitution of the epidermal and dermal components, with characteristic cells at each stage.
  • the first reaction to the wound is the synthesis of extracellular matrix components such as fibronectin, fibrinogen, vitronectin, etc., providing a matrix that serves as a scaffold for cells to migrate to the upper part.
  • Activated platelet strength, platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor-a (transformation factor, TGF-), transforming growth Factor-1 (TGF- ⁇ ), insulin-like growth factor-I (I: IGF-I), etc. are released, and inflammatory cells migrate to the wound. Two days later, macrophages and lymphocytes appear and hold the key to wound healing.
  • macrophages and lymphocytes serve as a source of necrotic tissue removal, growth factors, and cytodynamics at the wound site.
  • the intense factor colony sti mu factor factor: CSF
  • interleukin-8 IL-8
  • Heparin-binding epidermal growth factor secreted by lymphocytes (he arinbi d inng epi de rma lgro wt hf ac tor: .HB-EGF), basic fibroblast growth factor (basic fibl ob lastg rowt hfactor) : B FGF) induces proliferation of fibroblasts, vascular endothelial cells, and vascular smooth muscle cells, and promotes angiogenesis.
  • fibronectin, collagen, hyaluronic acid, etc. make up the extracellular matrix of the new dermis.
  • PDGF, bFGF promotes cell division of skin cells
  • KGF keratinocyte growth factor
  • cytokines such as growth factors, growth factors, etc.
  • cytokine is key to the healing process. Absent.
  • the expression of the cell adhesion factor receptor on the cell surface plays a role in adhesion between cells, adhesion between cells and extracellular matrix, contact of wounds and imparting contractility.
  • tissue degeneration and necrosis In the process of tissue destruction and reconstruction during the healing process of wounds and ulcers, tissue degeneration and necrosis, leaching based on circulatory disorders, and inflammation reactions involving proliferation of tissue cells and free cells, inflammatory cells and proteases derived from tissue cells Is known to play an important role.
  • tissue degeneration and necrosis In the process of tissue destruction and reconstruction during the healing process of wounds and ulcers, tissue degeneration and necrosis, leaching based on circulatory disorders, and inflammation reactions involving proliferation of tissue cells and free cells, inflammatory cells and proteases derived from tissue cells Is known to play an important role.
  • MM P matrix metallobu orase
  • Matrix meta-oral proteases are a group of neutral proteases that form famili, and have Zn 2 — at the active center. It is well known that MMPs plays an important role in the degradation of extracellular matrix, and more than 10 types of MMPs are known to date. Destruction of the extracellular matrix by MMPs is one of the major causes of delay in the cure of intractable diseases involving tissue destruction, and this increase in MMP activity is associated with endogenous MMPs inhibitors. It is thought to be the result of a quantitative imbalance with TIMPs.
  • neutrophils and macrophages have the ability to secrete various types of MMPs, but their expression is increased during inflammation. Induction of MMPs production is regulated in a complex manner.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing ⁇ IMPs as a main active ingredient to treat or prevent chronic (refractory) beach pain, treat a wound, and furthermore, to remove surgical scars caused by various surgical operations.
  • An object of the present invention is to provide a treatment means characterized by prevention and treatment of scars and reduction of surgical scars ⁇ trauma scars.
  • TIMPs is an endogenous inhibitor present in tissues and body fluids and specifically inhibits the activity of MMPs, a growth factor-like activity on cultured epidermal keratinocytes and cultured fibroblasts. Focusing on the fact that TMPs inhibit the activity of MMPs, it is possible to provide an effective treatment for chronic (refractory) actin, and we conducted various studies of its clinical usefulness. Thus, the present invention succeeded in providing a therapeutic agent for skin deficiency deficiency comprising T IMPs as an active ingredient, in particular, a therapeutic agent for treating skin hamlet and a therapeutic agent for wound.
  • the present inventors set up TIMPs, which were conventionally difficult to obtain in large quantities from tissues or cultured cells or blood derived from animals including humans, and it was difficult to apply or use them strictly in actual practice.
  • the recombinant TIMPs rTIMPs
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is a.
  • An agent for treating skin deficiency which comprises at least one tissue inhibitor selected from the group consisting of meta-proteases as an active ingredient (a pharmaceutical composition for treating skin deficiency, hereinafter the same) ),
  • the therapeutic agent is used in the treatment of skin deficiency, including the prevention of scarring due to skin deficiency and the preventive treatment for reducing the scar.
  • Recombinant Tissue Inhibitor Metallob Tissue 1 is expressed by transformants obtained using Escherichia coli, CH0 cells or C0S-1 cells as host cells, and the obtained gene product is purified.
  • tissue inhibitor meta-proteinase 2 is expressed by transformants obtained using Escherichia coli, CHO cells or COS-1 cells as host cells, and the resulting gene product is purified.
  • tissue inhibitor metabolic protease 1 and tissue inhibitor metabolic protease 2 as the tissue inhibitor metabolic proteases of the above-mentioned (18).
  • the therapeutic agent as described in and
  • the dosage form of the therapeutic agent is ointment, plaster, solution, solution, oil, cream, paste, cataplasm, liniment, lotion, spray, suspension, emulsion
  • Tissue inhibitor characterized by using an effective amount of at least one tissue inhibitor selected from the group consisting of meta-oral proteases in artificially cultured skin) How to treat, and
  • tissue inhibitor selected from the group consisting of tissue inhibitors of meta-oral proteases for producing a pharmaceutical composition for treating or preventing dermatosis deficiency.
  • the therapeutic agent according to the above (1) which contains rTIMP-1 or NO and rTIMP-2 obtained as active ingredients, according to the method described in (1), (37) Synthesis of 1stst rand cDNA by reverse transcription reaction using poly (A) mRNA prepared from human normal gingival fibroblasts (Gin-1 cells) as type I and oligo dT (15-18) as primer Then, the PCR primer was used to amplify the TIMP-1 gene using the PCR primer: primer Primer T1 F1; 5'-ATGGCCCCCT TTGAGCCCCTG-3 'and primer T1RI; After subcloning the obtained TIMP-1 gene into a suitable cloning vector, for example, pUC13, Cloning into a current vector, for example, pMEMneo (Le eeta 1., Nature, 294, 228-232, 19981), introducing it into a host cell, and obtaining the TIMP-1 transgenic yeast and CHO cell thus obtained.
  • PCR primer primer T2F7: 5'-AAAGTCGACCATGGGCGCCGC GGCCCGCACCCT—3 'and primer T2R5; 5'-TT
  • the resulting TIMP-2 gene was subcloned into an appropriate cloning vector, for example, pUC13, and then an appropriate expression vector was added.
  • an appropriate cloning vector for example, pUC13
  • an appropriate expression vector was added.
  • rTIMP-2 prepared by cloning into pKG, introducing into host cells, and culturing the thus obtained transformant cells including the transfected CHO cells with TIMP-2 as an active ingredient (see above).
  • the therapeutic agent according to (1) which comprises rT IMP-2 prepared as described in Example 1 as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows the results of a stability test of a liquid formulation containing rTIMP-2.
  • Figure 2 shows the change in the area of the skin defect due to the administration of rTIMP-2 in the SD rat experimental skin loss model.
  • FIG. 3 shows the change in the area of the skin defect due to the administration of rTIMP-2 in an experimental model of skin deficiency in aged ICR mice.
  • FIG. 4 shows the change in the area of the skin defect due to administration of rTIMP-2 in an experimental diabetic mouse skin deficiency model.
  • FIG. 5 shows the results of a dose-dependent test of the therapeutic effect on skin deficiency of a test drug containing rTIMP-2.
  • FIG. 6 is a photograph of a typical histopathological finding of the group treated with a test drug containing rTIMP-2 on day 15 of the test in a diabetic mouse experimental skin defect model, showing a photograph of the form of the organism.
  • Fig. 7 shows typical histopathological findings of the group treated with the test drug containing rTIMP-2 on day 5 in the diabetic mouse experimental skin defect model.
  • Fig. 6 is an enlarged view of the boxed part in Fig. 6. The photo shows a picture of the creature's form.
  • FIG. 8 is a photograph of typical histopathological findings of the control group versus the test drug treatment group containing rTIMP-2 in the diabetic mouse experimental skin deficiency model. A photograph is shown.
  • FIG. 9 is a magnified photograph of a boxed part of FIG. 8 showing a typical histopathological finding of a control group in a test with an experimental skin defect model in diabetic mice, and shows a photograph of the form of an organism.
  • FIG. 10 shows the growth promoting effect of rT IMP-2 on human normal dermal fibroblasts.
  • FIG. 11 shows the growth promoting effect of rT IMP-2 on normal skin fibroblasts in percentage relative to control.
  • FIG. 12 shows the results of comparing the therapeutic effects of the test drug containing rT IMP-1 and the test drug containing rT IMP-2 on skin defects.
  • the TIMPs used in the present invention may include inhibitors for the MMP family, and for example, inhibitors for MMPs such as TIMP-1 and TIMP-2 can be used.
  • TIMP-2 has many excellent properties as a therapeutic agent for skin deficiencies, particularly as a therapeutic agent for skin fulminants and a wound.
  • rTIMP-2 shows excellent properties.
  • TI MP-1 is a glycoprotein, and is used in tissues such as cartilage, dental pulp, gingiva, uterus, placenta, and skin from humans, pests and other animals, as well as articular osteocytes, osteoblasts, and fibroblasts from various tissues It is produced from cultured cells such as epithelial cells, amniotic fluid, serum, plasma, platelets, monocytes, macrophages, etc., and can be prepared from a condition culture of these tissues and cultured cells. For example, Kodama et al., Collagen Re 1. Res., 7, 341-350, 1987, and Kishi and Hayakawa, J. Biochem., 96, 395-404, 1984.
  • ⁇ Culture of pulp-derived cells ⁇ Monochrome from human serum It can be isolated by affinity chromatography using a null antibody. Also, it can be obtained from human placenta or the like according to the method described in Kodama eta 1., J. Immuno 1. Methods, 127, 103-108, 1990.
  • TIMP-2 was found relatively recently and has about 40% homology with TIMP-1 in amino acid sequence, but differs from TIMP-1 — binds conjugated oligosaccharide chains I haven't.
  • TIMP-2 can also be obtained from various tissues, culture solutions of tissue-derived cultured cells, and the like as in the case of TIMP-1. For example, according to the method described in Fu jimo toeta]., Clin. Chim. Acta, 220, 31-45, 19993, JP-A-6-300757, etc., monoclonal antibodies can be obtained from human placenta or the like. It can be obtained by affinity chromatography or the like.
  • TIMP-2 has a different property from TIMP-1 and a different molecular structure without N-linked oligosaccharide chains, TIMP-2 has a direct therapeutic effect on wounds, It is very useful as an agent for promoting healing, and as an agent for preventing the development of keloid II hypertrophic scars in skin defect wounds after surgery.
  • TI MP-1 and TI MP-2 are based on recombinant DNA technology (Maniatis, T. eta l., Molecular Cloning, Co Id Sprin Harbo r Labo ratory, Co) d Sp ri ng Harbor, ew York, 1982).
  • recombinant DNA technology Maniatis, T. eta l., Molecular Cloning, Co Id Sprin Harbo r Labo ratory, Co) d Sp ri ng Harbor, ew York, 1982.
  • TIMPs in quantity and quality that can be used in animal experiments and clinical tests required for approval of the production of pharmaceuticals.
  • the healing process of wounds and skin Ithamaki involves a complex multi-step process as described above, and each stage involves various in vivo cells and bioactive factors that are different from each other. Because they work in a variety of balances, it is possible to determine what role TIMPs actually plays under pathological conditions, what kind of pharmacological activity and biological activity, and what kind of disease is effective. It should be understood that is difficult. From this point of view, recombinant DNA technology can be used to produce the product in direct form and in sufficient quantity and quality to confirm its role in the healing process of complex wounds and skin cancer.
  • rT IMPs obtained in a quantity and quality that can be used in animal experiments and clinical trials required for the approval of the manufacture of pharmaceuticals can be used for the treatment of skin deficiency, especially for the treatment or prevention of skin blemishes and wounds. It is noteworthy to find therapeutic and healing promoting activities.
  • eukaryotic hosts such as yeast and Chinese hamster ovary cells (CHO cells), prokaryotic hosts such as Escherichia coli, and insect cells such as Sf21
  • eukaryotic hosts such as yeast and Chinese hamster ovary cells (CHO cells)
  • prokaryotic hosts such as Escherichia coli
  • insect cells such as Sf21
  • TIMP-1 which is a glycoprotein
  • a host vector system using eukaryotic cells as a host is preferably used. Acquisition of rTIMP-1 and rTIMP-2 by the recombinant DNA method is performed, for example, according to Williams on, eta 1., Biochem. J., 268, 267-274, 1990, Boone, USA., 87, 2800-2804, 1990.
  • rTIMP-1 is 1ststrand by reverse transcription reaction using poly-A mRNA prepared from human normal gingival fibroblasts (Gin-1 cells) as type I and oligo dT (15-18) as a primer.
  • c DNA Then, using a PCR primer, for example, primer TIF1; 5'-ATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG-3 'and primer T1R1; 5'-CAGGATTCAGGCTATCTG-3', amplify TIMP-1 gene appropriately by PCR reaction.
  • an appropriate expression vector for example, pMEMne0 (Leeeta 1., Nature, 294, 228-232, 198 1), and introduced into CH 0 cells and the like by a common calcium phosphate coprecipitation method.
  • Transformants such as TIMP-1 transgenic yeast and CHO cells, are cultured by a suitable method such as microcarrier culture or high-density continuous culture, and rTIMP-1 is prepared from the resulting condition medium. I do. It should be understood that, depending on the host cell into which the expression vector has been introduced, the sugar structure of the gene product may be different from that of the natural product.
  • RT IMP-2 can be obtained by reverse transcription using, for example, poly A "mRNA prepared from human G in-1 cells as a type I and oligo dT (15 to 18) as a primer.
  • d Perform cDNA synthesis and then use PCR primers, for example, primer T2F7; 5'-AAAAGTC GACCATGGGCGCCGCGGCCCGCACCCT-3 'and primer T2R5;
  • the gene is amplified, and the obtained TIMP-2 gene is subcloned into an appropriate cloning vector, for example, pUC13, and then cloned into an appropriate expression vector, for example, pKG.
  • Transfected cells such as CHO cells were cultured by an appropriate method such as microcarrier culture or high-density continuous culture. Prepare rT IMP-2 from the medium.
  • RT IMPs obtained by using recombinant DNA technology may have one or more mutations in its constituent amino acids, such as deletions, substitutions, insertions, transpositions, etc., so long as they are compatible with the purpose of the present invention.
  • the amino acid sequence can be different due to addition.
  • recombinant DNA technology for example, one or more amino acids can be deleted, substituted, or inserted by mutagenizing a specific site of the basic DNA sequence.
  • a representative method is the position-directed mutagenesis method (edited by The Biochemical Society of Japan, "New Biochemistry Experiment Course 2, Nucleic Acid 111, Recombinant DNA Technology", Tokyo Kagaku Dojin, pages 233 to 251, October 5, 1992) ).
  • TIMPs derived from these various sources can be obtained by conventional methods used for the purification of normal proteins, such as salting out using ammonium sulfate and sodium sulfate, gel filtration carriers and ion exchange carriers. Chromatography, electrophoresis, monoclonal antibodies against each TIMPs, affinity chromatography using ConA, etc., high performance liquid chromatography, etc. can be used alone or in any combination according to the properties of each TIMP. It can be used and purified as appropriate.
  • TIMP-1 which is a natural substance is contained in a molecule due to the effect of processing during the process of isolation or isolation. In fact, it is a product that has various forms of sugar chains and is therefore composed of substances with various molecular weights and the like.
  • rT IMPs does not contain contaminants that are normally involved in non-recombinant cells (non-transformants).
  • rTIMP-2 can be obtained as a final product containing little denatured protein and the like after purification and isolation.
  • rT IMP-2 is for the treatment of complex wounds and skin sores It is said to be obtained in a sufficient amount and purity to confirm its function in the healing process and to be sufficient for use in animal tests and clinical tests required for the approval of the production of pharmaceuticals. Its properties are recognized and it is excellent as an active ingredient of medicine.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing TIMPs as an active ingredient and containing a pharmaceutically and pharmaceutically acceptable pharmaceutical additive.
  • the active ingredient selected from the group consisting of TIMPs can be administered in the range of about 0.000 lng to about 100 mg per day, but of course the symptoms, age, degree of disease, Depending on the concomitant drug, etc., the dose can be selected so as not to cause any side effects, and the number of administrations can be appropriately selected, such as once to multiple times per day.
  • the active ingredient selected from the group consisting of TIMPs can be incorporated into the drug product in the range of 0.001% to 50%, but the amount can be appropriately selected as necessary. It is possible.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by mixing and the like, and if necessary, stabilizers, PH regulators, surfactants, mouthwashes, fragrances, preservatives, bases, solvents, diluents, fillers Agent, extender, solubilizer, solubilizer, isotonic agent, emulsifier, suspending agent, dispersant, thickener, gelling agent, curing agent, absorbent, adhesive, elasticizer, plastic Agents, binders, disintegrants, radiation agents, preservatives, antioxidants, sunscreens, humectants, emollients, antistatic agents, soothing agents, etc., alone or in combination.
  • Stabilizers include amino acids such as glycine or salts thereof, sugars such as glucose and sucrose, sugar alcohols such as mannitol and sorbitol, oligosaccharides, polysaccharides, albumin, gelatin, proteins such as globulin and protamine, and peptides And the like.
  • the pH regulator include inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and carbonic acid, organic acids such as citric acid, and salts thereof. Other, distributed to pharmaceuticals It can be appropriately selected as necessary from those known to be used in combination.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be adapted for oral, topical, transdermal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal or intraarticular administration, but is preferably applied locally to a fistula or a wound.
  • it can be used in combination with other drugs such as hamagi and wound treatments.
  • cytokines such as PDGF, TGF-, growth factors such as TGF- / 3, IGF-I, CSF, IL-8, EGF, bFGF, KGF, and other physiologically active substances are also available.
  • Mixing is also possible if it is effective for the treatment of skin deficiency of the present invention.
  • it can be used together with artificially cultured skin, and it can also be used in combination with medical materials for treatment or medicines that are considered to be effective for treating skin deficiency symptoms.
  • compositions of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is to be administered locally to the affected part, ointments, descendants, solutions, solutions, oils, creams, pastes, cataplasms, remedies, lotions, sprays Preparations, suspensions, emulsions, tinctures for external use, skin solutions, irrigation agents, patches and the like can be arbitrarily selected. Further, a liquid agent or the like can be used by impregnating gauze, absorbent cotton, a wound dressing material, an adhesive blaster, or the like.
  • the additives and preparation methods are, for example, supervised by the Japan Public Health Association, 11th revised edition of the Japanese Pharmacopoeia, published on July 18, 1986, published by Hirokawa Shoten Co., Ltd.
  • Pharmaceutical Development Vol. 12 (Pharmaceutical Ingredient [I]), published on October 15, 1990, Hirokawa Shoten Co., Ltd .;
  • Pharmaceutical Development Vol. 12 (Pharmaceutical Materials [11 )) Published on October 28, 1990, referring to the descriptions of Hirokawa Shoten Co., Ltd., etc., and selecting from them as needed and applying them.
  • any method and means known in the art can be used.
  • any TIMPs that inhibit MMPs activity can be used.
  • a large amount of homogeneous TIMPs can be obtained.
  • artificially prepared r TIMPs can be used.
  • rTIMP-2 can be obtained in an amount and purity that is homogeneous and effective in the healing process of wounds and skin ulcers, and has excellent properties in handling.
  • strict requirements are required for the stability of the preparation. TIMP-2 also has excellent properties in this respect.
  • TIMPs required for preparing the pharmaceutical composition according to the present invention was performed according to the methods described in JP-A-63-210665 and JP-A-5-244895, TIMP-1 or TIMP-2 can be performed by enzyme immunochemistry using a sandwich assay using two types of monoclonal antibodies that specifically recognize different epitopes.
  • the confirmation of the effect of the pharmaceutical composition according to the present invention is typified by various wounds, skin ulcers, surgical wounds by various surgical operations, trauma wounds, arterial occlusive lower limb veins, and vein g stagnating lower limbs * ulcers Vascular disorder fistula, pressure ulcer due to sustained pressure stimulus, diabetic ulcer, burn injury, traumatic fistula, radiation bleb, drug phlebotomy, postoperative phlebology, inflammatory fistula, simple It can be confirmed by using a model suitable for evaluating the activity of treating skin deficiency, in particular, the activity of treating or preventing skin ulcers and the treatment of wounds, and the activity of promoting healing, using a model such as rosacea.
  • the effect confirmation test using an experimental skin defect model can be evaluated as follows. Skin defects are made in two places with a circular punch (8 mm ID) on the back skin of rats or mice that have been shaved in advance under ether anesthesia. T IMPs-containing solution (vehicle 0.005% benzonalconium chloride-saline: 0.005% benzalkonium chloride 0.15M NaCl solution, pH 7.2) was used as a test drug daily for the skin defect. Twenty-two times a day. -On the other hand, as a control, only the physiological saline containing 0.005% benzaluconium chloride without TIMPs is administered to the affected area every day.
  • T IMPs-containing solution vehicle 0.005% benzonalconium chloride-saline: 0.005% benzalkonium chloride 0.15M NaCl solution, pH 7.2
  • the effect confirmation test using the experimental surgical wound model can be evaluated as follows. For example, diabetic mice (KK—Ay ZT a Jc 1), 6 weeks old, weighing about 30 g, were subjected to Nembutal anesthesia (3 Omg / kg, ip) and pre-shaved and disinfected from the back to the abdomen. Then, make a flank incision about 10 mm in length perpendicular to the midline with a scalpel. Immediately on one incision, a solution containing TIMPs as a test drug (vehicle 005% saline containing benzalkonium chloride; 0.005
  • the surface tissue of the affected area is collected and histopathologically examined to evaluate the healing effect.
  • the gross findings are evaluated based on the size of the suture wound compared to the control group and the blood color of the suture wound and the surrounding area. Histopathological findings are evaluated based on the balance between degeneration, necrosis and reconstructed images, fibrosis and infiltration of inflammatory cells and edema compared to the control group.
  • Drugs containing at least one tissue inhibitor selected from the group consisting of TIMPs as an active ingredient in this manner include, in addition to vasculopathy beach fistulas represented by arterial occlusive lower limb fistula and venous g lower limb fistula, Pressure ulcers and diabetic beach pain due to persistent pressure irritation, which are difficult to treat, fever burn sores, traumatic necrosis, radiation fistula, drug ulcer, postoperative beach fistula, inflammatory It is considered to have a preventive or curative effect on the nodules, simple nodules, etc., and a symptom improving effect.
  • Drugs containing at least one tissue inhibitor as an active ingredient selected from the group consisting of TIMPs include chronic (refractory) skin ulcers and other factors such as aging, physical factors, or serious underlying diseases. Is involved in various factors, such as the presence of a background in some cases, and is considered to have significant activity against symptoms and diseases that are not rarely associated with wound infections. At least selected from the group consisting of TIMPs A drug containing one tissue inhibitor as an active ingredient is useful alone as a drug having a strong effect. In addition, drugs containing at least one tissue inhibitor selected from the group consisting of TIMPs as an active ingredient have been shown to prevent the development of keloid ⁇ hypertrophic scars and prevent traumatic scars in skin * defective wounds after surgery.
  • TIMPs are useful as therapeutic agents for chronic (refractory) ulcers.
  • Drugs containing at least one tissue inhibitor selected from the group consisting of rTIMPs, in particular, rTIMP-2 as an active ingredient have the advantages described above, in addition to their advantages, including their processing as pharmaceuticals. It has excellent activity on various kinds of wounds, wounds caused by surgery, skin ulcers and the like.
  • the therapeutic agent for skin deficiency containing rT IMP-2 can be expected to have stable biological activity even after long-term storage, and can be expected to have excellent biological activity even after being applied to the affected area.
  • TIMP-1 can be obtained from human normal gingival fibroblasts (Gin-1 cells) according to the method described in, for example, Kodamaeta 1., Co 11 age Re 1. Res., 7, 341-350, 1987.
  • U 1 troge 1 Ac A-44 (LKB), Con A Sepharose, anti-TIMP-1 monoclonal antibody (for example, clone No. 7 disclosed in JP-A-63-219392). — 2 IB 12, etc.) Join Purify using a Sepharose 4 ⁇ affinity column. Finally, treat at 35 ° C for 30 minutes in 4M guanidine monohydrochloric acid, and then test on a Bio-gel P60 column. Protein factors that may have bound to 1 were reconstituted and removed by fractionation to prepare.
  • T IMP—2 is, for example, F u j i mo t o e t a 1., C l i n.
  • rTIMP-1 was prepared, for example, according to the method described in JP-A-5-199868. From a total RNA fraction prepared from human normal gingival fibroblasts (Gin-1 cells), poly (A) -mRNA was purified and concentrated using an oligo (dT) -cellulose column. The reverse transcription reaction using polyA mRNA as type I and oligo dT (15 to 18) as primers resulted in the synthesis of 1ststrandcDNA.
  • TIMP-1 gene After subcloning the obtained TIMP-1 gene into an appropriate cloning vector, for example, pUC13, an appropriate expression vector, for example, pME
  • an appropriate expression vector for example, pME
  • Mneo Leeeta l., Nature, 294, 228-2232, 19981
  • the TIMP-1 gene-introduced CH0 cells were cultured by an appropriate method such as micromouth carrier culture or high-density continuous culture, and rTIMP-1 was prepared from the obtained condition medium.
  • the prepared rTIMP-1 was observed as a single band of about 30 kDa on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE, 12% homogeneous gel, under reduced conditions).
  • Western blotting using a labeled mouse anti-human TIMP-1 antibody also revealed a single band of about 30 kDa.
  • rT I MP- 1 of human fibroblasts (CCD-4 1 SK cells) inhibition activity against derived MMP- 1 is, IC 5. There was approximately 1 X 1 0- 9 M.
  • r TIMP-2 was prepared, for example, according to the method of Aoki et al. (Continuous T issue, 19995: 26: 281-290). Poly-A mRNA was purified and concentrated using an oligo (dT) -cellulose column from the total RNA fraction prepared from human G in-1 cells. 1st strand cDNA was synthesized by a reverse transcription reaction using poly-A mRNA as type I and oligo dT (15 to 18) as primers. Sci. USA., 87, 2800-2804, 1990. PCR primers based on the cDNA A sequence of TIMP-2 as described in Bone, eta 1., Proc. Natl. Ac.
  • TIMP-2 transfected CHO cells were cultured by an appropriate method such as microcarrier culture or high-density continuous culture, and rTIMP-2 was prepared from the obtained condition medium.
  • the prepared TIMP-2 was observed as a single band of about 24 kDa on SDS-PAGE (12% homogeneous gel, normal conditions), and was subjected to Western blotting using mouse anti-human TIMP-2 monoclonal antibody. In this case, it was recognized as a single band of about 24 kDa.
  • the inhibitory activity against MMP-1 derived from CCD-41 SK cells was 1; There was about 1. 1 X 1 0- 9 M.
  • the pharmaceutical composition provided by the present invention has the ability to use any TIMPs that inhibit MMPs activity. Preferably, a large amount of homogeneous TIMPs can be obtained. R TIMP s artificially prepared can be used.
  • Example 2 Preparation of ointment containing rT IMP-1
  • ointment preparations various publicly known ointment bases can be used.
  • rTIMP-1 can be added to macrogol ointment and formulated as follows.
  • Example 3 Preparation of ointment containing rTIMP-2
  • Example 2 r The ointment containing TIMP-2 was applied in the same manner as described in Example 2.
  • the rTIMP-2 obtained in Example 1 can be formulated by adding it to Macrogol ointment.
  • Example i Preparation of rT IMP-1 containing solution
  • the rTIMP-2 containing liquid preparation can be formulated using rTIMP-2 obtained in Example 1 in the same manner as in the method described in Example 4.
  • Example 6 Daily stability of rT IMP-2 containing liquid preparation
  • the stability of the rTIMP-2 containing solution stored at 4 ° C was evaluated by its inhibitory activity against purified human MMP-1 in invitro.
  • the preparation of rTIMP-2 containing solution was carried out according to the method described in Example 5.
  • Human latent MMP-1 can be obtained, for example, according to the method described in Fujimo toeta 1., C1 inn. Chim. Acta, 219, 1-14-1993, and human neonatal fibroblasts. (NB 1 RGB) can be purified from the culture supernatant.
  • 0.1M Tris-HC1 (pH 7.5) buffer containing 0.4M NaC1.10mM CaC is used. Add 1 and incubate at 35 ° C for 2 hours (boil the control reaction at 100 ° C for 5 minutes). Stop the reaction by adding 10 l of o-L-n-anhydrous dissolved in 50% ethanol. Add 0,02% BSA, 0.2M NaC1, 5mM CaC and add 50mM Tris-HC1 (pH 7.5), diluted appropriately with Elastase 2001, and add 10 to 35. Incubate for minutes.
  • the rT IMP-2 containing solution prepared in Example 5 was used as the rT IMP-2 containing test drug.
  • a physiological saline solution containing 0.005% benzalkonium chloride sterilized with a membrane filter having a pore size of 0.1 / m was used.
  • test drug containing rTIMP-2 and the solvent for the control were continuously administered by injecting two drops (approximately 221) directly into the affected area using a syringe with a 26G needle once per test.
  • the affected area was hermetically sealed with a covering agent (bioc1usiVe) and an elastic bandage (Silky Tex) so as not to contaminate the affected area of the skin defect.
  • the change in the area of the skin defect was determined from the daily change in the calculated area ratio.
  • the rTIMP-2 containing liquid prepared in Example 5 was used as the rTIMP-2 containing test drug. However, the content of rTIMP-2 was set to four types of 0.05%, 0.01% and 0.001% in addition to 0.1%. As a control, a physiological saline containing 0.005% benzalkonium chloride was used.
  • mice Using 30 diabetic mice (KK-AyZTaJc1) (13 weeks old, body weight 39-55 g) as test animals, the site of an experimental skin defect on the back skin of the mouse by the method described in Example 7 was made in two places. Each wound was used as a site for administration of a test drug or control solvent containing rTIMP-2 at different concentrations.
  • test drug containing rTIMP-2 and the control were directly instilled once daily into the affected area as described in Example 7 and administered daily until wound closure.
  • the affected area of the skin defect was sealed and bandaged with a covering agent (bi0c1usiVe) and an elastic bandage (Silky Tex).
  • mice were used for each combination.
  • Fig. 5 shows the change over time in the area of the wound after treatment with various concentrations of the test drug containing rTIMP-2.
  • the test drug containing rTIMP-2 at a concentration of at least 0.001% or more showed a clear wound healing promoting effect.
  • There is a dose-dependent trend in the strength of the action but the effects of 0.001% drug and 0.01% drug are almost the same, and 0.05% drug and 0.1% drug Showed almost the same effect.
  • Example 9 Histological evaluation of the therapeutic effect of rT IMP-2 containing agent on skin defect
  • the rTIMP-2 containing liquid preparation prepared in Example 5 was used, and as a control, 0.005% benzalkonium chloride-containing physiological saline was used.
  • mice Using 30 diabetic mice (KK-AyZTa J cl) (8-13 weeks old, body weight 36-53 g) as test kills, an experimental skin defect site was formed on the back skin of the mice by the method described in Example 7. We made two places. One skin deficiency site was the site where the rTIMP-2 containing test drug was administered, and the other site was the site where the control solvent was administered. (3) Administration of r TIMP-2 containing test drug and histological evaluation of affected area
  • test drug containing rTIMP-2 and the control were directly instilled once a day at the dose described in Example 7 into the wound site and administered daily until wound closure.
  • the affected area of the skin defect was hermetically sealed and bandaged with a coating agent (bioc1usiVe) and an elastic bandage (Silky Tex).
  • rTIMP-2 As the number of treatment days elapsed, a clear reconstructed image of the epidermis was observed in the group treated with the rTIMP-2-containing test drug as compared with the control group, and granulation tissue formation, dense matrix formation, and Angiogenesis was clearly promoted. In particular, re-epithelialization was remarkable, which was considered to be the result of histologically promoted migration of keratinocytes. In addition, it was considered that rTIMP-2 also has an action of promoting granulation.
  • Fig. 6 and Fig. 7 which is an enlarged photograph of a part of the histological image shown in the figure
  • r TIMP-2 treated mice are completely healed (the wound is small)
  • Figure 7 shows that the thickness of the epidermis at the healed site is the same as the thickness of the epidermis outside the wound, indicating that healing is more complete.
  • FIG. 8 and FIG. 9 which is an enlarged photograph of a part of the histological image shown in FIG. 8).
  • the epithelial site is also healed in the group treated with the test drug containing TIMP-2. It can be seen that the thickness of the epidermis is thinner than the position).
  • the histological findings of the wound were classified, quantified and evaluated according to the degree as follows.
  • Re-epithelialization The image immediately after wound creation was set to 0, the time of complete healing was set to 10 and the degree of re-epithelialization was evaluated on a 10-point scale.
  • Example 10 Effect of a solution containing 10 rT IMP-2 on proliferation of human normal skin fibroblasts
  • the rTIMP-2 obtained in Example 1 is added to a physiological saline (0.15 M NaCl solution, pH 7.2), and the final concentration is adjusted to, for example, 1 Omg / m1.
  • the prepared solvent was sterilized with a membrane filter having a pore size of 0.1 ⁇ m and stored refrigerated (4 ° C) until use.
  • Human normal skin fibroblasts are obtained by primary culture of human skin, or are commercially available, for example, commercially available from Conetics. Infant-derived normal skin fibroblasts can be used.
  • Cell proliferation was measured by a dye extraction method.
  • the degree of cell proliferation was determined from the difference from the absorbance of the control cultured without TIMP-2.
  • FIG. 10 shows the degree of proliferation of cells cultured at various rT IMP-2 ′ concentrations by absorbance.
  • FIG. 11 shows the degree of proliferation relative to the control as a percentage.
  • the rTIMP-1 containing liquid prepared in Example 4 was used as the rTIMP-1 containing test drug, and the rTIMP-2 containing liquid prepared in Example 5 was used as the rTIMP-2 containing test drug.
  • a physiological saline solution containing 0.005% benzaluconium chloride sterilized with a membrane filter having a pore size of 0.1 m was used.
  • mice Using 10 diabetic mice (KK-AyZTa J cl) (early 8 weeks old, body weight 31-36 g) as test animals, two experimental skin defect sites were created on the back skin of the mice by the method described in Example 7. did. The five mice were used as rTIMP-1 administration group and rTIMP-2 administration group, respectively. 1 place The site of skin deficiency was the site of administration of the test drug containing rTIMP-1 or rTIMP-2, and the other was the site of administration of the control solvent.
  • test drug and control were applied once a day, and the dose described in Example 7 was directly dropped into the affected area and administered daily until wound closure.
  • the protection of the skin It deficient part and the change in the area of the affected part were calculated by the method described in Example 7.
  • Fig. 12 shows the daily changes in the area of the part when treated with rTIMP-1 and rTIMP-2. Both groups showed almost the same wound healing process, with no significant difference. There was no significant difference between the two groups when comparing the number of days required for 50% healing. That is, the concentration used in this test was 0.
  • At least one tissue inhibitor selected from the group consisting of rTIMPs, in particular, a drug containing rTIMP-2 as an active ingredient has the advantages described above, in addition to its advantages, including its processing as a formulation. It has excellent activity on various kinds of wounds, wounds caused by surgery, cutaneous fistula, etc.
  • the therapeutic agent for rT IMP-2 containing skin deficiency can be expected to have stable biological activity even after long-term storage, and can be expected to have excellent biological activity even after being applied to the affected area.
  • Drugs containing at least one tissue inhibitor as an active ingredient are selected from the group consisting of vasculopathy hamsters represented by arterial occlusive lower limbs * ⁇ and venous duct Pressure ulcers or diabetic hamaki due to a certain sustained pressure stimulus, burns * ulcers, traumatic ham fistulas, radiation ulcers, drug hammers, postoperative hammers, inflammatory nodules, simplicity * It is judged to have a preventive or therapeutic effect on fistulas, etc., and an effect of improving symptoms.
  • vasculopathy hamsters represented by arterial occlusive lower limbs * ⁇ and venous duct Pressure ulcers or diabetic hamaki due to a certain sustained pressure stimulus, burns * ulcers, traumatic ham fistulas, radiation ulcers, drug hammers, postoperative hammers, inflammatory nodules, simplicity * It is judged to have a preventive or therapeutic effect on fistulas, etc., and an effect of improving symptoms.
  • Drugs containing at least one tissue inhibitor as an active ingredient include chronic (refractory) dermal fistulas, which may be due to aging, physical factors, or serious underlying diseases. These factors are considered to have significant activity against symptoms and diseases that are not rarely associated with wound infections.
  • Drugs containing at least one tissue inhibitor as an active ingredient, selected from the group consisting of TIMPs are useful alone as potent drugs.
  • a drug containing at least one tissue inhibitor selected from the group consisting of TIMPs as an active ingredient has been shown to have the activity of preventing the development of keloid hypertrophic scars and the prevention of trauma scars in skin defect wounds after surgery.
  • TIMPs are useful as a therapeutic agent for chronic (refractory) Hama fistula.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing TIMPs as a main active ingredient.
  • the drug composition containing TIMPs as the main active ingredient according to the present invention can promote the healing of a difficult-to-treat, difficult-to-treat (refractory) sarcoma fulminosa. It is small and less noticeable. This effect is very useful from the aesthetic point of view, which is an important factor in qua1ityof1ife.
  • the treatment using the pharmaceutical composition according to the present invention makes it possible to at least accelerate the healing of the surgical wound in simple surgery, thereby shortening the length of hospital stay. This in turn contributes to reducing the financial burden on healthcare financing such as health insurance.

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Description

明 細 害 新規な皮膚欠損症治療剤 産業上の利用分野
本発明は、 ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼ類 (t i s s ue i nh i b i t o r o f me t a l l op ro t e i na s e s : TIMPs) から成る群から選ばれた少なくとも一つ のティシュ インヒビターを有効成分とすることを特徴とする医薬組成 物に関わるものであり、 皮膚欠損症治療剤、 特には皮膚濱瘍患者の患部 に適用される皮膚濱瘍治療剤及び創傷患者の患部に適用される創傷治療 剤で、 さらには手術創や外傷創の予防的治療により手術瘢痕ゃ外傷瘢痕 の縮小化に有効な治療剤に関する。 さらに詳しく言えば、 本発明は、 テ イシュ インヒビター ォブ メタロブ口テアーゼー 1 (t i s s ue i nh i b i t o r o f ma t a l l op r o t e i na s e s— 1 : T I MP— 1 ) あるいはティシュ インヒビター ォブ メタロブ 口テアーセ一 2 " i s s u e i nh i b i t o r o f m a t a 1 l op ro t e i na s e s— 2 ： T I MP- 2) を主たる有効成分 として含有する製剤で、 皮膚 *瘍の治療や創傷の治療に有効であり、 且 つ種々の外科的手術による手術創や外傷創の予防的治療により手術瘢痕 や外傷瘢痕の縮小化を特徵とする治療剤に関する。 本発明は、 別の面 ではリコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタロブ口テア ーゼ類 （rTIMPs)から成る群から選ばれた少なくとも一つのティ シュ インヒビタ一を有効成分とすることを特徴とする皮膚欠損症の治 療剤、 特にはリコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタ口 プロテアーゼー 1 (r T I MP— 1 ) 及びリコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテア一ゼ _ 2 ( r T I MP— 2) から 成る群から選ばれたものを少なくとも有効成分として含有することを特 徵とする皮膚欠損症の治療剤、 更には創傷治療、 褥瘡性潸瘍のような儍 性濱癟、 炎症性浪瘻、 単純性濱瘍といった皮膚滑瘍の予防及び治療のた めの医薬に関する。 背景技術
創傷、 浪瘙の治癒過程は大まかに①炎症②細胞增殖③表皮及び真皮成 分の再構成を経るが、 それぞれの段階で特徴的な細胞が存在する。 傷に 対する最初の反応は、 フイブロネクチン、 フイブリノ一ゲン、 ビトロネ クチン等の細胞外マトリックス成分の合成であり、 細胞が釗部へ移動す るための足場となるマトリックスを提供する。 さらに活性化した血小板 力、ら血小板由来增殖因子 (p l a t e l e t -d e r i v e d g r o wt h f a c t o r : PDGF) , トランスフォーミング成長因子一 a (t r an s f o rm i n g g r owt h f a c t o r一な ： T GF—な） 、 トランスフォーミ ング成長因子一 (TGF— ^) 、 イン スリン様増殖因子— I ( i n s u l i n— l i k e g r owt h f a c t o r— I ： I GF— I) 等が放出され、 炎症細胞が創部へ遊走す 感染症を併発しない場合、 1〜2日後にマクロファージ、 リンパ球が 出現し創部治癒の鍵を握る。 すなわち、 マクロファージ及びリンパ球は 創部の壊死組織の除去と增殖因子、 サイト力インの供給源となる。 マク 口ファージの分泌する TGF—な、 TGF— ) S、 I GF— I、 コロニー 朿!！激因子 （c o l ony s t i mu l a t i ng f a c t o r : C SF) 、 インターロイキン一 8 (i n t e r l e uk i n-8 ： I L— 8 ) は、 細胞を創部へ遊走させることにより、 炎症過程から組織再生の 過程へ移行させる。 また、 リンパ球の分泌するへパリン結合型上皮成長 因子 (he a r i n b i nd i ng ep i de rma l g r o wt h f ac t o r :.HB— EGF) 、 塩基性線維芽細胞増殖因子 （ ba s i c f i b l ob l a s t g rowt h f a c t o r ： b FGF) は、 線維芽細胞、 血管内皮細胞、 血管平滑筋細胞の増殖を誘導 し、 血管新生を促す。
続いてフイブロネクチン、 コラーゲン、 ヒアルロン酸等により新生真 皮の細胞外マトリックス力く構成される。 PDGF、
Figure imgf000005_0001
bFG Fは皮膚細胞の細胞分裂を促進し、 ケラチノサイ ト増殖因子 （k e r a t i nocy t e g rowt h f a c t o r : KG F) は上皮細胞 にのみ作用し、 増殖を促す。 ケラチノサイトが線維芽細胞の増殖、 コラ 一ゲン新生を促すサイトカイン類を産生し、 皮膚修復の最終的な質を決 定していると考えられている。
このような種々の増殖因子に対する細胞表面リセプターの発現は、 細 胞の移動、 増殖という治癒過程の重要な部位を担っていると考えられる。
し力、しな力、'ら、 増殖因子をはじめとするサイトカイン類の作用は複雑 なクロストークの上に成り立つており、 必ずしもある一種のサイトカイ ンが治癒過程の鍵を握っている訳ではない。 また、 細胞表面の細胞接着 因子リセブターの発現は細胞同志の接着や細胞と細胞外マトリックスの 接着、 創部の触合や収縮性の賦与といった役割を担っている。
創傷、 潦瘍の治癒過程における組織の破壊と再構築において、 組織変 性 ·壊死、 循環障害に基づく浸出、 組織細胞や遊離細胞の増殖を伴う炎 症反応では、 炎症細胞や組織細胞由来のプロテアーゼが重要な役割を果 たしていることが知られている。 実際、 皮膚演瘍、 角膜濱癟、 熱傷濱瘼、 皮膚水疱性疾患などでは、 ある種のマトリックスメタロブ口テアーゼ (ma t r i x me t a l l op ro t e i na s e : MM P )活性 の上昇が観察されている。
マトリックスメタ口プロテアーゼ類 （MM P s ) は、 フアミリ一を形 成する一群の中性プロテアーゼであり、 活性中心に Z n 2—を有する。 細 胞外マトリックスの分解に MM P sが重要な役割を担っていることは周 知のことであり、 現在までに 1 0数種類の MM Pが知られている。 MM P sによる細胞外マトリックスの破壊は、 組織破壊を伴う難治性疾患の 治癒を遅延させている主要な原因の一つであり、 この MM P活性の上昇 は、 内在性の MM P sインヒビタ一である T I M P sとの量的不均衡の 結果生じていると考えられている。
血液細胞由来の炎症細胞のうちでも、 好中球やマクロファージでは多 種類の MM P sの分泌能を有しているが、 炎症時に発現の昂進している 增殖因子をはじめとする種々のサイトカインによって、 MM P s産生誘 導は複雑に調節を受けている。
皮 *濱瘳には動脈閉塞性下腿浪癢及び静脈蠻滞性下腿清瘻に代表され る血管障害性の濱痛の他に、 処置困難な清痕として持統的な圧迫刺激に よる褥瘡や糖尿病性濱瘓の他、 その成因によって熱傷濱瘓、 外傷性演癌、 放射線濱癟、 薬物濱癟、 術後濱瘓、 炎症性浪瘼、 単純性浪瘳等がある。 慢性 （難治性） 皮膚清癌は、 加齢や物理的因子あるいは重篤な基礎疾患 が背景に存在する場合もあるなど様々な要因が関与し、 さらに創部感染 症を併発することもまれではないため、 その多くは長期間の治療を必要 とする。 これらの処置困難な皮膚清瘍、 特に慢性 （難治性） 清瘳の治療 には現在、 精製白糖 'ポピドンョード剤、 トコレチナート剤、 ブクラデ シンナトリウム剤、 力デキソマー ·ヨウ素剤等が使用されている。
し力、しな力《ら、 これらの薬剤の大半は患部の殺菌 ·清浄化を目的とし た薬剤や創面被瘡剤であり、 積極的に患部の細胞増殖、 組織再生を意図 して開発されたものは少ない。 慢性 （難治性） 濱癢は、 その種類により 部位、 大きさ、 病理学的状態等が異なることや治癒を妨げている要因が 未だ明確ではないため、 これまで単独で強力な効果を示す薬剤は登場し ていない。 今後、 6 5歳以上の高齢者が人口に占める割合が增加し有病 高齢者も増加することが予想され、 その中には褥瘡性濱癀ゃ下腿濱痛等 の慢性 （難治性） 滑瘍患者の増加も見込まれることなどから、 単独で傻 性 （難治性） 皮庸濱瘻、 創傷に広範に作用する新規薬物の開発が望まれ ている。
また、 国内で年間何百万件もの手術が施行されていると言われている が、 少なくとも単純外科手術に於ける手術痕の治癒が早まれば入院期間 の短縮を可能とする。 このことは、 延いては健康保険等の医療財政への 経済的負担を軽減することとなる。 さらに手術後の皮膚欠損創における ケロイドゃ肥厚性瘢痕の発生予防や外傷痕の予防治療は、 q u a l i t y o f 1 i f eの重要な要素を占める審美的な観点からも非常に有用性 が高い。 しかし、 こうした目的に非常に有効な直接的薬効をもった創傷 治療剤、 外科手術による手術創の治癒促進剤、 そして手術後の皮膚欠損 創におけるケロイドゃ肥厚性瘢痕の発生予防剤は現在までのところ無い のが実情である。 皮膚欠損症などに関連した臨床的な考察 ·説明などは、 例えば 「クリストファ一外科学 （第 2版） 」 （石川浩一 他 1名監訳、 医学書院 発行） 、 「褥瘡，皮膚濱瘍のカラーア トラス、 診断と治療」 (久木田淳 他 1名監修 ·編集、 臨床医薬研究会 発行、 中外医学社） 、
「創傷の治療 最近の進歩」 （波利井清紀 監修、 森ロ隆彦 編著、 克 誠堂出版株式会社、 1 9 9 3年 発行） 、 「ドレッシング 新しい創傷 管理」 （穴澤貞夫 監修、 倉本秋 他 3名編集、 へるす出版、 1 9 9 5 年 発行） などに記載があり、 これらのうちにある記載は適宜参照され 問題点などを理解するのに利用される。 発明の開示
本発明の目的は、 τ I MP sを主な有効成分とした医薬組成物により、 慢性 （難治性） 濱痛の治療や予防、 創傷の治療、 さらには種々の外科的 手術による手術痕ゃ外傷痕の予防及び治療並びに手術痕ゃ外傷痕の縮小 化を特徴とした治療手段を提供することにある。
本発明者らは、 T I MP sが組織や体液中に存在し MMP sの活性を 特異的に阻害する内在性のインヒビターであること、 培養表皮角化細胞 や培養線維芽細胞に対する増殖因子様活性を有することに着目し、 T I MP sによる MMP s活性の阻害を利用した効果的な慢性 （難治性） 演 癢の治療剤が提供できるのではないかと考え、 臨床的有用性を種々研究 した結果、 T IMPsを有効成分とする皮庸欠損症治療剤、 特には皮膚 濱瘙治療剤及び創傷治療剤による療法の提供に成功した。
本発明者らは、 従来ヒトを含めた動物由来の組織あるいは培養細胞、 血液からでは大量に入手することが困難で、 なかなかその実際の厳密な 適用あるいは利用が困難であった T I MP sを組換え DN A技術を利用 して大量に得ると共に、 こうして大置に得られたリコンビナント T I M P s (rTIMPs) を用いてそれが実際に如何なる薬理作用を有する かを確認し、 さらに臨床的に使用できることを見出して、 本発明を完成 した。
本発明は、
(1) ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼ類から成る 群から選ばれた少なくとも一つのティシュ インヒビターを有効成分と することを特徴とする皮膚欠損症治療剤 （皮膚欠損症治療用医薬組成物、 以下同じ） 、
(2)治療剤が、 皮膚欠損症の治療において皮膚欠損症の瘢痕の発生予 防及び該瘢痕の縮小化を図るための予防的治療を含む用途で用いられる ものであることを特徴とする上記 （1 ) 記載の治療剤、
(3) 皮膚欠損症が創傷であることを特徵とする上記 （1 ) 記載の治療 剤、
(4) 創傷が手術創で、 その手術創あるいはそれに関連する手術瘢痕を 予防的治療により縮小化をなすものであることを特徴とする上記 （3) 記載の治療剤、
(5) 創傷が外傷創で、 その外傷創あるいはそれに関連する外傷瘢痕を 予防的治療により縮小化をなすものであることを特徴とする上記 （ 3 ) 記載の治療剤、
(6) 皮膚欠損症が皮膚濱瘍であることを特徴とする上記 （1) 記載の 治療剤、
(7) 皮庸滇癘が術後清痰で、 その術後濱癣あるいはそれに関連する術 後瘢痕を予防的治療により縮小化をなすものであることを特徴とする上 記 （6) 記載の治療剤、
(8) 皮庸攩痛が外傷性濱瘼で、 その外傷性 ¾瘍あるいはそれに関連す る外僂性瘢痕を予防的. 療により縮小化をなすものであることを特徴と する上記 （6) 記載の治療剤、
(9) 皮膚澳瘻が悝性濱痛であることを特徴とする上記 (6) 記載の治 療剤、
(1 0) 皮膚滑瘍が褥瘡性濱癟であることを特徴とする上記 （6) 記載 の治療剤、
(1 1) 皮膚澳瘍が血管障害性演瘻であることを特徴とする上記 （6) 記載の治療剤、
(1 2) 皮庸瘐痰が炎症性濱瘳であることを特徴とする上記 （6) 記載 の治療剤、
(1 3) 皮膚浪瘍が単純性演瘓であることを特徴とする上記 （6) 記載 の治療剤、
(1 4) 有効成分としてティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテ ァーゼ一 1を含有することを特徴とする上記 （1)〜（1 3) のいずれ か一記載の治療剤、
(1 5) ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼ一 1とし てリコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテア一 ゼー 1を含有することを特徴とする上記 （1 4) 記載の治療剤、
(1 6) リコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタロブ口 テアーゼー 1が宿主細胞として大腸菌、 C H 0細胞又は C 0 S— 1細胞 を用いて得られた形質転換体細胞により発現され、 得られた遺伝子産物 を精製したものであることを特徴とする上記 （1 5) 記載の治療剤、
(1 7) 有効成分としてティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテ ァーゼ一 2を含有することを特徴とする上記 （1)〜（1 3) のいずれ か一記載の治療剤、
(1 8) ティシュ インヒビタ一 ォブ メタロブ口テアーゼー 2とし てリコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテア一 ゼー 2を含有することを特徴とする上記 （1 7) 記載の治療剤、
(1 9) リコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロ テアーゼー 2が宿主細胞として大腸菌、 CHO細胞又は COS— 1細胞 を用いて得られた形質転換体細胞により発現され、 得られた遗伝子産物 を精製したものであることを特徴とする上記 （1 8) 記載の治療剤、 (20) ティシュ インヒビター ォブ メタロブ口テアーゼ類として ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼー 1及びティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼー 2の混合物を有効成分と することを特徴とする上記 （1)〜（1 3) のいずれか一記載の治療剤、 (2 1) ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼー 1とし てリコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテア一 ゼ一 1をそしてティ シュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼ一 2としてリコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロ テアーゼ— 2をそれぞれ含有することを特徵とする上記 （20) 記載の 治療剤、 及び
(22) リコンビナント ティ シュ インヒビター ォブ メタ口プロ テアーゼー 1及びリコンビナント ティ シュ インヒビタ一 ォブ メ タロプロテアーゼー 2がそれぞれ宿主細胞として大腸菌、 CHO細胞又 は COS— 1細胞を用いて得られた形質転換体細胞により発現され、 得 られた遗伝子産物を精製したものであることを特徴とする上記 （2 1 ) 記載の治療剤を提供するものである。
さらに本発明では、
(23) 治療剤が、 患部局所に投与するのに適した剤形であることを特 徴とする上記 （1)〜（22) のいずれか一記載の治療剤、
(24) 治療剤の剤形が、 軟膏製剤、 硬膏製剤、 溶液剤、 水剤、 油剤、 クリーム剤、 パスタ剤、 パップ剤、 リニメント剤、 ローション剤、 スプ レー剤、 懸濁剤、 乳濁剤、 外用チンキ剤、 皮膚用水剤、 灌注剤及び貼付 剤からなる群から選ばれたもののうちの一つであることを特徴とする上 記 （1)〜（23) のいずれか一記載の治療剤、
( 25 ) 治療剤の剤形が、 ドレッシング剤、 皮膚被 剤あるいは袢創裔 剤、 皮膚粘着剤及び包帯からなる群から選ばれたもののうちの一つであ ることを特徴とする上記 （1)〜（23) のいずれか一記載の治療剤、 (26) 医薬として許容される担体、 賦形剤又は希釈剤を配合してある ことを特徴とする上記 （1 )〜（25) のいずれか一記載の治療剤、 ( 27 ) ティシュ インヒビター ォブ メタロブ口テアーゼ類から成 る群から選ばれた少なくとも一つのティシュ インヒビターの有効量を 患者に投与することを特徴とする皮膚欠損症を治療する方法、
(28) 皮膚欠損症の瘢痕の発生予防及び該瘢痕の縮小化を図ることを 特徴とする上記 （27) 記載の方法、
(29) 創傷、 皮膚濱瘻、 外科手術による手術創、 外傷創、 動脈閉塞性 下腿潰瘻及び静脈懋滞性下腿濱瘍を含む血管障害性の濱瘍、 持続的な圧 迫刺激による褥瘡や糖尿病性演瘍、 熱傷浪瘍、 外傷性渙瘍、 放射線濱癟、 薬物濱瘻、 術後濱瘍、 炎症性澳瘍並びに単純性濱瘍からなる群から選ば れた疾患のうちのいずれか一つを治療することを特徴とする上記 (27 ) 又は （28) 記載の方法、
(30) «瘻や創傷患部への局所投与を行うことを特徴とする上記 （ 2
7) 〜 （29) のいずれか一記載の方法、
(3 1 ) ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼ類から成 る群から選ばれた少なくとも一つのティシュ インヒビターの有効量を 人工的に培養された皮) tと一緒に用いることを特徴とする皮膚欠損症を 治療する方法、 及び
(32) 皮庸欠損症治療又は予防のための医薬組成物を製造するための、 ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼ類から成る群から 選ばれたティシュ インヒビターの用途を提供する。
また本発明に従えば、
( 33 ) Ko d ama e t a l. , Co l l a g e n Re l. R e s. ， 7, 34 1〜 350, 1 987あるいは K i s h i a n d H a y a k awa, J. B i o c h em. , 96, 395〜 404, 1 984に記載の方法に準じて、 ゥシ歯髄由来細胞の培養液ゃヒト血清を 含むヒト、 ゥシ、 その他の動物由来の軟骨、 歯髄、 歯肉、 子宮、 胎盤、 皮膚の組織中や、 関節軟骨細胞、 骨芽細胞、 各種組織由来線維芽細胞、 あるいは上皮細胞、 羊水、 血清、 血漿、 血小板、 単球、 マクロファージ、 又はその培養液から得られた T IMP- 1を有効成分として含有する上 記 （ 1 ) 記載の治療剤、
(34) Kodama e t a 1. , J. I mm u n o 1. Me t h od s， 127, 103〜 1 08， 1 990に記載の方法に従いヒト胎 盤から得られた T IMP— 1を有効成分として含有する上記 （1)記載 の治療剤、
(35) Fu j imo t o e t a l. , C I i n. Ch im. Ac t a, 220, 31〜45, 1993あるいは特開平 6— 300757 号公報に記載の方法に従い、 ヒト胎盤を含むヒト、 ゥシ、 その他の動物 由来の軟骨、 歯髄、 歯肉、 子宮、 皮膚等の組織や、 関節軟骨細胞、 骨芽 細胞、 各種組織由来線維芽細胞、 あるいは上皮細胞、 羊水、 血清、 血漿、 血小板、 単球、 マクロファージ、 又はその培養液より得られた T IMP ― 2を有効成分として含有する上記 ( 1 ) 記載の治療剤、
(36 ) W i 1 1 i ams on, e t a l. , B i o chem. J. , 268, 267〜 274, 1990、 Boone, e t a 1. , P r o c. Na t l. Ac ad. S c i. USA. , 87, 2800〜 28 04， 1 990に記載の方法に従い得られた rT I MP- 1又はノ及び rTIMP-2を有効成分として含有する上記 （ 1 ) 記載の治療剤、 (37) ヒト正常歯肉線維芽細胞 （G i n— 1細胞） より調製したポリ A" mRNAを铸型、 オリゴ dT (1 5〜18個） をプライマーとした 逆転写反応により 1 s t s t rand c DN Aの合成を行い、 次に PCRプライマー：ブライマー T1 F 1 ； 5 ' — ATGGCCCCCT TTGAGCCCCTG- 3 ' 及びプライマー T 1 RI ； 5 ' 一 CAG GATTCAGGCTATCTG— 3' を用い PC R反応により T I M P— 1遗伝子の増幅を行い、 得られた T IMP— 1遺伝子を適当なクロ 一二ングベクター、 例えば pUC l 3にサブクローニング後、 適当な発 現べクタ一、 例えば pMEMn eo (Le e e t a 1. , Na t u r e， 294, 228〜 232, 1 981 ) にクローニングし、 宿主細胞 に導入し， こうして得られた TIMP— 1遺伝子導入酵母、 CHO細胞 を含む形質転換体を培養して調製された r T I MP— 1を有効成分とし て含有する上記 （ 1 )記載の治療剤、
(38) ヒト G i n— 1細胞より調製したポリ A— mRNAを铸型、 ォ リゴ dT (1 5〜1 8個） をプライマーとした逆転写反応により 1 s t s t r and cDNAの合成を行い、 次に PCRプライマー：ブラ イマ一 T2F7 ： 5 ' -AAAGTCGACCATGGGCGCCGC GGCCCGCACCCT— 3 ' 及びプライマー T2R5 ； 5 ' 一 TT
AGGAATTCTTGC- 3 ' を用い PC R反応により T I MP— 2 遗伝子の増幅を行い、 得られた T I MP— 2遺伝子を適当なクローニン グベクター、 例えば pUC l 3にサブクローニング後、 適当な発現べク ター、 例えば pKGにクローニングし、 宿主細胞に導入し、 こうして得 られた T I MP— 2遺伝子導入 CHO細胞を含む形質転換体細胞を培養 して調製された rT IMP— 2を有効成分として含有する上記 （1)記 載の治療剤、
(39)実施例 1に記載されたようにして調製された T I MP- 1を有 効成分として含有する上記 （ 1 )記載の治療剤、
(40)実施例 1に記載されたようにして調製された T IMP— 2を有 効成分として含有する上記 （ 1 ) 記載の治療剤、
(41)実施例 1に記載されたようにして調製された rT IMP— 1を 有効成分として含有する上記 （1)記載の治療剤、
( 42 )実施例 1に記載されたようにして調製された rT IMP— 2を 有効成分として含有する上記 （1)記載の治療剤、 (43)特開平 5— 1 99868号公報に記載の方法に準じて調製され た r T I MP— 1を有効成分として含有する上記 （ 1 )記載の治療剤、 及び
(44) A 0 k iらの方法 (Conn e c t i ve Ti s s u e, 1995 ; 26 : 281 -290) に準じて調製した rT I MP— 2を 有効成分として含有する上記 （1) 記載の治療剤が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 r T I M P— 2含有液剤の安定性試験の結果を示す。
図 2は、 SDラッ ト実験的皮庸欠損モデルでの rT IMP— 2投与に よる皮膚欠損部の面積変化を示す。
図 3は、 老齢 I CRマウス実験的皮庸欠損モデルでの r T IMP— 2 投与による皮膚欠損部の面積変化を示す。
図 4は、 糖尿病マウス実験的皮庸欠損モデルでの r T I M P— 2投与 による皮膚欠損部の面積変化を示す。
図 5は、 r T I M P— 2含有試験薬の皮膚欠損治療効果の用量依存性 試験の結果を示す。
図 6は、 糖尿病マウス実験的皮膚欠損モデルでの試験 15日目におけ る r T I MP— 2含有試験薬処置群の典型的病理組織学所見の写真で、 生物の形態の写真を示す。
図 7は、 糖尿病マウス実験的皮膚欠損モデルでの試験 I 5日目におけ る r T I MP— 2含有試験薬処置群の典型的病理組織学所見を示す図 6 の四角で囲った部分の拡大写真で、 生物の形態の写真を示す。
図 8は、 糖尿病マウス実験的皮庸欠損モデルでの試験 1 5曰目におけ る r T I MP— 2含有試験薬処置群に対する対照群の典型的病理組織学 所見の写真で、 生物の形態の写真を示す。 図 9は、 糖尿病マウス実験的皮膚欠損モデルでの試験での対照群の典 型的病理組織学所見を示す図 8の四角で囲った部分の拡大写真で、 生物 の形態の写真を示す。
図 10は、 rT IMP— 2のヒト正常皮膚線維芽細胞に対する増殖促 進効果を示す。
図 1 1は、 rT IMP— 2の tト正常皮膚線維芽細胞に対する増殖促 進効果を対照に対するパーセンテージで示す。
図 12は、 rT IMP— 1含有試験薬及び rT IMP - 2含有試験薬 の皮膚欠損治療効果を比較した結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明で使用される T I MP sは、 MMPファミリーに対するインヒ ビターを含んでいてよく、 例えば T IMP— 1、 T IMP— 2といった MMP sに対するインヒビターを用いることができる。 特に T IMP— 2は皮膚欠損症治療剤、 特には皮膚濱瘍治療剤及び創傷治療剤として多 くの優れた特性を持っている。 またとりわけ r T I MP— 2は優れた性 状を示す。
T I MP— 1は糖タンパク質であり、 ヒト、 ゥシその他の動物由来の 軟骨、 歯髄、 歯肉、 子宮、 胎盤、 皮膚等の組織中や、 関節软骨細胞、 骨 芽細胞、 各種組織由来線維芽細胞、 上皮細胞等の培養細胞、 羊水、 血清、 血漿、 血小板、 単球、 マクロファージ等から産生され、 これらの組織や 培養細胞のコンディシヨン培養液から調製することができる。 例えば、 Kodama e t a l. ， Co l l agen R e 1. Re s. , 7, 34 1〜 350, 1987及び Ki sh i and H a y a k a wa, J. B i ochem. ， 96， 395〜 404， 1 984に記載 の方法に準じて、 ゥシ歯髄由来細胞の培養液ゃヒト血清からモノクロ一 ナル抗体を用いたァフィ二ティークロマトグラフィー等により単離でき る。 また、 Kodama e t a 1. , J. I mm u n o 1. Me t hod s, 127, 1 03〜 108, 1 990に記載の方法に従いヒト 胎盤などからも得ることができる。
T IMP— 2は、 比較的最近になって見出され、 T IMP— 1とアミ ノ酸配列上約 40%の相同性を有するが、 TIMP— 1と異なり —結 合型オリゴ糖鎖を結合していない。 T I MP— 2も T I MP- 1の場合 と同様の種々の組織、 組織由来培養細胞の培養液等から得ることが出来 る。 例えば、 Fu j imo t o e t a】. ， C l i n. C h i m. Ac t a, 220, 31〜45, 1 993、 特開平 6 - 300757号 公報等に記載の方法に従い、 ヒト胎盤などからモノクローナル抗体を用 いたァフィ二ティークロマトグラフィ一等により得ることができる。 T IMP— 2は、 TIMP— 1と異なる性状及び N—結合型オリゴ糖鎖を 持たないという異なる分子構造を有するにも拘らず、 直接的薬効をもつ た創傷治療剤、 外科手術による手術創の治癒促進剤、 そして手術後の皮 膚欠損創におけるケロイドゃ肥厚性瘢痕の発生予防剤などとして非常に 用である。
T I MP- 1及び T I MP— 2は組換え DNA技術 （Man i a t i s， T. e t a l. , Mo l e c u l a r C l on i ng, Co I d Sp r i n Ha rbo r Labo r a t o ry, Co】 d Sp r i ng Ha rbo r, ew Yo rk, 1 982) を用い ることにより得ることもできる。 従来の培養細胞のコンディシヨン培養 液や血清、 さらには胎盤などから得る場合にはそれらに固有のある種の 制約があるが、 組換え DN A技術を適用しての製造方法ではこうした制 約を受けることがなく、 医薬の製造承認に必要とされる動物実験や臨床 試験に用いることのできる量及び質の T I MP sを得ることができる。 特に創傷や皮 It濱癢の治癒過程は上記したように複雑な多段階の過程が 関与し、 そして各段階でそれぞれ異なる各種の生体内細胞や生理活性因 子が関与しており、 さらにそれらは様々なバランスを保って作用してい るので、 病的な状態下で実際に T I MP sが如何なる役割を担い、 どの 様な薬理活性や生理活性を持ち、 どの様な病気に有効かを確かめるのは 困難であることが理解されるべきである。 こうした観点からみると組換 え DNA技術を用いることにより、 直接的形態で製造され、 そして複雑 な創傷や皮庸濱癌の治癒過程に於ける働きを確認できるに十分な量及び 質で得られ、 更に医薬の製造承認に必要とされる動物実験や臨床試験に 用いることのできる量及び質で得られた rT I MP sに皮膚欠損症治療 活性、 特には皮膚濱瘓治療あるいは予防活性及び創傷治療並びに治癒促 進活性を見出したことは注目される。
例えば T IMP- 1及び T I MP— 2をコードする核酸配列を利用し、 酵母、 チャイニーズハムスター卵巣細胞 （CHO細胞） などの真核細胞 宿主や大腸菌などの原核細胞宿主、 S f 21などの昆虫細胞等、 通常組 換え DN A技術に用いられる全ての宿主と宿主に応じた発現ベクターを 用いることにより得ることができる。 糖タンパク質である T I MP- 1 の場合は、 好ましくは真核細胞を宿主とした宿主べクタ一系を使用する。 組換え DN A法による r T I MP— 1及び r T I MP— 2の取得は、 例 えば W i l l i ams on, e t a 1. , B i o chem. J. ， 2 68， 267〜 274， 1990、 Boone, e t a 1. , Pro c. Na t l. Ac ad. Sc i. USA. , 87, 2800〜 280 4, 1990に記載の方法を参考にすることができる。
例えば r T I MP— 1は、 ヒト正常歯肉線維芽細胞 （G i n— 1細胞 ) より調製したポリ A mRNAを铸型、 オリゴ dT (15〜18個） をブライマーとした逆転写反応により 1 s t s t rand c DNA の合成を行い、 次に PCRプライマー、 例えばプライマー T I F 1 ； 5 ' -ATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG-3 ' 及びブライマー T 1 R 1 ； 5 ' -CAGGATTCAGGCTATCTG- 3 ' を用い PCR反応により適宜 T I MP— 1遺伝子の増幅を行い、 得られた T I MP- 1遺伝子を適当なクローニングベクター、 例えば pUC 1 3にサ ブクローニング後、 適当な発現ベクター、 例えば pMEMn e 0 (L e e e t a 1. , Na t u r e, 294, 228〜 232, 1 98 1) に クローニングし、 一般的なリン酸カルシゥム共沈法等により C H 0細胞 等に導入した。 T I MP— 1遗伝子導入酵母、 CHO細胞等の形質転換 体をマイクロキヤリヤー培養や高密度連铳培養など適当な方法で培養し、 得られたコンディシヨン培地から r T I MP— 1を調製する。 発現べク ターを導入した宿主細胞に対応して、 遺伝子産物の糖鎖構造は天然物と 異なったものが得られることは理解されるべきである。
また、 rT I MP— 2は、 例えばヒ ト G i n— 1細胞より調製したポ リ A" mRNAを铸型、 オリゴ dT (1 5〜1 8個） をプライマーとし た逆転写反応により 1 s t s t r an d cDNAの合成を行い、 次 に PCRプライマー、 例えばプライマー T2 F 7 ； 5 ' 一 AAAGTC GACCATGGGCGCCGCGGCCCGCACCCT—3 ' 及び ブライマー T2R5 ； 5 ' — TTAAGATCTGTCGACTTAA GGATCCTCGATATCGAGGAATTCTTGC-3 ' を用 い PCR反応により適宜 T I MP— 2 ¾伝子の增幅を行い、 得られた T IMP— 2遗伝子を適当なクローニングベクター、 例えば pUC 1 3に サブクローニング後、 適当な発現ベクター、 例えば pKGにクローニン グし、 一般的なリン酸カルシウム共沈法等により CHO細胞等に導入し た。 T I MP— 2遗伝子導入 CHO細胞などの形質転換体をマイクロキ ャリヤー培養や高密度連続培養など適当な方法で培養し、 得られたコン ディシヨン培地から rT I MP— 2を調製する。
組換え DN A技術を用いることにより得られる rT I MP sは、 本発 明の目的に合致する限り、 その構成ァミノ酸における 1個以上の変異、 例えば欠失、 置換、 挿入、 転位もしく.は付加により、 アミノ酸配列が相 違したものであることができる。 組換え DN A技術を用いれば、 例えば 基本となる D N A配列の特定の部位に突然変異を誘発することにより、 1個又は複数個のアミノ酸の欠失、 置換、 挿入を図ることが可能である。 代表的な方法としては、 位置指定変異導入法 （日本生化学会編、 「新生 化学実験講座 2、 核酸 111 、 組換 DNA技術」 、 東京化学同人、 233 頁〜 251頁、 1992年 10月 5日） が挙げられる。
これら種々の起源に由来する T I MP sは、 従来公知の通常タンパク 質の精製に用いられる方法、 例えば、 硫酸アンモニゥムゃ硫酸ナトリウ ムを用いた塩析法、 ゲルろ過担体やイオン交換担体を用いたクロマトグ ラフィ一法、 電気泳動法、 各 T IMPsに対するモノクローナル抗体、 ConAなどを用いたァフィ二ティークロマトグラフィー法、 高速液体 クロマトグラフィー法などを各 T I M Pの性質に合わせ、 単独または任 窻の組合わせにより使用して適宜精製することができる。 ところで、 ミ クロ的には天然物は、 均一の産物として得ることには限界があり、 例え ば天然物質である T I MP- 1は、 本来的あるいは単離の過程における 処理の影響で分子中に各種の形態の糖鎖を有し、 それに起因して様々な 分子量等をもつ物質からなる産物であるのが実情である。
微量で生物活性を持ち、 完全な分離精製が困難であることから非組換 え細胞 （非形質転換体） において普通には随伴するような夾雑物を、 r T IMPsは含まないと考えられる。 特に rT IMP— 2は、 精製単離 処理を加えて、 変成タンパク質などを含むことの少ない最終産物として 得ることが可能である。 rT IMP— 2は、 複雑な創傷や皮膚濱痛の治 癒過程に於ける働きを確認できるに十分な量及び純度で得られ、 更に医 薬の製造承認に必要とされる動物実験や臨床試験に用いることのできる に十分な量及び純度で得られるという特性が認められ、 医薬の有効成分 として優れている。
本発明は、 T I M P sを有効成分とし薬学的、 製剤的に許容される医 薬品添加物を含有する薬剤組成物を提供する。 有効成分の T I M P sか ら成る群から選ばれたものは、 1日当たり約 0 . O O l n g〜約 1 0 0 m gの範囲で投与することが可能であるが、 もちろん症状、 年齢、 疾患 の程度、 併用する薬剤などに応じ、 副作用などを生じないようにその投 与量を選択することができるし、 投与回数も 1日当たり 1回からそれ以 上の複数回といったように適宜選択することができる。 有効成分の T I M P sから成る群から選ばれたものは、 製剤に 0 . 0 0 0 1 %〜5 0 % の範囲で配合することができるが、 必要に応じその量は適宜選択するこ とは可能である。
本発明の薬剤組成物は混合などによって調製され、 適宜必要に応じて 安定化剤、 P H調節剤、 界面活性剤、 緩銜剤、 香料、 防腐剤、 基剤、 溶 剤、 希釈剤、 充塡剤、 増量剤、 溶解補助剤、 可溶化剤、 等張化剤、 乳化 剤、 懸濁化剤、 分散剤、 增粘剤、 ゲル化剤、 硬化剤、 吸収剤、 粘着剤、 弾性剤、 可塑剤、 結合剤、 崩壊剤、 喷射剤、 保存剤、 抗酸化剤、 遮光剤、 保湿剤、 緩和剤、 帯電防止剤、 無痛化剤などを単独もしくは組合わせて 含有させることができる。 安定化剤としては、 グリシンなどのアミノ酸 あるいはその塩、 ブドウ糖、 ショ糖などの糖、 マンニトール、 ソルビト ールなどの糖アルコール、 オリゴ糖、 多糖、 アルブミン、 ゼラチン、 グ ロブリン、 プロタミンなどのタンパク質、 ペプチドなどが挙げられる。 p H調節剤としては、 塩酸、 硫酸、 燐酸、 炭酸などの無機酸、 クェン酸 などの有機酸、 あるいはそれらの塩が挙げられる。 その他、 医薬品に配 合されて用いることが知られているものから適宜必要に応じ選択して用 いることが出来る。
本発明医薬組成物は、 経口、 局所、 経皮、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮 内もしくは関節内投与に適合し得るが、 ¾瘻や創傷患部への局所投与が 好適である。 もちろん他の濱癢治療薬や創傷治療薬などの薬剤と併用す ることも可能である。 またサイト力イン、 例えば P D G F、 T G F—な、 T G F - /3、 I G F - I、 C S F、 I L— 8、 E G F , b F G F、 K G Fなどの増殖因子をはじめとするサイトカイン類あるいはその他の生理 活性物質を配合することも本発明の皮膚欠損症治療に有効であるならば 可能である。 また場合によっては人工的に培養された皮膚と一緒に用い ることも可能であり、 皮膚欠損症状の治療に有効と考えられる処置用医 療材料あるいは医薬と併用することも可能である。
本発明の医薬組成物を患部局所へ投与する場合、 製剤として軟膏製剤、 硬裔製剤、 溶液剤、 水剤、 油剤、 クリーム剤、 パスタ剤、 パップ剤、 リ 二メ ント剤、 ローション剤、 スプレー剤、 懸濁剤、 乳濁剤、 外用チンキ 剤、 皮膚用水剤、 灌注剤、 貼付剤等を任意に選択することができる。 ま た液剤などをガーゼ、 脱脂綿、 創傷被覆材、 粘着ブラスタ一などに含浸 させ用いることもできる。
医薬品製造にあたっては、 その添加剤等や調製法などは、 例えば財団 法人日本公定害協会監修、 第十一改正 日本薬局方解説書、 昭和 6 1年 7月 1 8日発行、 株式会社廣川書店発行；一番ケ瀬 尚 他編 医薬品 の開発 1 2巻 （製剤素剤 〔 I〕 ） 、 平成 2年 1 0月 1 5日発行、 株式会 社廣川書店；同、 医薬品の開発 1 2卷 （製剤素材 〔11〕 ） 平成 2年 1 0 月 2 8日発行、 株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうち から必要に応じて適宜選択して適用することができる。
皮膚欠損症治療に使用する場合皮膚を介しての活性成分の吸収などが 重要であると考えられるが、 一般には湿潤状態に保つと薬物の吸収が良 好となる場合がある。 本発明の皮 ia欠損症治療に有効であるならば、 当 該分野で知られた如何なる方法、 手段をも用いることが出来る。 本発明 の薬剤組成物に含まれる T I M P sは、 MM P s活性を阻害する T I M P sであればどのような T I M P sでも使用することができるカ^ 好ま しくは大量に均質な T I M P sが得られる点で人為的に調製した r T I M P sを使用することができる。 特に r T I M P - 2は均質でかつ複雑 な創傷や皮膚滇瘍の治癒過程に於ける働きに有効な量及び純度で得られ、 さらにその取扱いにおいても優れた性状を有している。 医薬として用い るにあたっては製剤の安定性などについても厳しい要件が必要とされる 力 \ r T I M P— 2はこうした点でもすぐれた性状を有している。
. 本発明に関わる薬剤組成物の調製に必要な T I M P sの定量は、 特開 昭 6 3— 2 1 0 6 6 5号公報及び特開平 5— 2 4 4 9 8 5に記載の方法 に従い、 T I M P - 1あるいは T I M P - 2それぞれで異なるェピトー プを特異的に認識する 2種類のモノクローナル抗体を用いたサンドィッ チアッセィ系により酵素免疫化学的に行うことができる。
本発明に関わる薬剤組成物の効果確認は、 種々の創傷、 皮膚浪瘍、 種 々の外科手術による手術創、 外傷創、 動脈閉塞性下腿濱瘍及び静脈 g滞 性下腿 *瘍に代表される血管障害性の演瘻、 持铳的な圧迫刺激による褥 瘡ゃ糖尿病性癀瘍、 熱傷演癢、 外傷性滑瘻、 放射線濱瘍、 薬物濱瘻、 術 後濱癀、 炎症性濱瘻、 単純性浪癀等のモデルなどを用い、 皮膚欠損症治 療活性、 特には皮膚潰瘍治療あるいは予防活性及び創傷治療並びに治癒 促進活性を評価するのに適した系を用いて確認されうる。
特に本発明に関わる薬剤組成物の効果確認試験は以下に記載した実験 的皮膚欠損 （¾痛及び創傷） モデル及び実験的手術創モデル等を用いて 行われうる力 他に様々な手法を用いることが出来ることは理解される べきである。
実験的皮膚欠損モデルによる効果確認試験は以下の様にして評価でき る。 皮膚欠損は、 エーテル麻酔下に予め剃毛したラットあるいはマウス の背部皮膚に円形パンチ （内径 8 mm) で 2力所作製する。 皮膚欠損患 部に試験薬として T IMPs含有液剤 （溶媒 0. 005 %塩化べンザル コニゥム含有生理食塩水： 0. 005 %塩化ベンザルコニゥム含有 0. 1 5M NaC l溶液、 pH7. 2 ) を 1日 1回 22 1連日投与した。 —方、 対照として患部に T I MP sを含まない 0. 005 %塩化ベンザ ルコニゥム含有生理食塩水のみを同じく連日投与する。 その結果、 対照 群と比較し、 本発明の薬剤組成物を投与した群では皮 *欠損患部の欠損 面積の縮小の促進が認められ、 完治に至る日数の短縮を示し、 患部及び その周辺部の血色の改善も顕著であった。 さらに特筆すべき点は、 皮膚 欠損患部の再上皮化、 肉芽組織の形成、 血管新生などが促進され、 患部 の修復が促進し、 治療瘢痕が小さく、 より目立たないことであった。 こ の効果は、 T I MP sが単に慢性 （難治性） 浪瘙治療剤として有用であ るばかりでなく一般の手術痕ゃ外傷痕の縮小化にも利用でき、 Qua 1 i t y o f 1 i f eで重要な要素を占める善美的観点からも非常に 有用性が高いものと判断された。
実験的手術創モデルによる効果確認試験は以下の様にして評価できる。 例えば、 糖尿病マウス （KK— Ay ZT a J c 1 ) 6週齢、 体重 30 g前後） を用い、 ネンブタール麻酔 （3 Omg/k g， i. p. ) を施したマウスの予め剃毛、 消毒した背部から腹部にかけての皮膚をつ まみ上げ、 メスで正中線に垂直に、 左右対照に長さ約 1 0mmの側腹部 切創を作製する。 直ちに一方の切創に試験薬として T I MP s含有液剤 (溶媒 005 %塩化ベンザルコニゥム含有生理食塩水； 0. 005
%塩化ベンザルコニゥム含有 0. 1 5M NaC l溶液、 pH7. 2) 他方の切創に対照の 0 . 0 0 5 %塩化ベンザルコニゥム含有生理食塩水 を 2 6 G針付き注射筒を使用して 2滴 （約 2 2 1 ) 滴下し、 速やかに 等間隔に 2ケ所、 絹糸を用いて縫合する。 その後、 1日 1回 7日間、 試 験薬あるいは対照液を連続外用 （滴下） 投与する。 切創部位は、 汚染防 止の為、 被覆剤 （b i 0 c 1 u s i V e ) 及び弾性絆創膏 （シルキーテ ックス） を用いて密封包帯する。 試験 7日目に抜糸し、 経日的に患部の 治癒状況及び瘢痕の形成の程度の肉眼的所見及び、 患部表層組織を採取 し病理組織学的検索を行い治癒効果を評価する。 肉眼的所見では、 対照 群と比較した縫合創の大きさ、 縫合創及び周辺部の血色から評価する。 病理組織学的所見では、 対照群と比較した変性、 壊死の程度と再生像の バランス、 繊維化の程度と炎症細胞の浸潤、 浮歴のバランス等から評価 する。
尚、 本発明に関わる医薬組成物を適用した部位に肉眼的所見上判断さ れる副作用は認められなかった。
こうして T I M P sから成る群から選ばれた少なくとも一つのティシュ インヒビターを有効成分とする薬剤は、 動脈閉塞性下腿濱瘍及び静脈 g 滞性下腿濱瘻に代表される血管障害性の濱瘻の他、 処置困難な浪瘻であ る持続的な圧迫刺激による褥瘡や糖尿病性濱痛、 その成因によって呼ば れる熱傷濱瘍、 外傷性清瘍、 放射線浪瘻、 薬物滚瘍、 術後濱瘻、 炎症性 演瘍、 単純性演瘍等に対する予防作用あるいは治療作用、 症状改善作用 などを有していると判断される。 T I M P sから成る群から選ばれた少 なくとも一つのティシュ インヒビターを有効成分とする薬剤は、 慢性 (難治性） 皮膚演瘍などであって、 加齢や物理的因子あるいは重篤な基 礎疾患が背景に存在する場合もあるなどの様々な要因が関与し、 さらに 創部感染症を併発することもまれではない症状、 病気に対し有意の活性 を有していると判断される。 T I M P sから成る群から選ばれた少なく とも一つのティシュインヒビターを有効成分とする薬剤は、 単独で強力 な効果を示す薬剤として有用である。 また T I MP sから成る群から選 ばれた少なくとも一つのティシュ インヒビターを有効成分とする薬剤 は、 手術後の皮 *欠損創におけるケロイドゃ肥厚性瘢痕の発生予防や外 傷痕の予防活性を示し、 直接的薬効をもった創傷治療剤、 外科手術によ る手術創の治癒促進剤、 そして手術後の皮膚欠損創におけるケロイドゃ 肥厚性瘢痕の発生予防剤として有用である。 更に T I MP sは慢性 （難 治性） 演瘍治療剤として有用である。
r T I MP sから成る群から選ばれた少なくとも一つのティシュ ィ ンヒビター、 特に rT IMP— 2を有効成分として含有する医薬は、 そ の製剤としての加工などを含めた有利な点に加え、 上記したような各種 の創傷、 手術に伴う傷、 皮膚潰癟等に優れた活性を示す。 rT IMP— 2含有皮膚欠損症治療剤は、 長期間の保存の後でも安定した生理活性が 期待でき、 患部に適用した後も優れた生物活性の作用効果が期待できる。 実施例
次に実施例を示して、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明はこ の具体例により限定されるものでなく、 その思想に従うかぎり各種の形 態で実施できることは理解されるべきである。
実施例 1 T I MP sの調製
T I M P— 1は、 例えば K o d a m a e t a 1. , C o 1 1 a g en R e 1. Re s. ， 7, 341〜 350， 1987に記載の方法 に従い、 ヒト正常歯肉線維芽細胞 （G i n— 1細胞） のコンディシヨン 培綦液より U 1 t r o g e 1 A c A- 44 (LKB) , Con Aセ ファロース、 抗 T I MP— 1モノクローナル抗体 （例えば特開昭 63 - 219392号公報に開示のクローン No. 7— 2 I B 12など） 結合 セファロ一ス 4 Β ·ァフィ二ティーカラムを用いて精製し、 最後に、 3 5°C、 30分間、 4Mグァニジン一塩酸中で処理した後、 B i o— g e l P 60カラムに供試し T I MP- 1に結合している可能性のあるタンパ ク性因子を解甦、 分画により除去し調製した。
T I MP— 2は、 例えば F u j i mo t o e t a 1. , C l i n.
Ch i m. Ac t a, 220, 3 1〜45， 1 993及び特開平 6— 3 007 57号公報に記載の方法に従い、 胎盤を細断後、 緩銜液中で攬拌 し、 得られた上清を抗 T I MP— 2モノクローナル抗体 （例えば特開平 5 - 24 4 985号公報に開示のクローン No. 67 - 4 H 1 1など） 結合セファロ一ス 4 B ·ァフィ二ティーカラムに供試した後、 U 1 t r o g e 1 A c A— 44 (LKB) を用いて調製した。
r T I M P— 1は、 例えば特開平 5— 1 99868号公報に記載の方 法に準じて調製した。 ヒト正常歯肉線維芽細胞 （G i n— 1細胞） より 調製した全 RNA画分からオリゴ （dT) —セルロースカラムによりポ リ A— mRNA精製濃縮した。 ポリ A mRNAを铸型、 オリゴ dT ( 1 5〜1 8個） をプライマーとした逆転写反応により 1 s t s t r a n d c DN Aの合成を ί亍つた。 Do c h e r t y e t a 1. , N a t u r e, 3 1 8, 66〜 69, 1 985に記載されている T I MP 一 1の c DNA配列を参考に P CRプライマー、 ブライマ一 T I F 1 ； 5 ' -ATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG- 3 ' 及びプライ マー T 1 R 1 ； 5 ' 一 CAGGATTCAGGCTATCTG - 3 ' を 作成し、 これらの PCRプライマーを用い先に調製した 1 s t s t r a n d cDNAを铸型とした PCR反応により T I MP— 1遺伝子の 增幅を行った。
得られた T I MP— 1遺伝子を適当なクローニングベクター、 例えば pUC 1 3にサブクローニング後、 適当な発現べクタ一、 例えば p ME Mn e o (L e e e t a l. ， Na t u r e, 294, 228〜 2 32， 1 98 1 ) にクローニングし、 一般的なリン酸カルシウム共沈法 により C H 0細胞に導入した。 T I M P— 1遗伝子導入 C H 0細胞をマ イク口キヤリヤー培養や高密度連続培養など適当な方法で培養し、 得ら れたコンディシヨン培地から r T I MP— 1を調製した。
調製された r T I M P— 1は、 ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリ ルアミ ド電気泳動 （SDS— PAGE、 1 2%均一ゲル、 ¾元条件） 上 で約 30 kD aの単一バンドとして認められ、 ペルォキシダ一ゼ標識マ ウス抗ヒ ト T I MP— 1抗体を用いたウェスタンプロッティングにおい ても約 30 kD aの単一バンドとして認められた。 rT I MP— 1のヒ ト線維芽細胞 （CCD— 4 1 SK細胞） 由来 MMP— 1に対する阻害活 性は、 I C5。が約 1 X 1 0—9Mであった。
r T I MP— 2は、 例えば A o k iらの方法 （Con n e c t i v e T i s s u e, 1 9955 : 26 : 28 1— 290) に準じて調製し た。 ヒ ト G i n— 1細胞より調製した全 RNA画分からオリゴ （dT) —セルロースカラムによりポリ A mRNAを精製濃縮した。 ポリ A一 mRNAを铸型、 オリゴ dT (1 5〜1 8個） をプライマーとした逆転 写反応により 1 s t s t r a nd c DN Aの合成を行った。 B o o n e， e t a 1. , P r o c. Na t l. Ac a d. S c i. USA. , 87， 2800〜 2804， 1 990に記載の T I MP— 2の c D N A A配列を参考に PCRプライマー、 プライマー T2 F 7 ； 5 ' —AAA 及びプライマー T2 R 5 ； 5 ' — TTAAGATCTGTCGACTT AAGGATCCTCGATATCGAGGAATTCTTGC-3 ' を作成し、 これらの PCRプライマーを用い先に調製した 1 s t s t r a nd c DN Aを铸型とした P C R反応により T I MP— 2遗 伝子の増幅を行った。 得られた T I MP— 2遗伝子を適当なクローニン グベクター、 例えば pUC l 3にサブクローニング後、 適当な発現べク ター、 例えば p KGにクローニングし、 一般的なリン酸カルシウム共沈 法により CHO細胞に導入した。 T I MP— 2遺伝子導入 CHO細胞を マイクロキヤリヤー培養や高密度連続培養など適当な方法で培養し、 得 られたコンディシヨン培地から rT IMP— 2を調製した。 調製された T IMP— 2は SDS— PAGE (1 2 %均一ゲル、 通元条件） 上で約 24 kDaの単一バンドとして認められ、 マウス抗ヒ ト T I MP— 2モ ノクローナル抗体によるウェスタンプロッティングにおいても約 24 k D aの単一バンドとして認められたものであった。 CCD— 4 1 SK細 胞由来 MMP— 1に対する阻害活性は、 1じ；。が約1. 1 X 1 0—9Mで あった。 本発明に提供される薬剤組成物には、 MMPs活性を阻害す る T I MP sであればどのような T I MP sでも使用することができる 力 \ 好ましくは大量に均質な T IMPsが得られる点で人為的に調製し た r T I MP sを使用できる。 実施例 2 rT IMP— 1含有軟膏の調製
軟膏製剤としては、 公知公用の各種軟膏基剤を使用することができる が、 例えば rTIMP— 1をマクロゴール軟膏に加えて以下の様にして 製剤化することができる。
マクロゴール 400及びマクロゴール 4000各々 5 gにパラォキシ 安息香酸ェチル 5m g及び実施例 1で得られた T I MP- 1 1 mgを 加え、 常法により均一に混合して軟膏剤を調製した。 実施例 3 rTIMP— 2含有軟膏の調製
r T I MP— 2含有軟膏は、 実施例 2に記載の方法と同様にして実施 例 1で得られた rTIMP— 2をマクロゴール軟膏に加えて製剤化する ことができる。 実施例 i rT IMP- 1含有液剤の調製
0. 005 %塩化ベンザルコニゥム含有生理食塩水 （0. 005 %塩 化ベンザルコニゥム含有 0. 15M NaC I溶液、 pH7. 2 ) に、 実施例 1で得られた r T I MP- 1を最終濃度 0. 1 %となるように加 え調製する。 調製した液剤は、 ポアサイズ 0· 1 t/mのメンブレンフィ ルターで滅菌した後、 使用時まで冷蔵 （4°C) で保存した。 実施例 5 rTIMP— 2含有液剤の調製
rTIMP— 2含有液剤は、 実施例 4に記載の方法と同様にして実施 例 1で得られた r T I MP— 2を用いて製剤化することができる。 実施例 6 rT IMP-2含有液剤の経日安定性
4 °Cで保存した rTIMP— 2含有液剤の安定性を、 i n v i t r o での精製ヒ ト MMP— 1に対する阻害活性で評価した。 r T I MP- 2 含有液剤の調製は、 実施例 5に記載した方法に準じた。 ヒ ト潜在型 MM P— 1は、 例えば Fu j imo t o e t a 1. , C 1 i n. Ch im. Ac t a, 219， 1〜1 4, 1 993に記載の方法に従い、 ヒ ト新生児繊維芽細胞 （NB 1 RGB) の培養上清から精製することがで さ 。
( 1 ) rTIMP-2含有液剤の i n v i t r o阻害活性の
測定方法
阻害活性の測定は、 N a g a i e t a 1. , 炎症， 4 , 123〜 130, 1984及びNaga i e t a ， 炎症， 4， 24マ〜 254, 1 984に記載の方法を参考にして測定することができる。
0. 02 %B S A, 0. 2 M Na C l, 5 mM C a Cし 含有 50 mM Tr i s -HC 1 (pH7. 5 ) 緩衝液で適宜稀釈した精製ヒト 潜在型 MMP— 1 20〃 1に等量の 2mM 4 -Am i n o p h e n y l me r c u r i c a c e t a t eを加え、 35。Cで 2時間ィンキ ュベー卜する。 これに 0. 2M N a C 1 , 5 mM C a C 1 含有 50 mM T r i s-HC 1 (pH 7. 5) 緩衝液で段階稀釈した r T I MP— 2含有液剤 60 μ. 1を加え （このとき対照は緩銜液のみを 60 / 1添加する） 、 3 5°Cでさらに 1 5分間ィンキュベー卜する。 さ らに 0. 4M N a C 1. 1 0 mM C a Cし 含有 0. 1M T r i s-HC 1 (pH7. 5) 緩衝液で 2倍に希釈した F I TC檫識コラー ゲン 1 00〃 1を加え、 35 °Cで 2時間ィンキュベー卜する （対照用の 反応系は 1 00°Cで 5分間煮沸する） 。 50 %エタノールに溶解した o—フ Lナント口リ ン 1 0〃 Iを添加し、 反応を停止する。 0. 02 % BSA, 0. 2M N a C 1 , 5 mM C aCし 含有 50mM T r i s -HC 1 (pH7. 5) 緩衝液で適宜稀釈したエラスタ一ゼ 200 1を添加し 35てで 1 0分間インキュベートする。 これに 4 00〃 1 の 70%エタノール、 0. 67M N a C 1含有 T r i s— HC 1 (p H9. 5) 緩衝液を加え 3 0秒間ミキサーで攪拌する。 これを違心し、 得られた上清の蛍光を Ex ； 4 95 nm, Em； 520 nmの波長で測 定する。
対照の蛍光強度を 1 00%基質が分解された場合として、 試料の蛍光 強度の差を算出し、 50%阻害濃度 （ I C:,,値） を求めた。
( 2 ) 保存安定性
4 °C条件で保存した r T I MP— 2含有液剤の安定性を I C 。値によ り評価した。 その結果、 本液剤は少なくとも 1 2週間はその阻害活性は 安定であり、 冷蔵での比較的長期間の保存の後でも安定した生理活性が 期待できると判断された。 経週的な阻害活性測定の結果は、 図 1に示し た。 実 ί|例 7_ rT IMP-2含有剤の皮膚欠損 （創傷及び 瘍） 治療効果 (1) rT IMP— 2含有試験薬の調製
rT IMP— 2含有試験薬として、 実施例 5で調製した rT IMP— 2含有液剤を使用した。 対照として 0. 005 %塩化ベンザルコニゥム 含有生理食塩水をポアサイズ 0. 1 /mのメンブレンフィルターで滅菌 したものを使用した。
(2)試験動物及び実験的皮 *欠損モデルの作製
試験動物として SDラット （平 12週齢、 体重 254〜385 g) 8 匹、 老齡 （r e t i r e) I CRマウス （早 30週齡、 体重 20〜 56 g) 9匹及び糖尿病マウス （KK一 AyZTa J c l) (早 6週齡、 体重 26〜34 g) 6匹を用い、 エーテル麻酔下に予め剃毛、 消毒した これらのラットあるいはマウスの背部皮膚に円形パンチ （内径 8mm) を使用して正中線を中心に左右対称に実験的皮膚欠損部位を 2力所作製 した。 1ケ所の皮霜欠損部位は r T I M P— 2含有試験薬投与部位、 他 方を対照溶媒の投与部位とした。
(3) rT IMP— 2含有試験薬の投与と患部の観察
rT IMP— 2含有試験薬及び対照の溶媒は、 1曰 1回、 26 G針付 き注射筒を使用して 2滴 （約 22 1 ) を患部に直接滴下し連続投与し た。 老齢 （r e t i r e) I C Rマウス及び糖尿病マウスでは、 皮膚欠 損患部が汚染されないように被覆剤 （b i o c 1 u s i V e)及び弾性 絆創膏 （シルキーテックス） を用いて、 患部を密封包帯した。
毎日、 皮膚欠損部分の長径と短径をノギスで測定し、 以下の方法によ り治癒過程における創面積の変化を求めた。 皮膚欠損作製日 （DayO) の長径と短径の積を 1 00%として、 これに対する比率を次式により算 出した。
皮膚欠損部の長径 X短径 （観察曰）
面積比 （％) = X 1 00
皮庸欠損部の長径 X短径 （Day O)
算出した面積比の経日的変化より、 皮膚欠損部の面積変化を求めた。
① SDラッ トの試験結果
rTIMP-2含有試験薬の投与群は、 対照群に比べ 4日目以降顕著 に皮膚欠損面積の縮小の促進が認められ、 僅かではあるが完治日数の短 縮も示した。 経日的な治癒過程の典型的な結果を図 2に示した。
②老齢 I CRマウスの試験結果
rTIMP-2含有試験薬の投与群は、 対照群に比べ 3日目以降顕著 に皮膚欠損面積の縮小の促進が認められ、 さらに完治日数の短縮も示し た。 図 3に試験結果を平均し治癒過程を表示したものを示した。
③糖尿病マウスの試験結果
r T I MP— 2含有試験薬の投与群は、 対照群に比べ 3日目以降顕著 に皮膚欠損面積の縮小の促進が認められ、 さらに完治日数の短縮も示し た。 図 4に試験結果を平均し治癒過程を表示したものを示した。
これらの 3種の何れの試験動物における肉眼的所見でも、 試験 3日目 で対照群と比較し明らかに試験薬投与群では皮膚欠損部位の血色が良く、 乾燥の程度も高かった。 試験 9日ないし 10日目では、 対照群の皮膚欠 損部位の面積もかなり縮小し血色も改善してきている力 試験薬投与群 ではさらに皮廣欠損部位の面積が縮小しており、 正常色に迫っていた。 皮膚欠損が治癒した段階での対照群及び試験薬投与群の処置部位を比較 すると、 試験薬投与群では治療瘢痕が小さく、 より目立たなかった。 す なわち、 本試験結果で特筆すべき点は、 皮膚欠損部治癒の促進ばかりで なく治療瘢痕が小さく、 より目立たないことであり、 ヒトに適用すると 皮膚欠損創におけるケロイドゃ肥厚性瘢痕の発生や外傷痕を予防すると 推定される。 尚、 これらの試験において観察所見上判断される副作用は 全く認められなかった。 実施例 8 r T I MP- 2含有剤の皮膚欠損治療効果の用量依存性
(1) rT IMP - 2含有試験薬の調製
rTIMP-2含有試験薬として実施例 5で調製した r T I M P— 2 含有液剤を使用した。 但し、 rTIMP— 2の含有量を 0. 1 %以外に 0. 05%、 0. 01%及び0. 001 %の計 4種類設定した。 対照と して 0. 005 %塩化ベンザルコニゥム含有生理食塩水を使用した。
(2)試験動物及び実験的皮膚欠損モデルの作製
試験動物として糖尿病マウス （KK一 A yZT a J c 1 ) (早 13 週齢、 体重 39〜55 g) 30匹を用い、 実施例 7に記載の方法でマウ ス背部皮膚に実験的皮膚欠損部位を 2力所作製した。 それぞれの創部を 濃度の異なる r T I MP— 2含有試験薬あるいは対照溶媒の投与部位と した。
(3) rTIMP— 2含有試験薬の投与と患部の観察
rTIMP-2含有試験薬及び対照は、 1日 1回、 実施例 7に記載の 用 iを患部に直接滴下し、 創閉鎖まで連日投与した。 皮膚欠損患部は被 覆剤 （b i 0 c 1 u s i V e) 及び弾性絆創膏 （シルキーテックス） を 用いて患部を密封包帯した。
毎日、 皮赛欠損部の長径と短径をノギスで測定し、 実施例 7に記載の 方法により患部の面積変化を算出した。 2力所の創部へ投与する種々濃度の r T I MP— 2含有試験薬の組合 せは、
(ィ） 対照 （0%) 及び 0. 00 1 %、
(口） 0. 00 1 %及び 0. 0 1 %、
(ハ） 0. 0 1 %及び 0. 05%、 、
(二） 0. 05 %及び 0. 1 %、
(ホ） 0. 0 1 %及び 0. 1 %
とし、 各組合せにそれぞれ 6匹のマウスを使用した。
図 5に種々濃度の r T I MP— 2含有試験薬で処理した際の、 創部の 経日的面積変化を示した。 対照と比較し、 少なくとも 0. 00 1 %以上 の濃度の r T I M P— 2含有試験薬は明らかな創傷治癒促進作用を示し た。 その作用の強さには、 用量依存的傾向が認められるが、 0. 00 1 %薬剤と 0. 0 1 %薬剤の作用はほぼ同程度、 また、 0. 05%薬剤と 0. 1 %薬剤もほぼ同程度の作用を示した。 実施例 9 rT IMP- 2含有剤の皮膚欠損治療効果の組織学的評価
(1 ) rT IMP— 2含有試験薬の調製
r T I MP— 2含有試験薬として、 実施例 5で調製した rT I MP— 2含有液剤を、 対照として 0. 005 %塩化ベンザルコニゥム含有生理 食塩水を使用した。
(2) 試験動物及び実験的皮庸欠損モデルの作製
試験勦物として糖尿病マウス （KK— AyZTa J c l ) ( 8〜 1 3週齡、 体重 36〜53 g) 30匹を用い、 実施例 7に記載の方法で マウス背部皮膚に実験的皮膚欠損部位を 2力所作製した。 1ケ所の皮庸 欠損部位は r T I MP - 2含有試験薬投与部位、 他方を対照溶媒の投与 部位とした。 ( 3 ) r T I M P— 2含有試験薬の投与と患部の組織学的評価
r T I M P - 2含有試験薬及び対照は、 1日 1回、 実施例 7に記載の 用量を創患部に直接滴下し、 創閉鎖まで連日投与した。 皮膚欠損患部は 被覆剤 （b i o c 1 u s i V e ) 及び弾性絆創膏 （シルキーテックス） を用いて患部を密封包帯した。
試験 0、 5、 1 0、 1 5、 2 0日目に各々 6匹をペントバルビタール の腹腔内投与により屠殺した。 創部を全て含むように皮 *を四方形に筋 膜上の深さで切り出し、 これを 1 0 %ホルマリンにて固定後、 パラフィ ン包埋プロックを作製した。 各々のプロックから 5 mの薄切標本スラ イドを作製し、 各スライドをへマトキンリンーェォジン染色した。
( 4 ) 組織学的評価
治療日数の経過と共に、 r T I M P— 2含有試験薬処置群では対照群 と比較して、 明らかな表皮の再生像が認められ、 その下部では、 肉芽組 織の形成、 密なマトリ ックスの形成、 血管新生が明らかに促進されてい た。 特に再上皮化は顕著であり、 組織学的にケラチノサイ卜の遊走が促 進された結果と考えられた。 また、 r T I M P— 2には肉芽形成の促進 作用もあることが考えられた。
試験 1 5日目の対照群及び r T I M P— 2含有試験薬処置群の組織像 を図 6〜9に示した。 図 6及びその図のうちに示した組織像の一部分の 拡大写真である図 7をみると明らかなように r T I M P— 2処置マウス では完全に治癒している （傷口が小さい） ことが分かる （図 7では治癒 部位の表皮の厚さが創部以外の部分の表皮の厚さと同じであることがわ かり、 治癒がより完全であることを示している） 。 これは対照のマウス (図 8及びその図のうちに示した組織像の一部分の拡大写真である図 9 ) を比較してみるとより明らかである （図 9では未治癒部位の上皮化が未 だ不充分であり、 上皮部位も r T I M P— 2含有試験薬処置群の治癒部 位に比べ表皮の厚さが薄いことが分かる） 。 また、 創部の組織学的所見 を下記の様にその程度により分類、 数値化し、 評価を行った。
(a) 再上皮化：創作製直後の像を 0、 完全治癒時を 1 0とし、 再上皮 化の程度を 1 0段階で評価した。
( b ) 肉芽形成：次の 4段階で評価した。
1 ：薄い肉芽 2 ；中程度の肉芽 3 ；厚い肉芽 4 ；非常に厚い肉芽
(c) マトリックス密度：次の 4段階で評価した。
1 ；水腫 2 ；少量の粗いマトリックス 3 ；中程度のマトリックス 4 ；密なマトリックス
(d) 浸潤した細胞の数 （線維芽細胞、 マクロファージ） ：次の 4段階 で評価した。
1 ；殆ど無し 2 ；中程度 3 ；多数 4 ；非常に多数
(e) 創当りの毛細血管の数：次の段階で評価した。
0 ; 0〜4 1 ; 5〜1 4 2 : 1 5〜 2 4 3 : 2 5〜 3 4
1 0 ； 9 5 ~ 1 0 4 e t c.
例えば、 試験 1 0曰目の各組織学的所見を数値化し評価した結果を表
1に示した。 数値評価からも r T I M P— 2含有試験薬処置群では、 対 照群に比較して再上皮化、 肉芽形成、 マトリ ックス密度の促進、 毛細血 管数の増加が確認され、 特に再上皮化は顕著であった。
表 1 組織学的評価による rTIIIIP-2 の創傷治癒促進効果 処 匿 «1^ 再 ±J¾化 ^ΙΒ» マトリックス密度 a
Χ^^ Ο ΒΡΒΙ' RA P"2 3 4.0土0 2.3 ±0.6 2.3 ±0.6 2.3 ±0.6 13 ±0.6
2 XM Q] M P"2 3 7.0 ±1.7 3 Τ 3.0 ±0 3.0 ± 0 2.3 ±0.6 9.7 ±1.
Figure imgf000038_0001
ρ < 0.05
実施例 1 0 rT IMP- 2含有液剤のヒト正常皮膚線維芽細胞の増 殖に与える効果
(1 ) rT I MP— 2試験薬の調製
生理食塩水 （ 0. 1 5 M Na C 1溶液、 p H 7. 2) に実施例 1で 得られた r T I MP- 2を加え、 最終濃度を例えば 1 Omg/m 1に調 製する。 調製した溶剤は、 ポアサイズ 0. 1〃mのメンブレンフィルタ 一で滅菌した後、 使用時まで冷蔵 （4°C) 保存した。
(2) ヒト正常皮膚線維芽細胞の培養及び增殖促進効果の判定 ヒト正常皮膚線維芽細胞は、 ヒト皮膚の初代培養により取得したり、 あるいは市販の、 例えば C 1 o n e t i c s社より販売されている新生 児由来正常皮膚線維芽細胞を使用することができる。
細胞の増殖測定は、 色素抽出法により行った。
1 0 %ゥシ胎仔血清を含むィ一グル M E M培地中で培養した細胞を 9 6穴マイクロプレートにゥエル当り 1 03 c e 1 1 sZO. 1 m 1接種 した。 37°C、 5%CO- インキュベータ一中で一晩培養した後、 培地 を除去するために細胞を 3回 P B Sで洗浄した。 洗浄した細胞に種々濃 度の r T I MP— 2を添加したゥシ胎仔血清を含むイーグル MEM培地 を加え、 37°C、 5 %CO' で 5日間培養した。 このとき、 rT IMP 一 2を添加する基礎培地として、 0%、 1. 25%、 2. 5%、 5%、 1 0%のゥシ胎仔血清を含むイーグル MEM培地を使用した。
培養終了 ¾、 培地を吸引除去し、 20%メタノールに溶解した 0. 5 %クリスタルバイオレツ トを加え 30分間染色した。 蒸留水で細胞を穏 やかに洗浄し、 乾燥させた後、 細胞に取り込まれたクリスタルバイオレ ットを 30 %酢酸で溶出した。 溶出したクリスタルバイオレツ トをマイ クロプレートリーダー （東ソ一製、 MPRA4) を使用し、 570 nm の吸光度で測定した。 r T I MP- 2無添加で培養した対照の吸光度との差から細胞の増殖 の程度を判定した。 図 1 0に様々な rT IMP— 2'濃度で培養した細胞 の増殖の程度を吸光度で示した。 また、 図 1 1には対照に対する増殖の 程度をパーセンテージで表示した。
その結果、 rTIMP— 2濃度 S zgZmlより用量依存的に、 ヒ ト 正常皮膚線維芽細胞の増殖を促進した。 また、 rT IMP— 2濃度 10 OjUgZmlでは、 対照に比較して 40〜50%の増殖の促進が認めら れた。 図 1 1からも明らかなように、 培地に含まれるゥシ胎仔血清の量 によらず、 培地中の r T I MP— 2濃度に依存的に一様に増殖促進効果 を示した。 すなわち、 この効果は培地中のゥシ胎仔血清の量には依存せ ず、 rT IMP— 2自体の作用と推定できる。 実施例 1 1 rT I MP— 1及び r T I M P— 2の創傷治癒促進効果
の比較
( 1 ) rTIMP- 1含有試験薬及び r T I MP— 2含有試験薬の調 製
rT IMP- 1含有試験薬として、 実施例 4で調製した r T I M P— 1含有液剤を、 r T I MP— 2含有試験薬として実施例 5で調製した r T I MP— 2含有液剤を使用した。 対照として 0. 005 %塩化ベンザ ルコニゥム含有生理食塩水をポアサイズ 0. 1 mのメンブレンフィル タ一で滅菌したものを使用した。
(2)試験動物及び実験的皮 *欠損モデルの作製
試験動物として糖尿病マウス （KK一 AyZTa J c l) (早 8週 齡、 体重 31〜36 g) 10匹を用い、 実施例 7に記載の方法でマウス 背部皮膚に実験的皮膚欠損部位を 2ケ所作製した。 各 5匹のマウスをそ れぞれ r T I MP— 1投与群、 r T I MP - 2投与群とした。 1ケ所の 皮膚欠損部位は r T I MP— 1含有試験薬あるいは r T I MP— 2含有 試験薬の投与部位、 他方を対照溶媒の投与部位とした。
(3) 試験薬の投与と患部の観察
試験薬及び対照は、 1曰 1回、 実施例 7に記載の用量を患部に直接滴 下し、 創閉鎖まで連日投与した。 皮 It欠損部の保護、 患部の面積変化は、 実施例 7に記載の方法により算出した。
図 1 2に r T I MP— 1及び r T I MP— 2で処理した際の劎部の経 日的面積変化を示した。 両群ともほぼ同様の創傷治癒過程を示し、 有意 差を認めなかった。 また、 50%治癒に要した日数を比較した場合も両 群に有意な差は認められなかった。 すなわち、 本試験で用いた濃度 0.
1 %では、 rT IMP— 1と rT I MP— 2は、 ほぼ同等の創傷治癒効 果を有することが示された。
r T I MP sから成る群から選ばれた少なくとも一つのティシュ インヒビター、 特に rT I MP— 2を有効成分として含有する医薬は、 その製剤としての加工などを含めた有利な点に加え、 上記したような各 種の創傷、 手術に伴う傷、 皮膚潸瘻等に優れた活性を示す。 rT IMP - 2含有皮膚欠損症治療剤は、 長期間の保存の後でも安定した生理活性 が期待でき、 患部に適用した後も優れた生物活性の作用効果が期待でき こうして T I MP sから成る群から選ばれた少なくとも一つのティシュ インヒビターを有効成分とする薬剤は、 動脈閉塞性下腿 *瘼及び静脈管 滞性下腿清瘍に代表される血管障害性の濱瘍の他、 処置困難な濱瘻であ る持铳的な圧迫刺激による褥瘡や糖尿病性濱癢、 その成因によって呼ば れる熱傷 *瘍、 外傷性濱瘻、 放射線清瘍、 薬物濱瘍、 術後濱瘍、 炎症性 演瘍、 単純性 *瘻等に対する予防作用あるいは治療作用、 症状改善作用 などを有していると判断される。 T I MP sから成る群から選ばれた少 なくとも一つのティシュ インヒビターを有効成分とする薬剤は、 慢性 (難治性） 皮庸浪瘻などであって、 加齢や物理的因子あるいは重篤な基 礎疾患が背景に存在する場合もあるなどの様々な要因が関与し、 さらに 創部感染症を併発することもまれではない症状、 病気に対し有意の活性 を有していると判断される。 T I M P sから成る群から選ばれた少なく とも一つのティシュ インヒビターを有効成分とする薬剤は、 単独で強 力な効果を示す薬剤として有用である。 また T I M P sから成る群から 選ばれた少なくとも一つのティシュ インヒビターを有効成分とする薬 剤は、 手術後の皮膚欠損創におけるケロイ ドゃ肥厚性瘢痕の発生予防や 外傷痕の予防活性を示し、 直接的薬効をもった創傷治療剤、 外科手術に よる手術創の治癒促進剤、 そして手術後の皮膚欠損創におけるケロイ ド や肥厚性瘢痕の発生予防剤として有用である。 更に T I M P sは慢性 （ 難治性） 濱瘻治療剤として有用である。 産業上の利用可能性
本発明は、 T I M P sを主たる有効成分とする薬剤組成物を提供する。 本発明に関わる T I M P sを主たる有効成分とする薬剤組成物により処 置困難な懊性 （難治性） 皮庸濱瘍の治癒促進を達成することができるが、 加えて特筆すべきは治癒瘢痕が小さく、 より目立たないことである。 こ の効果は q u a 1 i t y o f 1 i f eで重要な要素を占める審美的 観点からも非常に有用性が高い。 さらに本発明に関わる薬剤組成物を用 いた治療により、 少なくとも単純外科手術に於ける手術創の治癒を早め ることが可能となり入院期間の短縮を可能とする。 このことは、 延いて は健康保険等の医療財政への経済的負担を軽減することにも貢献する。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ティシュ インヒビタ一 ォブ メタロブ口テアーゼ類から成る 群から選ばれた少なくとも一つのティシュ インヒビターを有効成分と することを特徵とする皮膚欠損症治療剤。
2 . 治療剤が、 皮膚欠損症の治療において皮 *欠損症の瘢痕の発生予 防及び該瘢痕の縮小化を図るための予防的治療を含む用途で用いられる ものであることを特徴とする請求項 1記載の治療剤。
3 . 皮) *欠損症が創傷であることを特徴とする請求項 1記載の治療剤。
4 . 創傷が手術創で、 その手術創あるいはそれに関連する手術瘢痕を 予防的治療により縮小化をなすものであることを特徴とする請求項 3記 載の治療剤。
5 . 創傷が外傷創で、 その外傷創あるいはそれに関連する外傷瘢痕を 予防的治療により縮小化をなすものであることを特徴とする請求項 3記 載の治療剤。
6 . 皮霜欠損症が皮膚濱癢であることを特徴とする請求項 1記載の治 療剤。
7 . 皮膚浪瘻が術後濱瘻で、 その術後濱瘍あるいはそれに関連する術 後瘢痕を予防的治療により縮小化をなすものであることを特徴とする請 求項 6記載の治療剤。
8 . 皮庸清瘍が外傷性濱瘍で、 その外傷性濱瘻あるいはそれに関連す る外傷性瘢痕を予防的治療により縮小化をなすものであることを特徴と する請求項 6記載の治療剤。
9 . 皮膚濱瘻が慢性濱瘼であることを特徵とする請求項 6記載の治療 剤。
1 0. 皮 I»潰瘍が褥瘡性湞瘍であることを特徴とする請求項 6記載の 治療剤。
1 1. 皮膚濱瘻が血管障害性潸瘍であることを特徴とする請求項 6記 載の治療剤。
1 2. 皮膚演瘍が炎症性潰瘍であることを特徴とする請求項 6記載の 治療剤。
1 3. 皮膚浪瘍が単純性潰瘍であることを特徴とする請求項 6記載の 治療剤。
1 4. 有効成分としてティシュ インヒビター ォブ メタロブロテ ァーゼ— 1を含有することを特徴とする請求項 1〜1 3のいずれか一記 載の治療剤。
1 5. ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼー 1とし てリコンビナント ティ シュ インヒビター ォブ メタロブ口テア一 ゼー 1を含有することを特徵とする請求項 1 4記載の治療剤。
1 6. リコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロ テアーゼ— 1が宿主細胞として大腸菌、 CHO細胞又は COS— 1細胞 を用 t、て得られた形質転換体細胞により発現され、 得られた遺伝子産物 を精製したものであることを特徴とする請求項 1 5記載の治療剤。
1 7. 有効成分としてティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテ ァーゼ— 2を含有することを特徵とする請求項 1〜1 3のいずれか一記 載の治療剤。
1 8. ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼー 2とし てリコンビナン ト ティ シュ インヒビター ォブ メタ口プロテア一 ゼー 2を含有することを特徴とする請求項 1 7記載の治療剤。
1 9. リコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロ テアーゼ— 2が宿主細胞として大腸菌、 CHO細胞又は COS— 1細胞 を用いて得られた形質転換体細胞により発現され、 得られた遺伝子産物 を精製したものであることを特徴とする請求項 1 8記載の治療剤。
2 0 . ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼ類として ティシュ インヒビタ一 ォブ メタ口プロテア一ゼ一 1及びティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼ一 2の混合物を有効成分と することを特徴とする請求項 1〜 1 3のいずれか一記載の治療剤。
2 1 . ティシュ インヒビタ一 ォブ メタ口プロテアーゼ一 1 とし てリコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテア一 ゼ一 1をそしてティシュ インヒビター ォブ メタ口プロテアーゼ一 2としてリコンビナント ティシュ インヒビタ一 ォブ メタ口プロ テアーゼー 2をそれぞれ含有することを特徴とする請求項 2 0記載の治 療剤。
2 2 . リコンビナント ティ シュ インヒビター ォブ メタ口プロ テアーゼー 1及びリコンビナント ティシュ インヒビター ォブ メ タロプロテアーゼ— 2がそれぞれ宿主細胞として大腸菌、 C H O細胞又 は C O S— 1細胞を用いて得られた形質転換体細胞により発現され、 得 られた遺伝子産物を精製したものであることを特徴とする請求項 2 1記 載の治療剤。
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