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WO1996036341A1 - Use of a glucan structure compound for inhibiting antibodies and method for obtaining same - Google Patents

Use of a glucan structure compound for inhibiting antibodies and method for obtaining same Download PDF

Info

Publication number
WO1996036341A1
WO1996036341A1 PCT/FR1996/000745 FR9600745W WO9636341A1 WO 1996036341 A1 WO1996036341 A1 WO 1996036341A1 FR 9600745 W FR9600745 W FR 9600745W WO 9636341 A1 WO9636341 A1 WO 9636341A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound according
gal
antibodies
apg
membrane
Prior art date
Application number
PCT/FR1996/000745
Other languages
French (fr)
Inventor
Hans Binz
Gérard Normier
Jean-Pierre Revillard
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pierre Fabre Medicament filed Critical Pierre Fabre Medicament
Priority to AU59047/96A priority Critical patent/AU5904796A/en
Publication of WO1996036341A1 publication Critical patent/WO1996036341A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans

Definitions

  • the present invention relates to the field of xenografts, and more particularly to the production of a product making it possible to eliminate rejection factors from xenografts.
  • This classification corresponds to a survival of a few hours or a few days in concordant combinations with acute rejection of the grafted organ and a survival of a few minutes to an hour in discordant species with acute rejection.
  • the main information comes from studies of isolated organs from pigs perfused with human blood or plasma and from in vitro studies using pig endothelial cells and cytotoxicity tests using human serum. 1. Immunological effectors of acute rejection
  • IgM and IgG class antibodies are natural antibodies which exist throughout the adult human population. These IgM and IgG class antibodies are cytotoxic for pig endothelial cells in the presence of human complement. Their specificity will be discussed below
  • the first epitope corresponds to a terminal gay sugar, present in all animal species except in Old World monkeys and in humans where an ⁇ galactosyltransferase, initially cloned in mice, has stop codons.
  • the glycoproteins are devoid of galactose ⁇ 1-3 at the end of the chain and there are natural antibodies which recognize this epitope (anti-Gay antibodies).
  • anti-Gay antibodies These antibodies have been the subject of numerous works essentially by GALILI and collaborators (Galili: 1985, J. Exp. Med. 162: 573-582; Galili, 1987, PNAS (USA) 84: 1369-1373; Galili 1993. Immunol Today 14: 480-482).
  • transgenic pigs with an overexpression of the CD55 (Decay accelerating factor) molecule in their endothelial cells, making it possible to dissociate the membrane attack complex from the complement.
  • CD55 Decay accelerating factor
  • transgenic pigs for CD55 have been produced by the WHITE group.
  • Other complement inhibitor protein genes are under study and represent potential candidates for the production of transgenic pigs: these are CD59, CD46 and CD35 (complement IRC receptors).
  • transgenic pigs expressing parasitic proteases of anticomplementary activity It is also possible to envisage the production of transgenic pigs expressing parasitic proteases of anticomplementary activity. All these methods come up against several theoretical and practical difficulties: on the one hand the production of transgenic pigs is currently technically very difficult in the absence of totipotent cell lines, on the other hand protection against the membrane attack complex does not prevent the release of very mediators strongly inflammatory such as C5a. It is therefore unlikely that protection from the action of the complement is sufficient to solve the problem.
  • the subject of the present invention is the use of a compound comprising at least part of the glycan structure of the membrane of a gram negative bacterium for the production of a product allowing blocking and / or elimination of anti-Gay antibodies in humans.
  • Bacterial strains especially gram negative bacteria, produce in their membrane glycan molecules of extremely varied structure and whose strict antigen specificity is already used for serotyping and in some cases for vaccination.
  • the glycan molecules of bacterial or fungal origin, or their hemisynthesis derivatives can be used for the purification of preformed antibodies.
  • the glycan structure comes from the membrane of a bacterium of the genus Klebsiella, in particular of the species Klebsiella pneumoniae.
  • a bacterium particularly suited to the implementation of the invention is the non-encapsulated strain of Klebsiella pneumoniae, deposited under the number IPI 145 in the national collection of the Institut Pasteur.
  • the product according to the invention comprises at least one part having one of the following structures:
  • the glycan structures are isolated from membranes of gram negative bacteria in a soluble and detoxified form. The process must be adapted according to the molecular mass and the characteristics of the glycan considered.
  • GC-APG galactoside chain
  • APG Acyl Poly (1,3) galactoside
  • n being between 40 and 60.
  • the molecular mass of APG is around 34 Kda.
  • the compound according to the invention can in particular be obtained from a suspension of membranes of gram negative bacteria by a process which comprises the following stages: a) delipidation, b) alkaline hydrolysis, c) exclusion chromatography, d) recovery of the detoxified and purified glycan chains having a molecular weight of between approximately 20 Kda and 35 Kda.
  • the parameters of the exclusion chromatography step will be adapted according to the characteristics of the product which it is desired to recover.
  • this step can thus be carried out by molecular sieving on Sephacryl® S 300 HR, at room temperature.
  • the process for producing the GC-APG is carried out as follows. From a biomass of Klebsiella pneumoniae stored at ⁇ 20 ° C., after thawing, grinding is carried out by high pressure homogenization and removal of the debris by centrifugation. The product obtained is subjected to acid precipitation at room temperature and then to dialysis with a cutoff coefficient of 10,000. After alkaline hydrolysis and enzymatic proteolysis, a fraction is precipitated with alcohol which is recovered by centrifugation and then delipidated. A further alkaline hydrolysis is then carried out, followed by dialysis to recover the dialysate which contains the extract stored at -20 ° C.
  • This extract is then purified by clarification then filtration followed by molecular sieving chromatography.
  • the product is then subjected to acid hydrolysis and to centrifugation then to purification steps by dialysis and filtration through 0.22 ⁇ m. It is then lyophilized in order to be stored in a sterile and pyrogen-free form suitable for intravenous infusion.
  • Means can then be used to obtain different structural configurations, in particular GC-APG.
  • the GC-APG molecule shows two digalactoside units in the same chain.
  • the unit formed by ( ⁇ Gal p - ⁇ Gal) n being located at the end of the GC-APG and therefore preferentially exposed to antibodies recognizing this sequence.
  • the particular susceptibility of the ⁇ Gal f residue to controlled hydrolysis conditions makes it possible to selectively eliminate this sequence.
  • the sequence obtained then becomes:
  • Such a compound can be obtained by carrying out a controlled hydrolysis with a weak acid at a molarity of between 0.05 and 0.2 M.
  • the hydrolysis conditions necessary for the selective elimination of the motif ( ⁇ Gal p -> ⁇ Gal f ) are as follows: Tri Fluoro Acetic acid 0, 1 M, 30 minutes at 100 ° C.
  • This structural form can be isolated directly from the crude GC-APG by exclusion chromatography on Sephadex G75.
  • the antibodies directed against the preparations according to the invention are all directed against the Gala (1-3) Gai epitope, yet expressed by all the rabbit cells, which indicates a rupture of tolerance following immunization with complete Freund's adjuvant.
  • Anti-Gal ⁇ (1-3) Gal IgM represents 80% of the antibodies involved in the rejection of pig xenografts and are responsible for the haemagglutination of pig red blood cells (Sandrin et al., 1993). The hemagglutination inhibition observed with melibiosis confirms these data.
  • a GC-APG preparation according to the invention completely inhibits its agglutinating properties confirming the interaction of the antibodies with the Gal ⁇ (1-3) Gal epitope already demonstrated by ELISA and further showing the value of this interaction at the cellular level.
  • the greater capacity of the APG preparations according to the invention to inhibit hemagglutination is explained by the existence of repetitive epitopes favorable to the capture of polyvalent IgM.
  • Glycans of bacterial origin in vivo neutralize natural anti-Gai antibodies in humans. These glycans can simultaneously specifically induce tolerance in vivo by immune paralysis, since polysaccharides are not rapidly metabolized in the body.
  • the glycan structure is integral with a support element.
  • the support element can be removed during an extracorporeal circuit.
  • These molecules can be coupled to an immunoabsorbent in the form of a membrane and used in an extracorporeal hemofiltration circuit.
  • APG or GC-APG are coupled to a biocompatible membrane according to methods depending on the nature of the membrane used. If the biocompatible membrane contains amino groups, it is possible to couple the GC-APG by carbodiimide or by reductive deamination. The glycanic compound is then secured to a fixed part of an extracorporeal circuit.
  • the support is a molecular structure which can be blocked on a suitable column or a solid support which can be blocked by physical means.
  • the glycan molecules or their hemi-synthesis derivatives can be used systemically, in particular intravenously, to neutralize the preformed antibodies and simultaneously induce tolerance.
  • the glycan structure of low molecular weight, can in particular be coupled to a support allowing polymerization, in particular trimerization or tetramerization for intravenous injection.
  • the invention also includes pharmaceutical compositions containing a glycanic compound as described above and pharmaceutically acceptable excipients.
  • Figure 1 Specificity of anti-JOOIX antibodies in normal human serum for GC-APG.
  • the pool of 10 normal human plasmas (pool 10) is diluted 1/20 in 0.15M NaCl and incubated for 2 hours at 37 ° C on a shaker in the presence of increasing concentrations of J001X or GC-APG in the same solvent.
  • the antibodies remaining free are detected by ELISA on J001X (10 ⁇ g / ml) at the bottom of the plate according to the J001X antibody procedure.
  • Figure 2 Specificity of anti-JOOIX antibodies in hyperimmune rabbit serum for GC-APG.
  • the serum of a rabbit immunized with PGM Kp is diluted to 1/100000 then treated with J001X or GC-APG as described for FIG. 1.
  • the anti-JOOIX IgGs remaining free are revealed by ELISA thanks to the use of a polyclonal goat anti-rabbit ⁇ -chain antibody.
  • Figure 3 Recognition of the Gal ⁇ (1-3) Gal epitope by anti-JOOIX antibodies in normal human serum. Pool 10 is treated as indicated for FIG. 1 by increasing doses of A. melibiose (recognized by anti-Gal ⁇ (1-3) Gal antibodies) or B. of glucose as negative control.
  • Figure 4 Specificity of IgG of hyperimmune rabbit serum for the Gal ⁇ (1-3) Gal epitope. The serum of a rabbit immunized with PGM Kp is treated as indicated in FIG. 2 with increasing doses of A. melibiosis or B. of glucose as negative control.
  • Figure 5 Non-belonging of anti-JOOIX or anti-melibiose IgG of normal human serum to the group of polyreactive antibodies.
  • Normal human plasma is treated as indicated in FIG. 1 with increasing doses of A. J001X, B. of melibiosis or C. of TNP-BSA and immobilized at the bottom of the plate. They are detected using a polyclonal goat anti-human IgG antibody.
  • FIG. 1 Anti-JOOIX antibodies do not recognize TNP-BSA. Pool 10 is treated with increasing concentrations of TNP-BSA and anti-JOOIX antibodies are detected as indicated in FIG. 1.
  • Figure 7 Structure of melibiose (6- ⁇ -D-gaIactopyranosyl-D-glucopyranose) and the two polyGal chains represented in GC-APG (after Kol et al., 1992).
  • the biomass of Klebsiella pneumoniae is obtained by culture in a fermenter, in a liquid medium, under conventional conditions.
  • the only specific constraint being the blocking of growth at the end of the exponential phase by abrupt cooling to 4 ° C to preserve the biological structures.
  • the biomass is separated from the culture medium by continuous centrifugation at low temperature and washed by centrifugation.
  • the cell concentrate is stored in the freezer while waiting to be processed.
  • the concentrate is thawed in a reactor and suspended in trisHCl buffer (10 mM) pH 7.0, containing MgCl 2 (10 mM) and NaCl (150 mM) at 4 ° C to have a final concentration equivalent to 50 g of dry cells per liter of suspension.
  • the production of industrial batches uses the equivalent of 1 to 3 Kg of dry cells per operation. 5 mg of ase DN are then added per liter of suspension.
  • the microbial cells are then disintegrated by continuous passage on industrial mills of the APV type, Manton Gaulin.
  • the bacterial lysate thus obtained is subjected to a first continuous clarification at 15,000 xg on a sharples separator at 4 ° C to remove the unmilled cells and the grinding residues.
  • the centrifugation pellet is eliminated and the supernatant collected, it constitutes the clarified lysate.
  • the clarified bacterial lysate is acidified to pH 4.2 ⁇ 0.1 with concentrated acetic acid and then left to stand for 30 minutes at 4 ° C.
  • the impurity precipitate is removed by continuous centrifugation at 15,000 xg using a Sharples separator.
  • the opalescent supernatant containing the membrane fraction is neutralized with NaOH and then dialyzed by ultrafiltration at constant volume against distilled water on a membrane cutting at 10,000 Daltons. When the resistivity reaches 500 ⁇ c ⁇ r 1 , the volume is concentrated to reach 20 1 per Kg of equivalent in dry starting cells.
  • the membrane suspension thus obtained will be immediately used for the preparation of GC-APG.
  • the APG is isolated from the digestate previously obtained by precipitation with 2 volumes of ethyl alcohol previously cooled to -20 ° C. After standing for 30 minutes at + 4 ° C., the APG precipitate is collected by continuous centrifugation at 15,000 ⁇ g on a Sharples separator.
  • the pellet is defatted using 3 liters of chloroform / methanol mixture (3/1) per kg of dry cells, after dispersion with
  • the residue is taken up in 3 liters of osmosis water per kg of dry cells and dispersed with Turrax.
  • the supernatant is subjected to alkaline hydrolysis (0.5 N NaOH, 1 h,
  • the solution containing APG is thawed for 24 hours at room temperature. After clarification by ultracentrifugation 30,000 g at 4 ° C for 1 hour, the supernatant is sterile filtered through a 0.22 ⁇ m filter and lyophilized. The average APG yield is close to 25 g per kg of dry cells.
  • the hydrolyzed lipid fraction of the APG precipitates. It is separated by centrifugation at 10,000 x g for 20 minutes at + 4 ° C. The supernatant containing the GC-APG is collected and then neutralized to pH 7.0 with sodium hydroxide. The average yield of GC-APG at this stage is close to 90%.
  • the GC-APG solution obtained above is sterilized by filtration on a 0.22 ⁇ m membrane.
  • the biomass of Klebsiella pneumoniae is obtained by culture in a fermenter, in a liquid medium, under conventional conditions.
  • the only specific constraint being the blocking of growth at the end of the exponential phase by abrupt cooling to 4 ° C to preserve the biological structures.
  • the biomass is separated from the culture medium by continuous centrifugation at low temperature and washed by centrifugation.
  • the cell concentrate is stored in the freezer while waiting to be processed.
  • the concentrate is thawed in a reactor and suspended in tris-HCl buffer (10 mM) pH 7.0, containing Mg Cl 2 (10 mM) and NaCl (150 mM) at 4 ° C to have an equivalent final concentration 50 g of dry cells per liter of suspension.
  • tris-HCl buffer (10 mM) pH 7.0, containing Mg Cl 2 (10 mM) and NaCl (150 mM) at 4 ° C to have an equivalent final concentration 50 g of dry cells per liter of suspension.
  • the production of industrial batches uses the equivalent of 1 to 3 kg of dry cells per operation. 5 mg of ase DN are then added per liter of suspension.
  • the microbial cells are then disintegrated by continuous passage on industrial mills of the APV type, Manton Gaulin.
  • the bacterial lysate thus obtained is subjected to a first continuous clarification at 15,000 x g on a separator, Sharples at 4 ° C to remove the unmilled cells and the grinding residues.
  • the centrifugation pellet is eliminated and the supernatant collected, it constitutes the clarified lysate.
  • the clarified bacterial lysate is acidified to pH 4.2 ⁇ 0.1 with concentrated acetic acid and then left to stand for 30 minutes at + 4 ° C.
  • the impurity precipitate is removed by continuous centrifugation at 15,000 xg on a separator Sharples.
  • the opalescent supernatant containing the membrane fraction is neutralized with NaOH and then dialyzed by ultrafiltration at constant volume against distilled water on a membrane cutting at 10,000 Daltons. When the resistivity reaches 500 ⁇ cm- 1 , the volume is concentrated to reach 20 1 per kg of equivalent in dry starting cells.
  • the membrane suspension thus obtained will be immediately used for the preparation of GC-APG.
  • the APG is isolated from the digestate previously obtained by precipitation with 2 volumes of ethyl alcohol previously cooled to -20 ° C. After standing for 30 minutes at + 4 ° C., the APG precipitate is collected by continuous centrifugation at 15 000 xg on Sharples separator. At this stage, the average yield of APG is close to 25 g per kg of dry equivalent in starting biomass.
  • the pellet of alcoholic precipitate obtained previously is dispersed in 5 l of a 1% solution of acetic acid per kg of dry equivalent of starting biomass.
  • the solution is then quickly brought to a temperature of 100 °.
  • the hydrolyzed lipid fraction of the APG precipitates. It is separated by centrifugation at 10,000 x g for 20 minutes at + 4 ° C.
  • the supernatant containing the GC-APG is collected and then neutralized to pH 7.0 with sodium hydroxide.
  • the average yield of GC-APG at this stage is close to 90%.
  • the GC-APG solution obtained above is sterilized by filtration on a 0.22 ⁇ m membrane.
  • the biomass of Klebsiella pneumoniae is obtained by culture in a fermenter, in a liquid medium, under conventional conditions.
  • the only specific constraint being the blocking of growth at the end of the exponential phase by abrupt cooling to 4 ° C to preserve the biological structures.
  • the biomass is separated from the culture medium by continuous centrifugation at low temperature and washed by centrifugation.
  • the cell concentrate is stored in the freezer while waiting to be processed.
  • the concentrate is thawed in a reactor and suspended in tris-HCl buffer (10 mM) pH 7.0, containing MgCl (10 mM) and NaCl (150 mM) at 4 ° C to have a final concentration equivalent to 50 g of cells dry per liter of suspension.
  • tris-HCl buffer (10 mM) pH 7.0 containing MgCl (10 mM) and NaCl (150 mM) at 4 ° C to have a final concentration equivalent to 50 g of cells dry per liter of suspension.
  • the production of industrial batches uses the equivalent of 1 to 3 Kg of dry cells per operation. 5 mg of ase DN are then added per liter of suspension.
  • the microbial cells are then disintegrated by continuous passage on industrial mills of the APV type, Manton Gaulin.
  • the bacterial lysate thus obtained is subjected to a first continuous clarification at 15,000 x g on a sharples separator at 4 ° C to remove the unmilled cells and the grinding residues.
  • the centrifugation pellet is eliminated and the supernatant collected, it constitutes the clarified lysate.
  • the clarified bacterial lysate is acidified to pH 4.2 ⁇ 0.1 with concentrated acetic acid and then left to stand for 30 minutes at 4 ° C.
  • the impurity precipitate is removed by continuous centrifugation at 15,000 xg using a Sharples separator.
  • the opalescent supernatant containing the fraction membrane is neutralized by NaOH then dialyzed by ultrafiltration at constant volume against distilled water on a membrane cutting at 10,000 Daltons. When the resistivity reaches 500 ⁇ cm - 1 , the volume is concentrated to reach 201 per kg of equivalent in dry starting cells.
  • the membrane suspension thus obtained will be immediately used for the preparation of GC-APG.
  • the APG is isolated from the digestate previously obtained by precipitation with 2 volumes of ethyl alcohol previously cooled to -20 ° C. After standing for 30 minutes at + 4 ° C., the APG precipitate is collected by continuous centrifugation at 15,000 ⁇ g on a Sharples separator.
  • the pellet is defatted using 3 liters of chloroform / methanol mixture (3/1) per kg of dry cells, after dispersion with Turrax.
  • the residue is taken up in 3 liters of osmosis water per kg of dry cells and dispersed with Turrax. After stirring overnight at + 4 ° C, the solution is clarified by ultracentrifugation at 30,000 g, 1 h at 4 ° C.
  • the supernatant is subjected to alkaline hydrolysis (0.5 N NaOH, 1 h, 56 ° C) and then neutralized using HCl.
  • the solution is dialyzed by ultrafiltration at constant volume on a membrane cutting at 10,000 Da up to 2,500 ⁇ cm- 1 and concentrated to 4 liters per kg of dry cells.
  • the solution After adjusting the pH to 7.2, the solution is stored at -20 ° C pending lyophilization.
  • the solution containing APG is thawed for 24 hours at room temperature.
  • the supernatant is sterile filtered through a 0.22 ⁇ m filter and lyophilized.
  • the average APG yield is close to 25 g per kg of dry cells.
  • the distal part of the GC-APG molecule is composed of digalactoside ( ⁇ Galp -> ⁇ Galf) n
  • the particular sensitivity of galactofuranose to hydrolysis managed by trifluoroacetic acid can be advantageously used to selectively eliminate the block (5 ⁇ Gal p - ⁇ Gal f).
  • the operating conditions will be as follows: 1 g of GC-APG obtained according to the method described above is dissolved in 200 ml of a 0.1 M solution of trifluoroacetic acid. The solution is then brought 30 minutes to 100 ° C. to hydrolyze the galactofuranose residues, then cooled and neutralized with sodium hydroxide.
  • the GC-APG is then separated from the hydrolysis products by a simple chromatography on Sephadex G25 in water. Under these conditions, the GC-APG immediately exits to the exclusion volume while the hydrolysis residues which are essentially disaccharides are greatly delayed.
  • the GC-APG thus obtained has its molecular mass reduced to 20-25,000 Daltons and can be sterilized and lyophilized as described above.
  • the preparation obtained from K. pneumoniae according to Example 3 is designated by J001X.
  • the Fauve de Bourgogne rabbits were immunized by four subcutaneous injections one week apart with PGM Kp (100 ⁇ g / ml in 0.5 ml of PBS in emulsion in the complete Freund's adjuvant at the first injection then by adjuvant Freund's incomplete for subsequent injections).
  • the sera were collected 10 days after the last injection.
  • Anti-JOO IX antibodies are detected by ELISA on J001X immobilized at the bottom of the plate.
  • the anti-JOOIX antibodies retained are revealed by means of antibodies conjugated to peroxidase anti-rabbit IgG and anti-human IgM or IgG, the presence of anti-JOOIX IgA could not be detected in pool 10.
  • the sera are titrated in order to define for each class of Ig the lowest dilution at the edge of the saturation plateau.
  • the specificity of anti-JOOIX antibodies is studied by pretreating the sera diluted with increasing concentrations of GC-APG or melibiose in solution at 37 ° C for 2 h.
  • Anti-JOOIX antibodies not linked to sugars are then revealed by ELISA on J001X in solid phase.
  • Anti-JOOIX human IgGs (FIG. 1A) and IgM (FIG. 1B) are neutralized in a dose-dependent manner by GC-APG. All of the IgG antibodies are absorbed by 0.05 mg / ml of GC-APG; IgM are neutralized with 5 mg / ml of GC-APG. GC-APG also absorbs all anti-JOOIX hyperimmune rabbit IgGs (Fig. 2). Absorption by melibiose at the highest concentration tested
  • the anti-JOOIX IgG and IgM detectable by ELISA and naturally present in human serum are directed against the polygalactose chain GC-APG. Partial absorption by melibiosis indicates that more than half of IgG and 3/4 of IgM anti-JOOIX are directed against the epitopes ⁇ (l-3) Galactose of GC-APG (Fig. 7).
  • Natural polyreactive antibodies have the property of reacting with haptens such as trinitrophenyl. If the anti-JOOIX antibodies belong to this category of antibodies, it is possible to reduce their reactivity with J001X by pretreating the SHN with the TNP coupled with BSA. Conversely, the treatment of NHS with J001X should decrease the reactivity of anti-TNP antibodies with TNP-BSA.
  • J001X or by TNP-BSA according to the protocol described in the previous paragraph.
  • the capture of the two specificities of antibodies is then revealed by ELISA on J001X or on TNP-BSA at the bottom of the plate.
  • Anti-TNP-BSA IgGs do not recognize J001X (Fig. 5A) or melibiosis (Fig. 5B) since no dose-dependent reduction in the binding of these antibodies to TNP-BSA at the back of the plate cannot be detected. Under the same conditions 6.7 ⁇ g / ml of TNP-BSA in the soluble phase capture all of the IgGs which are specific to it (FIG. 5C).
  • anti-JOOIX IgG and IgM are not neutralized by TNP-BSA in the soluble phase even at a concentration 9 times greater than the minimum concentration necessary for the neutralization of all the anti-TNP-BSA IgG detectable under the conditions of this test (Fig. 6).
  • Example 7 Are anti-JOOIX antibodies involved in the hemagglutination of pig red cells?
  • Pig red cells are agglutinated by IgM present in the
  • Pool 10 is pretreated with increasing doses of the compound used as an absorbent.
  • the treated or untreated pool is then diluted from half to half and each dilution is brought into contact with an equal volume of pig red cells in order to define the haemagglutinating titer.
  • Table 1 indicates a dose-dependent decrease in the agglutinating titer in the presence of J001X and melibiosis, while the glucose does not modify the titer relative to the control. However, at the highest concentration tested for melibiosis (600 mM), hemagglutination is still observed with the 1/16 NHS. Curiously, the results obtained with J001X cannot be reproduced in the presence of GC-APG.
  • the antibodies responsible for the hemagglutination of pig red cells are directed against the Gal ⁇ (1-3) Gal epitopes, as confirmed by the inhibition of hemagglutination by the serum pretreated with melibiosis. J001X also interacts with the antibodies involved in this reaction. This result is not due to a non-specific interaction of J001X with red cells, so it is indeed a capture of the antibodies responsible for hemagglutination.
  • Table 1 Inhibition of the hemagglutination of pig red cells by the serum in the presence of J001X or melibiosis
  • the pool 10 decompleted and diluted 1/16 in PBS is incubated for 2 h at 37 ° C with shaking in the presence of the indicated compounds and then diluted from half to half. Fifty ⁇ l of each dilution are incubated in the presence of the same volume of 1% pig red cells for 2 h at room temperature. The haemagglutinating titer is the highest dilution of serum giving agglutination of red blood cells.
  • Example 8 example of coupling of APG on a support constituted by porous microbeads
  • the example chosen is that of coupling APG to an activated support with N-hydroxysuccinimide esters (Affi Prep 10, BIORAD, Ivry-sur-Seine, France).
  • the Affi Prep 10 100 ml support is transferred to a funnel fitted with a sintered glass and washed, under reduced pressure, with 30 to 50 volumes of 10 mM sodium acetate buffer, pH 4.5, at a temperature of 4 ° vs.
  • the support is quickly washed with 3 volumes of 50 mM bicarbonate buffer pH 8.3 at 4 ° C.
  • the support is transferred to a 500 ml beaker and 1 g of APG dissolved in 300 ml of 50 mM bicarbonate buffer pH 8.3 is added.
  • the mixture is stirred moderately using a propeller driven by an IKA RW20 motor for 4 hours at + 4 ° C.
  • the support is washed with four volumes of 0.5 M NaCl in water to remove the unbound APG.

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Abstract

The object of the invention is the use of a compound containing at least part of the glucan structure of a gram negative bacteria membrane for making a product that inhibits and/or suppresses anti-galactose antibodies in a human subject. The invention also pertains to a method for obtaining a glucan product capable of being used for this purpose.

Description

UTILISATION D'UN COMPOSE COMPORTANT UNE STRUCTURE GLYCANIQUE POUR LE BLOCAGE D'ANTICORPS ET PROCEDE D'OBTENTION D'UN TEL PRODUIT.USE OF A COMPOUND COMPRISING A GLYCANIC STRUCTURE FOR THE BLOCKING OF ANTIBODIES AND METHOD FOR OBTAINING SUCH A PRODUCT.
La présente invention se rapporte au domaine des xénogreffes, et plus particulièrement à l'obtention d'un produit permettant d'éliminer des facteurs de rejet des xénogreffes.The present invention relates to the field of xenografts, and more particularly to the production of a product making it possible to eliminate rejection factors from xenografts.
a/ Les xénogreffesa / The xenografts
La barrière d'espèce en transplantation d'organes a été longtemps considérée comme infranchissable. Cependant, dès les années 60, REEMSTMA à la Nouvelle-Orléans et J. TRAEGER à Lyon, réalisaient des greffes de reins de chimpanzés à l'homme sous immunosuppression conventionnelle avec, dans un cas, une fonction du transplant pendant 9 mois, les autres ayant abouti à des rejets précoces. Plus récemment STARZL à Pittsburg a pratiqué deux hétérogreffes de foie de babouin avec des survies de quelques mois sous FK 506.The species barrier in organ transplantation has long been considered insurmountable. However, as early as the 1960s, REEMSTMA in New Orleans and J. TRAEGER in Lyon, carried out kidney transplants from chimpanzees to humans under conventional immunosuppression with, in one case, a transplant function for 9 months, the others leading to early releases. More recently STARZL in Pittsburg has performed two baboon liver heterografts with survival of a few months on FK 506.
Ces observations anecdotiques ne sont qu'une indication de l'intérêt croissant porté par la communauté médicale et scientifique aux hétérogreffes. Depuis trois ans de très nombreux colloques sont organisés sur ce sujet qui mobilise un nombre croissant de groupes de recherche et certaines compagnies pharmaceutiques ou biotechnologiques.These anecdotal observations are only an indication of the growing interest in the heterograft by the medical and scientific community. For the past three years, numerous conferences have been organized on this subject, which mobilizes an increasing number of research groups and certain pharmaceutical or biotechnology companies.
Les raisons de cet engouement tiennent essentiellement à l'expansion des indications des allogreffes dans de nombreuses situations de défaillance irréversible aiguë ou chronique d'un organe vital (coeur, poumon, coeur-poumon, foie, rein, rein+pancréas). Ce développement, lié à l'amélioration des conditions d'immunosuppression se heurte à une diminution du nombre d'organes utilisables pour la greffe. Cette diminution tient à de nombreux facteurs: diminution des morts cérébrales traumatiques par accident de circulation, augmentation du nombre de refus des dons d'organes par les familles, augmentation du nombre de donneurs non acceptables du fait des risques infectieux ou des lésions organiques provoquées par la réanimation. Dans ce contexte l'option des hétérogreffes apparait à tous comme un très grand enjeu médical et économique, malgré les fantastiques difficultés biologiques. Les expérimentations sont poursuivies actuellement sur couples d'espèces concordantes ou discordantes. Cette classification correspond à une survie de quelques heures ou quelques jours dans les combinaisons concordantes avec rejet aigu de l'organe greffé et une survie de quelques minutes à une heure dans les espèces discordantes avec rejet suraigu. Bien que les premières expériences cliniques aient été faites avec des chimpanzés ou des babouins, il se dessine actuellement un consensus pour le choix du porc ou du mini-porc comme espèce donneuse d'organes. Ceci tient à de multiples raisons liées d'abord à la taille des organes et à des possibilités d'élevage dans des conditions strictement contrôlées. Cependant il faut signaler qu'il n'existe pas actuellement de lignées de cellules totipotentes chez le porc, équivalentes des lignées ES de la souris, ce qui rend particulièrement difficile la production de porcs transgéniques, qui ne peut actuellement s'effectuer que par micro-injection d'ADN dans l'oeuf fécondé. Le pourcentage de succès d'expression du transgène atteint au maximum 1% des embryons implantés.The reasons for this craze are mainly due to the expansion of allograft indications in many situations of irreversible acute or chronic failure of a vital organ (heart, lung, heart-lung, liver, kidney, kidney + pancreas). This development, linked to the improvement in immunosuppression conditions, comes up against a reduction in the number of organs usable for transplantation. This decrease is due to many factors: decrease in traumatic brain deaths from traffic accidents, increase in the number of refusals of organ donation by families, increase in the number of unacceptable donors due to infectious risks or organic lesions caused by resuscitation. In this context the option of heterografts appears to all as a very big medical and economic issue, despite the fantastic biological difficulties. Experiments are currently continuing on pairs of concordant or discordant species. This classification corresponds to a survival of a few hours or a few days in concordant combinations with acute rejection of the grafted organ and a survival of a few minutes to an hour in discordant species with acute rejection. Although the first clinical experiments were made with chimpanzees or baboons, there is currently emerging a consensus for the choice of pork or mini-pig as an organ donor species. This is due to multiple reasons linked first of all to the size of the organs and to possibilities of breeding under strictly controlled conditions. However, it should be noted that there are currently no totipotent cell lines in pigs, equivalent to the ES lines of mice, which makes production of transgenic pigs particularly difficult, which can currently only be carried out by micro -injection of DNA into the fertilized egg. The percentage of transgene expression success reaches a maximum of 1% of implanted embryos.
Ces considérations concernant les xénogreffes d'organes ne s'appliquent pas aux xénogreffes de cellules. De nombreux Laboratoires utilisent le modèle expérimental des souris SCID reconstituées par cellules souches ou cellules lymphoïdes humaines (SCID/Hu). De nombreuses recherches concernent les cellules hétérologues encapsulées (ex. îlots de Langerhans). Cependant, vu les progrès d'immortalisation des cellules somatiques et des manipulations génétiques, il n'est pas certain que la greffe de cellules hétérologues ait un avenir par rapport aux greffes de cellules autologues ou aux injections d'ADN pur dans le cadre de la thérapie génique.These considerations regarding organ xenografts do not apply to cell xenografts. Many Laboratories use the experimental model of SCID mice reconstituted by stem cells or human lymphoid cells (SCID / Hu). A lot of research concerns encapsulated heterologous cells (eg islets of Langerhans). However, given the progress of somatic cell immortalization and genetic manipulation, it is not certain that heterologous cell transplants have a future compared to autologous cell transplants or injections of pure DNA in the context of genetical therapy.
b/ Les aspects immunologiques des xénogreffesb / Immunological aspects of xenografts
Les principales informations proviennent d'études d'organes isolés de porc perfusé avec du sang ou du plasma humain et d'études in vitro utilisant des cellules endothéliales de porc et des tests de cytotoxicité à l'aide de sérum humain. 1. Les effecteurs immunologiques du rejet suraiguThe main information comes from studies of isolated organs from pigs perfused with human blood or plasma and from in vitro studies using pig endothelial cells and cytotoxicity tests using human serum. 1. Immunological effectors of acute rejection
Les éléments actuellement identifiés comme effecteurs du rejet suraigu qui survient dans les minutes suivant le contact de l'organe vascularisé de porc avec le sang humain sont les suivants:The elements currently identified as effectors of the acute rejection that occurs within minutes of contact of the pig's vascularized organ with human blood are as follows:
- anticorps préformés : il s'agit d'anticorps naturels qui existent dans toute la population humaine adulte. Ces anticorps de classe IgM et lgG sont cytotoxiques pour les cellules endothéliales de porc en présence de complément humain. Leur spécificité sera discutée ci-dessous- preformed antibodies: these are natural antibodies which exist throughout the adult human population. These IgM and IgG class antibodies are cytotoxic for pig endothelial cells in the presence of human complement. Their specificity will be discussed below
(Avrameas and Ternynck, 1993, Molec. Immunol. 30: 1130-1142).(Avrameas and Ternynck, 1993, Molec. Immunol. 30: 1130-1142).
- le système du complément est activé à la fois par la voie classique probablement par les anticorps, mais aussi par la voie alterne.- the complement system is activated both by the classical route, probably by antibodies, but also by the alternate route.
- le système de contact et le système de coagulation semblent jouer un rôle très important avec activation directe de ces systèmes par les cellules endothéliales de porc, suggérée par les lésions observées avec des sérums décomplémentés. - des travaux montrent que des cellules NK sont susceptibles d'induire un rejet suraigu.- the contact system and the coagulation system seem to play a very important role with direct activation of these systems by pig endothelial cells, suggested by the lesions observed with decomplemented sera. - studies show that NK cells are capable of inducing acute rejection.
Le poids relatif de ces différents facteurs et le rôle éventuel de l'immunité spécifique par les lymphocytes T ne peuvent être correctement appréciés actuellement.The relative weight of these various factors and the possible role of specific immunity by T lymphocytes cannot currently be properly appreciated.
2. Spécificité des anticorps2. Specificity of the antibodies
Les extraits de cellules endothéliales porcines analysés en immunoblot en présence de sérums humains normaux révèlent la présence de multiples bandes identifiées actuellement uniquement par leur poids moléculaire. Différents travaux permettent de penser qu'une partie sinon la totalité de ces anticorps naturels est dirigée contre des épitopes glucidiques et, actuellement, 4 épitopes majeurs ont été identifiés à partir d'études in vitro de cytotoxicité vis-à-vis de cellules endothéliales ou d'hémagglutination de globules rouges de porc (B. WEIL). Ces 4 épitopes sont: - Galαl -> 3, Galβl -> 4, Glc NacExtracts from porcine endothelial cells analyzed in immunoblot in the presence of normal human sera reveal the presence of multiple bands currently identified only by their molecular weight. Various studies suggest that some if not all of these natural antibodies are directed against carbohydrate epitopes and, currently, 4 major epitopes have been identified from in vitro studies of cytotoxicity with respect to endothelial cells or haemagglutination of pig red blood cells (B. WEIL). These 4 epitopes are: - Galαl -> 3, Galβl -> 4, Glc Nac
- Glc Nac α l->4- Glc Nac α l-> 4
- Galβl -> 3 Glc Nac- Galβl -> 3 Glc Nac
- Galβl -> Glc Nac- Galβl -> Glc Nac
Le premier épitope correspond à un sucre Gai terminal, présent dans toutes les espèces animales sauf chez les singes du Vieux Monde et chez l'homme où une αgalactosyltransférase, clonée initialement chez la souris, présente des codons stop. Dans ces espèces animales les glycoproteines sont dépourvues du galactose α 1-3 en bout de chaîne et il existe des anticorps naturels qui reconnaissent cet épitope (anticorps anti- Gai). Ces anticorps ont fait l'objet de nombreux travaux essentiellement par GALILI et collaborateurs (Galili : 1985, J. Exp. Med. 162: 573-582 ; Galili, 1987, PNAS (USA) 84: 1369-1373 ; Galili 1993. Immunol. Today 14: 480-482). Ils étaient considérés initialement comme étant exclusivement de classe IgG et représenteraient environ 1% des IgG du sérum humain normal. Tout récemment, un groupe australien (SANDRIN et collaborateurs, PNAS 1993, 90. 1 1391-95) a identifié aussi des IgM dirigées contre cet épitope. Cet épitope est représenté sur le galactose et sur le mélibiose qui représente l'immunoabsorbant de référence pour ces anticorps. Il est présent sur différentes espèces bactériennes: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Serra a marescens ...The first epitope corresponds to a terminal gay sugar, present in all animal species except in Old World monkeys and in humans where an αgalactosyltransferase, initially cloned in mice, has stop codons. In these animal species, the glycoproteins are devoid of galactose α 1-3 at the end of the chain and there are natural antibodies which recognize this epitope (anti-Gay antibodies). These antibodies have been the subject of numerous works essentially by GALILI and collaborators (Galili: 1985, J. Exp. Med. 162: 573-582; Galili, 1987, PNAS (USA) 84: 1369-1373; Galili 1993. Immunol Today 14: 480-482). They were initially considered to be exclusively of the IgG class and represent approximately 1% of the IgG of normal human serum. Very recently, an Australian group (SANDRIN et al., PNAS 1993, 90. 1 1391-95) also identified IgM directed against this epitope. This epitope is represented on the galactose and on the melibiose which represents the reference immunoabsorbent for these antibodies. It is present on different bacterial species: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Serra a marescens ...
Les recherches actuelles sont axées principalement sur la production de porcs transgéniques ayant au niveau de leurs cellules endothéliales une surexpression de la molécule CD55 (Decay accelerating factor) permettant de dissocier le complexe d'attaque membranaire du complément. Une vingtaine de porcs transgéniques pour CD55 ont été produits par le groupe de WHITE. D'autres gènes de protéines inhibitrices du complément sont en cours d'étude et représentent des candidats éventuels pour la production de porcs transgéniques : il s'agit de CD59, CD46 et CD35 (récepteurs CRI du complément).Current research is mainly focused on the production of transgenic pigs with an overexpression of the CD55 (Decay accelerating factor) molecule in their endothelial cells, making it possible to dissociate the membrane attack complex from the complement. About twenty transgenic pigs for CD55 have been produced by the WHITE group. Other complement inhibitor protein genes are under study and represent potential candidates for the production of transgenic pigs: these are CD59, CD46 and CD35 (complement IRC receptors).
On peut aussi envisager la production de porcs transgéniques exprimant des protéases parasitaires d'activité anticomplémentaire. Toutes ces méthodes se heurtent à plusieurs difficultés théoriques et pratiques : d'une part la production de porcs transgéniques est actuellement techniquement très difficile en l'absence de lignées de cellules totipotentes, d'autre part la protection vis-à-vis du complexe d'attaque membranaire n'empêche pas la libération de médiateurs très fortement inflammatoires tels que C5a. Il y a donc peu de chances que la protection vis-à-vis de l'action du complément soit suffisante pour résoudre le problème.It is also possible to envisage the production of transgenic pigs expressing parasitic proteases of anticomplementary activity. All these methods come up against several theoretical and practical difficulties: on the one hand the production of transgenic pigs is currently technically very difficult in the absence of totipotent cell lines, on the other hand protection against the membrane attack complex does not prevent the release of very mediators strongly inflammatory such as C5a. It is therefore unlikely that protection from the action of the complement is sufficient to solve the problem.
Les autres perspectives thérapeutiques envisageables sont délétion par recombinaison homologue du gène de l'a 1-3 glycosyl-transférase chez le porc ainsi que celle d'autres enzymes de glycosylation au fur et à mesure de l'identification des épitopes cibles des anticorps naturels.The other possible therapeutic perspectives are deletion by homologous recombination of the gene for a 1-3 glycosyl transferase in pigs as well as that of other glycosylation enzymes as the target epitopes of natural antibodies are identified.
Aucune de ces voies de recherche n'a pour le moment donné de résultats entièrement satisfaisants.None of these lines of research have so far produced entirely satisfactory results.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'un composé comportant au moins une partie de la structure glycanique de la membrane d'une bactérie gram négatif pour la réalisation d'un produit permettant le blocage et/ou l'élimination des anticorps anti-Gai chez l'homme.This is why the subject of the present invention is the use of a compound comprising at least part of the glycan structure of the membrane of a gram negative bacterium for the production of a product allowing blocking and / or elimination of anti-Gay antibodies in humans.
Les souches bactériennes, notamment les bactéries gram négatif, produisent dans leur membrane des molécules glycaniques de structure extrêmement variée et dont la spécificité antigènique stricte est déjà mise à profit pour le sérotypage et dans certains cas pour la vaccination.Bacterial strains, especially gram negative bacteria, produce in their membrane glycan molecules of extremely varied structure and whose strict antigen specificity is already used for serotyping and in some cases for vaccination.
Les molécules glycaniques d'origine bactérienne ou fongiques, ou leur dérivés d'hémisynthèse peuvent être utilisées pour l'épuration des anticorps préformés.The glycan molecules of bacterial or fungal origin, or their hemisynthesis derivatives can be used for the purification of preformed antibodies.
De manière avantageuse la structure glycanique provient de la membrane d'une bactérie du genre Klebsiella, en particulier de l'espèce Klebsiella pneumoniae.Advantageously, the glycan structure comes from the membrane of a bacterium of the genus Klebsiella, in particular of the species Klebsiella pneumoniae.
Une bactérie particulièrement adaptée à la mise en oeuvre de l'invention est la souche non capsulée de Klebsiella pneumoniae, déposée sous le n° IPI 145 à la collection nationale de l'Institut Pasteur. Le produit selon l'invention comporte au moins une partie présentant l'une des structures suivantes :A bacterium particularly suited to the implementation of the invention is the non-encapsulated strain of Klebsiella pneumoniae, deposited under the number IPI 145 in the national collection of the Institut Pasteur. The product according to the invention comprises at least one part having one of the following structures:
1) - (α Galp -> β Galf -) - 3 1,3 11) - (α Gal p -> β Galf -) - 3 1.3 1
2) - (α Galp -> β Galp -) - 3 1,3 12) - (α Gal p -> β Gal p -) - 3 1.3 1
Les structures glycaniques sont isolées à partir de membranes de bactéries gram négatif dans une forme soluble et détoxifiée. Le procédé doit être adapté en fonction de la masse moléculaire et des caractéristiques du glycane considéré.The glycan structures are isolated from membranes of gram negative bacteria in a soluble and detoxified form. The process must be adapted according to the molecular mass and the characteristics of the glycan considered.
Il peut notamment être préparé à partir de la chaîne galactosidique (notée GC-APG) provenant de l'Acyl Poly(l,3) galactoside (noté APG) de K. pneumoniae ; il s'agit d'une chaîne polysaccharidique détoxifiée du LPS de la souche de K. pneumoniae.It can in particular be prepared from the galactoside chain (denoted GC-APG) originating from Acyl Poly (1,3) galactoside (denoted APG) from K. pneumoniae; it is a polysaccharide chain detoxified from the LPS of the K. pneumoniae strain.
Elle est constituée d'une chaîne linéaire de résidus galactose assemblés exclusivement en position(l ,3) et qui présente la structure suivante :It consists of a linear chain of galactose residues assembled exclusively in position (1, 3) and which has the following structure:
Core- DOCore- DO
Figure imgf000008_0001
m étant compris entre 20 et 30, et n étant compris entre 40 et 60.
Figure imgf000008_0001
m being between 20 and 30, and n being between 40 and 60.
A l'extrémité de la chaîne polygalactosidique se trouve une séquence heptose-acide cétodéoxyoctulosonique.At the end of the polygalactoside chain is a heptose-ketodeoxyoctulosonic acid sequence.
La masse moléculaire de l'APG est de l'ordre de 34 Kda.The molecular mass of APG is around 34 Kda.
Le composé selon l'invention peut notamment être obtenu à partir d'une suspension de membranes de bactéries gram négatif par un procédé qui comporte les étapes suivantes : a) délipidation, b) hydrolyse alcaline, c) chromatographie d'exclusion, d) récupération des chaînes glycaniques détoxifiées et purifiées présentant un poids moléculaire compris entre environ 20 Kda et 35 Kda.The compound according to the invention can in particular be obtained from a suspension of membranes of gram negative bacteria by a process which comprises the following stages: a) delipidation, b) alkaline hydrolysis, c) exclusion chromatography, d) recovery of the detoxified and purified glycan chains having a molecular weight of between approximately 20 Kda and 35 Kda.
Les paramètres de l'étape de chromatographie d'exclusion seront adaptés en fonction des caractéristiques du produit que l'on souhaite récupérer. Dans le cas de l'APG, cette étape peut ainsi être effectuée par tamisage moléculaire sur Sephacryl® S 300 HR, à température ambiante.The parameters of the exclusion chromatography step will be adapted according to the characteristics of the product which it is desired to recover. In the case of APG, this step can thus be carried out by molecular sieving on Sephacryl® S 300 HR, at room temperature.
Dans un des modes préférés de réalisation de l'invention le procédé de production du GC-APG est effectué de la façon suivante. A partir d'une biomasse de Klebsiella pneumoniae stockée à - 20° C, après décongélation on effectue un broyage par homogénéisation à haute pression et élimination des débris par centrifugation. Le produit obtenu est soumis à une précipitation acide à température ambiante puis à une dialyse avec un coefficient de coupure à 10 000. Après hydrolyse alcaline et protéolyse enzymatique, on précipite par l'alcool une fraction qui est récupérée par centrifugation puis délipidée. On réalise ensuite une nouvelle hydrolyse alcaline puis une dialyse pour récupérer le dialysat qui contient l'extrait conservé à - 20° C.In one of the preferred embodiments of the invention, the process for producing the GC-APG is carried out as follows. From a biomass of Klebsiella pneumoniae stored at −20 ° C., after thawing, grinding is carried out by high pressure homogenization and removal of the debris by centrifugation. The product obtained is subjected to acid precipitation at room temperature and then to dialysis with a cutoff coefficient of 10,000. After alkaline hydrolysis and enzymatic proteolysis, a fraction is precipitated with alcohol which is recovered by centrifugation and then delipidated. A further alkaline hydrolysis is then carried out, followed by dialysis to recover the dialysate which contains the extract stored at -20 ° C.
Cet extrait est ensuite purifié par clarification puis filtration suivie d'une chromatographie par tamisage moléculaire. Le produit est ensuite soumis à une hydrolyse acide et à une centrifugation puis à des étapes de purification par dialyse et filtration sur 0,22 μm. Il est ensuite lyophilisé afin d'être conservé sous une forme stérile et apyrogène adaptée à la perfusion par voie intra-veineuse. Selon la nature des anticorps préformés à éliminer, il peut être souhaitable de moduler la spécificité antigénique et l'immunoaffinité du composé servant à la préparation du produit selon l'invention.This extract is then purified by clarification then filtration followed by molecular sieving chromatography. The product is then subjected to acid hydrolysis and to centrifugation then to purification steps by dialysis and filtration through 0.22 μm. It is then lyophilized in order to be stored in a sterile and pyrogen-free form suitable for intravenous infusion. Depending on the nature of the preformed antibodies to be eliminated, it may be desirable to modulate the antigenic specificity and the immunoaffinity of the compound used for the preparation of the product according to the invention.
On peut alors mettre en oeuvre des moyens permettant d'obtenir différentes configurations de structure, notamment du GC-APG. La molécule de GC-APG fait apparaître deux unités digalactosidiques dans la même chaîne.Means can then be used to obtain different structural configurations, in particular GC-APG. The GC-APG molecule shows two digalactoside units in the same chain.
L'unité formée de (α Gal p - β Gal ) n se trouvant située à l'extrémité du GC-APG et donc préférentiellement exposée aux anticorps reconnaissant cette séquence. La susceptibilité particulière du résidu β Galf à des conditions d'hydrolyse contrôlée permet d'éliminer sélectivement cette séquence. La séquence obtenue devient alors :The unit formed by (α Gal p - β Gal) n being located at the end of the GC-APG and therefore preferentially exposed to antibodies recognizing this sequence. The particular susceptibility of the β Gal f residue to controlled hydrolysis conditions makes it possible to selectively eliminate this sequence. The sequence obtained then becomes:
- ( - α Galp --> β Galp - ) - Core-KDO 3 1,3 1 m- (- α Gal p -> β Gal p -) - Core-KDO 3 1.3 1 m
avec m compris entre 20 et 30 dont la masse moléculaire apparente est voisine de : (PM = 20-25000 D)with m between 20 and 30 whose apparent molecular mass is close to: (PM = 20-25000 D)
Un tel composé peut être obtenu en effectuant une hydrolyse ménagée par un acide faible à une molarité comprise entre 0,05 et 0,2 M. Les conditions d'hydrolyse nécessaires à l'élimination sélective du motif (α Galp --> β Galf) sont les suivantes : acide Tri Fluoro Acétique 0, 1 M, 30 minutes à 100° C.Such a compound can be obtained by carrying out a controlled hydrolysis with a weak acid at a molarity of between 0.05 and 0.2 M. The hydrolysis conditions necessary for the selective elimination of the motif (α Gal p -> β Gal f ) are as follows: Tri Fluoro Acetic acid 0, 1 M, 30 minutes at 100 ° C.
Il est également possible d'obtenir la séquence inverse suivante :It is also possible to obtain the following reverse sequence:
- ( - α Galp -> β Galf - ) - - Core-KDO 3 1,3 1 n- (- α Gal p -> β Galf -) - - Core-KDO 3 1.3 1 n
avec n compris entre 40 et 60 dont la masse moléculaire apparente est voisine de : (PM = 20-25.000 D)with n between 40 and 60 whose apparent molecular mass is close to: (PM = 20-25,000 D)
En effet, cette voie de biosynthèse existe directement dans la bactérie K. pneumoniae IP-I-145 conduisant à une séquence homogène, exempte du motif (α Galp -> β Galp).Indeed, this biosynthetic pathway exists directly in the bacterium K. pneumoniae IP-I-145 leading to a homogeneous sequence, free of the motif (α Gal p -> β Gal p ).
Cette forme structurale peut être isolée directement du GC-APG brut par chromatographie d'exclusion sur Sephadex G75.This structural form can be isolated directly from the crude GC-APG by exclusion chromatography on Sephadex G75.
La plupart des sérums humains normaux contiennent des anticorps dirigés contre une préparation obtenue selon l'invention à partir de Klebsiella pneumoniae et possédant une chaîne polygalactose. Les Demandeurs ont recherché si ces anticorps étaient spécifiques de l'épitope Galα( l-3)Gal, qui est exprimé sur la plupart des cellules d'animaux. Par absorptions différentielles sur mélibiose et BSA-trinitrophénylée, on a pu montrer que ces anticorps naturels humains, comme les anticorps immuns de lapin, reconnaissant la préparation selon l'invention, sont spécifiques de l'épitope Galα(l-3)Gal de GC-APG. L'absence de réaction croisée entre ces anticorps et les anticorps naturels anti-TNP indique que les anticorps dirigés contre les composés selon l'invention n'appartiennent pas à la population des anticorps naturels polyréactifs. Lors de l'hyperimmunisation de lapins par PGM Kp, les anticorps dirigés contre les préparations selon l'invention sont tous dirigés contre l'épitope Gala (1-3) Gai, pourtant exprimé par toutes les cellules de lapin, ce qui indique une rupture de tolérance consécutive à l'immunisation avec de l'adjuvant complet de Freund. Les IgM anti-Galα(l-3)Gal représentent 80% des anticorps impliqués dans le rejet des xénogreffes de porc et sont responsables de l'hémagglutination des hématies de porc (Sandrin et al., 1993 ). L'inhibition d'hémagglutination observée avec le mélibiose confirme ces données. Le prétraitement du sérum humain normal par une préparation de GC-APG selon l'invention inhibe en totalité ses propriétés agglutinantes confirmant l'interaction des anticorps avec l'épitope Galα( l-3)Gal déjà démontrée par ELISA et montrant en outre l'intérêt de cette interaction au niveau cellulaire. La plus grande capacité des préparations d'APG selon l'invention à inhiber l'hémagglutination s'explique par l'existence d'épitopes répétifs favorable à la capture d'IgM polyvalentes.Most normal human sera contain antibodies directed against a preparation obtained according to the invention from Klebsiella pneumoniae and having a polygalactose chain. The Applicants have investigated whether these antibodies are specific for the Galα (1-3) Gal epitope, which is expressed on most animal cells. By differential absorption on melibiosis and BSA-trinitrophenylated, it has been possible to show that these natural human antibodies, such as rabbit immune antibodies, recognizing the preparation according to the invention, are specific of the Galα (1-3) Gal epitope of GC-APG. The absence of cross-reaction between these antibodies and natural anti-NPT antibodies indicates that the antibodies directed against the compounds according to the invention do not belong to the population of natural polyreactive antibodies. During hyperimmunization of rabbits with PGM Kp, the antibodies directed against the preparations according to the invention are all directed against the Gala (1-3) Gai epitope, yet expressed by all the rabbit cells, which indicates a rupture of tolerance following immunization with complete Freund's adjuvant. Anti-Galα (1-3) Gal IgM represents 80% of the antibodies involved in the rejection of pig xenografts and are responsible for the haemagglutination of pig red blood cells (Sandrin et al., 1993). The hemagglutination inhibition observed with melibiosis confirms these data. The pretreatment of normal human serum with a GC-APG preparation according to the invention completely inhibits its agglutinating properties confirming the interaction of the antibodies with the Galα (1-3) Gal epitope already demonstrated by ELISA and further showing the value of this interaction at the cellular level. The greater capacity of the APG preparations according to the invention to inhibit hemagglutination is explained by the existence of repetitive epitopes favorable to the capture of polyvalent IgM.
Les glycanes d'origine bactérienne neutralisent in vivo les anticorps naturels anti-Gai chez l'homme. Ces glycanes peuvent simultanément induire de façon spécifique une tolérance in vivo par une paralysie immunitaire, les polysaccharides n'étant pas métabolisés rapidement dans l'organisme.Glycans of bacterial origin in vivo neutralize natural anti-Gai antibodies in humans. These glycans can simultaneously specifically induce tolerance in vivo by immune paralysis, since polysaccharides are not rapidly metabolized in the body.
Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, la structure glycanique est solidaire d'un élément support.According to an advantageous embodiment of the invention, the glycan structure is integral with a support element.
De préférence, l'élément support peut être prélevé au cours d'un circuit extracorporel. Ces molécules peuvent être couplées à un immunoabsorbant sous forme de membrane et utilisées dans un circuit extracorporel d'hémofiltration.Preferably, the support element can be removed during an extracorporeal circuit. These molecules can be coupled to an immunoabsorbent in the form of a membrane and used in an extracorporeal hemofiltration circuit.
APG ou GC-APG sont couplés à une membrane biocompatible suivant des méthodes dépendant de la nature de la membrane utilisée. Si la membrane biocompatible contient des groupements aminés, il est possible de coupler le GC-APG par la carbodiimide ou par déamination réductive. Le composé glycanique est alors solidaire d'une partie fixe d'un circuit extracorporel.APG or GC-APG are coupled to a biocompatible membrane according to methods depending on the nature of the membrane used. If the biocompatible membrane contains amino groups, it is possible to couple the GC-APG by carbodiimide or by reductive deamination. The glycanic compound is then secured to a fixed part of an extracorporeal circuit.
Selon un autre aspect, le support est une structure moléculaire qui peut être bloquée sur une colonne adaptée ou un support solide qui peut être bloqué par des moyens physiques.According to another aspect, the support is a molecular structure which can be blocked on a suitable column or a solid support which can be blocked by physical means.
Les molécules glycaniques ou leurs dérivés d'hémi-synthèse peuvent être utilisés par voie systémique, notamment par voie intra¬ veineuse, pour neutraliser les anticorps préformés et induire simultanément une tolérance. La structure glycanique, de faible poids moléculaire, peut notamment être couplée à un support permettant la polymérisation, en particulier la trimérisation ou la tétramérisation pour injection intraveineuse.The glycan molecules or their hemi-synthesis derivatives can be used systemically, in particular intravenously, to neutralize the preformed antibodies and simultaneously induce tolerance. The glycan structure, of low molecular weight, can in particular be coupled to a support allowing polymerization, in particular trimerization or tetramerization for intravenous injection.
L'invention comprend également des composi tions pharmaceutiques contenant un composé glycanique tel que décrit précédemment et des excipients pharmaceutiquement acceptables.The invention also includes pharmaceutical compositions containing a glycanic compound as described above and pharmaceutically acceptable excipients.
Dans les exemples qui suivent on se référera aux figures en annexe.In the examples which follow, reference is made to the appended figures.
Figure 1 : Spécificité des anticorps anti-JOOIX du sérum humain normal pour GC-APG. Le pool de 10 plasmas humains normaux (pool 10) est dilué au 1/20 en NaCl 0.15M et incubé 2 heures à 37° C sur agitateur en présence de concentrations croissantes de J001X ou de GC-APG dans le même solvant. Les anticorps restés libres sont détectés par ELISA sur J001X (10 μg/ml) en fond de plaque selon la procédure J001X anticorps. Gauche : IgG anti-JOOIX révélées par un anticorps polyclonal de chèvre anti-chaîne γ humaine. Droite : IgM anti-JOOIX révélées par un anticorps polyclonal de chèvre anti-chaîne μ humaine.Figure 1: Specificity of anti-JOOIX antibodies in normal human serum for GC-APG. The pool of 10 normal human plasmas (pool 10) is diluted 1/20 in 0.15M NaCl and incubated for 2 hours at 37 ° C on a shaker in the presence of increasing concentrations of J001X or GC-APG in the same solvent. The antibodies remaining free are detected by ELISA on J001X (10 μg / ml) at the bottom of the plate according to the J001X antibody procedure. Left: anti-JOOIX IgG revealed by a goat anti-human γ-chain polyclonal antibody. Right: anti-JOOIX IgM revealed by a polyclonal goat anti-human μ chain antibody.
Figure 2 : Spécificité des anticorps anti-JOOIX du sérum de lapin hyperimmun pour GC-APG. Le sérum d'un lapin immunisé par PGM Kp est dilué au 1/100000 puis traité par J001X ou GC-APG comme décrit pour la figure 1. Les IgG anti-JOOIX restées libres sont révélés par ELISA grâce à l'utilisation d'un anticorps polyclonal de chèvre anti-chaîne γ de lapin.Figure 2: Specificity of anti-JOOIX antibodies in hyperimmune rabbit serum for GC-APG. The serum of a rabbit immunized with PGM Kp is diluted to 1/100000 then treated with J001X or GC-APG as described for FIG. 1. The anti-JOOIX IgGs remaining free are revealed by ELISA thanks to the use of a polyclonal goat anti-rabbit γ-chain antibody.
Figure 3 : Reconnaissance de l'épitope Galα( l-3)Gal par les anticorps anti-JOOIX du sérum humain normal. Le pool 10 est traité comme indiqué pour la figure 1 par des doses croissantes A. de mélibiose (reconnu par les anticorps anti-Galα( l-3)Gal) ou B. de glucose comme contrôle négatif. Figure 4 : Spécificité des IgG du sérum hyperimmun de lapin pour l'épitope Galα(l-3)Gal. Le sérum d'un lapin immunisé par PGM Kp est traité comme indiqué dans la figure 2 par des doses croissantes A. de mélibiose ou B. de glucose comme contrôle négatif. Figure 5 : Non appartenance des IgG anti-JOOIX ou anti-mélibiose du sérum humain normal au groupe des anticorps polyréactifs. Un plasma humain normal est traité comme indiqué dans la figure 1 par des doses croissantes A. de J001X, B. de mélibiose ou C. de TNP-BSA et immobilisé en fond de plaque. Elles sont détectées au moyen d'un anticorps polyclonal de chèvre anti-IgG humaines.Figure 3: Recognition of the Galα (1-3) Gal epitope by anti-JOOIX antibodies in normal human serum. Pool 10 is treated as indicated for FIG. 1 by increasing doses of A. melibiose (recognized by anti-Galα (1-3) Gal antibodies) or B. of glucose as negative control. Figure 4: Specificity of IgG of hyperimmune rabbit serum for the Galα (1-3) Gal epitope. The serum of a rabbit immunized with PGM Kp is treated as indicated in FIG. 2 with increasing doses of A. melibiosis or B. of glucose as negative control. Figure 5: Non-belonging of anti-JOOIX or anti-melibiose IgG of normal human serum to the group of polyreactive antibodies. Normal human plasma is treated as indicated in FIG. 1 with increasing doses of A. J001X, B. of melibiosis or C. of TNP-BSA and immobilized at the bottom of the plate. They are detected using a polyclonal goat anti-human IgG antibody.
Figure 6 : Les anticorps anti-JOOIX ne reconnaissent pas le TNP- BSA. Le pool 10 est traité par des concentrations croissantes de TNP-BSA et les anticorps anti-JOOIX sont détectés comme indiqué dans la figure 1.Figure 6: Anti-JOOIX antibodies do not recognize TNP-BSA. Pool 10 is treated with increasing concentrations of TNP-BSA and anti-JOOIX antibodies are detected as indicated in FIG. 1.
Figure 7 : Structure du mélibiose (6-α-D-gaIactopyranosyl-D- glucopyranose) et des deux chaînes polyGal représentées dans GC-APG (d'après Kol et al., 1992).Figure 7: Structure of melibiose (6-α-D-gaIactopyranosyl-D-glucopyranose) and the two polyGal chains represented in GC-APG (after Kol et al., 1992).
Exemple 1: Préparation du GC-APG, après délipidation de l'APGExample 1: Preparation of the GC-APG, after delipidation of the APG
1. Obtention du Lysat bactérien clarifié1. Obtaining the clarified bacterial lysate
La biomasse de Klebsiella pneumoniae est obtenue par culture en fermenteur, en milieu liquide, dans des conditions classiques. La seule contrainte spécifique étant le blocage de la croissance en fin de phase exponentielle par un brusque refroidissement à 4°C pour préserver les structures biologiques.The biomass of Klebsiella pneumoniae is obtained by culture in a fermenter, in a liquid medium, under conventional conditions. The only specific constraint being the blocking of growth at the end of the exponential phase by abrupt cooling to 4 ° C to preserve the biological structures.
La biomasse est séparée du milieu de culture par centrifugation continue à basse température et lavée par centrifugation. Le concentrât cellulaire est stocké au congélateur en attendant d'être traité. Le concentrât est décongelé dans un réacteur et mis en suspension dans du tampon trisHCl (lOmM) pH 7,0, contenant MgCl2 (10mM)et NaCl (150mM) à 4°C pour avoir une concentration finale équivalente à 50 g de cellules sèches par litre de suspension. La production de lots industriels met en oeuvre l'équivalent de 1 à 3 Kg de cellules sèches par opération. On ajoute ensuite 5 mg de DN ase par litre de suspension. Les cellules microbiennes sont alors désintégrées par passage en continu sur des broyeurs industriels de type APV, Manton Gaulin. Le Lysat bactérien ainsi obtenu, est soumis à une première clarification continue à 15 000 x g sur un séparateur sharples à 4°C pour éliminer les cellules non broyées et les résidus de broyage. Le culot de centrifugation est éliminé et le surnageant recueilli, il constitue le lysat clarifié.The biomass is separated from the culture medium by continuous centrifugation at low temperature and washed by centrifugation. The cell concentrate is stored in the freezer while waiting to be processed. The concentrate is thawed in a reactor and suspended in trisHCl buffer (10 mM) pH 7.0, containing MgCl 2 (10 mM) and NaCl (150 mM) at 4 ° C to have a final concentration equivalent to 50 g of dry cells per liter of suspension. The production of industrial batches uses the equivalent of 1 to 3 Kg of dry cells per operation. 5 mg of ase DN are then added per liter of suspension. The microbial cells are then disintegrated by continuous passage on industrial mills of the APV type, Manton Gaulin. The bacterial lysate thus obtained is subjected to a first continuous clarification at 15,000 xg on a sharples separator at 4 ° C to remove the unmilled cells and the grinding residues. The centrifugation pellet is eliminated and the supernatant collected, it constitutes the clarified lysate.
2. Isolement de la fraction membranaire2. Isolation of the membrane fraction
Le lysat bactérien clarifié est acidifié à pH 4,2 ± 0,1 par l'acide acétique concentré puis laissé au repos pendant 30 minutes à 4°C. Le précipité d'impuretés est éliminé par centrifugation continue à 15 000 x g par séparateur Sharples. Le surnageant opalescent contenant la fraction membranaire est neutralisé par NaOH puis dialyse par ultrafiltration à volume constant contre de l'eau distillée sur une membrane coupant à 10 000 Daltons. Lorsque la résistivité atteint 500 Ω cπr1, le volume est concentré pour atteindre 20 1 par Kg d'équivalent en cellules sèches de départ.The clarified bacterial lysate is acidified to pH 4.2 ± 0.1 with concentrated acetic acid and then left to stand for 30 minutes at 4 ° C. The impurity precipitate is removed by continuous centrifugation at 15,000 xg using a Sharples separator. The opalescent supernatant containing the membrane fraction is neutralized with NaOH and then dialyzed by ultrafiltration at constant volume against distilled water on a membrane cutting at 10,000 Daltons. When the resistivity reaches 500 Ω cπr 1 , the volume is concentrated to reach 20 1 per Kg of equivalent in dry starting cells.
La suspension membranaire ainsi obtenue sera immédiatement utilisée pour la préparation de GC-APG.The membrane suspension thus obtained will be immediately used for the preparation of GC-APG.
3. Préparation de l'APG3. Preparation of the APG
a) Hydrolyse alcalinea) Alkaline hydrolysis
Elle est destinée à solubiliser les membranes pour permettre l'isolement de l'APG brut.It is intended to dissolve the membranes to allow the isolation of the crude APG.
A la suspension membranaire obtenue précédemment, on ajoute sous agitation de l'hydroxyde de sodium concentré pour avoir une molarité finale de 0,5 M. La solution est ensuite portée à 56°C et maintenue sous agitation pendant une heure à cette température. Après un refroidissement rapide à température ambiante, la solution est neutralisée à pH 7,0 par l'acide chlorydrique dilué. b) Digestion enzymatiqueTo the membrane suspension obtained above, concentrated sodium hydroxide is added with stirring to have a final molarity of 0.5 M. The solution is then brought to 56 ° C. and kept stirring for one hour at this temperature. After rapid cooling to room temperature, the solution is neutralized to pH 7.0 with dilute hydrochloric acid. b) Enzymatic digestion
Elle est destinée à éliminer les impuretés protéiques et à digérer les résidus de peptidoglycane membranaire pouvant subsister après l'hydrolyse alcaline.It is intended to eliminate protein impurities and to digest residues of membrane peptidoglycan which may remain after alkaline hydrolysis.
A la solution neutralisée, on ajoute du tampon tris lOmM et de l'EDTA qsp ImM, puis le pH est ajusté à 7,5. On ajoute alors 5 000 unités de protéinase K par kg de cellules sèches et 160.106 unités de lysozyme par kg de cellules sèches et le mélange est ensuite maintenu sous agitation pendant deux heures à 37°C.To the neutralized solution, 10 mM tris buffer and EDTA qsp ImM are added, then the pH is adjusted to 7.5. 5,000 units of proteinase K per kg of dry cells and 160 × 10 6 units of lysozyme per kg of dry cells are then added and the mixture is then stirred for two hours at 37 ° C.
c) Précipitation éthanolc) Ethanol precipitation
L'APG est isolé du digestat obtenu précédemment par précipitation avec 2 volumes d'alcool éthylique préalablement refroidi à -20°C. Après un repos de 30 minutes à + 4°C, le précipité d'APG est recueilli par centrifugation continue à 15 000 x g sur séparateur Sharples.The APG is isolated from the digestate previously obtained by precipitation with 2 volumes of ethyl alcohol previously cooled to -20 ° C. After standing for 30 minutes at + 4 ° C., the APG precipitate is collected by continuous centrifugation at 15,000 × g on a Sharples separator.
d) Délipidation et deuxième hydrolyse alcalined) Delipidation and second alkaline hydrolysis
Le culot est délipidé à l'aide de 3 litres de mélange chloroforme/méthanol (3/1 ) par kg de cellules sèches, après dispersion auThe pellet is defatted using 3 liters of chloroform / methanol mixture (3/1) per kg of dry cells, after dispersion with
Turrax.Turrax.
Le résidu est repris par 3 litres d'eau osmosée par kg de cellules sèches et dispersé au Turrax.The residue is taken up in 3 liters of osmosis water per kg of dry cells and dispersed with Turrax.
Après agitation une nuit à +4°C, la solution est clarifiée par ultracentrifugation à 30 000 g, 1 h à 4°C.After stirring overnight at + 4 ° C, the solution is clarified by ultracentrifugation at 30,000 g, 1 h at 4 ° C.
Le surnageant est soumis à une hydrolyse alcaline (0,5 N NaOH, lh,The supernatant is subjected to alkaline hydrolysis (0.5 N NaOH, 1 h,
56°C) puis neutralisé à l'aide d'HCl. La solution est dialysée par ultrafiltration à volume constant sur membrane coupant à 10 000 Da jusqu'à 2500 Ω cm-1 et concentrée à 4 litres par kg de cellules sèches.56 ° C) then neutralized with HCl. The solution is dialyzed by ultrafiltration at constant volume on a membrane cutting at 10,000 Da up to 2,500 Ω cm- 1 and concentrated to 4 liters per kg of dry cells.
Après ajustement du pH à 7,2, la solution est stockée à -20°C en attente de lyophilisation. e) Lyophilisation de l'APGAfter adjusting the pH to 7.2, the solution is stored at -20 ° C pending lyophilization. e) Lyophilization of the APG
La solution contenant l'APG est décongelée 24 heures à température ambiante. Après clarification par ultracentrifugation 30 000 g à 4°C pendant 1 heure, le surnageant est filtré stérilement sur filtre 0,22 μm et lyophilisé. Le rendement moyen en APG est voisin de 25 g par kg de cellules sèches.The solution containing APG is thawed for 24 hours at room temperature. After clarification by ultracentrifugation 30,000 g at 4 ° C for 1 hour, the supernatant is sterile filtered through a 0.22 μm filter and lyophilized. The average APG yield is close to 25 g per kg of dry cells.
f) Hydrolyse acidef) Acid hydrolysis
Elle est destinée à cliver le pôle lipophile de l'APG pour libérer la chaîne polysaccharidique constituant le GC-APG.It is intended to cleave the lipophilic pole of the APG to release the polysaccharide chain constituting the GC-APG.
25 g d'APG lyophilisé sont dispersés dans 5 1 d'une solution à 1 % d'acide acétique. La solution est ensuite portée rapidement à une température de25 g of lyophilized APG are dispersed in 5 l of a 1% solution of acetic acid. The solution is then quickly brought to a temperature of
100°C et maintenue sous agitation pendant une heure à cette température.100 ° C and kept stirring for one hour at this temperature.
Après refroidissement à température ambiante, la fraction lipidique hydrolysée de l'APG précipite. Elle est séparée par centrifugation à 10 000 x g pendant 20 minutes à + 4°C. Le surnageant contenant le GC-APG est recueilli puis neutralisé à pH 7,0 par de l'hydroxyde de sodium. Le rendement moyen en GC-APG à cette étape est voisin de 90%.After cooling to room temperature, the hydrolyzed lipid fraction of the APG precipitates. It is separated by centrifugation at 10,000 x g for 20 minutes at + 4 ° C. The supernatant containing the GC-APG is collected and then neutralized to pH 7.0 with sodium hydroxide. The average yield of GC-APG at this stage is close to 90%.
g) Stérilisationg) Sterilization
La solution de GC-APG obtenue précédemment est stérilisée par filtration sur une membrane à 0,22 μm.The GC-APG solution obtained above is sterilized by filtration on a 0.22 μm membrane.
h) Lyophilisationh) Lyophilization
La solution stérile est ensuite lyophilisée stérilement. Le lyophilisât ainsi obtenu représente le GC-APG vrac. Le rendement moyen est voisin de 20 g par kg de biomasse (équivalent sec) de départ. Exemple 2 : Préparation du GC-APGThe sterile solution is then lyophilized sterile. The lyophilisate thus obtained represents the GC-APG bulk. The average yield is close to 20 g per kg of starting biomass (dry equivalent). Example 2: Preparation of the GC-APG
1. Obtention du lysat bactérien clarifié1. Obtaining the clarified bacterial lysate
La biomasse de Klebsiella pneumoniae est obtenue par culture en fermenteur, en milieu liquide, dans des conditions classiques. La seule contrainte spécifique étant le blocage de la croissance en fin de phase exponentielle par un brusque refroidissement à 4° C pour préserver les structures biologiques. La biomasse est séparée du milieu de culture par centrifugation continue à basse température et lavée par centrifugation. Le concentrât cellulaire est stocké au congélateur en attendant d'être traité.The biomass of Klebsiella pneumoniae is obtained by culture in a fermenter, in a liquid medium, under conventional conditions. The only specific constraint being the blocking of growth at the end of the exponential phase by abrupt cooling to 4 ° C to preserve the biological structures. The biomass is separated from the culture medium by continuous centrifugation at low temperature and washed by centrifugation. The cell concentrate is stored in the freezer while waiting to be processed.
Le concentrât est décongelé dans un réacteur et mis en suspension dans du tampon tris-HCl (10 mM) pH 7,0, contenant Mg Cl 2 (10 mM) et NaCl (150 mM) à 4° C pour avoir une concentration finale équivalente à 50 g de cellules sèches par litre de suspension. La production de lots industriels met en oeuvre l'équivalent de 1 à 3 kg de cellules sèches par opération. On ajoute ensuite 5 mg de DN ase par litre de suspension.The concentrate is thawed in a reactor and suspended in tris-HCl buffer (10 mM) pH 7.0, containing Mg Cl 2 (10 mM) and NaCl (150 mM) at 4 ° C to have an equivalent final concentration 50 g of dry cells per liter of suspension. The production of industrial batches uses the equivalent of 1 to 3 kg of dry cells per operation. 5 mg of ase DN are then added per liter of suspension.
Les cellules microbiennes sont alors désintégrées par passage en continu sur des broyeurs industriels de type APV, Manton Gaulin. Le lysat bactérien ainsi obtenu, est soumis à une première clarification continue à 15 000 x g sur un séparateur, Sharples à 4° C pour éliminer les cellules non broyées et les résidus de broyage. Le culot de centrifugation est éliminé et le surnageant recueilli, il constitue le lysat clarifié.The microbial cells are then disintegrated by continuous passage on industrial mills of the APV type, Manton Gaulin. The bacterial lysate thus obtained is subjected to a first continuous clarification at 15,000 x g on a separator, Sharples at 4 ° C to remove the unmilled cells and the grinding residues. The centrifugation pellet is eliminated and the supernatant collected, it constitutes the clarified lysate.
2. Isolement de la fraction membranaire2. Isolation of the membrane fraction
Le lysat bactérien clarifié est acidifié à pH 4,2 ± 0, 1 par l'acide acétique concentré puis laissé au repos pendant 30 minutes à +4° C. Le précipité d'impuretés est éliminé par centrifugation continue à 15 000 x g sur séparateur Sharples. Le surnageant opalescent contenant la fraction membranaire est neutralisé par NaOH puis dialyse par ultrafiltration à volume constant contre de l'eau distillée sur une membrane coupant à 10 000 Daltons. Lorsque la résistivité atteint 500 Ω cm-1, le volume est concentré pour atteindre 20 1 par kg d'équivalent en cellules sèches de départ. La suspension membranaire ainsi obtenue sera immédiatement utilisée pour la préparation de GC-APG.The clarified bacterial lysate is acidified to pH 4.2 ± 0.1 with concentrated acetic acid and then left to stand for 30 minutes at + 4 ° C. The impurity precipitate is removed by continuous centrifugation at 15,000 xg on a separator Sharples. The opalescent supernatant containing the membrane fraction is neutralized with NaOH and then dialyzed by ultrafiltration at constant volume against distilled water on a membrane cutting at 10,000 Daltons. When the resistivity reaches 500 Ω cm- 1 , the volume is concentrated to reach 20 1 per kg of equivalent in dry starting cells. The membrane suspension thus obtained will be immediately used for the preparation of GC-APG.
3. Préparation du GC-APG3. Preparation of the GC-APG
a) Hydrolyse alcalinea) Alkaline hydrolysis
Elle est destiné à solubiliser les membranes pour permettre l'isolement de l'APG brut. A la suspension membranaire obtenue précédemment, on ajoute sous agitation de l'hydroxyde de sodium concentré pour avoir une molarité finale de 0,5 M. La solution est ensuite portée à 56° C et maintenue sous agitation pendant une heure à cette température. Après un refroidissement rapide à température ambiante, la solution est neutralisée à pH 7,0 par l'acide chlorhydrique dilué.It is intended to dissolve the membranes to allow the isolation of the crude APG. To the membrane suspension obtained above, concentrated sodium hydroxide is added with stirring to have a final molarity of 0.5 M. The solution is then brought to 56 ° C. and kept stirring for one hour at this temperature. After rapid cooling to room temperature, the solution is neutralized to pH 7.0 with dilute hydrochloric acid.
b) Digestion enzymatiqueb) Enzymatic digestion
Elle est destinée à éliminer les impuretés protéiques et à digérer les résidus de peptidoglycane membranaire pouvant subsister après l'hydrolyse alcaline.It is intended to eliminate protein impurities and to digest residues of membrane peptidoglycan which may remain after alkaline hydrolysis.
A la solution neutralisée, on ajoute du tampon tris 10 mM et de l'EDTA qsp 1 mM puis le pH est ajusté à 7,5. On ajoute alors 5 000 unités de protéinases K et 160.106 unités de lysozyme par kg de cellules sèches et le mélange est ensuite maintenu sous agitation pendant deux heures à 37° C.To the neutralized solution, 10 mM tris buffer and EDTA qs 1 mM are added, then the pH is adjusted to 7.5. 5,000 units of proteinase K and 160 × 10 6 units of lysozyme per kg of dry cells are then added and the mixture is then stirred for two hours at 37 ° C.
c) Isolement de l'APGc) Isolation of the APG
L'APG est isolé du digestat obtenu précédemment par précipitation avec 2 volumes d'alcool éthylique préalablement refroidi à -20° C. Après un repos de 30 minutes à +4° C, le précipité d'APG est recueilli par centrifugation continue à 15 000 x g sur séparateur Sharples. A cette étape, le rendement moyen en APG est voisin de 25 g par kg d'équivalent sec en biomasse de départ.The APG is isolated from the digestate previously obtained by precipitation with 2 volumes of ethyl alcohol previously cooled to -20 ° C. After standing for 30 minutes at + 4 ° C., the APG precipitate is collected by continuous centrifugation at 15 000 xg on Sharples separator. At this stage, the average yield of APG is close to 25 g per kg of dry equivalent in starting biomass.
d) Hydrolyse acided) Acid hydrolysis
Elle est destinée à cliver le pôle lipophile de l'APG pour libérer la chaîne polysaccharidique constituant le GC-APG.It is intended to cleave the lipophilic pole of the APG to release the polysaccharide chain constituting the GC-APG.
Le culot de précipité alcoolique obtenu précédemment est dispersé dans 5 1 d'une solution à 1 % d'acide acétique par kg d'équivalent sec de biomasse de départ.The pellet of alcoholic precipitate obtained previously is dispersed in 5 l of a 1% solution of acetic acid per kg of dry equivalent of starting biomass.
La solution est ensuite portée rapidement à une température de 100°The solution is then quickly brought to a temperature of 100 °.
C et maintenue sous agitation pendant une heure à cette température.C and kept stirring for one hour at this temperature.
Après refroidissement à température ambiante, la fraction lipidique hydrolysée de l'APG précipite. Elle est séparée par centrifugation à 10 000 x g pendant 20 minutes à +4° C.After cooling to room temperature, the hydrolyzed lipid fraction of the APG precipitates. It is separated by centrifugation at 10,000 x g for 20 minutes at + 4 ° C.
Le surnageant contenant le GC-APG est recueilli puis neutralisé à pH 7,0 par de l'hydroxyde de sodium. Le rendement moyen en GC-APG à cette étape est voisin de 90%.The supernatant containing the GC-APG is collected and then neutralized to pH 7.0 with sodium hydroxide. The average yield of GC-APG at this stage is close to 90%.
f) Stérilisationf) Sterilization
La solution de GC-APG obtenue précédemment est stérilisée par filtration sur une membrane à 0,22 μm.The GC-APG solution obtained above is sterilized by filtration on a 0.22 μm membrane.
g) Lyophilisationg) Lyophilization
La solution stérile est ensuite lyophilisée stérilement. Le lyophilisât ainsi obtenu représente le GC-APG vrac. Le rendement moyen est voisin de 20 g par kg de biomasse (équivalent sec) de départ. Exemple 3: Préparation du J001X (APG délipidé)The sterile solution is then lyophilized sterile. The lyophilisate thus obtained represents the GC-APG bulk. The average yield is close to 20 g per kg of starting biomass (dry equivalent). Example 3: Preparation of J001X (defatted APG)
1. Obtention du Lysat bactérien clarifié1. Obtaining the clarified bacterial lysate
La biomasse de Klebsiella pneumoniae est obtenue par culture en fermenteur, en milieu liquide, dans des conditions classiques. La seule contrainte spécifique étant le blocage de la croissance en fin de phase exponentielle par un brusque refroidissement à 4°C pour préserver les structures biologiques. La biomasse est séparée du milieu de culture par centrifugation continue à basse température et lavée par centrifugation. Le concentrât cellulaire est stocké au congélateur en attendant d'être traité.The biomass of Klebsiella pneumoniae is obtained by culture in a fermenter, in a liquid medium, under conventional conditions. The only specific constraint being the blocking of growth at the end of the exponential phase by abrupt cooling to 4 ° C to preserve the biological structures. The biomass is separated from the culture medium by continuous centrifugation at low temperature and washed by centrifugation. The cell concentrate is stored in the freezer while waiting to be processed.
Le concentrât est décongelé dans un réacteur et mis en suspension dans du tampon tris-HCl (lOmM) pH 7,0, contenant MgCl (10mM)et NaCl ( 150mM) à 4°C pour avoir une concentration finale équivalente à 50 g de cellules sèches par litre de suspension. La production de lots industriels met en oeuvre l'équivalent de 1 à 3 Kg de cellules sèches par opération. On ajoute ensuite 5 mg de DN ase par litre de suspension.The concentrate is thawed in a reactor and suspended in tris-HCl buffer (10 mM) pH 7.0, containing MgCl (10 mM) and NaCl (150 mM) at 4 ° C to have a final concentration equivalent to 50 g of cells dry per liter of suspension. The production of industrial batches uses the equivalent of 1 to 3 Kg of dry cells per operation. 5 mg of ase DN are then added per liter of suspension.
Les cellules microbiennes sont alors désintégrées par passage en continu sur des broyeurs industriels de type APV, Manton Gaulin. Le Lysat bactérien ainsi obtenu, est soumis à une première clarification continue à 15 000 x g sur un séparateur sharples à 4°C pour éliminer les cellules non broyées et les résidus de broyage. Le culot de centrifugation est éliminé et le surnageant recueilli, il constitue le lysat clarifié.The microbial cells are then disintegrated by continuous passage on industrial mills of the APV type, Manton Gaulin. The bacterial lysate thus obtained is subjected to a first continuous clarification at 15,000 x g on a sharples separator at 4 ° C to remove the unmilled cells and the grinding residues. The centrifugation pellet is eliminated and the supernatant collected, it constitutes the clarified lysate.
2. Isolement de la fraction membranaire2. Isolation of the membrane fraction
Le lysat bactérien clarifié est acidifié à pH 4,2 ± 0, 1 par l'acide acétique concentré puis laissé au repos pendant 30 minutes à 4°C. Le précipité d'impuretés est éliminé par centrifugation continue à 15 000 x g par séparateur Sharples. Le surnageant opalescent contenant la fraction membranaire est neutralisé par NaOH puis dialyse par ultrafiltration à volume constant contre de l'eau distillée sur une membrane coupant à 10 000 Daltons. Lorsque la résistivité atteint 500 Ω cm- 1, le volume est concentré pour atteindre 201 par Kg d'équivalent en cellules sèches de départ.The clarified bacterial lysate is acidified to pH 4.2 ± 0.1 with concentrated acetic acid and then left to stand for 30 minutes at 4 ° C. The impurity precipitate is removed by continuous centrifugation at 15,000 xg using a Sharples separator. The opalescent supernatant containing the fraction membrane is neutralized by NaOH then dialyzed by ultrafiltration at constant volume against distilled water on a membrane cutting at 10,000 Daltons. When the resistivity reaches 500 Ω cm - 1 , the volume is concentrated to reach 201 per kg of equivalent in dry starting cells.
La suspension membranaire ainsi obtenue sera immédiatement utilisée pour la préparation de GC-APG.The membrane suspension thus obtained will be immediately used for the preparation of GC-APG.
3. Préparation du J001X3. Preparation of the J001X
a) Hydrolyse alcalinea) Alkaline hydrolysis
Elle est destinée à solubiliser les membranes pour permettre l'isolement de l'APG brut. A la suspension membranaire obtenue précédemment, on ajoute sous agitation de l'hydroxyde de sodium concentré pour avoir une molarité finale de 0,5 M. La solution est ensuite portée à 56°C et maintenue sous agitation pendant une heure à cette température. Après un refroidissement rapide à température ambiante, la solution est neutralisée à pH 7,0 par l'acide chlorydrique dilué.It is intended to dissolve the membranes to allow the isolation of the crude APG. To the membrane suspension obtained above, concentrated sodium hydroxide is added with stirring to have a final molarity of 0.5 M. The solution is then brought to 56 ° C. and kept stirring for one hour at this temperature. After rapid cooling to room temperature, the solution is neutralized to pH 7.0 with dilute hydrochloric acid.
b) Digestion enzymatiqueb) Enzymatic digestion
Elle est destinée à éliminer les impuretés protéiques et à digérer les résidus de peptidoglycane membranaire pouvant subsister après l'hydrolyse alcaline.It is intended to eliminate protein impurities and to digest residues of membrane peptidoglycan which may remain after alkaline hydrolysis.
A la solution neutralisée, on ajoute du tampon tris lOmM et de l'EDTA qsp ImM, puis le pH est ajusté à 7,5. On ajoute alors 5 000 unités de protéinase K par kg de cellules sèches et 160.106 unités de lysozyme par kg de cellules sèches et le mélange est ensuite maintenu sous agitation pendant deux heures à 37°C. c) Précipitation éthanolTo the neutralized solution, 10 mM tris buffer and EDTA qsp ImM are added, then the pH is adjusted to 7.5. 5,000 units of proteinase K per kg of dry cells and 160 × 10 6 units of lysozyme per kg of dry cells are then added and the mixture is then stirred for two hours at 37 ° C. c) Ethanol precipitation
L'APG est isolé du digestat obtenu précédemment par précipitation avec 2 volumes d'alcool éthylique préalablement refroidi à -20°C. Après un repos de 30 minutes à + 4°C, le précipité d'APG est recueilli par centrifugation continue à 15 000 x g sur séparateur Sharples.The APG is isolated from the digestate previously obtained by precipitation with 2 volumes of ethyl alcohol previously cooled to -20 ° C. After standing for 30 minutes at + 4 ° C., the APG precipitate is collected by continuous centrifugation at 15,000 × g on a Sharples separator.
d) Délipidation et deuxième hydrolyse alcalined) Delipidation and second alkaline hydrolysis
Le culot est délipidé à l'aide de 3 litres de mélange chloroforme/méthanol (3/1) par kg de cellules sèches, après dispersion au Turrax.The pellet is defatted using 3 liters of chloroform / methanol mixture (3/1) per kg of dry cells, after dispersion with Turrax.
Le résidu est repris par 3 litres d'eau osmosée par kg de cellules sèches et dispersé au Turrax. Après agitation une nuit à +4°C, la solution est clarifiée par ultracentrifugation à 30 000 g, 1 h à 4°C.The residue is taken up in 3 liters of osmosis water per kg of dry cells and dispersed with Turrax. After stirring overnight at + 4 ° C, the solution is clarified by ultracentrifugation at 30,000 g, 1 h at 4 ° C.
Le surnageant est soumis à une hydrolyse alcaline (0,5 N NaOH, lh, 56°C) puis neutralisé à l'aide d'HCl.The supernatant is subjected to alkaline hydrolysis (0.5 N NaOH, 1 h, 56 ° C) and then neutralized using HCl.
La solution est dialysée par ultrafiltration à volume constant sur membrane coupant à 10 000 Da jusqu'à 2500 Ω cm-1 et concentrée à 4 litres par kg de cellules sèches.The solution is dialyzed by ultrafiltration at constant volume on a membrane cutting at 10,000 Da up to 2,500 Ω cm- 1 and concentrated to 4 liters per kg of dry cells.
Après ajustement du pH à 7,2, la solution est stockée à -20°C en attente de lyophilisation.After adjusting the pH to 7.2, the solution is stored at -20 ° C pending lyophilization.
e) Lyophilisation de l'APGe) Lyophilization of the APG
La solution contenant l'APG est décongelée 24 heures à température ambiante.The solution containing APG is thawed for 24 hours at room temperature.
Après clarification par ultracentrifugation 30 000 g à 4°C pendant 1 heure, le surnageant est filtré stérilement sur filtre 0,22 μm et lyophilisé.After clarification by ultracentrifugation 30,000 g at 4 ° C for 1 hour, the supernatant is sterile filtered through a 0.22 μm filter and lyophilized.
Le rendement moyen en APG est voisin de 25 g par kg de cellules sèches. 21The average APG yield is close to 25 g per kg of dry cells. 21
Exemple 4 : Modification de la structure du GC-APGExample 4: Modification of the structure of the GC-APG
Comme l'indique le schéma de structure du GC-APG présenté dans la description de la présente demande, la partie distale de la molécule de GC- APG est composée du digalactoside (α Galp -> β Galf ) n As indicated by the GC-APG structure diagram presented in the description of the present application, the distal part of the GC-APG molecule is composed of digalactoside (α Galp -> β Galf) n
1,3 Afin de permettre une exposition optimale du motif (α Galp --> β Galp ) m 1,3 à la reconnaissance par les anticorps naturels, la sensibilité particulière du galactofuranose à une hydrolyse ménagée par l'acide trifluoroacétique peut être avantageusement mise à profit pour éliminer sélectivement le bloc (5α Gal p - β Gal f). Les conditions opératoires seront les suivantes : lg de GC-APG obtenu selon le procédé décrit précédemment est dissout dans 200 ml d'une solution 0,1 M d'acide trifluoroacétique. La solution est ensuite portée 30 minutes à 100° C pour hydrolyser les résidus galactofuranose puis refroidie et neutralisée par l'hydroxyde de sodium.1.3 In order to allow optimal exposure of the motif (α Gal p -> β Gal p ) m 1.3 to recognition by natural antibodies, the particular sensitivity of galactofuranose to hydrolysis managed by trifluoroacetic acid can be advantageously used to selectively eliminate the block (5α Gal p - β Gal f). The operating conditions will be as follows: 1 g of GC-APG obtained according to the method described above is dissolved in 200 ml of a 0.1 M solution of trifluoroacetic acid. The solution is then brought 30 minutes to 100 ° C. to hydrolyze the galactofuranose residues, then cooled and neutralized with sodium hydroxide.
Le GC-APG est ensuite séparé des produits d'hydrolyse par une simple chromatographie sur Séphadex G25 dans l'eau. Dans ces conditions, le GC-APG sort immédiatement au volume d'exclusion alors que les résidus d'hydrolyse qui sont essentiellement des disaccharides sont fortement retardés.The GC-APG is then separated from the hydrolysis products by a simple chromatography on Sephadex G25 in water. Under these conditions, the GC-APG immediately exits to the exclusion volume while the hydrolysis residues which are essentially disaccharides are greatly delayed.
Le GC-APG ainsi obtenu a sa masse moléculaire réduite à 20-25 000 Daltons et peut être stérilisé et lyophilisé comme décrit précédemment.The GC-APG thus obtained has its molecular mass reduced to 20-25,000 Daltons and can be sterilized and lyophilized as described above.
Exemple 5 : Spécificité des anticorps anti-JOOIXEXAMPLE 5 Specificity of the Anti-JOOIX Antibodies
La préparation obtenue à partir de K. pneumoniae selon l'exemple 3 est désignée par J001X. Etude des anticorps naturels présents dans un pool de plasma de 10 donneurs sains (pool 10) ainsi que des anticorps produits chez le lapin par immunisation avec PGM Kp. Les lapins Fauve de Bourgogne ont été immunisés par quatre injections sous cutanées à une semaine d'intervalle avec PGM Kp (100 μg/ml dans 0,5 ml de PBS en émulsion dans l'adjuvant complet de Freund à la première injection puis en adjuvant incomplet de Freund pour les injections suivantes). Les sérums ont été prélevés 10 jours après la dernière injection.The preparation obtained from K. pneumoniae according to Example 3 is designated by J001X. Study of natural antibodies present in a plasma pool of 10 healthy donors (pool 10) as well as antibodies produced in rabbits by immunization with PGM Kp. The Fauve de Bourgogne rabbits were immunized by four subcutaneous injections one week apart with PGM Kp (100 μg / ml in 0.5 ml of PBS in emulsion in the complete Freund's adjuvant at the first injection then by adjuvant Freund's incomplete for subsequent injections). The sera were collected 10 days after the last injection.
ProtocoleProtocol
Les anticorps anti-JOO IX sont détectés par ELISA sur J001X immobilisé en fond de plaque. Les anticorps anti-JOOIX retenus sont révélés au moyen d'anticorps conjugués à la péroxydase anti-IgG de lapin et anti-IgM ou IgG humaines, la présence d'IgA anti-JOOIX n'ayant pu être détectée dans le pool 10. Les sérums sont titrés afin de définir pour chaque classe d'Ig la plus faible dilution à la limite du plateau de saturation. La spécificité des anticorps anti-JOOIX est étudiée en prétraitant les sérums dilués par des concentrations croissantes de GC-APG ou de mélibiose en solution à 37° C pendant 2h. Les anticorps anti-JOOIX non liés aux sucres sont ensuite révélés par ELISA sur J001X en phase solide.Anti-JOO IX antibodies are detected by ELISA on J001X immobilized at the bottom of the plate. The anti-JOOIX antibodies retained are revealed by means of antibodies conjugated to peroxidase anti-rabbit IgG and anti-human IgM or IgG, the presence of anti-JOOIX IgA could not be detected in pool 10. The sera are titrated in order to define for each class of Ig the lowest dilution at the edge of the saturation plateau. The specificity of anti-JOOIX antibodies is studied by pretreating the sera diluted with increasing concentrations of GC-APG or melibiose in solution at 37 ° C for 2 h. Anti-JOOIX antibodies not linked to sugars are then revealed by ELISA on J001X in solid phase.
RésultatsResults
Les IgG (Fig. 1A) et les IgM (Fig. 1B) humaines anti-JOOIX sont neutralisées de façon dose dépendante par GC-APG. La totalité des anticorps IgG est absorbé par 0,05 mg/ml de GC-APG ; les IgM sont neutralisées par 5 mg/ml de GC-APG. GC-APG absorbe également la totalité des IgG anti-JOOIX de lapin hyperimmun (Fig.2). L'absorption par la mélibiose à la plus forte concentration testéeAnti-JOOIX human IgGs (FIG. 1A) and IgM (FIG. 1B) are neutralized in a dose-dependent manner by GC-APG. All of the IgG antibodies are absorbed by 0.05 mg / ml of GC-APG; IgM are neutralized with 5 mg / ml of GC-APG. GC-APG also absorbs all anti-JOOIX hyperimmune rabbit IgGs (Fig. 2). Absorption by melibiose at the highest concentration tested
( 1200 mM) entraîne seulement une diminution partielle des anticorps anti-JOOIX: 57% des IgG et 77% des IgM (Fig. 3A). Le glucose utilisé comme contrôle n'interfère pas avec ces acides, indiquant la spécificité de la neutralisation par la mélibiose (Fig. 3B). Sur sérum de lapin hyperimmun 96% des IgG anti-JOOIX sont capturées par la mélibiose à 1200 mM (Fig.4).(1200 mM) only leads to a partial decrease in anti-JOOIX antibodies: 57% of IgG and 77% of IgM (Fig. 3A). The glucose used as a control does not interfere with these acids, indicating the specificity of neutralization by melibiosis (Fig. 3B). On hyperimmune rabbit serum 96% of anti-JOOIX IgG is captured by melibiosis at 1200 mM (Fig. 4).
ConclusionConclusion
Les IgG et IgM anti-JOOIX détectables par ELISA et naturellement présentes dans le sérum humain sont dirigées contre la chaine polygalactose GC-APG. L'absorption partielle par la mélibiose indique que plus de la moitiée des IgG et les 3/4 des IgM anti-JOOIX sont dirigés contre les épitopes α(l-3) Galactose de GC-APG (Fig. 7).The anti-JOOIX IgG and IgM detectable by ELISA and naturally present in human serum are directed against the polygalactose chain GC-APG. Partial absorption by melibiosis indicates that more than half of IgG and 3/4 of IgM anti-JOOIX are directed against the epitopes α (l-3) Galactose of GC-APG (Fig. 7).
Dans le sérum de lapin hyperimmun la totalité des IgG anti-JOOIX est dirigée contre l'épitope α( l-3) Galactose de GC-APG. Cet épitope, exprimé par les cellules de lapin, est normalement toléré. L'apparition d'anticorps anti-α Gai au cours de l'immunisation par PGM Kp se fait donc au prix d'une rupture de tolérance.In hyperimmune rabbit serum, all of the anti-JOOIX IgGs are directed against the epitope α (l-3) Galactose of GC-APG. This epitope, expressed by rabbit cells, is normally tolerated. The appearance of anti-α Gai antibodies during immunization with PGM Kp therefore comes at the cost of a breach of tolerance.
Exemple 6Example 6
Les anticorps naturels polyréactifs ont la propriété de réagir avec des haptènes tels que le trinitrophényl. Si les anticorps anti-JOOIX appartiennent à cette catégorie d'anticorps il est possible de diminuer leur réactivité avec J001X en prétraitant le SHN avec le TNP couplé à la BSA. Inversement le traitement du SHN avec J001X devrait diminuer la réactivité des anticorps anti-TNP avec le TNP-BSA.Natural polyreactive antibodies have the property of reacting with haptens such as trinitrophenyl. If the anti-JOOIX antibodies belong to this category of antibodies, it is possible to reduce their reactivity with J001X by pretreating the SHN with the TNP coupled with BSA. Conversely, the treatment of NHS with J001X should decrease the reactivity of anti-TNP antibodies with TNP-BSA.
ProtocoleProtocol
Les acides polyréactifs sont détectés par ELISA avec TNP-BSA en fond de plaque selon la technique de T. Ternynck (Ternynck et al., 1986). Le pool 10, insuffisamment concentré en anticorps anti-TNP-BSA, a été remplacé dans cette étude par le plasma Y dans lequel seules des IgG anti-TNP-BSA sont détectables. Ce sérum présente par ailleurs les mêmes caractéristiques que le pool 10 en ce qui concerne le reste de l'étude. Les réactions croisées entre les anticorps anti-JOOIX et les anticorps polyréactifs sont étudiées par traitement du pool de plasma humain parPolyreactive acids are detected by ELISA with TNP-BSA at the bottom of the plate according to the technique of T. Ternynck (Ternynck et al., 1986). Pool 10, insufficiently concentrated in anti-TNP-BSA antibodies, was replaced in this study by plasma Y in which only anti-TNP-BSA IgG are detectable. This serum moreover has the same characteristics as pool 10 with regard to the rest of the study. Cross-reactions between anti-JOOIX antibodies and polyreactive antibodies are studied by treatment of the human plasma pool with
J001X ou par TNP-BSA selon le protocole décrit dans le précédent paragraphe. La capture des deux spécificités d'anticorps est ensuite révélée par ELISA sur J001X ou sur TNP-BSA en fond de plaque.J001X or by TNP-BSA according to the protocol described in the previous paragraph. The capture of the two specificities of antibodies is then revealed by ELISA on J001X or on TNP-BSA at the bottom of the plate.
RésultatsResults
Les IgG anti-TNP-BSA ne reconnaissent pas J001X (Fig. 5A), ni la mélibiose (Fig. 5B) puisqu'aucune diminution dose dépendante de la liaison de ces anticorps au TNP-BSA en fond de plaque ne peut être détectée. Dans les mêmes conditions 6,7 μg/ml de TNP-BSA en phase soluble capturent la totalité des IgG qui lui sont spécifiques (Fig. 5C).Anti-TNP-BSA IgGs do not recognize J001X (Fig. 5A) or melibiosis (Fig. 5B) since no dose-dependent reduction in the binding of these antibodies to TNP-BSA at the back of the plate cannot be detected. Under the same conditions 6.7 μg / ml of TNP-BSA in the soluble phase capture all of the IgGs which are specific to it (FIG. 5C).
Inversement les IgG et IgM anti-JOOIX ne sont pas neutralisés par le TNP-BSA en phase soluble même à une concentration 9 fois supérieure à la concentration minimale nécessaire à la neutralisation de la totalité des IgG anti-TNP-BSA détectables dans les conditions de ce test (Fig.6).Conversely, anti-JOOIX IgG and IgM are not neutralized by TNP-BSA in the soluble phase even at a concentration 9 times greater than the minimum concentration necessary for the neutralization of all the anti-TNP-BSA IgG detectable under the conditions of this test (Fig. 6).
ConclusionConclusion
Il n'existe pas de réaction croisée entre les anticorps anti-TNP et les anticorps anti-JOOIX. Les anticorps naturels anti-JOOIX n'appartiennent donc pas au groupe des anticorps naturels polyréactifs. Les anticorps anti-Galα( l-3) reconnaissant la mélibiose n'appartiennent pas non plus à ce groupe.There is no cross-reaction between anti-NPT antibodies and anti-JOOIX antibodies. Natural anti-JOOIX antibodies therefore do not belong to the group of natural polyreactive antibodies. The anti-Galα (1-3) antibodies recognizing melibiosis do not belong to this group either.
Exemple 7 : Les anticorps anti-JOOIX sont-ils impliqués dans l'hémagglutination des hématies de porc ?Example 7: Are anti-JOOIX antibodies involved in the hemagglutination of pig red cells?
Les hématies de porc sont agglutinées par les IgM présentes dans lePig red cells are agglutinated by IgM present in the
SHN. D'après Sandrin (Sandrin et al., 1993) la plupart des IgM dirigées contre les cellules de porc et présentes dans le sérum humain normal reconnaissent l'épitope Galα( l-3). ProtocoleSHN. According to Sandrin (Sandrin et al., 1993) most IgM directed against pig cells and present in normal human serum recognize the Galα epitope (1-3). Protocol
Le pool 10 est prétraité par des doses croissantes du composé utilisé comme absorbant. Le pool traité ou non traité est ensuite dilué de demi en demi et chaque dilution est mise en présence d'un volume égal d'hématies de porc afin de définir le titre hémagglutinant.Pool 10 is pretreated with increasing doses of the compound used as an absorbent. The treated or untreated pool is then diluted from half to half and each dilution is brought into contact with an equal volume of pig red cells in order to define the haemagglutinating titer.
RésultatsResults
Le tableau 1 indique une diminution dose dépendante du titre agglutinant en présence de J001X et de mélibiose, alors que le glucose ne modifie pas le titre par rapport au contrôle. Cependant à la plus forte concentration testée en mélibiose (600 mM) une hémagglutination est encore observée avec le SHN au 1/16. Curieusement les résultats obtenus avec J001X ne peuvent être reproduits en présence de GC-APG.Table 1 indicates a dose-dependent decrease in the agglutinating titer in the presence of J001X and melibiosis, while the glucose does not modify the titer relative to the control. However, at the highest concentration tested for melibiosis (600 mM), hemagglutination is still observed with the 1/16 NHS. Curiously, the results obtained with J001X cannot be reproduced in the presence of GC-APG.
Cette différence pourrait s'expliquer par une interaction artéfactuelle de J001X avec le système de révélation par liaison non spécifique aux hématies entraînant un masquage des sites reconnus par les anticorps sériques. Pour écarter une telle hypothèse la titration du pool 10 non traité a été reproduite sur des hématies incubées 2h à 37° C en présence de J001X (0,33 mg/ml), dilué de 1/2 en 1/2 dans du PBS ou dans le pool 10. Les hématies sont ensuite lavées puis mises en présence des dilutions du pool 10 non traité pour titration. Le titre obtenu avec les hématies traitées, indiquant que J001X n'interfère pas avec le système de révélation mais bien avec les anticorps responsables de l'hémagglutination.This difference could be explained by an artefactual interaction of J001X with the revelation system by nonspecific binding to red cells, leading to masking of the sites recognized by the serum antibodies. To rule out such a hypothesis, the titration of the untreated pool 10 was reproduced on red cells incubated for 2 h at 37 ° C. in the presence of J001X (0.33 mg / ml), diluted 1/2 to 1/2 in PBS or in pool 10. The red cells are then washed and then put in the presence of the dilutions of the untreated pool 10 for titration. The titer obtained with the treated red cells, indicating that J001X does not interfere with the revelation system but indeed with the antibodies responsible for the haemagglutination.
ConclusionConclusion
Les anticorps responsables de l'hémagglutination des hématies de porc sont dirigés contre les épitopes Galα( l-3)Gal comme le confirme l'inhibition d'hémagglutination par le sérum pré-traité par la mélibiose. J001X interagit également avec les anticorps impliqués dans cette réaction. Ce résultat n'est pas dû à une interaction non spécifique de J001X avec les hématies, il s'agit donc bien d'une capture des anticorps responsables de l'hémagglutination.The antibodies responsible for the hemagglutination of pig red cells are directed against the Galα (1-3) Gal epitopes, as confirmed by the inhibition of hemagglutination by the serum pretreated with melibiosis. J001X also interacts with the antibodies involved in this reaction. This result is not due to a non-specific interaction of J001X with red cells, so it is indeed a capture of the antibodies responsible for hemagglutination.
Tableau 1 : Inhibition de l'hémagglutination des hématies de porc par le sérum en présence de J001X ou de mélibioseTable 1: Inhibition of the hemagglutination of pig red cells by the serum in the presence of J001X or melibiosis
Absorbant Concentration Titre héπAbsorbent Concentration Title héπ
Aucun 64 Glucose (mM) 120 64None 64 Glucose (mM) 120 64
600 64600 64
Mélibiose (mM) 0,% 64Melibiosis (mM) 0,% 64
4,8 644.8 64
24 6424 64
120 32120 32
300 32300 32
600 16 J001X (mg/ml) 0,037 32600 16 J001X (mg / ml) 0.037 32
0,11 <160.11 <16
0,33 <L60.33 <L6
GC-APG (mg/ml) 2 64GC-APG (mg / ml) 2 64
1 641 64
Le pool 10 décomplété et dilué au 1/16 dans du PBS est incubé 2h à 37° C sous agitation en présence des composés indiqués puis dilué de demi en demi. Cinquante μl de chaque dilution sont incubés en présence du même volume d'hématies de porc à 1% pendant 2h à température ambiante. Le titre hémagglutinant est la plus forte dilution de sérum donnant une agglutination des hématies. Exemple 8 : exemple de couplage d'APG sur un support constitué de microbilles poreusesThe pool 10 decompleted and diluted 1/16 in PBS is incubated for 2 h at 37 ° C with shaking in the presence of the indicated compounds and then diluted from half to half. Fifty μl of each dilution are incubated in the presence of the same volume of 1% pig red cells for 2 h at room temperature. The haemagglutinating titer is the highest dilution of serum giving agglutination of red blood cells. Example 8: example of coupling of APG on a support constituted by porous microbeads
L'exemple choisi est celui du couplage de l'APG sur un support activé avec des esters de N-hydroxysuccinimide (Affi Prep 10, BIORAD, Ivry-sur-Seine, France).The example chosen is that of coupling APG to an activated support with N-hydroxysuccinimide esters (Affi Prep 10, BIORAD, Ivry-sur-Seine, France).
On transfère le support Affi Prep 10 100 ml sur un entonnoir muni d'un verre fritte et on lave, sous pression réduite, avec 30 à 50 volumes de tampon acétate de sodium 10 mM, pH 4,5, à une température de 4°C. Le support est lavé rapidement avec 3 volumes de tampon bicarbonate 50 mM pH 8,3 à 4°C.The Affi Prep 10 100 ml support is transferred to a funnel fitted with a sintered glass and washed, under reduced pressure, with 30 to 50 volumes of 10 mM sodium acetate buffer, pH 4.5, at a temperature of 4 ° vs. The support is quickly washed with 3 volumes of 50 mM bicarbonate buffer pH 8.3 at 4 ° C.
On transfère le support dans un bêcher de 500 ml et on ajoute 1 g d'APG dissous dans 300 ml de tampon bicarbonate 50 mM pH 8,3.The support is transferred to a 500 ml beaker and 1 g of APG dissolved in 300 ml of 50 mM bicarbonate buffer pH 8.3 is added.
On agite modérément à l'aide d'une hélice entraînée par un moteur IKA RW20 pendant 4 heures à +4°C.The mixture is stirred moderately using a propeller driven by an IKA RW20 motor for 4 hours at + 4 ° C.
On lave le support avec quatre volumes de NaCl 0,5 M dans l'eau afin d'éliminer l'APG non fixé.The support is washed with four volumes of 0.5 M NaCl in water to remove the unbound APG.
Enfin, le support est transféré dans une colonne et lavé par six volumes de PBS. Finally, the support is transferred to a column and washed with six volumes of PBS.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un composé comportant au moins une partie de la structure glycanique de la membrane d'une bactérie gram négatif pour la réalisation d'un produit permettant le blocage et/ou l'élimination des anticorps anti-galactose chez l'homme.1. Use of a compound comprising at least part of the glycan structure of the membrane of a gram negative bacterium for the production of a product allowing the blocking and / or the elimination of anti-galactose antibodies in humans .
2. Utilisation d'un composé selon la revendication 1 pour la réalisation d'un produit permettant le blocage et/ou l'élimination des anticorps humains impliqués dans le rejet des greffes d'organes provenant d'une autre espèce.2. Use of a compound according to claim 1 for the production of a product for blocking and / or eliminating human antibodies involved in the rejection of organ transplants from another species.
3. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les anticorps sont dirigés contre les épitopes choisis dans le groupe comprenant3. Use of a compound according to one of claims 1 or 2, characterized in that the antibodies are directed against the epitopes chosen from the group comprising
- Galαl -> 3, Galβl -> 4, Glc Nac - Glc Nac α l->4- Galαl -> 3, Galβl -> 4, Glc Nac - Glc Nac α l-> 4
- Galβl -> 3 Glc Nac- Galβl -> 3 Glc Nac
- Galβl -> Glc Nac- Galβl -> Glc Nac
4. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit composé comporte au moins une partie de la structure glycanique de la membrane d'une bactérie du genre Klebsiella.4. Use of a compound according to one of claims 1 to 3, characterized in that said compound comprises at least part of the glycan structure of the membrane of a bacterium of the genus Klebsiella.
5. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la bactérie appartient à l'espèce Klebsiella pneumoniae.5. Use of a compound according to one of claims 1 to 4, characterized in that the bacterium belongs to the species Klebsiella pneumoniae.
6. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la membrane provient d'une souche non capsulée de Klebsiella pneumoniae, déposée sous le n° IPI 145.6. Use of a compound according to one of claims 1 to 5, characterized in that the membrane comes from a non-encapsulated strain of Klebsiella pneumoniae, deposited under the number IPI 145.
7. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le produit comporte au moins une partie présentant l'une des structures suivantes :7. Use of a compound according to one of claims 1 to 6, characterized in that the product comprises at least one part having one of the following structures:
1) - (α Galp -> β Galf -) -1) - (α Gal p -> β Gal f -) -
3 1,3 13 1.3 1
2) - (α Galp -> β Galp -) - 3 1,3 1 2) - (α Gal p -> β Gal p -) - 3 1.3 1
8. Utilisation d'un composé selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'à l'extrémité de la chaîne polygalactosidique se trouve une séquence heptose-acide cétodéoxyoctulosonique.8. Use of a compound according to claim 7, characterized in that at the end of the polygalactoside chain is a heptose-ketodeoxyoctulosonic acid sequence.
9. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'il a la formule suivante :9. Use of a compound according to one of claims 1 to 8, characterized in that it has the following formula:
- ( - α Galp -> β Galf - ) - - ( - α Galp -> β Galp - ) Core-KDO 3 1,3 1 n 3 1,3 1 m- (- α Gal p -> β Gal f -) - - (- α Gal p -> β Gal p -) Core-KDO 3 1.3 1 n 3 1.3 1 m
avec . m compris entre 20 et 30with. m between 20 and 30
. n compris entre 40 et 60. n between 40 and 60
10. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'il a la formule suivante :10. Use of a compound according to one of claims 1 to 9, characterized in that it has the following formula:
- ( - α Galp --> β Galp - ) - Core-KDO 3 1,3 1 m- (- α Gal p -> β Gal p -) - Core-KDO 3 1.3 1 m
avec m compris entre 20 et 30with m between 20 and 30
1 1. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'il a la formule suivante :1 1. Use of a compound according to one of claims 1 to 10, characterized in that it has the following formula:
- ( - α Galp --> β Galf - ) - Core-KDO 3 1,3 1 n- (- α Gal p -> β Gal f -) - Core-KDO 3 1.3 1 n
avec n compris entre 40 et 60with n between 40 and 60
12. Utilisation d'un composé selon la revendication 1 provenant d'autres espèces bactériennes ou fongiques possédant les épitopes glycaniques exprimés sur l'endothélium de porc et fixant des anticorps préformés du sérum humain.12. Use of a compound according to claim 1 coming from other bacterial or fungal species having the glycan epitopes expressed on the pig endothelium and fixing preformed antibodies of human serum.
13. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que la structure glycanique est solidaire d'un élément support. 3013. Use of a compound according to one of claims 1 to 12, characterized in that the glycan structure is integral with a support element. 30
14. Utilisation d'un composé selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'élément support peut être prélevé au cours d'un circuit extracorporel.14. Use of a compound according to claim 13, characterized in that the support element can be removed during an extracorporeal circuit.
15. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que la structure glycanique est couplée à un support permettant la polymérisation, en particulier la trimérisation ou tétramérisation en vue de la préparation d'un produit injectable pour induction de tolérance.15. Use of a compound according to one of claims 13 or 14, characterized in that the glycan structure is coupled to a support allowing polymerization, in particular trimerization or tetramerization for the preparation of an injectable product for tolerance induction.
16. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que le support est une structure moléculaire qui peut être bloquée sur une colonne adaptée ou un support solide qui peut être bloqué par des moyens physiques.16. Use of a compound according to one of claims 13 or 14, characterized in that the support is a molecular structure which can be blocked on a suitable column or a solid support which can be blocked by physical means.
17. Utilisation d'un composé selon la revendication 13, caractérisée en ce que la structure glycanique est solidaire d'une partie fixe d'un circuit extracorporel.17. Use of a compound according to claim 13, characterized in that the glycan structure is integral with a fixed part of an extracorporeal circuit.
18. Procédé d'obtention d'un produit glycanique susceptible d'être utilisé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'on effectue sur une suspension de membranes de bactéries gram négatif les étapes suivantes : a) délipidation, b) hydrolyse alcaline, c) chromatographie d'exclusion, d) récupération des chaînes glycaniques détoxifiées.18. A process for obtaining a glycanic product capable of being used according to one of claims 1 to 17, characterized in that the following steps are carried out on a suspension of membranes of gram negative bacteria: a) defatting, b) alkaline hydrolysis, c) exclusion chromatography, d) recovery of the detoxified glycan chains.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'on effectue en outre une hydrolyse ménagée par un acide faible à une molarité comprise entre 0,05 et 0,2 M.19. The method of claim 18, characterized in that one further performs a hydrolysis controlled by a weak acid at a molarity between 0.05 and 0.2 M.
20. Procédé selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce qu'on récupère un polygalactoside. 20. Method according to one of claims 18 or 19, characterized in that a polygalactoside is recovered.
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