[go: up one dir, main page]

WO1996038176A1 - Inhibiteur de la croissance de cellules leucemiques contenant des derives oligonucleotidiques antisens agissant contre le gene de la tumeur de wilms (wt1) - Google Patents

Inhibiteur de la croissance de cellules leucemiques contenant des derives oligonucleotidiques antisens agissant contre le gene de la tumeur de wilms (wt1) Download PDF

Info

Publication number
WO1996038176A1
WO1996038176A1 PCT/JP1996/001394 JP9601394W WO9638176A1 WO 1996038176 A1 WO1996038176 A1 WO 1996038176A1 JP 9601394 W JP9601394 W JP 9601394W WO 9638176 A1 WO9638176 A1 WO 9638176A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antisense oligonucleotide
seq
cell growth
leukemia cell
oligonucleotide derivative
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/001394
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Haruo Sugiyama
Tamotsu Yamagami
Kazushi Inoue
Original Assignee
Kishimoto, Tadamitsu
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kishimoto, Tadamitsu filed Critical Kishimoto, Tadamitsu
Priority to US08/952,664 priority Critical patent/US6034235A/en
Priority to EP96914430A priority patent/EP0841068B1/en
Priority to DE69636339T priority patent/DE69636339T2/de
Priority to AU57796/96A priority patent/AU5779696A/en
Publication of WO1996038176A1 publication Critical patent/WO1996038176A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/311—Phosphotriesters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Definitions

  • the present invention relates to a leukemia cell growth inhibitor comprising an antisense oligonucleotide derivative.
  • Wilms tumor is a pediatric kidney tumor that results from inactivation of both alleles of the Wilms oncogene (WT1) located on chromosome 11p13 (Call KM et al., Cell 60: 509). , 1990).
  • WT1 Wilms oncogene
  • the non-coding upstream sequence of WT1 CE Camphell et al., Oncogene 9: 583-595, 1994
  • WT1 is involved in the proliferation of leukemia cells, and it is not known that an antisense oligonucleotide derivative against WT1 inhibits or inhibits the proliferation of leukemia cells. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a leukemia cell proliferation inhibitor comprising an antisense oligonucleotide derivative against the Wilms oncogene (WT1).
  • WT1 Wilms oncogene
  • FIG. 1 is a Draf showing the inhibitory effect of oligonucleotides on the growth of the leukemia cell line K566.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the concentrations of oligonucleotides SE 3 and AS 3 and the proliferation of the leukemia cell line K566.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the concentration of oligonucleotides SE4 and AS4 and the proliferation of the leukemia cell line K566.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of the oligonucleotides SE 3 and AS 3 on the growth of the leukemia cell line K566 over time.
  • Figure 5 is a Draf showing the effect of various oligonucleotides on the growth of the leukemia cell line K566.
  • FIG. 6 is a graph showing the inhibitory effect of various oligonucleotides on the proliferation of the WT1 expression-positive leukemia cell line HEL.
  • FIG. 7 is a graph showing the inhibitory effect of various oligonucleotides on the proliferation of the WT1 expression-positive leukemia cell line THP-1.
  • FIG. 8 is a graph showing the inhibitory effect of various oligonucleotides on the growth of the WT1 expression-negative malignant lymphoma cell line U937.
  • FIG. 9 is a graph showing the effects of oligonucleotides SE 3 and AS 3 on the formation of leukemia cell cogni from bone marrow mononuclear cells derived from leukemia patients.
  • FIG. 10 is a graph showing the effects of the oligonucleotides SE 3 and AS 3 on the formation of granulocyte-macrophage colonies from bone marrow mononuclear cells from healthy volunteers.
  • A is an electropherogram showing that the level of WT1 protein in the cells was reduced when various WT1 antisense oligonucleotides were added to the culture medium of K562 cells.
  • B is a photograph substituted for a drawing, and B shows that WT1 antigen was added to fresh leukemia cells from a patient having AML. This shows that the level of WT1 protein in the cells was reduced when the sense oligonucleotide was added.
  • the present invention provides a leukemia cell growth inhibitor comprising an antisense oligonucleotide derivative against WT1.
  • the antisense oligonucleotide derivative used in the present invention may be, for example, one against WT1 such as one against the transcription cabling site of WT1, one against the translation initiation region, one against exon or one against intron.
  • Antisense oligonucleotide derivative may be, for example, one against WT1 such as one against the transcription cabling site of WT1, one against the translation initiation region, one against exon or one against intron.
  • the nucleotide sequence of the sense DNA strand in the region containing the transcription capping site of WT1 is represented by SEQ ID NO: 9, and the nucleotide sequence of the sense DNA strand of exons 1 to 10 in the WT1 code region is SEQ ID NO: 9.
  • the present invention uses such antisense oligonucleotide derivatives for the base sequence of the sense DNA strand of WT1.
  • This antisense oligonucleotide derivative is usually 5 to 50, preferably 9 to 30 contiguous bases of WT1 antisense DNA or RNA strand, or WT1 DNA or RNA strand. If it is capable of binding to a chain, it is an antisense oligonucleotide derivative consisting of 5 to 70, preferably 9 to 50 bases, which are intermittent or partially complementary.
  • transcriptional binding site examples include those having the following nucleotide sequences: 5'-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3 '(SEQ ID NO: 2) and 5'-TCA AATAAGAGGGGCCGG-3' (SEQ ID NO: 4).
  • translation initiation region examples include translation initiation codon ATG and antisense oligonucleotide derivatives for the region including upstream and / or downstream thereof.
  • nucleotide sequence 5′-G TCGGAGCCCATTTGCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 6) and the like.
  • the WT1 coding region contains 10 exons
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention is directed to a sequence contained in any of these exons or splicing.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention is directed to a sequence contained in any of these exons or splicing.
  • For all introns and sequences in the 3 ', 5' non-coding region for sequences that span any two subsequent exons, or for sequences that span consecutive introns and exons Things.
  • One example is that for the sixth amino acid, for the following nucleotide sequence: 5′-CGTTGTGTGGTTATCGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 8).
  • antisense oligonucleotide derivative of the present invention having a base sequence that is intermittent or partially complementary to the DNA or RNA chain of WT1 is not particularly limited with respect to the corresponding region. Also include those such as ribozymes having the function of cleaving the DNA or RNA strand of WT1.
  • the structure of the antisense oligonucleotide derivative used in the present invention is as shown in the chemical formula 1, wherein X is independently oxygen (0), thio (S), lower alkyl group or primary amino group. Or secondary amine. Y may independently be either oxygen (0) or zeolite (S). Z is hydrogen or a hydroxyl group.
  • B is selected from adenine, guanine, thymine, or cytosine when Z is hydrogen, and selected from adenine, guanine, peracil, or cytosine when Z is a hydroxyl group;
  • WT1 is a complementary oligonucleotide of DNA or mRNA.
  • R is independently hydrogen, a dimethoxytrityl group or a lower alkyl group. 11 is 7 — 2 8 Chemical formula 1
  • Preferred antisense oligonucleotide derivatives include not only unmodified antisense oligonucleotides but also modified antisense oligonucleotides. Examples of such modifications include lower alkylphosphonate modifications such as the above-mentioned methylphosphonate type or ethylphosphonate type, and other phosphorothioate modifications or phosphoroamidate modifications. See Formula 2.) 0
  • antisense oligonucleotide derivatives are usually: Can be obtained by law.
  • the antisense oligonucleotide in Chemical Formula 1 wherein X and Y are 0 and Z is hydrogen or a hydroxyl group can be easily synthesized by a commercially available DNA synthesizer (for example, manufactured by Applied Biosystems).
  • the antisense oligodeoxyribonucleotide in which Z is hydrogen can be synthesized by a solid phase synthesis method using phosphoramidite, a solid phase synthesis method using hydrogen phosphonate, or the like.
  • the modified phosphoric acid triester in which X is a lower alkoxy group can be prepared by a conventional method, for example, by converting an oligonucleotide obtained by chemical synthesis into a DMFZ methanol Z 2,6—lutidine solution of a silk mouth lid. (Moody HM, et al., Nucleic Acids Res., 17, 4769-4782 (1989)).
  • Modified alkyl phosphonates in which X is an alkyl group can be obtained by a conventional method, for example, using a phosphoramidite (MA Dorman, et al. al., Tetrahedron, 40, 95-102 (1984); KL Agar al and F. Rift in a, Nucleic Acids Res., 6, 3009-3024 (1979)).
  • a phosphoramidite MA Dorman, et al. al., Tetrahedron, 40, 95-102 (1984); KL Agar al and F. Rift in a, Nucleic Acids Res., 6, 3009-3024 (1979)
  • the modified phosphorothioate in which X is S can be obtained by a conventional method, for example, a solid phase synthesis method using zeolite (A. Stein, et.al., Nucleic Acids Res., 16, 3209-3221 (1988)) or tetra It can be obtained by a solid phase synthesis method using ethylthiuram disulfide (H. Vu and BL Hirschebein, Tetrahedron Letters, 32, 3005-3008 (1991)).
  • a modified phospholipid dithioate in which both X and Y are s can be obtained by a solid-phase synthesis method, for example, by converting a bisamidite into a thioamidite and acting on the thioamidite (WK-D. Brill, et. , J. Am. Chem. Soc., 111, 2321-2322 (1989)).
  • the phosphoramidate-modified product in which X is a primary amine or a secondary amine can be obtained by a solid phase synthesis method, for example, by treating hydrazine phosphonate with a primary or secondary amine.
  • a solid phase synthesis method for example, by treating hydrazine phosphonate with a primary or secondary amine.
  • B. Froe hler, et.al. Nucleic Acids Res., 16, 4831-4839 (1988) Alternatively, it can be obtained by oxidizing amidite with tert-butyl hydroperoxide (H. Ozaki, et.al., Tetrahedron Lett., 30, 5899-5902 (1989)).
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention acts at any stage from genomic DNA to mature mRNA, and inhibits the expression of leukemia cells by suppressing its expression. Therefore, the antisense oligonucleotide of the present invention is expected to be effective for treating leukemia.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention is considered to specifically inhibit the growth of leukemia cells without inhibiting the growth of normal bone marrow cells. Therefore, the cells of leukemia patients, for example, bone marrow cells or peripheral blood are taken out of the body, and treated in vitro with the antisense oligonucleotide derivative of the present invention to inhibit the growth of leukemia cells, and to obtain normal bone marrow cells. It can also be applied to “autologous bone marrow transplantation” and “autologous peripheral blood stem cell transplantation”, such as returning only cells to the body.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be used as an external preparation such as a liniment or a poultice by mixing with a suitable base material which is inactive against the derivative.
  • excipients can be a freeze-dried preparation such as a liquid preparation, a nasal drop and the like. These can be prepared according to a conventional method.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention is applied directly to the affected area of the patient, or is adapted to the patient so as to be able to reach the affected area as a result of intravenous administration or the like.
  • An antisense encapsulating material that further enhances durability and membrane permeability can be used.
  • Liposo And L-lysine, lipids, lipids, cholesterol, ribofectin or derivatives thereof can be used.
  • the dosage of the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be suitably adjusted and used according to the condition, age, sex, body weight, etc. of the patient, and can be used as a preferable amount.
  • various administration methods such as oral, intramuscular, intraperitoneal, intradermal, subcutaneous, intravenous, intraarterial, and rectal administration. Any suitable method can be used depending on the administration method.
  • the oligodeoxyribonucleotides (SEQ ID NOS: 1 to 8) used below were synthesized using an automated synthesizer (Applied Biosystems), purified by high performance liquid chromatography, and ethanol precipitation was performed. Performed three times and resuspended in phosphate buffer.
  • the synthesized oligonucleotides are as follows.
  • SEQ ID NO: 1 Sense sequence of transcriptional cabling site (SE1)
  • SE1 Sense sequence of transcriptional cabling site
  • AS1 Antisense sequence of transcriptional cabling site
  • SEQ ID NO: 3 Sense sequence of transcriptional binding region (SE2) SEQ ID NO .: Antisense sequence of transcriptional binding region (AS
  • SEQ ID NO: 6 Antisense sequence of translation initiation region (AS 3) SEQ ID NO: 7 Sense sequence of exon 6 (SE 4)
  • FIG. 1 shows the results. As is clear from this figure, each of the antisense oligonucleotides inhibited cell proliferation more strongly than the corresponding sense oligonucleotides. .
  • Example 2 The same experiment as in Example 1 was performed, except that the oligonucleotides SE 3 and AS 3 were added at various concentrations. As is evident from Fig. 2, the sense oligonucleotide (SE3) hardly inhibited the cell growth, whereas the antisense oligonucleotide (AS3) caused the cell growth in a concentration-dependent manner. Was inhibited.
  • SE3 sense oligonucleotide
  • AS3 antisense oligonucleotide
  • Example 4 The same experiment as in Example 1 was performed, except that the oligonucleotides SE4 and AS4 were added at various concentrations. As is evident from Fig. 3, the sense oligonucleotide (SE4) hardly inhibited cell growth, whereas the antisense oligonucleotide (AS4) inhibited cell growth in a concentration-dependent manner. did.
  • SE4 sense oligonucleotide
  • AS4 antisense oligonucleotide
  • Example 4 The same experiment as in Example 1 was performed. However, the cells were cultured at a density of 2.5 ⁇ 10 4 cells / "m 1 ml / well in a flat bottom 24-well plate. The oligonucleotides SE 3 and AS 3 were added. The number of surviving cells was counted every day for 2 to 5 days, and the results are shown in Fig. 4. As is clear from the figure, when the sense oligonucleotide was added, cell proliferation was observed as in the control. When antisense oligonucleotides were added, cell proliferation was suppressed.
  • Example 2 The same experiment as in Example 1 was performed. However, as oligonucleotides, SE 3 and AS 3 and antisense oligogonucleotide 5′-AGAGAAGAAGG GAACCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 20) for the myelin peroxidase (MPO) gene (MPO—AS) And antisense oligonucleotide 5'-GCGTGGGCAGCCTGGGAA-3 '(SEQ ID NO: 21) (FV-AS) against blood coagulation factor V (FV) was used. As is clear from FIG. 5, cell proliferation was inhibited only when AS 3 was used.
  • MPO myelin peroxidase
  • FV-AS blood coagulation factor V
  • Example 2 The same experiment as in Example 1 was performed, except that WT1 expression-positive cell lines HEL and THP-1 and WT1 expression-negative cell line U933 were used as experimental cells.
  • the same eight oligonucleotides as in Example 1 were used as the oligonucleotides.
  • HEL FIG. 6
  • THP-1 FIG. 7
  • cell proliferation was inhibited by the antisense oligonucleotide.
  • the WT1-expressing negative cell line U933 FIG. 8
  • the addition of antisense oligonucleotide did not inhibit the cell growth.
  • Example 7 Bone marrow cells from leukemia patients and healthy volunteers are heparinized
  • GM contains CSF (100 ng / l) and IL-13 (100 nit Zml) —1.5 X 10 0 mononuclear cells in a flat bottomed 96-well plate containing MEM Six plates were plated in a volume of 100 to 1 noel.
  • the treatment with oligonucleotides (SE3 and AS3) was the same as in Example 1.
  • methylcellulose medium [1.2% methylcellulose-containing MEM, 20% FCS, GM-CSF (100 ng / ml), G-CSF (100 ng / ml) ml), IL-3 (100 ml) and SCF (100 ng / ml)].
  • Culture was performed in triplicate. On the 14th day, leukemia cell colonies (CFU-L) and granulocyte-macrophage colonies (CFU-M) were counted.
  • FIG. 9 shows leukemia colony formation in samples from four leukemia patients (two acute myeloid leukemia (AML) and two chronic myeloid leukemia (CML)). It can be seen that the appearance of colonies was inhibited by the antisense oligonucleotide.
  • FIG. 10 shows the appearance of granulocyte macrophage colonies in samples from healthy volunteers. Colony formation was not inhibited by antisense oligonucleotides.
  • Nowell K566 cells (A) or fresh leukemia cells (B) from a patient with AML were added to random oligonucleotides, origonucleotides.
  • AS1, oligonucleotide AS2 or oligonucleotide AS3 was added at a concentration of 200 ⁇ g Zml, and further every 24 hours at a concentration of 100 / gZml. 4 days after initial processing by Origo Nuku Leotide Cells were harvested, washed with PBS, and lysed with Laemli's sample buffer.
  • the densities of the bands corresponding to the WT1 protein and actin were determined by densitometer CS—900 (Shizu, Kyoto), and
  • the 1 Zactin ratio was calculated.
  • FIGS. 11A and 11B The results are shown in FIGS. 11A and 11B.
  • lane 1 shows the case where random oligonucleotide was added
  • lane 2 shows the case where oligonucleotide AS3 was added
  • lane 3 shows the case where oligonucleotide ASI was added
  • Lane 4 shows the results obtained when the oligonucleotide AS 2 was added.
  • A uses K562 cells
  • B uses fresh leukemia cells from patients with AML. The result of the case where there was is shown.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is effective for inhibiting the proliferation of leukemia cells, and is therefore expected as a novel therapeutic agent for leukemia.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • TGGTATCCTC GACCAGGGCC ACAGGCAGTG CTCGGCGGAG TGGCTCCAGG AGHACCCGC 60 TCCCTGCCGG GCTTCGTATC CAAACCCTCC CCTTCACCCC TCCTCCCCAA ACTGGGCGCC 120 AGGATGCTCC GGCCGGMTA TACGCAGGCT TTGGGCGTIT GCCMGGGH TTCTTCCCTC 180
  • CTAAACTAGC CGCTGTTTTC CCGGCTTMC CGTAGAAGAA HAGATAHC CTCACTGGAA 240
  • GCMCTCCCG GCCACCCAAC TGAGGGACGT TCGCTTTCAG TCCCGACCTC TGGAACCCAC 420
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • GTGAAAAGCC TITCAGCTGT CGGTGGCCAA GTTGTCAGM AAAGTITGCC CGGTCAGATG 60 TTAGTCCG CCATCACMC ATGCATCAGA GAAACATGAC CAAACTCCAG CTGGCGCTIT 120 GAGGGGTCTC CCTCGGGGAC CGTTCAGTGT CCCAGGCA 158 SEQ ID NO: 20
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

明 細 書 ゥィルムス腫瘍遺伝子 （WT 1 ) に対するアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤 発明の分野
本発明はァンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体を含んで成る、 白血病細胞増殖阻害剤に関する。 背景技術
ウィルムス（Wilms) 腫瘍は、 染色体 1 1 p 1 3 に位置するウィル ムス腫瘍遺伝子 （WT 1 ) の両対立遺伝子の不活性化により生ずる 小児腎腫瘍である（Call KM et al. , Cell 60： 509， 1990)。 WT 1 の非コー ド上流配列 （C. E. Camphellら、 Oncogene 9： 583- 595， 199 4)及びィ ン ト ロ ンを含むコー ド領域（D. A. Haberら、 Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 88： 9618-9622, (1991))はすでに報告されており、 腫瘍 等の増殖及び分化に関与することが予想される（D.A. Haberら、 前掲
) o
しかしながら、 WT 1 が白血病細胞の増殖に関与しており、 WT 1 に対するアンチセ ンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体が白血病細胞の 増殖を抑制 · 阻害することは知られていない。 発明の開示
従って本発明は、 ウィルムス（Wilms) 腫瘍遺伝子 （WT 1 ) に対 するアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体を含んで成る白血病細 胞の増殖阻害剤を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1 は、 白血病細胞株 K 5 6 2の増殖に対するォリ ゴヌク レオチ ドの阻害効果を示すダラフである。
図 2 は、 オリ ゴヌク レオチ ド S E 3及び A S 3の濃度と、 白血病 細胞株 K 5 6 2の増殖との関連を示すグラフである。
図 3 は、 オリ ゴヌク レオチ ド S E 4及び A S 4の濃度と、 白血病 細胞株 K 5 6 2の増殖との関係を示すグラフである。
図 4 は、 オリ ゴヌク レオチ ド S E 3及び A S 3が白血病細胞株 K 5 6 2の増殖に及ぼす効果を経時的に示すグラフである。
図 5 は、 種々のオリ ゴヌク レオチ ドが白血病細胞株 K 5 6 2の増 殖に及ぼす影響を示すダラフである。
図 6 は、 W T 1発現陽性の白血病細胞株 H E Lの増殖に対する種 々のオリ ゴヌク レオチ ドの阻害効果を示す ラフである。
図 7 は、 W T 1発現陽性の白血病細胞株 T H P— 1 の増殖に対す る種々のオリ ゴヌク レオチ ドの阻害効果を示すグラフである。
図 8 は、 W T 1発現陰性の悪性リ ンパ腫細胞株 U 9 3 7の増殖に 対する種々のオリ ゴヌク レオチ ドの阻害効果を示すダラフである。
図 9 は、 白血病患者由来の骨髄単核球細胞からの白血病細胞コ口 ニーの形成に対するォリ ゴヌク レオチ ド S E 3及び A S 3の効果を 示すグラフである。
図 1 0 は、 健康な志願者由来の骨髄単核球細胞からの顆粒球マク 口ファージコロニーの形成に対するオリ ゴヌ ク レオチ ド S E 3及び A S 3の効果を示すグラフである。
図 1 1 において、 Aは K 5 6 2細胞の培養液に種々の W T 1 ア ン チセンスォリ ゴヌク レオチ ドを添加した場合に細胞中の W T 1 蛋白 質のレベルが低下したことを示す電気泳動図の図面代用写真であり 、 Bは A M Lを有する患者からの新鮮な白血病細胞に W T 1 ア ンチ センスオリ ゴヌク レオチ ドを添加した場合に細胞中の WT 1蛋白質 のレベルが低下したことを示す。 具体的な説明
本発明は、 WT 1 に対するアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導 体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤を提供する。 本発明で使用す るアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体は、 例えば、 WT 1 の転 写キヤ ッ ビング部位に対するもの、 翻訳開始領域に対するもの、 ェ クソンに対するものまたはイン トロンに対するものなどの WT 1 に 対するァンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体である。
例えば WT 1 の転写キヤッピング部位を含む領域のセンス D N A 鎖の塩基配列は配列番号 ： 9で表わされ、 また WT 1 のコー ド領域 のェクソン 1 〜 1 0のセンス D N A鎖の塩基配列は配列番号 ： 1 0 〜 1 9で表わされるが、 本発明はこのような WT 1 のセンス D N A 鎖の塩基配列に対するァンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体を用 いる。 このアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体は、 通常 WT 1 のアンチセンス D N A鎖または R N A鎖の連続した 5〜 5 0個、 好 ま しく は、 9〜 3 0個の塩基または WT 1 の D N A鎖または R N A 鎖に結合することができるものであれば、 断続的または部分的に相 補的な 5〜 7 0個、 好ま しく は、 9〜 5 0個の塩基から成るァンチ センスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体である。
転写キヤ ッ ビング部位に対するものとしては、 例えば次の塩基配 列 ： 5 ' -AGGGTCGAATGCGGTGGG -3' (配列番号 ： 2 ) 及び 5 ' -TCA AATAAGAGGGGCCGG- 3 ' (配列番号 ： 4 ) などのものが挙げられる。 また、 翻訳開始領域に対するものと しては、 翻訳開始コ ドン A T G 並びにその上流及び/又は下流を含む領域に対するァンチセンスォ リ ゴヌク レオチ ド誘導体が挙げられ、 例えば次の塩基配列 ： 5 ' - G TCGGAGCCCATTTGCTG- 3 ' (配列番号 ： 6 ) などが挙げられる。
また、 W T 1 のコー ド領域には 1 0個のェクソンが含まれており 、 本発明のアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体は、 これらのェ クソンのいずれかに含まれる配列に対するもの、 又はスプライシン グ後に連続するいずれか 2個のェクソンにわたる配列に対するもの あるいは、 連続するィ ン トロ ンとェクソンにわたる配列に対するも の、 全てのィ ン トロン及び 3 ' ， 5 ' 側非コー ド領域の配列に対す るものである。 1例と して、 第 6ェク ソ ンに対するものであり、 次 の塩基配列 ： 5 ' -CGTTGTGTGGTTATCGCT- 3 ' (配列番号 ： 8 ) に対 するものが挙げられる。
さらに、 WT 1 の D N A鎖または R N A鎖と断続的または部分的 に相補的な塩基配列を有する本発明のァンチセンスオリ ゴヌク レオ チ ド誘導体は対応する領域については特に問わないが、 これらの中 には、 WT 1 の D N A鎖または R N A鎖を切断する機能を有するリ ボザィムのようなものも含まれる。
本発明において使用されるアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導 体の構造は、 化学式 1 に示したとおりであるが、 Xは独立して酸素 (0) 、 ィォゥ （ S ) 、 低級アルキル基あるいは一級ァミ ンまたは 二級ァミ ンのいずれでもよい。 Yは独立して酸素 （0) あるいはィ ォゥ （ S ) のいずれでもよい。 Zは水素または水酸基である。 Bは Zが水素のときアデニン、 グァニン、 チミ ン、 あるいはシ ト シンの いずれかから選ばれ、 Zが水酸基のときアデニン、 グァニン、 ゥラ シルあるいはシ トシンのいずれかから選ばれ、 主と して WT 1 をコ ー ドする D N A又は mR N Aの相補的オリ ゴヌク レオチ ドである。 Rは独立して水素またはジメ トキシ ト リチル基あるいは低級アルキ ル基である。 11は 7 — 2 8である。
Figure imgf000007_0001
化学式 1
好ま しいアンチセ ンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体と しては修飾さ れていないアンチセ ンスオリ ゴヌ ク レオチ ドだけでなく、 修飾され たァンチセンスォ リ ゴヌ ク レオチ ドでもよい。 この様な修飾体と し て、 例えば前述のメ チルホスホネー ト型又はェチルホスホネー ト型 のような低級アルキルホスホネー ト修飾体、 その他ホスホロチォェ ー ト修飾体あるいはホスホロア ミ デー ト修飾体等が挙げられる （化 学式 2参照） 。 0
X— P=Y の例
0
メチルホスホネー ト CH: Ρ 0
ホスホロチォエー ト
Figure imgf000008_0001
ホスホロジチォエー ト S"一
ホスホロアミデー ト ヽ Ν—
リ ン酸卜 リエステル CH30— P
0 化学式 2
これらのアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体は次のとおり常 法によって得ることができる。
化学式 1 の X及び Yが 0、 Zが水素又は水酸基であるア ンチセン スオリ ゴヌ ク レオチ ドは市販の D N A合成装置 （例えば Applied Bi osystems社製など） によって容易に合成される。
Zが水素であるアンチセンスオリ ゴデォキシリ ボヌ ク レオチ ドの 合成法はホスホロァ ミ ダイ トを用いた固相合成法、 ハイ ドロジェ ン ホスホネー トを用いた固相合成法などで得ることができる。
例えは、 T.Atkinson, M. Smith, in Oligonucleotide Synthesis ： A Practical Approach, ed. M. J. Gait, IRL Press, 35-81 (1984) ； M. H. Caruthers, Science, 230, 281 (1985) ； A. Kume, M. Fujii , M. Sekine, . Hata, J. Org. Chem. , 49， 2139 (1984) ； B. C. Froehl er， . atteucci, Tetrahedron Lett. , 27, 469 (1986) ； P. J. Gar egg, I. Lindh, T. Regberg, J. Stawinski, R. Stromberg, C. Henrich son, ibid, 27, 4051 (1986) ；
B. S. Sproat, M. J. Gait, in Oligonucleotide Synthesis ： A Pra ctical Approach, ed. M. J. Gait, IRL Press, 83-115 (1984) ； S. L . Beaucage and . H. Caruthers, Tetrahedron Lett. , 22， 1859-186 2 (1981) ； M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. , 21， 719-722 (1980) ； M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. , 103, 3185-3191 (1981)を参照のこと。
Xが低級アルコキシ基である リ ン酸 ト リエステル修飾体は、 常法 、 例えば化学合成で得られたォリ ゴヌ ク レオチ ドを ト シルク 口 リ ド の DMFZメ タノール Z 2， 6 —ルチジン溶液で処理することによ り得るこ とができる （Moody H. M.， et al. , Nucleic Acids Res. , 17, 4769-4782 (1989)) 。
Xがアルキル基であるアルキルホスホネー ト修飾体は、 常法、 例 えばホスホア ミ ダイ トを用いて得ることができる （M. A. Dorman, et . al. , Tetrahedron, 40， 95-102 (1984) ； K. L. Agar al and F. Rift in a, Nucleic Acids Res.， 6, 3009-3024 (1979)) 。
Xが Sであるホスホロチォエー ト修飾体は、 常法、 例えばィォゥ を用いた固相合成法（ A. Stein, et.al.， Nucleic Acids Res. , 16 ， 3209-3221 (1988)) あるいはテ トラエチルチウラム ジスルフィ ドを用いて、 固相合成法により得ることができる （H.Vu and B. L. H irschbein, Tetrahedron Letters, 32， 3005-3008 (1991)) 。
X， Yがともに sであるホスホ口ジチォエー ト修飾体は、 例えば ビスアミダイ トをチォアミダイ トに変換しィォゥを作用させること により固相合成法により得ることができる （W.K. -D. Brill, et.al. ， J. Am. Chem. Soc. , 111, 2321-2322 (1989))。
Xがー級アミ ンあるいは二級ァミ ンであるホスホロアミデー ト修 飾体は、 例えばハイ ドロジヱンホスホネー トを一級あるいは二級ァ ミ ンで処理することにより固相合成法で得ることができる （B. Froe hler, et.al. Nucleic Acids Res. , 16， 4831-4839 (1988))。 ある いは、 アミダイ トを t e r t 一ブチルハイ ドロパーォキサイ ドで酸 化しても得ることができる （H.Ozaki, et.al., Tetrahedron Lett. ， 30， 5899-5902 (1989)) 。
Zが水酸基であるアンチセンスオリ ゴリボヌク レオチ ドの合成法 は、 アンチセンスオリ ゴデォキシリボヌク レオチ ドに比べて、 リボ ース （糖） に 2 ' —水酸基があるためその保護を行わなければなら ない点できわめて複雑ではあるが、 保護基およびリ ン酸化方法を適 宜選択することによつて合成することができる （微生物学基礎講座 8巻、 遺伝子工学、 大塚栄子、 三浦一伸共著、 安藤忠彦、 坂口健二 編、 1 9 8 7年 1 0月 1 0 日、 共立出版株式会社発行参照） 。
精製および純度確認は、 高速液体クロマ トグラフィー、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動で行う ことができる。 分子量の確認は、 E 1 ectrospray Ionization Mass Spectrometry又は Fast Atom Bonba rdment-Mass Spectrometryで行う こと力くできる。
本発明のァンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体は、 genomic DN A から matureな mRNAに至るいかなる段階においても作用し、 その発 現を抑制することによつて白血病細胞の増殖を阻害すると考えられ る。 従って、 本願発明のアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ドは白血病 の治療のために有効であると期待される。
さらに本発明のアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体は、 後述 するとおり、 正常な骨髄細胞の増殖を阻害することなく、 特異的に 白血病細胞の増殖を阻害すると考えられる。 したがって、 白血病患 者の細胞、 例えば骨髄細胞または末梢血を体外へ取り出し、 本発明 のアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体で in vitro処理して白血 病細胞の増殖を阻害しておいて、 正常な骨髄細胞だけを再び体内に 戻すというような 「自家骨髄移植」 「自家末梢血幹細胞移植」 への 応用も可能である。
本発明のアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体は、 それらに対 して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、 パップ剤などの外用剤 とすることができる。
また、 必要に応じて、 賦形剤、 等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤 、 防腐剤、 無痛化剤等を加えて錠剤、 散剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 リボソームカプセル剤、 注射剤、 液剤、 点鼻剤など、 さ らに凍結乾 燥剤とすることができる。 これらは常法に従って調製することがで ¾ 。
本発明のアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体は患者の患部に 直接適用するか、 または血管内に投与するなどして結果的に患部に 到達し得るように患者に適応させる。 さ らに持続性、 膜透過性を高 めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。 例えば、 リポゾ ーム、 ポ リ 一 L一 リ ジ ン、 リ ピ ッ ド、 コ レステロール、 リ ボフ ェ ク チン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド誘導体の投与量は、 患 者の状態、 年齢、 性別、 体重などに応じて適宜調整し好ま しい量を 用いることができる。 また、 その投与方法は、 患者の状態、 薬剤形 態などに応じ、 経口投与、 筋肉内投与、 腹腔内投与、 皮内投与、 皮 下投与、 静脈内投与、 動脈内投与、 直腸投与などの種々の投与方法 から適宜好ま しい方法を用いることができる。
以下本発明を実施例において詳しく説明する。 実施例
合成例 1.
以下に使用するォリ ゴデォキシリボヌク レオチ ド （配列番号 ： 1 〜 8 ) を、 自動合成装置 （Applied Biosystems) を用いて合成し、 高速液体ク口マ トグラフィ一により精製し、 エタノール沈澱を 3回 行い、 そしてリ ン酸緩衝液に懸濁した。 合成したオリ ゴヌク レオ チ ドは次の通りである。
配列番号 1 転写キヤ ッ ビング部位のセンス配列 （ S E 1 ) 配列番号 2 転写キヤ ッ ビング部位のアンチセ ンス配列 （A S 1 )
. 配列番号 3 転写キヤ ッ ビング領域のセンス配列 （ S E 2 ) 配列番号 転写キヤ ッ ビング領域のアンチセンス配列 （A S
2 )
配列番号 5 翻訳開始領域のセンス配列 （ S E 3 )
配列番号 6 翻訳開始領域のア ンチセンス配列 （ A S 3 ) 配列番号 7 ェク ソ ン 6のセ ンス配列 （ S E 4 )
配列番号 8 ェク ソ ン 6のア ンチセンス配列 （A S 4 ) 実施例 1 .
W T 1発現陽性の白血病細胞株 K 5 6 2を 5 x 1 0 4 個 Zml、 1 0 0 fi 1 ゥエルの量で、 平底 9 6 —ゥエルプレー ト内の、 ゥシ胎 児血清 （F C S ) を含有しない R P M I 1 6 4 0培地に接種した。 各オリ ゴヌク レオチ ドを、 3連のゥエルに、 最終濃度が 2 0 0 g Zmlとなるように添加した。 2時間のイ ンキュベーシ ョ ンの後、 各 ゥエルに最終濃度が 1 0 %となるように F C Sを添加した。 2 4時 間毎に、 前記の量の半分のォリ ゴヌク レオチ ドを培養物に添加した o
9 6時間培養した後、 色素排除法により生存細胞を計数した。 対 照培養物として、 ヌ ク レオチ ドを含有しない同じ体積の P B Sを添 加し、 そしてこの対照培養物の細胞数を 1 0 0 %と した。
この結果を図 1 に示す。 この図から明らかな通り、 いずれのア ン チセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドも、 対応するセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドに比べて強く細胞の増殖を阻害した。 .
実施例 2 .
実施例 1 と同様の実験を行ったが、 オリ ゴヌク レオチ ド S E 3及 び A S 3を種々の濃度で添加した。 図 2から明らかな通り、 センス オリ ゴヌ ク レオチ ド （ S E 3 ) は細胞の増殖をほとんど阻害しなか つたが、 アンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド （ A S 3 ) は濃度依存的 に細胞の増殖を阻害した。
実施例 3 .
実施例 1 と同様の実験を行ったが、 オリ ゴヌ ク レオチ ド S E 4及 び A S 4を種々の濃度で添加した。 図 3から明らかな通り、 センス オリ ゴヌ ク レオチ ド （ S E 4 ) は細胞の増殖をほとんど阻害しなか つたが、 アンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド （A S 4 ) は濃度依存的 に細胞の増殖を阻害した。 実施例 4
実施例 1 と同様の実験を行った。 但し、 細胞を、 平底 2 4 —ゥェ ルプレー ト中で 2. 5 X 1 0 4 個 /"m 1 ml/ゥエルの量で培養し た。 オリ ゴヌク レオチ ド S E 3及び A S 3を添加し、 2〜 5 日間に 毎日生存細胞数を計数した。 結果を図 4 に示す。 図から明らかな通 り、 センスオリ ゴヌク レオチ ドを添加した場合、 対照の場合と同様 に細胞の増殖が見られたが、 アンチセ ンスオリ ゴヌク レオチ ドを添 加した場合、 細胞の増殖は抑制された。
実施例 5.
実施例 1 と同様の実験を行った。 但し、 オリ ゴヌク レオチ ドとし て、 S E 3及び A S 3、 並びにミエ口パーォキシダーゼ （ M P O ) 遺伝子に対するァンチセンスォリ ゴヌク レオチ ド 5 ' -AGAGAAGAAGG GAACCCC- 3 ' (配列番号 ： 2 0 ) (M P O— A S ) 及び血液凝固因 子 V ( F V) に対するアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ド 5 ' -GCGTG GGCAGCCTGGGAA- 3 ' (配列番号 ： 2 1 ) (F V— A S ) を用いた。 図 5から明らかなように、 A S 3を用いた場合のみ細胞の増殖が阻 害された。
実施例 6.
実施例 1 と同様の実験を行ったが、 実験細胞として、 WT 1発現 陽性細胞株 H E L及び T H P— 1、 並びに WT 1発現陰性細胞株 U 9 3 7を用いた。 オリ ゴヌク レオチ ドと しては、 実施例 1 の場合と 同じ 8種類を用いた。 WT 1発現陽性細胞系 H E L (図 6 ) 又は T H P— 1 (図 7 ) を用いた場合には、 アンチセンスオリ ゴヌク レオ チ ドにより細胞の増殖は阻害された。 これに対して、 WT 1発現陰 性細胞株 U 9 3 7 (図 8 ) を用いた場合、 ア ンチセ ンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドを添加しても細胞の増殖は阻害されなかった。
実施例 7. 白血病患者及び健康な志願者からの骨髄細胞をへパリ ン処理し、
R P M I 1 6 4 0培地に懸濁し、 そして Ficoll- Hypaque密度勾配遠 心により骨髄単核球細胞を得た。 GM— C S F ( 1 0 0 ng/ l) 及 び I L一 3 ( 1 0 0ュニッ ト Zml) を含む — MEMを入れた平底 9 6 ーゥエルプレー 卜に、 上記の単核細胞を 1. 5 X 1 0 6 個 ml 、 1 0 0 〃 1ノゥエルの量でプレー ト した。 オリ ゴヌク レオチ ド （ S E 3及び A S 3 ) による処理は実施例 1 と同様にした。
9 6時間後、 細胞を集め、 そしてメチルセルロース培地 〔 1. 2 %メ チルセルロースな 一 MEM、 2 0 % F C S、 GM— C S F ( 1 0 0 ng/ml) 、 G - C S F ( 1 0 0 ng/ml) 、 I L - 3 ( 1 0 0ュ 二ッ ト ml) 及び S C F ( 1 0 ng/ml) 〕 にプレー ト した。 培養は 3連で行った。 1 4 日目に白血病細胞コロニー （C F U— L) 及び 顆粒球一マクロファージコロニー （C F U— M) を計数した。
図 9 に白血病患者 4名 （急性骨髄性白血病 （AML) 2名、 慢性 骨髄性白血病 （CML) 2名） からのサンプルでの白血病コロニー の形成を示す。 アンチセンスオリ ゴヌク レオチ ドにより コロニーの 出現が阻害されたことがわかる。 図 1 0 には、 健康な志願者からの サンプルでの顆粒球マクロファージコロニーの出現を示す。 アンチ センスオリ ゴヌク レオチ ドによってもコロニーの形成は阻害されな カヽつた。
実施例 8.
2 4 —ゥエルプレー ト中で、 5 X 1 0 細胞ノウエルの K 5 6 2 細胞 （A) 又は AM Lを有する患者からの新鮮な白血病細胞 （B) に、 ランダムオリ ゴヌク レオチ ド、 オリ ゴヌク レオチ ド A S 1 、 ォ リ ゴヌ ク レオチ ド A S 2又はオリ ゴヌク レオチ ド A S 3を 2 0 0 u gZmlの濃度で添加し、 さ らに 2 4時間毎に 1 0 0 / gZmlの濃度 で添加した。 オリ ゴヌク レオチ ドによる最初の処理から 4 日後に細 胞を収得し、 P B Sにより洗浄し、 そして Laemliのサンプル緩衝液 により細胞溶解した。
2 X 1 0 4 個の細胞からの各細胞溶解物を 5分間煮沸し、 そ して 次に 7. 5 % ドデシル硫酸ナ ト リ ウム一ポリ アク リルア ミ ドゲル中 の各レーンに適用 した。 電気泳動の後、 蛋白質をイ ンモビロン（1薦 obi Ion) ポリ ビニリデンジフルオリ ド · フィルター （Millipore Co rp. MA、 米国） に移行させた。 このフィルターを、 合成ポリべプチ ド （ァ ミ ノ酸位置 1 7 7 — 1 9 2 ； Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin (配列番号 ： 2 2 ) に対す る抗— WT 1 ポリ クローナル抗体によりプローブし、 そして次にホ ースラディ ッ シュパーォキシダーゼ一結合抗—免疫グロブリ ン抗体
(Amersham, Little Chalfont 、 英国） により処理した。 洗浄後、 フィルターを検出試薬 （Amersham, Little Chalfont 、 英国） に 1 時間浸漬し、 そして 1〜 5分間オー トラジオグラフ処理した。
T B S T 0. 0 5 % Tween 20 を含有する Tr is—緩衝液） によ り 2回洗浄した後、 フィルターを抗一ァクチンモノ クローナル抗体
(Oncogene Science Inc. , NY 、 米国） によりプローブし、 そして 上記のようにしてオー トラ ジオグラフ処理した。
WT 1 蛋白質及びァクチンに対応するバン ドの密度をデンシ トメ 一ター C S— 9 0 0 0 (シ ミ ズ、 京都） により測定し、 そして WT
1 Zァクチン比を計算した。
結果を図 1 1 の A及び Bに示す。 この図において、 レーン 1 はラ ンダムオリ ゴヌ ク レオチ ドを添加した場合、 レーン 2 はオリ ゴヌ ク レオチ ド A S 3を添加した場合、 レーン 3 はオリ ゴヌ ク レオチ ド A S I を添加した場合、 そしてレーン 4 はオリ ゴヌ ク レオチ ド A S 2 を添加した場合の結果を示す。 この図の Aは K 5 6 2細胞を用いた 場合、 そ して Bは AMLを有する患者からの新鮮な白血病細胞を用 いた場合の結果を示す。
Aから明らかなように、 K 5 6 2細胞の培地に W T 1 オリ ゴヌク レオチ ドを添加した場合、 W T 1蛋白質のレベルが有意に低下した 。 他方、 対照と してのランダムオリ ゴヌク レオチ ドは W T 1蛋白質 レベルに影響を与えなかった。 また、 Bから明らかなように、 W T 1 オリ ゴヌク レオチ ドを A M Lを有する患者から新たに単離した白 血病細胞の培地に添加した場合、 W T 1 蛋白質レベルが有意に低下 した。 これらの結果は、 W T 1 アンチセンスオリ ゴヌク レオチ ドが 、 W T 1蛋白質レベルの低下を介して白血病細胞の増殖を特異的に 阻害したことを明瞭に示している。 産業上の利用可能性
以上の通り、 本発明のアンチセンスオリ ゴヌク レオチ ドは白血病 細胞の増殖の阻害のために有効であり、 従って新規な白血病治療剤 と して期待される。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
CCCACCGCAT TCGACCCT 18 配列番号： 2
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類.：合成 DNA
配列
AGGGTCGAAT GCGGTGGG 18 配列番号： 3
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
CCGGCCCCTC HATTTGA 18 配列番号： 4
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA 配列
TCAAATAAGA GGGGCCGG 18 配列番号： 5
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
CAGCAMTGG GCTCCGAC 18 配列番号： 6
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列-
GTCGGAGCCC ATTTGCTG 18 配列番号： 7
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
AGCGATAACC ACACMCG 18 配列番号： 8
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成 D N A
配列
CGTTGTGTGG HATCGCT 18 配列番号： 9
配列の長さ ： 1 2 7 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 D N A
配列
TGGTATCCTC GACCAGGGCC ACAGGCAGTG CTCGGCGGAG TGGCTCCAGG AGHACCCGC 60 TCCCTGCCGG GCTTCGTATC CAAACCCTCC CCTTCACCCC TCCTCCCCAA ACTGGGCGCC 120 AGGATGCTCC GGCCGGMTA TACGCAGGCT TTGGGCGTIT GCCMGGGH TTCTTCCCTC 180
CTAAACTAGC CGCTGTTTTC CCGGCTTMC CGTAGAAGAA HAGATAHC CTCACTGGAA 240
AGGGAAACTA AGTGCTGCTG ACTCCMTTT TAGGTAGGCG GCAACCGCCT TCCGCCTGGC 300
GCAAACCTCA CCMGTAAAC MCTACTAGC CGATCGAAAT ACGCCCGGCT TATAACTGGT 360
GCMCTCCCG GCCACCCAAC TGAGGGACGT TCGCTTTCAG TCCCGACCTC TGGAACCCAC 420
AAAGGGCCAC CTCTTTCCCC AGTGACCCCA AGATCATGGC CACTCCCCTA CCCGACAGH 480
CTAGAGCAAG AGCCAGACTC AAGGGTGCAA AGCAAGGGTA TACGCHCH TGAAGCTTGA 540
CTGAGT CTT TCTGCGCTTT CCTGAAGHC CCGCCCTCH GGAGCCTACC TGCCCCTCCC 600
TCCAAACCAC TCTTITAGAT TMCAACCCC ATCTCTACTC CCACCGCAH CGACCCTGCC 660
CGGACTCACT GCTACTGAAC GGACTCTCCA GTGAGACGAG GCTCCCACAC TGGCGAAGGC 720
MGAAGGGGA GGTGGGGGGA GGGTTGTGCC ACACCGGCCA GCTGAGAGCG CGTGTTGGGT 780
TGAAGAGGAG GGTGTCTCCG AGAGGGACGC TCCCTCGGAC CCGCCCTCAC CCCAGCTGCG 840
AGGGCGCCCC CAAGGAGCAG CGCGCGCTGC CTGGCCGGGC TTGGGCTGCT GAGTGAATGG 900
AGCGGCCGAG CCTCCTGGCT CCTCCTCTTC CCCGCGCCGC CGGCCCCTCT TATTTGAGCT 960
TTGGGMGCT GAGGGCAGCC AGGCAGCTGG GGTMGGAGT TCMGGCAGC GCCCACACCC 1020
GGGGGCTCTC CGCMCCCGA CCGCCTGTCG CTCCCCCACT TCCCGCCCTC CCTCCCACCT 1080 CCC； A€ CCGCATACCCGCCCC TAA-
Figure imgf000021_0001
1272
1260
1200
AC8 CCCS i csA CGGCGCAOT CCCCAACCAC TCATTCMGC ATGAGGATCC CATGGGCCAG CAGGGCTCGC 120 GG 123 配列番号： 1 2
配列の長さ ： 1 0 3
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DN A
配列の特徵： WT 1遺伝子のェクソン 3
配列
GTGAGCAGCA GTACTCGGTG CCGCCCCCGG TCTATGGCTG CCACACCCCC ACCGACAGCT 60 GCACCGGCAG CCAGGCT TG CTGCTGAGGA CGCCCTACAG CAG 103 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 7 8 .
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列の特徵： WT 1遺伝子のェクソン 4
配列
TGACAATTTA TACCAAATGA CATCCCAGCT TGAATGCATG ACCTGGAATC AGATGAACTT 60 AGGAGGCACC HAAAGGG 78 配列番号： 1 4
配列の長さ ： 5 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列の特徴： WT 1遺伝子のェクソン 5
配列 AGTTGCTGCT GGGAGCTCCA GCTCAGTGM ATGGACAGAA GGGCAGAGCA A 51 配列番号： 1 5
配列の長さ ： 9 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 D N A
配列の特徴： WT 1遺伝子のェクソン 6
配列
CCACAGCACA GGGTACGAGA GCGATAACCA CACAACGCCC ATCCTCTGCG GAGCCCAATA 60 CAGAATACAC ACGCACGGTG TCTTCAGAGG CATTCAG 97 配列番号： 1 6
配列の長さ ： 1 5 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 D N A
配列の特徵： WT 1遺伝子のェクソン 7
配列
GATGTGCGAC GTGTGCCTGG AGTAGCCCCG ACTCTTGTAC GGTCGGCATC TGAGACCAGT 60 GAGAAACGCC CCTTCATGTG TGCTTACCCA GGCTGCAATA AGAGATATTT TMGCTGTCC 120 CACHACAGA TGCACAGCAG GMGCACACT G 151 配列番号： 1 7
配列の長さ ： 9 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 D N A
配列の特徴： WT 1遺伝子のェクソン 8
配列 GTGAGAAACC ATACCAGTGT GACITCAAGG ACTGTGMCG AAGGITITCT CGTTCAGACC 60 AGCTCAAAAG ACACCAAAGG AGACATACAG 90 配列番号： 1 8
配列の長さ ： 9 3
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 D N A
配列の特徵： WT 1遺伝子のェクソン 9
配列
GTGTGAAACC A1TCCAGTGT AAAACTTGTC AGCGAAAGH CTCCCGGTCC GACCACCTGA 60 AGACCCACAC CAGGACTCAT ACAGGTAAAA CM 93 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 1 5 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 D N A
配列の特徴： WT 1遺伝子のェクソン 1 0の一部分
配列
GTGAAAAGCC (TITCAGCTGT CGGTGGCCAA GTTGTCAGM AAAGTITGCC CGGTCAGATG 60 TTAGTCCG CCATCACMC ATGCATCAGA GAAACATGAC CAAACTCCAG CTGGCGCTIT 120 GAGGGGTCTC CCTCGGGGAC CGTTCAGTGT CCCAGGCA 158 配列番号： 2 0
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 D N A
配列 AGAGAAGAAG GGAACCCC 18 配列番号： 2 1
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 D N A
配列
GCGTGGGCAG CCTGGGAA 18 配列番号： 2 2
配列の長さ ： 1 6
配列の型：アミノ酸
配列の種類：合成ペプチド
配列
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin
5 10 15

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ウイルムス腫瘍遺伝子 （W T 1 ) に対するアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤。
2 . 前記アンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体が、 ウィルムス 腫瘍遺伝子の転写キヤ ッ ビング部位の連続する少なく と も 9個のヌ ク レオチ ドに対するアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドである、 請求 項 1 に記載の白血病細胞増殖阻害剤。
3 . 前記アンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体が、 次の塩基配 列 ：
5 ' -AGGGTCGAATGCGGTGGG- 3 ' (配列番号 ： 2 ) 又は
5 ' -TCAAATAAGAGGGGGCGG- 3 ' (配列番号 ： 4 )
を有する、 請求項 2 に記載の白血病細胞増殖阻害剤。
4 . 前記アンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体が、 ウィルムス 腫瘍遺伝子の翻訳開始領域の連続する少なく とも 9個のヌ ク レオチ ドに対するアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドである、 請求項 1 に記 載の白血病細胞増殖阻害剤。
5 . 前記アンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドが、 次の塩基配列 ： 5 ' -GTCGGAGCCCATTTGCTG- 3 ' (配列番号 ： 6 )
を有する、 請求項 4 に記載の白血病細胞増殖阻害剤。
6 . 前記アンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体が、 ウィルムス 腫瘍遺伝子のェクソ ン中の連続する少なく と も 9個のヌ ク レオチ ド に対応するァンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドである、 請求項 1 に記 載の白血病細胞増殖阻害剤。
7 . 前記ェク ソ ンが第 6 ェク ソ ンである、 請求項 6 に記載の白血 病細胞増殖阻害剤。
8 . 前記アンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体が、 次の塩基配 列 ：
5 ' -CGTTGTGTGGTTATCGCT- 3 ' (配列番号 ： 8 ) を有する、 請求項 7 に記載の白血病細胞増殖阻害剤。
PCT/JP1996/001394 1995-06-01 1996-05-24 Inhibiteur de la croissance de cellules leucemiques contenant des derives oligonucleotidiques antisens agissant contre le gene de la tumeur de wilms (wt1) WO1996038176A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/952,664 US6034235A (en) 1995-06-01 1996-05-24 Growth inhibitor for leukemia cell comprising antisense oligonucleotide derivative to wilms tumor gene (WT1)
EP96914430A EP0841068B1 (en) 1995-06-01 1996-05-24 Leukemic cell growth inhibitor containing antisense oligonucleotide derivative against wilms' tumor gene (wt1)
DE69636339T DE69636339T2 (de) 1995-06-01 1996-05-24 Wachstumsinhibitor gegen leukämische zellen, der antisense-oligonukleotidderivate gegen das wilms-tumorgen enthält
AU57796/96A AU5779696A (en) 1995-06-01 1996-05-24 Leukemic cell growth inhibitor containing antisense oligonuc leotide derivative against wilms' tumor gene (wt1)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP15667295 1995-06-01
JP7/156672 1995-06-01

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09/487,874 Division US6277832B1 (en) 1995-06-01 2000-01-20 Growth inhibitor for leukemia cells comprising antisense oligonucleotide derivative to wilms tumor gene (wt1)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1996038176A1 true WO1996038176A1 (fr) 1996-12-05

Family

ID=15632793

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1996/001394 WO1996038176A1 (fr) 1995-06-01 1996-05-24 Inhibiteur de la croissance de cellules leucemiques contenant des derives oligonucleotidiques antisens agissant contre le gene de la tumeur de wilms (wt1)

Country Status (7)

Country Link
US (2) US6034235A (ja)
EP (1) EP0841068B1 (ja)
AT (1) ATE332710T1 (ja)
AU (1) AU5779696A (ja)
DE (1) DE69636339T2 (ja)
ES (1) ES2268705T3 (ja)
WO (1) WO1996038176A1 (ja)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999003506A1 (fr) 1997-07-16 1999-01-28 Haruo Sugiyama Medicaments contre une tumeur solide, contenant des inhibiteurs de l'expression du gene (wt1) de la tumeur de wilms
WO2002079253A1 (fr) * 2001-03-22 2002-10-10 Haruo Sugiyama Peptide modifie wt1
WO2005092393A1 (ja) * 2004-03-29 2005-10-06 Haruo Sugiyama Wt1遺伝子の発現を抑制するマイクロrnaおよびその利用
US7030212B1 (en) 1998-07-31 2006-04-18 Haruo Sugiyama Tumor antigen based on products of the tumor suppressor gene WT1
US7063854B1 (en) 1998-09-30 2006-06-20 Corixa Corporation Composition and methods for WTI specific immunotherapy
US7115272B1 (en) 1998-09-30 2006-10-03 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US7144581B2 (en) 2000-10-09 2006-12-05 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US7323181B2 (en) 1998-09-30 2008-01-29 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US7329410B1 (en) 1998-09-30 2008-02-12 Corixa Corporation Compositions and method for WT1 specific immunotherapy
US7553494B2 (en) 2001-08-24 2009-06-30 Corixa Corporation WT1 fusion proteins
US7901693B2 (en) 1998-09-30 2011-03-08 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US8299234B2 (en) 2004-03-29 2012-10-30 Haruo Sugiyama siRNA hat inhibits WT1 gene expression and uses thereof

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5855911A (en) * 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
US7309692B1 (en) * 1996-07-08 2007-12-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1
US6977244B2 (en) 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US20030092656A1 (en) * 1997-07-16 2003-05-15 Haruo Sugiyama Therapeutic agents for treatment of solid tumors comprising an expression-inhibiting sustance against Wilms' tumor gene (WT1)
US7704962B1 (en) 1997-10-03 2010-04-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Small oligonucleotides with anti-tumor activity
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US20030039635A1 (en) * 1998-09-30 2003-02-27 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US20030215458A1 (en) * 1998-09-30 2003-11-20 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US20030235557A1 (en) * 1998-09-30 2003-12-25 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
AU2001271042A1 (en) * 2000-07-19 2002-01-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel antisense oligonucleotide derivatives against wilms's tumor gene
WO2003061386A1 (en) * 2002-01-03 2003-07-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Wt1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer
CN101113163B (zh) * 2002-06-12 2010-10-06 株式会社国际癌症免疫研究所 Hla-a24限制性癌抗原肽
US7425618B2 (en) 2002-06-14 2008-09-16 Medimmune, Inc. Stabilized anti-respiratory syncytial virus (RSV) antibody formulations
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
AU2003262094A1 (en) * 2002-09-12 2004-04-30 Haruo Sugiyama Cancer antigen peptide preparation
US7563810B2 (en) 2002-11-06 2009-07-21 Celgene Corporation Methods of using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myeloproliferative diseases
US8034831B2 (en) 2002-11-06 2011-10-11 Celgene Corporation Methods for the treatment and management of myeloproliferative diseases using 4-(amino)-2-(2,6-Dioxo(3-piperidyl)-isoindoline-1,3-dione in combination with other therapies
WO2004063217A1 (ja) * 2003-01-15 2004-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 二量体化ペプチド
JP4764818B2 (ja) 2003-04-11 2011-09-07 メディミューン，エルエルシー 組換えｉｌ−９抗体およびその使用
US20050048617A1 (en) 2003-08-18 2005-03-03 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
EP1720565A1 (en) * 2004-03-04 2006-11-15 Corixa Corporation Co-encapsulated wt1 polypeptide and immunostimulant microsphere formulations and methods thereof
JP4740122B2 (ja) * 2004-03-29 2011-08-03 治夫 杉山 細胞集団の中から肝細胞、内皮細胞、または造血細胞の前駆細胞を分離する方法
AU2005249360B2 (en) 2004-04-12 2011-07-21 Medimmune, Llc Anti-IL-9 antibody formulations and uses thereof
JP2008518023A (ja) 2004-10-27 2008-05-29 メディミューン，インコーポレーテッド 同族抗原に対する親和性を改変することによる抗体特異性の調節
FR2877350B1 (fr) * 2004-11-03 2010-08-27 Centre Nat Rech Scient IDENTIFICATION ET UTILISATION DE miRNAs IMPLIQUES DANS LA DIFFERENCIATION DE CELLULES ISSUES D'UNE LEUCEMIE MYELOIDE
JP5153613B2 (ja) 2005-03-18 2013-02-27 メディミューン，エルエルシー 抗体のフレームワーク・シャッフル
WO2007002543A2 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Medimmune, Inc. Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles
US8399426B2 (en) * 2006-04-11 2013-03-19 Bioinfra Inc. Method for treating breast cancer using adenine nucleotide translocator 2 (ANT2) siRNA or ANT2 shRNA
KR20070101610A (ko) * 2006-04-11 2007-10-17 주식회사 바이오인프라 Ａｎｔ２ 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 ｒｎａ를이용한 암 유전자 치료 및 항암제 내성 극복방법
RS53120B (en) 2006-08-28 2014-06-30 Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. ANTAGONISTIC HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO THE HUMAN LIGHT
AU2008232902B2 (en) 2007-03-30 2013-10-03 Medlmmune, Llc Antibody formulation
KR101686247B1 (ko) 2007-10-31 2016-12-14 메디뮨 엘엘씨 단백질 스캐폴드
EP2668210B1 (en) 2011-01-26 2020-06-17 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
EP2877493B1 (en) 2012-07-25 2018-03-21 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
US20150231240A1 (en) 2012-10-09 2015-08-20 Igenica Biotherapeutics, Inc. Anti-c16orf54 antibodies and methods of use thereof
US10100123B2 (en) 2013-06-06 2018-10-16 Pierre Fabre Medicament Anti-C10orf54 antibodies and uses thereof
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
KR102693806B1 (ko) 2014-12-11 2024-08-09 피에르 파브르 메디카먼트 항-c10orf54 항체들 및 그들의 용도들
WO2016139482A1 (en) 2015-03-03 2016-09-09 Kymab Limited Antibodies, uses & methods
US11253590B2 (en) 2015-12-02 2022-02-22 Stsciences, Inc. Antibodies specific to glycosylated BTLA (B- and T- lymphocyte attenuator)
KR102803158B1 (ko) 2015-12-02 2025-05-08 주식회사 에스티큐브앤컴퍼니 Btn1a1에 면역특이적으로 결합하는 항체와 분자 및 그의 치료 용도
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
US20200148768A1 (en) 2017-05-31 2020-05-14 Stcube & Co., Inc. Antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1 and the therapeutic uses thereof
US12215151B2 (en) 2017-05-31 2025-02-04 Stcube & Co., Inc. Methods of treating cancer using antibodies and molecules that immunospecifically bind to BTN1A1
KR20250097991A (ko) 2017-06-06 2025-06-30 주식회사 에스티큐브앤컴퍼니 Btn1a1 또는 btn1a1-리간드에 결합하는 항체 및 분자를 사용하여 암을 치료하는 방법
KR20250024129A (ko) 2018-07-20 2025-02-18 피에르 파브르 메디카먼트 Vista의 수용체

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995029995A1 (en) * 1994-04-28 1995-11-09 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Wt1 monoclonal antibodies and methods of use therefor

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1536392A (en) * 1991-01-18 1992-08-27 Oncogene Science, Inc. Methods of transcriptionally modulating expression of oncogenes and tumor suppressor genes

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995029995A1 (en) * 1994-04-28 1995-11-09 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Wt1 monoclonal antibodies and methods of use therefor

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOOD, Vol. 84, No. 8, (1994), K. INOUE et al., p. 2672-2680. *
BLOOD, Vol. 84, No. 9, (1994), K. INOUE et al., p. 3071-3079. *
CELL, Vol. 60, No. 3, (1990), K.M. CALL et al., p. 509-520. *
HUMAN MOLECULAR GENETICS, Vol. 3, No. 9, (1994), K. PRITCHARD-JONES et al., p. 1633-1637. *
NATURE, Vol. 343, (1990), M. GESSLER et al., p. 774-778. *
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., Vol. 88, No. 21, (1991), D.A. HABER et al., p. 9618-9622. *
THE JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL HEMATOLOGY, Vol. 36, No. 6, (1995), KAZUSHI INOUE et al., p. 552-228. *

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999003506A1 (fr) 1997-07-16 1999-01-28 Haruo Sugiyama Medicaments contre une tumeur solide, contenant des inhibiteurs de l'expression du gene (wt1) de la tumeur de wilms
US7696180B2 (en) 1997-07-16 2010-04-13 Haruo Sugiyama Therapeutic agents for treatment of solid tumors comprising an expression-inhibiting substance against Wilms' tumor gene (WT1)
EP1004319A4 (en) * 1997-07-16 2005-08-10 Haruo Sugiyama MEDICAMENTS FOR MASSIVE TUMORS THAT INCLUDE INHIBITORS OF THE EXPRESSION OF WILMS 'TUMORGEN
US7608685B1 (en) 1998-07-31 2009-10-27 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Tumor antigen based on products of the tumor suppressor gene WT1
US7030212B1 (en) 1998-07-31 2006-04-18 Haruo Sugiyama Tumor antigen based on products of the tumor suppressor gene WT1
US7517950B2 (en) 1998-07-31 2009-04-14 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Tumor antigen based on products of the tumor suppressor gene WT1
US7390871B2 (en) 1998-07-31 2008-06-24 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Tumor antigen based on products of the tumor suppressor gene WT1
US7368119B2 (en) 1998-09-30 2008-05-06 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US7662386B2 (en) 1998-09-30 2010-02-16 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US7329410B1 (en) 1998-09-30 2008-02-12 Corixa Corporation Compositions and method for WT1 specific immunotherapy
US7115272B1 (en) 1998-09-30 2006-10-03 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US7063854B1 (en) 1998-09-30 2006-06-20 Corixa Corporation Composition and methods for WTI specific immunotherapy
US7901693B2 (en) 1998-09-30 2011-03-08 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US7323181B2 (en) 1998-09-30 2008-01-29 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US7655249B2 (en) 1998-09-30 2010-02-02 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US7144581B2 (en) 2000-10-09 2006-12-05 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
WO2002079253A1 (fr) * 2001-03-22 2002-10-10 Haruo Sugiyama Peptide modifie wt1
US7553494B2 (en) 2001-08-24 2009-06-30 Corixa Corporation WT1 fusion proteins
US7915393B2 (en) 2001-08-24 2011-03-29 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
WO2005092393A1 (ja) * 2004-03-29 2005-10-06 Haruo Sugiyama Wt1遺伝子の発現を抑制するマイクロrnaおよびその利用
US8299234B2 (en) 2004-03-29 2012-10-30 Haruo Sugiyama siRNA hat inhibits WT1 gene expression and uses thereof
US8603997B2 (en) 2004-03-29 2013-12-10 Haruo Sugiyama siRNA that inhibits WT1 gene expression and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP0841068A1 (en) 1998-05-13
ES2268705T3 (es) 2007-03-16
DE69636339D1 (de) 2006-08-24
ATE332710T1 (de) 2006-08-15
EP0841068B1 (en) 2006-07-12
US6277832B1 (en) 2001-08-21
US6034235A (en) 2000-03-07
DE69636339T2 (de) 2007-07-19
EP0841068A4 (en) 2004-07-07
AU5779696A (en) 1996-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1996038176A1 (fr) Inhibiteur de la croissance de cellules leucemiques contenant des derives oligonucleotidiques antisens agissant contre le gene de la tumeur de wilms (wt1)
RU2695430C2 (ru) Антисмысловые нуклеиновые кислоты
EP0625192B1 (en) Nucleozymes
JP6414886B2 (ja) 抗癌治療に用いられる長鎖非コードｒｎａ
US5652222A (en) Selective inhibition of leukemic cell proliferation by bcr-abl antisense oligonucleotides
JPH11501509A (ja) ｔ（１４：１８）転座を有する腫瘍細胞に関連するアンチセンス転写産物とこの腫瘍細胞の診断及び治療に有用なオリゴデオキシヌクレオチド
EP1004319B1 (en) Remedies for solid tumor containing wilms' tumor gene (wt1) expression inhibitors
EP0640143A1 (en) Senescent cell derived inhibitors of dna synthesis
JPH09510714A (ja) オリゴヌクレオチドｎ３’→ｐ５’ホスホルアミデート：合成および化合物；ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ耐性特性
WO2024001172A1 (en) Oligonucleotide modulators activating complement factor h expression
WO1997020924A1 (en) A class of oligonucleotides, therapeutically useful as antitumoural agents
JP3904260B2 (ja) ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤
KR20000065690A (ko) 반응 특이성 및 안정성을 개선시킨 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, 안티센스 ｄｎａ 및 그 제조방법
US20030092656A1 (en) Therapeutic agents for treatment of solid tumors comprising an expression-inhibiting sustance against Wilms' tumor gene (WT1)
JPH05500217A (ja) ｃ―ａｂｌプロト―オンコ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
WO2022240783A1 (en) Methods of treating liver diseases with phosphodiesterase 3b (pde3b) inhibitors
JPH06508130A (ja) ｃ−ｍｙｂプロト−オンコジーンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる結腸直腸癌の処置
JP2002507186A (ja) ｃ−ｋｉｔプロト−オンコ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用
JP4986816B2 (ja) ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対する発現阻害物質を含んで成る固形腫瘍治療剤
JPH1059996A (ja) 白血病性芽細胞のアポトーシスをもたらす分化誘導物質と結合した、人のｃ−ｆｅｓ プロト癌遺伝子の一次転写に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用法
CN119365601A (zh) 靶向RecQL1解旋酶基因的siRNA
CN115103911A (zh) 修饰的异源核酸
CN118541479A (zh) 用卵黄样羧肽酶(cpvl)抑制剂治疗皮肤癌的方法
JP2022529562A (ja) オリゴヌクレオチド分子及び腫瘍治療におけるその応用
WO2002006297A1 (fr) Nouveaux derives d'oligonucleotides antisens contre le gene de la tumeur de wilms

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AM AT AU AZ BB BG BR BY CA CH CN CZ DE DK EE ES FI GB GE HU IS KE KG KR KZ LK LR LS LT LU LV MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK TJ TM TR TT UA UG US UZ VN AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): KE LS MW SD SZ UG AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN ML MR

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08952664

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1996914430

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1996914430

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1996914430

Country of ref document: EP