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WO1997004093A1 - Sequences nucleotidiques et peptidiques pour le traitement de la myasthenie - Google Patents

Sequences nucleotidiques et peptidiques pour le traitement de la myasthenie Download PDF

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Publication number
WO1997004093A1
WO1997004093A1 PCT/FR1996/001131 FR9601131W WO9704093A1 WO 1997004093 A1 WO1997004093 A1 WO 1997004093A1 FR 9601131 W FR9601131 W FR 9601131W WO 9704093 A1 WO9704093 A1 WO 9704093A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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sequence
peptide
seq
segment
coding
Prior art date
Application number
PCT/FR1996/001131
Other languages
English (en)
Inventor
Sylvia Cohen-Kaminsky
Sonia Berrih-Aknin
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique
Priority to EP96926423A priority Critical patent/EP0839195A1/fr
Priority to JP9506367A priority patent/JPH11514968A/ja
Publication of WO1997004093A1 publication Critical patent/WO1997004093A1/fr

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
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    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the present invention relates to the use of nucleotide and peptide sequences for obtaining drugs intended for the prevention or treatment of myasthenia gravis autoimmune acquired.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions and vaccines comprising the above nucleotide and peptide sequences.
  • Myasthenia gravis is an autoimmune disease which is characterized by fatigue and muscular weakness. This disease is caused by autoantibodies that recognize the nicotinic acetylcholine receptor (RACh) on the muscle, thereby hindering neuromuscular transmission (1). These anti-RACh autoantibodies are found in the sera of 85% of patients (2) and at least some of them are pathogenic (3, 4). The presence and activation of T helper cells participate in the pathogenesis of myasthenia gravis (5-9).
  • RACh nicotinic acetylcholine receptor
  • the thymus is supposed to play a direct role in the physiology of this pathology, as confirmed by the favorable effect of thymectomy on clinical evolution (10,11) and its frequent morphological anomalies (50-70% of hyperplasia, 10 -15% thy dreary) (12-14).
  • the production of the above-mentioned anti-RACh autoantibodies is under the control of CD4 + helper T cells restricted to MHC (Major Histocompatibility Complex) class II.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • the peptides resulting from the degradation of the autoantigen, namely RACh, in macrophages or other cells presenting the antigen, are coupled to the MHC class II molecule, HLA DR.
  • T cells are stimulated by recognizing this peptide-HLA DR complex, via a receptor, also known as a T cell receptor, the latter thus stimulated being able in turn to stimulate B cells which will produce antibodies recognizing RACh .
  • the immunogenetic aspect of the pathology was studied by HLA typing on a large number of patients.
  • the HLA DR3 or DR5 haplotypes have been serologically defined in correlation with the pathology (26-28).
  • a strong association with HLA DR3 has been found in young patients with thymic hyperplasia (27).
  • Molecular typing confirmed these results (29) and identified the HLA-DQ alleles (DQA1 * 0501 and DQB1 * 0201) as being frequently expressed in patients with thymic hyperplasia (30).
  • the autoantigen RACh involved in myasthenia gravis is well characterized at the molecular and functional levels (31), and that numerous monoclonal antibodies have been produced (32).
  • immunodominant B epitopes have been identified on the ⁇ subunit (MIR. HIR) (33-35). T cell epitopes have also been identified using recombinant fragments and synthetic peptides (36-40), thus revealing the multiepitopic nature of the autoantigen.
  • the aim of the present invention is to provide medicaments intended for the treatment or prevention of autoimmune myasthenia gravis, these medicaments comprising molecules capable of specifically binding either to the segment of the T cell receptor capable of recognizing and binding to peptide-HLA DR complex mentioned above, either to the gene or to the RNA.
  • these medicaments comprising molecules capable of specifically binding either to the segment of the T cell receptor capable of recognizing and binding to peptide-HLA DR complex mentioned above, either to the gene or to the RNA.
  • the messenger RNA (mRNA) coding for this segment, and this in a sufficiently stable (or in a sufficiently durable equilibrium) so that either the abovementioned complex can no longer bind to said segment, or the abovementioned gene or mRNA cannot no longer be translated into a peptide sequence corresponding to said segment.
  • Another object of the present invention is to provide medicaments capable of causing the production in the organism of molecules capable of specifically binding to the segment of the T cell receptor or to the gene or to the RNA coding for this segment.
  • Another object of the present invention is to provide medicaments which can be used as vaccines against myasthenia gravis, these vaccines comprising either molecules capable of generating the production in the organism of antibodies capable of specifically binding to the receptor segment of the T cells, ie vectors containing nucleotide sequences coding for molecules capable of generating the production in the body of antibodies as described above.
  • the T receptor is very polymorphic. It consists of two ⁇ and ⁇ subunits, each encoded by the combination of several genes (V, D, J, C). 24 families of V genes have been described for the ⁇ chain.
  • the present invention stems from the discovery made by the Inventors that the V ⁇ 5.1 segment of the T cell receptor is closely linked to myasthenia gravis, and this more particularly in patients of the HLA DR3 haplotype. namely in patients expressing molecules of the class II histocompatibility complex (HLA DR) of the HLA DR3 type.
  • HLA DR class II histocompatibility complex
  • myasthenia gravis is understood in the foregoing and what follows, myasthenia gravis autoimmune acquired.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO 2 comprises the aforementioned V ⁇ 5.1 segment, said segment being delimited by the amino acids located at positions 20 and 113, and being preceded by a signal peptide delimited by the amino acids located at positions 1 and 19;
  • the mRNA sequence represented by SEQ ID NO 3 codes for the above-mentioned SEQ ID NO 2 sequence, in particular for the aforementioned V ⁇ 5.1 segment;
  • the antisense DNA sequence represented by SEQ ID NO 4 is the sequence complementary to the sequence represented by SEQ ID NO 1;
  • the antisense RNA sequence represented by SEQ ID NO 5 is the sequence complementary to the sequence represented by SEQ ID NO 3.
  • the subject of the present invention is the use of nucleotide or peptide sequences, for obtaining medicaments capable of being used in the context of the prevention or treatment of myasthenia gravis, said nucleotide sequences being chosen from:
  • peptide sequences being chosen from:
  • a more particular subject of the invention is the use of nucleoditic or peptide sequences as described above, for obtaining medicaments capable of being used in the context of the prevention or treatment of myasthenia gravis in patients with HLA DR3 haplotype.
  • patients in whom the above-mentioned drugs are likely to be used to prevent or treat myasthenia gravis are patients:
  • grade IIB as defined according to the classification of Osserman (41)
  • - presenting a hyperplastic thymus, thymic hyperplasia being defined at the same time by a significant thymic mass and the presence of lymphoid follicles (12-14)
  • the nucleoditic sequences used are those capable of coding for a peptide sequence, itself capable of generating the formation of antibodies capable of recognizing and forming an immunological complex with all or part of the amino acid sequence of the V ⁇ 5.1 segment of the human T cell receptor.
  • nucleotide sequences are chosen from:
  • the DNA sequence represented by SEQ ID N0 comprising in particular the nucleotide sequence coding for the peptide sequence of V ⁇ 5.1 segment of the human T cell receptor, said peptide sequence consisting of the sequence of 94 amino acids delimited by the amino acids located at positions 20 and 113 of the sequence represented by SEQ ID NO 2, - any fragment of DNA of at least approximately 15 contiguous nucleotides of the DNA sequence represented by SEQ ID NO 1, capable of coding for a peptide fragment of at least approximately 5 contiguous amino acids of the peptide sequence represented by SEQ ID NO 2, said peptide fragment itself being capable of generating the formation of antibodies capable of recognizing and forming an immunological complex with all or part of the amino acid sequence of said V ⁇ 5.1 segment,
  • peptide sequence capable of causing the formation of antibodies is meant in what precedes and what follows, any peptide sequence capable, in particular when it is in the blood circulation of an individual, of elicit an immune response in this individual by the production of antibodies by the latter's immune system, these antibodies being capable of specifically recognizing and forming a stable immunological complex with the above-mentioned peptide sequence or with the amino acid sequence of the V ⁇ 5 segment .1 above.
  • the abovementioned DNA fragments comprise approximately 15 nucleotides to approximately 408 contiguous nucleotides, preferably from approximately 60 nucleotides to approximately 300 contiguous nucleotides of the DNA sequence represented by SEQ ID NO 1, capable of respectively coding for a fragment peptide from about 5 amino acids to about 136 acids contiguous amines. preferably from about 20 amino acids to about 100 amino acids of the peptide sequence represented by SEQ ID NO 2.
  • Preferred DNA fragments capable of being used in the context of the present invention are those comprising all or part: of the nucleotide sequence delimited by the nucleotides located at positions 1 and 339 of the sequence represented by SEQ ID NO 1 and coding for the polypeptide comprising a signal peptide delimited by the amino acids located in positions 1 and 19 of the sequence represented by SEQ ID NO 2. This signal peptide being followed by the V ⁇ 5.1 segment delimited by the amino acids located in positions 20 and 113 of the sequence represented by SEQ ID NO 2.
  • Preferred DNA fragments capable of being used in the context of the present invention are those mentioned above from approximately 60 nucleotides to approximately 300 nucleotides comprising all or part of the nucleotide sequence coding for the CDR1 region of the V ⁇ 5.1 segment and / or all or part of the nucleotide sequence coding for the CDR2 region of the V ⁇ 5.1 segment.
  • DNA fragments mentioned above are those comprising:
  • the percentage of homology between the nucleotides constituting the abovementioned derived DNA sequences, and those constituting the DNA sequence represented by SEQ ID NO 1, or the abovementioned DNA fragments is at least approximately 60% . preferably about 90%.
  • the percentage of homology between the amino acids constituting the above-mentioned derived peptide sequences, and those constituting the peptide sequence represented by SEQ ID NO 2. or the above-mentioned peptide fragments is at least about 60%. preferably about 90%.
  • the nucleotide sequences used are chosen from those capable of coding for an antisense RNA, this antisense RNA itself being capable of hybridizing with all or part of the mRNA represented by SEQ ID N0 3, said mRNA being coded by the DNA sequence coding for the amino acid sequence of said segment
  • nucleotide sequences are chosen from:
  • the antisense DNA sequence represented by SEQ ID N0 4, said DNA sequence coding for the antisense RNA represented by SEQ ID N0 5. capable of hybridizing with the mRNA represented by SEQ ID NO 3,
  • nucleotide sequences of the invention represented by SEQ ID NO 1.
  • SEQ ID NO 4 and SEQ ID NO 5 the derivative sequences and the sequence fragments of the invention mentioned above , must be taken into consideration as being represented in the 5 ' ⁇ 3' direction.
  • the first nucleotide of a complementary sequence in the 5 '- »3' direction as described above is the complement of the last nucleotide of the sequence in the 5 '-> 3' direction coding for the peptide sequence V ⁇ 5 .1 (or by a fragment of this peptide sequence or a derived peptide), the second nucleotide of this complementary sequence is the complement of the penultimate nucleotide of the sequence coding for the peptide sequence V ⁇ 5.1, and so on , up to the last nucleotide of said complementary sequence which is the complement of the first nucleotide of the sequence coding for the peptide sequence V ⁇ 5.1.
  • SEQ ID NO 4 is such that, when this antisense RNA is represented in the 5 ' ⁇ 3' direction, its first nucleotide corresponds to the last nucleotide of the DNA sequence represented by SEQ ID NO 1 coding for the peptide sequence V ⁇ 5. 1, and therefore hybridizes with the last nucleotide of the mRNA represented by SEQ ID NO 3 encoded by the latter, while its last nucleotide corresponds to the first nucleotide of the DNA sequence coding for the peptide sequence V ⁇ 5.1, and therefore hybridizes with the first nucleotide of the mRNA encoded by the latter.
  • antisense RNA is meant in the above and what follows, any RNA coded by the above-mentioned complementary sequence and represented in the reverse direction (3 '- »5') from the direction in which the mRNA coded by the sequence coding for the V ⁇ 5.1 peptide sequence (or fragment or derived peptide), the latter mRNA being also designated sense mRNA (5 ' ⁇ 3').
  • antisense RNA is therefore intended for an RNA sequence complementary to the base sequence of messenger RNA, the complementary term to be understood in the sense that each base (or a majority of bases) of the sequence antisense (read in the direction 3 ' ⁇ - 5') is capable of pairing with the corresponding bases (G with C, A with U) of the RNA messenger (sequence read in the 5 ' ⁇ 3' direction).
  • Antisense RNA is an RNA produced by the transcription of the non-coding DNA strand (nonsense strand).
  • RNA-RNA complex can interfere either with subsequent transcription, with maturation, transport or translation, or even lead to degradation of the mRNA.
  • the abovementioned antisense DNA fragments comprise from approximately 12 nucleotides to approximately 30 contiguous nucleotides. preferably from approximately 15 nucleotides to approximately 20 contiguous nucleotides of the DNA sequence represented by SEQ ID NO 4, capable of respectively coding for an antisense RNA fragment of approximately 12 to approximately 30 nucleotides, preferably approximately 15 nucleotides to approximately 20 nucleotides of the antisense RNA sequence represented by SEQ ID NO 5.
  • Preferred antisense DNA fragments capable of being used in the context of the present invention are those comprising all or part: of the nucleotide sequence delimited by the nucleotides located at positions 73 and 41 1 of the sequence represented by SEQ ID NO 4 and coding for the antisense RNA delimited by the nucleotides located at positions 73 and 411 of the sequence represented by SEQ ID NO 5,
  • the percentage of homology between the nucleotides constituting the abovementioned derivative antisense DNA sequences, and those constituting the antisense DNA sequence represented by SEQ ID NO 4. or the The above-mentioned antisense DNA fragments is at least about 60%, preferably about 90%.
  • the percentage of homology between the nucleotides constituting the abovementioned derivative antisense RNA sequences, and those constituting the antisense RNA sequence represented by SEQ ID NO 5, is at least about 60%, preferably of about 90%.
  • nucleotide sequences chosen from those capable of coding for a peptide sequence or for an antisense RNA as described above, and used in the context of the present invention. are contained in recombinant nucleotide sequences comprising the elements necessary to allow transcription of the abovementioned nucleotide sequences, in particular a promoter and a transcription terminator.
  • the subject of the present invention is any recombinant nucleotide sequence containing one (or more) nucleotide sequence (s) of the invention coding for a peptide sequence or for an antisense RNA as described above, as well as the elements necessary for the transcription of these sequences, in particular a promoter or a transcription terminator.
  • the recombinant nucleotide sequences of the invention comprise a nucleotide sequence coding for an amino acid sequence, said nucleotide sequence being located upstream and / or downstream of the nucleotide sequence of the invention, said recombinant nucleotide sequences coding thus for a hybrid protein containing a peptide sequence as described above of the invention preceded and / or followed by an amino acid sequence, in particular an amino acid sequence capable of increasing the immunogenic character of the hybrid protein compared to to the aforementioned single peptide sequence of the invention.
  • the abovementioned recombinant nucleotide sequences of the invention are inserted into vectors, in particular into plasmids, capable of allowing the expression of said recombinant nucleotide sequences in the organism.
  • the subject of the present invention is any vector, in particular any plasmid, containing one (or more) recombinant nucleotide sequence (s) as defined above.
  • a more particular subject of the invention is the use of vectors as described above, in particular of plasmids.
  • nucleotide sequences according to the invention containing recombinant nucleotide sequences according to the invention, the latter themselves containing at least one nucleotide sequence according to the invention coding for a peptide sequence, as described above, capable of generating the formation of antibodies capable of recognizing and forming an immunological complex with all or part of the amino acid sequence of the V ⁇ 5.1 segment of the human T cell receptor, for obtaining vaccines against myasthenia gravis, which may in particular be used in prophylaxis or therapy as part of the treatment of the patients described above, these vaccines still being designated naked DNA vaccines.
  • the nucleotide sequences used are those capable of hybridizing with all or part of the DNA sequence coding for the amino acid sequence of the V ⁇ 5.1 segment of the human T cell receptor .
  • such nucleotide sequences are chosen from those complementary to all or part of one of the strands of the DNA sequence represented by SEQ ID NO 1, in particular from nucleotide sequences comprising at least approximately 12 contiguous nucleotides up to the number maximum of nucleotides of the DNA sequence represented by SEQ ID NO 4 complementary to the DNA sequence represented by SEQ ID NO 1, or among antisense DNA fragments as described above, or also among sequences of 'DNA derived from all or part of the DNA sequence represented by SEQ ID NO 4 or from the above-mentioned antisense DNA fragments, in particular by substitution, deletion and / or addition of one (or more) nucleotide (s).
  • the nucleotide sequences used are those which hybridize with all or part of the mRNA coded by the DNA sequence coding for the amino acid sequence of the V ⁇ 5.1 segment of the receptor for human T cells, these nucleotide sequences themselves represent an antisense RNA, this antisense RNA advantageously consisting of at least about 12 contiguous nucleotides complementary to nucleotides of the abovementioned mRNA.
  • such nucleotide sequences are chosen from:
  • the abovementioned antisense RNA fragments comprise approximately 12 nucleotides to approximately 30 contiguous nucleotides, preferably from approximately 15 nucleotides to approximately 20 contiguous nucleotides of the RNA sequence represented by SEQ ID NO 5. capable of hybridizing with the mRNA represented by SEQ ID NO 3 defined above.
  • Preferred antisense DNA fragments capable of being used in the context of the present invention are those comprising all or part:
  • nucleotide sequence delimited by the nucleotides located at positions 73 and 411 of the sequence represented by SEQ ID NO 5 - the nucleotide sequence delimited by the nucleotides located at positions 73 and 354 of the sequence represented by SEQ ID NO 5
  • the percentage of homology between the nucleotides constituting the abovementioned derivative antisense RNA sequences and those constituting the RNA sequence represented by SEQ ID NO 5, or the abovementioned antisense RNA fragments is at least approximately 60 %, preferably around 90%.
  • the peptide sequences used are those capable of generating the formation of antibodies capable of recognizing and forming an immunological complex with the V ⁇ 5.1 segment of the receptor for human T cells.
  • the above-mentioned peptide sequences are chosen from:
  • the abovementioned peptide fragments comprise approximately 5 amino acids to approximately 136 contiguous amino acids preferably, from approximately 20 amino acids to approximately 100 contiguous amino acids of the peptide sequence represented by SEQ ID NO 2, capable of causing the formation of 'antibodies as defined above.
  • Preferred peptide fragments are those comprising all or part:
  • Preferred peptide fragments are those of approximately 20 amino acids to approximately 100 amino acids comprising all or part of the CDR1 region and / or the CDR2 region mentioned above of the V ⁇ 5.1 segment.
  • Particularly preferred peptide fragments mentioned above are those comprising: - all or part of the peptide of 6 amino acids delimited by the amino acids located at positions 45 and 50 of the sequence represented by
  • the percentage of homology between the amino acids constituting the above-mentioned derived peptide sequences, and those constituting the peptide sequence represented by SEQ ID NO 2, or the above-mentioned peptide fragments is at least about 60%, preferably d 'about 90%.
  • the peptide sequences used as antibodies are those capable of recognizing and forming an immunological complex with the amino acid sequence of the V ⁇ 5.1 segment of the human T cell receptor.
  • said antibodies are polyclonal or monoclonal antibodies as obtained by immunization of an animal with peptide sequences chosen from: - the peptide sequence represented by SEQ ID N0 2,
  • a subject of the invention is also pharmaceutical compositions comprising, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, one (or more) nucleotide sequence (s) as described above, coding for a sequence peptide itself representing an antibody capable of recognizing and forming an immunological complex with all or part of the amino acid sequence of the V ⁇ 5.1 segment of the human T cell receptor, said nucleotide sequence (s) ) being advantageously contained in recombinant nucleotide sequences as defined above, the latter themselves being inserted into vectors as defined above.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, one (or more) nucleotide sequence (s) as described above, coding for an antisense RNA, itself capable of hybridizing with all or part of the DNA sequence coding for the amino acid sequence of the V ⁇ 5 segment. 1 of the human T cell receptor, said nucleotide sequence (s) being advantageously contained in recombinant nucleotide sequences as defined above, the latter themselves being inserted into vectors as defined above -above.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, one (or more) nucleotide sequence (s) as described above, capable of hybridizing with all or part of the DNA sequence coding for the amino acid sequence of the V ⁇ 5.1 segment of the human T cell receptor, or with all or part of the mRNA encoded by this DNA sequence.
  • a subject of the invention is also pharmaceutical compositions comprising, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, one (or more) peptide sequence (s) as described above, corresponding to antibodies capable of recognizing and forming an immunological complex with all or part of the amino acid sequence of the V ⁇ 5.1 segment of the human T cell receptor.
  • the invention also relates to the vaccines, also known as naked DNA vaccines as described above, and comprising, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, one (or more) nucleotide sequence (s) as described (s) ) above, capable of coding for a peptide sequence, itself capable of generating the formation of antibodies capable of recognizing and forming an immunological complex with all or part of the amino acid sequence of the V ⁇ 5 segment .1 the human T cell receptor, said nucleotide sequence (s) being advantageously contained in recombinant nucleotide sequences as defined above, the latter themselves being inserted into vectors as defined above.
  • nucleotide sequence (s) being advantageously contained in recombinant nucleotide sequences as defined above, the latter themselves being inserted into vectors as defined above.
  • a subject of the invention is also the vaccines comprising, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, one (or more) peptide sequence (s) as described above, capable of '' generate the formation of antibodies capable of recognizing and forming an immunological complex with the amino acid sequence of the V ⁇ 5 segment. 1 of the human T cell receptor.
  • the pharmaceutical compositions and vaccines according to the invention are in the form of injectable preparations, in particular by the intravenous route, preferably by the intramuscular route, or by the subcutaneous route.
  • the invention also relates to the complexes formed between the abovementioned nucleotide sequences used in the context of the present invention, and the DNA or RNA sequence coding for said V ⁇ 5.1 segment.
  • the subject of the invention is more particularly:
  • the invention also relates to the complexes formed between the above-mentioned peptide sequences used in the context of the present invention, and the amino acid sequence of said segment V ⁇ 5.1.
  • the invention more particularly relates to the complexes formed on the one hand between the antibodies, or directly administered to a patient. either generated by the introduction into the body, or by the production in the body (case of the naked DNA vaccine), of the peptide sequence represented by SEQ ID NO 2, or of a fragment or of a derived sequence of the latter as defined above, and on the other hand all or part of the amino acid sequence of the V ⁇ 5.1 segment.
  • nucleotide sequences used in the context of the present invention are obtained by any conventional method well known to those skilled in the art of cloning or nucleotide synthesis.
  • SEQ ID NO 1. the latter was cloned by Kimura et al. , J. Exp. Med. , 184, 739-750 (1988); its access number in Gene bank is X04927.
  • peptide sequences used in the context of the present invention are obtained by any conventional method well known to those skilled in the art of peptide synthesis in liquid or solid phase.
  • a more particular subject of the invention is the recombinant polypeptides, and in particular the peptide sequence corresponding to the segment.
  • V ⁇ 5.1 of the human T cell receptor namely the peptide sequence represented by SEQ ID NO 2, or the fragments or the peptide sequences aforementioned derivatives, as obtained by transformation of cells (such as bacteria, in particular E. coli. yeasts, insect cells infected with a Baculovirus, eukaryotic cells such as Cos or CHO cells) with a nucleotide sequence recombinant as defined above, containing a DNA sequence according to the invention, in particular using a vector as described above.
  • cells such as bacteria, in particular E. coli. yeasts, insect cells infected with a Baculovirus, eukaryotic cells such as Cos or CHO cells
  • recombinant polypeptides should be understood to mean any molecule having a polypeptide chain capable of being produced by genetic engineering, via a phase of transcription of the DNA of the corresponding gene, which leads to the obtaining RNA which is subsequently transformed into mRNA (by suppression of introns), the latter then being translated by ribosomes, in the form of proteins, the whole being carried out under the control of appropriate regulatory elements inside a host cell. Consequently, the expression "recombinant polypeptides” used does not exclude the possibility that said polypeptides include other groups, such as glycosylated groups.
  • the term "recombinant" indicates that the polypeptide was produced by genetic engineering, because it results from the expression, in an appropriate cellular host, of the corresponding nucleotide sequence which was previously introduced into an expression vector used to transform said cell host.
  • the invention also relates to the antibodies as described above directed against the peptide sequences used in the context of the invention, and more particularly those directed against the aforementioned recombinant polypeptides, in particular those directed against the peptide sequence represented by SEQ ID NO 2, or a fragment or a sequence derived from the latter as defined above.
  • Such antibodies can be obtained by immunizing an animal with these polypeptides, followed by the recovery of the antibodies formed. It goes without saying that this production is not limited to polyclonal antibodies.
  • the subject of the invention is more particularly humanized or chimeric antibodies as obtained from DNA encoding the above-mentioned antibodies according to the conventional methods for obtaining these antibodies, these methods being described and commented on in particular in: Winter G., Harris WJ, Immunology Today, vol. 14, No. 6, 243-246 (1993); Bach JF et al. , Immunology Today, vol. 14, No. 9, 421-425 (1993); Bach JF. The Immunologist, 214, 135-137 (1994).
  • humanized antibodies are more particularly characterized in that their specific part recognizing the V ⁇ 5.1 fragment consists of an amino acid sequence of animal origin, in particular of mice, while their non-specific part does not recognize the V ⁇ 5 segment. 1 consists of an amino acid sequence of human origin.
  • the subject of the invention is also any method of treatment and / or prevention of myasthenia gravis by administration of one or more pharmaceutical compositions, and / or of one or more vaccines described above according to the invention, to a patient myasthenia gravis, and more particularly to a patient with an HLA-DR3 haplotype.
  • the invention will be further illustrated in the following detailed description of the demonstration of the involvement of the V ⁇ 5.1 segment of the T cell receptor in autoimmune myasthenia gravis in patients of the HLA DR3 haplotype.
  • Hyperplasia is limited to the thymus characterized by the presence of germinal centers, as described by Rosa ⁇ and Levine (13). Osserman's modified classification was used to grade the severity of the condition (41). All patients have a generalized form of pathology.
  • Patients with an IIA degree of severity exhibit moderately disordered functional activity and moderate weakness of the limb or eye muscles.
  • Patients with a degree of severity IIB have a large dysregulation of functional activity and significant signs of weakness of the muscles of the limbs and bulbar.
  • the anti-RACh were titrated using the RACh of human muscle complexed with the iodinated ⁇ -bungarotoxin as described in (42).
  • the thymuses were obtained from myasthenic patients who underwent a thymectomy after therapeutic prescription of the latter at Marie Lannelongue hospital (Le Plessis-Robinson, France). All the thymuses of the seven patients were hyperplastic and contained lymphoid follicles as described in (13, 18).
  • thymuses were rinsed in HBSS (Hank's Balanced Sait Solution) and cell suspensions were obtained by gentle grinding of the thymic tissue, followed by passage through sterile gauze, washing and freezing in liquid nitrogen until use. After thawing, a loss of approximately 15-20% of immature cortical thymocytes CD1 + (CD4 + CD8 +) was observed, resulting in a proportional increase in the percentage of mature medullary thymocytes CD4 + CD8- and CD4-CD8 +. As this study was mainly focused on mature CD4 + thymic cells (thymocytes without CD8), this was not detrimental.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the synthesis and purification of the peptides corresponding to positions 169-181 and 351-368 of the ⁇ subunit of RACh was carried out by the solid phase method (43).
  • the amino acid composition of the peptides was checked by amino acid analysis.
  • the amino acid sequences of these peptides are described in reference 36.
  • the two peptides correspond to selected domains of the ⁇ subunit of RACh.
  • Peptide 169-181 is extra cytoplasmic and corresponds to a sequence bordering on the binding site of ⁇ -bungarotoxin on the ⁇ subunit. It contains a motif of 5 residues (sequence
  • the peptide 351-368 is intracytoplasmic and corresponds to a highly immunogenic region designated HIR (35). Its sequence is in a helical conformation in the intact protein and therefore presages an antigenic site according to Delisi et al. (45).
  • the two peptides contain one to two anchoring residues in a position suitable for binding to the HLA-DR3 molecule which, moreover, represents a HLA class II allele associated with myasthenia gravis, according to one or the other of the link patterns described (46-50).
  • the cDNA of the ⁇ subunit of human RACh contains exon P3A (51).
  • the larger fragment extracytoplasmic corresponding to amino acids 1-210 was cloned as a fusion protein in a commercially available vector (pMAL ® -C2, New England Biolabs, Beverly, MA) downstream of the wrong E gene that encodes a maltose binding protein (MBP). and has been strongly expressed in E. coli.
  • the fusion protein was 70% pure.
  • the fusion protein was then purified in one step using the affinity of MBP for maltose. then split using coagulation factor Xa according to the manufacturer's recommendations.
  • the ri -210 fragment was purified by preparative electrophoresis with continuous elution with a high yield (80-90%) and a high level of purity. Purity is a critical factor as it minimizes the risk of observing false positive protein reactions recombinant due to contamination with bacterial proteins.
  • the ⁇ r 1 -120 fragment was sterilized by filtration through 0.22 ⁇ m membranes and stored at -20 ° C. until used in proliferation experiments. It leads to the appearance of proliferative responses from PBMCs and thymocytes from many MG patients included or not in this study.
  • TCR T cell receptors
  • Two-color flow cytometry analyzes were performed 8 days after stimulation with IL-2 alone, or peptide + IL-2, using specific anti-CD4 and anti-TCR-V ⁇ monoclonal antibodies.
  • an additional step consists in staining with an anti-CD4 conjugated with phycoerythrin (Immunotech) for 30 minutes at 4 ° C. After washing, the cells were incubated for 20 minutes with 2 ⁇ g / ml of propidium iodide (PI, Becton Dickinson, Mountain View, CA) (52). Dead cells were excluded during the analysis by positive staining with propidium iodide.
  • PI propidium iodide
  • CD8 thymocytes or PBMCs from myasthenic patients were stimulated with a peptide and then with IL-2 to allow the regeneration of potentially modulated receptors (53, 54).
  • the cells were then harvested and analyzed by two-color immunofluorescence and flow cytometry for the expression of
  • CD8 + was only observed after nine days of culture with the peptide and IL-2.
  • the peptide 351-368 also induces a significant increase in V ⁇ 5.1 + in the CD4 + thymocytes of this patient.
  • the recombinant fragment r ⁇ l-210 was used initially as a source of peptides capable of being able to be naturally generated.
  • the engagement of numerous V ⁇ gene segments in the response of thymocytes and PBMCs to this fragment has led the inventors to use another strategy by using selected peptides to study the repertoire of T cells involved in the response to the autoantigen. in MG patients.
  • the experiments using the ri -210 fragment confirm the multidetermining nature of the autoantigen.
  • V ⁇ segments in the response to synthetic peptides in PBMC
  • V ⁇ 5.1 The differences in expression of V ⁇ calculated as indicated above, and representing the stimulation of a population expressing a given V ⁇ , reveal the prevalence of the expansion of cells expressing V ⁇ 5.1 in response to the peptide 169-181 in the thymus and the periphery.
  • the implication of V ⁇ 5.1 is less clear in response to peptide 351-368. It appears in the thymocytes or PBMC from patients in whom the disease has recently appeared. In all cases, and at least with regard to thymocytes, the use of V ⁇ 5.1 in response to this peptide is observed exclusively in severely affected patients.
  • the DR3 haplotype is strongly associated with the use of V ⁇ 5. 1 in response to peptide 169-181
  • All but one patient expressed the DR3 haplotype (patient 7).
  • the percentage of V ⁇ 5.1 + CD4 + cells is not increased in response to peptides 169-181 or peptide 351-368.
  • PBMC thymocytes or PBMC
  • both the proliferation consecutive to the peptide 169-181 and the expansion of the cells expressing V ⁇ 5.1 were inhibited, which indicates that the DR3 molecule plays a major role in the presentation of the peptide.
  • the artifacts in the analysis of the results were carefully avoided by excluding dead cells from cultures using the incorporation of propidium iodide.
  • the fluorescent labeling experiments were carried out with antibodies directly coupled to fluorochrome, and always included negative controls.
  • the expansion of V ⁇ 5.1 is included in the expansion of the entire CD4 + population.
  • the patient's T cells respond to peptides by proliferation, and the depletion of cells expressing V ⁇ 5.1 inhibited this proliferation.
  • an anti-DR3 alloantiserum not only inhibits proliferation of peptide 369-391, but also the expansion of cells expressing V ⁇ 5.1 in response to this peptide.
  • RACh is a multi-epitopic autoantigen as indicated by the large number of T cell epitopes, found by different research groups on the ⁇ subunit as well as on the other subunits (36-40).
  • the inventors' approach is based on the selection of two peptides of the ⁇ subunit of RACh for which the proliferative memory T response in patients is correlated with clinical data (antibody titer, disease severity). These Peptides are therefore potentially pathogenic and involved in the disease (36) when the following arguments are taken into account:
  • the aforementioned peptides generally do not generate a response in the controls (22, 40, 60).
  • the normal immune repertoire contains autoreactive T cells for RACh and other autoantigens (56, 61. 62,63), and it may be admitted that the specificities of the most frequent autoreactive T cells in the normal immune repertoire are less involved. in the disease and vice versa:
  • the expansion of CD4 cells in response to the peptide involves the cells expressing V ⁇ 5.1 in all patients sharing the HLA-DRB 1 * 03 allele.
  • the sharing of T cell specificity by different myasthenic patients expressing a common HLA DR B1 allele (HLA-DR3), which is also associated with the disease, demonstrates that the cells which have proliferated in response to the peptide are characteristic of the disease.
  • HLA-DR3 haplotype Myasthenia gravis is associated with an increase in the frequency of the DR3 allele (26-30). This association is more evident in women, in young patients and in patients with thymic hyperplasia (27). In addition, thymic hyperplasia is associated with a high antibody titer and a generalized form of the disease (1, 10, 14). This would explain the importance of the expression of the HLA-DR3 haplotype in patients selected solely on the basis of the above clinical criteria. It should be noted that the only patient not expressing the HLA DRB1 * 03 haplotype, does not exhibit expansion of the cells expressing V ⁇ 5.1, either ex vivo or in culture after stimulation. with the peptide. All HLA-DR3 patients also express HLA DQA1 501 and HLA DQB1 201, which are strongly linked with HLA DRB1 * 03.
  • the two peptides selected in this study contain the key residues proposed and arranged according to the consensus motifs defined for the peptides associated with HLA-DR3 (46-50).
  • the direct demonstration of the implication of HLA-DR3 in the presentation of the peptide 169-181. is provided by our experiences of inhibiting the expansion of CD4 + V ⁇ 5.1 + cells and proliferation in response to the peptide by a specific anti DR3 alloantiserum in two patients tested. Therefore, the peptides used in this study are important components in the ternary complex to direct the observed V ⁇ 5.1 expansion.
  • thymectomy is well accepted for young patients with a hyperplastic thymus, and can act by suppressing the source of potentially self-reactive T and B cells, as well as the potential site for reactivation of the autoimmune process (25).
  • Clinical improvement after thymectomy is apparent after only one or two years.
  • the use of anticholinesterase compounds is only a symptomatic treatment which is difficult to balance and for which the risk of overdose is permanent. As for corticosteroid treatment, this is accompanied by serious side effects.
  • Acetylcholine receptor specifies T lymphocyte clones in the normal human immune directory: target epitopes. HLA restriction, and membrane phenotypes. Ann. Neurol. 29: 508-516.

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques ou peptidiques, pour l'obtention de médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la prévention ou du traitement de la myasthénie autoimmune acquise, lesdites séquences nucléotidiques étant choisies parmi: celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique représentant elle-même un anticorps capable de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1, celles susceptibles de coder pour un ARN antisens, lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm codé par la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1, ou celles susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1, ou avec tout ou partie de l'ARNm codé par cette séquence d'ADN, lesdites séquences peptidiques étant choisies parmi: celles susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou celles correspondant à des anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T.

Description

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES ET PEPTIDIQUES POUR LE TRAITEMENT DE LA MYASTHENIE.
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques et peptidiques pour l'obtention de médicaments destinés à la prévention ou au traitement de la myasthénie autoimmune acquise. L' invention concerne également les compositions pharmaceutiques et les vaccins comprenant les séquences nucléotidiques et peptidiques susmentionnées.
La myasthénie (Myasthenia Gravis) est une maladie autoimmune qui se caractérise par un état de fatigabilité à l'effort et de faiblesse musculaire. Cette maladie est causée par des autoanticorps reconnaissant le récepteur nicotinique de l' acetylcholine (RACh) sur le muscle, entravant ainsi la transmission neuromusculaire (1). Ces autoanticorps anti-RACh sont retrouvés dans les sérums de 85 % des patients (2) et une partie au moins d'entre eux sont pathogènes (3, 4). La présence et l'activation de cellules T helper participent à la pathogénèse de la myasthénie (5-9). Le thymus est supposé jouer un rôle direct dans la physiologie de cette pathologie, comme le confirme l'effet favorable de la thymectomie sur l'évolution clinique (10,11) et ses fréquentes anomalies morphologiques (50-70 % d'hyperplasie, 10-15 % de thy morne) (12- 14).
Plusieurs résultats expérimentaux sont fortement en faveur du rôle du thymus dans l' autosensibilisation primaire et/ou dans le déclenchement et la perpétuation du processus autoimmun : hyperactivité des cellules thymiques T et B (15-18), autoréactivité vis à vis du récepteur à l' acetylcholine au niveau des cellules B et T (18-23), présence de l' autoantigène (24). anomalies fonctionnelles des cellules épithéliales et en particulier un dérèglement de la production d'IL-6 (25).
En bref résumé, la production des autoanticorps anti-RACh susmentionnés, est sous le contrôle des cellules T helper CD4+ restreintes au CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité) de classe II. Les peptides issus de la dégradation de l' autoantigène, à savoir du RACh, dans les macrophages ou autres cellules présentant l'antigène, sont couplés à la molécule du CMH de classe II, HLA DR. Les cellules T sont stimulées en reconnaissant ce complexe peptide-HLA DR, par l'intermédiaire d'un récepteur, encore désigné récepteur des cellules T, ces dernières ainsi stimulées pouvant à leur tour stimuler les cellules B qui vont produire des anticorps reconnaissant les RACh.
L'aspect immunogénétique de la pathologie a été étudié par typage HLA sur un grand nombre de patients. Les haplotypes HLA DR3 ou DR5 ont été sérologiquement définis en corrélation avec la pathologie (26-28). Une forte association avec HLA DR3 a été trouvée chez les jeunes patients, avec une hyperplasie thymique (27). Le typage moléculaire a confirmé ces résultats (29) et a identifié les allèles HLA-DQ (DQA1 *0501 et DQB1 *0201) comme étant fréquemment exprimés chez les patients avec une hyperplasie thymique (30). De même que l' autoantigène RACh impliqué dans la myasthénie est bien caractérisé aux niveaux moléculaire et fonctionnel (31), et que de nombreux anticorps monoclonaux ont été produits (32). des épitopes B immunodominants ont été identifiés sur la sous-unité α (MIR. HIR) (33-35). Les épitopes des cellules T ont également été identifiés en utilisant des fragments recombinants et des peptides synthétiques (36-40), révélant ainsi la nature multiépitopique de l' autoantigène.
Le but de la présente invention est de fournir des médicaments destinés au traitement ou à la prévention de la myasthénie autoimmune acquise, ces médicaments comprenant des molécules susceptibles de se lier spécifiquement soit au segment du récepteur des cellules T capable de reconnaître et de se lier au complexe peptide-HLA DR susmentionné, soit au gène ou à l'ARN. notamment l'ARN messager (ARNm), codant pour ce segment, et ce de manière suffisamment stable (ou dans un équilibre suffisamment durable) pour que soit le complexe susmentionné ne puisse plus se lier audit segment, soit le gène ou ARNm susmentionné ne puissent plus être traduits en séquence peptidique correspondant audit segment.
Un autre but de la présente invention est de fournir des médicaments susceptibles d'engendrer la production dans l'organisme de molécules capables de se lier spécifiquement au segment du récepteur des cellules T ou au gène ou à l 'ARN codant pour ce segment.
Un autre but de la présente invention est de fournir des médicaments utilisables en tant que vaccins contre la myasthénie, ces vaccins comprenant soit des molécules susceptibles d'engendrer la production dans l'organisme d'anticorps capables de se lier spécifiquement au segment du récepteur des cellules T, soit des vecteurs contenant des séquences nucléotidiques codant pour des molécules susceptibles d'engendrer la production dans l'organisme d'anticorps tels que décrits ci-dessus.
Il convient toutefois de noter que le récepteur T est très polymorphe. Il se compose de deux sous-unités α et β, chacune codée par la combinaison de plusieurs gènes (V, D, J, C). 24 familles de gènes V ont été décrites pour la chaîne β.
Aucune corrélation entre les familles particulières de gènes codant pour les différentes régions des sous-unités α et β d'une part, et la myasthénie d'autre part, n'a été mise en évidence jusqu'à ce jour, si bien qu 'aucune approche thérapeutique par blocage d'un segment spécifique du récepteur des cellules T ou d'un gène codant pour un tel segment spécifique, n'a pu être envisagée jusqu'à présent.
La présente invention découle de la découverte faite par les Inventeurs du fait que le segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T est étroitement lié à la myasthénie, et ce plus particulièrement chez les patients d'haplotype HLA DR3. à savoir chez les patients exprimant des molécules du complexe d'histocompatibilité de classe II (HLA DR) du type HLA DR3.
Il convient de préciser que l'on entend par myasthénie dans ce qui précède et ce qui suit, la myasthénie autoimmune acquise.
Il sera fait référence dans la suite de ce texte aux séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 décrites dans la liste de séquences ci-après, ces séquences étant les suivantes:
- la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 code pour le segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T;
- la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO 2 comprend le segment Vβ5.1 susmentionné, ledit segment étant délimité par les acides aminés situés aux positions 20 et 113, et étant précédé par un peptide signal délimité par les acides aminés situés aux positions 1 et 19; - la séquence d'ARNm représentée par SEQ ID NO 3 code pour la séquence SEQ ID NO 2 susmentionnée, notamment pour le segment Vβ5.1 susmentionné;
- la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4 est la séquence complémentaire de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 ; - la séquence d'ARN antisens représentée par SEQ ID NO 5 est la séquence complémentaire de la séquence représentée par SEQ ID NO 3.
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques ou peptidiques, pour l'obtention de médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la prévention ou du traitement de la myasthénie, lesdites séquences nucléotidiques étant choisies parmi :
- celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou - celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique représentant elle-même un anticorps capable de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1 , - celles susceptibles de coder pour un ARN antisens, lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm codé par la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1. ou
- celles susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1 , ou avec tout ou partie de l'ARNm codé par cette séquence d'ADN, lesdites séquences peptidiques étant choisies parmi :
- celles susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou
- celles correspondant à des anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T.
L' invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de séquences nucléoditiques ou peptidiques telles que décrites ci-dessus, pour l'obtention de médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la prévention ou du traitement de la myasthénie chez les patients d'haplotype HLA DR3.
De préférence, les patients chez lesquels les médicaments susmentionnés sont susceptibles d'être utilisés pour prévenir ou traiter la myasthénie, sont des patients:
- démarrant la maladie généralement avant d'avoir atteint une quarantaine d'années environ,
- présentant une myasthénie généralisée, le plus souvent de forme sévère: grade IIB tel que défini selon la classification d'Osserman (41), - présentant un thymus hyperplasique, l' hyperplasie thymique étant définie à la fois par une masse thymique importante et la présence de follicules lymphoïdes (12-14),
- présentant un taux d'anticorps dirigés contre le récepteur RACh supérieur à environ 10 nM (et susceptible d'être mesuré par la méthode décrite dans la référence (42).
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les séquences nucléoditiques utilisées sont celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines. Avantageusement, de telles séquences nucléotidiques sont choisies parmi :
- la séquence d'ADN représentée par SEQ ID N0 1 , comprenant notamment la séquence nucléotidique codant pour la séquence peptidique du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite séquence peptidique étant constituée par l'enchaînement de 94 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, - tout fragment d'ADN d'au moins environ 15 nucléotides contigus de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , susceptible de coder pour un fragment peptidique d'au moins environ 5 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ledit fragment peptidique étant lui- même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ 5.1 ,
- toute séquence d'ADN dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , ou d'un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou -addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 ou du fragment d'ADN susmentionnés, ladite séquence d'ADN dérivée étant susceptible de coder soit pour une séquence peptidique identique à la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou identique à un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, soit pour une séquence peptidique dérivée de celle représentée par SEQ ID N0 2, ou dérivée d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s) de la séquence peptidique représentée par SEQ ID N0 2, ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ladite séquence peptidique dérivée étant elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ 5.1.
Il va de soi que par séquence peptidique susceptible d'engendrer la formation d'anticorps, on entend dans ce qui précède et ce qui suit, toute séquence peptidique capable, notamment lorsqu'elle se trouve dans la circulation sanguine d'un individu, d'élliciter une réponse immunitaire chez cet individu par production d'anticorps par le système immunitaire de ce dernier, ces anticorps étant capables de reconnaître spécifiquement et de former un complexe immunologique stable avec la séquence peptidique susmentionnée ou avec la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 susmentionné. Avantageusement, les fragments d'ADN susmentionnés comprennent environ 15 nucléotides à environ 408 nucléotides contigus, de préférence d'environ 60 nucléotides à environ 300 nucléotides contigus de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , susceptibles de coder respectivement pour un fragment peptidique d'environ 5 acides aminés à environ 136 acides aminés contigus. de préférence d'environ 20 acides aminés à environ 100 acides aminés de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2.
Des fragments d'ADN préférés susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention sont ceux comprenant tout ou partie: - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 1 et 339 de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 et codant pour le polypeptide comprenant un peptide signal délimité par les acides aminés situés aux positions 1 et 19 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2. ce peptide signal étant suivi par le segment Vβ5.1 délimité par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2.
- de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 58 et 339 de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 et codant pour le segment Vβ5. 1 délimité par les acides aminés situés aux positions 20 et 1 13 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 1 et 57 de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 et codant pour le peptide signal susmentionné délimité par les acides aminés situés aux positions 1 et 19 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2.
Des fragments d'ADN préférés susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention, sont ceux susmentionnés d'environ 60 nucléotides à environ 300 nucléotides comprenant tout ou partie de la séquence nucléotidique codant pour la région CDRl du segment Vβ5.1 et/ou tout ou partie de la séquence nucléotidique codant pour la région CDR2 du segment Vβ5.1.
Les régions CDRl et CDR2 susmentionnées du segment Vβ5. 1 ont pu être déterminées à partir des articles suivants:
- Kronenberg et al. , Ann. Rev. Immunol. , 4: 529 à 591 (1986),
- Novotny et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 83: 742-746 (1986),
- Chothia et al. , The EMBO Journal, 7, n° 12, 3745-3755 (1988),
- Claverie et al. , Immunology Today, vol. 10, 10-14 (1989), - Davis et al. , Nature, 334, 395-402 (1988),
- Jorgensen et al. , Ann. Rev. Immunol. , 10, 835-873 (1992),
- Bellio et al. , J. Exp. Med. , 129, 1087-1097 (1994),
- Prochnika-Chalufour, International Immunology, vol. 3, n° 9, 853-864 ( 1991). - Chien and Davis, Immunology Today, vol. 14, n° 12, 597-602 (1993).
Des fragments d'ADN susmentionnés particulièrement préférés sont ceux comprenant:
- tout ou partie de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 133 et 150 de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 . et codant pour la région CDRl de 6 acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 45 et 50 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2. et/ou
- tout ou partie de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 199 et 243 de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 , et codant pour la région CDR2 de 15 acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 67 et 81 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2.
Avantageusement, le pourcentage d'homologie entre les nucléotides constituant les séquences d'ADN dérivées susmentionnées, et ceux constituant la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , ou les fragments d'ADN susmentionnés, est d'au moins environ 60% . de préférence d'environ 90% .
Avantageusement encore, le pourcentage d'homologie entre les acides aminés constituant les séquences peptidiques dérivées susmentionnées, et ceux constituant la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2. ou les fragments peptidiques susmentionnés, est d'au moins environ 60% . de préférence d'environ 90% .
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, les séquences nucléotidiques utilisées sont choisies parmi celles susceptibles de coder pour un ARN antisens, cet ARN antisens étant lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm représenté par SEQ ID N0 3, ledit ARNm étant codé par la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment
Vβ5.1 , à savoir par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID N0 1. Avantageusement, de telles séquences nucléotidiques sont choisies parmi:
- la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID N0 4, ladite séquence d'ADN codant pour l'ARN antisens représenté par SEQ ID N0 5. susceptible de s'hybrider avec l'ARNm représentée par SEQ ID NO 3,
- tout fragment d'ADN antisens d'au moins environ 12 nucléotides contigus de la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID N0 4. susceptible de coder pour un fragment d'ARN antisens d'au moins environ 15 nucléotides contigus de l'ARN antisens représenté par SEQ ID N0 5. ledit fragment d'ARN antisens étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus,
- toute séquence d'ADN antisens dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID N0 4, ou d'un fragment d'ADN antisens tel que défini ci-dessus, notamment par substitution. suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ADN antisens du fragment d'ADN antisens susmentionnés, ladite séquence d'ADN antisens étant susceptible de coder soit pour un ARN antisens identique à celui représenté par SEQ ID N0 5, ou identique à un fragment d'ARN antisens tel que défini ci-dessus, soit pour un ARN antisens dérivé de celui représenté par SEQ ID NO 5, ou dérivé d'un fragment d'ARN antisens tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de l'ARN antisens représenté par SEQ ID NO 5, ou d'un fragment d'ARN antisens tel que défini ci-dessus, ledit ARN antisens dérivé étant lui- même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus.
Il va de soi que les séquences nucléotidiques de l'invention représentées par SEQ ID NO 1. SEQ ID NO 3. SEQ ID NO 4 et SEQ ID NO 5, les séquences dérivées et les fragments de séquences de l'invention mentionnés ci- dessus, doivent être pris en considération comme étant représentées dans le sens 5' → 3' .
Ainsi, le premier nucléotide d'une séquence complémentaire dans le sens 5 ' — » 3 ' telle que décrite ci-dessus, est le complément du dernier nucléotide de la séquence dans le sens 5' — > 3' codant pour la séquence peptidique Vβ5.1 (ou par un fragment de cette séquence peptidique ou un peptide dérivé), le second nucléotide de cette séquence complémentaire est le complément de l 'avant- dernier nucléotide de la séquence codant pour la séquence peptidique Vβ5.1 , et ainsi de suite, jusqu'au dernier nucléotide de ladite séquence complémentaire qui est le complément du premier nucléotide de la séquence codant pour la séquence peptidique Vβ5.1. L'ARN antisens codé par la séquence complémentaire représentée par
SEQ ID NO 4 susmentionnée est tel que, lorsque cet ARN antisens est représenté dans le sens 5' → 3' , son premier nucléotide correspond au dernier nucléotide de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 codant pour la séquence peptidique Vβ5. 1 , et donc s'hybride avec le dernier nucléotide de l'ARNm représenté par SEQ ID NO 3 codé par cette dernière, tandis que son dernier nucléotide correspond au premier nucléotide de la séquence d'ADN codant pour la séquence peptidique Vβ5.1 , et donc s'hybride avec le premier nucléotide de l'ARNm codé par cette dernière.
Ainsi, on entend par ARN antisens dans ce qui précède et ce qui suit, tout ARN codé par la susdite séquence complémentaire et représenté dans le sens inverse (3' — » 5') du sens dans lequel est représenté l'ARNm codé par la séquence codant pour la séquence peptidique Vβ5.1 (ou fragment ou peptide dérivé), ce dernier ARNm étant encore désigné ARNm sens (5' → 3').
Le terme d'ARN antisens s'adresse donc à une séquence d'ARN complémentaire de la séquence en bases de l'ARN messager, le terme complémentaire devant être compris en ce sens que chaque base (ou une majorité de bases) de la séquence antisens (lue dans le sens 3 ' →- 5') est capable de s'apparier avec les bases correspondantes (G avec C, A avec U) de l'ARN messager (séquence lue dans le sens 5 ' → 3 '). L'ARN antisens est un ARN produit par la transcription du brin d'ADN non codant (brin non-sens).
Cette stratégie antisens est plus particulièrement décrite dans le brevet européen n° 240 208, ou dans "Antisense stratégies" Armais of the New York Academy of Sciences, Volume 660 (1992), Editors: Renato Baserga, David T. ,
Denhardt. ou encore dans Médecine/Sciences, 10: 250-281 (1994), ou encore dans Grooke S. T. , Lebleu B. : Antisens Research and Applications, New York: CRC Press Inc. , 1993.
On pense que l' inhibition de la synthèse d'une protéine selon la stratégie antisens, en l'occurrence de la séquence peptidique Vβ5.1 dans le cas présent, est la conséquence de la formation d'un duplex entre les deux ARN complémentaires (sens et antisens) empêchant ainsi la production de la protéine. Le mécanisme cependant reste obscur. Le complexe ARN-ARN peut interférer soit avec une transcription ultérieure, soit avec la maturation, le transport ou la traduction ou bien encore conduire à une dégradation de l'ARNm.
Avantageusement, les fragments d'ADN antisens susmentionnés comprennent environ 12 nucléotides à environ 30 nucléotides contigus. de préférence d'environ 15 nucléotides à environ 20 nucléotides contigus de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 4, susceptibles de coder respectivement pour un fragment d'ARN antisens d'environ 12 à environ 30 nucléotides, de préférence d'environ 15 nucléotides à environ 20 nucléotides de la séquence d'ARN antisens représentée par SEQ ID NO 5.
Des fragments d'ADN antisens préférés susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention sont ceux comprenant tout ou partie: - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 73 et 41 1 de la séquence représentée par SEQ ID NO 4 et codant pour l'ARN antisens délimité par les nucléotides situés aux positions 73 et 411 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5,
- de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 73 et 354 de la séquence représentée par SEQ ID NO 4 et codant pour l'ARN antisens délimité par les nucléotides situés aux positions 73 et 354 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5,
- de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 355 et 41 1 de la séquence représentée par SEQ ID NO 4 et codant pour l'ARN antisens délimité par les nucléotides situés aux positions 355 et 41 1 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5.
Avantageusement, le pourcentage d'homologie entre les nucléotides constituant les séquences d'ADN antisens dérivés susmentionnées, et ceux constituant la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4. ou les fragments d'ADN antisens susmentionnés, est d'au moins environ 60% , de préférence d'environ 90% .
Avantageusement encore, le pourcentage d'homologie entre les nucléotides constituant les séquences d'ARN antisens dérivées susmentionnées, et ceux constituant la séquence d'ARN antisens représentée par SEQ ID NO 5, est d'au moins environ 60% , de préférence d'environ 90% .
Avantageusement, les séquences nucléotidiques choisies parmi celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique ou pour un ARN antisens telles que décrites ci-dessus, et utilisées dans le cadre de la présente invention. sont contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes comprenant les éléments nécessaires pour permettre la transcription des séquences nucléotidiques susmentionnées, notamment un promoteur et un terminateur de transcription.
A ce titre, la présente invention a pour objet toute séquence nucléotidique recombinante contenant une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) de l'invention codant pour une séquence peptidique ou pour un ARN antisens telles que décrites ci-dessus, ainsi que les éléments nécessaires pour la transcription de ces séquences, notamment un promoteur ou un terminateur de transcription.
Le cas échéant, les séquences nucléotidiques recombinantes de l'invention comprennent une séquence nucléotidique codant pour une séquence en acides aminés, ladite séquence nucléotidique étant située en amont et/ou en aval de la séquence nucléotidique de l'invention, lesdites séquences nucléotidiques recombinantes codant ainsi pour une protéine hybride contenant une séquence peptidique telle que décrite ci-dessus de l' invention précédée et/ou suivie par une séquence en acides aminés, notamment une séquence en acides aminés susceptible d'augmenter le caractère immunogène de la protéine hybride par rapport à la seule séquence peptidique susmentionnée de l'invention.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques recombinantes susmentionnées de l'invention sont insérées dans des vecteurs, notamment dans des plasmides, susceptibles de permettre l'expression desdites séquences nucléotidiques recombinantes dans l'organisme.
A ce titre, la présente invention a pour objet tout vecteur, notamment tout plasmide, contenant une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) recombinante(s) telle(s) que définie(s) ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de vecteurs tels que décrits ci-dessus, notamment de plasmides. contenant des séquences nucléotidiques recombinantes selon l'invention, ces dernières contenant elles- mêmes au moins une séquence nucléotidique selon l'invention codant pour une séquence peptidique, telle que décrite ci-dessus, susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, pour l'obtention de vaccins contre la myasthénie, susceptibles notamment d'être utilisés en prophylaxie ou thérapie dans le cadre du traitement des patients décrits ci-dessus, ces vaccins étant encore désignés vaccins à ADN nu.
A titre d'illustration, on peut citer les revues générales et celles plus spécifiques sur les vaccins à ADN nu suivantes: Ladenheim, Biofutur, mai 1995, pp. 15-21 ; Xiang et al.. Virology, 199, 132-140 (1994); Xu and Liew. Vaccine, vol. 12, n° 16, 1534-1536. (1994); Cichutek. Vaccine, vol. 12. n° 16,
1520-1525, (1994); Danko and Wolff, Vaccine, vol. 12, n° 16, 1499-1502 (1994); Davis et al., Vaccine, vol. 12. n° 16, 1503-1508 (1994); Spooner et al.. Gène Therapy, 2, 173-180 (1995); Manthorpe et al., Human Gène Therapy, 4, 419-431 (1993); Whalen and Davis. Clinical Immunology and Immunopathology, vol. 75, n° 1 , April, pp. 1-12 (1995); Ulmer et al.. Science.
259, 1745-1749 (1993).
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les séquences nucléotidiques utilisées sont celles susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines. Avantageusement, de telles séquences nucléotidiques sont choisies parmi celles complémentaires de tout ou partie de l'un des brins de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , notamment parmi des séquences nucléotidiques comprenant au moins environ 12 nucléotides contigus jusqu'au nombre maximum de nucléotides de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 4 complémentaire de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID N0 1 , ou parmi des fragments d'ADN antisens tels que décrits ci-dessus, ou encore parmi des séquences d'ADN dérivées de tout ou partie de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 4 ou des fragments d'ADN antisens susmentionnés, notamment par substitution, suppression et/ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s).
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les séquences nucléotidiques utilisées sont celles s'hybridant avec tout ou partie de l'ARNm codé par la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ces séquences nucléotidiques représentent elles-mêmes un ARN antisens, cet ARN antisens étant avantageusement constitué d'au moins environ 12 nucléotides contigus complémentaires de nucléotides de l'ARNm susmentionné. Avantageusement, de telles séquences nucléotidiques sont choisies parmi :
- la séquence d'ARN antisens représentée par SEQ ID N0 5, - tout fragment d'au moins environ 12 nucléotides contigus de la séquence d'ARN antisens représentée par SEQ ID NO 5, ledit fragment étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm représenté par SEQ ID NO 3 défini ci-dessus, - toute séquence d'ARN antisens dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ARN antisens représentée par SEQ ID NO 5, ou d'un fragment tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ARN antisens ou du fragment susmentionnés, ladite séquence d'ARN antisens dérivée étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus.
Avantageusement, les fragments d'ARN antisens susmentionnés comprennent environ 12 nucléotides à environ 30 nucléotides contigus, de préférence d'environ 15 nucléotides à environ 20 nucléotides contigus de la séquence d'ARN représentée par SEQ ID NO 5. susceptibles de s'hybrider avec l'ARNm représenté par SEQ ID NO 3 défini ci-dessus.
Des fragments d'ADN antisens préférés susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention sont ceux comprenant tout ou partie:
- de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 73 et 411 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5, - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 73 et 354 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5,
- de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 355 et 411 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5.
Avantageusement, le pourcentage d'homologie entre les nucléotides constituant les séquences d'ARN antisens dérivées susmentionnées et ceux constituant la séquence d'ARN représentée par SEQ ID NO 5, ou les fragments d'ARN antisens susmentionnés, est d'au moins environ 60% , de préférence d'environ 90% .
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les séquences peptidiques utilisées sont celles susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines. Avantageusement, les séquences peptidiques susmentionnées sont choisies parmi:
- la séquence peptidique représentée par SEQ ID N0 2, - tout fragment peptidique d'au moins environ 5 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID N0 2, ledit fragment étant susceptible d'engendrer la production d'anticorps chez un patient, ces anticorps étant capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1 susmentionnée,
- toute séquence peptidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s) de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2 ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ladite séquence peptidique étant susceptible d'engendrer la production d'anticorps chez un patient, ces anticorps étant capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1. Avantageusement, les fragments peptidiques susmentionnés comprennent environ 5 acides aminés à environ 136 acides aminés contigus de préférence, d'environ 20 acides aminés à environ 100 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps tels que définis ci-dessus. Des fragments peptidiques préférés sont ceux comprenant tout ou partie:
- de la séquence peptidique de 114 acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, cette séquence peptidique étant constituée successivement d'une part par les 19 acides aminés délimités par les acides aminés situés aux positions 1 et 19 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2 et correspondant au peptide signal, et d'autre part, par les 94 acides aminés délimités par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2,
- de la séquence peptidique de 94 acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par
SEQ ID NO 2,
- de la séquence peptidique de 19 acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 19 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2. Des fragments peptidiques préférés sont ceux d'environ 20 acides aminés à environ 100 acides aminés comprenant tout ou partie de la région CDRl et/ou de la région CDR2 susmentionnées du segment Vβ5.1.
Des fragments peptidiques susmentionnés particulièrement préférés sont ceux comprenant: - tout ou partie du peptide de 6 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 45 et 50 de la séquence représentée par
SEQ ID NO 2, et correspondant à la région CDRl . et/ou - tout ou partie du peptide de 15 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 67 et 81 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, et correspondant à la région CDR2.
Avantageusement encore, le pourcentage d'homologie entre les acides aminés constituant les séquences peptidiques dérivées susmentionnées, et ceux constituant la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou les fragments peptidiques susmentionnés, est d'au moins environ 60% , de préférence d'environ 90% .
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les séquences peptidiques utilisées en tant qu'anticorps sont celles susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines. Avantageusement, lesdits anticorps sont des anticorps polyclonaux ou monoclonaux tels qu'obtenus par immunisation d'un animal avec des séquences peptidiques choisies parmi : - la séquence peptidique représentée par SEQ ID N0 2,
- tout fragment d'environ 5 à environ 136 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID N0 2. notamment tout fragment peptidique tel que décrit ci-dessus, ledit fragment étant susceptible de permettre la production par le système immunitaire d'un animal, d'anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1 ,
- toute séquence peptidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s), de la séquence peptidique représentée par SEQ ID N0 2 ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ladite séquence peptidique dérivée étant susceptible de permettre la production par le système immunitaire d'un animal, d'anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1.
L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, codant pour une séquence peptidique représentant elle-même un anticorps capable de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies ci-dessus, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis ci-dessus. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, codant pour un ARN antisens, lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés du segment Vβ5. 1 du récepteur des cellules T humaines, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies ci-dessus, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis ci-dessus. L' invention vise également les compositions pharmaceutiques comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou avec tout ou partie de l'ARNm codé par cette séquence d'ADN.
L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, correspondant à des anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines.
L' invention concerne également les vaccins, encore désignés vaccins à ADN nu tels que décrits ci-dessus, et comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telles que décrite(s) ci-dessus, susceptible(s) de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies ci-dessus, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis ci-dessus.
L'invention a également pour objet les vaccins comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, susceptible(s) d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec la séquence en acides aminés du segment Vβ5. 1 du récepteur des cellules T humaines. Avantageusement, les compositions pharmaceutiques et vaccins selon l'invention se présentent sous forme de préparations injectables, notamment par voie intraveineuse, de préférence par voie intramusculaire, ou par voie sous- cutanée. L'invention concerne également les complexes formés entre les séquences nucléotidiques susmentionnées utilisées dans le cadre de la présente invention, et la séquence d'ADN ou d'ARN codant pour ledit segment Vβ5.1.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet:
- les complexes formés entre la séquence d'ADN complémentaire représentée par SEQ ID NO 4, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière, tels que définis ci-dessus, avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour ledit segment Vβ5.1 ;
- les complexes formés entre la séquence d'ARN antisens représentée par SEQ ID NO 5, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière tels que définis ci-dessus, avec tout ou partie de la séquence d'ARNm codant pour ledit segment Vβ5.1.
L'invention concerne également les complexes formés entre les séquences peptidiques susmentionnées utilisées dans le cadre de la présente invention, et la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les complexes formés d'une part entre les anticorps, soit directement administrés à un patient. soit engendrés par l'introduction dans l'organisme, ou par la production dans l'organisme (cas du vaccin à ADN nu), de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou d'un fragment ou d'une séquence dérivée de cette dernière tels que définis ci-dessus, et d'autre part tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1.
Les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont obtenues par toute méthode classique bien connue de l'homme du métier de clonage ou de synthèse nucléotidique. S'agissant de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1. cette dernière a été clonée par Kimura et al. , J. Exp. Med. , 184, 739-750 (1988); son numéro d'accès dans Gène bank est le X04927.
Les séquences peptidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont obtenues par toute méthode classique bien connue de l'homme du métier de synthèse peptidique en phase liquide ou solide.
L' invention a plus particulièrement pour objet les polypeptides recombinants, et notamment la séquence peptidique correspondant au segment
Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, à savoir la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou les fragments ou les séquences peptidiques dérivées susmentionnées, tels qu'obtenus par transformation de cellules (telles que des bactéries, notamment E. coli. des levures, des cellules d'insectes infectées par un Baculovirus, des cellules eucaryotes telles que les cellules Cos ou CHO) avec une séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci- dessus, contenant une séquence d'ADN selon l' invention, notamment à l 'aide d'un vecteur tel que décrit ci-dessus.
Par l'expression "polypeptides recombinants" , on doit entendre toute molécule possédant une chaîne polypeptidique susceptible d'être produite par génie génétique, par l'intermédiaire d'une phase de transcription de l'ADN du gène correspondant, ce qui conduit à l'obtention d'ARN qui est par la suite transformé en ARNm (par suppression des introns), ce dernier étant ensuite traduit par les ribosomes, sous forme de protéines, le tout étant effectué sous contrôle d'éléments de régulation appropriés à l'intérieur d'une cellule hôte. Par conséquent, l 'expression "polypeptides recombinants" utilisée n'exclut pas la possibilité que lesdits polypeptides comprennent d'autres groupements, tels que les groupements glycosylés.
Bien entendu, le terme "recombinant" indique que le polypeptide a été produit par génie génétique, car il résulte de l'expression, dans un hôte cellulaire approprié, de la séquence nucléotidique correspondante qui a été auparavant introduite dans un vecteur d'expression utilisé pour transformer ledit hôte cellulaire.
L'invention concerne également les anticorps tels que décrits ci-dessus dirigés contre les séquences peptidiques utilisées dans le cadre de l'invention, et plus particulièrement ceux dirigés contre les polypeptides recombinants susmentionnés, notamment ceux dirigés contre la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière tels que définis ci-dessus.
De tels anticorps peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec ces polypeptides, suivie de la récupération des anticorps formés. II va de soi que cette production n'est pas limitée aux anticorps polyclonaux.
Elle s'applique encore à tout anticorps monoclonal produit par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat. immunisés contre l'un des polypeptides purifiés de l'invention d'une part, et des cellules d'un myélome approprié d'autre part, et d'être sélectionné, par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le polypeptide susmentionné initialement mis en oeuvre pour l'immunisation des animaux. A ce titre, l 'invention a plus particulièrement pour objet les anticorps humanisés ou chimériques tels qu'obtenus à partir de l 'ADN codant pour les anticorps susmentionnés selon les méthodes classiques d'obtention de ces anticorps, ces méthodes étant décrites et commentées notamment dans: Winter G. , Harris W.J. , Immunology Today, vol. 14, n° 6, 243-246 (1993); Bach J.F. et al. , Immunology Today, vol. 14, n° 9, 421-425 (1993); Bach J.F.. The Immunologist, 214, 135-137 (1994).
Ces anticorps humanisés sont plus particulièrement caractérisés en ce que leur partie spécifique reconnaissant le fragment Vβ5.1 est constituée d'une séquence en acides aminés d'origine animale, notamment de souris, tandis que leur partie non spécifique ne reconnaissant pas le segment Vβ5.1 est constituée d'une séquence en acides aminés d'origine humaine.
L'invention vise également les compositions pharmaceutiques comprenant les anticorps humanisés susmentionnés en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L' invention a également pour objet toute méthode de traitement et/ou de prévention de la myasthénie par administration d'une ou plusieurs compositions pharmaceutiques, et/ou d'un ou plusieurs vaccins décrits ci-dessus selon l'invention, à un patient atteint de myasthénie, et plus particulièrement à un patient ayant un haplotype HLA-DR3.
L'invention sera davantage illustrée dans la description détaillée qui suit de la mise en évidence de l'implication du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T dans la myasthénie autoimmune acquise chez des patients d'haplotype HLA DR3.
Matériel et méthodes
Patients
Les patients ont été suivis à l'hôpital Marie Lannelongue. Le diagnostic de la myasthénie a été effectué sur la base de caractéristiques cliniques, du décrément électromyographique et de l'effet positif de médicaments anticholinestérasique. Sept patients ont été sélectionnés dans cette étude, en fonction de critères précis. Ils sont jeunes, presque tous de sexe féminin, présentant une maladie généralisée, un thymus hyperplasique et un titre élevé en anticorps anti-RACh et ont de préférence développé récemment la pathologie. L'utilisation d'anticholinastérasique a été l'unique traitement. Les patients suivis par corticotherapie ont été exclus, car ce traitement modifie considérablement les populations thymiques (14). Le typage HLA a été déterminé par oligotypage selon la méthode décrite par (référence 29). L'hyperplasie est limitée au thymus caractérisé par la présence de centres germinatifs, tels que décrits par Rosaï et Levine (13). La classification modifiée d'Osserman a été utilisée pour graduer la sévérité de la pathologie (41). Tous les patients ont une forme généralisée de la pathologie.
Les patients présentant un degré de sévérité IIA, présentent une activité fonctionnelle modérément déréglée et une faiblesse modérée des muscles des membres ou oculaires. Les patients avec un degré de sévérité IIB présentent un grand dérèglement de l'activité fonctionnelle et des signes importants de faiblesse de la musculature des membres et bulbaire. Les anti-RACh ont été titrés en utilisant le RACh de muscle humain complexé avec l'α-bungarotoxine iodée telle que décrite dans (42).
Isolement des cellules T thymiques et du sang périphérique
Les thymus ont été obtenus à partir de patients myasthéniques ayant subi une thymectomie après prescription thérapeutique de cette dernière à l'hôpital Marie Lannelongue (Le Plessis-Robinson, France). Tous les thymus des sept patients étaient hyperplasiques et contenaient des follicules lymphoïdes tels que décrits dans (13, 18).
Les thymus ont été rincés dans du HBSS (Hank's Balanced Sait Solution) et des suspensions cellulaires ont été obtenues par broyage en douceur du tissu thymique, suivi par un passage à travers une gaze stérile, lavage et congélation dans l'azote liquide jusqu'à utilisation. Après décongélation, une perte d'environ 15-20 % des thymocytes corticaux immatures CD1 + (CD4+ CD8 + ) a été observée, entraînant une augmentation proportionnelle du pourcentage de thymocytes médullaires matures CD4 +CD8- et CD4-CD8 + . Comme cette étude est essentiellement axée sur les cellules thymiques matures CD4 + (thymocytes sans CD8), ceci n'était pas préjudiciable. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été obtenues par centrifugation en gradient de densité de sang veineux recueilli sur EDTA. Les cellules isolées ont été lavées dans HBSS et congelées jusqu'à utilisation. Aucune altération des sous-populations de PBMC n'a été observée après décongélation, et la viabilité confirmée par exclusion de la coloration au bleu trypan. est supérieure à 95 % au moment de l'utilisation. Synthèse peptidique
La synthèse et la purification des peptides correspondant aux positions 169-181 et 351-368 de la sous-unité α du RACh a été réalisée par la méthode en phase solide (43). La composition des acides aminés des peptides a été vérifiée par analyse en acide aminés. Les séquences en acides aminés de ces peptides sont décrites dans la référence 36. Les deux peptides correspondent à des domaines sélectionnés de la sous-unité α du RACh. Le peptide 169-181 est extra cytoplasmique et correspond à une séquence avoisinant le site de liaison de l'α- bungarotoxine sur la sous-unité α. Il contient un motif de 5 résidus (séquence
175-179) que l'on retrouve généralement dans les sites antigéniques connus des cellules T (44). Le peptide 351-368 est intracytoplasmique et correspond à une région fortement immunogène désignée HIR (35). Sa séquence est dans une conformation hélicoïdale dans la protéine intacte et par conséquent, présage d'un site antigénique selon Delisi et al. (45). De plus, les deux peptides contiennent un à deux résidus d'ancrage en position adéquate pour la liaison à la molécule HLA-DR3 qui, par ailleurs, représente un allèle HLA de classe II associé à la myasthénie, selon l'un ou l'autre des motifs de liaison décrits (46-50).
Fragments recombinants RACh α
L'ADNc de la sous-unité α du RACh humain contient l'exon P3A (51). Le plus grand fragment extracytoplasmique correspondant aux acides aminés 1-210, a été clone sous forme de protéine de fusion dans un vecteur disponible commercialement (pMAL®-C2, New England Biolabs, Beverly, MA) en aval du gène mal E qui code pour une protéine de liaison au maltose (MBP). et a été fortement exprimé dans E. coli.
Un codon stop a été placé en position 211 , afin d'assurer la terminaison de la traduction. La majorité (90 %) de la protéine de fusion était insoluble et trouvée sous forme de corps d'inclusion.
Après extraction dans l'urée 8M des corps d'inclusion lavés, puis dialyse étape par étape dans des tampons avec des concentrations décroissantes d'urée pour la renaturation, la protéine de fusion était pure à 70 % . La protéine de fusion a ensuite été purifiée en une étape en utilisant l'affinité de la MBP pour le maltose. puis scindée en utilisant le facteur de coagulation Xa selon les recommandations du fabricant. Le fragment ri -210 a été purifié par électrophorese préparative à élution continue avec un haut rendement (80-90 % ) et un haut niveau de pureté. La pureté est un facteur critique car elle permet de minimiser le risque d'observer des réactions faussement positives aux protéines recombinantes en raison de contamination par des protéines bactériennes. Le fragment αr 1 -120 a été stérilisé par filtration à travers des membranes de 0,22 μm et stocké à - 20°C jusqu'à utilisation dans des expériences de prolifération. Il entraîne l'apparition de réponses prolifératives des PBMC et des thymocytes de nombreux patients MG inclus ou non dans cette étude.
Expériences de déplétion des sous-populations CD8 et Vβ
Les sous-populations de PBMC et lymphocytes thymiques exprimant CD8 (ainsi que les cellules doublement positives CD4-r-CD8+ de thymus) ont été déplétées par sélection positive des cellules CD8 -K en utilisant des billes paramagnétiques couplées à des anti-CD8+ (IObeads. Immunotech, Marseille. France), en suivant les instructions du fabricant. Pour les expériences de déplétion de la sous-population Vβ, des billes paramagnétiques couplées à des immunoglobulines de souris liées à des anti-Vβ5.1 ou des anti-Vβ8 ont été utilisées selon les recommandations du fabricant (Immunotech) tout de suite après déplétion des CD8, et la culture a été effectuée selon la méthode décrite ci-dessus.
Culture cellulaire pour l'analyse de l'expression du segment Vβ des récepteurs des cellules T (TCR)
Les PBMC ou les cellules T thymiques déplétées en CD8 ont été mises en culture pendant 6 jours dans des plaques à 48 puits (Falcon. Becton Dickinson) dans un milieu (RPMI 1640) complété avec 5 % de sérum AB humain, glutamine 2 mM, pénicilline 100 IU/ml, streptomycine 100 μg/ml. 1 % MEM acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium 1 mM, tampon hepes 10 mM (tous provenant de Gibco. Détroit, MI), β-mercaptoéthanol 5 x 10" 5M avec ou sans un peptide de synthèse sélectionné (5 μg/ml) ou le fragment ri -210 (5 μg/ml), puis de l'IL-2 naturelle purifiée (10 U/ml) (Boehringer Mannheim.
GmbH, Mannheim, Allemagne) est ajoutée pendant 2 jours. Au moins 10 puits (jusqu'à 15 puits) ont été préparés pour chacune des conditions de culture et ont été regroupés pour le procédé de marquage fluorescent. Dans les expériences d'inhibition utilisant les alloantisérums anti-DR3 spécifiques, le sérum a été additionné au début de la culture à une concentration variant de 0, 1 % à 10 % . Immunofluorescence et cytométrie de flux
Les analyses de cytométrie de flux à deux couleurs ont été réalisées 8 jours après stimulation avec l'IL-2 seule, ou peptide + IL-2, en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques anti-CD4 et anti-TCR-Vβ.
Les anticorps monoclonaux (mAbs) suivants, dirigés contre la région V du TCR ont été utilisés : anti-Vβ5a (reconnaissant Vβ5-2 et 5.3), anti-Vβ5b (reconnaissant Vβ5-3 seulement), anti-Vβ5c (reconnaissant Vβ5.1 seulement), anti-Vβόa (reconnaissant un allèle allotypique, Vβ6.7), anti-Vβ8a (reconnaissant la famille Vβ8), anti-Vβl2a (reconnaissant la famille Vβ l2), tous disponibles commercialement chez T Cell Sciences, Cambridge, MA. Tous les anticorps étaient couplés au FITC. L' immunofluorescence directe a été réalisée selon les instructions du fabricant. Pour le double marquage, après 3 lavages, une étape additionnelle consiste en une coloration avec un anti-CD4 conjugué à la phycoérythrine (Immunotech) pendant 30 minutes à 4°C. Après lavages, les cellules ont été incubées pendant 20 minutes avec 2 μg/ml d' iodure de propidium (PI, Becton Dickinson, Mountain View, CA) (52). Les cellules mortes ont été exclues lors de l'analyse par coloration positive au iodure de propidium.
Expérience de prolifération et de déplétion de la sous-population Vβ
Les cellules T périphériques ou thymiques déplétées en cellules CD8 ont été cultivées dans des puits de plaque de microtitration (Costar) (0,2 x 105 cellules/puits) dans le milieu décrit ci-dessus avec ou sans 5 μg/ml de peptide.
Après 6 jours, rIL-2 (10 U/ml) est additionnée et 2 jours après 1 μCi de thymidine tritiée (activité spécifique 6,7 Ci/mmole : New England Nuclear. Boston, MA) est ajouté à chaque puits pendant 18 heures. Les cellules sont ensuite récoltées et l' incorporation de thymidine tritiée détectée par comptage de la radioactivité sur des filtres de fibre de verre dans un compteur à liquide de scintillation (LKB, Bromma, Suède). Six puits identiques sont préparés pour chaque condition de culture. Les résultats sont exprimés en index de stimulation défini par: cpm avec peptide pour 10^ cellules/cpm sans peptide pour 10 cellules. Lorsqu' indiqué, un alloantisérum anti-DR3 a été ajouté pour inhiber la prolifération cellulaire telle que décrite ci-dessus. Résultats
Stratégie expérimentale.
Afin de déterminer le répertoire des cellules T impliquées dans la réponse à des peptides de la sous-unité α du RACh. les thymocytes ou PBMC dépiétés en CD8 provenant de patients myasthéniques ont été stimulés avec un peptide puis par l'IL-2 pour permettre la régénération de récepteurs potentiellement modulés (53, 54). Les cellules furent ensuite récoltées et analysées par Immunofluorescence à deux couleurs et cytométrie de flux pour l'expression de
CD4 et de Vβ d'une part sur les petites cellules (au repos) et d'autre part sur les grandes cellules (activées). L'épuisement en cellules CD8 + a été très efficace dans les lymphocytes sanguins ainsi que dans les lymphocytes thymiques. L'analyse par cytométrie de flux donne moins de 0.5 % de cellules CD8 + ou de cellules CD4 + CD8 + après déplétion. De plus, aucune expansion de cellules
CD8 + n'a été observée après neuf jours de culture avec le peptide et IL-2.
L'activation in vitro des cellules thymiques T CD4+ conduit à une blastogénèse qui peut être facilement identifiée par des paramètres de taille (FSC) et de granulosité (SSC). Les cellules blastiques activées apparaissent plus grandes et plus granuleuses que les cellules non blastiques, ces dernières ayant une taille et une granulométrie typique des lymphocytes pris ex-vivo non stimulés. Les cellules activées représentent environ 5 % à 12 % de la population totale dans la culture, sur la base de l'expression de DR et de CD25. L'analyse de l'expression de Vβ par les cellules CD4+ après stimulation avec les peptides, a été réalisée avec des anticorps contre les membres des familles Vβ5.
Vβ8, Vβ6 et Vβl2. Il est important de noter que, dans toute les analyses cytométriques, les cellules mortes ont été exclues par coloration à l' iodure de propidium. De plus, la spécificité de la liaison de l'anticorps à la région Vβ des TCR a été confirmée par utilisation d'anticorps témoins de même isotype qui colorent moins de 0,5 % de cellules T dans les cultures.
Une augmentation de la proportion de cellules blastiques, ainsi que des variations de la distribution des segments Vβ au sein des cellules blastiques. sont considérées comme représentant une réponse significative au peptide. Lorsque l'analyse est effectuée sur l'ensemble des cellules vivantes, aucune différence mesurable n'est observée dans les cultures stimulées par les peptides du RACh en comparaison avec les cultures témoins non stimulées. Une augmentation mesurable de sous-populations Vβ sélectives ne peut être observée que dans les cellules blastiques activées. C'est pourquoi l'analyse cytotluorographique a été effectuée sur une accumulation d'événements (plusieurs milliers) correspondant à la population activée vivante, permettant ainsi une détermination plus précise des cellules CD4+ exprimant un Vβ donné.
Expansion spécifique des cellules exprimant un Vβ donné dans les cellules T thymiques matures CD4+ provenant de patients MG en réponse aux peptides synthétiques.
Les expériences décrites ci-dessus ont été réalisées pour analyser l 'expression du segment Vβ en réponse aux antigènes dérivés du RACh chez 7 patients MG. L'analyse cytofluorographique de l'utilisation de la région Vβ en réponse aux peptides 169-181 et 351-368 et au fragment recombinant rαl-210 du RACh. conduit aux observations suivantes. Chez un patient pris comme exemple (patient n° 2). la stimulation des cellules thymiques CD4+ avec le peptide 169-181 entraîne une augmentation spécifique et mesurable des cellules Vβ5. 1 + (de 5.3 à 14,4 %) et des cellules Vβ8 + (de 7.4 à 10,4 %) alors que ce même peptide n' induit aucune augmentation des autres familles Vβ testées. Le peptide 351-368 induit également une augmentation significative des Vβ5.1 + dans les thymocytes CD4+ de ce patient. Le fragment recombinant rαl-210 a été utilisé initialement en tant que source de peptides susceptibles de pouvoir être naturellement générés. Toutefois, l'engagement de nombreux segments de gènes Vβ dans la réponse des thymocytes et PBMC à ce fragment a conduit les inventeurs à utiliser une autre stratégie par utilisation de peptides sélectionnés pour étudier le répertoire de cellules T impliquées dans la réponse à l'autoantigène chez les patients MG. Quoiqu'il en soit, les expériences utilisant le fragment ri -210 confirment la nature multidéterminante de l'autoantigène
RACh et spécialement celle de la chaîne α qui a été intensément étudiée (36-40). Afin de visualiser la stimulation spécifique de la région Vβ par les peptides chez tous les patients de même que pour comparer de façon appropriée parmi différents patients les sous-populations de cellules T portant un segment Vβ donné après stimulation peptidique, les résultats ci-après sont exprimés sous forme de différences calculées entre le pourcentage de cellules blastiques T CD4+ portant un segment Vβ particulier après stimulation et le pourcentage de cellules T CD4+ portant ce segment Vβ dans les cultures témoins (sans peptide). En terme de variation du répertoire des cellules T en réponse à un peptide, il est raisonnable de considérer qu'une différence de 2 % est significative. Par conséquent les différences supérieures à 2 % constituent des expansions significatives. Cela prend également en compte le fait que la fréquence des cellules répondant au peptide dans la myasthénie se situe entre 1/100 000 à 1/200 000 (55, 56) et que les variations dues aux erreurs d'analyse par FACS® sont habituellement évaluées à 0,5 % . Par conséquent, il est très signifiant que les cellules T portant Vβ5.1 et, à un moindre degré Vβ8. soient enrichies en grandes cellules après activation par les peptides. Sur les 6 patients étudiés. 5 (tous d'haplotype HLA-DR3) présentent cette expansion de la région Vβ5. 1 dans les thymocytes. Le sixième patient qui ne présente pas d'expansion a des caractéristiques cliniques et biologiques qui sont précisées plus loin, et notamment n'a pas l'haplotype HLA-DR3. Les différences négatives observées dans d'autres sous-populations Vβ sont probablement dues à une compensation due à l'enrichissement en cellules Vβ5. 1 + (et Vβ8 + ). L'expansion des Vβ5. 1 varie approximativement de 2 à 10 % dans les thymocytes stimulés avec p 169- 181. et de 2 à 4 % dans les thymocytes stimulés avec p351-368.
Utilisation de segments Vβ dans la réponse aux peptides synthétiques dans les PBMC
De même que pour l'étude des thymocytes, les expansions n'ont pu être détectées que parmi les cellules activées, de sorte que seuls les résultats sur les cellules activées sont présentés. La prévalence de l'expansion des cellules exprimant Vβ5.1 en réponse au peptide 169-181 est très nette dans les PBMC et concerne 6 des 7 patients étudiés, bien que des niveaux d'expansion moindres soient observés en comparaison avec les thymocytes.
Par ailleurs, la restriction à Vβ5.1 est plus marquée ; les autres familles ou autres membres de la famille Vβ5 sont moins fréquemment utilisés, à l 'exception de Vβ8 qui est augmenté chez 3 patients sur 7. Peu d'expansions significatives ont été observées avec le peptide 351-368; elles n'ont impliqué que la famille Vβ5.1 (sur 1 patient parmi les 7 étudiés, MG). Encore une fois, l'expansion des cellules exprimant Vβ5.1 a uniquement été observée chez les cellules CD4+ activées en réponse aux peptides.
La prolifération spécifique en réponse aux peptides est supprimée dans les cellules thymiques CD4+ après déplétion en Vβ5.1
Des expériences de déplétion ont été effectuées pour étudier davantage la spécificité et la sélectivité de l'implication de Vβ5.1 dans la réponse aux peptides synthétiques. Les cellules T thymiques CD4+ déplétées en cellules exprimant Vβ5.1 ont été comparées aux cellules T thymiques CD4+ totales du point de vue de leur capacité proliférative en réponse aux peptides. Plus de 86 % d'épuisement en cellules exprimant Vβ5. 1 chez deux patients suppriment les réponses prolifératives aux peptides ainsi qu'au fragment recombinant rαl-210.
Analyse des résultats chez tous les patients étudiés
Un résumé de l'analyse de l'utilisation des fragments Vβ par les cellules T CD4+ de patients myasthéniques en réponse aux peptides 169-181 et 351-368. est représenté sur le tableau 2.
Les différences d'expression de Vβ calculée de la manière indiquée ci- dessus, et représentant la stimulation d'une population exprimant un Vβ donné, révèlent la prévalence de l'expansion des cellules exprimant Vβ5.1 en réponse au peptide 169-181 dans le thymus et à la périphérie. L'implication de Vβ5.1 est moins nette en réponse au peptide 351-368. Elle apparaît au niveau des thymocytes ou PBMC provenant de patients chez lesquels la maladie s'est récemment déclarée. Dans tous les cas, et au moins en ce qui concerne les thymocytes, l'utilisation de Vβ5.1 en réponse à ce peptide est observée exclusivement chez les patients sévèrement affectés.
L'haplotype DR3 est fortement associé à l'utilisation de Vβ5. 1 dans la réponse au peptide 169-181
Tous les patients, sauf un, expriment l'haplotype DR3 (patient 7). Chez ce patient, le pourcentage de cellules Vβ5.1 + CD4 + (thymocytes ou PBMC) n'est pas augmenté en réponse aux peptides 169-181 ni au peptide 351-368. De plus, lorsque les alloantisérums anti-DR3 spécifiques sont ajoutés dans les cultures, à la fois la prolifération consécutive au peptide 169-181 et l'expansion des cellules exprimant Vβ5.1 ont été inhibées, ce qui indique que la molécule DR3 joue un rôle majeur dans le cadre de la présentation du peptide.
En conclusion:
Les cellules T reconnaissent un complexe formé d'un antigène peptidique lié à des molécules du CMH par l'intermédiaire d'un récepteur spécifique en tant que troisième composant d'un complexe trimoléculaire. Ces travaux fournissent pour la première fois des résultats montrant une association entre l'expression d'un gène TCR et la spécificité pour une combinaison particulière peptide du soi/CMH dans la myasthénie autoimmune acquise humaine.
Ces résultats montrent l'utilisation récurrente d'un segment de gène du TCR encore appelé Vβ5.1. en réponse au peptide synthétique 169-181 (et à un moindre degré au peptide p351-368) par les cellules T CD4 + thymiques et du sang périphérique dans un sous-groupe de patients myasthéniques partageant l'haplotype DR3. Par conséquent, les interactions in vivo impliquant le peptide 169-181 de la sous-unité α du RACh, les récepteurs des cellules T constitués du segment Vβ5.1. et la molécule HLA DR3 sont fortement probables, ce qui autorise une immuno-intervention potentielle dans un sous-groupe de jeunes patients myasthéniques.
Cette étude sur un groupe homogène sélectionné de patients myasthéniques présentant des signes cliniques communs tels qu'un thymus hyperplasique, une maladie généralisée et un titre élevé en anticorps, démontre une sélectivité Vβ partagée entre différents patients dans la réponse immune cellulaire au peptide synthétique 169-181 , (et à un moindre degré au peptide 351-368), de la sous- unité α du RACh, qui est fortement associée à l'haplotype HLA DR3. La spécificité de cette expansion originale, mesurable, en réponse au peptide est appuyée par plusieurs arguments expérimentaux. Tout d'abord, elle est observée exclusivement dans la population des cellules blastiques activées, indiquant un effet réel du peptide sur l'expansion cellulaire, et pas seulement une sélection d'une population préexistante dans la culture. Deuxièmement, les artefacts dans l 'analyse des résultats ont été soigneusement évités en excluant les cellules mortes des cultures en utilisant l'incorporation de l' iodure de propidium. De plus, les expériences de marquage fluorescent ont été réalisées avec des anticorps directement couplés au fluorochrome, et ont toujours inclus des contrôles négatifs. Troisièmement, l'expansion de Vβ5.1 est comprise dans l 'expansion de la population entière CD4 + . Quatrièmement, les cellules T des patients répondent aux peptides par prolifération, et la déplétion en cellules exprimant Vβ5.1 a inhibé cette prolifération. Cinquièmement, un alloantisérum anti-DR3 inhibe non seulement la prolifération au peptide 369-391 , mais également l'expansion des cellules exprimant Vβ5.1 en réponse à ce peptide.
Il peut être apprécié que l'augmentation spécifique des cellules T CD4 + exprimant Vβ5.1 après stimulation peptidique, est plus importante dans le thymus. Il est possible que les cellules T répondant au peptide proviennent du thymus au stade d' initiation de la maladie et migrent vers la périphérie où elles se trouvent à l'état actif chez les patients à début récent de la maladie.
Le RACh est un autoantigène multiépitopique comme l' indique le grand nombre d' épitopes de cellules T, trouvés par différents groupes de recherche sur la sous-unité α ainsi que sur les autres sous-unités (36-40). L'approche des inventeurs est basée sur la sélection de deux peptides de la sous-unité α du RACh pour lesquels la réponse proliférative mémoire T chez les patients est corrélée aux données cliniques (titre en anticorps, sévérité de la maladie). Ces peptides sont par conséquent potentiellement pathogènes et impliqués dans la maladie (36) lorsque l'on prend en considération les arguments suivants :
1) le rôle de ces peptides dans la réponse proliférative in vitro des cellules T mémoire de patients myasthéniques a également été confirmée par deux études indépendantes réalisées sur des patients italiens (39) et israéliens (40);
2) d'autres études ayant pour but de définir des épitopes de cellules T chez des patients myasthéniques. n'ont pas pris en compte la variation des formes cliniques de la maladie et les sous-populations de patients, et ont fourni des données sur peu de patients dont des patients âgés avec de faibles taux en anticorps, représentant une minorité parmi la population totale de patients myasthéniques (37. 57-59);
3) à la différence de plusieurs épitopes décrits dans la littérature, les peptides susmentionnés ne génèrent en général pas de réponse chez les témoins (22, 40,60). Le répertoire immun normal contient des cellules T autoréactives pour le RACh et d'autres autoantigènes (56, 61. 62,63), et il peut être admis que les spécificités des cellules T autoréactives les plus fréquentes dans le répertoire immun normal sont moins impliquées dans la maladie et vice versa:
4) le suivi, après thymectomie, de la réaction de PBMC de trois patients myasthéniques (non inclus dans cette étude) répondant au peptide p 169-181 avant l'intervention, ne révèle aucune réponse proliférative une à deux années après l'intervention chirurgicale;
5) l'expansion des cellules CD4 en réponse au peptide implique les cellules exprimant Vβ5.1 chez tous les patients partageant l'allèle HLA-DRB 1 *03. Le partage de spécificité de cellules T par différents patients myasthéniques exprimant un allèle HLA DR Bl commun (HLA-DR3), qui est par ailleurs associé à la maladie, démontre que les cellules ayant proliféré en réponse au peptide sont caractéristiques de la maladie.
Tous ces points pris ensemble indiquent que les deux peptides sélectionnés dans cette étude présentant une réactivité associée aux données cliniques, sont susceptibles d'être impliqués dans la pathogenèse de cette maladie.
La myasthénie est associée à une augmentation de la fréquence de l'allèle DR3 (26-30). cette association est plus évidente chez les femmes, chez les patients jeunes et chez les patients présentant une hyperplasie thymique (27). Par ailleurs, l' hyperplasie thymique est associée à un titre élevé en anticorps et à une forme généralisée de la maladie (1 , 10, 14). Ceci expliquerait l'importance de l'expression de l'haplotype HLA-DR3 chez les patients sélectionnés uniquement sur la base des critères cliniques ci-dessus. Il faut noter que le seul patient n'exprimant pas l'haplotype HLA DRB1*03, ne présente pas d'expansion des cellules exprimant Vβ5.1 , que ce soit ex vivo ou en culture après stimulation avec le peptide. Tous les patients HLA-DR3 expriment également HLA DQA1 501 et HLA DQB1 201 , qui sont fortement liés avec HLA DRB1 *03.
Plusieurs arguments sont en faveur du rôle d'HLA-DR3 dans la présentation du peptide de pl69-181. Tout d'abord, toutes les lignées et les clones cellulaires dérivés de patients myasthéniques pour lesquels la restriction HLA a été examinée, sont restreints à la molécule DR, mais pas DQ ni SB (61 , 64, 65). Deuxièmement, plusieurs lignées ou clones cellulaires dirigés contre la molécule RACh entière, ou de façon plus importante aux fragments extracytoplasmiques de la sous-unité α du RACh, ont été trouvés comme étant restreints à DR3 (60, 63, 66, 67). Toutefois, aucune donnée n'était disponible sur l'utilisation du récepteur des cellules T par de telles lignées cellulaires. Troisièmement, les deux peptides sélectionnés dans cette étude contiennent les résidus clés proposés et disposés selon les motifs consensus définis pour les peptides associés à HLA-DR3 (46-50). Enfin, la démonstration directe de l' implication de HLA-DR3 dans la présentation du peptide 169-181. est apportée par nos expériences d'inhibition de l'expansion des cellules CD4+ Vβ5.1 + et de la prolifération en réponse au peptide par un alloantisérum anti DR3 spécifique chez deux patients testés. Par conséquent, les peptides utilisés dans cette étude sont des composants importants dans le complexe ternaire pour diriger l'expansion Vβ5.1 observée.
Finalement, cette étude a montré que des peptides potentiellement impliqués dans la maladie, présentés par la molécule HLA DR3 qui représente par ailleurs un allèle dominant dans la sous-population de patients myasthéniques de cette étude, sont responsables in vitro de l'expansion spécifique et récurrente des cellules exprimant Vβ5.1. Ceci peut être relié au fait que l'expression de Vβ5.1 par des cellules de patients myasthéniques est généralement augmentée dans les populations T CD4+ thymiques analysées ex vivo. De plus, cette augmentation dans le thymus peut être le résultat d'un mécanisme de sélection actif conduisant à l'échappement de cellules autoréactives durant l'étape de différenciation de la population de cellules doubles positives CD4+ CD8 + exprimant faiblement CD3 vers celles exprimant fortement CD3. Ces résultats soulignent l' importance de l' interaction moléculaire dans le complexe ternaire représenté par la molécule HLA-DR3. le peptide 169-181 et les récepteurs des cellules T utilisant Vβ5. 1 , dans la maladie, et ouvrent des perspectives à de nouveaux moyens thérapeutiques dans le cadre du traitement de la myasthénie, au moins dans la sous-population de patients décrite ci-dessus. Les moyens thérapeutiques actuels de la myasthénie sont la thymectomie. l 'utilisation de composés anticholinestérasiques en association ou non avec des corticostéroïdes. Il n'a jamais été démontré que ces moyens thérapeutiques diminuent le processus de propagation de cette maladie, ou conduisent à des rémissions. Seule la thymectomie est bien admise pour les jeunes patients avec un thymus hyperplasique, et peut agir en supprimant la source de cellules T et B potentiellement autoréactives, ainsi que le site potentiel de réactivation du processus autoimmun (25). L'amélioration clinique après thymectomie est apparente après seulement une ou deux années. L'utilisation de composés anticholinestérasiques constitue seulement un traitement symptomatique difficile à équilibrer et pour lequel le risque de surdosage est permanent. Quant au traitement par les corticostéroïdes, celui-ci est accompagné d'effets secondaires sérieux.
La suppression de la réponse immune au RACh chez les patients myasthéniques avec des moyens plus spécifiques améliorerait la prise en charge de ces patients. La fraction de cellule T spécifique de la maladie est probablement très petite chez les myasthéniques, et pourrait inclure les cellules portant Vβ5. 1 chez les patients HLA-DR3. Ceci pourrait expliquer la raison pour laquelle les approches expérimentales globales sur le répertoire Vβ dans le cadre des maladies autoimmunes humaines ont connu un succès très limité.
L'intérêt de notre étude a été de définir l'implication dans la pathogenèse d'une petite population de cellules T exprimant le Vβ5.1 et représentant au maximum 5% des cellules T CD4+ comme cible potentielle d'une thérapeutique sélective et spécifique de la myasthénie chez un sous-groupe de patients homogène cliniquement et biologiquement et expriment l'haplotype HLA-DR3.
Tableau 1 v
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β
Données cliniques des patients myasthéniques O •t-
Figure imgf000033_0002
Patient (a) Sexe Age (b) Début de la Titre en Histologie du Sé\ éi ité de là Tyi page HLA (f) maladie (c) anti-RACh Thymus (d) maladie (e) DRB 1 * DQA 1 " DQB 1 -
1 F 32 1 mois 752 hyperplasie (2) MB 0301- 1501 501-102 201-601
2 M 20 6 mois 21.8 hyperplasie (4) MB 0301-04 501-301 201-301
3 F 31 8 mois 12.6 hyperplasie (3) II Λ 03- 13 501 - 102 201 -604
4 F 20 9 mois 6.8 hyperplasie (2) I1B 03- 1 101 501-501 201-301
5 F 31 12 mois > 10.5 hyperplasie (2) IIΛ 0301 -O iOl 501- 101 201 -501
6 F 22 13 mois 54.9 hyperplasie (4) 1IB 0301-04 501 -301 201 -302
7 F 22 10 ans > 30 hyperplasie (4) IIB 0103-0101 501 - 101 501-301
(a) Tous les patients ont reçu un traitement anticholinestérasique. Les patients traités avec des coiticoides ont été exclus de l 'étude
(b) Au moment de la thymectomie
(c) Intervalle de temps entie l'apparition des premieis signes de myasthénie et la thymectomie
(d) Degré d'hyperplasie défini par la taille et le nombre de follicules lymphoides. 20 (e) Graduation selon la classification d'Osserman.
(f) Oligotypage par PCR.
O
H
S. Sβ
W
Tableau 2
Résumé des données chez tous les patients testés.
Thymocytes famille Vβ
5.1 5-2.3J 5J 6.7 I 8 π
MG1
MG2
MG3 MG4- MG5 nd J 6d
MG6
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MG7
Figure imgf000034_0004
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0003
Figure imgf000034_0005
Les cases remplies représentent une différence significative (Δ > 3 %) en pourcentage de cellules exprimant Vβ entre les cultures témoins sans peptide et les cultures avec peptide.
Noter la récurrence de l'utilisation du segment Vβ5.1 chez tous les patients HLA DR3 testés (et pas chez le patient MG 7, non DR3), en réponse au peptide 169-181 à la fois au niveau des thymocytes et des PBMC. REFERENCES
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(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
(B) RUE: 3, rue Michel-Ange
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75016
(ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES ET PEPTIDIQUES POUR LE TRAITEMENT DE LA MYASTHENIE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE DEPOT: FR 9508736
(B) DATE DE DEPOT: 19-JUL-1995
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 411 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..411
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATG GGC TCC AGG CTG CTC TGT TGG GTG CTG CTT TGT CTC CTG GGA GCA 48 Met Gly Ser Arg Leu Leu Cys Trp Val Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15
GGC CCA GTA AAG GCT GGA GTC ACT CAA ACT CCA AGA TAT CTG ATC AAA 96 Gly Pro Val Lys Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Lys 20 25 30
ACG AGA GGA CAG CAA GTG ACA CTG AGC TGC TCC CCT ATC TCT GGG CAT 144 Thr Arg Gly Gin Gin Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His 35 40 45 AGG AGT GTA TCC TGG TAC CAA CAG ACC CCA GGA CAG GGC CTT CAG TTC 192 Arg Ser Val Ser Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin Gly Leu Gin Phe 50 55 60
CTC TTT GAA TAC TTC AGT GAG ACA CAG AGA AAC AAA GGA AAC TTC CCT 240 Leu Phe Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gin Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro 65 70 75 80
GGT CGA TTC TCA GGG CGC CAG TTC TCT AAC TCT CGC TCT GAG ATG AAT 288 Gly Arg Phe Ser Gly Arg Gin Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn 85 90 95
GTG AGC ACC TTG GAG CTG GGG GAC TCG GCC CTT TAT CTT TGC GCC AGC 336 Val Ser Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110
AGC TTG TCC GTC TCC GGG GAG CTG TTT TTT GGA GAA GGC TCT AGG CTG 384 Ser Leu Ser Val Ser Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu 115 120 125
ACC GTA CTG GAG GAC CTG AAA AAC GTG 411
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val 130 135
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 137 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Gly Ser Arg Leu Leu Cys Trp Val Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15
Gly Pro Val Lys Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Lys 20 25 30
Thr Arg Gly Gin Gin Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His 35 40 45
Arg Ser Val Ser Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin Gly Leu Gin Phe 50 55 60
Leu Phe Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gin Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro 65 70 75 80
Gly Arg Phe Ser Gly Arg Gin Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn 85 90 95
Val Ser Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Leu Ser Val Ser Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu 115 120 125
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val 130 135
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 411 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AUGGGCUCCA GGCUGCUCUG UUGGGUGCUG CUUUGUCUCC UGGGAGCAGG CCCAGUAAAG 60
GCUGGAGUCA CUCAAACUCC AAGAUAUCUG AUCAAAACGA GAGGACAGCA AGUGACACUG 120
AGCUGCUCCC CUAUCUCUGG GCAUAGGAGU GUAUCCUGGU ACCAACAGAC CCCAGGACAG 180
GGCCUUCAGU UCCUCUUUGA AUACUUCAGU GAGACACAGA GAAACAAAGG AAACUUCCCU 240
GGUCGAUUCU CAGGGCGCCA GUUCUCUAAC UCUCGCUCUG AGAUGAAUGU GAGCACCUUG 300
GAGCUGGGGG ACUCGGCCCU UUAUCUUUGC GCCAGCAGCU UGUCCGUCUC CGGGGAGCUG 360
UUUUUUGGAG AAGGCUCUAG GCUGACCGUA CUGGAGGACC UGAAAAACGU G 411
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 411 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN antisens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CACGTTTTTC AGGTCCTCCA GTACGGTCAG CCTAGAGCCT TCTCCAAAAA ACAGCTCCCC 60
GGAGACGGAC AAGCTGCTGG CGCAAAGATA AAGGGCCGAG TCCCCCAGCT CCAAGGTGCT 120
CACATTCATC TCAGAGCGAG AGTTAGAGAA CTGGCGCCCT GAGAATCGAC CAGGGAAGTT 180
TCCTTTGTTT CTCTGTGTCT CACTGAAGTA TTCAAAGAGG AACTGAAGGC CCTGTCCTGG 240 GGTCTGTTGG TACCAGGATA CACTCCTATG CCCAGAGATA GGGGAGCAGC TCAGTGTCAC 300 TTGCTGTCCT CTCGTTTTGA TCAGATATCT TGGAGTTTGA GTGACTCCAG CCTTTACTGG 360 GCCTGCTCCC AGGAGACAAA GCAGCACCCA ACAGAGCAGC CTGGAGCCCA T 411
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 411 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARN antisens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CACGUUUUUC AGGUCCUCCA GUACGGUCAG CCUAGAGCCU UCUCCAAAAA ACAGCUCCCC 60
GGAGACGGAC AAGCUGCUGG CGCAAAGAUA AAGGGCCGAG UCCCCCAGCU CCAAGGUGCU 120
CACAUUCAUC UCAGAGCGAG AGUUAGAGAA CUGGCGCCCU GAGAAUCGAC CAGGGAAGUU 180
UCCUUUGUUU CUCUGUGUCU CACUGAAGUA UUCAAAGAGG AACUGAAGGC CCUGUCCUGG 240
GGUCUGUUGG UACCAGGAUA CACUCCUAUG CCCAGAGAUA GGGGAGCAGC UCAGUGUCAC 300
UUGCUGUCCU CUCGUUUUGA UCAGAUAUCU UGGAGUUUGA GUGACUCCAG CCUUUACUGG 360
GCCUGCUCCC AGGAGACAAA GCAGCACCCA ACAGAGCAGC CUGGAGCCCA U 411

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de séquences nucléotidiques ou peptidiques, pour l 'obtention de médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la prévention ou du
5 traitement de la myasthénie autoimmune acquise. lesdites séquences nucléotidiques étant choisies parmi :
- celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides lϋ aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou
- celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique représentant elle-même un anticorps capable de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5. 1 .
15 - celles susceptibles de coder pour un ARN antisens, lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm codé par la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5. 1 , ou
- celles susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1. ou avec
20 tout ou partie de l'ARNm codé par cette séquence d'ADN, lesdites séquences peptidiques étant choisies parmi :
- celles susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou
25 - celles correspondant à des anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T.
2. Utilisation de séquences nucléoditiques ou peptidiques selon la 30 revendication 1 , pour l'obtention de médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la prévention ou du traitement de la myasthénie chez les patients d'haplotype HLA DR3, à savoir chez les patients exprimant des molécules du complexe d'histocompatibilité de classe II (HLA DR) du type HLA DR3.
35
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les séquences nucléoditiques susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, sont choisies parmi :
- la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1. comprenant notamment la séquence nucléotidique codant pour la séquence peptidique du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite séquence peptidique étant constituée par l 'enchaînement de 94 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2
- tout fragment d'ADN d'au moins environ 15 nucléotides contigus de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , susceptible de coder pour un fragment peptidique d'au moins environ 5 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ledit fragment peptidique étant lui- même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1 ,
- toute séquence d'ADN dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , ou d'un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 ou du fragment d'ADN susmentionnés, ladite séquence d'ADN dérivée étant susceptible de coder soit pour une séquence peptidique identique à la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou identique à un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, soit pour une séquence peptidique dérivée de celle représentée par SEQ ID NO 2, ou dérivée d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s) de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ladite séquence peptidique dérivée étant elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1.
4. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques choisies parmi celles susceptibles de coder pour un ARN antisens, cet ARN antisens étant lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm représenté par SEQ ID NO 3 et codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , sont choisies parmi:
- la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4, ladite séquence d'ADN codant pour l'ARN antisens représenté par SEQ ID NO 5. - tout fragment d'ADN antisens d'au moins environ 12 nucléotides contigus de la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4, susceptible de coder pour un fragment d'ARN antisens d'au moins environ 12 nucléotides de l'ARN antisens représenté par SEQ ID NO 5, ledit fragment d'ARN antisens étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus,
- toute séquence d'ADN antisens dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4, ou d'un fragment d'ADN antisens tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ADN antisens du fragment d'ADN antisens susmentionnés, ladite séquence d'ADN antisens étant susceptible de coder soit pour un ARN antisens identique à celui représenté par SEQ ID NO 5, ou identique à un fragment d'ARN antisens tel que défini ci-dessus, soit pour un ARN antisens dérivé de celui représenté par SEQ ID NO 5, ou dérivé d'un fragment d'ARN antisens tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de l'ARN antisens représenté par SEQ ID NO 5, ou d'un fragment d'ARN antisens tel que défini ci-dessus, ledit ARN antisens dérivé étant lui- même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques choisies parmi celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique ou pour un ARN antisens, sont contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes comprenant les éléments nécessaires pour permettre la transcription des séquences nucléotidiques susmentionnées, notamment un promoteur et un terminateur de transcription.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques recombinantes sont insérées dans des vecteurs, notamment dans des plasmides, susceptibles de permettre l'expression desdites séquences nucléotidiques recombinantes dans l'organisme.
7. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2. caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés de la région Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, sont choisies parmi celles complémentaires de tout ou partie de l'un des brins de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID N0 1 , notamment parmi des séquences nucléotidiques comprenant au moins environ 12 nucléotides contigus jusqu'au nombre maximum de nucléotides de la séquences d'ADN représentée par SEQ ID NO 4, complémentaire de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , ou encore parmi des séquences d'ADN dérivées de tout ou partie de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 4, notamment par substitution, suppression et/ ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s).
8. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques s'hybridant avec tout ou partie de l'ARNm codé par la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés de la région Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, représentent elles- mêmes un ARN antisens, cet ARN antisens étant avantageusement constitué d'au moins environ 12 nucléotides contigus complémentaires de tout ou partie de l'ARNm susmentionné, lesdites séquences nucléotidiques étant choisies parmi: - la séquence d'ARN antisens représentée par SEQ ID NO 5,
- tout fragment d'au moins environ 12 nucléotides contigus de la séquence d'ARN antisens représentée par SEQ ID NO 5, ledit fragment étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus,
- toute séquence d'ARN antisens dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ARN antisens représentée par SEQ ID NO 5, ou d'un fragment tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ARN antisens ou du fragment susmentionnés, ladite séquence d'ARN antisens dérivée étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus.
9. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, de séquences peptidiques susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, lesdites séquences peptidiques étant choisies parmi :
- la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2,
- tout fragment peptidique d'environ 5 à environ 136 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ledit fragment étant susceptible d'engendrer la production d'anticorps chez un patient, ces anticorps étant capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1 susmentionnée,
- toute séquence peptidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s) de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2 ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ladite séquence peptidique étant susceptible d'engendrer la production d'anticorps chez un patient, ces anticorps étant capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1.
10. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, de séquences peptidiques en tant qu'anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaine, lesdits anticorps étant des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, le cas échéant, humanisés, tels qu'obtenus par immunisation d'un animal avec des séquences peptidiques choisies parmi :
- la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2.
- tout fragment d'environ 5 à environ 136 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ledit fragment étant susceptible de permettre la production par le système immunitaire d'un animal, d'anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1 , - toute séquence peptidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s), de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2 ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ladite séquence peptidique dérivée étant susceptible de permettre la production par le système immunitaire d'un animal, d'anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1.
11. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) codant pour une séquence peptidique représentant elle-même un anticorps capable de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies dans la revendication
5, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis dans la revendication 6.
12. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) codant pour un ARN antisens, lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour le segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, et plus particulièrement une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que définie(s) dans la revendication 4, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies dans la revendication 5, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis dans la revendication 6.
13. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment Vβ5.1, ou avec tout ou partie de l'ARNm codé par cette séquence d'ADN, et plus particulièrement une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que défιnie(s) dans les revendications 7 et 8.
14. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) correspondant à des anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, et plus particulièrement une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) telle(s) que défιnie(s) dans la revendication 10.
15. Vaccins caractérisés en ce qu'ils comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, et plus particulièrement une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que définie(s) dans la revendication 3, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies dans la revendication 5. ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis dans la revendication 6.
16. Vaccins caractérisés en ce qu'ils comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment Vβ5.1 du récepteur des cellules T humaines, et plus particulièrement une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) telle(s) que définie(s) dans la revendication 9.
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