WO1997008198A1

WO1997008198A1 - Composes a base de peptides antigeniques et procede de dosage immunologique

Info

Publication number: WO1997008198A1
Application number: PCT/JP1996/002416
Authority: WO
Inventors: Toshiaki Kumazawa; Yoshiyasu Kiya; Hiroaki Tagami
Original assignee: Srl, Inc.
Priority date: 1995-08-31
Filing date: 1996-08-29
Publication date: 1997-03-06
Also published as: AU6837196A; KR19990044211A; JPH0967395A; EP0852234A1

Description

糸田抗原べプチド化合物および免疫学的測定方法技術分野

本発明は、 HCV (C型肝炎ウィルス）関連抗体の測定に有用な抗原ペプチド化合物および免疫学的測定方法に関する。背景技術

地球上には種々のウィルスが存在しており、そのうちの幾つかは病原体である。例えば、ウィルス性肝炎の原因となる肝炎ウィルスは、輸血、注射あるいは出産等の際に感染することが知られている。

輸血はヒトの生命維持のための重要な一手段であるが、この輸血によってウイルス性肝炎が発症した例が、現在まで数多く報告されている。このウィルス性肝炎は、一般に A型、 B型および非 A非 B型に分類されている。

従来においては、 B型肝炎ウィルス（HBV) も輸血時のウィルス性肝炎の原因として知られていた。近年この HBVの存在を検出する検査試薬が開発され、輸血前に簡便に H B Vの存在を確認することが可能となったため、輸血による H B V感染者は皆無となった。一方、明らかにウィルス性でありながら、それまで肝炎を起こす原因として考えられていた A型肝炎ウィルス（HAV) による A型でも H BVによる B型でもない肝炎（非 A非 B型； nonAnonB型）の存在も知られていたが、その発生源（ウィルス）を確認することは、従来は困難とされていた。

1 9 8 9年に、 Choo, Q-L. ら（Science, 244 , 3 5 9— 3 6 2 , 1 9 8 9) および Kuo , G.ら（Science, 24 4 , 3 6 2— 3 6 4, 1 98 9 ) によって、非 A非 B型肝炎ウィルスの存在が明らかにされた。この肝炎ウィルスは HCV

(C型肝炎ウィルス）と命名されたが、この HCVはヒトとチンパンジーのみに感染することが、以前から報告されていた。

上記文献においては、以下のような実験が記載されている。すなわち、患者に投与されて非 A非 B型肝炎を発症させた血液凝固第 VIII因子製剤と同じ製剤をチンパンジー No. 1に投与し、非 A非 B型肝炎を発症させた。更に該チンパンジーの肝臓からの抽出物をチンパンジー No. 2に投与し、同様に非 A非 B型肝炎を発症させた後、チンパンジー No. 2の血漿を抽出した。また、このチンパンジー No.

2の血漿を更にチンパンジー No. 3に投与し、非 A非 B型肝炎の発症を確認した。この発症が確認された血漿に対して、目的とするウィルスをフラビノウィルスと想定してウィルス粒子の濃縮操作（Bradley, D. W.ら： Gastroenterology,

88： 773 -779, 1 989 ) を行い、ウィルスの R N Aを抽出した。このようにして得た RN Aに基づいて c DNAを合成し、； Lgt 1 1ライブラリーを作製した。この； Lgtl 1ライブラリ一に対して、回復期のチンパンジー血清や非 A 非 B型慢性肝炎患者血清を用いたィムノスクリ一二ングを行い、反応するクロ— ンの選択を行った。この結果、 5-1-1· と称されるクローンのみが HCVに由来する c DN A断片であることが確認された。

上述した操作は、特公平 2— 5008 80号公報にも記載されており、遺伝子配列も明らかにされている。また、日本でも HCVの遺伝子配列に関する報告がなされている（Journal of virology, 65 (3) , 1 105〜 1 1 1 3, 1 9 91) c

1 990年 6月の日本肝臓学会において、 HCV構造領域の遺伝子配列が自治医科大学の岡本らによって明らかにされた（第 26回日本肝臓学会予稿集、 1 9

90年）。 1 990年 7月の日本癌学会においては、岡本らと同様に、 HCVの構造領域の遺伝子配列が明らかされた（第 49回日本癌学会予稿集、 1 990年）。これらの発表を比較すると、 HCVコア領域に関しては遺伝子の変異がほとんどないが、 HCVエンベロープ領域の遺伝子配列に関しては、両者間で若干の相違が認められる。

その後、 HCV構造領域のコア抗原と HCV非構造領域の抗原部位とを組み合わせた抗体検査が提案され（臨床病理， 40 ( 1 2 ), 1 245-1 2 5 1 , 1 9 9 2) 、このような抗体検査により、ほぼ完全に H C V抗体陽性者のスクリーニングを行うことが可能となった。

—方、 H C V検査と平行して C型肝炎のィンタ一フエ口ンによる治療が行われるようになったが、 H C Vの遺伝子型（genotype)の種類により、インタ一フエ口ン治療の効果が異なることが判明している。この genotypeの分類は、 Okamoto H. ：肝胆膝， 7-14 ( 1 9 9 2) によって明らかにされており、 I型（Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, 8 8, 24 5 1 -24 5 5, 1 9 9 1 ) 、 II型（Jou rnal of virology, 6 5 (3 ) , 1 1 0 5〜： L 1 1 3， 1 9 9 1 ) 、 111 型（Jo urnal of General Virology, 72 , 2 6 9 7-2 704, 1 99 1) および IV型

(Virology, 1 8 8 , 3 3 1 -34 1， 1 99 2 ) に分類されている。更に、岡本らにより、 V型までの genotypeの分類が示された（医学の歩み、 1 7 1 ( 1 4) 、 994〜 9 9 8頁（ 1 9 94年））。

1 9 93年 6月に行われた日本肝臓学会では、 genotype I型および II型（インターフェロン治療： 20%有効）は、 genotypelll 型および IV型（インターフエロン治療： 8 0%有効）に比べ、インターフェロンの治療効果が低いことが報告された（第 2 9回日本肝臓学会予稿集、第 5 5頁、 1 9 9 3年）。一方、上記した genotype V型については症例が稀であるため、この V型に対するィンタ一フエ口ンの治療効果は明らかでない。

インターフェロンの投与は脱毛や発熱などの強い副作用が伴うことが多く、患者への負担が大きいため、治療前の HC Vgenotypeの判定はインターフヱロン投与効果の予測に極めて重要である。しかしながら、従来の genotype判定法においては、「患者検体中の HC Vの RN A抽出、これに対応する c DNAの合成、該 c DNAの P CR (ポリメラーゼ連鎖反応）法による増幅、電気泳動法を用いる増幅 c DN Aのバンドの確認」という、通常 4 8時間以上にもおよぶ複雑な工程を経て genotypeが決定されていたため、長い時間と高いコストとが必要とされていた。

—方、遺伝子組み替えの方法を用いて製造した抗原（約 3 00個のアミノ酸からなる）を用いて、患者血清中の HCV抗体が 2つのタイプ（serotype) に分類できることが報告されている（肝胆膝、 2_2_, 8 8 3〜 8 8 9、 1 9.9 1年）が、この分類は、上記した（インターフェロン治療の判定に重要な） genotypeとの対応の点において必ずしも充分ではなかった。この serotypeは血清型であり、遺伝子配列 3個で 1個のァミノ酸と認識されるため、 genotypeよりも serotypeの方が少ない数の分類となる。上述したように、インターフェロン投与には多額の費用がかかるが、このインターフェロン投与の前提となる上記 genotypeの判定にも多額の費用がかかるという欠点があった。治療前に HCVの genotype判定を簡便に行うことが可能であれば、インターフヱロン投与効果を簡便に予測することが可能となり、インターフ工口ンの投与方法や治療指針を計画的に策定することができ、更には患者への精神的、肉体的、並びに経済的負担を軽減することができるため、簡便な HCVの genotype判定が切望されていた。

したがって本発明の目的は、 HC Vの genotype I型および II型と、 genotypell I 型および IV型と、 genotypeV型との区別が可能な HCV抗体の簡便な測定を可能とする HCV抗体測定用抗原を提供することにある。

本発明の他の目的は、 HCVの genotype I型および II型と、 genotypelll 型および IV型と、 genotypeV型との区別が可能で、—しかも交叉反応ないし非特異反応が抑制された H C V抗体の測定を可能とする H C V抗体測定用抗原を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、 HCVの genotype I型および II型と、 genotypelll 型および IV型と、 genotypeV型との区別が可能な HC V抗体の簡便な測定法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、 HC Vの genotype I型および II型と、 genotypelll 型および IV型と、 genotypeV型との区別が可能で、しかも交叉反応ないし非特異反応が抑制された HCV抗体の測定法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、 HCVの genotype I型および II型と、 genotypelll 型および IV型と、 genotypeV型との区別が可能な低コストの HCV抗体の測定法を提供することにある。発明の開示

本発明者は鋭意研究の結果、 HC V抗原部位に基づく特定のアミノ酸配列（少なくとも 6個のアミノ酸を含む配列）を用いて HCV抗体型（serotype) の判定を行うことが、 HCVの genotype l型および II型と、 genotypelll 型および IV型と、 genotypeV型との簡便な区別を可能とするのみならず、抗原一抗体反応に伴う交叉反応ないし非特異反応を効果的に抑制して、上述した目的の達成に極めて効果的であることを見出した。

本発明の抗原べプチド化合物は上記知見に基づくものであり、より詳しくは、下記式（1 ) で示される配列に含まれるアミノ酸配列であって、連続した少なくとも 6個のアミノ酸からなる配列を含むことを特徴とするものである。

L e u- H i s - I 1 e - A s n - G i n- A r g - A 1 a - V a 1 - V a 1 - A l a - P r o- A s p- L y s- G l u- V a l - L e u- T y r - G l u- A 1 a - P h e- A s p- G l u- Me t - G 1 u- G 1 u- C y s - S e r- G l n- A l a - A r g - P r o- T y r - I 1 e - G 1 u- G i n- A r g- G 1 n- V a 1 - I l e- A l a- H i s - G l n- P h e- L y s- G l u- L y s - V a 1 - L e u ( 1 )

更に、本発明によれば下記式（2) で示される配列に含まれるアミノ酸配列であって、連続した少なくとも 6個のアミノ酸からなる配列を含むことを特徴とする抗原べプチド化合物が提供される。

G 1 u- A 1 a - P h e- A s - G 1 u- Me t - G 1 u- G 1 u- C y s - S e r- G l n- A l a- A r g- P r o - T y r- I l e- G l u- G l n- A r g- G l n- V a l - I 1 e - A 1 a - H i s - G i n- P h e- L y s - G 1 u- L y s - V a 1 - L e u ( 2)

更に、本発明によれば下記式（3 ) で示される配列に含まれるアミノ酸配列であって、連続した少なくとも 6個のアミノ酸からなる配列を含むことを特徴とする抗原べプチド化合物が提供される。

S e r- G l n- A l a- A r g - P r o- T y r - I 1 e~ G l u- G l n- A r g- G l n- V a l - I 1 e - A 1 a - H i s - G i n- P h e- L y s - G 1 u- L y s - V a 1 - L e u ( 3)

更に、本発明によれば上記式（ 1 ) 、（2) および又は（3) に記載の抗原ぺプチドを担体に結合させ、抗原—抗体反応を利用して該ぺプチドに検体中の H CV抗体を結合させ、更に抗原一抗体反応を利用して該 HCV抗体に標識リガンドを結合させることにより、上記検体中の HC V抗体を測定することを特徴とする HC V抗体の免疫学的測定法が提供される。ここに、「リガンド」とは、抗原およびノ又は抗体に対して特異的な結合性を有する物質（例えば抗体および Z又は抗原）をいう。

上述した従来の genotype判定においては、 H C V遺伝子の配列自体を利用して HCVの型判定を行っているが、本発明においては、 HCVに固有の抗原部位に対する抗体の型（serotype) を利用して H C Vの型判定を行っている。このような抗体型の判定は、従来の genotype判定（H C Vの R N A抽出→ c D N Aの合成 →該0 DN Aの P CR法による增幅→電気泳動法を用いた増幅バンドの確認）に比べて著しく短時間で行うことができ、しかも作業工程も単純であるため、本発明によれば、簡便且つ低コストの H CV型（genotype) の判定方法を提供することができる。

上記した従来の血清型判定法（約 300個のアミノ酸からなる抗原を用いる）と比較して、本発明においては、抗原一抗体反応に伴う交叉反応ないし非特異反応が効果的に抑制されている。

本発明によれば、上記した（1) 〜（3) のいずれかのペプチドを用いることにより、従来からの HCV— genotypeの（ I型および II型）と、（III 型および IV型）との判定に加え、更に genotypeV型の検出ないし判定が可能となる。

本発明によれば、このような HCVタイプの更なる細分化が可能となることにより、感染経路の分析にも有用な情報を得ることができる。

後述する実施例の方法により serotype判定を行った結果、上記した genotype V 型（serotypelll型に相当する）は日本では稀であるが、アジア諸国や欧米諸国ではむしろ主要な型であることが見出された（タイでは、およそ半数が serotype III 型であった）。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1において H C Vの c 0 r e領域に関し Hydrophil icity Value を計算により求めた結果を示すグラフである。

図 2は、実施例 1において HC Vの N S 4領域に関し Hydrophilicity Valueを計算により求めた結果を示すグラフである。

図 3は、実施例 1において HC Vの N S 5領域に関し Hydrophilicity Valueを計算により求めた結果を示すグラフである。

図 4は、実施例 2において得られた抗原ペプチド化合物（2) (c k k-n 5 2) の HP L C分析結果を示すクロマトグラムである。

図 5は、実施例 2において得られた抗原ペプチド化合物（1) (_C k k— n 5 1) の HP L C分析結果を示すクロマトグラムである。

図 6は、 HCVの抗原領域と各抗原べプチドとの関係を示す模式図である。図 7は、 H CVの抗原タイプと各抗原べプチドとの関係を示す模式図である。発明を実施するための最良の形態

以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を詳細に説明する。

本明細書においては、アミノ酸配列の表記においては、 N末端（左側）から C 末端（右側）へ記载する（例えば、以下のアミノ酸配列（ 1 ) においては、 kて gが N末端、 P r oが C末端である）。また、本明細書においては、下記に示すァミノ酸表記を用いる。

(アミノ酸の一文字表記および三文字表記）

<略号 > <名称 > ぐ略号 > ぐ名称 >

A s p D ァスパラギン酸 V a 1 V バリン

A s n N ァスパラギン Me t M メチォニン

T h r T トレオニン l i e I イソロイシン

S e r S セリン L e u L ロイシン

G 1 u E グルタミン酸 T y r Y チロシン

G i n Q グルタミン P h e F フエニノレアラニン

P r o P プロリン T r p W トリプトファン

G 1 y G グリシン L y s K リジン

A l a A ァラニン H i s H ヒスチジン

C y s C システィン A r g R アルギニン

(抗原べプチド化合物）

本発明の抗原ペプチド化合物は、下記式（ 1 ) (アミノ酸 4 8個）、（2) (アミノ酸 3 1個）、または（3) (アミノ酸 2 2個）で示される配列に含まれる配列であって、少なくとも 6個の連続したァミノ酸からなる配列を有するぺプチド化合物である。

L e u- H i s - I 1 e - A s n- G 1 n- A r g- A l a- V a 1- V a 1 - A 1 a - P r o- A s p- L y s - G 1 u- V a 1 - L e u- T y r - G l u - A 1 a - P h e - A s p- G 1 u- Me t - G 1 u- G 1 u- C y s - S e r - G i n- A 1 a - A r g- P r o - T y r - I 1 e - G l u- G i n- A r g- G 1 n- V a 1 - I l e- A l a- H i s- G l n- P h e- L y s- G l u -

L y s- V a l - L e u (1) ( c k k一 n 5 1 ; N S 4領域に対応）

(一文字表記： LH I NQ RAVVA PDKEV LYEAF DEMEE CS QAR PY I EQ AQV I A HQ F KE K V L)

G 1 u- A 1 a - P h e- A s - G 1 u- M e t - G 1 u- G 1 u- C y s - S e r - G 1 n- A 1 a - A r g- P r o- T y r - I 1 e - G l u- G i n - A r g- G l n- V a 1 - I 1 e - A 1 a - H i s - G i n- P h e- L y s -

G l u- L y s- V a l - L e u (2) (c k k-n 52 ； NS

4領域に対応）

(—文字表記： EAFDE ME E C S Q AR P Y I EQAQ V I AHQ FKEKV L)

S e r - G i n- A l a - A r g- P r o- T y r- I l e- G l u- G l n- A r g- G l n- V a 1 - I 1 e - A 1 a - H i s - G i n- P h e- L y s -

G l u- L y s - V a 1 - L e u (3) (c k k-n 53 ； NS

4領域に対応）

(—文字表記： S QARP Y I EQA QV I AH QFKEK V L) 本発明者の知見によれば、上記式（1 ) 、（2) 又は（3) で示されるァミノ酸 48、 3 1ないし 22個からなる配列を構成する種々の長さのアミノ酸配列であって、少なくとも 6個の連続したアミノ酸を含む配列は、本発明においてぺプチド（ 1) 、（2) および又は（3) と同様に、抗原として好適に使用可能である。このような「種々の長さのアミノ酸配列」を構成するアミノ酸の偶数は、 HCVの識別性と、交叉反応 ·非特異反応の抑制とのバランスの点からは、 1 0 個以上（更には 22個以上）であることが好ましい。

上記した「種々の長さのアミノ酸配列」の具体例（アミノ酸 6個以上）としては、例えば、下記の配列が挙げられる。

上記ペプチド化合物（1) に含まれるアミノ酸配列

A s n- G i n- A r g - A 1 a - V a 1 - V a 1 - A 1 a - P r o- A s p- L y s - G 1 u - V a 1 - L e u- T y r - G 1 u - A 1 a - P h e - A s p - G l u- Me t- G l u- G 1 u- C y s - S e r - G l n- A l a - A r g- P r o- Ty r- I l e - G l u- G l n- A r g- G l n- V a 1 - I 1 e- A 1 a - H i s - G i n - P h e- L y s - G 1 u )

(一文字表記： NQR A V V A PDKEVLYEAF DEMEE C S QAR P Y I E Q AQ V I A HQFKE)

上記ペプチド化合物（2) に含まれるアミノ酸配列

A s p- G l u- Me t - G l u - G l u- C y s- S e r- G l n- A l a- A r g- P r o- T y r- I 1 e- G l u- G l n- A r g - G i n- V a 1- I 1 e - A 1 a - H i s - G i n- P h e- L y s - G l u- L y s- V a l - L e u

(—文字表記： D EME E C S Q A R PY I EQAQV I A HQ F KE K V L)

上記ペプチド化合物（3) に含まれるアミノ酸配列

S e r - G i n- A l a - A r g - P r o- T y r - I l e- G l u- G l n- A r g- G l n- V a l - I 1 e - A 1 a - H i s- G l n- P h e- L y s - G l u- L y s

(—文字表記： SQAR PY I EQAQV I A HQFKEK)

本発明者の知見によれば、上記した（ 1) 、（2) 又は（3) の配列を「含む」ペプチドも、上記（ 1 ) 、（2) 又は（3) と同様に抗原として好適に使用可能である。このようなペプチドを構成するアミノ酸の数は、化学的に合成する場合には 40個以下であることが好ましく、リコンビナント法を用いて得る場合には 100個以下であることが好ましい。

上述した抗原べプチド化合物（少なくとも 6個のァミノ酸を含むぺプチド化合物）を得る方法は特に制限されない。該ペプチド化合物は化学的に合成してもよく、また遺伝子工学的手法（例えば遺伝子組替え技術、すなわちリコンビナント法）を用いて製造してもよい。化学的手法を用いる場合、中間生成物の精製等が容易な点からは、固相法によりアミノ酸を連結することが好ましく、更には自動ペプチド合成機（例えば、アプライド ·バイオシステムズ社製の 43 OAぺプチド合成機）を用いて合成することが好ましい。

(抗原べプチド化合物の抗原性の確認）

上記したペプチド化合物（1) 、（2) および（3) の配列は、 HCVのNS 4領域のアミノ酸配列からの抗原部位の抽出に基づいて見出したものである（後述の実施例 1を参照）。本発明者は、更に、これらのペプチド化合物（1) 、

(2) および（3) を用いた酵素免疫測定法（E L I S Aないし E I A) により H C Vgenotypeの検査を行い、別途 H C Vgenotypeの判定を行つた患者の検体を用いて、その特異性を確認した（後述の実施例 4および 5を参照）。

(他の抗原べプチド化合物）

上述したペプチド化合物（1) 、（2) およびノ又は（3) (いずれも HCV の NS 4領域に対応する配列）を用いることにより、後述するように serotypeの判定が充分可能であるが、 serotype判定の一層の精度向上ないし適用範囲拡大の点からは、上記ペプチド化合物（1 ) 、（2) および又は（3) と、他の抗原ペプチド化合物とを組合わせることが好ましい。このような「他の抗原ペプチド化合物」としては、下記のペプチド（4) 〜（9) が挙げられる。

l i e- l i e- L e u- S e r - G l y- A r g- P r o- A l a- l i e- V a 1 - P r o- A s p- A r g - G 1 u- L e u- L e u- T y r - G 1 n- G 1 u- P h e- A s p- G 1 u - M e t - G 1 u - G 1 u - C y s - A 1 a - S e r- H i s - L e u- P r o- T y r- I l e- G l u- G l n- G l y-

Me t- G l n- L e u- A l a (4) (c k k一 n l、 NS 4 領域に対応）

(—文字表記： I I L S G RPA I V PDRE L LYQE F DEMEE CASHL PY I EQ GMQ LA)

L e u- H i s - V a 1 - A s n - G i n- A r g - A 1 a - V a 1 - V a 1 - A 1 a - P r o- A s p- L y s - G l u- V a 1 - L e u- T y r - G 1 u- A 1 a - P h e- A s p- G l u- Me t - G l u- G l u- C y s - A 1 a - S e r - A r g - A 1 a - A 1 a - L e u- I 1 e - G l u- G l u- G 1 y-

G l n- A r g- I l e- A l a (5) (c k k— n 2、 NS 4 領域に対応）

(—文字表記： LHVNQ RAVVA PDKEV LYEAF DEMEE CASRA A L I E E GQR I A)

Cy s_ Th r- Th r- H i s - H i s- V a l - S e r- P r o- A s p- A 1 a - A s - L e u- I 1 e - G 1 u - A 1 a - A s n - L e u- L e u-

T r p- A r g (6) (c k k一 n 3、 N S 5領域に対応）

(一文字表記： CTTHH V S PDA DL I EA N L LWR)

C y s - T h r - T h r - H i s - G 1 y- L y s - A 1 a - T y r - A s p- V a 1 - A s p - M e t - V a 1 - A s p- A 1 a - A s n- L e u- P h e-

M e t - G 1 y (7) ( c k k-n 4 NS 5領域に対応）

(—文字表記： CTTHG KAYDV D VD A NLFMG)

G l y- A r g- A r g- G l n- P r o- I 1 e - P r o- L y s - A 1 a - A r g- A r g- P r o- G 1 u- G 1 y - A r g - T h r - T r p - A 1 a -

G i n- P r o ( 8 ) (c k k一 c l、 c o r e領域に対応）

(—文字表記： GRRQP I PKAR R P EGR TWAQ P)

G l y- A r g- A r g- G l n- P r o- I 1 e - P r o- L y s- A s p- A r g- A r g- S e r- Th r - G 1 y- L y s - S e r- T r p - G 1 y-

L y s - P r o (9) (c k k一 c 2、 c o r e領域に対応）

(一文字表記： GRRQP I PKDR RS TGK SWGKP)

上記ペプチド（4) 〜（9) についても、 N S 4領域対応のペプチド（ 1 ) 、 (2) ないし（3) の場合と同様にして、抗原性の確認、製造等を行うことがでさる。

また、本発明者の知見によれば、上記式（4) 〜（ 9) で示されるアミノ酸 4 0個または 20個からなる配列を構成する種々の長さのァミノ酸配列であって、少なくとも 6個の連続したアミノ酸を含む配列は、本発明においてペプチド（4 ) 、（5) 、 (6) 、 (7) 、 (8) および Z又は（9) のいずれかと同様に、抗原べプチドとして好適に使用可能である。

このような種々の長さのアミノ酸配列 (ァミノ酸 6個以上) としては、例えば、下記の配列が挙げられる。

上記ペプチド化合物（4) に含まれるアミノ酸配列

l i e- l i e- L e u- S e r- G l y- A r g- P r o- A l a- I 1 e- V a 1 - P r o- A s p- A r g - G l u- L e u- L e u- Ty r - G 1 n- G 1 u- P h e- A s p- G l u- Me t - G l u- G l u- C y s- A l a- S e r- H i s- L e u (10)

(—文字表記： I I L S G R P A I V PDRE L LYQE F DEMEE C A S H L)

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> ■σ yielr→n Mlu《u Po G Glu Cs A r-

E M E P Y E C A

l G lieius Lu P Gn Metlul S rie G G C H

E 【 E M Ckk E E Snl C4l yylluu Mro T Gsa S一r G C一 u P

〔k K Akn E一一cr」 S ^一 Y C-一 yyellel Lu Tur G G n G M

Q L K P Y ypilihe Gl u Aa Gn Pn_u G s As G M

Q K E E F D M yl U> Ginu G H Gle一 s utlu A i L Glue G C n s- 。l G Mu

Q G M E广 £ C H E

一一 *- ¾ *< ^ >- · 、

Π拏】 IfZ0/96dT/13d 86180 6 O 上記ペプチド化合物（5) に含まれるアミノ酸配列

L e u- H i s - V a 1 - A s n - G i n- A r g- A 1 a- V a 1- V a 1 - A 1 a - P r o- A s p- L y s - G 1 u- V a 1 - L e u- T y r - G 1 u- A 1 a - P h e - A s - G 1 u - M e t - G 1 u- G l u- C y s - A 1 a - S e r- Ar g- A l a (1 1)

(—文字表記： LHVNQ RAW A PDKE V L YEAF DEME E C A S R A)

ST

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G C=

C*1 E 3

CO

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- > - J > - > 〕 2k kコ-

^

r-

cn JO

【z拏】 ^^0/96<^13<1 86180/ム 6 OAV 上記ペプチド化合物（6) に含まれるアミノ酸配列

V a 1 - S e r - P r o- A s p- A l a- A s p- L e u- I 1 e - G 1 u

A 1 a - A s n - L e u- L e u- T r p- A r g (1 2)

(—文字表記： VS PDA DL I EA NL LWR)

Z0/96K«71〕 -

usy Β·ιγ u\' aii ΐΐθ'ΐ dsy Β{ γ dsy ο jas \ s ι n

N v a i T n v a d S A ii CSG"-^^^] na^ USY Bi v "ID a I I dsy B ] y dsy o J j J as 入 s jjj sju

N Y H l T Q Y a d S A H ll [ C^U -

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Y (l a S Λ H H 1 .L 3 [ΐ ¹¹-^^³] J I|丄 J IJ丄 sズ 3 丄丄：）

SSN

上記ペプチド化合物（7) に含まれるアミノ酸配列

L y s- A 1 a - Ty r - A s p- V a 1- A s p- Me t - V a 1 - A s p

A 1 a - A s n- L e u- P h e- Me t - G 1 y · (1 3)

(一文字表記： KAYDV DMVDA NL FMG)

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Λ (1 A V 0 11 1 X 3 [ひ ^u— Wつ] λ10 » d η»Ί usy Β\γ dsy dsy J BA dsy Ji|l Bjy Ajo s m JI!丄 J 丄 sA;)

上記ペプチド化合物（8) に含まれるアミノ酸配列

A r g - G 1 n - P r o- I 1 e - P r o- L y s- A l a- Ar g- A r g- P r o - G 1 u- G 1 y- A r g- Th r - T r p - A 1 a - G i n- P r o (—文字表記： RQP I PKAR RPEGR TWAQP)

上記ペプチド化合物（9) に含まれるアミノ酸配列

G i n - P r o- I 1 e- P r o - L y s - A s p- A r g- A r g- S e r- Th r - G 1 y- L y s- S e r - T r p- G 1 y- L y s - P r o

(—文字表記： QP I PKDR RS TGK SWGKP)

本発明者の知見によれば、上記した（4) ないし（9) のいずれかの配列を含むペプチド（アミノ酸 6個以上からなる）も、上記（4) ないし（9) と同様に抗原として好適に使用可能である。このようなべプチドを構成するアミノ酸の数は、化学的に合成する場合には 40個以下であ—ることが好ましく、リコンビナント法を用いて得る場合には 1 00個以下であることが好ましい。

本発明者の知見によれば、上記ペプチド化合物（1 ) 〜（3) をそれぞれ単独で抗原として用いる場合、 serotype判定の精度の点から、抗原として好ましい順は以下の通りである。この欄の記載においては、「（ 1 ) 、（2) 、 (3) 、

(4) およびノ又は（5) J をまとめて「NS 4」と表し、 Γ (8) および又は（9) 」をまとめて「c o r eJ と表し、 Γ (6) および又は（7) j をまとめて「N S 5」と表す。

好ましい順： c o r e〉NS 4〉NS 5

—方、上記べプチド化合物 c 0 r e、 N S 4、および N S 5のいずれか 2種類を組合わせて抗原として用いる場合、 serotype判定の精度の点から、抗原として好ましい順は以下の通りである。

好ましい順：（c o r e) + (N S 4 ) > (c o r e) + (N S 5 )

また、上記べプチド化合物 c o r e、 N S 4、および N S 5のいずれか 3種類を組合わせて抗原として用いる場合、 serotype判定の精度の点から、抗原として好ましい順は以下の通りである。

好ましい順：（c o r e ) + (N S 4 ) + (N S δ ) > (c o r e) + (N S 5) + (N S 4 ) (HCV抗体の測定方法）

上記した抗原べプチド化合物の HCV抗体との特異的結合性を利用して、試料ないし検体中の HCV抗体を免疫学的に測定することが可能である。本発明において使用する免疫学的測定法は特に制限されないが、例えば、公知のィムノアツセィ法を特に制限なく使用することが可能である。このようなィムノアツセィ法としては、例えば、酵素免疫測定法、放射免疫測定法（R I A) 、蛍光免疫測定法（F I A) 等が使用できる。このィムノアッセィにおいては公知の測定技術

(例えば、競合法、二抗体法、サンドイッチ法等）を特に制限なく使用することが可能である。このような公知の測定技術に関しては、文献（E I Aに関しては、例えば、石川榮治「酵素免疫測定法」（第 3版）、 1 80頁、医学書院）を参照することができる。 .

本発明によれば、上記抗原べプチド化合物を用いて HCV抗体を免疫学的に測定することにより、検体の HCV抗体の種類（serotype) を判定することができる（例え ίま *後述するように、 H C Vの serotypeカ group I 、 group II、なレヽし gr oup III のいずれであるか判定できる）。後述するように、 HC Vserotypeの gr oup I は HCV genotype Iおよび IIに対応し、 H C V serotypeの group IIは HC Vgenotype IIIおよび IVに対応し、 H C V serotypeの group III は HCVgenoty peVに対応するため、簡便な HC Vgenotypeの判定が可能となる。

上記ィムノアッセィにおいては、必要に応じて、上記抗原ペプチド化合物を担体（ないし支持体）に結合ないし固相化して、その HCV抗体との特異的結合性を利用して、 H C V抗原に対する抗体の種類（すなわち H CVの serotype) を判定することができる。この際の担体ないし支持体としては、ゥシ血清アルブミン (B SA) 、好ましくは分子量 5万から 10万程度のポリペプチド、マイクロプレートのゥエル、好ましくは直径 0. 1 μ mから 6 mm程度のポリスチレンボール（ないしポリスチレンビーズ）等が好ましく用いられる。

上記ペプチド（ 1 ) 〜（3) は、上述したように H C V抗体測定に好適に用いることができるが、更には、例えば HC Vに対するヮクチン製造用の抗原ないし免疫原として用いることも可能である。この場合のワクチンは、例えば、遺伝子工学的手法を用いて作製することができる（リコンビナント法）。以下、実施例に基づき本発明を更に具体的に説明する。

実施例 1

(Hydrophilicity Valueによる抗原部位の特定）

Geoffrey RS, Nature, 30 2 , 490-4 9 5 ( 1 98 3) で合成された抗原性を有するペプチドの配列と、 HCVの遺伝子配列（第 26回日本肝臓学会予稿集、 1 9 90年；第 4 9回日本癌学会予稿集、 1 9 9 0年； Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 8 8, 24 5 1-24 5 5, 1 99 1 ； Journal of virology,

6 5 (3) , 1 1 05〜 1 1 1 3， 1 9 9 1 ； Journal of General Virology,

72, 26 9 7-2704, 1 9 9 1 ； Virology, 1 8 8 , 3 3 1-34 1 , 1 9 92 ) とに基づき、 HCVの非構造領域および構造領域のアミノ酸配列を決定した。

このように求めたアミノ酸配列に基づき、その抗原部位を Hopp TP， Proc. Nat 1. Acad. Sci. 7_8., 3 8 24-3 8 2 8 ( 1 9 8 1 ) の方法で算出した。より具体的には、各アミノ酸の Hydrophlicity Value を用い、以下のようにして行つた。

上記により求めた HCVを構成するアミノ酸配列に基づき、連続する 6個のァミノ酸の Hyrdrophilicity Valueを合計した。この計算を H C Vアミノ酸配列の全領域について行い、親水性および疎水性の強度を算出した。親水性が高い部分を、抗原性を示す部位とした。

この際、 Jack K.， Mol. Biol. 1 5 7, 1 0 5 ( 1 9 8 2 ) に示されている H ydropathy Value や Alan MS. , Science, 2 2 7， 4 2 9 ( 1 9 8 5) に示されている Antigenicity Value 等も、上記 Hydrophi 1 ici ty Valueと同様に算出することが可能であった。

上記 Hydrophilicity Valueを用いた計算により求めた結果を図 1 ( c o r e領域）、図 2 (N S 4領域）および図 3 (NS 5領域）のグラフに示す。

上記図 1で得られた結果に基づいて C型肝炎の抗原となり得る領域を抽出し、更に、このようにして求めた領域のうち、 genotype Iおよび genotypellで共通のアミノ酸配列を有する領域と、 genotype IIIおよび genotype IVで共通のァミノ酸配列を有する領域とを求めた。更に、 genotype I、 II、 III および IV型とは異なる V型のアミノ酸配列を有する領域をも求めた。

この結果、このような条件を満たした抗原のアミノ酸配列として、 NS 4領域に関して下記の c k k— n 5 1、 c k k一 n 5 2、および c k k— n 53が求められた。

L e u- H i s - I 1 e - A s n- G i n- A r g - A 1 a - V a 1 - V a 1 - A 1 a - P r o- A s p- L y s - G 1 u - V a 1 - L e u- T y r - G l u- A l a- P h e- A s p- G l u - Me t - G l u- G l u- C y s - S e r- G 1 n- A 1 a - A r g - P r o- T y r - I 1 e - G l u- G i n- A r g - G 1 n- V a 1 - I 1 e - A 1 a- H i s - G 1 n- P h e - L y s - G 1 u- L y s- V a 1 - L e u (1 ) c k k— n 5 1

G 1 u- A 1 a - P h e - A s p- G 1 u- Me t - G l u- G 1 u- C y s - S e r - G l n- A l a- A r g- P r o - T y r- I l e- G l u- G l n- A r g- G l n- V a l - l i e- A l a- H i s- G l n- P h e- L y s - G l u- L y s- V a l - L e u (2) c k k - n 5 2

S e r- G l n- A l a- A r g- P r o- T y r - l i e- G l u- G l n- A r g - G l n- V a l - I 1 e - A 1 a - H i s - G i n- P h e- L y s -

G l u- L y s - V a l - L e u (3) c k k— n 5 3

実施例 2

(C型肝炎の抗原の作製）

上記した H C Vの抗原ペプチド化合物（c k k— n 5 1 ) 、（ c k k一 n 5 2) 、（c k k— n 5 3) 、（ c k k一 n 1 ；構造式（ 4 ) ) および（ c k k— n 1 ；構造式（5) ) を以下に示す方法で合成した。

ペプチドの合成は、自動ペプチド合成機 Applied Biosystems 4 3 OA Peptide Synthesizer を用い、 t— B o c アミノ酸の対称性無水物を試薬として用いて行った。得られた合成べプチドをァニソール ' ジメチルザルフアイド 'パラチォクレゾール内に溶解した後、フッ化水素酸の存在下で、 0〜5°Cで 1時間反応させて脱保護を行った（S. Sakakibara, Bull. Chera. So Jpn. 4 0 , 2 1 64 ( 1 9 6 7 ) 参照）。

脱保護により得られた粗結晶を 2 Ν酢酸に溶解してエーテルで抽出し、抽出物を凍結乾燥した。この凍結乾燥物を HP LC (高性能液体クロマトグラフィー）を用いて精製した。

この HP L C精製は、カラム（SISEIDO カプセルパック C 1 8 S G 1 20、直径 46 mm、長さ 2 50 mm) を用い、純水中に 0. 1 %トリフルォロ酢酸（Tr ifluoroacetic acid； T F A) と 5 %ァセトニトリル（CH₃ CN) が含まれる溶液と、純水中に 0· 1 %T F Aと 50 %ァセトニトリルが含まれる溶液とを用い、流量 1 2m 1 /m i nで移動相にグラジェントをかけることによって行った。この際に得られたクロマトグラムを図 4 ( c k k - n 5 2) に示す。

上記と同様にして、合成抗原べプチド c k k一 n l (40) 、 n 2 (40) 、 n 5 1、および n 5 3を用いて精製した。この際に得られたクロマトグラムを図 5 ( c k k - n 5 1 ) に示す。

上記と同様にして、下記に示す合成抗原ぺチド c k k— n 3および c k k一 n 4 (NS 5領域ペプチド）；および c k k一 c lおよび c k k一 c 2 (2 0ァミノ酸からなる c 0 r e領域べプチド）を、それぞれ合成した。

I 1 e - I 1 e - L e u- S e r - G l y- A r g- P r o- A 1 a - I 1 e- V a 1 - P r o- A s p- A r g- G l u- L e u - L e u- T y r- G l n- G 1 u - P h e- A s p- G 1 u - M e t - G 1 u - G 1 u - C y s - A 1 a - S e r- H i s - L e u- P r o- T y r - I 1 e - G l u- G l n- G l y-

Me t - G l n- L e u- A l a (4) (c k k一 n l、 N S 4 領域に対応）

(—文字表記： I I L S G R PA I V PDRE L LYQE F D EME E CASHL P Y I E Q GMQ LA)

L e u- H i s - V a 1 - A s n - G i n- A r g - A 1 a - V a 1 - V a 1 - A 1 a - P r o- A s p- L y s - G 1 u - V a 1 - L e u- T y r - G l u- A 1 a - P h e- A s - G 1 u - Me t - G 1 u - G 1 u - C y s - A 1 a - S e r - A r g- A l a- A l a - L e u- I 1 e - G l u- G l u- G l y -

G l n- A r g- I l e- A l a ( 5) (c k k— n 2、 N S 4 領域に対応）

(—文字表記： LHVNQ RAW A PDKEV LYEAF DEME E CASRA A L I E E GQR I A)

C y s - Th r - Th r - H i s - H i s - V a 1 - S e r- P r o- A s p- A 1 a - A s p - L e u- I 1 e - G 1 u- A 1 a - A s n- L e u- L e u-

T r p- A r g -- (6) ( c k k一 n 3、 N S 5領域に対応）

(—文字表記： CTTHH VS PDA DL I EA NL LWR)

C y s - Th r - Th r- H i s - G 1 y- L y s - A 1 a - T y r - A s p- V a 1 - A s p- Me t - V a 1 - A s p- A 1 a - A s n- L e u- P h e -

Me t- G l y (7) (c k k一 n 4、 NS 5領域に対応）

(—文字表記： CTTHG KAYDV DMVDA NL FMG)

G 1 y- A r g- A r g- G i n- P r o- I 1 e - P r o- L y s- A l a- A r g- A r g- P r o- G l u- G l y- A r g- Th r - T r p- A 1 a -

G i n- P r o (8) (c k k— c l、 c o r e領域に対応）

(一文字表記： GRRQP I PKAR RP EGR TWAQ P)

G l y- A r g- A r g- G i n- P r o- l i e - P r o- L y s- A s p- A r g - A r g - S e r- Th r- G 1 y- L y s - S e r - T r p - G l y -

L y s - P r o (9) (c k k一 c 2、 c o r e領域に対応）

(一文字表記： GRRQP I PKDR RS TGK S WGK P)

上記した種々の抗原べプチドと、 HC Vの抗原領域との関係を図 6および図 7 に模式的に示す。

実施例 3

(ELISA 用プレー卜の作製）

実施例 2で得た N S 4領域の抗原ペプチド c k k一 n 1を、 0. 1 5MN a C 1一 0 · 1 OMN a 2 H P O₄ - N a H₂ P O₄ · 2 H ₂ O緩衝液（ P B S ) P H 7. 0に、 1 i gZm 1の濃度となるように溶解した。このペプチド溶液を、 96 -ウェルマィクロブレ一ト（商品名： ELISA PLATE 6 866 7 、 NUNC 社製）に 1ゥエルあたり 1 00 μ 1ずつ分注し、 3 7。Cで 60分間静置して上記抗原べプチドをマイクロプレートに固相化した。

余剰の前記べプチド溶液を除去した後、マイクロプレートを 0. 0 1MP B S ( H 7. 0) で 3回洗浄した。洗浄液を除去した後、濃度 0. 1 %のゼラチンの 0. 0 1 MP B S ( p H 7. 0) 溶液を 1ゥエルあたり 3 0 0 μ 1ずつ分注し、 3 7^ 6 0分間静置してゼラチンをプレート上にコーティングした。余剰の前記ゼラチン溶液を除去した後、濃度 0. 0 5 %の Tw e e η 2 0を含有する 0. 0 1 MP B S溶液（ρ Η 7. 0 ) で 3回洗浄した。

このようにしてゼラチンをコーティングしたプレートを 2 5 °Cで 6時間乾燥した後、 4°Cで検体分析時まで保存した。

実施例 4

(検体の分析）

検体（2 0種類）は、予め株式会社エスァ一ルエル八王子ラボラトリーにおいて、文献記载（Okaraoto H.、肝胆膝， 2 4 , 7-1 4 ( 1 9 9 2 ) ； Chayaraa, K. , Tsubota, A. , Arase, Y. , et al. , J. Gastroenterol. Hepatol. 8， 1 5 0〜 1 5 6 ( 1 9 9 3 ) ) の P C Rを用いる方法を用いて H C V genotype の検査を行い、 H C Vgenotypeの判定を得た。

このようにして P C R法により H C Vgenotypeの判定を行った検体を用いて、以下のようにして実施例 2で得た抗原ペプチドの特異性を確認した。この検討においては、実施例 3で作製した抗原ペプチド固相化マイクロプレートを用い、以下のような手順で分析を行った。

上記した各検体をそれぞれ 0. 0 1 % B S Aおよび 0. 0 5 % Tw e e n 2 0 を含有する 0. 0 1 MP B S ( p H 7. 0 ) で 5 0倍に希釈して、各ゥエルに 1 0 0 μ 1ずつ分注して、上記抗原ペプチドと 3 7°Cで 6 0分間反応させた（抗原ペプチド一 H C V抗体の反応）。

反応後、マイクロプレートを 0. 0 5 %T w e e n 2 0含有 0. 0 1 MP B S ( p H 7. 0 ) で 5回洗浄し、洗浄液を除去した後、濃度 1 g / 2 0 m 1 のペルォキシダ―ゼ標識抗ヒト I g G抗体（K P L社製）を 1 0 0 1ずつ各ゥエルに注入し、 3 7°Cで 6 0分間反応させた（H C V抗体一 P O D標識抗ヒト I g G抗体の反応）。

反応後、マイクロプレートを 0. 0 5 %T w e e n 2 0含有 0. 0 1 M P B S ( H 7. 0 ) で 5回洗浄し、洗浄液を除去した後、各ゥエルに 0. 0 2 3 %過酸化水素、および 0. 0 0 5 % o—フヱニレンジァミン（O P D) を含有する 0. 1Mクェン酸一 N a 2 HP〇₄ 緩衝液を 1 00 μ 1ずつ分注し 3 7°Cで 30分間反応させた（ペルォキシダ一ゼの活性測定反応）。反応後、 5N硫酸を 50 μ 1 ずつ添加して反応を停止させ、波長 4 9 1 nmの吸光度（AB Sないし OD) を分光光度計（商品名：プレートリーダ一、日本インターメッド社製 N J - 200

1 ) で測定した。

実施例 5

(抗原べプチド c k k一 n 2、 n 5 2を用いた検体の測定）

実施例 3で用いた抗原べプチド c k k一 n 1に代えて、実施例 2で得た抗原べプチド c k k一 n 2又は n 5 2を用いた以外は、実施例 3と同様にして抗原ぺプチド c k k一 n 2または n 5 2を固相化したマイクロプレートを作製した。このようにして得たマイクロプレートを用いた以外は実施例 4と同様にして、予め H CV genotypeの判定を行った検体（ 20種類） .を分析した。

次いで、上記実施例 4および本実施例で得られた吸光度の測定データに基づいて、 serotype判定を行った。

この際の serotype判定においては、抗原ペプチド c k k— n 1 (serotype 1に対応するペプチド）を用いた場合の吸光度と、抗原ペプチド c k k— n 2 (sero type2に対応するペプチド）を用いた場合の吸光度と、抗原ペプチド c k k一 n 5 2 (serotype3に対応するペプチド）を用いた場合の吸光度とを比較して、いずれか一つの吸光度の値が、他の吸光度の値の 1. 5倍以上であった場合に、吸光度が高かったもののタイプ（ c k k一 n 1であれば serotype 1、 c k k - n 2 であれば serotype 2、 c k k一 n 5 2であれば serotype 3 ) とした。ここで用いた判定方法を下記の表 5にまとめて示す。

【表 5】

サンブル

抗原 1 2 3 4 5 ckk- -nl 〇 ckk- ■n2 〇 ckk- •n52

〇〇秦〇判定 1 2型 3型 1+2+3 判

> >〇の OD値は 1.5倍以上の場合秦の抗原の型と判定する,

»陽性〇陰性

上記により得られた serotype判定結果を、下記表 6 (検体の希釈率は 5 0倍）に示す。

NS4 NS5 core iff

1

*t * rJ

2 2

3 K

Λ 1 £s

Π 2 3

6 2 4

7 2 3

8 1 +2 3

9 1 2

10 0 3

11 0 4

12 1 2

13 1 2

14 0 0

in 1 0

16

拳書〇〇 P 〇 2 3

17 書〇〇〇〇秦〇 1 2

18 〇〇〇 o 〇 o 鲁 2 2

19 1 2

20 〇

〇〇〇謇 3 5

锵 6 第 1列：検体番号

第 2〜 4列： N S 4領域抗原べプチド c k k一 n 1 (第 2列、 N S 4— 1 ) 、 c k k - n 2 (第 3列、 NS 4— 2) 、および c k k一 n 5 2 (第 4列、 NS 4 - 3) のそれぞれを用いた場合の検体の陽性（き）、または陰性

(〇）の区別。上記表 6 (N= 20) の serotype判定結果中、 " 1 " は 1型、 " 2" は 2型、 " 0" は陰性（判定不能）、 " 1 + 2" は混在型（すなわち、いずれか一方の吸光度の値も、他方の吸光度の値の 1. 5倍未満であり、 OD値が cutoff値以上であつた場合）、 " 0" は判定不能を示す。

上記で得られた serotype判定の結果をまとめて、 genotype判定結果（図 5 (表 1 ) 中、第 9列" genotype" に示す）と比較したところ、以下の対応関係が得られた（Hepatology, 1 6 (4 ) , 8 8 6， 1 9 9 2参照）。

く serotypeと genotypeとの対応 >

genotype判定 serotype判定

(P C R) (NS 4抗原）

I group I

II group I

III group II

IV group II

V group III .

(表中、「genotypeV」は、 P C R法による genotype判定において V型と判定されたものを示す。）

実施例 6

(抗原べプチド c k k— n 3および c k k一 n 4を用いた検体の測定）

実施例 3で用いた抗原べプチド c k k一 η 1に代えて、実施例 2で得た N S δ 領域の抗原べプチド c k k一 η 3および c k k— η 4をそれぞれ用いた以外は、実施例 3と同様にしてそれぞれの抗原べプチドを固相化したマイク口プレートを作製した。このようにして得たマイクロプレートを用いた以外は実施例 4および 5と同様にして、予め H C Vgenotypeの判定を行った検体（ 2 0種類）を分析した。

本実施例の方法による serotype判定においては、実施例 5の場合と同様に、吸光度（ c k k一 n 3 ) と、吸光度（c k k一 η 4 ) とを比較して、いずれか一方の値が他方の値の 1 . 5倍以上であった場合に、吸光度の高い方のタイプ（c k k一 n 3の方であれば serotype 1、 c k k一 n 4の方であれば serotype 2 ) とした。

上記により得られた serotype判定結果を、前述した表 6の第 5〜 6列に示す。本実施例で得られた serotype判定の結果をまとめて、 genotype判定結果と比較したところ、実施例 4および 5の結果と同様に、以下の対応関係が得られた。上記した表 6において、各列のデータの意味は以下の通りである。

第 5〜 6列： N S 5領域抗原べプチド c k k一 n 3 (第 5列、 N S 5 — 1 ) 、および c k k一 n 4 (第 6列、 N S 5 — 2 ) のそれぞれを用いた場合の検体の陽性（暴）、または陰性（〇）の区別。

< serotypeと genotypeとの対応 >

genotype判疋' serotv卫 e判定

(P C R) (N S 5 )

I group I

II group I

III group II

IV group II

V group III

実施例 7

(抗原べプチド c k k一 c 1および c k k— c 2を用いた検体の測定）

実施例 3で用いた抗原べプチド c k k — n 1に代えて、実施例 2で得た c 0 r e領域の抗原べプチド c k k — c lおよび c k k — c 2 (いずれもァミノ酸 2 0 個からなるペプチド）をそれぞれ用いた以外は、実施例 3 と同様にしてそれぞれの抗原べプチドを固相化したマイクロプレートを作製した。

このようにして得たマイクロプレートを用いた以外は実施例 4および 5と同様にして、予め HC Vgenotypeの判定を行った検体（ 20種類）を分析した。

上記により得られた serotype判定結果を、前述した表 6の第 7 ~ 8列に示す。本実施例の方法による serotype判定においては、実施例 5の場合と同様に、吸光度（ c k k一 c 1) と、吸光度（ c k k一 c 2) とを比較して、いずれか一方の値が他方の値の 1. 5倍以上であった場合に、吸光度の高い方のタイプ（c k k一 c 1の方であれば serotype 1、 c k k— c 2の方であれば serotype 2 ) とした。

本実施例で得られた serotype判定の結果をまとめて、 genotype判定結果と比較したところ、実施例 4および 5の結果と同様に、以下の対応関係が得られた。上記した表 6において、各列のデータの意味は以下の通りである。

第 7 ~ 8列： c 0 r e領域抗原べプチド c k k一 c 1 (第 7列、 c o r e 一 1 ) 、および c k k一 c 2 (第 8列、 · c o r e— 2) のそれぞれを用いた場合の検体の陽性（秦）、または陰性（〇）の区別。

第 9列： serotype判定結果。

第 1 0列： genotype判定結果。

< serotypeと genotypeとの対 J¾、 >

genotype判疋 serotype判定

(P C R) (c o r e )

I group I

II group I

III group II

IV group II

V group III

上述したように本発明によれば、従来の serotype判定方法では判定不能であつた genotype V型も、 c k k— n 5 1又は c k k一 n 5 2を用いることにより、 se rotypelll 型として判定可能となった。

上述したように genotype Iおよび genotype IIは serotype I と良く相関し、 genotype IIIおよび enotype IVは serotype IIと良く関し、更に genotypeV は serotype IIIと良く相関していた。産業上の利用可能性

上述したように本発明によれば、 HCVに固有の特定のアミノ酸配列を有する抗原べプチド化合物およびこれを用いる HCV抗体測定方法が提供される。本発明によれば、交叉反応ないし非特異反応を抑制しつつ NS 4領域の感度を向上させることにより、検体の serotypeを簡便且つ正確に判定することが可能となる。したがって本発明によれば、 N S 4領域の感度を向上させた正確且つ簡便な serotype判定に基づき、例えば、インターフヱロン治療の効果をあらかじめ予測することが可能となる。

更には、本発明による HCV抗体価測定に基づき、 C型肝炎の治癒ないし治療経過を簡便に観察することが可能となる。すなわち、本発明によれば、疫学的な点からセロタイプを利用することが可能となり、過去の感染（NS 4領域の抗体価）と、現在の肝炎（N S 4および/又は N S 5領域の抗体価）との関係についての知見を得ることも可能となる。

更には、本発明によれば、 HCVの genotype I型および II型と、 genotypelll 型および IV型と、 genotypeV型との区別が可能な H C V抗体の簡便な測定を可能とする HCV抗体測定用抗原が提供される。

更には、本発明によれば、 HCVの genotype I型および II型と、 genotypelll 型および IV型と、 genotypeV型との区別が可能で、しかも交叉反応ないし非特異反応が抑制された HCV抗体の測定を可能とする HC V抗体測定用抗原が提供される。

更には、本発明によれば、 HCVの genotype I型および II型と、 genotypelll 型および IV型と、 genotypeV型との区別が可能な H C V抗体の簡便な測定法が提供される。

更には、本発明によれば、 HCVの genotype I型および II型と、 genotypelll 型および IV型と、 genotypeV型との区別が可能で、しかも交叉反応ないし非特異反応が抑制された HCV抗体の測定法が提供される。

更には、本発明によれば、 H C Vの genotype I型および II型と、 genotypelll 型および IV型と、 genotypeV型との区別が可能な低コス卜の HCV抗体の測定法が提供される

Claims

言青求の範囲

1. 下記式（1 ) ないし（3) からなる群から選ばれた配列に含まれるァミノ酸配列であって、連続した少なくとも 6個のァミノ酸からなる配列を含むことを特徴とする抗原べプチド化合物。

L e u- H i s - I 1 e - A s n- G i n- A r g - A 1 a - V a 1 - V a 1 - A 1 a - P r o- A s p- L y s - G 1 u- V a 1 - L e u- T y r - G 1 u- A 1 a - P h e - A s p- G 1 u- Me t - G 1 u - G l u- C y s - S e r - G i n- A 1 a- A r g- P r o- T y r - I 1 e- G l u- G 1 n- A r g- G 1 n- V a 1 - I l e - A l a - H i s - G l n- P h e - L y s - G l u- L y s - V a l - L e u ( 1 )

G 1 u- A 1 a - P h e - A s p- G l u- M e t - G l u- G 1 u- C y s - S e r - G l n- A l a- A r g- P r o- T y r - I 1 e - G 1 u- G 1 n- A r g- G l n- V a l - I 1 e - A 1 a - H i s - G l n- P h e - L y s - G 1 u - L y s - V a 1 - L e u ( 2)

S e r - G i n- A 1 a - A r g - P r o- T y r - I 1 e - G 1 u- G 1 n- A r g- G l n- V a l - I 1 e - A 1 a - H i s - G i n- P h e - L y s- G 1 u - L y s - V a 1 - L e u ( 3)

2. 前記アミノ酸配列が、下記式（1 ) で示される配列である請求項 1記載の抗原べプチド化合物。

L e u- H i s - I 1 e - A s n - G i n- A r g- A 1 a - V a 1 - V a 1 - A l a - P r o- A s p- L y s - G l u_ V a 1 - L e u- T y r - G l u - A 1 a - P h e - A s - G 1 u- M e t - G 1 u - G l u- C y s - S e r - G l n- A l a - A r g- P r o- T y r - I 1 e - G l u- G l n- A r g- G 1 n - V a 1 - I l e - A l a - H i s - G i n- P h e - L y s - G l u - L y s - V a 1 - L e u ( 1 )

3 , 前記アミノ酸配列が、下記式（2) で示される配列である請求項 1記載の抗原べプチド化合物。

G 1 u- A 1 a - P h e- A s p- G l u- Me t - G l u - G l u- C y s- S e r- G l n- A l a- A r g- P r o- Ty r- l i e- G l u- G l n- A r g- G 1 n- V a 1 - I 1 e- A l a- H i s - G i n- P h e- L y s - G 1 u- L y s - V a 1 - L e u (2)

4. 前記アミノ酸配列が、下記式（3) で示される配列である請求項 1記載の抗原べプチド化合物。

S e r - G i n- A l a - A r g - P r o- Ty r- I 1 e - G l u- G 1 n- A r g - G l n- V a 1 - I 1 e - A 1 a- H i s - G i n- P h e- L y s - G 1 u - L y s - V a 1 - L e u (3)

5. 化学的手法を用いて製造した請求項 1記載の抗原ぺプチド化合物。

6. 遺伝子工学的手法を用いて製造した請求項 1記載の抗原べプチド化合物。

7. 請求項 1に記載の抗原べプチドを担体に結合させ、抗原—抗体反応を利用して該ぺプチドに検体中の HCV抗体を結合させ、更に抗原一抗体反応を利用して該 HCV抗体に標識リガンドを結合させることにより、上記検体中の HCV抗体を測定することを特徴とする HCV抗体の免疫学的測定法。

8. 前記標識リガンドとして、酵素で標識したリガンドを用いる請求項 7記载の HCV抗体の免疫学的測定法。

9. 前記標識リガンドとして、放射性物質で標識したリガンドを用いる請求項 7記載の HC V抗体の免疫学的測定法。

1 0. 前記標識リガンドとして、蛍光物質で標識したリガンドを用いる請求項 7記載の H C V抗体の免疫学的測定法。

1 1. 請求項 1に記載の抗原べプチドから選択されたいずれか 2以上の抗原べプチドを用いて、 HCVのセロタイブ（serotype) を判定する請求項 6記載の H CV抗体の免疫学的測定法。

1 2· 請求項 1に記載の H C Vの N S 4領域、 c o r e領域および N S 5領域に対応する抗原べプチドから選択された、異なる領域に対応する 2以上の抗原べプチドを用いて、 HCVのセロタイブ（serotype) を判定する請求項 7記載の H C V抗体の免疫学的測定法 _c