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WO1997010355A1 - Processus de production d'amide d'acide actif sur le plan optique - Google Patents

Processus de production d'amide d'acide actif sur le plan optique Download PDF

Info

Publication number
WO1997010355A1
WO1997010355A1 PCT/JP1995/001823 JP9501823W WO9710355A1 WO 1997010355 A1 WO1997010355 A1 WO 1997010355A1 JP 9501823 W JP9501823 W JP 9501823W WO 9710355 A1 WO9710355 A1 WO 9710355A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ferm
group
rhodococcus
compound
nitrile
Prior art date
Application number
PCT/JP1995/001823
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazumasa Otsubo
Keizou Yamamoto
Wataru Takahashi
Original Assignee
Nagase & Company, Ltd.
Asahi Chemical Industry Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nagase & Company, Ltd., Asahi Chemical Industry Co., Ltd. filed Critical Nagase & Company, Ltd.
Priority to PCT/JP1995/001823 priority Critical patent/WO1997010355A1/ja
Publication of WO1997010355A1 publication Critical patent/WO1997010355A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an acid amide compound having a high optical purity from a racemate or a corresponding nitrile compound having a low optical purity by using a living organism or a processed product thereof. More specifically, it is useful as an intermediate for producing a drug substance such as a drug for treating arrhythmia or a drug for treating arteriosclerosis, and as an intermediate for producing an amine having high optical purity which is important as an optical resolving agent.
  • Useful acid amide compounds with high optical purity use specific microorganisms that have nitrile hydratase activity, but have very low nitrilase and amidase activities and very low racemase activity, or processed products thereof. Accordingly, the present invention relates to a method for producing from a racemate or a corresponding nitrile compound having low optical purity. Further, the present invention relates to a novel microorganism useful for the above method.
  • Methods for producing an optically active acid amide include a method using an optically active resolving agent, a method using asymmetric synthesis, and a method for treating an organism or a processed product thereof (crushed bacterial cells, crude or purified enzyme active substances). Etc.) are known.
  • the method using an optically active resolving agent is relatively expensive since the optical resolving agent used is relatively expensive, and the method used several times to obtain an optical purity of 98% ee or more generally required for pharmaceuticals.
  • the asymmetric synthesis method is disadvantageous in that the steps are complicated and many steps must be performed, and the yield and optical purity are low.
  • Racemic 2-aryl alkane nitriles are acted on by microorganisms acting on Pseudomonas ⁇ , celiacia ⁇ or moraxella ⁇ to produce an optically active amide having a hydroxyl group or a lower alkyl at the ⁇ -position.
  • Production method PC International Publication W092 / 052755): This method has low amide generation activity of all microorganisms used, and the nitrile concentration used in the reaction is about 0. It is industrially disadvantageous in that it is as low as 2 to 0.8%.
  • the optical purity of the generated optically active amide is extremely low, about 30% e.e., and its industrial value as an optically active amide is low.
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for producing an acid amide using a microorganism or a processed product thereof, which has a high acid amide generation rate and high optical purity.
  • the racemic or low-purity L-butyryl compound represented by the following general formula (I) can be converted into the optically pure diacid amide compound represented by the following general formula (II)
  • the nitrilase activity to convert nitril to the corresponding carboxylic acid and the amidase activity to convert the generated acid amide to the corresponding carboxylic acid are extremely weak.
  • these microorganisms can convert even a high nitrile concentration into an acid amide, and can provide a high acid amide production rate and a high optical purity.
  • microorganisms convert only one optical isomer of the nitrile compound to the acid amide and not the other, but the recovery and re-racemization of the other optically active nitrile compound is not possible. It is industrially advantageous because it is easy and can be reused as a starting material.
  • a racemic or nitrile compound having a low optical purity represented by the following general formula (I) can be converted into an acid amide having a high optical purity represented by the following general formula ( ⁇ ) the compound was Kotogawa or ⁇ efficiently be produced '0
  • Corynebacterium sp. A68 (FERM BP— 5215), Rhodococcus sp KPO-2028 (FERM BP— 5216), Rhodococcus sp. PP-25 (FERM BP— 5217), Rhodococcus sp. PP-121 (FERM) BP-5218), Rhodococcus 'Maris BP-479-9 (FERM BP-5219), Bacillus' subtilis PP-116-15 (FERM BP-5220), Brevibacterium sp PP-133-7 (FERM BP- 52 21),
  • the present invention provides a novel microorganism, Rhodococcus maris BP-479-9 (FERM BP-5219), which is particularly useful in performing the above method.
  • R 2 represents water purple or a ⁇ ( ⁇ alkyl group.
  • R 2 is a CC * alkyl group, the group may be present in any of the ortho, meta and para positions.
  • the ⁇ C beta alkyl group represents a straight ⁇ or branched ⁇ alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, e.g., methyl, Echiru, .eta. propyl, Isoburopiru, .eta. butyl, t- butyl group , Isobutyl, n-pentyl, neopentyl, and ⁇ -hexyl group.
  • a (: 4 alkyl group represents a directly-sold or branched alkyl group having 1 to 4 coal atoms.
  • 1-3 pieces of Fuyuniru groups S substitution has been C, and -C 3 alkyl group represents methyl substituted with 1-3 Fuyuniru group, Echiru, a n- propyl or isopropyl group, such as benzyl And benzhydrinole, trityl, phenethyl, and vinyl group.
  • the C 3 -C 8 cycloalkyl group a cycloalkyl group from 3 to eight carbon atoms, i.e., Shikurobu port pills, cyclobutyl, cyclopentyl, key sill cyclohexane, butyl or Shikurookuchiru group cyclohexylene.
  • the nitrile compound of the general formula (I) wherein R 2 is water purple is converted.
  • R 1 is ( ⁇ 4 alkyl group, methyl or ethyl group substituted with 1 or 2 phenyl groups, or C S -C 7 cycloalkyl group
  • R 2 is hydrogen
  • ( ⁇ to (: 4 alkyl groups are as defined above, and C 5 to C 7 cycloalkyl groups are cyclopentyl and cycloalkyl) Represents a hexyl or cycloheptyl group.
  • R 1 is ( ⁇ to (: 4 alkyl group, benzyl group, benzhydryl group, or C 5 to C 7 cycloalkyl group
  • R 2 is hydrogen
  • the nitrile compound of general formula (I) is converted to the corresponding acid amide according to the method of the present invention.
  • R 1 is The nitrile compound represented by the above general formula (I), which is an alkyl group and R 2 is hydrogen, is converted into a corresponding acid amide according to the method of the present invention.
  • the nitrile compound of the above general formula (I) wherein R 1 is an isopropyl or t-butyl group and R 2 is hydrogen is converted to the corresponding acid amide according to the method of the present invention. Convert to
  • the nitrile compound represented by the above general formula (I), which is a starting material in the method of the present invention, can be obtained, for example, from Journal of American Chemical Society (J. Am. Chen. So), Vol. 79 Pp. 3467-3469 (1957); JP-A-51-77044; JP-A-51-122636; Synthesis. (1986) and the like. In addition, starting materials available from commercial products may be purchased and used.
  • the optical purity is low in one of the (S) -form or the (R) -form. Mixtures can also be used.
  • the acid amide represented by the general formula (II) having high optical purity produced by the method of the present invention is an amine having high optical purity which is important as an intermediate for producing a pharmaceutical substance or as an optical resolving agent.
  • Useful as an intermediate for the production of Representative examples of these acid amides ( ⁇ ) include, for example, (R) -body or (S) -body, or (+)-body or (one) -body:
  • the present invention relates to a method for converting an optically inactive nitrile into a corresponding optically active acid amide by utilizing a microorganism or a processed product thereof. is important.
  • nitril is converted to an acid amide by using any of these strains or a processed product thereof.
  • the treated product is preferably used in the method of the present invention.
  • the processed product is used in the method of the present invention.
  • Maris BP-479-9 (FERM BP-5219), or
  • the processed product is used in the method of the present invention.
  • Rhodococcus' maris BP-479-9 (FERM BP-5219) or a processed product thereof is used in the method of the present invention.
  • mutants obtained by treating these strains with a known mutagen such as N-methyl- ⁇ '-nitronitrosoguanidine (NTG) or gene engineering can be used.
  • NTG N-methyl- ⁇ '-nitronitrosoguanidine
  • Strains modified by a genetic method can also be used in the method of the present invention.
  • Corynepacterium 'SP68 (FERM BP-5215) is a known strain described in JP-A-3-19695 (for the mycological K, refer to the same publication). This strain was introduced in 1988 On August 22, he was originally deposited with the National Institute of Biotechnology and Industrial Technology, and was transferred to the International Depositary on September 1, 1995, and was assigned the indicated accession number.
  • Rhodococcus sp. KP0-2028 (FERM BP-5216), Rhodococcus sp. PP-25 (FERM BP-5217), Rhodococcus sp.
  • PP-121 (FERM BP-5218), Rhodococcus maris BP-479-9 (FERM BP-5219), Bacillus subtilis PP-116-15 (FERM BP-5220), and Brevibacterium 'SP PP-133-7 (FERM BP-5221) are all new. This is a new strain isolated as nitrile bacteria from soil. All of these strains were originally deposited on November 2, 1993 at the Institute of Life Science and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and transferred to an international deposit on September 1, 1995, and given the respective accession numbers. Have been.
  • Rhodococcus' SP KPO-2028 (FERM BP-5216) Cell shape
  • Rhodococcus' Maris BP-479-9 (FERM BP-5219) cell shape; rod-like
  • the microorganism used in the method of the present invention is cultured. Cultivation of the microorganism can be performed according to a known method.
  • the medium used may be a medium containing the usual nutrients for the usual microorganisms, ie coal, nitrogen, mineral nutrients and the like.
  • a carbon source glucose, glycerin, ethanol, sucrose, glutamic acid, acetic acid, citric acid, fumaric acid and the like can be used.
  • an inorganic nitrogen source such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonia, urea, or an organic nitrogen source such as bran extract, malt extract, peptone, meat extract, etc. can be used. .
  • Phosphoric acid, magnesium, potassium, iron, cobalt, manganese, lanthanum and the like can be used as inorganic nutrients. These nutrient sources may be used in appropriate combination. Further, as a substance for increasing the reaction activity of the microorganism, a cyano compound such as acetonitrile and isobutyronitrile and an amide compound such as cabrolactam may be added.
  • the pH of the medium may be in the range of 5-10, preferably in the range of 6-8.
  • the culture temperature is from 18 to 50 ° C, preferably from 25 to 40 ° C.
  • the culturing time varies depending on the culturing conditions, but is usually 1 to 4 days, and culturing may be performed until the activity is maximized.
  • the above-mentioned processed microorganism is a nitrile hydratase activity capable of optically selectively hydrating a nitrile group of a racemic or nitrile compound (I) having a low optical purity. If it has the property, it means that it may be in any form. Its form differs depending on whether the enzyme activity is mainly present in the cells or extracellularly.
  • the enzyme activity is present in the cells, the culture of the above microorganism, the cells collected therefrom, the treated cells (eg, the crushed cells, the separation / extraction from these cells) Enzymatically active substances at various purification stages), the cells immobilized on a carrier by a known appropriate method, or the treated cells.
  • the activity is present outside the cells, the culture of the microorganism, the culture broth, the enzymatic active separated and extracted from the culture broth, or immobilized on a carrier by a known suitable method Refers to the activated enzyme and the like.
  • the enzyme active substance can be isolated and purified from the microorganism using a known enzyme purification means.
  • the enzyme is an intracellular enzyme
  • the cells are collected by, for example, centrifugation of a microorganism culture, and the cells are disrupted by mechanical means such as ultrasonic treatment or a dyno mill.
  • a crude enzyme solution is obtained by removing solid matter such as cell debris by centrifugation or the like, and the crude enzyme solution is subjected to ultracentrifugation separation, salting out, organic solvent precipitation, adsorption chromatography, Purify by ion-exchange chromatography, gel chromatography, reverse-phase chromatography, etc.
  • a stabilizer for preventing inactivation of the enzyme during the enzyme purification a commonly used stabilizer or about 1 to 10 O mM of isobutylamide may be added.
  • the microorganism obtained as described above or a treated product thereof is usually mixed with a suitable reaction medium in a suitable reaction medium. It may be brought into contact with racemate or nitrile (I) having low optical purity under the conditions.
  • Suitable reaction media include water, aqueous media such as buffers or hair fluids, water Mixed medium of a water-soluble organic solvent and a water-soluble organic solvent such as methanol, dimethyl sulfoxide or acetone, and a two-phase medium comprising an aqueous medium and a water-insoluble organic solvent such as hexane, ethyl acetate, ethyl ether or toluene (Including water-insoluble solvents saturated with water).
  • a suitable surfactant may be added to the reaction medium in an amount of about 0.01 to 2%.
  • Racemic or nitrile (I) of low optical purity may be added to the reaction medium in powder or liquid form or dissolved in a suitable solvent.
  • concentration of nitrile (I) added to the reaction solution is about 0.01 to 70% by weight, preferably about 1,0 to 50% by weight.
  • Nitril (I) need not be completely dissolved in the reaction medium.
  • the concentration of the microorganism or the processed product used in the above reaction varies depending on the degree of nitrile hydratase activity.
  • concentration of the cells in the reaction solution may be generally in the range of 0.05 to 20% by weight.
  • the treated product is added in such an amount that an activity equivalent to that in the case of using a microbial cell is obtained.
  • the reaction temperature may be about 5-60 ° (preferably, about 15-50 ° C.)
  • the reaction pH may be about 4-11, preferably about 7-10.
  • the reaction time varies depending on the reaction conditions, but is usually in the range of 100 to 100 hours.
  • the progress of the reaction is monitored by high performance liquid chromatography (HPLC), etc., and the optical activity generated
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the reaction is preferably terminated when the optical purity of the acid amide ( ⁇ ) is higher than the desired optical purity, preferably at least 80% ee, particularly preferably at least 90% ee.
  • a new nitrile (I) may be added to the reaction solution so that the nitrile (I) concentration is maintained within the above range
  • the optically active acid amide ( ⁇ ) can be isolated from the reaction mixture by various methods, for example, hexane or azo acid And a method of separation by chromatography on a silica gel column. If the generated optically active acid amide ( ⁇ ) has low solubility in the reaction medium, crystals precipitate during the reaction, and this can be recovered by centrifugation or the like.
  • the optical purity can be increased by the operation of preferential crystallization.
  • the enzyme nitrile hydratase of the microorganism used in the present method selectively acts on only one isomer of racemic nitrile (I) to generate an optically active acid amide ( ⁇ ). It is based on that.
  • these microorganisms have extremely low nitrilase activity of converting nitrile to acid and amidase activity of converting acid amide to acid, optically active acid amide ( ⁇ ) can be obtained without generation of acid.
  • the racemase activity of converting an optically active acid amide ( ⁇ ) into a racemate is extremely low, the acid amide ( ⁇ ) can be recovered without lowering the optical purity.
  • an optically active acid amide ( ⁇ ) When an optically active acid amide ( ⁇ ) is produced by the method of the present invention, an unconverted optically active nitrile compound remains. It can be recovered by simple operations such as extraction, centrifugation, and column separation. The recovered optically active nitrile compound itself can be converted into an optically active amine or optically active carboxylic acid which is useful as a pharmaceutical or an optical resolving agent and used. Further, the recovered optically active nitrile compound can be easily racemized by treating it with, for example, ammonia or sodium hydroxide in a solvent such as methanol. This racemic nitrile compound (I) can be reused in the method of the present invention. Therefore, if the purpose is to produce only the optically active acid amide ( ⁇ ), the desired optically active acid amide ( ⁇ ) can be produced in high yield. Can be
  • the first example is that an optically active acid amide (D) is hydrogenated under acidic conditions.
  • the desired optically active amine (III) is obtained by performing steric retention reduction with sodium borohydride.
  • This a reaction is carried out in an inert solvent.
  • an aprotic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO), diglyme, ethylene glycol dimethyl ether, tetrahydrofuran (THF), or 1,4-dioxane is preferable.
  • Examples of the acid used in the primary reaction include, for example, inorganic acids such as hydrobromic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, and nitric acid; organic acids such as sulfuric acid, P-toluenesulfonic acid, and methanesulfonic acid; Ether complex, Al chloride Emit Lewis acids such as titanium tetrachloride.
  • chloroic acid which provides a high yield and is easy to handle, is a preferred solvent.
  • Use of acid :! Is about 1 to 20 molar equivalents, preferably about 3 to 10 molar equivalents, based on the optically active acid amide ( ⁇ ).
  • the amount of sodium borohydride used is about 1 to 20 mole equivalents, preferably about 3 to 10 mole equivalents, based on the acid amide ( ⁇ ).
  • the reaction is usually carried out at a temperature of about 20 to 200 ° C, preferably at a temperature of about 50 to 180 ° C to control side reactions.
  • the optically active amine (m) obtained by this general reaction can be recovered from the reaction solution, for example, as follows. That is, the reaction solution is made strongly acidic with an aqueous hydrochloric acid solution or the like, and this solution is washed with a water-immiscible organic solvent such as dichloromethane or chloroform. Next, the aqueous layer is made strongly alkaline, and extracted with a water-immiscible organic solvent such as dichloromethane and chloroform, and the solvent of the extract is distilled off to obtain an optically active amine (m).
  • the desired optical activity is obtained by dehydrating the optically active acid amide ( ⁇ ) while maintaining the steric state and hydrogenating the obtained optically active nitrile (IV) while maintaining the steric state.
  • This is a method to obtain a good amine (m).
  • the steric retention dehydration reaction of an optically active acid amide ( ⁇ ) is carried out by treating with a dehydrating agent in an inert solvent.
  • Examples of the dehydrating agent to be used include a dehydrating agent such as thionyl chloride, anhydrous dianhydride and diphosphorus pentoxide, and an azeotropic dehydrating agent such as sulfuric acid and P-toluenesulfonic acid.
  • thionyl chloride which provides a high yield and can control racemization, is a preferred dehydrating agent.
  • the amount of thionyl chloride to be used is about 1 to 20 equivalents, preferably about 1 to 3 equivalents, relative to the optically active acid amide ( ⁇ ). This reaction can be carried out at a temperature of about 50-150 ° C, In order to control the temperature, it is preferable to carry out at a temperature of about 70 to 100.
  • Examples of the inert solvent include ethyl acetate and toluene.
  • the optically active nitrile (IV) obtained by this dehydration reaction is recovered from the reaction solution by washing the reaction solution with a weak alkaline aqueous solution, water, or a saline solution, and then distilling off the solvent. be able to.
  • the steric retention hydrogenation of the thus obtained optically active nitrile (IV) is carried out by hydrogenation in an inert solvent in the presence of a catalyst.
  • a catalyst As the source catalyst, a homogeneous catalyst or a heterogeneous catalyst can be used.
  • Raney nickel is preferably used as a heterogeneous catalyst which can be added in a simple and high yield with water purple.
  • the amount of the catalyst used is about 1 to 50% (wtZwt ratio), preferably about 10 to 30% Ot / wt ratio, based on the optically active nitrile (IV).
  • inert solvent examples include alcohol solvents such as methanol, ethanol and isopropanol, and ether solvents such as diglyme, tetrahydrofuran (THF) and 1,4-dioxane.
  • alcohol solvents such as methanol, ethanol and isopropanol
  • ether solvents such as diglyme, tetrahydrofuran (THF) and 1,4-dioxane.
  • ethanol or isobrovanol are preferred solvents.
  • the hydrogenation is preferably carried out at room temperature to 120, preferably at room temperature to 80.
  • the hydrogen pressure may be between 1 and 100 kgZcm 2 'G, preferably between 5 and 800 kgZcm 2 ' G.
  • aqueous ammonia to the reaction solution in order to suppress the generation of by-products such as dialkylamine.
  • the amount of ammonia to be added may be about 0.01 to 1.0 molar equivalent relative to the optically active nitrile (IV), and about 0.1 to 0.5 to suppress racemization. It is preferably a molar equivalent.
  • the obtained optically active amine (II) can be recovered from the reaction solution in the same manner as described above.
  • the optical purity of the starting materials, intermediate products and target products is determined, for example, by Chiral Cell 0D-R, Chiral Cell 0J, Chiral AGP, Crown Pack (CBOfNPAK) CR (Daicel Chemical Industries) , Ceramosper Chiral RU-1 ( ⁇ seido), Sumichiral (SUMICHIBAL) 0 A (Sumitomo Chemical Analysis Center), Opti-pak TA (Waters), etc. It can be measured by the HP LC analysis used.
  • the percentages in the following examples represent weight Z capacity O / v)% unless otherwise specified.
  • the production rate and optical purity of the optically active acid amide were measured by high performance liquid chromatography (HPLC). The yield was calculated based on the total amount of nitrile (racemic) used in the reaction (therefore, the maximum value was 50%). Optical purity was indicated by the enantiomeric excess.
  • the culture was centrifuged to collect the cells, and the cells were dissolved in 40 ml of a 0.01 M phosphate solution (pH 7.5). Then, 20 g of oily 2-fu: L 2-loo 3-methylbutyronitrile was added, 35. The reaction was carried out for 40 hours while stirring with C. When a part of the reaction solution was analyzed under the following HPLC analysis conditions, the yield of 2-fluoro-3-methylbutylamide was 34%, and the optical purity of the S-isomer was 92.0% ee. . No production of 2-phenyl-3-methylbutyric acid was observed.
  • Retention time 3.9 minutes for S-form, 5.0 minutes for R-form.
  • the other organisms listed in Table 1 below were allowed to act on 2-fluoro-3-methylbutyronitrile in the same manner as described above.
  • Table 1 shows the production rate and optical purity of 2-phenyl-3-methylbutylamide measured by HP LC.
  • Rhodococcus * Maris BP-479-9 strain (FERM BP-5219) was cultured under the same culture conditions as in Example 1. Then, the cells were collected by centrifugation, washed, and suspended in 10 ml of distilled water. To this, 10 Otng of 2-cyclohexyl-2-phenylacetonitrile was added and reacted at 30 for 24 hours. Analysis by HPLC revealed that (S) -2-cyclohexyl-2-phenylacetamide was produced at a production rate of 18%, and the optical purity of the S-isomer was 8 l% e.e. Incidentally, 2-cyclohexyl-2-phenylacetic acid was not produced.
  • Retention time S body 9.5 minutes, R body 12.0 minutes
  • the cells were collected by centrifugation, and the cells were suspended in a mixed solution of 90 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5) and 10 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO). Next, 0.1 lg of 2,3,3-triphenylpropionitrile was added, and the mixture was reacted at 30 parts for 48 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture was analyzed by HPLC under the following conditions. The title compound was produced at a production rate of 11%, and the optical purity was 82% ee. It turned out to be.
  • Retention time R body 7.7 minutes, S body 8.6 minutes
  • Rhodococcus maris BP-479-9 strain (FERM BP-5219) was cultured in a 2 L liquid medium in the same manner as in Example 1, and then the culture was centrifuged to collect 26 g of cells. This is washed with 30 mM potassium phosphate buffer containing 40mM Isobuchiruami de (P H 7.3), and suspended in the same buffer 60 ml. Then, the cells were sonicated at 9 KHz under ice-cooling for about 10 minutes to disrupt the cells. This cell lysate was centrifuged at 1800 Orpm for 20 minutes to remove cell debris and obtain a cell extract. The specific activity of nitrile hydratase in the extract was 0.126 U / mg.
  • the extract was dialyzed against 2 L of the same buffer as above, and the resulting dialysate was placed in a column of DEAE-cellulose, and a 5 OmM potassium phosphate buffer containing 0 to 0.5 M sodium chloride was added. Elution with linear (pH 7.0) gradient did. The fractions containing the enzymatic activity were collected, 15% ammonium sulfate was added, and the mixture was placed in a column of Phenyl Sepharose CL-14B, followed by 5 OmM potassium phosphate buffer containing 4 OmM isobutylamide (pH 7.3). Eluted. Fractions containing the enzyme activity were collected and subjected to humidification with 60% ammonium sulfate saturation. The obtained precipitate was dissolved in a small amount of 5 OmM potassium phosphate buffer (pH 7.3) and dialyzed with the same buffer to obtain purified nitrogen.
  • the method for measuring the sex and fermentation activities of the purified enzyme is as follows.
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis detected two submissions with molecular weights of 24000 and 25100.
  • this enzyme is a nitrile rehydratase that converts a nitrile compound to an acid amide compound, and is a nitrile compound having 2-phenyl-3-methylbutyronitrile and its analogous structure. It is an enzyme that has an excellent effect of optically hydrating A.
  • Retention time R body 7.7 minutes, S body 8.6 minutes
  • an acid amide compound having a high optical purity which is useful as a pharmaceutical intermediate or an intermediate for an optical resolving agent, can be efficiently converted from an inexpensive raw material such as a racemate or a nitrile compound having a low optical purity.
  • an inexpensive raw material such as a racemate or a nitrile compound having a low optical purity.
  • it can be produced with high purity, and this method is extremely useful in industry.

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Description

明 现 害 光孊掻性な酞ァミ ドの補造方法 技術分野
本発明は、 光孊玔床の高い酞アミ ド化合物を、 撖生物たたはその凊理物 を利甚するこずにより、 ラセミ䜓たたは光孊玔床の䜎い察応する二トリル 化合物から補造する方法に関する。 さらに詳しくは、 䞍敎脈治療薬あるい は動脈硬化治療薬などの医薬物質を補造するための䞭間䜓ずしお有甚な、 さらには光孊分割剀ずしお重芁な光孊玔床の高いァミンを補造するための 䞭間䜓ずしお有甚な光孊玔床の高い酞ァミ ド化合物を、 二トリルヒドラタ ヌれ掻性を持぀が、 二卜リラヌれ掻性およびァミダヌれ掻性は極めお䜎く、 か぀ラセマヌれ掻性も極めお䜎い特定の埮生物たたはその凊理物を利甚す るこずにより、 ラセミ䜓たたは光孊玔床の䜎い察応する二トリル化合物か ら補造する方法に関する。 さらに、 本発明は䞊蚘方法に有甚な新芏な埮生 物に関する。
背景技術
光孊掻性な酞アミ ドを補造する方法ずしおは、 光孊掻性な分割剀を甚い る方法、 䞍斉合成による方法、 あるいは撖生物たたはその凊理物菌䜓砎 砕物、 粗補たたは粟補された酵玠掻性䜓などを甚いる方法が知られおい る。
これら方法のうち、 光孊掻性な分割剀を甚いる方法は、 䜿甚する光孊分 割剀が比范的高䟡である点、 医薬ずしお䞀般に必芁ずされる光孊玔床 9 8 %e. e.以䞊を埗るためには䜕回もの再桔晶を必芁ずする点、 および䞍甚な 光孊異性䜓が半分量残り、 この残存する酞アミ ド化合物のラセミ化が困難 である点で䞍利である。 たた、 䞍斉合成による方法は、 工皋が耇雑であり 倚くの工皋を経なくおはならない点、 収率および光孊玔床が䜎い点などに より䞍利である。
䞀方、 埮生物たたはその凊理物を甚いる方法ずしおは、 䟋えば次の方法 が知られおいるが、 これら方法はそれぞれに欠点を有しおいる。
(1)ラセミ䜓の 2, 2-ゞメチルシクロプロパンカルボキサミ ド䞭の R䜓 のみを R- (— -2, 2-ゞメチルンクロプロパンカルボン酞に倉換し、 残぀ た S䜓を取埗する方法 (特開平 5-76391号公報 この方法はァミダ ヌれを甚いる方法であるが、 生成した䞍甚な R-カルボン酞は廃棄するか、 たたはラセミ化およびアミ ド化しお再䜿甚しなければならず、 工皋が耇雑 である。
(2)ラセミ䜓のな-アミノニトリルにバチルス厲、 ノ、'クテリゞナヌム厲、 ミクロコッカス Ÿたたはブレビパクテリゥム厲に属する埮生物を䜜甚させ お L-a-ァミノ酞ず D-α-ァミノアミ ドの混合物を補造する方法 (特衚昭 56-500031号公報 この方法は L-α-ァミノ酞ず アミノア ミ ドの䞡方を䞎えるので、 この混合物からそれぞれを分離および粟補する 工皋が必芁である点、 および目的ずする光孊掻性なアミ ドが半分量しか埗 られない点で工業的に䞍利である。
(3)ラセミ䜓の α-アミノニトリルにシナヌドモナス厲、 ロドコッカス Ÿ たたはノカルディア IRに厲する埮生物を䜜甚させお L-α-ァミノ酞ず D- α-アミノアミ ドの混合物を補造する方法 (特開平 2- 31694号公報 この方法は䞊蚘 (2)ず同様の点で䞍利である。
(4)ラセミ䜓のマンデロニ卜リルにロドコッ力ス ISに属する埮生物を䜜 甚させお α䜍に氎酞基を有する S-(+)-マンデルアミ ド類を補造する方法 (特開平 4-222591号公報 この方法は反応に甚いる二トリル濃床 力玄 0. 2 %ず䜎く、 工業的レベルには皋遠い。
(5)ラセミ䜓の 2 -ァリヌルアルカン二トリル類にシナヌドモナス厲、 セ ラチア厲たたはモラキセラ厲に厲する埮生物を䜜甚させお α䜍に氎酞基た たは䜎玚アルキル類を有する光孊掻性なァミ ドを補造する方法P C ΀囜 際公開 W0 9 2 / 0 5 2 7 5号明现害 この方法は䜿甚する埮生物のァ ミ ド生成掻性がいずれも䜎く、 反応に甚いる二トリル柳床が玄 0 . 2〜0 . 8 %ず䜎い点で工業的に䞍利である。
(6)ラセミ䜓の 2 -ァリ䞀ルアルカンニトリル類にシナヌドモナス厲に厲 する埮生物を䜜甚させおな䜍に䜎玚アルキル基を有する光孊掻性なァミ ド、 䟋えば 2 -プニルプロピオンアミ ドを補造する方法 (特開平 5 - 2 5 2 9
9 0号公報 この方法は生成した光孊掻性アミ ドの光孊玔床が 3 0 %e. e. 皋床ず極めお䜎く、 光孊掻性アミ ドずしおの工業的䟡倀が䜎い。
䞊蚘の通り、 公知の光孊掻性な酞アミ ドの補造方法はいずれも皮々の欠 点を有しおいる。 そこで、 本発明者らは、 䞊蚘のような欠点のない光孊掻 性な酞アミ ドの補造方法に぀いお鋭意怜蚎を行った。 この際に、 本発明者 らは埮生物たたはその凊理物を甚いる方法の方が、 a)酞アミ ドの生成率 ず光孊玔床が高く、 b)酞アミ ドの分離ず粟補が容易であり、 c)高い基質 濃床で倉換できる、 などの点で有利であるず考え、 広く公知および新芏な 埮生物およびそれから埗られる酵玠に぀いお怜玢を行った。 即ち、 再利甚 が困難な副生成物カルボン酞の生成が少なく、 目的の酞アミ ドの分離お よび粟補が容易であり、 反応液䞭の高い基質濃床での倉換が可胜であり、 そしお埗られる酞アミ ドの生成率および光孊玔床が高い、 埮生物たたはそ の凊理物を甚いる酞ァミ ドの補造方法に぀いお鋭意怜蚎を行った。
その結果、 埌蚘䞀般匏 I )で瀺されるラセミ䜓たたは光孊玔床の䜎 L、二 トリル化合物を埌蚘䞀般匏Π )で瀺される光孊玔床の髙ぃ酞アミ ド化合物 に倉換する光孊遞択的な二トリルヒドラタヌれ掻性を有するが、 二卜リル を察応するカルボン酞に倉換する二トリラヌれ掻性ならびに生成した酞ァ ミ ドを察応するカルボン酞に倉換するアミダヌれ掻性が極めお匱く、 か぀ 生成した酞ァミ ドをラセミ化するラセマヌれ掻性も極めお匱い埮生物が存 圚しおいるこずを芋い出した。
たた、 これら埮生物は高い二トリル濃床であっおもそれを酞アミ ドに倉 換するこずができ、 か぀高い酞アミ ドの生成率および光孊玔床を䞎えるこ ずができる。
さらに、 これら埮生物は二トリル化合物の䞀方の光孊異性䜓のみを酞ァ ミ ドに倉換し、 他方の光孊異性䜓は倉換しないが、 この他方の光孊掻性な 二トリル化合物の回収および再ラセミ化は容易であり、 再び出発原料ずし お利甚できるので、 工業的に有利である。
このように、 これら埮生物を利甚するこずにより、 埌蚘䞀般匏I )で瀺 されるラセミ䜓たたは光孊玔床の䜎い二トリル化合物から埌蚘䞀般匏Π ) で瀺される光孊玔床の高い酞ァミ ド化合物を効率よく補造できるこずがわ かゥた '0
発明の開瀺
即ち、 本発明は、 䞀般匏I )
R
Figure imgf000006_0001
[匏䞭、 Rリた C ,〜C eアルキル基、 1〜3個のフナニル基で眮換された C ! C aアルキル基、 たたは C 3〜C eシクロアルキル基を衚し、 R 2は氎 玠たたはじ,〜。 アルキル基を衚す]
で瀺されるラセミ䜓たたは光孊玔床の䜎い二トリル化合物を、 䞀般匏 : R
Figure imgf000007_0001
[匏䞭、 *は䞍斉炭衆原子の䜍眮を瀺し、 R1および R2は前蚘ず同じ意味 を有する]
で瀺される光孊玔床の高い察応ァミ ド化合物に倉換する方法であっお、 適圓な反応媒䜓䞭で該ニトリル化合物 I )を、
コリネバクテリりム . ゚スピヌ A68 (FERM BP— 5215)、 ロ ドコッカス '゚スピヌ KPO-2028 (FERM BP— 5216), ロ ドコッカス ·゚スピヌ PP-25 (FERM BP— 5217)、 ロ ドコッカス ·゚スピヌ PP-121 (FERM BP— 5218)、 ロ ドコッカス 'マリス BP-479-9 (FERM BP— 5219)、 バチルス ' サブチリス PP-116-15 (FERM BP— 5220)、 ブレビバクテリりム · ゚スピヌ PP-133-7 (FERM BP- 52 21)、
からなる矀から Ÿばれる、 垓二トリル化合物I)の二トリル基を光孊遞択 的に氎和し埗る二卜リルヒドラタヌれ掻性を有する埮生物たたはその凊理 物ず接觊させ、 生成した光孊玔床の高いアミ ド化合物Π)を該反応媒䜓か ら回収するこずを特城ずする方法を提䟛するものである。
さらに、 本発明は、 䞊蚘方法を実斜する際に特に有甚な新芏埮生物であ るロドコッカス .マリス BP-479-9 (FERM BP— 5219)を 提䟛するものである。
発明を実斜するための最良の圢態
䞊圮䞀般匏 I)においお、 R た Ci Ceアルキル基、 1〜3個のプ ニル基で眮換された C! CSアルキル基、 たたは C3〜CEシクロアルキル 基を衚し、 R2は氎玫たたは 〜(^アルキル基を衚す。 R2が C C*ァ ルキル基である堎合、 該基はオルト、 メタあるいはパラ䜍のいずれに存圚 しおいおもよい。
C ,〜 C βアルキル基ずは、 炭玠原子数 1〜6個の盎鉞たたは分岐鎖のァ ルキル基を衚し、 䟋えば、 メチル、 ェチル、 η-プロピル、 む゜ブロピル、 η-ブチル、 t-ブチル基、 む゜ブチル、 n-ペンチル、 ネオペンチル、 η-ぞキ シル基などが挙げられる。 たた、 〜4アルキル基ずは、 炭衆原子数 1 〜 4個の盎銷たたは分岐鑌のアルキル基を衚す。
1〜 3個のフナニル基で S换された C,〜C 3アルキル基ずは、 1〜3個 のフナニル基で眮換されたメチル、 ェチル、 n-プロピルたたはむ゜プロピ ル基を衚し、 䟋えば、 ベンゞル、 ベンズヒ ドリノレ、 ト リチル、 フヱネチル、 フ iニルブ口ビル基などが挙げられる。
C3〜C8シクロアルキル基ずは、 炭玠原子数 3〜 8個のシクロアルキル 基、 即ち、 シクロブ口ピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロぞキ シル、 シクロぞブチルたたはシクロォクチル基を衚す。
本発明の方法に埓っお、 R2が氎玫である䞀般匏I)で瀺される二トリ ル化合物を倉換するのが奜たしい。
たた、 R1が (^〜じ4アルキル基、 1もしくは 2個のフヱニル基で眮換 されたメチルもしくはェチル基、 たたは CS〜C7シクロアルキル基であり、 R2が氎玠である䞊蚘䞀般匏I)で瀺される二トリル化合物を倉換するの が奜たしい。 ここで、 ^〜(4アルキル基は䞊蚘定矩の通りであり、 C5 〜C7シク口アルキル基ずはシクロペンチル、 シク口ぞキシルたたはシク 口ぞプチル基を衚す。
より奜たしくは、 R1が (^〜(4アルキル基、 ベンゞル基、 ベンズヒ ド リル基、 たたは C5〜C7シクロアルキル基であり、 R2が氎玠である䞊蚘 䞀般匏 I )で瀺される二トリル化合物を、 本発明の方法に埓っお察応する 酞アミ ドに倉換する。
さらに奜たしくは、 R 1が
Figure imgf000009_0001
アルキル基であり、 R 2が氎玠である 䞊蚘䞀般匏I )で瀺される二卜リル化合物を、 本発明の方法に埓っお察応 する酞ァミ ドに倉換する。
最も奜たしくは、 R 1がむ゜プロピルたたは t-ブチル基であり、 R 2が氎 玠である䞊蚘䞀般匏I )で瀺される二トリル化合物を、 本発明の方法に埓぀ お察応する酞アミ ドに倉換する。
特に、 R 1がむ゜プロピル基であり、 R 2が氎玠である䞊蚘䞀般匏I )で 瀺される二トリル化合物を、 本発明の方法に埓っお察応する酞アミ ドに倉 換するのが奜たしい。
本発明の方法における出発物質である䞊蚘䞀般匏I )で瀺される二トリ ル化合物は、 䟋えば、 ゞャヌナル ·ォブ ·アメリカン ·ケミカル · ゜サむ ゚ティ䞀J. Am. Chen. So 、 79卷、 3467〜3469頁 (1957幎特開昭 5 1 - 7 0 7 4 4号公報特開昭 5 1 - 1 2 2 0 3 6号公報 シンセシスSynthe sis). 8卷、 645頁 1986幎などに蚘茉されおいる公知の方法に埓っお補 造するこずができる。 たた、 垂販品から入手可胜な出発物質は賌入しお䜿 甚しおもよい。
本発明の方法においおはラセミ䜓の二トリル化合物を䜿甚するのが普通 であるが、 䟋えば光孊分割凊理を行った埌のS )-䜓たたはR)-䜓の䞀方 に富む光孊玔床の䜎い混合物を䜿甚するこずもできる。
本発明の方法により補造される光孊玔床の高い䞊蚘䞀般匏Π )で瀺され る酞アミ ドは、 医薬物質を補造するための䞭間䜓ずしお、 たたは光孊分割 剀ずしお重芁な光孊玔床の高いァミンを補造するための䞭間䜓ずしお有甚 である。 これら酞アミ ドΠ )の代衚䟋は、 䟋えば、 以䞋に挙げるアミ ドの (R)-䜓もしくはS)-䜓、 たたは + )-䜓もしくは䞀 -䜓である 
2-プニルブロビオンアミ ド、
2-フ ニルブチルァミ ド、
2-フ Lニルバレルアミ ド、
2-プ二ルぞキサンアミ ド、
2-フヱニルぞブタンアミ ド、
2-フナニルオクタンアミ ド、
2 -フ ニル -3-メチルブチルアミ ド、
2-プニル -3, 3-ゞメチルブチルアミ ド、
2.3-ゞフナ二ルブロピオンァミ ド、
2, 3, 3-トリプニルブロピオンアミ ド
2, 4-ゞフナニルブチルァミ ド、
2-シクロペンチル -2-プニルァセトアミ ド、
2-シクロぞキシル -2-プニルァセトアミ ド、 たたは
2-シクロぞプチル -2-フナニルァセトアミ ド。
本発明は、 埮生物たたはその凊理物を利甚するこずにより、 光孊䞍掻性 な二トリルを察応する光孊掻性な酞ァミ ドに倉換する方法に関するもので あり、 このような方法においおは次の点が重芁である。
(1)反応液䞭の基質 (二トリル)濃床が高くおも倉換が可胜であるこず 
(2)埗られる酞アミ ドの生成率が高いこず
(3)埗られる酞ァミ ドの光孊玔床が高いこず埮生物の基質遞択性が高く、 酞アミ ドをラセミ化するラセマヌれ掻性が極めお䜎いこずおよび
(4)䞍甚な副生成物カルボン酞の生成が少ないこず埮生物が二トリル を光孊 «択的に氎和し埗る二トリルヒドラタヌれ掻性を持぀が、 二 トリルを酞に倉換する二トリラヌれ掻性および酞ァミ ドを酞に倉换 するァミダヌれ掻性が極めお䜎いこず。
本発明者らは、 これらの基準を満たす埮生物を広く公知および新芏な埮 生物に求めた。 その結果、 以䞋に挙げる 7皮類の菌株が䞊蚘基準を満たす こずを芋い出した
' コリネバクテリゥ厶 .゚スビヌ A68 (FERM BP— 5215)、 ' ロ ドコッカス ·゚スピヌ KPO-2028 (FERM BP— 521
6)、
' ロ ドコッカス '゚スピヌ PP-25 (FERM BP— 5217)、 ' ロ ドコッカス .゚スピヌ PP-121 (FERM BP— 5218)、 ' ロ ドコッカス . マリス BP-479-9 (FERM BP— 5219)、 'バチルス ' サブチリス PP-116-15(FERM BP— 5220)、 および
' ブレビバクテリゥム .゚スピヌ PP-133-7 (FERM BP— 5 即ち、 本発明の方法においおは、 これら菌株のいずれかたたはその凊理物 を甚いお二 トリルを酞ァミ ドに倉換する。
本発明の方法を実斜する際には、 䞊蚘埮生物の䞭に奜たしい矀が存圚す る。 即ち、 以䞋の菌株
' ロ ドコッカス '゚スピヌ KP 0-2028 (FERM BP-521 6)、
' ロ ドコッカス ·゚スピヌ PP-25 (FERM BP— 5217)、 • πドコッカス ·゚スピヌ PP-121 (FERM BP— 5218)、 ' ロ ドコッカス * マリス BP-479-9 (FERM BP— 5219)、 •バチルス 'サブチリス PP-116-15(FERM BP— 5220)、 たたは ' ブレビバクテリゥム '゚スピヌ PP-133-7 (FERM BP— 5 221)、
たたはその凊理物を本発明の方法においお甚いるのが奜たしい。
より奜たしくは、 以䞋の菌株
' ロドコッカス 'マリス BP-479-9 (FERM BP— 5219)、 'バチルス 'サブチリス PP-116-15(FERM BP— 5220)、 たたは
•ブレビバクテリゥム '゚スピヌ PP-133-7 (FERM BP— 5 221)、
たたはその凊理物を本発明の方法においお甚いる。
さらに奜たしくは、 以䞋の菌株
' 口 ドコッカス .マリス BP-479— 9 (FERM BP— 5219)、 たたは
•ブレビパクテリゥ厶 .゚スピヌ PP-133-7 (FERM BP— 5 221)、
たたはその凊理物を本発明の方法においお甚いる。
最も奜たしくは、 ロドコッカス 'マリス BP-479-9 (FERM B P— 5219)たたはその凊理物を本発明の方法においお甚いる。
䞊蚘の性質を保持しおいるならば、 これら菌株を N-メチル -Ν'-ニトロ ニトロ゜グァニゞンN T G)などの公知の倉異剀により凊理するこず によ぀お埗た倉異株や Ÿ䌝子工孊的手法により改倉した菌株を、 本発明の 方法においお䜿甚するこずもできる。
䞊蚘埮生物のうち、 コリネパクテリゥム '゚スピヌ Α68 (FERM BP-5215)は特開平 3-19695号公報に蚘茉された公知の菌株で あるその菌孊的性 Kに぀いおは同公報を参照。 この菌株は、 1988幎 8月 22曰に工業技術院生呜工孊工業技術研究所に原寄蚗され、 1995 幎 9月 1曰に囜際寄蚗に移管され、 衚蚘の受蚗番号を付䞎されおいる。 䞀方、 ロ ドコッカス .゚スピヌ KP0-2028(FERM BP- 52 16)、 ロ ドコッカス '゚スピヌ PP-25(FERM BP— 5217)、 ロ ドコッカス .゚スピヌ PP-121 (FERM BP— 5218)、 ロ ド コッカス ' マリス BP-479-9 (FERM BP— 5219)、 バチルス · サブチリス PP-116-15(FERM BP— 5220)、 およびブレビ バクテリり厶 '゚スピヌ P P-133-7(FERM BP— 5221)はい ずれも、 新たに土壌䞭より二トリル资化菌ずしお分離した新芏な菌株であ る。 これらの菌株はいずれも、 1993幎 11月 2日に工業技術院生呜ェ 孊工業技術研究所に原寄蚗され、 1995幎 9月 1曰に囜際寄蚗に移管さ れ、 それぞれ衚蚘の受蚗番号を付䞎されおいる。
以䞋に、 これら新芏な菌株の菌孊的性質を瀺す。
(a)ロ ドコッカス '゚スピヌ KPO-2028(FERM BP-5216) 现胞の圢 かん状
现胞の倚圢性の有無 有り
運動性の有無 無し
胞子の有無 無し
グラム染色 »性
肉汁寒倩平板培地に
おけるコロニヌの状態 生育良奜、ピンク、䞍透明、円圢、光沢、凞状、滑らか 力タラ䞀れ 陜性
ォキシダヌれ 陰性
OFテス ト
现胞壁ゞアミノ酞 m e s o-ゞァミ ノ ピメ リン酞 7/10355 その他  ミコヌル酞を含む
m  口 ドコッカス
(b)ロ ドコッカス '゚スピヌ PP-25 (FERM BP— 5217) 现胞の圢 かん状
现胞の倚圢性の有無 有り
運動性の有無 無し
胞子の有無 無し
グラム染色 陜性
肉汁寒倩平板培地に
おけるコロニヌの状態 生育良奜、ピンク、䞍透明、円圢、光沢、凞状、滑らか カタラヌれ 腞性
ォキシダヌれ 陰性
OFテスト
现胞壁ゞァミノ酞 me s 0-ゞァミノビメリン酞
その他 ミコヌル酞を含む
口 ドコッカス
(c)ロ ドコッカス ·゚スピヌ PP-121 (FERM BP— 5218) 现胞の圢 かん状
现胞の倚圢性の有無 有り
運動性の有無 無し
胞子の有無 無し
グラム染色 膿性
肉汁寒倩平板培地に おけるコロニヌの状態生育良奜、オフホワむ ト、半透明、円圢、䜎い凞状、 滑らか
カタラヌれ 陜性
ォキシダヌれ 陰性
OFテスト
现胞壁ゞァミノ酞 me s 0-ゞァミノピメ リン酞
その他 ミコヌル酞を含む
厲 Dドコッカス
(d)ロ ドコッカス 'マリス BP-479-9 (FERM BP— 5219) 现胞の圢 かん状
现胞の倚圢成の有無 有り
運動性の有無 無し
胞子の有無 無し
グラム染色 陜性
肉汁寒倩平板培地に
おけるコロニヌの状態生育良奜、オフホワむ ト、䞍透明、円圢、滑らか、 凞状、光沢
カタラヌれ 賜性
ォキシダヌれ 陰性
OFテスト
现胞壁ゞアミノ酞 me s o—ゞアミノビメリン酞
その他の生理孊的性質
碓酞塩の還元 陜性
ビラゞンァミダヌれ 隱 システィンァリルァミダヌれ 陰性 バリンァリルァミダヌれ 腿性 ピロリ ドニルァリルァミダヌれ 陰性 アル力リフォスファタヌれ 隱 S—グルクロニダヌれ 陰性
0—ガラク トシダヌれ 陰性 な䞀グルコシダヌれ 隅性
N—ァセチルグルコサミダヌれ 陰性 ゥレアヌれ 陰性 れラチン分解 陰性 itrlUi CC 险# アデニン分解 陜性 チロシン分解 陰性
5 % N a C 1存圚䞋での生育 生育する リボヌスからの酞生成  »性 各単䞀炭玠源での生育
むノシトヌル
マルトヌス
マンニトヌル
ラムノヌス
゜ルビトヌル
m—ヒ ドロキン安息銙酞 + アゞピン酞ナトリりム
クェン酞ナトリりム
グルタミ ン酞ナトリりム + Lヌチロシン
グリセロヌル
トレハロヌス
ァセトアミ ド
D—ガラク トヌス
çš® ·厲 ロ ドコッカス 'マリス
(e)バチルス 'サブチリス PP-116-15(FERM B P-5220 现胞の圢 、ん状
现胞の倚圢性の有無 無し
運助性の有無 有り
胞子の有無 有り
グラム染色 隔性
肉汁寒倩平板培地に
おけるコロニヌの状態 生育良奜、䞍透明、若干䞍芏則、衚面に若干くが み、光沢
カタラヌれ »性
ォキシダヌれ ϋ性
OFテスト F
胞子䜍 S タヌミナルたたはサブタヌミナル
胞子の圢状 ゚リプティカルたたはシリンドリカル
现胞内小球䜓
嫌気培逊 +
7%NaCl含有培地での生育 +
グルコヌスからの酞生成 + VPテスト +
カれむン分解 +
れラチン分解 +
デンプン加氎分解 +
硝酞通元
ゥレアヌれ +
ヌガラク トシダヌれ +
クェン酞の利甚 厲皮 バチルス ·サブチリス
(f)ブレビパクテリゥ厶 ·゚スピヌ PP-133-7 (FERM BP—
5221)
现胞の圢 かん状
现胞の倚圢性の有無 有り
運動性の有無 無し
胞子の有無 無し
グラム染色 腞性
肉汁寒倩平板培地に
おけるコロニヌの状態生育良奜、オフホワむ ト、半透明、円圢、䜎い凞状、 光沢、滑らか
77タラヌセ 暘性
ォキシダヌれ 陰性
OFテスト
现胞胰ゞアミノ酞 me s 0—ゞアミノビメリン酞
属 ブレビパクテリゥ厶 䞊蚘の 6菌株の同定に際しおは、 バヌゞ゚むズ ·マニュアル .ォブ · シ ステマティック ·パクテリォロゞ䞀BERGEY' S MANUAL of Systematic Bac teriology) 第 2卷 1986)およびザ ·プロ力リオ䞀トThe Prokaryotes), 第 2版 1992)に埓っお分類した。 たた、 特に断りのない限り、 本明现曞 䞭に蚘茉した他の菌株の同定に぀いおも䞊蚘によった。
本発明を実斜する際には、 先ず、 本発明の方法においお䜿甚する埮生物 を培逊する。 埮生物の培逊は、 公知の方法に準じお行うこずができる。 䜿 甚する培地は、 通垞の埮生物のための通垞の栄逊源、 即ち炭玢源、 窒玠源、 無機栄逊源などを含む培地であっおよい。 炭玠源ずしおは、 グルコヌス、 グリセリン、 ゚タノヌル、 シナヌクロヌス、 グルタミン酞、 酢酞、 クェン 酞、 フマル酞などを䜿甚するこずができる。 窒玠源ずしおは、 硫酞アンモ 二ゥム、 塩化アンモニゥム、 アンモニア、 尿玠などの無機窒玠源、 あるい は、 糠母゚キス、 麊芜゚キス、 ペプトン、 肉゚キスなどの有機窒玠源を䜿 甚するこずができる。 無機栄逊源ずしおは、 リン酞、 マグネシりム、 カリ ゥ厶、 鉄、 コバルト、 マンガン、 ランタンなどを䜿甚するこずができる。 これらの栄逊源を適宜組み合わせお䜿甚しおよい。 たた、 埮生物の反応掻 性を䞊昇させる物質ずしお、 ァセトニトリル、 む゜プチロニトリルなどの シァノ化合物、 カブロラクタ厶などのアミ ド化合物を添加しおもよい。 培 地の pHは 5〜1 0の範囲内、 奜たしくは 6〜8の範囲内であっおよい。 培逊枩床は 1 8〜5 0 °C、 奜たしくは 2 5〜4 0 °Cである。 培逊時間は培 逊条件に䟝存しお倉化するが、 通垞は 1〜4日間であり、 掻性が最倧にな るたで培逊すればよい。
䞊蚘の埮生物の凊理物ずは、 ラセミ䜓たたは光孊玔床の䜎い二トリル化 合物I )の二トリル基を光孊遞択的に氎和し埗る二トリルヒドラタヌれ掻 性を有しおいれば、 劂䜕なる圢態であっおもよいこずを意味する。 該酵玠 掻性が䞻ずしお菌䜓内に存圚するか、 たたは菌䜓倖に存圚するかによりそ の圢態は異なる。 該酵玠掻性が菌䜓内に存圚する堎合には、 䞊蚘埮生物を 培逊した培逊物、 そこから集めた菌䜓、 菌䜓凊理物䟋えば、 該菌䜓の砎 砕物、 これらの菌䜓から分離 ·抜出した皮々の粟補段階の酵玠掻性䜓、 公知の適圓な方法により担䜓に固定化した該菌䜓たたは該菌䜓凊理物など を指す。 該掻性が菌䜓倖に存圚する埞合には、 䞊蚘埮生物を培逊した培逊 物、 培逊 Ÿ液、 培逊 Ÿ液から分離 ·抜出した酵衆掻性䜓、 公知の適圓な方 法により担䜓に固定化した該酵玠掻性䜓などを指す。
本発明の方法においお酵玠掻性䜓を䜿甚する堎合には、 䞊蚘埮生物から 公知の酵玠粟補手段を甚いお該酵玠掻性䜓を単離 ·粟補するこずができる。 䟋えば、 該酵玠が菌䜓内酵玠である堎合には、 埮生物培逊物の遠心分離な どによっお菌䜓を集め、 この菌䜓を超音波凊理、 ダむノ ミルなどの機械的 手段によっお砎砕する。 次いで、 现胞片などの固圢物を遠心分離などによ぀ お陀くこずにより粗酵玠液を埗、 さらに、 この粗酵玠液を超 Ÿ心分離分画、 塩析、 有機溶媒沈殿、 吞着クロマトグラフィヌ、 むオン亀換クロマトグラ フィ䞀、 ゲル «過クロマトグラフィヌ、 逆盞クロマトグラフィヌなどによ り粟補する。 酵玠粟補䞭の酵玠の倱掻を防ぐための安定剀ずしお、 䞀般に 䜿甚される安定剀たたは 1〜1 0 O mM皋床のィ゜ブチルァミ ドを添加し おもよい。
本発明の方法に埓っお目的の光孊玔床の高い酞ァミ ドΠ )を補造するた めには、 通垞、 䞊蚘のようにしお埗た埮生物たたはその凊理物を、 適圓な 反応媒䜓䞭、 適圓な条件䞋でラセミ䜓たたは光孊玔床の䜎い二トリル I ) ず接觊させればよい。
適圓な反応媒䜓ずしおは、 氎、 緩衝液たたは培髮液などの氎性媒䜓、 æ°Ž 性媒䜓ずメタノヌル、 ゞメチルスルホキシドたたはァセトンなどの氎溶性 有機溶媒ずの混合媒䜓、 さらには氎性媒䜓ずぞキサン、 酢酞ェチル、 ゞェ チル゚ヌテルたたはトル゚ンなどの氎䞍溶性有機溶媒ずからなる二盞系媒 䜓 (氎で飜和した氎䞍溶性溶媒を含むを䜿甚するこずができる。 たた、 反 応媒䜓に適圓な界面掻性剀を 0. 0 1〜2 %皋床添加しおもよい。
ラセミ䜓たたは光孊玔床の䜎い二トリル I )は、 粉末もしくは液状のた たで、 たたは適圓な溶媒に溶かしお反応媒䜓に添加しおよい。 反応液䞭の 二トリルI )の添加濃床は、 箄 0 . 0 1〜7 0重量 、 奜たしくは玄 1 , 0 〜5 0重量 である。 二トリル I )は反応媒䜓䞭に完党に溶解しおいなく おもよい。
䞊蚘反応においお䜿甚する埮生物たたはその凊理物の濃床は、 二トリル ヒ ドラタヌれ掻性の皋床により異なる。 埮生物菌䜓を䜿甚する堎合には、 通垞、 該菌䜓の反応液䞭での濃床は 0. 0 5〜2 0重量の範囲内であ぀ およい。 埮生物の凊理物を䜿甚する堎合には、 埮生物菌䜓を䜿甚する堎合 ず同等の掻性が埗られる量で該凊理物を添加する。
反応枩床は、 箄 5〜6 0 ° (、 奜たしくは玄 1 5〜5 0 °Cであっおよい。 反応 pHは、 箄 4〜1 1、 奜たしくは玄 7〜1 0であっおよい。 反応時間 は反応条件に䟝存しお倉化するが、 通垞は 1 0〜1 0 0時間の範囲内であ る。 反応経過を高速液䜓クロマトグラフィヌH P L C )などによ぀お远跡 し、 生成する光孊掻性な酞アミ ドΠ )の光孊玔床が所望の光孊玔床より高 いずきに、 望たしくは 8 0 %e. e.以䞊、 特に望たしくは 9 0 %e. e.以䞊の ずきに反応を終了するのがよい。 反応䞭、 二トリル I )濃床が䞊蚘の範囲 内に維持されるように、 新たな二トリルI )を反応液に添加しおもよい。 䞊蚘の反応により埗られた光孊掻性な酞アミ ドΠ )は、 反応液から皮々 の方法によっお単離するこずができる。 䟋えば、 ぞキサンたたは祚酞ェチ ルなどの溶媒で抜出分離する方法、 シリカゲルカラムのクロマトグラフィ 䞀によ぀お分離する方法を甚いるこずができる。 たた、 生成した光孊掻性 な酞ァミ ドΠ )の反応媒䜓䞭の溶解床が䜎い堎合には反応䞭に結晶が析出 するので、 これを Ÿ心分離などによっお回収するこずができる。
たた、 䞊蚘反応で生成した光孊掻性な酞アミ ドΠ )が所望の光孊玔床に 連しない堎合、 優先晶出させる操䜜によっお光孊玔床を高めるこずができ る。
本発明の方法は、 本方法に甚いる埮生物の酵玠二トリルヒ ドラタヌれが ラセミ䜓の二トリル I )の䞀方の異性䜓のみに遞択的に䜜甚しお光孊掻性 な酞アミ ドΠ )を生成させるこずに基づいおいる。 たた、 これら埮生物の 二トリルを酞に倉換する二トリラヌれ掻性ならびに酞ァミ ドを酞に倉換す るァミダヌれ掻性が極めお䜎いため、 酞が生成するこずなく光孊掻性な酞 アミ ドΠ )が埗られる。 さらに、 光孊掻性な酞アミ ドΠ )をラセミ䜓に倉 换するラセマヌれ掻性も極めお䜎いため、 光孊玔床が䜎䞋するこずなく酞 アミ ドΠ )を回収するこずができる。
本発明の方法により光孊掻性な酞アミ ドΠ )を補造するず、 未倉換の光 孊掻性な二トリル化合物が残存する。 これは、 抜出、 遠心分離、 カラム分 離などの簡䟿な搡䜜で回収するこずができる。 この回収した光孊掻性な二 トリル化合物自䜓も、 医薬品や光孊分割剀ずしお有甚な光孊掻性ァミンゃ 光孊掻性カルボン酞に倉換しお䜿甚するこずができる。 たた、 回収した光 孊掻性な二トリル化合物は、 䟋えば、 メタノヌルなどの溶媒䞭でアンモニ ァや氎酞化ナトリりムなどにより凊理するこずによっお容易にラセミ化す るこずができる。 このラセミ䜓の二トリル化合物 I )を本発明の方法にお いお再利甚するこずができる。 埓っお、 光孊掻性な酞アミ ドΠ )のみの補 造を目的ずするならば、 高収率で目的の光孊掻性な酞アミ ドΠ )を補造す るこずができる。
次に、 以䞋の反応匏 1を参照しお、 光孊掻性な酞アミ ドπ )を光孊掻性 なァミンm)に立䜓保持しながら倉換する方法の䟋に぀いお説明する。
反応匏 1
2NH
Figure imgf000023_0001
(IV)
[匏䞭、 *は䞍斉炭玠原子の䜍 Sを瀺し、 R 1および R 2は前蚘ず同じ意味 を有する] 第 1の䟋は、 光孊掻性な酞アミ ドD )を酞性条件䞋、 氎玠化ホり玫ナト リりムで立䜓保持還元するこずにより、 目的の光孊掻性なアミンIII)を埗 る方法である。
この a元反応は䞍掻性溶媒䞭で行われる。 䞍掻性溶媒ずしおは、 ゞメチ ルスルホキシドDM S 0)、 ゞグリム、 ゚チレングリコヌルゞメチル゚ヌ テル、 テトラヒドロフランT H F)、 たたは 1 , 4䞀ゞォキサンなどの非 プロトン性溶媒が奜たしい。
この «元反応においお䜿甚される酞ずしおは、 䟋えば、 臭化氎玠酞、 å¡© 酞、 硫酞、 硝酞などの無機酞、 舎酞、 P-トル゚ンスルホン酞、 メタンスル ホン酞などの有機酞、 たたはトリフルォロホり玫゚ヌテル錯䜓、 塩化アル ミ、 四塩化チタンなどのルむス酞が䞟げられる。 しかし、 高収率が埗られ、 か぀取扱いが容易な胙酞が奜たしい溶媒である。 酞の䜿甚:は、 光孊掻性 な酞アミ ドΠ )に察しお玄 1〜2 0モル圓量、 奜たしくは玄 3〜1 0モル 圓量である。
氎玠化ホり玠ナトリりムの䜿甚量は、 酞アミ ドΠ )に察しお玄 1〜2 0 モル圓 i、 奜たしくは玄 3〜1 0モル圓: である。
反応は、 通垞、 箄 2 0〜2 0 0 °Cの枩床で行う力、'、 副反応を制埡するた めに玄 5 0〜1 8 0 °Cの枩床で行うのが奜たしい。
この通元反応によっお埗られた光孊掻性なアミンm)は、 䟋えば、 次の ようにしお反応液から回収するこずができる。 即ち、 反応液を塩酞氎溶液 などで匷酞性にし、 この液をゞクロロメタンやクロ σホルムなどの氎ず混 和しない有機溶媒で掗浄する。 次いで、 氎局を匷アルカリ性にし、 ゞクロ ロメタンやクロ口ホルムなどの氎ず混和しない有機溶媒で抜出し、 抜出液 の溶媒を留去するこずにより光孊掻性なァミンm)を埗る。
第 2の䟋は、 光孊掻性な酞アミ ドΠ )を立䜓保持したたた脱氎し、 埗ら れた光孊掻性な二トリル (IV)を立䜓保持したたた氎玠添加するこずにより、 目的の光孊掻性なァミンm)を埗る方法である。
光孊掻性な酞アミ ドπ )の立䜓保持脱氎反応は、 䞍掻性溶媒䞭、 脱氎剀 で凊理するこずにより行われる。
䜿甚される脱氎剀ずしおは、 䟋えば、 塩化チォニル、 無氎舎酞、 五酞化 二リンなどの脱氎剀、 たたは硫酞、 P-トル゚ンスルホン酞などの共沞脱氎 反応剀が挙げられる。 しかし、 高収率が埗られ、 か぀ラセミ化を制埡でき る塩化チォニルが奜たしい脱氎剀である。 塩化チォニルの䜿甚量は、 光孊 掻性な酞アミ ドΠ )に察しお玄 1〜2 0圓量、 奜たしくは玄 1〜3圓量で ある。 この反応は玄 5 0〜1 5 0 °Cの枩床で行うこずができるが、 副反応 を制埡するため、 箄 7 0〜1 0 0おの枩床で行うのが奜たしい。 䞍掻性溶 媒ずしおは、 䟋えば酢酞ェチルやトル゚ンなどが挙げられる。
この脱氎反応により埗られる光孊掻性な二トリルIV)は、 反応液を匱ァ ルカリ氎溶液、 氎、 たたは食塩氎などで掗净した埌、 溶媒を留去するこず によ぀お反応液から回収するこずができる。
このようにしお埗られた光孊掻性な二トリル (IV)の立䜓保持氎玠添加は、 䞍掻性溶媒䞭、 通元觊媒の存圚䞋に氎玠添加するこずにより行われる。 通元觊媒ずしおは、 均䞀系觊媒あるいは䞍均䞀系觊媒を甚いるこずがお きる。 簡䟿か぀高収率で氎玫添加できる䞍均䞀系觊媒ずしお、 䟋えば、 ラ ネヌニッケルを甚いるのが奜たしい。 通元觊媒の䜿甚量は、 光孊掻性な二 トリルIV)に察しお玄 1〜5 0 % (wtZwt比、 奜たしくは玄 1 0〜3 0 % Ot/wt比である。 䞍掻性溶媒ずしおは、 䟋えば、 メタノヌル、 ゚タノヌ ル、 む゜プロパノヌルなどのアルコヌル系溶媒、 あるいはゞグリム、 テト ラヒ ドロフランT H F)、 1 , 4䞀ゞォキサンなどの゚ヌテル系溶媒が挙 げられる。 副反応およびラセミ化の制埡のためには、 ゚タノヌルあるいは ィ゜ブロバノヌルが奜たしい溶媒である。
氎玠添加は宀枩〜 1 2 0お、 奜たしくは宀枩〜 8 0 の枩床で行うのが 望たしい。 氎玠圧は 1〜1 0 0kgZcm2 'Gであっおよく、 奜たしくは 5〜 8 0 kgZcm2'Gである。 たた、 ゞアルキルァミンなどの副生成物の生成を 抑制するために、 反応液にアンモニア氎を添加するのが効果的である。 æ·» 加するアンモニアの量は、 光孊掻性な二トリル (IV)に察しお玄 0. 0 1〜 1 . 0モル圓量であっおよく、 ラセミ化抑制のためには玄 0. 1〜0. 5モ ル圓量であるのが奜たしい。
埗られた光孊掻性なアミンΠ )の反応液からの回収は、 䞊蚘ず同様にし お行うこずができる。 䞊蚘の通元反応で生成した光孊掻性なアミンm)が所望の光孊玔床に達 しない堎合には、 光孊掻性なアミンin)ず酞性物質ずの塩を優先的に晶出 させる方法、 あるいは光孊掻性カルボン酞ずのゞァステレオマヌ塩を圢成 させる方法を甚いるこずにより、 光孊玔床を向䞊させるこずができる。 本発明の方法を実斜する際の、 出発物質、 䞭間生成物および目的生成物 の光孊玔床は、 䟋えばキラルセル 0D— R、 キラルセル 0 J、 キラル AG P、 クラりンパックCBOfNPAK)CR (ダむセル化孊工業、 セラモスパヌ . キラルCeramosper Chiral)RU— 1 (资生堂、 スミキラル (SUMICHIBAL) 0 A (䜏友化孊分析センタヌ、 ォプチ-パックOpti-pak) T A [りォヌタヌ ズ (Waters)]などの光孊分割カラムを甚いた HP L C分析によっお枬定す るこずができる。
実斜䟋
次に、 実斜䟋を挙げお本発明を詳现に説明するが、 これら実斜䟋は本発 明の範囲を限定するものではない。
なお、 以䞋の実斜䟋における衚瀺は、 特蚘しない限り、 重量 Z容量 O /v)%を瀺す。 光孊掻性な酞アミ ドの生成率および光孊玔床は、 高速液䜓 クロマトグラフィヌHPLC)によっお枬定した。 生成率は、 反応に甚い た二トリルラセミ䜓の党䜓量に基づいお算出した埓っお、 最倧倀は 5 0%である。 たた、 光孊玔床はェナンチォマヌ過剰率によっお瀺した。
実斜䟋 1 (S)— 2_フヱニルヌ 3—メチルブチルアミ ドの補造
1%フマル酞ナ トリりム、 1%酵母゚キス、 0.2%リ ン酞 2カリりム、 0.1%塩化ナトリりム、 0.02%硫酞マグネシりム · 7氎塩、 0.00 3%硫酞第䞀鉄 · 7氎塩、 および 0.03%ε—力プロラクタムを含む液 䜓培地 (ρΗ6.3)10 Onlを滅菌した。 これに、 同䞀培地で予め培逊した ロ ドコッカス . マリス BP— 479— 9(FERM BP— 5219)の培 逊物を 2%(vZv)ずなるように怍菌し、 28おで 36時間、 振 »培逊した。 培逊終了埌、 培逊物を遠心分離しお菌䜓を集め、 この菌䜓を 0.01 Mリ ン酞锟銜液 (pH7.5)40mlに ®®した。 次いで、 油状の 2—フ: L二ルヌ 3—メチルプチロニ卜リノレ 20 gを加え、 35。Cで揎拌しながら 40時間 反応させた。 反応終了液の䞀郚を䞋蚘の H PLC分析条件にお分析したず ころ、 2—フ 二ルヌ 3—メチルブチルアミ ドの生成率は 34%、 S䜓の 光孊玔床は 92.0 %e. e.であった。 2—フヱニルヌ 3—メチル酪酞の生 成は認められなかった。
反応終了液に 6 Onlのぞキサンを加え、 30分間撹拌した埌、 Ÿ過した ずころS)— 2—プ二ルヌ 3—メチルブチルアミ ド 6.89gを含む固圢 物が埗られた光孊玔床 98.6 He. e.)0 尚、 «液䞭には、 12.5 gの R 䜓リツチの 2—フ 二ルヌ 3—メチルブチロニトリルず 0.66gのラセ ミ䜓の 2—プ二ルヌ 3—メチルブチルアミ ドS  R= 1  1)が含たれ おいた。
次いで、 䞊蚘の固圢物にメタノヌル 10mlを加えお溶解した埌、 掻性炭 0.7gを加え、 揎拌し、 Ÿ過した。 Ÿ過したメタノヌル溶液を枛圧濃瞮し た埌、 也燥しお衚題化合物の癜色結晶 6.33gを埗た。
I R(NaCl) 3400、 3180、 2970、 1960、 1890、 1805、 1760、 1650、 1600、 1450、 1405、 125 0、 700CID-1 
NMR(CDC13)(5 0.71 (d.3 H, J = 6.7 Hz). 1.08(d.3 H, J =6.7Hz), 2.2〜2.6(m, 1H)、 2.92 ( d.1 H, J = 10. 1 Hz), 5.56(b r, 2H)、 7.1-7.6 (m.5H)
MS(m/e) 178(M+1)+ ;
光孊玔床 98.6%e.e. (䞋蚘の分析条件による HPLC分析)。 1^? 分析条件ヌ1(定量
カラム ノバパック ·フナニルりォヌタヌズ
溶離液ァセトニトリノレ 5 OmMリン酞䞀力リりム
= 40 : 60 (pH3.5)
流速  0.6πι1Ζ分
怜出  UV260nm
保持時間 2.1分
HP LC分析条件䞀 2 (光孊玔床
カラムキラルセル OD— R (ダむセル化孊工業 0.46 X 25cm 溶離液ァセトニトリル 50 πιΜリン酞䞀力リりム
=40  60 (ρΗ3.5)
流速  1.5 ml/分
怜出  UV220nn
保持時間 S䜓 3.9分、 R䜓 5.0分 さらに、 䞋蚘衚 1に挙げた他の埌生物を、 䞊蚘ず同様の方法で、 2—フ 二ルヌ 3—メチルプチロニトリルに䜜甚させた。 HP LCで枬定した 2— フェ二ルヌ 3—メチルブチルァミ ドの生成率ず光孊玔床を衚 1に瀺す。
è¡š
æ ª 生成率 光孊玔床
(%) (%e. e. ) ロ ドコッカス '゚スピヌ KPO-2028 (FERM BP-5216) 18.9 82.4 ロ ドコッカス '゚スピヌ PP-25 CFER BP-5217) 17.5 81. 6 ロ ドコッカス '゚スピヌ PP-121 (FERM BP-5218) 30.5 91.6 ロ ドコッカス ·マリス BP- 479-9 CFERM BP-5219) 34 92. 0 ブレビパクテリゥム '゚スピヌ PP-133-7 (FERM BP-5221) 16. 8 90. 4 実斜䟋 2 S—+)— 2—フヱニルヌ 3.3—ゞメチルブチルアミ ドの 補造
0.5%グルコヌス、 0.5%フマル酞ナトリりム、 0.2%リン酞 2力 リりム、 0.1%塩化ナトリりム、 0.02%硫酞マグネシりム · 7氎塩、 0.003%硫酞第䞀铁 * 7氎塩、 0.03%e—力プロラクタム、 および 0.1%む゜プチロニトリルを含む液䜓培地 (pH 6.3)50mlを滅菌した。 これに、 同䞀培地で予め培逊した䞋蚘衚 2の各埮生物の培逊物を 2 % (v/ V)ずなるように怍菌し、 28°Cで 30時間、 振 Ÿ培逊した。 これら培逊物 を各々にŸ心分離しお各菌䜓を集め、 これらを 0.01Mリン酞緩衝液 (p H7.0)10 mlに 滞した。 これら各々に 2—フヱニルヌ 3.3—ゞメチ ルブチロニトリル 10 Onigを添加し、 28おで 10時間培逊した。 HPL Cで枬定した衚題化合物の生成率ず光孊玔床を衚 2に瀺す。
この衚から、 本発明の方法においお利甚する埮生物が他の埮生物よりも 優れおいるこずが明らかである。 è¡š 2
B æ ª 生成率 光孊玔床
(Ÿ) ― (iŸe. e. ) コリネバクテリゥム '゚スビヌ A68 (FE M BP-5215) 30.3 97.9 ロドコッカス ·マリス BP-479-9 (FERM BP-5219) 40.5 97.2 バチルス ·サブチリス PP-116-15 (FERM BP-5220) 20.1 93.2 ブレビバクテリりム ·゚スピヌ PP-133-7 CFERH BP-5221) 36.7 96.9 アル力リゲネス ·゚スピヌ HP-611 (FERM P-12633) * 8.9 95.2 ノカルディア ' グロべルラ ATCC 21505 1.9 90.9 ロドンナヌドモナス 'スプロむデス ATCC 11167 6.2 88.0 キャンディダ* トロビカリス ATCC 2031 2.3 85^_2
* アルカリゲネス '゚スピヌ HP-611(FE P-12633)の蘭孊的性質は、 特開平 5-192190号公報に蚘茉されおいる。 実斜䟋 3 (S)— 2—シクロぞキシルヌ 2—プニルァセトアミ ドの補 造
ロ ドコッカス *マリス BP— 479— 9株FERM BP— 5219) を実斜䟋 1ず同様の培逊条件で培逊した。 次いで、 遠心分離により菌䜓を 集め、 菌䜓を掗浄した埌、 蒞留氎 10mlに懞濁させた。 これに、 2—シク 口ぞキシルヌ 2—フヱ二ルァセトニトリル 10 Otngを加え、 30でで 24 時間反応させた。 HPLCによっお分析したずころ、 S)— 2—シクロぞ キシルヌ 2—フヱニルァセトアミ ドが生成率 18%で生成し、 S䜓の光孊 玔床は 8 l%e.e.であるこずがわかった。 尚、 2—シクロぞキシルヌ 2— プニル酢酞は生成しなかった。
定量および光孊玔床は、 それぞれ次の H PLC条件で行った。 1? 0分析条件ヌ1(定量
カラム  ノバパック 'プニル りォヌタヌズ
溶離液 13mMリン酞 2氎玠アンモニゥム ァセトニトリル
=62 : 38
流速  1. Onl/分
怜出  UV260nm
保持時間 2.2分
HPLC分析条件䞀 2 (光孊玔床
カラム  キラルセル OD— R (ダむセル化孊ェ集 0.46 X 25 cm 溶離液氎 ァセトニトリル =30  70
流速  0 5πι1Ζ分
怜出  UV260nni
保持時間 S䜓 9.5分、 R䜓 12.0分
実斜䟋 4 (S)— 2, 3.3—トリフ ニルブロピオンアミ ドの補造
1.5%゚タノヌル、 1%酵母゚キス、 0.2%リン酞 2カリりム、 0. 1%塩化ナトリりム、 0.02%硫酞マグネシりム · 7氎塩、 0.003% 硫酞第 1鉄 · 7氎塩、 および 0.2%ァセトニトリルを含む液䜓培地 (pH 6.3)1 Lを滅菌した。 これに、 同䞀培地で予め培逊したブレビパクテリ ゥム '゚スピヌ PP— 133— 7株FERM B P— 5221 )を 2 %(v Zv)ずなるように怍菌し、 28おで 45時間培逊した。 培逊終了埌、 菌䜓 を遠心分離によっお集め、 この菌䜓を 0.05Mリン酞緩衝液 (pH 7.5) 90mlずゞメチルスルホキシドDMSO)l 0mlの混合液に懞濁した。 次 いで、 2, 3, 3—トリプニルプロピオ二トリル 0. lgを加え、 30おで 48時間反応させた。 反応終了埌、 反応液を䞋蚘の条件䞋で H PL C分析 したずころ、 衚題化合物が生成率 11 %で生成し、 光孊玔床は 82 %e. e. であるこずがわかった。
HPLC分析条件— 1(定量
カラム  ノバパック ·フヱニル りォヌタヌズ
溶離液 13nMリン酞 2氎玠アンモニゥム  ァセトニトリル
= 62 : 38
流速  1. Oml/分
怜出  UV260nm
保持時間 3.5分
HP LC分析条件䞀 2 (光孊玔床
カラム  キラルセル OD— R (ダむセル化孊工業 0.46 X 25cm 溶雕液氎 ァセトニトリル- 40  60
流速  0.5ml/分
怜出  UV260tm
保持時間 S䜓 13.4分、 R䜓 15.0分
参考䟋 1 (R)— 2—プ二ルヌ 3—メチルプチロニトリルの回収およ びラセミィ匕
実斜䟋 1で埗た R䜓リツチな 2—フヱ二ルヌ 3—メチルプチロニトリル ずラセミ䜓の 2—フナ二ルヌ 3—メチルプチルァミ ドを含むぞキサン溶液 からぞキサンを枛圧䞋に留去し、 油状物質を埗た。 この油状物質 10g(R 䜓リツチな 2—プ二ルヌ 3—メチルプチロニ卜リスレ 9.5g、 およびラセ ミ䜓の 2—フヱニルヌ 3—メチルブチルアミ ド 0.5 gを含有に塩化チォ ニル 3.3gを添加し、 85おで 1.5時間通流した。 この反応液を 20nl の氎で 2回掗浄し、 分液しお R䜓リツチな 2—プ二ルヌ 3—メチルプチ ロニトリル 9.7g(R S = 77  23)を埗た。 尚、 2—フヱニルヌ 3— メチルブチルアミ ドはもはや怜出されなかった。 次いで、 R䜓リツチな 2—フナ二ルヌ 3—メチルブチロニトリノレ 9.7g にメタノヌル 2.5mlず 6 N氎酞化ナトリりム氎溶液 0.4 mlを加え、 25 °Cで 1時間攬拌した。 次いで、 この反応液を 6 N塩酞で pH 7に調敎した 埌、 枛圧濃瞮しお、 ラセミ䜓の 2—フナ二ルヌ 3—メチルブチロニトリル (R S =l : 1)を 9.2g埗た。
尚、 2—フ L二ルヌ 3—メチルプチロニトリルの光孊玔床は、 以䞋に瀺 す H PLC条件にお枬定した。
カラム ォプチ-パック TA (りォヌタヌズ
溶離液 ィ゜プロパノヌルノぞキサン =2.5/97.5
流速 1. OinlZ分
怜出 UV254 no
保持時間 R䜓 7.7分、 S䜓 8.6分
参考䟋 2 ロドコッカス ' マリス BP— 479— 9株が産生するニト リルヒドラタヌれの粟補
ロ ドコッカス . マリス BP-479— 9株FERM BP— 5219) を実斜䟋 1ず同様にしお 2 Lの液䜓培地で培逊し、 次いで培逊物を遠心分 離するこずにより菌䜓 26gを集めた。 これを、 40mMむ゜ブチルアミ ド を含む 30 mMリン酞カリりム緩衝液 (PH 7.3)で掗浄した埌、 同緩衝液 60mlに懞濁した。 次いで、 9 KHzでの超音波凊理を氷冷䞋.に玄 10分 間行い、 菌䜓を砎砕した。 この菌䜓砎砕液を 1800 Orpmで 20分間遠 心分離しお现胞残骞を陀去し、 现胞抜出液を埗た。 該抜出液の二ト リルヒ ドラタヌれの比掻性は、 0.126U/mgであった。
該抜出液を䞊蚘ず同䞀の緩衝液 2 Lにお透析し、 埗られた透析内液を D EAE—セルロヌスのカラムに入れ、 0〜0.5M城化ナトリゥムを含む 5 OmMリン酞カリりム緩衢液pH 7.0 )の盎線的'濃床募配液により溶離 した。 酵玠掻性を含む分画を集め、 15%硫酞アンモニゥムを添加した埌、 プ二ルセファロヌス CL侀 4 Bのカラムに入れ、 4 OmMむ゜ブチルァ ミ ドを含む 5 OmMリン酞カリりム接衝液 (pH 7.3)で溶離した。 酵玠掻 性を含む分画を集め、 60%硫酞アンモニゥム飜和により城析した。 埗ら れた沈 »物を少量の 5 OmMリン酞カリりム緩衝液pH 7.3)に溶解し、 同锟衝液で透析しお粟補鰺玠を埗た。
2—フヱニルヌ 3—メチルプチロニトリルを基質ずしたずきの、 本酵Ÿ の二トリルヒドラタヌれずしおの比掻性は、 0.738UZmgであり、 生 成したS)— 2—フ 二ルヌ 3—メチルブチルアミ ドの光孊玔床は、 生成 率 40%のずきに 94%e.e.であった。
該粟補酵玠の性賓および酵衆掻性の枬定法は次の通りである。
(1)粟補酵玠の性質
(a)䜜甚
二卜リル化合物 1分子を氎和し、 酞アミ ド化合物 1分子を生成する反応 を觊媒する。 ラセミ䜓の 2—フヱニルヌ 3—メチルプチロニトリルに察し おは、 そのS)-䜓に䜜甚する速床がR)-䜓に察するよりも著しく速く、 桔果的に光孊掻性なS)— 2—フナ二ルヌ 3メチルブチルァミ ドを生成す る。
(b)サブュニッ トの分子量
SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により、 分子量 24000お よび 25100の 2぀のサブュニッ 卜が怜出された。
(2)酵玠掻性の枬定法
10 OmMリン酞カリりム緩衝液 (pH 8.0)0.9ml、 200 mM 2—フ 二ルヌ 3—メチルプチロニトリルのメタノヌル溶液 0.05 mlおよび適圓 量の酵衆液を加え、 linlになるように湖敎し、 30おで 30分間反応させ る。 次いで、 メタノヌル lmlを添加しお反応を停止させ、 生成した 2—プ 二ルヌ 3—メチルブチルァミ ドの量ず光孊玔床を H P L Cにお枬定する。 分析条件は、 䞊蚘の実斜䟋 1に蚘茉した通りである。
以䞊のように、 本酵玠は二トリル化合物を酞アミ ド化合物に倉換する二 トリノレヒドラタヌれであり、 2—フヱ二ルヌ 3—メチルプチロニトリルお よびその類䌌 *造を有する二トリル化合物を光孊遞択的に氎和するずいう 優れた効果を有する酵玠である。
参考䟋 3 (S)— 2—フナ二ルヌ 3—メチルブチルアミンの合成 光孊玔床 98.6 %e. e.のS)— 2—フナ二ルヌ 3—メチルブチルアミ ド 2.0 Og(l 1.28mモルを氎玫化ホり玠ナトリりム 2.13g(56.4 2nモルのゞグリム溶液 57mlに加え、 これに舎酞 3.39g(56.42m モルのゞグリム溶液 28 mlを 15分間で滎䞋し、 還流䞋に 3.5時間授拌 した。 反応終了埌、 反応液に濃塩酞を加えお pHlずし、 残枣を濟別した 埌、 クロ口ホルム 2 Omlを加えお抜出した。 次いで、 氎履を 4N NaOH 氎溶液で pH13ずし、 クロ口ホルム 20mlを加えお抜出した。 有機局を 枛圧濃瞮し、 無色透明の油䌏物ずしおS)— 2—フ Xニル 3—メチルプチ ルァミン 1.29g (収率 70.0%)を埗た。
I R(NaCl) : 3370, 2956、 2871、 1945、 1871、 1804、 1750、 1601、 1492、 1452、 702d"1 
NMR(CDCl3)d> : 0.72(d, 3H. J-6.7 Hz). 0.98(d.3 H. J=6.7Hz)、 1.07(b r.1 H). 1.85 ( d q , 1 H. J = 4.6. J-6.7Hz)、 2.32(d t, 1H, J=4.6 Hz, J = 8.4 Hz), 2.8 〜3.2(m, 2H)、 7.1〜7.4(m.5H) ;
MS(mZe) 164(M+ 1)+
光孊玔床 98.6 %e. e. (䞋蚘の分析条件による H PLC分析)。 HP LC分析条件
カラム  クラりンパック CR(+) (ダむセル化孊工業 0.4x 15cm 溶雕液  0. IN HC10< メタノヌル- 85 15
流速  0. ΎαιΙΖ分
怜出  UV210nm
保持時間 S䜓 61.8分、 R䜓 80.8分
参考䟋 4 (S)— 2—フナ二ルヌ 3—メチルプチロニトリルの合成 酢酞ェチル 4 mlに光孊玔床 98.6%e.e.のS)— 2—フ 二ルヌ 3— メチルプチルァミ ド 2.00g(l 1.28Bモルおよび塩化チォニル 1.7 5g(l 4.66πモルを加え、 通流䞋に 2時間撹拌した。 反応終了埌、 反 応液を氎 8 mlで掗浄した。 次いで、 æ°Ž 8 mlを加え、 さらに 4N NaOHæ°Ž 溶液を加えお pH 7に調敎しお掗浄し、 さらに 5 %NaC 1氎溶液にお掗浄 した。 このように掗浄した有機局を枛圧濃瞮し、 淡黄色透明油状物ずしお (S)— 2—プ二ルヌ 3—メチルプチロニトリノレ 1.78g (収率 99.0%) を埗た。
IR(NaCl) : 2966、 2237、 1954、 1879、 1809、 1734、 1601、 1491、 1456、 700 】 
NMR(CDC13)(5 1.03(d.3H. J = 4.7Hz). 1.06(d, 3 H, J = 4.7 Hz), 2.10(d q.1 H, J -6.2, J = 3.7Hz)、 3.6 6(d, 1H, J = 6.2Hz), 7.2〜 7.5 (m.5 H) :
MS(mZe) 160(M+ 1)+
光孊玔床 98.6 %e. e. (䞋蚘の分析条件による H P L C分析)。
HP LC分析条件
カラムォプチ-パック TA (りォヌタヌズ
溶離液 む゜プロパノヌルぞキサン =2.5 : 97.5 流速  1. Oml/分
怜出  UV254 no
保持時間 R䜓 7.7分、 S䜓 8.6分
参考䟋 5 (S)— 2—フナ二ルヌ 3—メチルプチルァミンの合成 光孊玔床 98· 6 %e.e.のS)— 2—プ二ルヌ 3—メチルプチロニト リル 2.00g(l 2.56«ηモルをむ゜ブロパノヌル 8.0mlに加え、 これ に 25%アンモニア氎 0.21mlおよびラネヌニッケル 0.60gを加えた。 次いで、 氎衆圧を 10kg/cm2*Gずし、 100°Cで 1.5時間氎 Ÿ添加した。 反応終了埌、 ラネヌニッケルをŸ別し、 む゜ブロパノヌルを枛圧䞋に留去 した。 この残留物に氎 20mlを加え、 10°Cに冷华した埌、 濃塩酞を加え お ρΗ1· 5ずした。 次いで、 ゞクロロメタン 20mlを加え、 氎局を掗浄し た。 氎局を 4N NaOH氎溶液で pHl 3ずし、 ゞクロロメタン 2 Onlで 抜出した。 この有機局を枛圧饑瞮し、 無色透明の油状物ずしおS)— 2— フヱニルヌ 3—メチルプチルァミン 1.76 g (収率 85.9%)を埗た。 H P L C分析により光孊玔床は 98.2%e.e.であった。
産業䞊の利甚可胜性
本発明の方法によれば、 安䟡な原料であるラセミ䜓たたは光孊玔床の䜎 い二トリル化合物から医薬品甚䞭間䜓あるいは光孊分割剀甚䞭間䜓ずしお 有甚な光孊玔床の高い酞アミ ド化合物を効率よく、 しかも高玔床に補造す るこずができ、 本方法は産業䞊極めお有甚である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 䞀般匏I) :
R2 ^ (
[匏䞭、 R1はじ〜じ,アルキル基、 1〜3個のフナニル基で眮換された じ【〜3アルキル基、 たたは C3〜C8シクロアルキル基を衚し、 R2は氎 玫たたは^〜 ^アルキル基を衚す]
で瀺されるラセミ䜓たたは光孊玔床の䜎い二トリル化合物を、 䞀般匏I):
Figure imgf000038_0001
[匏䞭、 *は䞍斉炭玠原子の䜍 Bを瀺し、 R1および R2は前蚘ず同じ意味 を有する]
で瀺される光孊玔床の高い察応アミ ド化合物に倉換する方法であっお、 適圓な反応媒䜓䞭で該ニトリル化合物 I )を、
• コリネバクテリゥム ·゚スピヌ A68 (FERM B P— 5215)、 ' ロ ドコッカス ·゚スピヌ KP 0-2028 CFERM BP— 5216) • D ドコッカス .゚スピヌ PP-25 (FERM BP— 5217)、 ' ロ ドコッカス .゚スビヌ PP-121 (FERM BP— 5218)、 ' ロ ドコッカス .マリス BP-479-9 (FERM BP— 5219)、 •バチルス ·サブチリス PP-116-15 (FERM BP— 5220)、 •ブレビパクテリゥ厶 ·゚スピヌ PP-133-7 (FERM BP— 52 21)、 からなる矀から aiばれる、 該ニトリル化合物 I )の二トリル基を光孊遞択 的に氎和し埗る二トリルヒ ドラタヌれ掻性を有する埮生物たたはその凊理 物ず接觊させ、 生成した光孊玔床の高いアミ ド化合物n)を該反応媒䜓か ら回収するこずを特城ずする方法。
2. 二トリル化合物が、 が氎衆である䞀股匏I )で瀺される化合物 である請求項 1に蚘茉の方法。
3. 二トリル化合物が、 R1がじ〜04アルキル基、 1もしくは 2個の フェニル基で眮換されたメチル基もしくはェチル基、 たたは C s〜 C 7シク 口アルキル基であり、 R2が氎玠である䞀般匏I)で瀺される化合物であ る請求項 2に蚘茉の方法。
4. 二トリル化合物が、 R1がじ,〜。,アルキル基、 ベンゞル基、 ベン ズヒ ドリル基、 たたは CS〜C7シクロアルキル基であり、 R2が氎玠であ る䞀般匏 I)で瀺される化合物である請求項 3に蚘茉の方法。
5. 二トリル化合物が、 R1が Ct C*アルキル基であり、 R2が氎衆で ある䞀般匏 I )で瀺される化合物である請求項 4に蚘茉の方法。
6. 二トリル化合物が、 R1がむ゜プロピル基たたは t-ブチル基であり、 R 2が氎玠である䞀般匏 I )で瀺される化合物である請求項 5に蚘茉の方 法。
7. 二トリル化合物が、 R1がむ゜プロピル基であり、 R 2が氎玠である —般匏 I )で瀺される化合物である請求項 6に蚘茉の方法。
8. 埮生物が、
• ロ ドコッカス ·゚スピヌ KP 0-2028 (FERM B P— 5216)、
• ロ ドコッカス · ゚スピヌ P P-25 (FERM B P— 5217)、
• ロ ドコッカス ·゚スピヌ PP-121 (FERM BP— 5218)、
• 口 ドコッカス · マリス BP-479-9 (FERM BP— 5219)、 'バチルス 'サブチリス PP-116-15 CFERM BP— 5220)、 たたは
• ブレビパクテリゥム .゚スピヌ PP-133-7 (FERM BP— 52 21)、
である請求項 1〜 7のいずれかに圮茉の方法。
9. 埮生物が、
' ロ ドコッカス .マリス BP- 479-9 (FERM BP— 5219)、 'バチルス 'サブチリス PP-116-15 (FERM BP— 5220)、 たたは
'ブレビパクテリゥム '゚スピヌ PP-133-7 (FERM B P-52 21)、
である I»求項 1〜 7のいずれかに蚘茉の方法。
10. 埮生物が、
' ロドコッカス .マリス BP-479-9 (FERM BP— 5219)、 たたは
' ブレビパクテリゥム '゚スピヌ PP-133-7 (FERM BP— 52 21)、
である請求項 1〜 7のいずれかに蚘茉の方法。
11. 埮生物が、 ロドコッカス 'マリス BP-479-9 (FERM BP -5219 )である請求項 1〜 7のいずれかに蚘茉の方法。
12. 二トリル化合物の二卜リル基を光孊遞択的に氎和し埗る二トリノレヒ ドラタヌれ掻性を有するロ ドコッカス 'マリス BP-479-9 (FER M BP— 5219)。
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