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WO1997013787A1 - Polypeptide se liant au facteur de croissance de cellules endotheliales vasculaires - Google Patents

Polypeptide se liant au facteur de croissance de cellules endotheliales vasculaires Download PDF

Info

Publication number
WO1997013787A1
WO1997013787A1 PCT/JP1996/002906 JP9602906W WO9713787A1 WO 1997013787 A1 WO1997013787 A1 WO 1997013787A1 JP 9602906 W JP9602906 W JP 9602906W WO 9713787 A1 WO9713787 A1 WO 9713787A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
vegf
flt
primer
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/002906
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masabumi Shibuya
Masaji Okamoto
Mikio Niwa
Tomoe Matsumoto
Makoto Asano
Toshiaki Segawa
Original Assignee
Toa Gosei Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toa Gosei Co., Ltd. filed Critical Toa Gosei Co., Ltd.
Priority to US09/051,363 priority Critical patent/US6270993B1/en
Publication of WO1997013787A1 publication Critical patent/WO1997013787A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide useful as an angiogenesis inhibitor, and a method for producing the same.
  • Some diseases are known to be associated with pathological angiogenesis that is closely related to their symptoms and etiology.
  • a typical disease is solid cancer.
  • cancer tissue In order for cancer tissue to grow beyond l to 2 mm in diameter, it is necessary for new blood vessels to extend from existing blood vessels to reach cancer tissue (J. Folkman, J. Natl. Cancer Inst., 82: 4 (1990)), and when blood vessels reach the cancer tissue, the proliferation of the cancer tissue is explosively accelerated.
  • diabetic retinopathy is associated with pathological neovascularization of the retina, which often causes blindness.
  • angiogenesis is one of the main symptoms (J. Folkman, N. Engle). J. Med., 320: 1211 (1989)). Therefore, substances that inhibit angiogenesis may be used to treat cancer and the aforementioned diseases.
  • Vascular endothelial cells are cells that form the innermost layer of blood vessels. Angiogenesis is carried out by causing vascular endothelial cells to proliferate under the stimulation of growth factors, physiologically active substances or mechanical damage. Growth factors that directly or indirectly stimulate the proliferation of vascular endothelial cells include bFGF (basic fibroblast growth factor), a FGF (acidic fibroblast growth factor), VEGF (Vascular Endothelial cell Growth Factor), PD— E CG F (Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor), TNF-H (Tumour Necrosis Factor-a), P DG F (Platelet D Even so, it can be expected that the antibody appearance rate is low.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • FGF acidic fibroblast growth factor
  • VEGF Vascular Endothelial cell Growth Factor
  • PD— E CG F Platinum-Derived Endothelial Cell Growth Factor
  • the soluble form of the HIV receptor CD4 CD5 has a blood half-life of 15 minutes (DJ Capon et al., Nature, 337: 525 (1989)), whereas in the case of Interferon T, The half-life was 30 minutes (I. Rutenfranz and H. Kirchner, J. Interferon Res., 8: 573 (1988)).
  • a method for extending the blood half-life a method is known in which a fusion polypeptide with a molecule having a long blood half-life such as an antibody molecule is produced by genetic engineering and used.
  • the serum half-life was extended from 15 minutes to 48 hours when chimerized with the Fc region of antibody IgG1 (DJ Capon et al., Ature, 337: 525). (1989)) 0 the effector function antibodies have by fusion Poribe peptide with F c region of antibodies, i.e. capturing material-dependent cellular cytotoxicity (DB Amos et al, Transpl antation , 7:.
  • the cDNA of the soluble receptor has been cloned (R. Shi Kendal and KA Thomas, Pro Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10705 (1993)).
  • the polypeptide encoded by this cDNA corresponds to the first to sixth immunoglobulin-like domains of the seven immunoglobulin-like domains in the extracellular region of FLT, and It bound VEGF with the same level of affinity as FLT and inhibited VEGF activity.
  • the first to sixth domains of the extracellular region expressed by genetic engineering of KDR bind to VEGF (R. Shi Kendal et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 201: 326 (1994)). Disclosure of the invention
  • mouse anti-VEGF neutralizing monoclonal antibody shows antitumor properties, it can be expected that it can be used as an anticancer agent.
  • administration of mouse antibodies to humans produces human antibodies to the mouse antibodies that can be neutralized or cause anaphylactic shock.
  • chimerization of mouse antibodies (S. Morrison et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1989)) It is necessary to bring the amino acid sequence of the mouse antibody closer to the amino acid sequence of the human antibody while maintaining the performance. This requires a high level of technology, knowledge, experience and effort, and the results are not always successful on a case-by-case basis. In addition, 100% cannot be converted into humans by this method.
  • Another method is to immunize using transgenic mice that produce human antibodies themselves (S. Wagner et al., Nucleic Acid Res., 22: 1389 (1994)). Professional skills are required.
  • the extracellular domain of the VEGF receptor can be used as an angiogenesis inhibitor because it can specifically bind to VEGF with high affinity and inhibit VEGF activity.
  • it is administered to humans because it is originally a human-derived polypeptide. 4th immunoglobulin domain 3 1 2 to 407
  • the present invention also includes a polypeptide in which the extracellular region of FLT is fused with another protein (for example, Fc region of immoglobulin).
  • Human vascular endothelial cells for example, human umbilical cord-derived vascular endothelial cells (sold by Iwaki Glass, Morinaga Milk Industries, Kurabo Industries, etc.) are cultured and subjected to the acidic phenol method (P. Chomzynski and N. Sacchi, Anal. Biochem., 162: 156 (1987)), and poly (A) and RNA are prepared using oligo dT cellulose. Using this as a type II, a single-stranded cDNA or a double-stranded cDNA is synthesized using reverse transcriptase and oligo dT (12 to 16) primer.
  • human vascular endothelial cells for example, human umbilical cord-derived vascular endothelial cells (sold by Iwaki Glass, Morinaga Milk Industries, Kurabo Industries, etc.) are cultured and subjected to the acidic phenol method (P. Chomzynski and N. Sacchi, Anal. Biochem., 162
  • the method for preparing poly (A) + RNA and the method for preparing cDNA can be performed according to “J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratly Press, 1989”. It can also be performed using a commercially available poly (A) + RNA preparation reagent (Oligot ex-dT30, manufactured by Takara Shuzo) or a cDNA synthesis kit (manufactured by Bulmasia Biosystems). If there is already f1tc DNA cloned from one cDNA library, the DNA of the region to be expressed may be directly cut out with an appropriate restriction enzyme and introduced into an expression vector.
  • c can amplify DNA of interest moiety by a primer as follows You only have to use one.
  • Primer DNA can be synthesized using a DNA synthesizer (manufactured by Applied Biosystems, Nippon Millipore Limited) or a custom DNA can be ordered (Suddy Technology Inc.). For example, to obtain a cDNA encoding the first to fourth immunoglobulin-like domains, W
  • polypeptides that can inhibit angiogenesis by specifically inhibiting VEGF, and particularly those that have a small molecular weight among the polypeptides relating to the extracellular region of the VEGF receptor. I worked hard. As a result, they found that a polypeptide containing the first immunoglobulin-like domain and the second immunoglobulin-like domain in the extracellular region of FLT binds to VEGF with high specificity and can inhibit VEGF activity. .
  • polypeptide generally refers to amino acids that are covalently linked to each other by peptide bonds, and is not limited in length.
  • polypeptides of the present invention also include those comprising other domains in addition to those comprising only the first and second immunoglobulin-like domains of the extracellular region of FLT.
  • polypeptides containing all of the first to fourth immunoglobulin-like domains, and polypeptides containing all of the first to fifth immunoglobulin-like domains are also included in the present invention. Included in polypeptides.
  • a polypeptide containing all of the first to sixth immunoglobulin-like domains to the sixth immunoglobulin-like domain or a polypeptide containing all of the first to seventh immunoglobulin-like domains to the seventh immunoglobulin-like domain has a molecular weight of Is too large, it is considered that the expression of the present invention such that expression by the recombinant DNA technique is easy to be performed and infiltration into the affected part is rapid is not sufficiently achieved, and the polypeptide is excluded from the polypeptide of the present invention. Is done.
  • the boundaries between the domains of FLT are not clearly distinguished, but in the present specification, each domain is defined as a domain including an amino acid sequence having the following residue numbers. [The residue numbers are the same as those in SEQ ID NO: 1.] That is, the residue number counted from the N-terminal of mature FLT ("Ser" at position 1 in SEQ ID NO: 1) is shown below:
  • Tertiary immunoglobulin domain 209 ⁇ 3 1 1 Recovery from the gel and cleavage with restriction enzymes can be performed according to the above-mentioned “Molecular Cloning J.
  • Kit using commercially available glass beads for example, Prep-A-Gene, Bio-Rad
  • the recovered DNA fragment is digested at both ends with a restriction enzyme capable of cleaving X (6) and Y (6), deproteinized by phenol treatment, and ethanol precipitated.
  • TE 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 1 mM EDTA
  • a restriction enzyme that can cleave the DNA
  • agarose gel electrophoresis is performed, and the vector DNA is recovered, so that small fragments between the X (6) and Y (6) cleavage sites can be removed.
  • You can insert these DNs The A fragment and the cleaved vector DNA are added, for example, so that the ratio of the vector DNA: inserted DNA fragment becomes 1: 5 to: 1: 10, and ligated using T4 DNA ligase. Add the ligated product to E.
  • coli competent cells perform the transformation, and add the antibiotic corresponding to the selection method (eg, ampicillin resistance, kanamycin resistance, etc.) coded into the vector.
  • the selection method eg, ampicillin resistance, kanamycin resistance, etc.
  • select antibiotic-resistant transformants in the culture medium containing the recombinant DNA inserted into the expression vector and examine the restriction enzyme cleavage patterns of the plasmids of each antibiotic-resistant transformant.
  • determine whether or not the desired DNA fragment is amplified by PCR using the primers obtained by amplifying the DNA fragment to be introduced with each transformant as a type I cell.
  • C series of operations to obtain a recombinant of these E. coli can be performed according to the aforementioned "Molecular CloningJ
  • yeasts such as Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Saccha romises cerevisiae, fungi such as Aspergillus, Sf9 (Sp Upstream primer: 5'-N (3-5) X (6) CGTCGCGCTCACCATGGTCAG-3 '(SEQ ID NO: 2) Downstream primer: 5'-N (3-5) Y (6) TTATTCGTAAATCTGGGGTTTCAC-3' (SEQ ID NO: : 3) may be used.
  • N represents any of A, C, G, and T
  • X or ⁇ represents a restriction enzyme recognition sequence
  • the number in parentheses represents the number of bases.
  • N (3 to 5 3 ⁇ 4A, C, G, indicates that there are 3 to 5 of any of T, X (6) or ⁇ (6) is a restriction enzyme that recognizes 6 bases It is preferable that these restriction enzyme recognition sequences are not present in the DN fragment to be inserted and the vector into which it is to be inserted
  • the downstream primer can be appropriately designed with reference to the above to amplify the DNA fragment encoding the desired C-terminus.
  • the coding sequence of the polypeptide is transferred to the promoter
  • the portion corresponding to the f1t DNA sequence is not necessarily limited to 21 bases and may be about 17 to 25 bases.
  • the DNA polymerase used for PCR should be Pfu polymerase (Stratagene) with Taq polymerase or proofreading (3 'exonuclease) activity.
  • Pfu polymerase (Stratagene) with Taq polymerase or proofreading (3 'exonuclease) activity.
  • Taq polymerase plus Pfu polymerase increases the reliability (Fiderity) of PCR amplification (W. Barnes, Proc. Natl. Acad. Sci. .SA, 91: 2216 (1994)) c
  • the sequence of the DNA fragment to be amplified by PCR is known, so after amplification, check the size by agarose gel electrophoresis, collect from the gel, digest with an appropriate restriction enzyme, and examine the electrophoresis pattern. Thus, whether or not the desired DNA fragment has been obtained can be determined.
  • Agarose gel electrophoresis DNA fragmentation
  • polypeptides will be obtained from silkworm body fluids with higher productivity than when cultured cells are used as a host (Hideki Kawai, Yoichiro Shimoguni) Bioindustry, 8:39 (1991)).
  • the bacterium will be able to utilize DNA that encodes the signal peptide of the secreted polypeptide of the host used.
  • DNA that encodes the signal peptide of the secreted polypeptide of the host used.
  • OmpF E. coli outer membrane protein
  • Fosufata an Ze PhoA ze PhoA
  • MALB maltose binding protein MALB maltose binding protein
  • Baci Llus amylase nucleotide sequence is known in the genus, alkaline phosphatase, signal peptidase, such as serine proteases
  • DNA encoding the peptide can be used. When expressed in cells, it may be used except for the signal peptide coding portion other than the initiation codon.
  • the polypeptide of the present invention obtained by the method described above can be purified by a general biochemical method. For example, ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration, hydrophobic chromatography, etc. can be used. Since the polypeptide of the present invention has a heparin affinity, it can be used with a heparin resin. Insect cells such as odoptera frugiperda), Sf21, ⁇ (derived from Trichoplusia ni), BN4 (derived from Bombyx moli), and mammalian cells such as CHO (derived from cinese hamster ovary) and COS cells (derived from monkey kidney) it can. A vector suitable for each type of host may be used.
  • Transformation methods for obtaining a recombinant host producing the polypeptide of the present invention include the following methods: E. coli, a competent cell, and Bacillus genus, a competent cell method (K. Bott and GA A. Willson, J. Bacteriol. 94: 562 (1967)), the protoplast method (M. Mandeland A. Higa, J. Mol. Biol., 53: 159 (1970)), and the protoplast method for yeast (M. Broker et al.
  • the lipofectin method RW alone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6077 (1989)
  • the calcium phosphate method F. Graham and AJ van der Eb, Virology, 52: 456 (1973)
  • the electrophoresis method can be applied to all of the above-mentioned cells. Basically, the part to be expressed using a plasmid or viral DNA that can be replicated in the host used. Can be incorporated downstream of a strong promoter that functions in its host. If the gene to be expressed does not have a translation initiation codon, it must be added.
  • a ribosome binding sequence is required (J. R-MacLaughlin et al., J. Biol. Chem., 256: 11283 (1981)). It is also possible to use a method in which homologous recombination occurs with the host chromosome using a vector that has a portion of the host chromosomal DNA and cannot replicate in the host, and is integrated into the host chromosome as a vector (Japanese Patent Laid-Open No. No. 2,780,92, DJ King et al., Biochem. J., 281: 317 (1992)).
  • a method using an animal or plant solid as a host instead of cultured cells can be used.
  • a silkworm virus is used.
  • a project is used. Since this plate specifically binds VEGF, if 125 I-labeled VEGF is used, the binding can be confirmed from the radioactivity remaining in the well. Pre-incubate the fraction from the chromatography and 125 I-VEGF which were used to purify the polypeptide of the present invention, transfer them to the wells of this plate, and measure the remaining radioactivity.
  • the polypeptide of the present invention binds to VEGF during pre-incubation, and it can be confirmed that it is difficult to bind to the plate by antagonizing the polypeptide of the present invention on the plate. .
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the domain of the FLT extracellular region.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of the process of constructing a recombinant baculovirus expressing 4N-FLT.
  • FIG. 3 is a diagram showing an outline of the process of constructing a recombinant baculovirus expressing 5N-FLT.
  • FIG. 4 is a diagram showing Western plots of culture supernatants and extracts of cells infected with B4N or B5N recombinant baculovirus.
  • FIG. 5 is a diagram showing a scatch analysis on the interaction between 4N-FLT or 5N-FLT and a VEGF fragment.
  • Figure 6 shows EDF 4 N— which promotes VEGF-dependent thymidine uptake of HUVEC. Affinity chromatography can be used.
  • a fusion polypeptide with another polypeptide it can be purified by utilizing the properties of the partner polypeptide (M. Uhlen et al., Methods Enzymol., 185: 129 ( 1990)).
  • the partner of the fusion polypeptide is the Fc region of the antibody, protein A sepharose or protein G sepharose ( ⁇ ⁇ Harlow and D.
  • the fraction containing the polypeptide of the present invention can be detected by EIA or Western analysis using an antibody that reacts with the polypeptide.
  • the antibody that reacts with the polypeptide of the present invention synthesizes an oligopeptide corresponding to the 24th to 30th amino acid sequence from the N-terminus and binds to a carrier protein such as bovine serum albumin or KLH (keyhole lymphethemocyanine).
  • a carrier protein such as bovine serum albumin or KLH (keyhole lymphethemocyanine).
  • KLH keyhole lymphethemocyanine
  • a fusion polypeptide of the polypeptide of the present invention and another polypeptide may be produced in Escherichia coli, purified using the characteristics of the fusion partner polypeptide as described above, and used as an immunogen. An antibody that reacts with the polypeptide of the present invention is obtained.
  • the polypeptide of the present invention binds to VEGF, it can be purified using its activity as an indicator-for example, in the same manner as preparing an antibody-immobilized plate for EIA, the polypeptide of the present invention before purification can be used.
  • the solution containing the polypeptide was appropriately diluted, and coated with a 96-well polystyrene microtiter plate to perform blocking treatment.
  • polypeptides comprising first to fourth immunoglobulin-like domains and first to fifth immunoglobulin-like domains
  • Example 1 Preparation of recombinant baculovirus expressing FLT extracellular region 1) Preparation of recombinant virus expressing first to fourth immunoglobulin-like domains of FLT
  • the vector was constructed according to the procedure described in “Molecular Cloning J” by Sambrook et al. In accordance with the procedure shown in FIG. 2.
  • the first to fourth immunoglobulin-like domains of FLT were To obtain the expressed recombinant virus, the DNA of plasmid pf 1 t3-7 (M. Shibuya et al., Oncogene, 5: 519 (1990)) was digested with restriction enzymes EcoRI and NdeI. Approximately 1.6 kbp of EcoRI-Ndel DNA fragment separated by agarose gel electrophoresis was prepared, while the DNA of plasmid pME18SNEo was digested with restriction enzymes EcoRI and XhoI.
  • FIG. 3 is a view showing inhibition by FLT or EDF rum 11 expression culture supernatant.
  • FIG. 7 is a diagram showing an autoradiograph after electrophoresis of a covalently crosslinked product of 125 I-VEGF,:, and a cell infected with a recombinant baculovirus expressing EDF or EDFA11. .
  • FIG. 8 is a diagram showing a scattering analysis on the interaction between EDF or EDFA11 and the VEGF fragment.
  • FIG. 9 is a diagram showing a VEG Faffine take mouth graph in the purification process of EDFA 11 and an electrophoresis pattern of each fraction.
  • FIG. 10 is a diagram showing an electrophoresis pattern and Western analysis of purified EDF ⁇ 11.
  • FIG. 11 shows human immunoglobulin Ig. ! of?
  • FIG. 4 is a diagram showing the correspondence between the schematic diagram of the c region and the positions of primers used for isolation.
  • FIG. 12 is a diagram showing agarose gel electrophoresis patterns of DNA amplified and purified by PCR and recombinant plasmid cleaved with restriction enzymes.
  • FIG. 13 is a diagram showing an agarose gel electrophoresis pattern of DNA amplified and purified by PCR.
  • FIG. 14 is a diagram showing an outline of the process from the isolation of each DNA fragment to the construction of recombinant plasmids expressing FLT 1st to 2nd-human IgG] -Fc.
  • FIG. 15 is a diagram showing a western blot of a recombinant E. coli crude extract using an anti-human IgG, -Fc monoclonal antibody.
  • Figure 17 shows a scattered analysis of the binding of 1: 5 I-VEGF of the FLT primary and secondary immunoglobulin-like domains of human IgG and Fc fusion proteins in the recombinant E. coli extract.
  • Figure 18 shows the partially purified FLT primary and secondary immunoglobulin-like domain
  • the cells were infected and the culture supernatant was collected. This sample was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and subjected to Western blotting.
  • NTB Nonroblue tetazolium chrolide
  • BCIP 5- Bromo-4-
  • a heron anti-FLT extracellular region polyclonal antibody as the primary antibody
  • an alga rephosphatase detecting and anti-heron IgG as the secondary antibody
  • the color was developed with chrolo-3- indolylphosphate p-toluidine salt (Gibco BRL).
  • Lane 1 is 2 ⁇ l of B4N infected cell culture supernatant
  • lane 2 is ⁇ 4 ⁇ infected cell extract 10 ⁇ l
  • lane 3 is ⁇ 5 ⁇ infected cell culture supernatant 2 ⁇ 1
  • lane 4 is ⁇ 5 ⁇ Infected cell extract 10 ⁇ 1 was electrophoresed.
  • the mobility of the immunochemically reacted band was consistent with the expected molecular weight.
  • these products are referred to as "4N-FLT” and "5N-FLT”. It was also determined that about 2 ⁇ g / m 1 of “4N_F LTJ” or “5N-F LT” was contained in the culture supernatant sample.
  • HiFiVe cells are infected with the recombinant virus "B4N” or “B5N", and the resulting culture supernatant is diluted 4-fold with PBS and microtiter plate (" 2 "Dynatech Co., Ltd.) 100 ⁇ l was put in a well at 4 ° C overnight and removed from the well. Wash the wells three times with PBS-0.1 ⁇ 1 ⁇ 2BSA, then PBS-1. / 0 83 250 // 1 placed and left at room temperature for 2 hr for blocking.
  • the vector was constructed according to the procedure described in “Molecular Cloning J” by Sambrook et al. According to the procedure shown in FIG. 3. Plasmid pf 1 t3-7 DNA was replaced with EcoRI and The DNA fragment was digested with Hind III to prepare a 1.9 kbp EcoRI-HindIII DNA fragment, and the oligonucleotide “5 ′ AGCTTTTAATGATCTAGAATGAC 3 ′ was used as an adapter to convert the HindIII end to XhoI.
  • the plasmid DNA was purified, and a recombinant virus was obtained according to the manual using BaculoGold (PharMingen), which is a baculovirus DNA lacking the pohedrin coding region.
  • BaculoGold BaculoGold (PharMingen)
  • BaculoGold BaculoGold
  • This recombinant baculovirus was named "B5N”.
  • Recombinant baculovirus “B5N” was amplified using Sf9 cells according to the manual and used for subsequent experiments.
  • “B5N” includes DNA encoding the amino acid sequence from the N-terminus of FLT to residue 560.
  • the 2.5 U Taq polymerase (Promega) primer sequence is as follows.
  • Primer 1 5'-CTCGGATCCGGATCTAGTTCAGGTTCAAAA-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Primer 2 5'-CTCGAATTCACTCCAGATTAGACTTGTCCGA-3' (SEQ ID NO: 9)
  • the underlined "primer 1" corresponds to the N-terminal coding sequence of mature FLT
  • the underlined "primer 2" corresponds to the C-terminal coding sequence of FLT extracellular region.
  • the reaction solution 200 ⁇ was treated with an equal amount of Kufloform to remove mineral oil, the aqueous layer was collected, 10% SDS was added to 4 ⁇ l of kneaded, and the mixture was incubated at 60 ° C for 5 minutes. . An aqueous layer obtained by treating this solution with an equal amount of TE-saturated phenol was recovered, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation .: The dried precipitate was dissolved in 30 ⁇ l of ⁇ ⁇ , and the mixture was dissolved in agarose gel.
  • HUVE C (Kurabo Ltd.) about 1 X 1 0 7 cells in 1 ml of IS OG EN the cells were disrupted by Bae added (sum pure drug Kogyo light) Ssuru further 9 m 1 of IS OG EN added 5 minutes Shake. To this solution, 1 ml of chloroform was added, shaken for 1 minute, centrifuged at 100,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was recovered. 110 volumes of 3M sodium phosphate (p. H5.2) was added and mixed, and 2.5 volumes of ethanol were further added. The precipitate was recovered by centrifugation, washed with 75% ethanol, dried, and dissolved in 100 ⁇ l of heat-sterilized pure water. 102 ⁇ g of RNA was obtained.
  • HUVEC C poly (A) + RNA was obtained according to the manual c.
  • HUVEC-derived cDNA obtained in 1) as type I, PCR was performed under the following conditions. Cultivated so that it became as it was, and further cultured for 20 hours. The cells were collected by centrifugation, and about 7.1 mg of a GST-EDF fusion polypeptide having a purity of about 60% was prepared using Glutathione Sepharose (Pharmacia Biosystems) according to the method described in the manual. As a result of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis by the Laemmli method, this fusion polypeptide has a molecular weight of 60,000, and the molecular weight of the fusion polypeptide partner is about 32,000 after subtracting the molecular weight of 28,000 from 03 chains. . Since the GST moiety is considered to be hardly degraded due to binding to glutathione sepharose, it is considered that the N-terminal side of EDF remains around 32,000 in molecular weight and the latter half of EDF is deleted. .
  • the GST-EDF fusion polypeptide prepared in 3) above was mixed with Freund's complete adjuvant, and the first GST-EDF fusion polypeptide was 200 ⁇ g per rabbit and 100 // g every two weeks thereafter. Immunized subcutaneously seven times. As a result of titration using a plate coated with the antigen, a sufficient immune reaction was obtained even when the serum was diluted 64,000-fold or more. ⁇ According to the method described in “Antibodies” of “E. Harlow and D. Lane”, 150 mg of an IgG fraction was obtained from the serum of two herons.
  • PCR was performed using plasmid pf 1 t 3-7 (M. Shibuya et al., Oncogene, 5: 519 (1990)) under the following conditions: After treatment with TE-saturated phenol, digested EcoRI and BamHI DNA fragments were recovered from the aqueous layer using “Prep-A-Gene”. Similarly, 1 g of the plasmid vector pGEX2T (Pharmacia Biosystems) is digested with EcoRI and BamHI, the reaction solution is treated with an equal amount of TE-saturated phenol, and the aqueous layer is subjected to “Prep-A ⁇ Gene”. To recover EcoRI and BamHI digested pGEX2T DNA.
  • DNA fragment and plasmid DNA were mixed at a molar ratio of 10: 1 to perform ligation (ligation kit, Takara Shuzo).
  • ligation kit Takara Shuzo
  • a competent cell of Escherichia coli JMl09 (Takara Shuzo) was transformed, and 2 XTY medium containing 75 / g / m1 ampicillin (16 g tryptone, 1 0 g yeast extract, 5 g sodium chloride, 1.5 g agar) and cultured overnight at 37 ° C.
  • Primer 5 5 '-CACCACCACCACCACCACCACCACTAACTAGAGCTCGCTGATC-3' (SEQ ID NO: 12)
  • Primer 6 5'-TTCTCGAATTCTCCCCAGCATGCCTGC-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • reaction solutions 200 1 were treated with an equal amount of chloroform, and the aqueous layer was collected, and 0.5% SDS, 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8), 5 mM EDTA, 200 ⁇ g / ml proteinase K ( (Proteinase K) was added, and the mixture was kept at 37 ° C for 30 minutes.
  • SDS 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8), 5 mM EDTA, 200 ⁇ g / ml proteinase K ( (Proteinase K) was added, and the mixture was kept at 37 ° C for 30 minutes.
  • These solutions were treated with TE-saturated phenol, the aqueous layer was precipitated with ethanol, and the DNA fragment encoding EDF and the DNA containing the polyadenylation signal were dissolved in TE.
  • Primer 3 5'-TTTCTCGGATCCTATAAATATGGTCAGCTACTGGGACACC-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • Primer 4 5'-GTGGTGGTGGTGGTGGTGACGCTCCAGATTAGACTTGTCCGA-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • the underlined "primer-1" corresponds to the N-terminal coding sequence of mature FLT
  • the underlined "primer-4" corresponds to the FLT extracellular region C-terminal coding sequence.
  • plasmid pRcZR SV manufactured by Invitrogen corp.
  • PCR was performed under the following conditions. Six clones having recombinant plasmids were selected in the same manner as described in
  • Plasmid DNA was prepared from a 3 ml culture of each clone by the alkaline method, the base sequence was determined, and about 300 bases upstream and 500 bases downstream of the inserted fragment were found. It was plasmid-derived. These plasmids were named "p EDFH 10" and "p EDFH 11". Escherichia coli having these plasmids was cultured overnight at 37 ° C in 10 Om1 2 XTY medium containing 50 ⁇ g / m1 ampicillin, and the recovered cells were subjected to an alkaline method (see “J. Sambrook”).
  • This DNA solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and it is considered that the DNA fragment encoding EDF and the DNA fragment containing the polyadenylation signal were fused.
  • the 2.5 kbp DNA fragment was recovered, and 50 ⁇ l of TE solution was collected.
  • Prepared as A DNA fragment was prepared by digesting both ends of this DNA fragment with BamHI and EcoRI.
  • 1 ⁇ g of plasmid pVL1333 (PharMingen) which is a transfer vector for recombinant baculovirus, was cut with BamHI and EcoRI in the same manner as described in Example 5-2).
  • a DNA fragment encoding EDF amplified by PCR from this plasmid DNA and plasmid pf1t3-7 was mixed with a DNA fragment digested with BamHI and EcoRI at a molar ratio of about 1: 5.
  • the cells were treated with a Ryge kit (Takara Shuzo) and transformed into E. coli JM109 competent cells. Therefore, when subtracted from the molecular weight of each covalent cross-linked product, they are 110,000 and 30,000. This suggests that cells infected with "BEDFH10" produce full-length EDF, and cells infected with "BEDFH11” express EDF fragments.
  • the fragment of EDF expressed from "BEDFH 11" was named "EDFA 11".
  • the above recombinant virus the moi0 3 (the moi virus particles: that the ratio of the cell number).
  • VEGF the molecular weight of the monomer is 20,000
  • EDFH 11 NaC1 was added to the culture supernatant of infected cells to a concentration of 0.3 M, and a heparin column (Pharmacia Biosystems) was used for FPLC (Pharmacia Biosystems). Fractionated. 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0 ⁇ 0) after sample loading — 2 with 0.3 M NaCl
  • the column was washed until the absorbance at 80 nm decreased by + minutes, and eluted with a 0.3-1 OM NaCl linear gradient.
  • the fraction having an absorbance of 280 nm was collected and subjected to VEGF affinity chromatography. Dilute the sample two-fold with PBS
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Example 3-2 One hour later, the mixture of 100 was used in Example 3-2).
  • the binding of VEGF was examined in a microtiter plate, and as a result, VEGF binding inhibition was observed in the fraction in which a 35,000 molecular weight band was observed by electrophoresis, which was almost the same as expected in the covalent crosslinking experiment (Fig.
  • EDF or “EDF ⁇ 11” was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and subjected to Western protein according to the method described in “Antibodies” of “E. Harlow and D. Lane”: Primary antibody The antibody of 4) in Example 1 was used at 2 ⁇ g / ml, and alkaline phosphatase-labeled anti-Egret IgG (EY La boratories) was used as a secondary antibody after 5,000-fold dilution, and NTB (Nitroblue Color was developed with tetazolium chro lide) and ⁇ CIP (5-bromo-4-chrolo-3-indolylphosphste p-toluidine salt) (manufactured by Gibco BRL).
  • the nucleotide sequence was determined to confirm the nucleotide sequence of the DNA cloned into the plasmids “p EDFH10” and “p EDFH 11”. As a result, the FLT of the inserted DNA of “p EDFH 10” was determined. The nucleotide sequence of the region corresponding to the extracellular region was completely identical to FLT. The nucleotide sequence of the region corresponding to the FLT extracellular region of the inserted DNA of ⁇ p EDFH ll '' was compared to FLT. In SEQ ID NO: 1, the C at position 105 was missing. As a result, the open reading frame was found to correspond to positions 122 to 246 of the FLT amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. This part contains the first and second domains of FLT.
  • the culture supernatant of “B EDFH 10” infected cells was concentrated 8-fold with Ikun ercible CX-lOj (manufactured by Nippon Millipore Limited), and 20 mM Tris-HCl (pH 7.8) / 50 mM KCl / 0.1% Ni ++ -NTA (QIAGEN, Diagen GimbH) equilibrated with Nonidet P -40/1 mM imidazole-hydrochloric acid ( ⁇ 7.8) was added and mixed at 4 ° C. for 1 hour.
  • Human IgG subclass profile kit (Zymed) was used to culture the supernatant of the IgG-producing strain human obstroma, I M9 (Dainippon Pharmaceutical) in RPMI 1640 medium. g was produced. A cDNA solution was prepared from 4 ⁇ 10 ′ I M9 cells in the same manner as described in II [Example 5] (1). From this cDNA, a human IgG] -Fc DNA fragment was amplified by PCR in two steps under the conditions shown in Table 7.
  • Primer 7 5'-TCTTGTGACAAAACTCACACATGC-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • Bleima-1 8 ⁇ '-CGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • FIG. 10B is a diagram in which the same sample as in FIG. 10A was subjected to Western blotting.
  • HUVEC human umbilical cord-derived vascular endothelial cells
  • EDF EGF
  • 4N-FLT EGF ⁇ 11 expression culture supernatant using recombinant virus compared to the case where the wild-type (wt) virus infection culture supernatant used as a control was added as a sample
  • VEGF-dependent thymidine incorporation was significantly inhibited. From these results, it was revealed that "EDF”, “4N-FLT” or “EDF 11” inhibits thymidine incorporation of HUVEC by VEGF, that is, inhibits DNA synthesis.
  • the first and second I Takeno immunoglobulin-like domains and human I g G; - examples relating fusion protein with the F c region E. coli strain HB101 was cultured overnight at 37 ° C in 3 ml of 2 x TY medium, centrifuged to collect the cells, and 0.5 ml of TE buffer (10 mM Tris-HC1 (p H7.5) No. 1 Suspended in 1 mM EDTA). Add 25 ⁇ l of 20 mg nom 1 egg white lysozyme, leave at room temperature for 15 minutes, lyse, add 50 l of 10% SDS and 0.5 ml of TE-saturated phenol and shake vigorously for 5 minutes.
  • the water layer was collected by centrifugation, centrifuged, and treated with an equivalent amount of black-mouthed form to remove phenol.
  • the DNA was precipitated by adding 2 volumes of ethanol, washed with 70% ethanol, and dried. The precipitate was dissolved in 200 ⁇ l of 20 / igZml RNase A solution to obtain an E. coli genome DNA solution. Using this as a type II, PCR was performed under the conditions shown in Table 9 to amplify the signal peptide coding DNA of OmpA.
  • Primer 11 5'-TAACCTGGCGATAACGAGGCGCAAATAATGAAAAAG-3 '(SEQ ID NO: 18) trx term SD omp init
  • Primer 12 5'-CTGAACTAGATTTCGGAGCGGCCTGCGCTA-3 '(SEQ ID NO: 19)
  • “Bam” of primer 10 is a restriction enzyme BamHI recognition sequence
  • “STP” is a stop codon
  • “h IgGl-Fc termj means human IgG! —The C-terminal part of the Fc coding region.
  • the antisense strand is composed of 8 and the primer 10.
  • the correspondence between the human IgG and the Fc coding region and the position of the primer is shown in Fig. 11.
  • the fibrous scale reaction solution was prepared using 1I [Example 5]. Treat in the same manner as described in (2), cut out the DNA fragment of about 700 bp by agarose gel electrophoresis, and filter one tube SUPEREC-01
  • Primer 13 5'-TTCTCGAATTCCCTGTGGAGTTATATATGAGC-3 '(SEQ ID NO: 20)
  • Primer 14 5'-GCCTCGTTATCGCCAGGTTAGCGTCGAGGA-3 '(SEQ ID NO: 21)
  • Primer 13 indicates the recognition cleavage site of the restriction enzyme EcoRI
  • SD indicates the ribosome binding sequence of the E. coli thioredoxin gene
  • trx init indicates the vicinity of the start codon of trxA.
  • OmpSD in Primer 14 refers to the ribosome binding sequence of omp A.
  • Primer 14 is the antisense strand. This PCR reaction solution was treated in the same manner as above, and the obtained DNA fragment was used as thioredoxin DNA ( Figures 12 and 14).
  • EDF 1 1 Bacchus expression vector p PCR was performed using EDFH 11 as type I under the conditions shown in Table 11, and FLT first and second immunoglobulin-like domain coding I)
  • "trx termj” means the coding end of the Escherichia coli thioredoxin gene (trxA)
  • "SD” means the ribosome binding sequence of omp A
  • "omp initj” means the vicinity of the start codon of omp A.
  • mflt means the N-terminal coding region of mature FLT
  • omp SP termj means the terminal part of the Omp A signal peptide coding region.
  • Primer-12 is the antisense strand.
  • PCR was performed under the following conditions to amplify the E. coli thioredoxin gene.
  • the Omp A signal peptide DNA of (1) of [Example 9], the thioredoxin DNA of (2) of [Example 9], and the EDF12 Fc DNA of (3) of [Example 9] are type III.
  • Recombinant PCR was performed under the conditions shown in Table 13, and the three DNA fragments were fused, amplified, and purified ( Figures 13 and 14).
  • lanes M, 1, 2, and 3 represent the molecular weight standard, EDF12 DNA, IgG, FcDNA, and EDF12FcDNA, respectively.
  • “Ec” and “Bm” in FIG. 14 indicate the locations of the recognition sequences of the restriction enzymes EcoRI and BamHI, respectively.
  • the NA was increased and purified in the same manner as above to obtain EDF12 DNA (Fig. 13).
  • Table 11 Composition of the reaction solution (in 100/1) PCR reaction conditions
  • Primer 15 5'-CGCTCCGAAA TCTAGTTCAGGTTCAAAATT-3 '(SEQ ID NO: 22) omp3 ⁇ 4P term mF
  • Primer 16 5 '-TTTRTCACAAgATTTRggCTCT gTgCTTATTTggACATCTAT-3'
  • HgG-Fc hinge of primer 16 means hinge coding DNA of human IgG
  • 214-FLT-208 means amino acid coding DNA of positions 208 to 214 of FLT.
  • Primer 16 is the antisense strand.
  • JM109 (pEDF12Fc) was shake-cultured at 37 ° C in 2 x TY medium containing 70 ⁇ l of 100 ⁇ g / m1 ampicillin.When the absorbance at a wavelength of 600 nm reached 1.0, I 0.5 mM was added, and the cells were further cultured for 12 hours. After completion of the culture, the culture was quenched, and 70 ⁇ l of 33 ⁇ p APMS F (Wako Pure Chemical Industries) was added to the culture as a protease inhibitor, followed by centrifugation to collect the cells.
  • the cells were suspended in 5 ml of 1 OmM Tris-HC1 (pH 8.0) / 33 nM pAPMS F, and 95% or more of the cells were sonicated using a sonicator. This was centrifuged at 100,000 X g for 20 minutes, and the precipitate was washed with 5 ml of 0.1 M Tris—HC 1 (pH 8.0) / 1 M C 1/33 nM pAPMS F / 5 mM EDTA. / 1% Triton x100 / 0.1% Nonidet-P40 The supernatant was centrifuged and centrifuged at 20,000 xg to remove insoluble components. The supernatant was used as a crude extract in the following analysis. At the same time, a crude extract was prepared in the same manner from JM109 (pTTQ18) having only a part of the vector as a control.
  • Figure 1 2 lanes M, 1, 2, 3, 4, 5, and 6 are molecular weight standards, 000 immunoreactive bands were detected ( Figure 15).
  • the samples in lanes 12 are a crude extract of JM109 (pTTQ18) and a crude extract of JM109 (pEDF12Fc), respectively.
  • the expected recombinant is 446 amino acid residues, which is a reasonable size.
  • the crude extract was subjected to Western blotting in the same manner as in (5) of [Example 7].
  • the crude extract was subjected to SDS_polyacrylamide electrophoresis by the Laemmli method, electroblotted on a PDVF membrane, and blocked, and then, as a primary antibody, an anti-human IgG : —Fc monoclonal antibody (MB L # IM-0280) 0.
  • Alkaline phosphatase-labeled pile mouse IgG (manufactured by Zymed) was diluted 4000 times and used as a secondary antibody at / zg / Zml.
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • the recombinant proteins of this example were obtained from human IgG, Fc-specific monoclonal antibodies.
  • Fc has been shown to have the biochemical properties of human IgG: Fc, which also recognizes and binds to protein A.
  • this fusion protein binds to VEGF with as high affinity as EDF and inhibits the biological activity of VEGF.
  • the polypeptide of the present invention can inhibit angiogenesis induced by VEGF, it can be used for treatment of solid cancer and other diseases accompanied by pathological angiogenesis.
  • it since it is composed of human-derived amino acids, it is difficult to produce antibodies even after long-term administration to humans.
  • conventional polypeptides R. Kendal and KA Thomas, Pro Natl., Acad. Sc., USA, 90: 10705 (1993)
  • it is easy to express with recombinant DNA and its infiltration into the affected area is quick.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • ⁇ iss an -i9S Nyu ⁇ s iH 4 ⁇ US V US V ⁇ ⁇ ⁇ -f 1! ⁇ 3 Interview ⁇ 3 ⁇ ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA) SEQ ID NO: 9
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書
VEG F結合性ポリぺプチド 技術分野
本発明は、 血管新生阻害剤として有用なポリペプチド、 およびその製造方法に 関する。 背景技術
幾つかの疾病では、 その症状や病因と密接に関連した病理的血管新生を伴うこ とが知られている。 中でも代表的な疾病は固形ガンで、 ガン組織が直径 l〜 2 m mを越えて増殖するためには、 既存血管から新生血管が延びてガン組織まで到達 することが必要であり （J. Folkman, J. Natl. Cancer Inst. , 82:4 (1990)) 、 また血管がガン組織に到達するとガン組織の増殖が爆発的に加速される。 また、 糖尿病性網膜症では網膜に病理的血管新生を伴い、 それが原因でしばしば失明す ることがある。 更に慢性関節リューマチ、 乾癬、 血管腫、 強皮症、 血管新生緑内 障などの疾病においても病理的血管新生を伴い、 それが主な症状の一つとなって いる （J. Folkman, N. Engle. J. Med. , 320:1211 (1989)) 。 従って血管新生を 阻害する物質はガンや前述の疾病の治療に利用できる可能性がある。
血管内皮細胞は血管の最も内側の層を形成している細胞である。 血管新生は血 管内皮細胞が成長因子や生理活性物質または機械的損傷などの刺激を受けて、 增 殖することによって行われる。 直接または間接的に血管内皮細胞の増殖を刺激す る成長因子として、 b F G F (basic Fibroblast Growth Factor) 、 a FG F ( acidic Fibroblast Growth Factor) 、 VE G F (Vascular Endothelial cell G rowth Factor) 、 P D— E CG F (Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor) 、 T N F—ひ (Tumour Necrosis Factor- a ) 、 P DG F (Platelet D しても抗体出現率は低いことが期待できる。 しかしながら本来体内に多量に存在 しないポリぺプチドを投与すると極めて速やかに代謝されてしまうことが報告さ れている。 例えば、 H I Vのレセプターである CD 4の可溶性型の血中半減期は 1 5分であり （D. J. Capon et al. , Nature, 337:525 (1989)) 、 インタ一フエ ロン T の場合は血中半减期は 3 0分であった （I. Rutenfranz and H. Kirchner, J. Interferon Res. , 8:573 (1988)) 。
血中半減期を延長する方法として、 抗体分子のような血中半减期の長い分子と の融合ポリぺプチドを遺伝子工学的に作成し利用する方法が知られている。 C D 4の例では抗体 I g G 1の F c領域とのキメラにした場合に血中半減期が 1 5分 から 4 8時問に延長された （D. J. Capon et al. , ature, 337:525 (1989)) 0 また抗体の F c領域との融合ポリべプチドにすることによって抗体が持っている エフェクター機能、 即ち捕体依存性細胞障害活性 （D. B. Amos et al.， Transpl antation, 7:220 (1969)) および抗体依存性細胞障害活性 （A. Y. Liu et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 84:3439 (1987)) を誘導できる効果も期待 できる。 更に F c領域を介して 2量体化されるので、 1分子が 2箇所でリガンド に結合できるようになるため、 膜表面や細胞外マトリクスなどの固相上のリガン ドに結合する場合には親和性が見かけ上、 格段に向上する効果も期待できる。 抗体との融合ポリぺプチドを利用する場合には、 融合により分子量が大きくな るので、 元のポリペプチドは分子量が小さいことが望ましい。 何故なら、 分子量 が大きいと遺伝子操作で融合ポリぺプチドを生産する組換え宿主を作成する際に 、 极ぅ DN Aの分子量が大きくなるからである。 一般に導入する DNAの分子量 が大きい程、 宿主への導入効率が悪くなり、 組換え体が得られる頻度が低下する ： また一般に生産させようとする組換えポリペプチドの分子量が大きい程、 産生 量が低くなる傾向がある c 更に固形ガンの治療に利用する場合には、 分子量の大 きいポリペプチドは患部への浸潤性が悪いことが報告されている （D. M. Lane e t al.， Br. J. Cancer, 70:521 (1994)) 。 (C. DeVries et al. , Science, 255:989 (1992)) 。 F LTに関しては、 可溶性 型レセプターの c DNAがクロ一ニングされている （R. し Kendal and K. A. T homas, Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 10705 (1993)) 。 この c DNA によりコ一ドされるポリべプチドは、 F LTの細胞外領域の 7つあるィムノグロ ブリン様ドメインのうち、 第 1〜第 6ィムノグロブリン様ドメインと対応してお り、 本来の F LTと同程度の親和性で VEGFと結合し VEGF活性を阻害した 。 また、 KDRについても遺伝子工学的に発現させた細胞外領域の第 1〜第 6 ド メインが VEGFに結合することが知られている （R. し Kendal et al. , Biche m. Biophys. Res. Commun. , 201:326 (1994)) 。 発明の開示
マウスの抗 VEGF中和モノクローナル抗体は抗腫瘍性を示すことから、 抗ガ ン剤として利用可能であると期待できる。 しかしながら、 マウスの抗体を人に投 与するとマウス抗体に対するヒ ト抗体が産生され、 中和されたりアナフイラキシ —ショックを引き起こしたりする場合がある。 このようなことを回避するために は、 マウス抗体のキメラ化 （S. し Morrison et al. , Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 81:6851 (1989)) ゃヒ ト化を行い、 中和能を損なわないようにしなが らマウス抗体のァミノ酸配列をヒ ト抗体のァミノ酸配列に近づける必要がある。 そのためには高度の技術と知識、 経験、 労力が必要であり、 成果はケースバイケ —スで必ずしも成功するとは限らない。 またこの方法でも 1 00%はヒ ト化でき ない。 他の方法としてはヒ ト抗体そのものを産生する トランスジエニックマウス を用いて免疫する方法があるが （S. Wagner et al. , Nucleic Acid Res. , 22:13 89(1994)) 、 やはり高度の専門的な技術が必要である。
前述のように、 VEG Fレセプターの細胞外領域は、 VEGFに対し特異的に 高親和性で結合し VEGF活性を阻害できるので、 血管新生阻害剤として利用す ることが考えられる。 しかも元々ヒ ト由来のボリペプチドであるために人に投与 第 4ィムノグロブリンドメイン 3 1 2〜407
第 5ィムノグロブリンドメイン 408〜 535
第 6ィムノグロブリンドメイン 536〜 640
第 7ィムノグロブリンドメイン 64 1〜736
更に本発明は、 上記 F LTの細胞外領域と他のタンパク質 （例えば、 ィムノグ ロブリンの F c領域） とが融合したポリべプチドも含む。
これらのペプチドは次のような手順を経て生産することができる。 ヒ ト血管内 皮細胞、 例えばヒ ト臍帯由来血管内皮細胞 （岩城硝子、 森永乳業、 クラボウなど から販売） を培養し酸性フエノール法 （P. Chomzynski and N. Sacchi, Anal. B iochem. , 162:156 (1987)) により全 RNAを抽出し、 オリゴ d Tセルロースに よってポリ （A) ，RNAを調製する。 これを铸型として逆転写酵素とオリゴ d T (1 2〜 16) プライマ一を用いて 1本鎖 c DNAまたは 2本鎖 c DNAを合 成する。 ポリ （A) +RNAの調製法、 c DN Aの調製法については 「J. Sambro ok et al. , Molecular Cloning , Cold Spring Harbor Laboratly Press, 198 9」 に従って行うことができる。 また市販のポリ （A) +RNA調製試薬 （Oligot ex- dT30、 宝酒造製） や c DNA合成キット （ブアルマシアバイオシステム社 製 ) を用いても行うことができる。 既に c DNAライブラリ一からクロ一ユングさ れた f 1 t c DNAがある場合は、 直接、 発現させようとする領域の DNAを適 当な制限酵素で切り出し、 発現ベクターに導入してもよい。
次に得られた c DN Aを踌型として P C R法 （ 「" PCR Protocols" , Academi c Press Inc. , 1990」 参照） により目的部分の D N Aを増幅することができる c 例えば、 以下のようなプライマ一を使用すればよい。 プライマー DNAは DNA 合成機 （アプライ ドバイオシステムズ製、 日本ミリポアリミテッ ド製など） で合 成するか、 カスタム DN Aを注文することができる （サヮディテクノロジ一社） 。 例えば第 1ィムノグロブリン様ドメイン〜第 4ィムノグロブリン様ドメインを コ一ドする c DN Aを得る場合は、 W
5 本発明者らは、 V E G Fを特異的に阻害することにより血管新生を阻害できる ポリぺプチド、 特に V E G Fレセプターの細胞外領域に関するポリぺプチドのう ち分子量が小さいポリべプチドを見いだすことを目的として鋭意努力した。 その 結果、 F L Tの細胞外領域の第 1ィムノグロブリン様ドメインおよび第 2ィムノ グロブリン様ドメインを含むポリぺプチドが V E G Fに特異的かつ高親和性で結 合し、 V E G F活性を阻害できることを見いだした。 なお、 本明細書において 「 ポリペプチド」 とは、 アミノ酸同士がペプチド結合によって共有結合しているも の一般を指し、 長さの制限はないものとする。
本発明のポリぺプチドには、 F L Tの細胞外領域の第 1ィムノグロブリン様ド メインおよび第 2ィムノグロブリン様ドメインのみからなるものの他に、 他のド メインを含んでいるものも含まれる。 例えば、 第 1ィムノグロブリン様ドメイン 〜第 4ィムノグロブリン様ドメインの全てを含むポリぺプチド、 第 1ィムノグロ ブリン様ドメイン〜第 5ィムノグロブリン様ドメインの全てを含むポリべプチド も本発明のポリペプチドに含まれる。 なお、 第 1ィムノグロブリン様ドメイン〜 第 6ィムノグロブリン様ドメインの全てを含むポリぺプチドまたは第 1ィムノグ ロブリン様ドメイン〜第 7ィムノグロブリン様ドメインの全てを含むポリぺプチ ドは、 分子量が大きすぎるので 「組換え D N A技術による発現が行い易く、 患部 への浸潤も速やかである」 という本願発明の効果を充分に奏し得ないものである と考えられ、 本願発明のポリペプチドからは除外される。 なお、 F L Tの各ドメ ィンの境界は明確に区別されるものではないが、 本明細書においては各ドメイン は、 それぞれ、 以下の残基番号のアミノ酸配列を含むドメインと定義される。 [ なお、 残基番号は、 配列番号： 1のものと同じである。 即ち、 成熟 F L Tの N末 端 （配列番号 1の 1位の 「S e r」 ） から数えた残基番号を示す： ]
第 1ィムノグロブリン ドメイン 1〜： 1 1 0
第 2ィムノグロブリン ドメイン 1 1 1〜2 0 8
第 3ィムノグロブリン ドメイン 2 0 9〜 3 1 1 ゲルからの回収、 制限酵素による切断は前述の 「Molecular CloningJ に従って 行うことができる。 また D N Aのゲルからの回収には市販のグラスビーズを利用 したキッ ト （例えば Prep- A- Gene、 バイオラッド社） を使用することができる。 回収した DN A断片は、 X (6)および Y (6)を切断できる制限酵素で断片の両端 を消化し、 フエノール処理により除タンパクを行い、 エタノール沈澱し、 適当な バッファ一、 例えば TE (lOmM Tris-HCl(pH7.5)/l mM EDTA) に溶かす。 同様に して適当な発現べクタ一のクロ一ユング用部位を、 X (6)および Y (6)を切断でき る制限酵素で切断し、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 ベクター DNAを回収す る。 このようにすることによって X (6)および Y (6)切断部位間の小さな断片を除 くことができる。 これらの挿入しょうとする DN A断片および切断したベクタ一 DNAを例えば、 ベクタ一 DN A：挿入 DN A断片の比が 1 ： 5〜： 1 ： 1 0にな るように加え、 T 4 DN Aリガーゼを用いてライゲ一シヨン反応を行う。 ライゲ —シヨン産物を大腸菌コンビテント細胞に加え、 形質転換を行い、 ベクタ一にコ —ドされた選択マ一力一 （例えば、 アンピシリン耐性、 カナマイシン耐性など） に対応する抗生物質を含む培地でまず抗生物質耐性の形質転換体を選択する。 発現べクターに DNA断片が挿入された組換え体は、 抗生物質耐性の各形質転 換体が持つプラスミ ドの制限酵素切断パターンを調べて選択する。 または各形質 転換体を菌体ごと铸型として、 揷入しょうとする DNA断片を増幅したプライマ 一を用いて PC Rすることにより、 目的とする DN A断片が増幅されるか否かで 組換え体かどうか調べることができる。 これらの大腸菌の組換え体を得る一連の 操作は前述の 「Molecular CloningJ に従って行うことができる c
本発明のポリぺプチドを生産させるために様々な宿主を利用することができる = 例 j Escherichia col i , Pseudomonos厲細菌、 Bacillus subtil is, Baci 1 lu s brevis、 Bacillus 1 iqueniformis, Bacillus thuringensisなどのグフム陰性 またはクフム陽性細菌、 Pichia pastoris、 Schizosaccharomyces pombe、 Saccha romises cerevisiaeなどのような酵母、 Aspergillus属のような真菌類、 Sf9 (Sp 上流プライマ一 ： 5' -N (3〜5) X (6) CGTCGCGCTCACCATGGTCAG-3' (配列番号： 2 ) 下流プライマー ： 5' - N (3〜5) Y (6) TTATTCGTAAATCTGGGGTTTCAC-3' (配列番号： 3 ) を用いればよい。
配列中、 Nは A、 C、 G、 Tの何れか、 Xまたは Υは制限酵素認識配列、 括弧 内の数字は塩基数を表す。 具体的には、 N(3〜5 ¾A、 C、 G、 Tの何れかが 3 〜 5個存在することを示し、 X (6)または Υ (6)は、 6塩基を認識する制限酵素の 認識部位を示す。 これらの制限酵素認識配列は、 增幅しょうとする DN Α断片お よびそれを挿入しようとするベクタ一には存在しない配列にすることが望ましい 。 配列番号： 1に記載の塩基配列を参考にして適宜下流プライマ一を設計し、 所 望の C末端をコードする DNA断片を増幅することができる。 また発現ベクター に組み込まれた時には、 ポリべプチドのコ一ディング配列はプロモータ一に対し て順方向に配置していなければならない。 プライマ一配列中、 f 1 t DNA配列 と対応する部分は必ずしも 2 1塩基に限定する必要はなく 1 7〜25塩基程度で もよい。 PCRの条件は前述の 「PCR Protocols」 記載の標準的条件でよいが、 铸 型の量やプライマ一配列によって反応の進み方が異なるので、 効率よく行うため に、 各パラメ一ター （例えば Mg+ +濃度、 アニーリング温度、 延長反応時間、 サ イクル数など） を適宜変更し、 至適化することができる。 PCRに使用する DN Aポリメラーゼは、 T a qポリメラーゼょりプルーフリーデイング （3 ' ェクソ ヌク レア一ゼ） 活性のある P f uポリメラ一ゼ （Stratagene社） か T a qポリメ ラ一ゼに P f uポリメラ一ゼを添加したものを用いた方が、 P CR増幅時の信頼 性 （Fiderity) が増す （W. . Barnes, Proc. Natl. Acad. Sci. し:. S. A. , 91: 2216 (1994)) c
この場合の PCRで増幅しようとする DNA断片は配列が既知なので、 増幅後 ァガロースゲル電気泳動でサイズを確認し、 またゲルより回収して、 適当な制限 酵素で消化し、 その電気泳動パターンを調べることにより目的の DN A断片が得 られたかどうか判断することができる。 ァガロースゲル電気泳動、 DNA断片の る BmNPVの組換えウィルスを作成しカイコに接種することにより、 培養細胞を宿主 とする場合に比べ、 より高い生産性でカイコ体液からポリべプチドが得られるで あろう （河合秀樹、 下群洋一郎、 バイオインダストリ一、 8 : 39 (1991) ) 。 PSV系 べクタ一の組換え体で形質転換したマウスミエローマ細胞を SCIDマウスゃヌ一ド マウスの腹腔に移植し腹水から、 組換えボリぺプチドを回収することも可能であ ろう。 本発明の D N Aを用いたトランスジエニック動物 （G. Wright at al. , Bi o/Technology, 9 : 830 (1991) ) またはトランスジエニック植物 （M. Owen et al. ， Bio/Technology, 10 : 790 (1992) ) を宿主として利用することも可能であろう。 本発明のポリぺプチドを細胞外に分泌させるには、 真核細胞を宿主に用いる場 合は F L Tのシグナルぺプチドコーディング部分をそのまま使用すればよい。 細 菌では使用する宿主の分泌ポリぺプチドのシグナルぺプチドをコ一ドする D N A を利用することができるであろう。 例えば、 大腸菌では外膜タンパク質である om pA、 OmpF、 フォスファタ一ゼである PhoA、 マルトース結合タンパク質である MalB 、 Baci llus属では塩基配列が既知のアミラーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 セ リンプロテアーゼなどのシグナルぺプチドをコ一ドする D N Aを利用することが できる。 また細胞内に発現させる場合には開始コ ドン以外のシグナルペプチドコ —デイング部分を除いて利用すればよい。 細菌の細胞內で外来性のポリべプチド を高発現させた場合にはしばしば封入体の形成が起こるが、 その場合は 8 M尿素 で可溶化後、 数/ g /m 1のポリペプチド濃度まで希釈し透析により徐々に尿素 を除くことで活性の何割かが回収できるであろう。 また、 大腸菌内で、 大腸菌チ ォレドキシンを同時に高発現させることにより、 封入体を生じさせにくくさせる ことも可能である:：
前述のような方法で得られた本発明のポリぺプチドは、 一般的な生化学的方法 により精製することができる。 例えば硫酸アンモニゥム沈澱、 イオン交換クロマ トグラフィー、 ゲル濾過、 疎水性クロマトグラフィーなどを利用することができ る 本発明のポリべァチドはへパリン親和性を有するので、 へパリン樹脂による odoptera frugiperda由来） 、 Sf21、 ΤΝδ (Trichoplusia ni由来） 、 BN4 (Bombyx moli由来） などのような昆虫細胞、 CHO (cninese hamster ovary由来） 、 C O S細胞 （サル腎臓由来） などのようなほ乳類細胞が利用できる。 ベクタ一は宿主 の種によってそれぞれ適したベクタ一を利用すればよい。 最終的な形質転換細胞 を得る前に、 本発明のポリべプチドを生産しょうとする宿主と大腸菌とのシャト ルベクターを用い、 一度大腸菌で組換え DN Aを得るのがより容易であろう。 本 発明のポリぺプチドを生産する組換え宿主を得るための形質転換方法は、 大腸菌 ではコンビテント細胞、 Bacillus属ではコンビテント細胞法 （K. Bott and G. A . Willson, J. Bacteriol. , 94:562 (1967)) 、 プロ トプラス ト法 （M. Mandel a nd A. Higa, J. Mol. Biol. , 53:159(1970)) 、 酵母ではプロ トプラス ト法 （M. Broker et al. , BioTechniques, 5:516 (1987)) 、 昆虫細胞およびほ乳類細胞で はリポフエクチン法 （R. W. alone et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ， 86:6077 (1989)) 、 リン酸カルシウム法 （F. し Graham and A. J. van der E b， Virology, 52:456 (1973)) により行うことができる。 またエレク トロボレ一 シヨン法 （BI0RAD社パンフレッ ト等参照） は前述の全ての細胞に応用可能である 基本的には使用する宿主内で複製可能なプラスミ ドまたはウィルス DNAを用 い、 発現させたい部分をコ一ドする DNAをその宿主内で機能する強力なプロモ 一ターの下流に組入れればよい。 発現させようとする遣伝子に翻訳開始コドンが ない場合にはこれを付加する必要がある。 また原核細胞を宿主に用いる場合はリ ボソ一ム結合配列が （J. R- MacLaughlin et al. , J. Biol. Chem. , 256:11283 (1981)) 必要である。 宿主染色体 DNAの一部を有し、 宿主内で複製できないべ クタ一を用いて宿主染色体と相同組換えを起こさせ、 宿主染色体内にベクターご と組込む方法も利用することができる （特開平 4一 2 780 9 2号公報、 D. J. King et al. , Biochem. J. , 281:317 (1992)) 。 また培養細胞ではなく、 動物ま たは植物固体を宿主とする方法も利用可能である 例えばカイコのウィルスであ —トを作成する。 このプレートは VEG Fを特異的に結合するので、 125 I標識 VEG Fを使用すればゥエルに残る放射活性から結合が確認できる。 本発明のポ リぺプチドを精製するために行ったクロマトグラフィ一の画分と125 I -VEG Fをプレインキュベ一トしてからこのプレートのゥエルに移し、 残る放射活性を 測定する。 その画分に本発明のポリべプチドが存在すればプレインキュベーショ ン中に VEGFに結合し、 プレート上の本発明のポリぺプチドと拮抗してプレー 卜に結合しにくくなることで存在が確認できる。
本発明のポリペプチドは VEG Fに高い親和性 （Kd=5xl0— 11程度） で結合して VEGFが VEGFレセプターに結合することを阻害する。 従って本発明のポリ ぺプチドは低濃度で VEGF活性を阻害することができる。 本発明のポリべプチ ドは V EG F活性を阻害するので V EG F刺激による血管内皮細胞の増殖を阻害 する。 また、 本発明のポリペプチドは VEGFによる血管透過性促進を阻害する 。 更に、 本発明のポリペプチドはインビボで V EG Fによる血管新生を阻害し、 本腫瘍の増殖を阻害する。 図面の簡単な説明
図 1は、 F LT細胞外領域のドメインの構成を表す模式図である。
図 2は、 4 N— F LTを発現する組換えバキュロウィルスの構築過程の概要を 示す図である。
図 3は、 5N—F LTを発現する組換えバキュロウィルスの構築過程の概要を 示す図である。
図 4は、 B 4 Nまたは B 5 N組換えバキュ口ウィルスを感染させた細胞の培養 上清および抽出液のウェスタンプロッ トを示す図である。
図 5は、 4N— F LTまたは 5 N— F LTと VEGF断片との相互作用に関す るスカッチヤ一ド解析を示す図である。
図 6は、 HUVECの VEGF依存性チミジン取り込み促進の EDF 4 N— ァフィ二テイクロマトグラフィ一を利用することができる。 他のポリぺプチドと の融合ポリぺプチドの場合は、 相手のポリぺプチドが有する特性を利用して精製 することが可能である (M. Uhlen et al. , Methods Enzymol. , 185: 129 (1990)) 。 例えば融合ポリぺプチドの相手が抗体の F c領域である場合にはプロテイン A セファロ一スまたはプロテイン Gセファロ一ス （Ε· Harlow and D. Lane, 'Anti bodies", Cold Spring Harbor し aboratoly Press, 1988) 、 グルタチオン卜ランス フェラーゼ （G ST) である場合にはダルタチオンセファロース （D. B. Smith and F. S. Johnson, Gene, 67:31 (1988)) 、 クロラムフエニコ一ルトラン スフ エラーゼである場合にはク口ラムフエニコ一ルセファロ一ス、 ヒスチジンオリゴ マ一である場合には Ni -NTA(nitryltriacetic acid)ァガロースを用いたァフィ 二ティクロマトグラフィー （F. H. Arnold, Bio/Tecnology, 9:151 (1991) ) を 利用することができる。
本発明のポリべプチドを含む画分は本ポリべプチドに反応する抗体を用いた E I Aまたはウェスタン解析によって検出することができる。 本発明のポリぺプチ ドと反応する抗体は、 N末端より 24番目〜 3 0番目にアミノ酸配列に対応する オリゴペプチドを合成し、 牛血清アルブミンまたは KLH (keyhole lymphet hem ocyanine)などのキャリアータンパク質とのコンジュゲイ トを作成しゥサギなどに 標準的な方法で免疫することで得られる （E. Harlow anr D. Lane, "Antibodies ", Cold Spring Harbor Press, 1988) 。 また本発明ポリペプチドと他のポリぺプ チドとの融合ポリぺプチドを大腸菌で生産し、 前述のように融合相手のポリぺプ チドの特性を利用して精製して免疫原として用いても本発明のポリべプチドに反 応する抗体は得られる。
本発明のポリべプチドは VEG Fに結合するので、 その活性を指標として精製 することもできる- 例えば E I A用に抗体固相化プレートを調製するのと同様の 要領で、 精製前の本発明のポリペプチドを含む溶液を適当に希釈し、 9 6穴のボ リスチレン製マイクロタイタ一プレートをコ一トしてブロッキング処理したプレ G) F c融合タンパク質の V EG F阻害活性を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
. 第 1〜第 4ィムノグロブリン様ドメインおよび第 1〜第 5ィムノグロブリ ン様ドメインからなるポリぺプチドに関する実施例
[実施例 1] F LT細胞外領域を発現する組換えバキュロウィルスの作成 1 ) F LTの第 1〜第 4ィムノグロブリン様ドメインを発現する組換えウィル スの作成
基本的にはサンブルック （J. Sambrook) らの 「Molecular CloningJ に記載さ れた方法に従い図 2に示す手順でベクターの構築を行った。 F LTの第 1〜第 4 ィムノグロブリン様ドメインを発現する組換えウィルスを得るために、 プラスミ ド p f 1 t 3— 7 (M. Shibuya et al. , Oncogene, 5:519 (1990)) の DNAを 制限酵素 E c o R Iおよび N d e Iで消化し、 ァガロースゲル電気泳動により分 離した約 1. 6 k b pの E c o R I - Nd e l DNA断片を調製した。 一方プラ スミ ド pME 1 8 S N e oの DNAを制限酵素 E c o R Iおよび X h o Iで消化 し、 ァガロースゲル電気泳動により分離した約 5. 5 k b pの E c o R I—Xh o 1 DNA断片を調製した。 Nd e l末端を X h o 1末端に変換するためにァダ プタ一として、 「5' TATTAATGATCTAGATGAC 3'」 （配列番号： 4) と 「5' TCGAGTCA TTCTAGATCATTAA 3' J (配列番号： 5) のオリゴヌクレオチドを室温で混合し、 更 に前記 「1 , 6 k b pの E c o R I - Nd e l DNA断片」 と 「5. 5 k b pの E c o R I—Xh o I DNA断片」 とを混合して T 4 D N Aリガーゼを用いて連結 反応を行い、 大腸菌に導入した。 得られた組換えプラスミ ド DNAを E c o R I および N o t Iで消化し、 得られた 1. 6 k b pの DN A断片を回収し、 pVL 1 3 93 (PharMingen社） の E c o R I /N o t I部位に導入した。 このプラス ミ ド DNAを精製し、 ボヘドリンコード領域を欠失したバキュロウィルス DNA である BaculoGold (PharMingen社） を用いてマニュアルに従って組換えウィルス F LTまたは EDF厶 1 1発現培養上清による阻害を示す図である。
図 7は、 EDFまたは EDFA 1 1を発現する組換えバキュロウィルスを感染 させた細胞と125 I—VEGF,:,との共有結合架橋産物の電気泳動後のォ一トラ ジオフラフィ一を示す図である。
図 8は、 EDFまたは EDFA 1 1 と V E G F断片との相互作用に関するスカ ツチヤード解析を示す図である。
図 9は、 EDFA 1 1の精製過程の VEG Fァフィ二テイク口マトグラムと各 フラクションの電気泳動パターンを示す図である。
図 1 0は、 精製 EDF Δ 1 1の電気泳動パターンとウェスタン解析を示す図で ある。
図 1 1は、 ヒ トイムノグロブリン I g。！の？ c領域の模式図と、 単離するのに 用いたプライマーの位置の対応を示す図である。
図 1 2は、 PCRで増幅 '精製した DN Aと制限酵素切断した組換えプラスミ ドのァガロースゲル電気泳動パターンを示す図である。
図 1 3は、 P CRで増幅 ·精製した DNAのァガロースゲル電気泳動パターン を示す図である。
図 1 4は、 各 DNA断片の単離から F LT第 1〜第 2—ヒ ト I gG】- F c発現 組換えプラスミ ド構築までの過程の概略を示す図である。
図 1 5は、 組換え大腸菌粗抽出液の抗ヒ ト I g G,- F cモノクローナル抗体に よるウェスタンブロッ トを示す図である。
図 ] 6は、 組換え大腸菌粗抽出液と I :£ I一 VEG F 155の共有結合架橋産物の SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動バタ一ンを示す図である =
図 1 7は、 組換え大腸菌抽出液の F LT第 1〜第 2ィムノグロブリン様ドメイ ン一ヒ ト I gG, F c融合タンパク質の 1 :5 I—V EG F の結合のスカツチヤー ド解析を示す図である。
図 1 8は、 部分精製 F LT第 1〜第 2ィムノグロブリン様ドメインーヒ 卜 I g 感染させ培養上清を回収した。 このサンプルを SDS—ポリアクリルアミ ドゲル 電気泳動しウェスタンブロッティングを行った。 1次抗体にゥサギ抗 F LT細胞 外領域ポリクロ一ナル抗体を用い、 2次抗体としてアル力リフォスファターゼ摞 識抗ゥサギ I gG使用し、 NTB (Nitroblue tetazolium chrolide)/ B C I P (5- Bromo - 4 - chrolo - 3- indolylphosphate p-toluidine salt) (Gibco BRL製) で発 色させた。 その結果この抗体との特異的な反応性が確認された （図 4) 。 レーン 1は B 4 N感染細胞培養上清 2 μ 1、 レーン 2は Β 4 Ν感染細胞抽出液 10 μ 1 、 レーン 3は Β 5 Ν感染細胞培養上清 2 μ 1、 レーン 4は Β 5 Ν感染細胞抽出液 1 0 ^ 1 を泳動したものである。 免疫化学的に反応したバンドの移動度は予想さ れる分子量と一致した。 以後これらの産物を 「4 N—F LT」 および 「5N— F LT」 と称する。 また培養上清サンプル中におよそ 2 μ g/m 1の 「4N_F L T J または 「5N—F LT」 が含まれていると判定された。
[実施例 3 ] 発現産物の V E G Fとの親和性
H i F i V e細胞に組換えウィルス 「B 4 N」 または 「B 5 N」 を感染させ、 得られた培養上清を PBSで 4倍に希釈しマイクロタイタ一プレート （ 「ィム口 ン 2」 ダイナテック社製） のゥエルに 1 00 μ 1入れ 4°Cで一夜置き、 ゥエルか ら除去した。 ゥエルを PBS— 0. 1 <½B S Aで 3回洗浄し、 次に P B S— 1。/0 83 を250 //1入れ、 室温で 2時間放置しブロッキングした。 ゥエルの中の 液を捨て、 1 00 μ 1中に比活性 66,000cpm/ngの125 I— VEG F 165 (VEGF の N末端から 1 65番目までの残基からなるペプチド Zアマシャム社製） 20280c pmに非標識の V E G F： , を 0〜15000pg混合した溶液を入れ室温で 3時間放置した 。 ゥエルの中の液を捨て P B S— 0 · 1 %B S Aで 3回洗浄し、 各ゥエルに残つ た放射活性をを yカウンターで測定しスカツチャード解析を行った （図 5) 。 図 5A、 Bはそれぞれ 「B 4N」 「B 5 N」 発現培養上清をコートしたプレートを 用いた結果である。 この時にコントロールウィルス感染 S f 9細胞の培養上清で コートしたプレー卜にはに5 I一 V EG Fi はほとんど結合しないので、 結合放 を得た。 この組換えバキュロウィルスを 「B 4 N」 と名付けた。 組換えバキュ口 ウィルス 「B 4 N」 を S f 9細胞を用いてマニュアルに従って増幅し、 以降の実 験に使用した。 なお、 「B4 N」 は F LTの N末端から 4 5 7残基までのァミノ 酸配列をコードする DN Aを含んでいる。
2) F LTの第 1〜第 5ィムノグロブリン様ドメインを発現する組換えウィル スの作成
基本的にはサンブルック （ Sambrook) らの 「Molecular CloningJ に記載さ れた方法に従い図 3に示す手順でベクタ一の構築を行った。 プラスミ ド p f 1 t 3— 7 DN Aを E c o R Iおよび H i n d IIIで切断し、 1. 9 k b pの E c o R I -H i n d IIIDNA断片を調製した。 H i n d III末端を X h o Iに変換す るためにアダプタ一として、 オリゴヌクレオチド 「5' AGCTTTTAATGATCTAGAATGAC 3'」 （配列番号： 6) と 「5' TCGAGTCATTCTAGATCATT A 3'」 （配列番号： 7) と を混合して加え、 前述のプラスミ ド pME 1 8 S N e oの 5. 5 k b pの E c o R I — Xh o l DNA断片と連結し、 これを用いて大腸菌を形質転換し、 組換 えプラスミ ドを得た。 得られた組換えプラスミ ド DNAを E c o R Iおよび N o t Iで消化し、 得られた 1. 9 k b pの DNA断片を回収し、 p VL 1 3 9 3 ( PharMingen社） の£。
Figure imgf000017_0001
1 ^0 1 I部位に導入した。 このプラスミ ド DN A を精製し、 ポへドリンコード領域を欠失したバキュロウィルス DN Aである Bacu loGold (PharMingen社） を用いてマニュアルに従って組換えウィルスを得た。 こ の組換えバキュロウィルスを 「B 5 N」 と名付けた。 組換えバキュロウィルス 「 B 5 N」 を S f 9細胞を用いてマニュアルに従って増幅し、 以降の実験に使用し た。 なお、 「B 5 N」 は F LTの N末端から 5 6 0残基までのアミノ酸配列をコ ―ドする DNAを含んでいる。
[実施例 2 ] 発現産物の免疫化学的解析
昆虫細胞 H i F i V e (Invitrogen Corp.製） を E x C e 1 1 4 0 0培地 （岩 城硝子社製） で培養し、 組換えバキュロウィルス 「B 4 N」 または 「B 5 N」 を 害効果を調べた。 ラッ トの肝臓より記載の方法で類洞壁內皮細胞を調製し、 24 穴プレー卜に 1 04 ウエルで撒き、 表 2に示したサンプル存在下で 4日間培 養 し、 ゥエル内の細胞数を測定した。 表 2の細胞数の欄の数値は撒いた直後の細胞 数を 1 0 0と表した時の相対値である。 「4 N— F LT」 「5 N— F LT」 のサ ンプルはそれぞれの組換えウィルス感染 H i F i V e培養上清を使用し、 含有量 はウェスタン解析の結果を元に算出した。 この結果から 「4 N—F LT」 および 「5 N— F LT」 は V EG Fの内皮細胞増殖活性を投与量依存的に阻害すること 力ゎカ る。
表 2
「4 N-F LT」 および 「5 N— F LT」 のラッ ト肝類洞壁内皮細胞の
VEGF依存性増殖阻害活性
VEG F濃度 4 N— F LT濃度 5 N— F LT濃度 細胞数
(n g X m 1 ) ( n g / m 1 ) ( n g /m 1；
0 0 0 0 1 0 0 260
40 0 4 0
1 1 00 0 44 1 0 4 0 2 7 1 0 1 00 2 8 3 0 0 300 3 4 0 0 1 9 1 3 1 00 0 6 9 3 0 4 0 22 1 3 0 1 00 8 3 射活性は挿入遺伝子からの発現産物への 125 I— V E G F , 65の結合であると考え られる。 「B4N」 または 「B 5N」 感染細胞の培養上清中の発現産物の V EG F165に対する親和性は共に Kd (解離定数） がおよそ 3〜4. 5 X 1 0 ''1であ り F LT (J. Waltenberger, et al. , J. Biol. Chem.， 269:26988 (1994)) また は可溶性型 FLT (R. し Kendal and K. A. Thomas, Proc. Natl. , Acad. Sci. ， U. S. A., 90:10705 (1993)) について報告されている値に近かった。
[実施例 4] 発現産物による V EG Fの生物活性の阻害
1) VEGFの透過性促進活性の阻害
V EG Fの透過性促進活性に対する 「4N— F LT」 または 「5N— F LT」 の阻害効果を調べた。 モルモッ 卜の心臓内に 0. 5m 1の 1。/。エバンスブル一色 素液を注入し、 30分後に VEG Fと共に 0. 2m lの 「4N— F LT」 または 「5N— F LT」 発現培養上清を剃毛した皮下に注入し、 更に 30分後に色素の 漏出を観察した （表 1) 。 この結果から 「4N—F LT」 および 「5N— FLT 」 は VEGFの透過性促進活性を阻害することが明らかになった。
表 1
4 N— F LTおよび 5 N— F L Tの V E G F透過性促進活性対する阻害効果 サンプル 色素漏出 （相対値）
P B S 0 %
10 ng VEGF/0.2 ml 1 00 %
10 ng VEGF+Ca.400 ng 4N-FLT/0.2 ml 5 %
10 ng VEGF+Ca.400 ng 5N-FLT/0.2 ml く 5 %
2) ラッ 卜類洞壁内皮細胞の VEG F依存性増殖の阻害
V EG F依存性の増殖に対する 「4 N— F L丁」 または 「5 N—F LT」 の阻 表 3 反応液組成 （ 1 0 0 / 1 中） P C Rの反応条件
10 μ 1 Taq buffer (P ega社製） 1) 9 5°C 1分を 1サイクル
2.5 mM MgCl2 2) 9 4。C 1分、 5 6 、 1分、
4 μ 1 HUVEC c匪 7 2°C 2. 5分を 3 4サイクル 各 0.1 mM dNTPs 3) 7 2°C 7分を 1サイクル
200 nM プライマ一 1
200 nM プライマー 2
2.5 U Taq ポリメラ一ゼ （Promega社製) プライマ一配列は、 以下の通りである。
プライマー 1 5' -CTCGGATCCGGATCTAGTTCAGGTTCAAAA-3' (配列番号： 8 ) プライマ一 2: 5' -CTCGAATTCACTCCAGATTAGACTTGTCCGA-3' (配列番号： 9)
「プライマ一 1」 の下線部は成熟 F LTの N末端コーディング配列に、 「ブラ イマ一 2」 の下線部は、 F LT細胞外領域 C末端コーディング配列に対応する。 反応液 2 00 \ をミネラルオイルを除くために等量のク口ロフオルムで処理 し、 水層を回収し、 1 0 %S D Sを 4 μ 1添カ卩し、 6 0°Cで 5分間保温した。 こ の溶液を等量の TE飽和フエノールで処理した水層を回収し、 エタノール沈澱し DNA断片を回収した:： 乾燥した沈澱を 3 0 μ 1 の Τ Εに溶解し、 ァガ口一スゲ ル電気泳動にかけた。 およそ 2. 2 k b ρの DNA断片を切り出し、 「Prep- A - G enej (BI0RAD製） を使用しマニュアルに従い D N Aを回収した。 回収した DNA 断片を HincII HindIII Hhalまたは Pstlで消化し、 切断パターンが F L T細胞外 領域コーディング DN Aの塩基配列から予想されるパターンと一致することを確 認した。 次にこの DN A断片を EcoRIおよび BamHIで消化し、 その反応液を等量の I I . 第 1〜第 2ィムノグロブリン様ドメインからなるポリペプチドに関する 実施例
[実施例 5] F LT細胞外領域 （E D F) と反応するポリクローナル抗体の作 成
1 ) ヒ ト臍帯由来血管内皮細胞 （HUVE C) c DNAの調製
HUVE C (クラボウ製） 約 1 X 1 07個の細胞に 1 m lの I S OG EN (和 光純薬工業製） を加えぺッスルで細胞を破砕し更に 9 m 1 の I S OG E Nを加え 5分間振とうした。 この溶液に 1 m 1のクロロフオルムを添加し 1分間振とうし 、 1 0， 0 0 0 r p mで 1 0分間遠心し、 上清液を回収し、 1 1 0容の 3 M齚 酸ナトリウム （p H 5. 2) を添加して混合し更に 2. 5容のエタノールを添加 した。 遠心して沈澱を回収し、 7 5 %エタノールで沈澱を洗浄し乾燥して 1 0 0 μ 1 の加熱滅菌した純水に溶解した。 1 0 2 μ gの RNAが得られた。 この溶液 に 1 0 % S D Sを 1 μ 1添加し 1 0 0 μ 1 の 「01igotex-dT30 (宝酒造製） 」 を添 加し 6 5°Cで 5分間保温した後、 氷中にて急冷した。 この溶液に 2 0 1の 5M 塩化ナトリウムを混合し 3 7°Cで 1 0分問保温した。 この懸濁液を 1 5， 0 0 0 r 111で1 5分間遠心し、 沈澱を 1 0 0 // 1 の加熱滅菌した純水に懸濁し 6 5 °C で 5分間保温した。 この懸濁液を 1 5， O O O r p mで 1 5分問遠心した上清を 回収してエタノール沈澱を行った。 乾燥した沈澱を 2 0 /1 1 の加熱滅菌した純水 に溶解し、 HUVE Cポリ （A) +RNAとした。 以下この溶液を用いフアルマシ ァの c DNA合成キッ トを用い、 マニュアルに従ってオリゴ d Tでプライミング された HUV E C 2重鎖 c DNA溶液1 0 0 μ 1 を得た c
2) F LT細胞外領域 （E D F) コ一デイング DNAのクローニング
1 ) で得た HUV E C由来 c DNAを铸型として、 以下の条件で P C Rを行つ た。 なるように添カ卩し、 更に 20時間培養した。 遠心して細胞を回収し、 グルタチォ ンセファロ一ス （フアルマシアバイオシステム） を用いてマニュアルに記載され た方法に従って、 純度 60%程度の G S T— EDF融合ポリペプチドを約 7. 1 mg調製した。 レムリ法で SDS—ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動した結果、 この融合ポリペプチドは分子量 60, 000であり、 03丁の分子量28， 00 0を差し引くと融合ポリペプチドの相手の分子量は 32， 000程度である。 グ ルタチオンセファロ一スに結合することから G S T部分はほとんど分解していな いと考えられるので、 EDFの N末端側が分子量 32， 000程度残り、 EDF の後半部が欠失していると考えられた。
4) G ST— EDF融合ポリペプチドに対する抗体の調製
上記 3) で調製した GST— EDF融合ポリペプチドをフロイントコンプリ一 トアジュバントと混合し、 ゥサギ 1羽につき GST— EDF融合ポリぺプチドを 初回 200 μ g、 以後 2週間ごとに 1 00 // gずつ、 7回皮下に免疫した。 抗原 をコートしたプレートによって力価測定を行った結果、 血清を 64, 000倍以 上希釈しても十分な免疫反応があった。 ゥサギ 2羽の血清から 「E. Harlow and D. Lane」 の 「Antibodies」 に記載された方法に従い、 1 50mgの I g G画分 を得た。
[実施例 6] EDFおよびその部分断片を発現する組換えバキュ口ウィルスの 作成
1 ) EDFおよびその部分断片を発現する組換えバキュロウィルスの作成用組 換えトランスファ一ベクターの構築
プラスミ ド p f 1 t 3 - 7 (M. Shibuya et al. , Oncogene, 5:519 (1990)) を 踌型として以下の条件で PC Rを行った: TE飽和フエノールで処理し、 水層から 「Prep - A - Gene」 を用いて EcoRI、 BamHI消 化 DNA断片を回収した。 同様にプラスミ ドベクター p GEX 2 T (フアルマシ ァバイオシステム製） 1 gを EcoRIおよび BamHIで消化し、 その反応液を等量の TE飽和フエノールで処理し、 その水層から 「Prep- A~Gene」 を用いて EcoRI、 Ba mHI消化 p GEX 2TDNAを回収した。
このようにして得られた DNA断片とプラスミ ド DNAを 1 0 : 1のモル比で 混合し、 ライゲーシヨン （ライゲーシヨンキット、 宝酒造製） を行った。 このラ ィゲ一シヨン溶液を用いて大腸菌 J Ml 09のコンビテントセル （宝酒造製） を 形質転換し、 75 / g/m 1のアンピシリンを含む 2 XTY培地 （1 1中 1 6 g トリプトン、 1 0 g酵母エキス、 5 g塩化ナトリ ウム、 1. 5 g寒天） にプレ一 ティングし 37°Cで一夜培養した。 出現するアンピシリン耐性コロニーを爪楊枝 で突き、 前述の PCR反応液から铸型を除いた溶液 1 5 μ 1 に移し、 サイクル数 を 30回にして前述と同様に PCRを行った。 PCR後の反応液をァガロースゲ ル電気泳動し、 2. 2 k b ρのバンドを与えるコロニ一から更にシングルコロニ —を単離し、 少量の培養液からプラスミ ド DNAを調製した。 （ 「J. Sambrook, et al. , Molecular し loning , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989」 の 方法に従った。 ） これらのプラスミ ド DNAを BamHIおよび EcoRIで消化し、 2. 2 k b pの DNA断片が生じることを確認した。 これらのプラスミ ド DNAの一 つを前記 「primerl」 または 「primer2」 を用いて配列決定を行い （ 「丄 Sambroo k, et al. , "Molecular Cloning , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 」 の方法に従った） 、 上流および下流から約 1 50塩基の配列を調べたところ、 F LT細胞外領域 （EDF) コーディング DN Aの塩基配列と一致した c
3) G S T— EDF融合ボリペプチドの調製
前述の塩基配列の一部を確認したブラスミ ドを有する大腸菌クローンを 500 m 1の 50 μ g/m 1アンピシリンを含む 2 XT Y培地で、 30 Cで振とう培養 を行い、 波長 600 n mの吸光度が 1. 0に達した時に I P T Gを 0. I mMと 表 5 反応液組成 （ 1 00 1 中） ： 反応条件
10/ 1 Pfu buf fer#l (Stratagene) 1) 95°C 1分 3サイクル
1 μ g p c/ SV 55。C 1分
0.1 mM dNTPs 75。C 0. 5分
200 nM プライマ一 5 2) 94 °C 1分 30サイクル
200 nM プライマ一 6 55。C 1分
5 U Pfu polymerase (Stratagene) 75°C 0. 5分
3) 75°C 5分 1サイクル 上記反応に用いたプライマ一配列は、 以下の通りである。
プライマ一 5： 5' -CACCACCACCACCACCACTAACTAGAGCTCGCTGATC-3' (配列番号： 1 2) プライマ一 6:5'- TTCTCGAATTCTCCCCAGCATGCCTGC- 3' (配列番号： 1 3)
「プライマー 5」 「プライマ一 6」 の下線部は、 pRc/RSVのゥシ成長ホルモン 遺伝子由来のポリアデニレ一ションシグナルの前後に対応する。
得られた各々の反応液 200 1を等量のクロロフオルムで処理し、 水層を回収 し、 0.5%SDS、0.1M Tris-HCl(pH6.8)、 5 mM EDTA、 200μ g/mlプロテネース K (p roteinase K) となるように各試薬を添加し、 37 °Cで 30分間保温した。 これら の溶液を TE飽和フエノールで処理し、 水層をエタノール沈澱し、 EDFをコー ドする D N A断片およびポリアデニレーシヨンシグナルを含む D N Aを T Eに溶 解した。 これらの DN A溶液をァガロースゲル電気泳動にかけ、 各々から 2. 2 k b p、 0. 3 k b pの DN A断片を回収し、 各々 50 μ 1の T E溶液とした :ί 次 にこれらの DNA断片を PCRにより融合させる （R. Higuchi, "PCR Protocols "， Academic Press Inc. , 177 (1990)参照） ために以下の条件で P C Rを行った： 表 4 反応液組成 （ 1 0 0 1中） ： 反応条件
10 μ 1 Pfu buffer#l (Stratagene社製） 1) 9 5。C 1分 3サイクル
1 μ g pflt3-7 5 5。C 1分
0.1 mM dNTPs 7 5 °C 2. 5分
200 nM プライマ一 3 2) 9 4 °C 1分 3 0サイクル
200 nM プライマ一 4 5 5°C 1分
5 U Pfu polymerase (Stratagene社製) 7 5 °C 2. 5分
3) 7 5°C 5分 1サイクル 上記反応に用いたプライマ一配列は、 以下の通りである。
プライマ— 3:5' -TTTCTCGGATCCTATAAATATGGTCAGCTACTGGGACACC-3' (配列番号： 1 0)
プライマ一 4: 5' -GTGGTGGTGGTGGTGGTGACGCTCCAGATTAGACTTGTCCGA-3' (配列番号： 1 1 )
「プライマ一 3」 の下線部は成熟 F LTの N末端コーディング配列に、 「ブラ イマ一 4」 の下線部は、 F LT細胞外領域 C末端コーディング配列に対応する。 またポリアデニレーシヨンシグナルを含む DN A断片を得るために、 プラスミ ド p R c ZR S V (Invitrogen corp.製） を铸型として牛成長ホルモン遺伝子由 来のボリアデ二レ一シヨンシグナルを含む DN A (0. 3 k b p ) を得るために 以下の条件で P C Rを行った。 に記載したのと同様の方法で組換えブラスミ ドを有するクローンを 6種選択した
。 各クローンの 3m 1の培養液からアルカリ法でプラスミ ド DN Aを調製し、 塩 基配列の決定を行い、 挿入断片の上流約 300塩基と下流約 500塩基を調べた ところ正しい配列は 2種類のクローン由来のプラスミ ドであった。 これらのプラ スミ ドを 「p EDFH 1 0」 および 「p EDFH l 1」 と名付けた。 これらのプ ラスミ ドを持つ大腸菌を 50 μ g/m 1のアンピシリンを含む 1 0 Om 1の 2 X TY培地で 37°Cで 1夜培養し、 回収した菌体からアルカリ法 （ 「J. Sambrook, et al. , "Molecular Cloning , Cola Spring Harbor Laboratory Press, 1989 J の 記載に従う） でプラスミ ド DNAを抽出し、 マニュアルに従ってイオン交換カラ ム （Diagen GimbH、 QIAGEN社製） で精製し、 各々 200 μ 1の T Eに溶解した約 1 00 gのプラスミ ド DNAを得た。
2) EDFおよびその部分断片を発現する組換えバキュロウィルスの作成 TMN— FH培地 （PharMingen社製） で培養した 80 %コンフルエンシーの状 態の S f 9細胞 （Invitrogen Corp.社製） をピペッティングで剥し、 2 x 1 06 個の細胞を直径 6 Ommのディッシュに撒き 30分放置して表面に吸着させた後 、 培地を無血清培地である E X— C e 1 1 400 (岩城硝子製） 2m l に置換し た。 「p EDFH 1 0 J または 「p EDFH l l」 を 8 μ1 ( 4 μ g) 、 欠失バキ ュロウィ/レス DNA (BaculoGold, PharMingen社製） 2 μ 1 (40 n g ) を 1 6 1中に混合した溶液と、 リボフヱクチンを滅菌純水で 2倍希釈した溶液 1 6 μ 1と を混合し 1 5分放置した後、 全量 32 μΐを前述のディッシュに添加し混合した。 このディッシュを湿潤箱に入れ 27 °Cで 6時間 30 r p mで振とう培養した後、 培地を 2. 5m 1の TMN— FHに置換し 27 Cで 5日間諍置培養した。 培地を 回収し遠心した上清をオリジナルウィルスス トック （それぞれ 「BEDFH 1 0 」 、 「BEDFH 1 1」 と称する） とした c 「Invitrogen corp.」 のマニュアル に従いプラークアツセィを行った結果、 これらのウィルスタイタ一は共におよそ 3 X 1 0 sであった。 各々のウィルスについて 2クローンずつ （ 「B E D F H 1 表 6 反応液組成 （ 1 0 0 μ 1中） 反応条件
1 μ 1 Pfu buffer #1 (Stratagene) 1) 9 5°C 1分 3サイクル 4/ 1 EDF coding DNA 5 8。C 1分
0.2δ μ 1 poly A signal DNA 7 5 °C 0. 5分
0. 1 mM dNTPs 2) 9 4 °C 1分 3 0サイクル 200 nM プライマ一 3 5 5。C 1分
200 nM プライマ一 6 7 5°C 0. 5分 1サイクル 5 U Pfu polymerase (Stratagene) 3) 7 5 °C 5分 得られた反応液 200μ 1を等量のクロロフオルムで処理し、 水層を回収し、 0.5 %SDS、0. 1M Tris-HCl (pH6.8) , 5 mM EDTA、 200 μ g/mlプロテネース Kとなるよう に各試薬を添加し、 3 7 °Cで 3 0分間保温した。 この溶液を T E飽和フヱノール で処理し、 水層をエタノール沈澱し、 D NAを T Eに溶解した。 この DNA溶液 をァガロースゲル電気泳動にかけ、 E D Fをコードする DNA断片とポリアデニ レ一ションシグナルを含む DN A断片が融合したと考えられる 2. 5 k b pの D NA断片を回収し 5 0 μ 1の T E溶液として調製した。 この DNA断片の両端を B amHIおよび EcoRIで消化した DN A断片を調製した。 一方組換えバキュ口ウィルス 用トランスファ一ベクターであるプラスミ ド p V L 1 3 9 3 (PharMingen社） の 1 μ gを BamHIおよび EcoRIで切断したものを実施例 5の 2) に記載したのと同様 の方法で調製した： このプラスミ ド D N Aとプラスミ ド p f 1 t 3 — 7から P C Rにより増幅した E D Fをコードする D N A断片を BamHIおよび EcoRIで消化した D NA断片をモル比およそ 1 ： 5で混合し、 ライゲ一シヨンキッ ト （宝酒造製） で処理し、 大腸菌 J M 1 0 9のコンビテン トセルに形質転換し、 実施例 5の 2 ) であるので、 それぞれの共有結合架橋産物の分子量から差し引くと、 1 1 0, 0 00と 30， 000である。 このことから 「BEDFH 1 0」 感染細胞は EDF の全長を生産しており 「BEDFH 1 1」 感染細胞は EDFの断片を発現してい ると考えられた。 「BEDFH 1 1」 から発現される EDFの断片を 「EDFA 1 1」 と名付けた。
2) V E G Fとの親和性
S f 9細胞に組換えウィルス 「BEDFH 1 0」 または 「BEDFH 1 1J を m.o. i. 5で感染させ、 7日間培養した培養上清をマイクロタイタープレート （ィ ムロン 2、 ダイナテック社製） のゥエルに 1 00 μ 1入れ 4。Cで一夜置いた。 そ の後ゥエルの中の液を捨て、 PBS— 0. 1 %B S Aで 3回洗浄し、 次に P B S 一 1 %B SAを 250 1入れ、 室温で 2時間放置しブロッキングした。 ゥェルの 中の液を捨て、 1 00 /i 1中に比活性 78,000cpm/ngの125 I— VEGF165 (アマシ ャム社製） 1 1 300 c 111に非標識の £〇？165を0〜1 2500 p g混合し た溶液を入れ室温で 3時間放置した。 ゥヱルの中の液を捨て PBS— 0. 1 %B S Aで 3回洗浄し、 各ゥエルに残った放射活性を yカウンタ一で測定しスカツチ ヤード解析を行った （図 8) 。 図 8A、 Bはそれぞれ EDFまたは 「EDF厶 1 1 j の発現培養上清をコートしたプレートを用いた結果である。 この時にコント ロールウィルス感染 S f 9細胞の培養上清でコートしたプレ一トには125 I - VE GF 165がほとんど結合しないので、 結合放射活性は挿入遺伝子からの発現産物へ の125 I— V EG F> の結合であると考えられる。 「BEDFH 1 0」 または 「 BEDFH 1 1 j 感染細胞の培養上清中の発現産物の V EG F に対する親和性 は共に Kd (解離定数） がおよそ 5 X 1 0— i ;であり F LT (J. Waltenberger, et al. , J. Biol. Chem. , 269:26988 (1994)) または可溶性型 F LT (R. し Ke ndal and K. Λ. Thomas, Pro atl. , Acad. Sci. , U. S. A. , 90: 10705 (1993 )) について報告されている値に近かった c
3) 組換えトランスファ一ベクタ一への挿入 DN Aの塩基配列解析 OJ からは 「BEDFH 10 1」 「BEDFH 1 02」 、 「BEDFH l l J 力 らは 「BEDFH 1 1 1」 「BEDFH 1 1 2」 ） プラーク単離を行い、 Invitr ogen corp. のマニュアルに従って 4段階に増幅したウィルス溶液約 200 m 1 ( タイタ一はおよそ 5 X 1 0 Vm 1 ) を得た。
[実施例 7] 組換えウィルス感染 S f 9細胞発現産物の解析
1) 125 I— VEGF1 :1との共有結合架橋産物
上記の組換えウィルスを m.o. i.0. 3 (m.o. i.とはウィルス粒子：細胞数の比 のこと） で感染させた S f 9細胞 2 X 1 05に、 125 I— VEGF12】 (150, OOOcp m/ng) を 1 80， O O O c p m添加し、 Ι Ο Ο μ Ιの PBS— 0. 10/0BSA中 で室温で 1時間置いた。 遠心により 2回、 同バッファ一で洗浄し、 再度 1 00 1の PB S— 0. 1 %BSAに懸濁した。 この溶液に 50 mMジサクシニルスべ レ一卜 (disuccinylsuDerate)Zンメチノレスノレホチシ卜 (dimethyisulfoxide)を 1 / 1 0容混合し室温で 40分間置いた後、 1M T s- HCl(pH6.8)を 1 Z 1 0容混合し た。 このサンプルをレムリ法で還元条件で SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気 泳動を行った後、 オートラジオグラフィによりシグナルを検出した （図 7) 。 プ ラスミ ド 「p EDFH l 0」 を用いて作成した組換えウィルスである 「BEDF H 1 0」 から分離した 2クローンの感染細胞では、 分子量 1 30, 000の共有 結合架橋産物が検出できた （図 7A、 レーン 1、 2) のに対して、 プラスミ ド 「 p EDFH 1 1」 を用いて作成した組換えウィルスである 「BEDFH 1 1」 か ら分離した 2クローンの感染細胞では分子量 50， 000の共有結合架橋産物が 観察された （図 7A、 レーン 3、 4) 。 一方、 EDFをコードする DNAをブロ モータ一とは逆向きに挿入した組換えトランスファ一ベクタ一を用いて作成した コン トロールウィルス感染細胞では共有結合架橋産物は検出できなかった。 図 7 Bのレーン 1はコン トロールウィルス感染細胞を使用し、 レーン 2は 「BEDF H l l」 感染細胞を使用し、 レーン 3はレーン 2の反応に 2 1 4倍の非標識 VE G Fを添加したサンアルである。 VEGF ：モノマ一の分子量が 20， 00 0 て精製 EDFサンプルとした。 「BEDFH 1 1」 感染細胞の培養上清は 0. 3 Mになるよう N a C 1 を添加して F P L C (フアルマシアバイオシステム製） で へパリンカラム （フアルマシアバイオシステム製） を用いて分画した。 サンプル 負荷のあと 0, 1 Mリン酸バッファー （p H 7 · 0) — 0. 3M Na C lで 2
80 nmの吸光度が +分下がるまで洗浄し、 0. 3— 1. OM Na C lのリニ アグラディェン卜で溶出した。 280 n mの吸収がある画分を回収し V EG Fァ フィニテイクロマトグラフィ一を行った。 P B Sでサンプルを 2倍に希釈して、
1. 4mgの VEGFをセファロ一ス 4 Bに共有結合したカラム 0. 4 m 1に負 荷した。 20m lの PBS— 0. 5M N a C 1でカラムを洗浄し、 1 0 mM酢 酸ナトリウム （pH4. 0) で、 0. 05m 1の 2M Tris- HC1(PH8.0)を入れた チューブに 0. 5m 1ノチューブで溶出した。 各フラクションをレムリ法で SD S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動後、 銀染色した （図 9A、 レーン番号はフ ラクション番号と一致） 。 また各フラクションを P B S— 0. 1 % B S Aで 1 0 倍希釈して、 等容の125 I — VEGF"5と混合し、 1時間後に 1 00 の混合液 を実施例 3の 2) で使用したマイクロタイタープレートで VEGFの 結合を調べ た。 その結果、 電気泳動で共有結合架橋実験での予想とほぼ一致する分子量 35 ， 000バンドが観察されたフラクションに VEG Fの結合阻害が見られた （図
9 Β
5) 免疫化学的解析
E D Fまたは 「 E D F Δ 1 1」 を S D S—ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動し 、 「E. Harlow and D. Lane」 の 「Antibodies」 に言己載の方法に従ってウェス タ ンプロテイングを行つた： 1次抗体として実施例 1の 4 ) の抗体を 2 μ g/mlで使 用し、 2次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ゥサギ I g G (E. Y. La boratories) を 5000倍希釈して使用し、 N T B (Ni troblue tetazol ium chro lide), β C I P (5- Bromo- 4 - chrolo - 3 - indolylphosphste p-toluidine salt) (G ibco BRL社製） で発色させた。 その結果、 約 3 5 k dの単一バンドが観察され、 プラスミ ド 「p EDFH l 0」 および 「p EDFH 1 1」 にクローニングした DN Aの塩基配列を確認するために塩基配列の決定を行った結果、 「p EDFH 1 0」 の挿入 DN Aの F LT細胞外領域と対応する領域の塩基配列は F LTと完 全に一致していた 「p EDFH l l」 の挿入 DNAの F LT細胞外領域と対応 する領域の塩基配列は F LTと比較して、 配列番号： 1で 1 0 5 3番目の Cが欠 失していた。 その結果、 オープンリ一デイングフレームが配列番号： 1の F LT ァミノ酸配列の一 2 2番から 24 6番までに対応するようになっていた。 この部 分は F LTの第一ドメインと第二ドメインを含んでいる。
4) 発現産物の精製
1 00m l の三角フラスコに 3 0 m 1 TMN— F Hを入れ 27。C、 70 r p m で培養した S f 9細胞 9 Om 1 ( 1. 5 X 1 06ノ m 1 ) に組換えウィルス 「： B E DFH 1 0」 または 「B EDFH 1 1」 を m. o. i. 5で感染させ、 20時間後に遠 心して培地を 60m l (3 0m l X 2) の E x— c e 1 1 40 5 (岩城硝子製） に置換して 4 8時間培養し、 1 /1 00容の 3 3 OmMフエ二ルメチルスルフォ ニルフルオラィ ド（phenylmethylsulfonyl fluoride) Zエタノールと l / l 000 容の ΙΟΟμ gZmlアンチパイン（antipain)、 200 g/mlァプロチニン（aprotinin)、 SOO tgZmlロイぺプチン（leupeptin)を添加し上清を回収した。 「B EDFH 1 0 」 感染細胞の培養上清は 「I國 ercible CX-lOj (日本ミリポアリミテツド製） で 8倍濃縮し、 20 mM Tris-HCl(pH7.8)/50 mM KCl/0.1% ノニデット（Nonidet)P -40/1 mM イミダゾ一ル-塩酸（ρΗ7· 8)で平衡化した Ni + + - NTA (QIAGEN, Diagen G imbH) を添加して 4 °Cで 1時間混合した。 1 0, 0 0 0 r p mで遠心して沈澱に 3 0 m 1 の 150 mM KCl/Ό.1% ノニデット P- 40/40 mM イミダゾ一ル-塩酸（ρΗ7· 8)を添加し 4°Cで 1 5分間混合し、 遠心して沈澱を回収し、 更に 2回同バ ッファ —で洗浄した。 沈澱に 0. 2m l の 250 mM イミダゾール-塩酸（pH7.8)を 添加し 室温で 1 5分間混合し遠心して上清を回収した。 再度沈澱に 0. 2 m 1 の 250 mM イミダゾール -塩酸（pH7.8)を添加し同様にして上清を回収し、 前回の上清と併せ [実施例 8]
1 ) ヒ ト I gG,— F c c DNAの単離
I g G生産株であるヒ トリンフオブラストーマ、 I M9 (大日本製薬） を RPMI 1640培地で培養した上清を、 Human IgG subclass profile kit (Zymed)を用いて調 ベたところ、 ヒ ト I g を生産していることがわかった。 4 x 1 0'個の I M9 細胞から、 I Iの [実施例 5] (1) 記載と同様の方法で c DNA溶液を調製し た。 この c DNAから、 表 7に示す条件で 2段階の PC Rによりヒ ト I gG】— F c c DNA断片を増幅した。
表 7 反応液組成 （ 1 00 μ 1 中） P C R反応条件
10 1 LA-PCR buffer (宝酒造） 1 ) 95°C、 1分を 1サイクル 各 0.1 mM dNTPs 2) 94°C、 1分、 56°C、 1分
2 μ 1 c DNA溶液 72°C、 1分を 20サイクル
200 nM プライマ一 7 3) プライマ一 9、 1 0を 200μΜ
200 n プライマ一 8 添加し、 94°C、 1分、 56
5.0 U ExTaq ポリメラ一ゼ （宝酒造） °C、 1分、 72°C、 1分を
1 5サイクル
4) 72。C、 7分を 1サイクル ブライマ一配列は、 以下の通りである。
プライマ一 7 ： 5' -TCTTGTGACAAAACTCACACATGC-3' (配列番号： 1 4)
ブライマ一 8 ： δ' -CGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTG-3' (配列番号： 1 5)
プライマー 9 ： 5' -GAGCCCAAATCTTGTGACAAAA-3' (配列番号： 1 6) この抗体との特異的な反応性が確認された （図 1 0 B) 。 以上のことから 「ED FA 1 1」 は F LTの N末端 267に相当するポリペプチドであることがわかつ た。 図 1 OAにおいてレーン 1はへパリンカラム後のサンプル、 レーン 2は VE GFァフィ二テイクロマトグラフィー後のサンプルを電気泳動して銀染色したも のである。 図 1 0 Bは、 図 1 0 Aと同じサンプルでウェスタンブロッ トを行った 図である。
6) VEGFの生物活性の阻害
VEGFによるヒ ト臍帯由来血管内皮細胞 （HUVEC) のチミジン取り込み 促進に対する 「EDF」 発現培養上清、 「4 N—F LT」 発現培養上清または 「 EDFA 1 1」 発現培養上清による阻害を調べた。 HUVEC (クラボウ社製） を 96穴コラーゲンコートプレート （岩城硝子製） に 3000個/ゥェルノ 1 0 0 μ 1 (EGM— UV培地、 クラボウ製） で撒き、 37°C、 5。/0 02で24時問 培養する。 PBSで 2回洗浄し、 20 n gZm 1の VEGF165を 50 / 1とサン プル 50 μ 1をゥエルに添加して 4日間培養した。 50 i C i Z2 nmo l e s/ m 1の3 H—チミジンを 1 0 μ 1ゥエルに添加して更に 24時間培養した。 P B S で 2回洗浄した後、 トリプシン/ EDTAで細胞を剥し、 セルハ一ベスター （Ca mbridge Technology In 製） でグラスフイノレターに回収し液体シンチレ一シヨン カウンターで放射活性を測定した （図 6) 。 対照として用いた野生株 （wt) ウイ ルス感染培養上清をサンプルとして添加した場合に比べ、 組換えウィルスを用い た 「EDF」 「4 N— F LT」 「 E D F Δ 1 1」 発現培養上清を添加した場合は 、 有意に VEG F依存性チミジン取り込みが阻害された。 この結果から 「EDF 」 「4 N— F LT」 または 「EDF厶 1 1」 は、 V E G Fによる H U V E Cのチ ミジン取り込みの促進、 即ち D N A合成の促進を阻害することが明らかになった
III, 第 1〜第 2ィムノグロブリン様ドメインとヒ ト I gG;— F c領域との融 合タンパク質に関する実施例 大腸菌株 HB 1 0 1を 3m 1の 2 xTY培地で 3 7°C、 一夜培養し、 遠心して 菌体を回収し、 0. 5m lの TEバッファ一 （1 0 mM T r i s— HC 1 (p H 7. 5) ノ 1 mMEDTA) に懸濁した。 20 m gノ m 1の卵白リゾチ一ムを 25 μ 1加えて室温に 1 5分置き、 溶菌させた後、 50 lの 1 0%SDSと 0 . 5m 1 TE飽和フエノールを加え、 5分間激しく振とうし、 遠心して水層を回 収し、 当量のクロ口ホルムで処理し、 フエノールを除いた。 2容のエタノールを 加え DNAを沈澱させ、 70%エタノールで洗浄し、 乾燥後、 沈澱を 200 μ 1 の 20 /i gZm lの RN a s e A溶液に溶解し、 大腸菌ゲノム DN A溶液とした 。 これを铸型として表 9の条件で P CRを行い、 OmpA のシグナルペプチドコ一デ ィング DN Aを増幅した。
表 9 反応液組成 （ 1 00 /i 1中） P C R反応条件
10 μ 1 LA-PCR buffer (宝酒造） 1 ) 95°C、 1分を 1サイクル 各 0.1 mM dNTPs 2) 94。C、 1分、 56°C、 1分
2 μ 1大腸菌ゲノム DNA 72°C、 1分を 35サイクル
200 nM プライマ一 11 3 ) 72°C、 7分を 1サイクル
200 nM プライマー 12
5.0 U ExTaq ポリメラ一ゼ （宝酒造） プライマー配列は、 以下の通りである
プライマー 11 ： 5 ' -TAACCTGGCGATAACGAGGCGCAAATAATGAAAAAG -3' (配列番号： 18) trx term SD omp init
プライマ— 12： 5' -CTGAACTAGATTTCGGAGCGGCCTGCGCTA-3' (配列番号： 1 9)
mi It omp SP term プライマ一 10： 5'-TTCTCGGATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGA-3' (配列番号： 1 7)
Bam STP hlgGl-Fc term
プライマ一 10の 「Bam」 は制限酵素 BamHI認識配列、 「STP」 は終止コ ドン、 「h IgGl-Fc termj はヒ ト I g G！— F cコーディング領域の C末端部分を意味する。 ただしプライマー 8とプライマ一 10はアンチセンス鎖である。 ヒ ト I g G ,— F c コーディング領域とプライマ一位置の対応を図 1 1に示した。 ？じ尺反応液を 1 Iの [実施例 5] (2) の記載と同様の方法で処理し、 ァガロースゲル電気泳動 に力け、 約 700 b pの DN A断片を切り出し、 フィルタ一チューブ SUPEREC-01
(宝酒造） で遠心し DN Aを回収した。 この DN A断片の Aval、 HpaII、 Rsal、 Smalの各制限酵素切断パターン （表 8) を調べ、 既報のヒ ト I g G — F c c D NA配列 （J.W. Ellison, B. J. Berson and し E. Hood, Nucleic Acid Res.， 10:4071 (1982)) と合致することを確認した。
表 8 生じた DNA断片のサイズ （b p)
I n t a c 700
Av a l 380, 280
H p a I I 300, 1 90, 1 1 0， 1 1 0
R s a I 300， 200, 75， 75
Sma l 480, 280
[実施例 9 ] 第 1〜第 2ィムノグロブリン様ドメインとヒ ト I g G〕一 F c領域 との融合タンパク質の発現系の構築
1 ) 大腸菌外膜タンパク質 OmpA のシグナルペプチドコーディング DNAの単 離 表 1 0 反応液組成 （ 1 00 I 中） P C R反応条件
10 μ 1 LA-PCR buffer (宝酒造) 1 ) 95°C、 1分を 1サイクル 各 0.1 m dNTPs 2) 94°C、 1分、 56°C、 1分
2 μ 1大腸菌ゲノム DN A 72°C、 1分を 3 5サイクル
200 nM プライマ一 13 3 ) 72°C、 7分を 1サイクル
200 nM プライマー 14
5.0 U ExTaq ポリメラーゼ （宝酒造） プライマ一配列は、 以下の通りである。
プライマー 13： 5'-TTCTCGAATTCCCTGTGGAGTTATATATGAGC-3' (配列番号： 20)
Eco SD trx init
プライマ一 14： 5'-GCCTCGTTATCGCCAGGTTAGCGTCGAGGA-3' (配列番号： 2 1)
ompSD trx term
プライマ一 13の 「Eco」 は制限酵素 EcoRI の認識切断部位、 「SD」 は、 大腸菌 チォレドキシン遺伝子のリボソーム結合配列、 「trx init」 は、 trxAの開始コド ン周辺を意味する。 プライマ一 14の 「ompSD」 は、 omp Aのリボソーム結合配列を 意味する。 プライマー 14はアンチセンス鎖である。 この PCR反応液を前述と同 様に処理し、 得られた DNA断片をチォレドキシン DNAとした （図 1 2、 図 1 4) c
(3) F LT第 1〜第 2ィムノグロブリン様ドメインコーディング DNAとヒ ト I g G:— F c領域コ一ディング DN Aの融合
EDF厶 1 1バキュ口発現べクタ一 p EDFH 1 1を踌型として表 1 1の条件 で P C Rを行い、 F LT第 1〜第 2ィムノグロブリン様ドメインコーディング I) プライマ一 11の 「trx termj は大腸菌チォレドキシン遺伝子 （trxA) コ一ディ ング末端部分、 「SD」 は、 omp Aのリボソーム結合配列、 「omp initj は、 omp A の開始コ ドン周辺を意味する。 プライマ一 12の 「mflt」 は成熟 F LTの N末端コ —デイング領域、 「omp SP termj は、 Omp Aシグナルペプチドコーディング領域 末端部分を意味する。 ただし、 プライマ一 12はアンチセンス鎖である。 なおチォ レドキシン遺伝子に関する配列は、 「B. J. Wallace and S. R. Kushner, Gene 32:399 (1984)」 を、 omp Aに関する配列は 「E. Beck and E. Bremmer, Nucleic Acid Res. , 8:3011 (1980) J を参考とした。 この P C R反応液を前述と同様に処理 し、 得られた DN A断片を Omp Aシグナルペプチド DN Aとした （図 1 2、 図 1 4 ) 。
(2) 大腸菌チォレドキシン遺伝子の増幅と単離
前述のように、 大腸菌で外来性タンパク質を高発現させると不溶性の封入体と なり易いことが知られている。 封入体を変性 ·可溶化 ·再活性化するのは回収率 が悪く労力を要する。 このような場合に大腸菌内で、 大腸菌チォレドキシンを同 時に高発現させると、 外来性タンパク質が正常なフォールディング構造をとるこ とができ、 封入体が生じにく くなることが報告されている （T. Yasukawa et al. , J. Biol. Chem. 270:25328(1995)) 。 そこでチォレドキシンを同時に高発現さ せるために遺伝子を単離した。
以下の条件で PC Rを行い、 大腸菌チォレドキシン遣伝子を増幅した。
とした （図 1 3、 図 1 4) 。
表 1 2 反応液組成 （ 1 00 μ 1 中） PCR反応条件
10 μ 1 LA- PCR buffer (宝酒造） 1 ) 95°C、 1分を 1サイクル 各 0.1 mM dNTPs 2) 94°C、 1分、 56 、 1分
0.1 // g EDF12 DNA 72°C、 1分を 25サイクル
0.1 μ g hlgG Fc cDNAFc DNA 3) 72。C、 7分を 1サイクル
200 nM プライマ一 15
200 nM プライマ一 10
5.0 U ExTaq ポリメラーゼ （宝酒造）
(4) 発現べクタ一の作製
[実施例 9] の （1 ) の Omp Aシグナルペプチド DN Aと [実施例 9 ] の （2) のチォレドキシン DN Aと [実施例 9] の （3) の EDF 1 2 F c DNAを铸型 として用い、 表 1 3の条件で組換え PC Rを行い、 3つの DNA断片を融合 .増 幅し精製した （図 1 3、 図 1 4) 。 図 1 3においてレーン M、 1、 2、 3はそれ ぞれ、 分子量スタンダ一ド、 EDF 1 2 DNA、 I g G, F c DNA, EDF 1 2 F c DNAである。 図 1 4の 「Ec」 、 「Bm」 はそれぞれ、 制限酵素 EcoRI、 BamHIの認識配列の存在箇所を表す。 N Aを增幅し、 前述と同様にして精製し、 EDF 1 2 DNAとした （図 1 3) 表 1 1 反応液組成 （1 00 / 1中） P C R反応条件
10 μ 1 LA-PCR buffer (宝酒造） 1 ) 95°C、 1分を 1サイクル 各 0.1 πιΜ dNTPs 2) 94°C、 1分、 56°C、 1分
0.8 /zg pEDFHIO DNA 72°C、 1分を 20サイクル
200 nM プライマ一 15 3 ) 72°C、 7分を 1サイクル
200 nM プライマー 16
5.0 U ExTaq ポリメラ一ゼ （宝酒造） プライマー配列は、 以下の通りである。
プライマー 15： 5' -CGCTCCGAAA TCTAGTTCAGGTTCAAAATT-3 ' (配列番号： 22) omp¾P term mFし T
プライマ一 16： 5' -TTTRTCACAAgATTTRggCTCT gTgCTTATTTggACATCTAT-3'
hlgG-Fc hinge 214- FLT- 208
(配列番号： 23)
プライマ一 16の 「hIgG - Fc hinge」 はヒ ト I g G〗のヒンジコーディング D N A 、 「214- FLT- 208」 は F L Tの 208位〜 21 4位のアミノ酸コーディング D N A を意味する。 プライマ一 16はアンチセンス鎖である。
このようにして得た F LT第 1〜第 2ィムノグロブリン様ドメインコ一ディン グ DNA (EDF12 DNA) と [実施例 8] の （1 ) で得られた I gG:— F c c D N Aを踌型として用い、 表 1 2の条件で組換え PC R (R. Higuchi, In 〃PCR Pr otocols", ed. by M. A. Innis et al. , Academic Press Inc. (1990) ) を行レヽ、 両 DNA断片を融合 ·増幅し、 これまでと同様に精製し、 EDF 1 2 F c DN A チォレドキシン DN A、 Omp A シグナルペプチド DN A、 E D F 1 2 F c DNA 、 チォレドキシン DN A— Otnp A シグナルペプチド DNA- E D F 1 2 F c DN A融合断片、 pEDF12Fc DNAの EcoRI +BamHI消化、 pTTQ18 DNAの EcoRI + BamHI消化 である。 （丸印は未消化プラスミ ドである。 ）
[実施例 10] 発現した融合タンパク質の解析
( 1 ) 粗抽出液の調製
JM109(pEDF12Fc)を 70 m 1の 100 μ g/m 1のアンピシリンを含む 2 x TY 培地で、 3 7°Cで振とう培養をおこない、 波長 600 nmの吸光度が 1. 0に達 した時に I ?丁〇を0. 5mM添加し、 更に 1 2時間培養した。 培養終了後、 培 養液を急冷し、 培養液にプロテア一ゼインヒビタ一として、 33 μΜ p APMS F (和光純薬工業） を 70 μ 1 を添加し、 遠心して菌体を回収した。 菌体を 5m 1の 1 OmM T r i s— HC 1 (p H 8. 0) / 33 nM pAPMS Fに懸濁 し、 ソニケ一ターを用いて菌体の 95%以上を超音波破砕した。 これを 1 0， 0 00 X gで 20分遠心し、 沈澱を 5m 1の 0. 1M T r i s— HC 1 (p H 8 . 0) /1M C 1 /33 nM p APMS F/5mM E DT A/ 1 %T r i t o nX 1 00/0. 1 % N o n i d e t - P 40 ίこ溶角 し、 20, 000 x g で遠心して不溶成分を除いた上清を粗抽出液として以下の解析に用いた。 同時に 対照としてべクタ一部分のみを持つ JM109 (pTTQ18)から同様にして粗抽出液を調製 した。
(2) E I Aによる融合タンパク質発現の確認
VEG Fと抗ヒ ト I g G抗体を用いたサンドィツチ E I Aによって確認した c VEG Fコートプレートを作成するために、 VEGF16 (R&D社製） を 50 η g/m 1 になるように P B Sで希釈し、 ィムロン 2マイクロタイタ一プレートに 1ゥエル当たり 1 00 / 1分注し、 4°Cで一夜置いた後、 [実施例 7] の （2) と同様にしてブロッキングした。 JM109(pTTQ18)および JM109(pEDF12Fc)の粗抽出 液を PB S/0. 1。/oB S Aで 20倍希釈した溶液 1 00 μ 1 を、 ゥエルに加え 表 1 3 反応液組成 （ 1 0 0 1中） P C R反応条件
10 μ 1 LA- PCR buffer (宝酒造） 1 ) 9 5 ：、 1分を 1サイクル 各 0.1 mM dNTPs 2) 9 5°C、 1分、 1 5分間か
0.1 μ g Omp k シグナゾレぺプチド DNA けて 5 5°Cまで下げ、 更に
OA μ ξ チォレドキシン DNA 5 5。C、 2分、 1 2°C、
0.1 g EDF12Fc DNA 2. 5分を 3サイクル
200 nM プライマ一 13 3) 9 4°C、 1分、 5 6°C、 1分
200 nM プライマ一 10 7 2°C、 2. 5分を
5.0 U ExTaq ポリメラ一ゼ （宝酒造） 2 2サイクル
4) Ί 2°C、 7分を 1サイクル このようにして得られた約 1. 7 K b pの DNA断片は、 プライマー 10とプラ イマ一 13に含められた EcoRI と BamHI 認識切断配列を末端に持つ。 この 1. 7 K b pの融合 DNA断片を EcoRIと BamHIで消化した。 一方、 大腸菌発現べクタ一 p TTQ 1 8 ( (株） アマシャムジャパン製） を EcoRIと BamHIで消化した。 これ らの制限酵素消化反応液を [実施例 5] の （2) と同様の方法で処理し、 DNA を回収した。 ライゲーシヨンキッ ト （宝酒造製） を用い、 ベクタ一：インサート のモル比 3 ： 1で連結反応を行った t: この反応液と大腸菌 JM109のコンビテン トセ ル （宝酒造製） を用いて形質転換を行い、 アンピシリン含有寒天培地にて生育す る形質転換体を選択した。 更にこの中から [実施例 5] の （2) と同様の方法で 、 1. 7 K b pの挿入 DN Aを持つ組換え体が数クロ一ン得られ、 その一つを JM 109(pEDF12Fc)とした。
図 1 2レーン M、 1、 2、 3、 4、 5、 6はそれぞれ、 分子量スタンダード、 000の免疫化学的に反応するバンドが検出された （図 1 5) 。 図 1 5において レーン 1 2のサンプルはそれぞれ、 JM109(pTTQ18)粗抽出液、 JM109 (pEDF12Fc) 粗抽出液である。 予想される組換え体は 446アミノ酸残基であるので、 妥当な サイズである。
(4) 1 :5 V EG F165との共有結合架橋産物の解析
組換えタンパク質と V E G Fとの結合複合体の分子量を調べるため、 各粗抽出 液 1 00 /z l と125 VEGF165 1 40, O O O c pmを混合し、 2時間室温で 置いた後、 サンブルックらの 「Molecular Cloning」 記載の方法で、 プロテイン A セファロ一ス （フアルマシア製） を用いて免疫沈降し、 [実施例 7] の （1) と 同様の方法で架橘反応を行った。 沈澱物を SDS—ポリアクリルアミ ド電気泳動 し、 ォ一トラジオグラフィーによりシグナルを検出した （図 1 6) 。 その結果、 対照抽出液では V EG Fの弱いシグナルのみが検出される （レーン 2) のに対し 、 組換え体 JM109(pEDF12Fc)の抽出液では、 還元条件で分子量がおよそ 1 52万の 架橋産物が検出された （レーン 1) 。 この結果から、 組換えタンパク質は V EG Fに結合し安定な複合体を形成でき、 プロティン Aとも結合することがわかる。
(5) 組換えタンパク質の V EG F親和性の測定
組換えタンパク質の VEG Fに対する結合親和性を知るために [実施例 7] の 2) と同様の方法でスカツチャード解析 （N=3) を行った （図 1 7) 。 ィムロ ン 2にプロティン A (力ッペル製） 20 μ g/m 1 を 1 ゥエル当たり 1 50 μ 1 でコートし、 ブロッキングした後、 粗抽出液を 1 ゥエル当たり 1 50 μ 1加え、 室温で 1時間置いた P B S/0. 1 %B S A/ 1 mM EDTA/O. 25% ジエラチン/ 0. l %N o n i cl e t— P40で3回洗浄した ·： 5 V E G F を洗浄する時も同じバッファ一で洗浄した。 その結果、 組換えタンパク質は ED Fと同程度の VEGF親和性を有していることが示された
(6) 組換えタンパク質による VEGFの生物活性の阻害
本組換えタンパク質を部分精製するために、 プロテイン Aセファロ一スカラム 室温で 1時間置いた後、 ゥヱルを PBSZO. 1 %B S Aで 6回洗浄した。 次に P B S/0. 1 %BS Aで 1 000倍希釈したペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ ト I g G抗体 （1^8し製# 1 ^1—083 7) を 1 00 /i l 、 ゥェルに加え室温で 1時間 放置し、 上述のようにゥエルを 6回洗浄した。 この後、 ペルォキシダーゼ基質溶 液 （2 OmM酢酸ナトリウム （pH5. 2) 、 0. 0 1 %過酸化水素、 オルトフ ェニレンジァミンタブレット （和光純薬製） 1錠 20!1 1 ) Ι Ο Ο μ Ιをゥェ ルに加え、 室温で 30分呈色反応を行い、 更に 1 00 1の 2 Ν硫酸を加えて反 応を停止し、 492 nmの吸光度を測定した。 その結果、 組換え体 JM109(pEDF12 Fc)抽出液は対照と比較して強く発色した （表 1 4) 。 これは VEGFと抗ヒ ト I g G抗体とのサンドイッチ E I Aであるので、 この結果から組換え体抽出液中に 、 VEGFに結合し、 かつ抗ヒ ト I gG抗体と結合する分子が含まれることが示 唆された。
表 1 4
20倍希釈粗抽出液 JM109(pTTQ18) JM109(pEDF12Fc) 吸光度 （492 nm) 0. 1 1 8 1. 056
(3) 組換えタンパク質の分子量の確認
組換えタンパク質の分子量を調べるため、 [実施例 7] の （5) と同様の方法 で粗抽出液をウェスタンプロッ 卜にかけた。 粗抽出液をレムリ法で S DS_ポリ アクリルアミ ド電気泳動し、 PDVF膜にエレク トロブロッ トし、 ブロッキング した後、 1次抗体として、 抗ヒ ト I gG:— F cモノクローナル抗体 （MB L# I M— 0280) 0. /z g/Zm lで、 2次抗体としてアルカリフォスファターゼ 標識杭マウス I gG (Z yme d製） を 4000倍希釈して使用した。
その結果、 JM109(pEDF12Fc)粗抽出液のレーンにのみ、 還元条件でおよそ分子量 6 配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 1 899
配列の型：核酸
鎖の数： 二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： c DN A
起源
生物名 ： ヒ ト
細胞の種類：胎盤組織
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 250. . 1 899
特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： sig peptide
存在位置： 250. . 3 1 5
特徴を決定した方法： S 特徴を表す記号： mat peptide
存在位置： 3 1 6. . 1 899 配列
60
TCGGGTGCAGCGGCCAGCGGGCCTGGCGGCGAGGATTACCCGGGGAAGTGGTTGTCTCCT 120 GGCTGGAGCCGCGAGACGGGCGCTCAGGGCGCGGGGCCGGCGGCGGCGAACGAGAGGACG 180 クロマトグラフィーを行い、 p H4. 0で溶出した。 83八を 1 11 8 111 1 とな るように添加した後、 P B Sで透析したサンプルを以下の実験に用いた。 他のサ ンプルも同様に B S Aを添加して透析した標品を使用した。
[実施例 7] の （6) と同様にして本組換えタンパク質による、 HUVECの VEG F依存性3 H—チミジンの取り込み促進に対する阻害活性を調べた。 ネガテ イブコントロールとしてヒ ト I g G!を 4 μ g/m 1で使用し、 ポジティブコント ロールとして、 精製 EDFを 2 μ g/m 1で使用した。 プロテイン Aセファロー スで部分精製した組換えタンパク質を 1 μ g_ m 1で使用したところ、 EDFを 添加した場合と同様に、 顕著な V EG F阻害活性が認められた （図 1 8) 。 一方 、 ヒ ト I g G,の添加ではこのような阻害は起こらなかった。 以上の結果から本組 換えタンパク質は、 V E G Fの血管内皮細胞増殖促進活性を阻害できることが示 された。
以上の結果から本実施例の組換えタンパク質である F L T第 1〜第 2ィムノグ ロブリン様ドメイン一ヒ ト I g G, F c融合タンパク質は、 ヒ ト I g G, F c特 異的なモノクローナル抗体によって認識され、 またプロティン Aとも結合すると いうヒ ト I gG: F cの生化学的特性を有していることが示された。 また本融合 タンパク質は、 EDFと同程度に高親和的に VEG Fと結合し、 かつ VEGFの 生物活性を阻害することが明らかになった。 産業上の利用の可能性
本発明のポリぺプチドは V E G F刺激による血管新生を阻害することができる ので固形ガンその他の病理的血管新生を伴う疾病の治療に利用できる。 また、 ヒ ト由来のアミノ酸からなるのでヒ トに長期投与しても抗体ができにくレ、 更に、 従来のボリペプチド （R. し Kendal and K. A. Thomas, Pro Natl.， Acad. Sc i.， U. S. A.， 90:10705 (1993)) より分子量が小さいので組換え D N Aによる 発現が行い易く、 患部への浸潤も速やかである。 l ie Phe l ie Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu
105 110 115
ATC CCC GAA ATT ATA CAC ATG ACT GAA GGA AGG GAG CTC GTC ATT CCC 720 l ie Pro Glu l ie l i e His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val l ie Pro
120 125 130 135
TGC CGG GTT ACG TCA CCT AAC ATC ACT GTT ACT TTA AAA AAG TTT CCA 768 Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn l ie Thr Val Thr Leu Lys し ys Phe Pro
140 145 150
CTT GAC ACT TTG ATC CCT GAT GGA AAA CGC ATA ATC TGG GAC AGT AGA 816 Leu Asp Thr Leu l ie Pro Asp Gly Lys Arg l ie l ie Trp Asp Ser Arg
155 160 165
AAG GGC TTC ATC ATA TCA AAT GCA ACG TAC AAA GAA ATA GGG CTT CTG 864 Lys Gly Phe l ie l i e Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu l ie Gly Leu Leu
170 175 180
ACC TGT GAA GCA ACA GTC AAT GGG CAT TTG TAT AAG ACA AAC TAT CTC 912 Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly Hi s Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu
185 190 195
ACA CAT CGA CAA ACC AAT ACA ATC ATA GAT GTC CAA ATA AGC ACA CCA 960 Thr His Arg Gin Thr Asn Thr l ie l ie Asp Val Gin l ie Ser Thr Pro
200 205 210 215
CGC CCA GTC AAA TTA CTT AGA GGC CAT ACT CTT GTC CTC AAT TGT ACT 1008 Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr
220 225 230
GCT ACC ACT CCC TTG AAC ACG AGA GTT CAA ATG ACC TGG AGT TAC CCT 1056 Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gin Met Thr Trp Ser Tyr Pro
235 240 245 ZL9 VVO 10V DVI OIV OVO V19 D1X 103 VOV 190 VDV IVO 19V 丄丄 V 111 V丄 V
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250 255 260
AAT TCC CAT GCC AAC ATA TTC TAC AGT GTT CTT ACT ATT GAC AAA ATG 1152 Asn Ser Hi s Ala Asn He Phe Tyr Ser Val Leu Thr l ie Asp Lys Met
265 270 275
CAG AAC AAA GAC AAA GGA CTT TAT ACT TGT CGT GTA AGG AGT GGA CCA 1200 Gin Asn Lys Asp Lys Gl y Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro
280 285 290 295
TCA TTC AAA TCT GTT AAC ACC TCA GTG CAT ATA TAT GAT AAA GCA TTC 1248 Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His l ie Tyr Asp Lys Ala Phe
300 305 310
ATC ACT GTG AAA CAT CGA AAA CAG CAG GTG CTT GAA ACC GTA GCT GGC 1296 l ie Thr Val Lys His Arg Lys Gin Gin Val Leu Glu Thr Val Ala Gly
315 320 325
AAG CGG TCT TAC CGG CTC TCT ATG AAA GTG AAG GCA TTT CCC TCG CCG 1344 Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro
330 335 340
GAA GTT GTA TGG TTA AAA GAT GGG TTA CCT GCG ACT GAG AAA TCT GCT 1392 Glu Val Val Trp Leu Lys Asp Gly し en Pro Ala Thr Glu lys Ser Ala
345 350 355
CGC TAT TTG ACT CGT GGC TAC TCG TTA ATT ATC AAG GAC GTA ACT GAA 1440 Arg Tyr Leu Thr Arg Gl y Tyr Ser Leu l ie He Lys Asp Val Thr Glu
360 365 370 375
GAG GAT GCA GGG AAT TAT ACA ATC TTG CTG AGC ATA AAA CAG TCA AAT 1 88 Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr l ie Leu Leu Ser l i e Lys Gin Ser Asn GGT GTC CCC GAG CCT CAG ATC ACT TGG TTT AAA AAC AAC CAC AAA ATA 2352 Gly Val Pro Glu Pro Gin l ie Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys l ie
665 670 675
CAA CAA GAG CCT GGA ATT ATT TTA GGA CCA GGA AGC AGC ACG CTG TTT 2400 Gin Gin Glu Pro Gly H e l ie Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe
680 685 690 695
ATT GAA AGA GTC ACA GAA GAG GAT GAA GGT GTC TAT CAC TGC AAA GCC 2448 l ie Glu Arg Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala
700 705 710
ACC AAC CAG AAG GGC TCT GTG GAA AGT TCA GCA TAC CTC ACT GTT CAA 2496 Thr Asn Gin Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gin
715 720 725
GGA ACC TCG GAC AAG TCT AAT CTG GAG 2523 Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Leu Glu
730 配列番号： 2
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A )
配列
CGTCGCGCTC ACCATGGTCA G 21 配列番号： 3 099 S99 0S9 usy STH sAo dsy naq _^丄 4丄 Jas ΘΙΙ ^IV 1ΒΛ 4丄 siH
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906Z0/96df/X3d L8iSl/L6 OAV 配列番号： 6
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
AGCTTTTAAT GATCTAGAAT GAC 23 配列番号： 7
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TCGAGTCATT CTAGATCATT AAA 23 配列番号： 8
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DN A)
配列
CTCGGATCCG GATCTAGTTC AGGTTCAAAA 30 W
51 配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TTATTCGTAA ATCTGGGGTT TCAC 24 配列番号： 4
配列の長さ ： 1 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TATTAATGAT CTAGATGAC ig 配列番号： 5
配列の長さ ： 22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TCGAGTCATT CTAGATCATT AA 22 GTGGTGGTGG TGGTGGTGAC GCTCCAGATT AGACTTGTCC GA 42 配列番号： 1 2
配列の長さ ： 3 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
CACCACCACC ACCACCACTA ACTAGAGCTC GCTGATC 37 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TTCTCGAATT CTCCCCAGCA TGCCTGC 27 配列番号： 1 4
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列番号： 9
配列の長さ ： 3 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
CTCGAATTCA CTCCAGATTA GACTTGTCCG A 31 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 4 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TTTCTCGGAT CCTATAAATA TGGTCAGCTA CTGGGACACC 40 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 4 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列 配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TTCTCGGATC CTTATTTACC CGGAGACAGG GA 32
配列番号： 1 8
配列の長さ ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TAACCTGGCG ATAACGAGGC GCAAATAATG AAAAAG 36 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
CTGAACTAGA TTTCGGAGCG GCCTGCGCTA 30 配列番号： 20
配列の長さ ： 32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 配列
TCTTGTGACA AAACTCACAC ATGC 24 配列番号： 1 5
配列の長さ ： 2 4
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列
CGGAGACAGG GAGAGGCTCT TCTG 24 配列番号： 1 6
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A )
配列
GAGCCCAAAT CTTGTGACAA AA 22 配列番号： 1 7
配列の長さ ： 3 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TTTGTCACAA GATTTGGGCT CTGTGCTTAT TTGGACATCT AT 2
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TTCTCGAATT CCCTGTGGAG TTATATATGA GC 32 配列番号： 21
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
GCCTCGTTAT CGCCAGGTTA GCGTCGAGGA 30 配列番号： 22
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
CGCTCCGAAA TCTAGTTCAG GTTCAAAATT 30 配列番号： 23
配列の長さ ： 4 2
配列の型：核酸

Claims

請求の範囲
1. V EG Fに結合して VEGFの活性を阻害することができる、 F LTの細胞 外領域の第 1ィムノグロブリン様ドメインおよび第 2ィムノグロブリン様ドメイ ンを含み、 かつ第 6ィムノグロブリン様ドメインおよび第 7ィムノグロプリン様 ドメインを含まないポリぺプチド。
2. 請求の範囲 1記載のポリペプチドをコードする DNA。
3. 請求の範囲 2に記載の DN Aを含むベクター。
4. 請求の範囲 3に記載のベクタ一を保持する形質転換体。
5. 請求の範囲 1記載のポリペプチドからなる医薬。
6. 請求の範囲 1記載のポリぺプチドからなる分析試薬。
PCT/JP1996/002906 1995-10-07 1996-10-07 Polypeptide se liant au facteur de croissance de cellules endotheliales vasculaires WO1997013787A1 (fr)

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JP8/211892 1996-07-23

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