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WO1997016171A1 - Liposome a membrane fusible faisant appel a un virus sendai recombinant - Google Patents

Liposome a membrane fusible faisant appel a un virus sendai recombinant Download PDF

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Publication number
WO1997016171A1
WO1997016171A1 PCT/JP1996/003070 JP9603070W WO9716171A1 WO 1997016171 A1 WO1997016171 A1 WO 1997016171A1 JP 9603070 W JP9603070 W JP 9603070W WO 9716171 A1 WO9716171 A1 WO 9716171A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sendai virus
virus
gene
rna
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/003070
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshiyuki Nagai
Atsushi Kato
Fukashi Murai
Yosuke Suzuki
Katsuo Takeda
Mamoru Hasegawa
Original Assignee
Dnavec Research Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dnavec Research Inc. filed Critical Dnavec Research Inc.
Priority to AU73353/96A priority Critical patent/AU7335396A/en
Priority to JP51721597A priority patent/JP3992200B2/ja
Publication of WO1997016171A1 publication Critical patent/WO1997016171A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to a membrane-fused ribosome obtained by fusing a recombinant Sendai virus with a ribosome.
  • DDS Drug Delivery System
  • One is a method using a viral vector. This includes a method of infecting cells with a virus having a desired exogenous gene on the genome, thereby introducing internal nucleic acids into the cells.
  • the other is a method of encapsulating or supporting a desired physiologically active substance in an artificial or semi-artificial transport carrier (carrier 1).
  • carrier 1 an artificial or semi-artificial transport carrier
  • This method depends on the physicochemical properties of the carrier itself to make various processes involved in the behavior and transport of the target substance in the living body, so that the bioactive substance can be converted into desired organs (target organs), cells (target cells). ) Or a method to reach an intracellular organ (target organ) (delivery system).
  • Examples of carriers in this method include proteins (Human Gene Therapy, 5, 29, 1994), peptides (Proceedings of National Acaaemy of Sciences of United States of America, 90, 893, 1993), and macromolecules (The Journal of Biological Chemistry, 269, 12918, 1994) and ribosomes (Proceedings of National Ac ademy of Sciences of United States of America, 92, 1744, 1995).
  • proteins Human Gene Therapy, 5, 29, 1994
  • peptides Proceedings of National Acaaemy of Sciences of United States of America, 90, 893, 1993
  • macromolecules The Journal of Biological Chemistry, 269, 12918, 1994
  • ribosomes Proceedings of National Ac ademy of Sciences of United States of America, 92, 1744, 1995.
  • Examples of this method include the Delino J-I system (Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America, 89, 7934, 1992) using transferrin receptor, which is frequently expressed on the surface of cancer cells, and target cells.
  • a delivery system using a specific antigen expressed on the surface Biochim Biophys Acta, 1152, 231-242, 1993
  • a delivery system using the Asiatic glycoprotein receptor Yuichi located on the surface of hepatocytes The Journal of Biological Chemistry, 266, 14338, 1991
  • the Delipari system utilizing Expansive membrane fusion of Sendai virus (Exp. Cell Res., 159, 399, 1985).
  • Sendai virus used as a material for this system is also called HVJ (Hemagglutinating virus of Japan), and is a paramyxovirus family (P aramyxoviridae), a strain of the parainfluenza virus type 1 belonging to the genus Paramyxovirus.
  • Sendai virions are polymorphic, have an envelope of 150-200 nm in diameter, and contain genomic RNA that does not translate into type II.
  • Sendai virus is historically known as an industrially useful virus, and is widely used for the production of heterokaryons and hybrid cells, in particular, for cell fusion. In addition, as described above, it is suitably used as a material for fusogenic ribosomes.
  • Sendai virus belongs to the group of RNA virus, (-) single-stranded RM virus, and (-) single-stranded RNA virus.
  • RNA viruses are classified into three types: dsRNA virus (double stranded RNA virus), (+) strand RNA virus, and (single) strand RNA virus.
  • the dsRNA virus group includes reovirus, oral virus, plant reovirus, etc., and has multiple segmented linear dsRNA genomes.
  • the (+) chain virus includes poliovirus, Sindbis virus, Semliki Forest virus, Japanese encephalitis virus, etc., and has one (+) chain & NA as its genome.
  • the genomic RNA itself of the (+)-strand RNA virus has a transmitting power.
  • the term “propagation power” refers to “infectious particles or a complex equivalent thereto” after the nucleic acid present in the cell is replicated after the nucleic acid is introduced into the cell by infection or an artificial technique. And the ability to spread one after another to other cells. "
  • Sindbis virus which is classified as (+)-strand RNA virus
  • Sendai virus which is classified as (-) strand RNA virus
  • Sindbis virus-derived (+) strand RNA artificially transcribed in vitro has propagating power, but Sendai artificially transcribed in vitro.
  • Viral RNA has neither (+) nor (1) strand propagation power.
  • DNA virus using DNA as genomic nucleic acid has been performed relatively early.
  • purified genomic DNA itself such as SV40 (J, Exp. Cell Res., 43, 415-425, 1983) has been used. It can be carried out by introducing the cells into monkey cells.
  • RNA viruses using RNA as genomic nucleic acid were preceded by development in (+)-strand RNA viruses.
  • genomic RNA simultaneously functions as mRNA.
  • poliovirus it has been reported in 1959 that purified RNA itself has a transmitting power (Journal of Experimental Medicine, 110, 65-89, 1959).
  • Semliki forest virus SFV
  • SFV Semliki forest virus
  • the Sendai virus has many advantages that can be used as an industrially useful virus.
  • it is a (single-stranded) RNA virus, a reconstitution system has been established. Did not. This is because the virion reconstitution system using viral cDNA was extremely difficult.
  • Influenza virus is a (single-strand) RNA virus composed of an eight-segment genome. According to these reports, exogenous genes were inserted into one of the cDNAs in advance, and RNA transcribed from all eight cDNAs including the exogenous genes was previously associated with the NP protein derived from the virus. And MP. By supplying these RNPs and RNA-dependent RNA polymerase into cells, reconstitution was established.
  • a virus such as a natural virus / recombinant vaccinia virus and a nucleic acid of a virus to be reconstituted are simultaneously used to supply factors necessary for reconstitution into cells. There is a problem that it is not easy to separate the reconstituted desired viruses and their harmful viruses, which are supplied to cells.
  • the object of the present invention is to develop a highly safe delivery system for DDS, ie, a physiologically active substance, utilizing the membrane fusion of Sendai virus.
  • an object of the present invention is to produce a Sendai virus having no transmitting power, and whether or not it can be produced depends on whether or not a technique for reconstituting the Sendai virus can be constructed.
  • the present inventors have intensively studied the establishment of a recombinant Sendai virus reconstitution system. In particular, detailed studies were performed on the conditions for efficient reconstitution, that is, the quantitative ratio of nucleic acids and cofactors to be introduced into cells. Furthermore, studies were conducted to eliminate contamination with recombinant vaccinia virus and the like.
  • the present inventors applied cDNAs for Sendai virus miniparticles or cDNAs derived from Sendai virus DI particles (see Defective interfering particles / EMBO. J., 10, 3079-3085, 1991) in order to apply to the reconstitution test of Sendai virus.
  • Various studies were performed using cDNA. As a result, we found efficient conditions for the ratio of the amount of cDNA, cDNAs involved in transcription and replication, and the recombinant vaccinia virus, which is a T7 RNA polymerase expression unit, to be introduced into cells.
  • the present inventors further obtain both the (+) strand and the (-) strand of full-length Sendai virus cDNA, and biosynthesize (+) or (single) strand Sendai virus RNA in cells.
  • Such a plasmid was constructed and introduced into cells expressing a group of cDNAs for transcription and replication.
  • Sendai virus particles from Sendai virus cDNA for the first time.
  • the present inventors for efficient particle reconstitution, it is more appropriate that the form of cDNA to be introduced into cells be circular than linear, and (1) that the strand RNA is transcribed in cells. It was newly found that the efficiency of particle formation was higher when (+) strand RNA was transcribed in the cell than when it was transferred.
  • the present inventors have found that the Sendai virus can be reconstituted without using a recombinant vaccinia virus which is a T7 RNA polymerase expression unit. That is, when the Sendai virus full-length RNA transcribed in a test tube was introduced into cells, and the cDNA of the initial transcriptase group was transcribed under the control of the T7 promoter, virus particles were reconstituted. This means that by constructing cells that express all of the initial transcription and replication enzymes, it is possible to produce recombinant Sendai virus without using any helper virus such as vaccinia virus. Is shown. In addition, cells expressing all of the initial transcriptase groups are described in “J.
  • the cells described in the document are cells derived from 293 cells having NP, P / C, and L on the chromosome among the Sendai virus genes. These cells are NP, P / C , L express the three proteins.
  • the present invention provides a method for performing genetic manipulation at the DNA level that lacks at least a portion of the Sendai virus structure gene in accordance with a conventional method, and reconstituting Sendai virus particles having no transmitting power from the recombinant DNA. Made it possible.
  • the present invention includes the following.
  • the recombinant Sendai virus is characterized in that at least one of the Sendai virus M ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ gene, F gene or HN gene is deleted or inactivated. Fusogenic ribosomes,
  • a host capable of expressing said gene, a Sendai virus replication enzyme (B) RNA contained in the recombinant Sendai virus contained in the fusogenic liposome according to any of (1) to (3) or RNA containing the cRNA of A Or a unit capable of biosynthesizing these RNAs, (c) a kit containing ribosomes containing the desired nucleic acid or drug,
  • kit according to (4) wherein the host is an animal, an animal-derived cell, an animal tissue, or an animal egg.
  • “Sendai virus j in which one or more functional protein genes have been deleted or inactivated may be derived from a strain classified as parainfluenza type 1; for example, strain Z (Sendai virus Z strain), those derived from the Fushimi strain (Sendai virus Fushimi strain), etc.
  • incomplete viruses such as DI particles and synthesized oligonucleotides are also used as a part of the material.
  • the virus fused to the ribosome may be either a virus that retains autonomous replication ability or a virus that does not retain autonomous replication ability, for example, incomplete virus such as DI particles, Sendai virus, etc.
  • Mini-genomes or synthesized oligonucleotides can also be used, but both ends of genomic RNA can be used It must be recognized and replicated by the NP, P / C, and L proteins that are the factors that make up the protein.
  • the recombinant Sendai virus can insert a desired exogenous gene or delete or modify a desired genomic gene.
  • Recombinant Sendai virus can, for example, inactivate or delete genes involved in immunogenicity, and modified some genes to increase the efficiency of RNA transcription and replication. It may be something. Specifically, for example, at least one of the replication factors NP gene, P / C gene or L gene can be modified to enhance transcription and replication functions.
  • HN protein one of the structural proteins, has both the hemagglutinin (hemagglutinin) activity and the neuraminidase activity, but, for example, it may weaken the former activity. If possible, it would be possible to improve the stability of the virus in the blood, and it would also be possible to modulate infectivity, for example by modifying the activity of the latter.
  • hemagglutinin hemagglutinin
  • neuraminidase activity hemagglutinin
  • it may weaken the former activity.
  • those derived from genomic RNA may be used, or those supplied to trans may be used.
  • the F protein involved in membrane fusion the fusion ability of the membrane fusion liposome can be regulated.
  • a protein source may be derived from genomic RNA or may be supplied in trans.
  • the recombinant Sendai virus used in the present invention does not have autonomous replication ability. If it does not have the autonomous replication ability, there are advantages such as that RNA does not grow in cells after infection and unnecessary protein synthesis does not occur.
  • nucleic acids and drugs to be introduced into the fusogenic ribosome examples include antisense (Drug Delivery System, 10, 91-97, 1995) and decoy (The Journal of Biologica 1 Chemistry, 267, 12403-12406, ⁇ 4 ), Ribozyme (The Drug Del ivery System , 10, 91-97, 1995), triple-stranded DNA (Cell Engineering, Vol. 13, No.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of pUC18 / T7 (+) HVJRz.DM.
  • FIG. 2 shows the structure of pUC18 / T7 ( ⁇ ) HVJRz.DNA. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • T7 Promoter Plasmid pUC18 / T7 (-) HVJRz inserted into pUC18 Plasmid, DNA containing Sendai virus cDNA designed to transcribe (-) strand RNA and lipozyme gene in this order DNA was prepared.
  • T7 Promoter a plasmid containing the Sendai virus cDNA designed to transcribe (+) strand RNA and DM retaining the lipozyme gene in this order, and a plasmid pUC18 / T7 (+) inserted into pUC18 plasmid HVJRz.DNA was prepared.
  • the structures of pUC18 / T7 ( ⁇ ) HVJRz.DNA and pUC18 / T7 (+) HVJRz.DNA are shown in FIGS. 1 and 2.
  • Example 2 Sendai virus reconstitution experiment from cDNA
  • LLC-MK2 cells subjected to normal Toribushin processing brass Chidzu click dish with a diameter of 6 cm 2, 000, 000 or the MEM medium (MEM + FBS 10%) and 2ml was added, C0 2 53 ⁇ 4, 37 °
  • the cells were cultured under the conditions of C for 24 hours. After removing the culture medium and washing with 1 ml of PBS, the recombinant vaccinia virus expressing T7 polymerase VTF7-3, which was prepared so that the moi / multiplicity of infection was 2, was obtained.
  • the turbid matter was added to 0.1 ml of PBS.
  • the petri dish was shaken so that the virus solution spread over the whole body every 15 minutes, and the infection was performed for 1 hour.
  • the virus solution was removed and washed with 1 ml of PBS.
  • a medium containing a cDNA solution was added to the dish.
  • a medium containing a cDNA solution was prepared as follows.
  • the nucleic acids (including plasmids expressing the factors necessary for Sendai virus replication, including pGEM-L, pGEM-P / C, and pGEM-NP) described in the table were placed in a 1.5 ml sampling tube, and HBS (Hepes buffered saline; 20 mM Hepes (pH 7.4, 150 mM NaCl) was added to a total volume of 0.1 ml.
  • HBS Hepes buffered saline; 20 mM Hepes (pH 7.4, 150 mM NaCl) was added to a total volume of 0.1 ml.
  • (+) cDNA in the table indicates brassmid pUC18 / T7 (-) HVJRz.DNA or pUC18 / T7 (+) HVJRz.DNA itself, / C remains circular, and / L indicates This indicates that the cells were linearized with the restriction enzyme Mlul and then introduced into cells.
  • the above petri dishes were cultured for 40 hours under the conditions of C0 25 2 and 37 ° C.
  • the cells in the Petri dish were scraped off using a rubber policeman, transferred to an Eppendorf tube, and centrifuged at 6000 rpm for 5 minutes to precipitate only the cell components, and suspended again in 1 ml of PBS.
  • a part of this cell solution was intact or diluted and inoculated into 10-day-old embryonated chicken eggs.
  • This cell solution was diluted with PBS to the cell number shown in Table 1, and 0.5 ml of the inoculated eggs was used for 35 cells. After culturing for 72 hours, the mixture was transferred to 4 ° C and left overnight.
  • the chorioallantoic fluid of this egg was collected as a virus fluid using a syringe and a needle.
  • the measurement of the brain (hemagglutinin unit) and PFU (plaque forming unit) of the collected oil solution was performed by the following method.
  • HAU The measurement of HAU was performed as follows. Chicken blood was centrifuged at 400 ⁇ g for 10 minutes and the supernatant was discarded. Remaining precipitate with 100 volumes of PBS! ! It became turbid and was further centrifuged at 400 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was discarded. This operation was repeated twice more to prepare a 0.1% blood cell solution.
  • the virus solution was diluted two-fold by a serial dilution method, and 0.05 ml of each was dispensed to a 96-well evening plate. This evening, 0.05 ml of the blood cell solution was further dispensed to the plate, mixed gently by gentle shaking, and allowed to stand at 4 ° C for 40 minutes. Thereafter, red blood cell aggregation was visually observed, and among the aggregated red blood cells, the dilution ratio of the highest dilution of the virus solution was indicated as HAU.
  • the measurement of PFU was performed as follows. CV-1 cells were grown in monolayers on 6-well culture plates. The culture plate was discarded, and 0.1 ml of the virus solution diluted 10-fold by the serial dilution method was dispensed into each culture plate and infected at 37 ° C for 1 hour. Serum-free 2 XMEM and 2% agar 55 during infection. The mixture was mixed with C, and triscine was further added to a final concentration of 0.0075 mg / ml. After infection of 1 hour, the virus solution was removed, added in culture locations 3ml mixed with agar to each culture plate Ueru, 37 in 5% C0 2 conditions. C Insulated for 3 days. 0.2 ml of 0.1% phenol red was added, and the mixture was kept at 37 ° C for 3 hours and then removed. The number of uncolored plaques was counted and the virus titer was evaluated as PFU / ml.
  • Table 1 shows the amounts of type I Sendai virus cDM introduced into LLC-M2 cells, pGEM-L, pGEM-P / C and pGEM-NP, which are cDM factors required for RNA replication, and the incubation volume. The Yong time, the number of cells inoculated into chicken eggs, HAU, and PFU are shown. Table 1 pGEM- pGEM- Type I cDA Total (g) Culture Time (&#) Cell Number HAU PFU
  • the sample showing both HAU and PFU was precipitated by ultracentrifugation, resuspended, purified by sucrose density gradient centrifugation at 20 ° to 60 °, and proteins were separated by 12.5 DS-PAGE.
  • the protein contained was the same size as the Sendai virus protein.
  • This result indicated that the cDNA could be introduced into cells to reconstitute Sendai virus.
  • the virus particles were reconstituted more efficiently than when the cDNA transcribing the (-) strand was introduced.
  • the virus particles were reconstituted more efficiently than when the cDNA was introduced in a linear form.
  • Example 2 An experiment was performed to determine whether all three of them required L, P / C, and NP-expressing brassmids.
  • the method is the same as in Example 2, except that in Example 2, pGEM-L pGEM-P / C and pGEM-NP were introduced into cells together with cDNA, whereas in this experiment, pGEM- L, pGE Any two or only one of MP / C and pGEM-NP was introduced into cells together with cDNA.
  • Table 2 shows the amounts and incubations of Sendai virus cDNA of type III introduced into LLC-MK2 cells, pGEM-L, pGEM-P / C and pGEM-NP, which are cDNAs of factors required for RNA replication. The time, the number of cells inoculated into chicken eggs, HAU, and PFU are shown.
  • Example 2 showed that Sendai virus was reconstituted from cDNA. We examined whether the same could be achieved with cDNA transcribed in vitro, ie, vRNA and cRNA.
  • the Sendai virus transcription unit pUC18 / T7 (-) HVJRz.DNA and pUC18 / T7 (+) HVJRz.DNA are linearized with the restriction enzyme Mlul, and then used as a gun to purify purified T7 polymerase (EPICENTRE).
  • RNA 10 4 2 4 40 I. OOE + 06 5 1 2 2 X 10 l in vilro (-) RNA 10 4 2 4 40 1.00E + 06 5 1 2 ⁇ ° in vi (ro (+) RNA 10 4 2 4 40 1.00E + 06 2 ' 10 3 in vitro (+) RNA 10 4 2 4 40 1.00E + 06 ⁇ 2 ND From these results, it was possible to reconstitute the virus regardless of which type of RNA was introduced into the cells. Above possible use
  • a system for efficiently reconstituting virus particles from Sendai virus cDNA has been established, and gene manipulation in Sendai virus has become possible.
  • one or more functional protein genes have been deleted or inactivated, and a recombinant Sendai virus capable of infecting cells and having no propagating ability has been produced.
  • DDS a highly safe delivery system for DDS, that is, a physiologically active substance, utilizing the membrane fusion properties of Sendai virus.

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Description

明现曞 組換え䜓センダむりィルスを利甚した膜融合性リボ゜ヌム 技術分野
本発明は、 組換え䜓センダむりィルスずリボ゜ヌムずを融合しお埗られる膜融 合性リボ゜ヌムに関する。 技術背景
薬物治療、 遺䌝子治療、 においお薬物 特に高分子化合物 や栞酞等の生理掻 性物質を、 目的ずする现胞たたは现胞内組織に到達させるシステム、 すなわちド ラッグデリバリ䞀システム Drug Del ivery System以䞋単に DDSず蚀う は重芁 な技術分野である。 DDSは 2぀の方法に分類するこずができる。
ひず぀は、 りィルスベクタヌを甚いる方法である。 これには、 所望の倖来性遺 䌝子をゲノム䞊に有するりィルスを现胞に感染させるこずにより、 内郚の栞酞を 现胞内に導入するずいう方法が含たれる。
もうひず぀は、 人工的なたたは半人工的な茞送担䜓 キャリア䞀 に、 所望の 生理掻性物質を封入たたは担持させる方法である。 この方法は、 目的物の生䜓内 挙動および茞送に関䞎する諞過皋を、 キダリア䞀自䜓の物理化孊的性質に䟝存さ せるこずにより、 生理掻性物質を所望の臓噚 暙的臓噚 、 现胞 暙的现胞 た たは现胞内噚官 暙的噚官 に到達せしめる方法 デリパリ䞀システム である 。 この方法におけるキャリア䞀ずしおは䟋えば、 蛋癜質 Human Gene Therapy, 5  29, 1994) 、 ぺプチド (Proceedings of National Acaaemy of Sciences of U nited States of America, 90, 893, 1993) 、 高分子 (The Journal of Biological Chemistry, 269, 12918, 1994) およびリボ゜ヌム (Proceedings of National Ac ademy of Sciences of United States of America, 92, 1744, 1995) 等を䟋瀺する こずができる。 これらキャリア䞀は、 分子量、 粒埄、 衚面電荷、 特異的結合胜等 の物理化孊的性質により、 生䜓内においおは固有の挙動および暙的指向性を呈す る。 そのため、 これらキャリアヌに封入たたは担持された生理掻性物質は、 キダ リア䞀ず同様の生䜓内挙動および暙的指向性を有するこずが可胜ずなる。 この方 法を甚いた䟋ずしおは、 癌现胞衚面に倚く発珟したトランスフェリンレセプ倕䞀 を利甚したデリノ J䞀システム (Proceedings of National Academy of Science s of United States of America, 897934 1992) 、 暙的现胞衚面に発珟した特異 的抗原を利甚したデリバリヌシステム (Biochim Biophys Acta, 1152,231-242, 19 93) 、 肝现胞衚面に存圚するァシァ口糖蛋癜レセブ倕䞀を利甚したデリバリ䞀シ ステム (The Journal of Biological Chemistry266 14338, 1991) 、 センダむゥ ィルスの膜融合性を利甚したデリパリ䞀システム Exp. Cell Res.159 399, 198 5) 等が挙げられる。
特に、 センダむりィルスの膜融合性を利甚したデリバリヌシステムにおいおは 、 ゚ンドサむ トヌシス経路を介さず、 生理掻性物質を暙的现胞質内に盎接導入す るこずが可胜であるため、 埓来の方法では困難であ぀た遺䌝子等の高分子量で安 定性の䜎い生理掻性物質の送達においお、 高い有効性が瀺されおいる  「Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Deliveryj Lee, V.H. L. et al . eds. Harwood Academic Publishers, Switzerland, 337, 1995) 。 しか しながら、 このシステムに甚いられるセンダむりィルスは野性株を玫倖線凊理し たものであり、 その安党性は必ずしも高いずは蚀えない。 玫倖線凊理によらず完 党に安党性を保぀こずのできる膜融合性リボ゜ヌムの開発は、 センダむりむルス の膜融合性を利甚したデリパリ䞀システムにおいお切望されおいる。 そしお、 そ のためには野生型りィルスずしおの掻性を有しないセンダむりィルスを実甚的な レベルで生産できるこずが必芁であった。
本システムの材料ずしお甚いられるセンダむりィルス Sendai virus) は、 H V J (Hemagglutinating virus of Japan)ずも呌ばれ、 パラミク゜りィルス科 P aramyxoviridae) 、 パラミク゜りィルス属 (Paramyxovirus) に属するパラむン フルェンザりィルス 1型の 1株である。 センダむりィルス粒子は倚圢性であり、 盎埄 150〜200nmの゚ンベロヌプを有し、 䞭に翻蚳の鎵型ずはならないゲノム RNA
(以䞋、 「 ― 鎖 RNA」 ず称する を有する。 センダむりィルスは、 歎史的に 芋おも産業䞊有甚なりィルスずしお知られおおり、 ずくに现胞のぞテロカリオン や雑皮现胞の䜜補、 すなわち现胞融合に広く利甚されおいる。 たた、 䞊述したよ うに膜融合性リボ゜ヌムの材料ずしお奜適に甚いられおいる。
ゲノム栞酞の圢態による分類では、 センダむりィルスは、 RNAりィルスの、  䞀 鎖 RMりィルスの、 ― 1本鎖 RNAりィルスグルヌプに属する。 RNAりィル スは、 dsRNAりィルスdouble stranded RNA virus), ( + ) 鎖 RNAりィルスおよ び 䞀 鎖 RNAりィルスの 3者に分類される。 dsRNAりィルスグルヌプには、 レオ りィルス、 口倕りィルス、 怍物レオりィルス等があり、 分節型の耇数の線状 dsRN Aゲノムを有しおいる。 + ) 鎖りィルスには、 ポリオりむルス、 シンドビスゥ ィルス、 セムリキ森林りィルス、 日本脳炎りィルス等があり、 1本の + ) 鎖 &N Aをゲノムずしお有しおおり、 この RNAゲノムは同時に mRNAずしおも機胜し、 耇補 や粒子圢成に必芁な蛋癜質を宿䞻现胞の翻蚳機胜に䟝存しお生産するこずができ る。 蚀い換えれば、 + ) 鎖 RNAりィルスが有するゲノム RNA自䜓が䌝播力を有す る。 なお、 本明现曞においお 「䌝播力」 ずは、 「感染や人工的な手法で栞酞を现 胞内に導入した埌、 现胞内に存圚する該栞酞が耇補埌、 感染性粒子たたはそれに 準ずる耇合䜓を圢成し、 別の现胞に次々ず䌝播するこずのできる胜力」 を蚀う。
( + ) 鎖 RNAりィルスに分類されるシンドビスりィルスや 䞀 鎖 RNAりィルスに 分類されるセンダむりィルスは、 䌝播力を有するが、 パルボりむルス科に分類さ れるアデノ随䌎りィルス Adeno-associated virus) は、 感染胜は有するが、 䌝 播カを有しない りィルス粒子が圢成されるためには、 アデノりむルスの同時感 染が必芁である 。 たた、 詊隓管内で人工的に転写されたシンドビスりィルス由 来の + ) 鎖 RNAは䌝播力を有するが、 詊隓管内で人工的に転写されたセンダむ りィルス RNAは + ) 鎖、 䞀 鎖ずもに䌝播力を有しない。
安党性の高いセンダむりィルス膜融合性リボ゜ヌムを䜜補するためには、 䌝播 力を有しない組換え䜓センダむりィルスを䜜出するこずが必芁ずなる。 これたで にも、 DI粒子のような䞍完党りィルスを利甚しお、 膜融合リポ゜䞀ムを䜜ろうず する詊みはなされおきたが、 䞍完党りィルスの増殖のためにはヘルパヌりィルス が必芁であったので、 感染性のあるヘルパヌりィルスが混入しおしたうずいう問 題があった。 即ち、 安党性の高いセンダむりィルス膜融合性リボ゜ヌムの原料ず なる 「有害なりィルスの混入のない、 䌝播力を有しないセンダむりィルス」 を単 離するためには、 センダむりィルスゲノムからのりィルス粒子の再構成のための 手法が確立しおいる必芁があ぀たが、 その方向の研究は粟力的に行なわれおいな かった。 りィルス粒子の再構成ずは、 「りィルスゲノムの栞酞を人工的に䜜補 し、 詊隓管内たたは现胞内においお、 もずのりィルスたたは組換え䜓りィルスを 䜜補するこず」 である。 
DNAをゲノム栞酞ずする DNAりィルスの再構成は比范的早くから行なわれおおり 、 䟋えば、 SV40 (J, Exp. Cel l Res. ,43,415-425, 1983) のように、 粟補したゲ ノム DNAそのものをサルの现胞に導入するこずにより行なうこずが可胜である。
RNAをゲノム栞酞ずする RNAりィルスの再構成は、 + ) 鎖 RNAりィルスにおいお開 発が先行した。 この理由は、 ゲノム RNAが、 同時に mRNAずしお機胜するからである 。 䟋えば、 ポリオりむルスでは、 粟補した RNA自䜓が䌝播力を有するこずが、 すで に 1959幎に報告されおいる (Journal of Experimental Medicine, 110,65-89, 195 9) 。 たた、 セムリキ森林りィルス Semliki forest virus; SFV) では、 宿䞻现 胞の DNA䟝存性 RNA転写掻性を利甚するこずにより、 cDNAを现胞内に導入するこず によっおりィルスの再構成が可胜であるこずが報告されおいる Journal of Vir ology,654107-41131991) 。
さらにはこれらの再構成技術を利甚しお、 遺䌝子治療甚ベクタヌの開発も進め られおいる [Bio/Technology, 11 , 916-920, 1993、 Nucleic Acids Research, 23, 1 495-1501 , 1995、 Human Gene Therapy, 6 116卜 1167 1995、 Methods in Cell Biol ogy, 43,43-53, 1994, Methods in Cell Biology,43, 55-78, 1994]。
ずころが、 前述したずおり、 センダむりィルスは産業的に有甚なりィルスずし お利甚しうる長所を倚数有しおいるにもかかわらず、 䞀 鎖 RNAりィルスであ るため、 再構成系が確立しおいなかった。 そのこずは、 りィルス cDNAを経由した りィルス粒子再構成系がきわめお困難だったこずに起因する。
前述したように 䞀 鎖 Aりィルスの RNA(vRNA; viral RNA)たたはその盞補 鎖 RNA(cRNA;complementary RNA)を単独で现胞内に導入しおも ( - ) 鎖舰りィル スは生成されないこずが明らかにされおいる。 このこずは、 + ) 鎖 RNAりィル スの堎合ず決定的に違う点である。 なお、 特開平 4-211377号公報には、 「負鎖 RN Aりィルスのゲノムに察応する cDNAおよび感染性の負鎖 RNAゥィルスの補造方法」 に぀いお蚘茉があるが、 該公報の実隓内容がそのたた蚘茉されおいる 「EMB0.J. , 9, 379-384 1990」 は、 実隓の再珟性がないこずが明らかずなり、 筆者みずから論 文内容を党面的に取り䞋げおいる EMB0.J. , 10, 3558, 1991参照 こずからしお、 特開平 4-211377号公報に蚘茉の技術が本発明の先行技術に該圓しないのは明らか 乙*あ ®。
(䞀 鎖 RNAりィルスの再構成系に぀いお、 むンフル゚ンザりむルスに関しお は報告がある (Annu.Rev. Microbiol . ,47, 765-790, 1993、 Curr. Opin. Genet. DEV. ,2, 77-81, 1992) 。 むンフル゚ンザりむルスは、 8分節ゲノムより構成され る 䞀 鎖 RNAりィルスである。 これらの報告によれば、 あらかじめそのうちの 1぀の cDNAに倖来性遺䌝子を揷入し、 たた倖来性遺䌝子を含む 8本すベおの cDNA から転写された RNAをあらかじめりィルス由来の NP蛋癜質ず䌚合させお MPずした 。 これらの RNPず、 RNA䟝存性 RNAポリメラヌれずを现胞内に䟛絊するこずにより 、 再構成が成立した。 たた、 䞀 鎖䞀本鎖 RNAりィルスに぀いおは、 ラブドり ィルス科に属する狂犬病りィルスで cDNAからのりィルス再構成に぀いおの報告が ある J. Virol .68, 713-719, 1994)。 埓っお、 ― 鎖 RNAりィルスの再構成系技術は基本的には公知のものずな぀ たが、 センダむりィルスの堎合は、 この手法をそのたた適甚しおも、 りィルスを 再構成するこずができなかった。 たた、 ラブドりィルスにおいおりィルス粒子が 再構成されたずいう報告に぀いおは、 マヌカ䞀遗䌝子の発珟や RT-PCR等で確認を 行なっおいるだけであり、 生産量の面から十分ずはいえなかった。 さらには、 埓 来は、 再構成に必芁な因子を现胞内で䟛絊する目的で、 倩然型のりィルスゃ組換 え型のワクチニァりィルス等のりィルスを、 再構成するべきりィルスの栞酞ず同 時に现胞に䟛絊しおおり、 再構成された所望のりィルスずそれらの有害なりィル スの分離が容易でないずいう問題があった。
発明の開瀺
本発明は、 センダむりィルスの膜融合性を利甚した、 D D S、 即ち生理掻性物 質のデリパリ䞀システムずしお、 安党性の高いものを開発するこずを課題ずする ο
もしセンダむりィルスにおいお、 栞酞を有しないりィルス粒子を補造するこず ができるならば、 安党性の高い膜融合性リボ゜ヌムを䜜補するこずが可胜である 。 しかし、 栞酞を有しないセンダむりィルス粒子を䜜補する方法は報告されおい ない。 そこで、 本発明者らはその代りに、 䌝播力を有しないセンダむりィルス粒 子を補造し、 安党性の高い膜融合性リポ゜䞀ムを䜜補するこずを目指しお研究を 進めた。 䌝播力を有しない組換え䜓センダむりィルスを原料ずしお甚いた堎合、 センダむりィルス由来の䞍掻化された RNAが膜融合性リポ゜䞀ム内に残る可胜性 は吊定できないものの、 野生型のりィルスを材料ずしお甚いる堎合よりもはるか に安党であるこずは明らかである。
本発明は、 より具䜓的には、 䌝播力を有しないセンダむりィルスを補造するこ ずを課題ずし、 補造できるか吊かは、 センダむりィルスの再構成技術を構築でき るか吊かに䟝存しおいる。 本発明者らは、 組換え䜓センダむりィルス再構成系の確立に関しお鋭意怜蚎を 行なった。 特に、 効率的な再構成条件すなわち现胞内に導入する栞酞や補助因子 等の量比等の詳现な怜蚎を行なった。 さらには、 組換え型のワクチニァりィルス 等の混入をなくするための怜蚎も行なった。
本発明者らはたず、 センダむりィルスの再構成詊隓に適甚するため、 センダむ りィルス DI粒子 defective interfering particle/EMBO. J. , 10, 3079-3085, 1991 参照 由来の cDNAたたはセンダむりィルスミニゲノムの cDNAを甚いお、 皮々の怜 蚎を行なった。 その結果、 现胞内に導入する、 cDNA、 転写耇補に関する cDNA矀、 および T7RNAポリメラヌれ発珟ュニッ卜である組換え䜓ワクチニァりィルスの量 比に぀いお、 効率の良い条件を芋い出した。 本発明者らは曎に、 センダむりィル ス党長の cDNAを + ) 鎖ず ― 鎖の䞡者ずも取埗し、 现胞内で + ) 鎖たたは (䞀 鎖のセンダむりィルス RNAが生合成されるようなプラスミ ドを構築し、 転 写耇補に関する cDNA矀を発珟しおいる现胞内に導入した。 その結果センダむりむ ルス cDNAよりセンダむりィルス粒子を再構成するこずに初めお成功した。 なお、 本発明者らによっお、 効率良い粒子再構成のためには、 现胞内に導入する cDNAの 圢態が線状よりも環状のほうが適圓であり、 たた 䞀 鎖 RNAが现胞内で転写さ れるよりも、 + ) 鎖 RNAが现胞内で転写されるほうが粒子圢成効率が高いこず が新たに芋い出された。
さらに、 本発明者らは、 T7RNAポリメラヌれ発珟ナニッ トである組換え䜓ワク チニァりィルスを甚いない堎合でもセンダむりィルスの再構成を行いうるこずを 芋い出した。 すなわち、 詊隓管内で転写したセンダむりィルス党長 RNAを现胞内 に導入し、 初期転写耇補酵玠矀の cDNAを T7プロモヌタ䞀支配䞋で転写させた堎合 、 りィルス粒子が再構成された。 このこずは、 初期転写耇補酵玠矀をすベお発珟 する现胞を構築すれば、 ワクチニァりィルスのようなヘルパヌりィルスを党く䜿 甚せずに組換え䜓センダむりィルスを䜜出するこずが可胜であるこずを瀺しおい る。 なお、 初期転写耇補酵玠矀をすベお発珟する现胞は、 「J. Virology, 68, 841 3-8417, 1994 j に蚘茉されおおり、 該蚘茉を参照しお圓業者が䜜出するこずが可 胜である。 なお、 該文献蚘茉の现胞は、 センダむりィルス遺䌝子のうち、 NP P/ C, L の 3者を染色䜓䞊に有しおいる 293现胞由来の现胞であり、 このものは、 NP  P/C, L の 3者の蛋癜質を発珟しおいる。
倚くのりィルスベクタ䞀の䟋から、 栞酞からりむルス粒子の再構成が効率よく できるならば、 所望のりィルス遺䌝子を組み換えたり、 倖来性遺䌝子を挿入した り、 たたは所望のりィルス遺䌝子を䞍掻化させたり、 欠倱させるこずは、 圓業者 にず぀お容易になしうるこずであるこずは明らかである。 即ち、 本発明においお 初めおセンダむりィルス粒子の再構成に成功したこずは、 本発明によっおセンダ ィりむルスの遗䌝子操䜜が可胜ずなったこずを意味するこずは、 圓業者には自明 のこずである。 䟋えば、 センダむりィルス構造䜓遗䌝子の少なくずも䞀郚を欠劂 させる DNAレベルでの遺䌝子操䜜を垞法に埓っお行い、 該組換え DNAから䌝播力を 有しないセンダむりィルス粒子を再構成するこずが、 本発明によっお可胜ずな぀ た。
すなわち本発明は以䞋のものを含む。
( 1 ) 1以䞊の機胜蛋癜質遺䌝子が欠倱たたは䞍掻化しおおり、 现胞感染胜を 有するが、 䌝播力を有しない組換え䜓センダむりィルスず、 所望の栞酞たたは薬 物を封入したリボ゜ヌムずを融合しお埗られる膜融合性リボ゜ヌム、
( 2 ) 組換え䜓センダむりィルスが、 センダむりィルスの M遗䌝子、 F遺䌝子 たたは HN遺䌝子のうち少なくずも 1以䞊の遺䌝子が欠倱たたは䞍掻化しおいるこ ずを特城ずする  1 ) に蚘茉の膜融合性リボ゜ヌム、
( 3 ) 組換え䜓センダむりィルスが倖来性遺䌝子を有するこずを特城ずする  1 ) たたは 2 ) のいずれかに蚘茉の膜融合性リボ゜ヌム、
( 4 ) ( a) ( 1 )〜  3 ) のいずれかに蚘茉の膜融合性リボ゜ヌムに含たれる組 換え䜓センダむりィルスの、 欠倱たたは䞍掻化しおいる遺䌝子に盞圓する遺䌝子 を染色䜓䞊に有し、 該遺䌝子を発珟しうる宿䞻で、 センダむりィルスの耇補酵玠 矀を発珟しうるもの、 b) (1)〜3) のいずれかに蚘茉の膜融合性リポ゜䞀 ムに含たれる組換え䜓センダむりィルスに含たれる RNAもしくは該 Aの cRNAを含 む RNA、 たたはこれらの RNAを生合成しうるナニッ ト、 c)所望の栞酞たたは薬物 を封入したリボ゜ヌムの 3者を含むキット、
(5) 宿䞻が動物、 動物に由来する现胞、 動物の組織たたは動物の卵であるこ ずを特城ずする 4) に蚘茉のキット、
(6) 動物が哺乳類であるこずを特城ずする 5) に蚘茉のキッ ト、
(7) 動物が鳥類であるこずを特城ずする 5) に蚘茉のキット、
(8) 1以䞊の機胜蛋癜質遺䌝子が欠倱たたは䞍掻化しおおり、 现胞感染胜を 有するが、 䌝播力および自埋耇補胜を有しない組換え䜓センダむりィルス、
(9) センダむりィルスの M遺䌝子、 F遺䌝子たたは HN遺䌝子のうち少なくずも 1以䞊の遺䌝子が欠倱たたは䞍掻化しおいるこずを特城ずする 8) に蚘茉の組 換え䜓センダむりィルス、 および
(10) 倖来性遺䌝子を有するこずを特城ずする 8) たたは 9)のいずれ かに蚘茉の組換え䜓センダむりィルス。
本発明においお、 「 1以䞊の機胜蛋癜質遺䌝子が欠倱たたは䞍掻化しおいるセ ンダむりィルス jは、 パラむンフルェンザ 1型に分類される株由来のものであれ ば良く、 䟋えば Zæ ª Sendai virus Z strain) 由来のもの、 フシミ株 Sendai virus Fushimi strain) 由来のもの等が挙げられる。 たた、 DI粒子等の䞍完党ゥ ィルスや、 合成したオリゎヌクレオチド等も、 材料の䞀郚ずしお䜿甚するこずが できる。 たた、 該りィルスでリボ゜ヌムず融合されるものは、 自埋耇補胜を保持 するもの、 たたは自埋耇補胜を保持しないもののどちらでも構わない。 䟋えば、 DI粒子等の䞍完党りィルス、 センダむりィルスのミニゲノムたたは合成したオリ ゎヌクレオチド等も䜿甚するこずができるが、 ゲノム RNAの䞡末端配列が、 现胞 内にトランスに䟛絊された耇補因子である NP P/Cおよび L蛋癜質により認識され お耇補するこずが必芁である。 組換え䜓センダむりィルスは、 所望の倖来性遺䌝子を挿入したり、 所望のゲノ ム遺䌝子を欠倱たたは改倉するこずが可胜である。 組換え䜓センダむりィルスは 、 たずえば免疫原性に関䞎する遺䌝子を䞍掻性化したり、 欠倱させたりするこず もできるし、 RNAの転写効率や耇補効率を高めるために、 䞀郚の遺䌝子を改倉した ものでも良い。 具䜓的には、 䟋えば耇補因子である NP遗䌝子、 P/C遺䌝子たたは L 遗䌝子の少なくずも䞀぀を改倉し、 転写、 耇補機胜を高めるこずもできる。 たた 、 構造䜓蛋癜質の 1぀である HN蛋癜質は、 赀血球凝集玠であるぞマグルチニン  hemagglutinin) 掻性ずノィラミニダ䞀れ (neuraminidase) 掻性ずの䞡者の掻性 を有するが、 䟋えば前者の掻性を匱めるこずができれば、 血液䞭でのりィルスの 安定性を向䞊させるこずが可胜であろうし、 䟋えば埌者の掻性を改倉するこずに より、 感染胜を調節するこずも可胜である。 むろん、 これらの蛋癜質の䟛絊原ず しおはゲノム RNA由来のものを甚いおも構わないし、 トランスに䟛絊されたものを 甚いおもよい。 たた、 膜融合に関わる F蛋癜質を改倉するこずにより、 膜融合リポ ゜䞀ムの融合胜を調節するこずもできる。 たた、 䟋えば、 现胞衚面の抗原分子ず なりうる F蛋癜質や HN蛋癜質の抗原提瀺ェビト䞀プ等を解析するこずが 、 再構成 系の確立により可胜ずなったため、 これを利甚しお抗原提瀺胜を匱めたセンダむ りィルス、 ひいおは抗原提瀺胜の匱たった膜融合性リボ゜ヌムを䜜補するこずも できる。 これらの改良もたた、 蛋癜質の䟛絊原ずしおはゲノム RNA由来のものを甚 いおも構わないし、 トランスに䟛絊されたものを甚いおもよい。
なお、 本発明に甚いる組換え䜓センダむりィルスは、 自立耇補胜を有しないも のである方が望たしい。 自立耇補胜を有しなければ、 感染埌现胞内で RNAが増殖す るこずがなく、 䞍芁な蛋癜質の合成が起こるこずがないなどの利点があるからで ある。
膜融合性リボ゜ヌム内に導入する栞酞、 薬剀ずしおは、 䟋えば、 アンチセンス (Drug Del ivery System, 10, 91-97, 1995) 、 デコむ (The Journal of Biologica 1 Chemistry, 267, 12403-12406, Γ 4) 、 リボザィム The Drug Del ivery System ,10,91-97,1995) 、 侉重鎖 DNA (现胞工孊、 13巻、 No.4, 277-285、 1994) 、 ブラ スミ ド DM (Methods Enzymology,221, 317-327, 1993) 、 RNAベクタ䞀、 および、 こ れらずキダリア䞀 (Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America, 89, 7934-7938, 1992) たたは、 蛋癜 (Journal of Biological Chemistry, 266 (6), 3361-3364, 1991) ずの耇合䜓、 さらには、 抗癌剀、 抗りィル ス剀、 トキシン ゞフテリアトキシン Biochim Biophys Acta 1192, 253-262,199 4 リシン Biochim Biophys Acta, 1070,246-252, 1991) 、 酵玠 (Immunology, 81, 280-284,1994) などが挙げられる。 図面の簡単な説明
図 1は pUC18/T7( + )HVJRz.DMの構成を瀺す図である。
図 2は pUC18/T7(- )HVJRz.DNAの構成を瀺す図である。 発明を実斜するための最良の圢態
以䞋実斜䟋により本発明を具䜓的に説明するが、 本発明はこれらの実斜䟋に限 定されるものではない。
[実斜䟋 1 ] センダむりィルス転写ュニッ ト pUC18/T7(-)HVJRz.DNAおよび pU C18/T7( + )HVJRz.DNAの䜜補
T7 プロモヌ倕䞀、 -)鎖 RNAが転写されるように蚭蚈されたセンダむりィルス c DNA、 リポザィム遺䌝子をこの順に保持する DNAを、 pUC18プラスミ ドに挿入したプ ラスミ ド pUC18/T7(-)HVJRz.DNAを䜜補した。 たた、 T7 プロモヌ倕䞀、 + )鎖 RNAが 転写されるように蚭蚈されたセンダむりィルス cDNA、 リポザィム遺䌝子をこの順 に保持する DMを、 pUC18プラスミ ドに挿入したブラスミ ド pUC18/T7( + )HVJRz.DNA を䜜補した。 pUC18/T7(-)HVJRz.DNAおよび pUC18/T7( + )HVJRz.DNAの構成を図 1お よび図 2に瀺した。
[実斜䟋 2] cDNAからのセンダむりィルス再構成実隓 盎埄 6 c mのブラスチヅクシャヌレに通垞のトリブシン凊理を斜した LLC-MK2现 胞を 2 000 000個ず MEM培地 (MEM +FBS 10%) 2mlずを添加し、 C02 5Ÿ 37°Cの条件 䞋で 24時間培逊した。 培逊液を取り陀き、 1mlの PBSを甚いお掗浄した埌、 倚重感 染床 moi/multiplicity of infection) が 2ずなるように調補した、 T7ポリメ ラヌれを発珟する組換えワクチニァりむルス VTF7-3を 0.1mlの PBSに想濁したもの を添加した。 15分毎にゥィルス液が党䜓にいきわたるようにシャヌレを揺らし、 1時間の感染を行った。 りィルス溶液を陀去し、 1mlの PBSを甚いお掗浄した。 こ のシャヌレに、 cDNA溶液を含む培地を添加した。 cDNA溶液を含む培地の䜜補は、 以䞋のように行なった。
衚に蚘した栞酞 センダむりィルスの耇補に必芁な因子を発珟するブラスミ ド 、 pGEM-L, pGEM-P/C, pGEM-NP を含む を 1.5mlのサンプリングチュヌブにずり 、 HBS(Hepes buffered saline ; 20mM Hepes pH7.4, 150mM NaCl )を加えお総量を 0.1mlにした。 衚䞭の - )たたは + )cDNAは、 ブラスミ ド pUC18/T7(- )HVJRz.DNAた たは pUC18/T7( + )HVJRz.DNAそのものを瀺し、 /Cは環状のたた、 /Lは制限酵玠 Mlul により盎鎖化した埌に现胞に導入しおいるこずを瀺す。
他方、 ポリスチレンチュヌブの䞭で、 HBS 0.07ml , D0TAP (ベ䞀リンガヌマンハ ィム瀟補 )0.03mlを調合し、 栞酞溶液をこのポリスチレンチュヌブに移した。 この 状態で、 10分静眮した。 これに、 现胞培逊液 2ml MEM +FBS 10%) を添加した。 さらにこの䞭にワクチニァりィルスの阻害剀であるリファンビシン Mfampicin ) ずシトシンァラビノシド C (Cytosin arabinoside C/Ara C) を最終濃床がそ れぞれ 0.1mg/ml, 0.04mg/mlずなるように添加した。 これにより、 cDNA溶液を含む 培地が䜜補された。
前蚘のシャヌレを 40時間 C02 5Ÿ 37°Cの条件䞋で培逊した。 ラバヌポリスマン を甚いおシャヌレ内の现胞をかき取り、 ゚ツペンドルフチュヌブに移し 6000rpm、 5分間の遠心を行っお现胞成分だけを沈殿し、 再床 lmlの PBSに懞濁した。 この现胞 液の䞀郚をそのたたの状態、 あるいは垌釈しお 1 0日霢の発育鶏卵に接皮した。 この现胞液を第 1衚に瀺した现胞数ずなるように PBSで垌釈し、 0.5ml 接皮した卵 を 35。C72時間培逊埌 4 °Cに移しお䞀晩眮いた。 この卵の挿尿液をりィルス液ずし お泚射噚ず泚射針を甚いお回収した。
回収したゥむリレス液の腊 (hemagglutinin unit)ず、 PFU(plaque forming uni t )の枬定を以䞋に瀺す方法で行った。
HAUの枬定は以䞋のように行なった。 鶏の血液を、 400x gで 10分間遠心し、 䞊枅 を捚おた。 残る沈殿を、 沈殿の 100倍量の PBSで濁し、 これをさらに 400x g10分 間遠心し、 䞊枅を捚おた。 この操䜜をさらに 2回、 繰り返し、 0. 1%血球溶液を䜜 補した。 りィルス溶液を段階垌釈法により 2倍ず぀に垌釈し、 その 0.05mlず぀を、 96穎の倕むタ䞀プレヌトに分泚した。 この倕むタ䞀プレヌトに、 さらに 0.05mlず ぀の血球溶液を分泚し、 軜く振動させおよく混ぜた埌、 4°Cで 40分静眮した。 その 埌、 赀血球の凝集を肉県で芳察し、 凝集したもののうち、 もっずもりィルス溶液 の垌釈率の高いものの垌釈率を、 HAUずしお瀺した。
PFUの枬定は以䞋のように行なった。 CV-1现胞を、 6穎のカルチャヌプレヌト䞊 に単局になるように生育させた。 カルチャヌプレヌトの培地を捚お、 段階垌釈法 により 10倍づっに垌釈したりィルス溶液 0. 1mlず぀をそれぞれのカルチダ䞀プレヌ ト内ゥ゚ルに分泚し、 37°C、 1時間感染させた。 感染䞭に血枅の含たれおいない 2 XMEMず 2%寒倩を 55。Cで混ぜ合わせ、 さらに最終濃床 0.0075mg/mlずなるようにト リブシンを加えた。 1時間の感染埌、 りィルス溶液を取り陀き、 寒倩ず混合した培 地 3mlず぀をそれぞれのカルチャヌプレヌト内ゥ゚ルに加え、 5 %C02条件䞋で 37 。C3日間保枩した。 0.2mlの 0. 1 %プノヌルレツ ドを加え、 37°C 3時間保枩した埌 、 取り陀いた。 色の付いおいないプラヌクの数を数え、 りィルスの力䟡を PFU/ml ずしお評䟡した。
è¡š 1には、 LLC-M2现胞に導入した銬型ずなるセンダむりィルス cDM、 RNA耇補 に必芁な因子の cDMである pGEM-L、 pGEM-P/Cおよび pGEM-NPの量、 むンキュべ䞀シ ペン時間、 鶏卵に接皮した现胞数、 HAU、 PFU をそれぞれ瀺した。 è¡š 1 pGEM- pGEM- é“žåž‹ cD A 合蚈 ( g) 培泰時間 (&#) 现胞数 HAU PFU
L(ug) Nr(ug)
(+) cDNA/C 10 4 2 4 40 1 ππ X i nJ 512
(+) cDNA/C 10 4 2 4 40 00 X 1 fl^ 256 □ j u
10 4 2 4 40 J 256
α.
Figure imgf000016_0001
] U
(+)cDNAし 10 4 2 4 40 1 0ΩΧ 1 <2 <10
(+) cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00 Ϊ06 <2 <I0
(-) cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00 104 <2 <10
(-) cDNAL 10 4 2 4 40 1.00 105 <2 10
(-) cDNAし 10 4 2 4 40 1.00XI06 <2 <10
(-) cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00 104 <2 <I0
(-) cDNA/C to 4 2 4 40 1.00X105 <2 <IO
(-) cDNAC 10 4 2 4 40 1.00X106 4 8X 103
HAU, PFUをずもに瀺したサンプルを超遠心で沈枣ずした埌、 再浮遊しお 20°〜 6 0Ÿのショ糖密床募配遠心で粟補し、 12.5 DS-PAGEで蛋癜質を分離したずころ、 こ こに含たれる蛋癜質は、 センダむりィルスの蛋癜質ず同じ倧きさのものであった この結果から、 cDNAを现胞に導入しおセンダむりむルスを再構成できるこずが 瀺された。 たた、 + )鎖を転写する cDNAを现胞内に導入したずきには、 -)鎖を転 写する cDNAを導入したずきに比べおりィルス粒子が効率よく再構成されるこずが 瀺された。 さらに、 cDNAを環状のたたで導入したずきには、 盎鎖状にしお導入し たずきに比べおりィルス粒子が効率よく再構成されるこずが瀺された。
[実斜䟋 3 ] センダむりィルス再構成に必芁な RNA耇補因子の怜蚎
L, P/C, NPを発珟するブラスミ ドが䞉者ずもに必芁かどうかを調べる実隓を行 ぀た。 方法は実斜䟋 2ず同様であるが、 実斜䟋 2では cDNAずずもに、 pGEM-L pG EM-P/C, pGEM-NPの 3者を现胞内に導入したのに察し、 本実隓では、 pGEM-L, pGE M-P/C, pGEM- NPのうちの任意の 2者たたは䞀者のみを cDNAずずもに现胞内に導入 した。
è¡š 2は、 LLC- MK2现胞に導入した鎵型ずなるセンダむりィルス cDNA、 RNA耇補に 必芁な因子の cDNAである pGEM-L、 pGEM-P/Cおよび pGEM-NPの量、 むンキュべ䞀ショ ン時間、 鶏卵に接皮した现胞数、 HAU、 PFU をそれぞれ瀺した。
è¡š 2
Ÿ型 CDNA 合蚈  β) PGEM-L pGE -P/C pGEM-NP 培 Ÿ時 fg (時 现胞数 HAU PFU
(+) cDNA/C 10 40 1.00 105 256 6X 108 (+) cDNAC 10 40 1.00X10° 512 4ΧΪ09
(+)cDNA/C 10 40 1.00 106 <2 <10 (+) cDNA/C 10 40 1.00 106 <2 く 10
(+) cDNAC 10 40 1.00 10° <2 く 10 (+) cDNAC 10 40 1.00X106 2 <10
(+) cDNA/C 10 40 1.00X ΪΟ6 <2 clO (+) cDNA/C 】0 40 Ι.00ΧΪ06 <2 clO
(+) cDNA/C 10 40 .oox 106 <2 clO (+) cDNA/C 10 40 1.00X 10 <2 clO
(+) cDNAC 10 0 40 1.00X106 <2 ;10 (+) cDNA/C 10 0 40 1.00X106 <2 :】0
(+) cDNA/C 10 0 40 1.O0X 106 <2 :10 C+)cDNA/C 10 0 40 1.00X 106 <2 :10 è¡š 2から、 どの組合わせの 2者を導入した堎合もりィルスの生産が認められな かった。 この結果、 この 3皮の蛋癜質すべおが、 再構成には必須であるこずが確
6'じ、 れ
[実斜䟋 4 ] in V ro-転写 RNAからのセンダむりィルス再構成実隓
実斜䟋 2で、 cDNAからセンダむりィルスが再構成されるこずを瀺したが、 さら に cDNAを in vitroで転写した産物、 すなわち vRNA および cRNAでも同様のこずが できうるかどうかを怜蚎した。
センダむりィルス転写ュニッ ト pUC18/T7( -)HVJRz.DNAおよび pUC18/T7( + )HVJRz .DNAを制限酵玠 Mlulで盎鎖状にした埌、 これを銃型ずしお甚い、 粟補 T7ポリメラ —れEPICENTRE TECHNOLOGIES: Ampliscribe T7 Transcription Kit)による in v itro RNA合成を行った。 in vitro RNA合成の方法はキッ トのプロトコルに埓った 。 ここで埗られた RNA産物を、 実斜䟋 2の cDNAの代わりに甚い、 同様の実隓を行い 、 りィルス生産の評䟡は HA詊隓により行った。 結果を衚 3に瀺す。
è¡š 3
miMk 合針 ( u g) GE -L(ug) pGE -P/C(ug) pGEM-NF(ug) 培卷時 時 现胞数 HAU PFU in vitro(-)RNA 1 0 4 2 4 40 I .OOE+06 5 1 2 2 X 10リ in vilro(-)RNA 1 0 4 2 4 40 1.00E+06 5 1 2 ^° in vi(ro(+)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 2 ' 103 in vitro(+)RNA 1 0 4 2 4 40 1.00E+06 <2 ND この結果より、 どちらのセンスの RNAを现胞内に導入しおも、 りィルスを再構成 するこずができた。 産業䞊の利甚の可胜性
本発明によっお、 センダむりィルス cDNAから効率よくりィルス粒子を再構成す る系が確立され、 センダむりィルスにおける遺䌝子操䜜が可胜ずなった。 その結 果、 1以䞊の機胜蛋癜質遺䌝子が欠倱たたは䞍掻化しおおり、 现胞感染胜を有す る力 䌝播力を有しない組換え䜓センダむりィルスが補造できるようになった。 そしお、 センダむりィルスの膜融合性を利甚した、 D D S、 即ち生理掻性物質の デリバリ䞀システムずしお、 安党性の高いものを提䟛するこずが可胜ずなった。

Claims

請求の範囲
1 . 1以䞊の機胜蛋癜質遺䌝子が欠倱たたは䞍掻化しおおり、 现胞感染胜を有す るが、 䌝播力を有しない組換え䜓センダむりィルスず、 所望の栞酞たたは薬物を 封入したリボ゜ヌムずを融合しお埗られる膜融合性リボ゜ヌム。
2 . 組換え䜓センダむりィルスが、 センダむりィルスの M遺䌝子
、 F遺䌝子たたは HN遺䌝子のうち少なくずも 1以䞊の遺䌝子が欠倱たたは䞍掻化 しおいるこずを特城ずする請求の範囲 1に蚘茉の膜融合性リボ゜ヌム。
3 . 組換え䜓センダむりィルスが倖来性遺䌝子を有するこずを特城ずする請求の 範囲 1たたは 2のいずれかに蚘茉の膜融合性リボ゜ヌム。
4 . (a)請求の範囲 1〜 3のいずれかに蚘茉の膜融合性リボ゜ヌムに含 たれる組 換え䜓センダむりィルスの、 欠倱たたは䞍掻化しおいる遺䌝子に盞圓する遺䌝子 を染色䜓䞊に有し、 該遺䌝子を発珟しうる宿䞻で、 センダむりィルスの耇補酵玠 矀を発珟しうるもの、 b)請求の範囲 1〜 3のいずれかに蚘茉の膜融合性リ ポ゜ —ムに含たれる組換え䜓センダむりィルスに含たれる RNAもしくは該 RNAの cRNAを 含む RNA、 たたはこれらの RNAを生合成しうるナニッ ト、 c )所望の栞酞たた は薬 物を封入したリボ゜ヌムの 3者を含むキット。
5 . 宿䞻が動物、 動物に由来する现胞、 動物の組織たたは動物の卵であるこずを 特城ずする請求の範囲 4に蚘茉のキット。
6 . 動物が哺乳類であるこずを特城ずする請求の範囲 5に蚘茉のキッ ト。
7 . 動物が鳥類であるこずを特城ずする請求の範囲 5に蚘茉のキッ ト。
8 . 1以䞊の機胜蛋癜質遺䌝子が欠倱たたは䞍掻化しおおり、 现胞感染胜を有す るが、 䌝播力および自埋耇補胜を有しない組換え䜓センダむりィルス。
9 . センダむりィルスの M遺䌝子、 F遺䌝子たたは HN遺䌝子のうち少なくずも 1以 䞊の遺䌝子が欠倱たたは䞍掻化しおいるこずを特城ずする請求の範囲 8に蚘茉の 組換え䜓センダむりィルス。 18
1 ° · 倖来性遺䌝子を有するこずを特城ずする請求の範囲 8たたは 9のいずれか に蚘茉の組換え䜓センダむりィルス。
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