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WO1997016538A1 - Vecteur de virus d'arn a brin negatif possedant une activite de replication autonome - Google Patents

Vecteur de virus d'arn a brin negatif possedant une activite de replication autonome Download PDF

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Publication number
WO1997016538A1
WO1997016538A1 PCT/JP1996/003068 JP9603068W WO9716538A1 WO 1997016538 A1 WO1997016538 A1 WO 1997016538A1 JP 9603068 W JP9603068 W JP 9603068W WO 9716538 A1 WO9716538 A1 WO 9716538A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rna
gene
host
complex
virus
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/003068
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshiyuki Nagai
Atsushi Kato
Fukashi Murai
Makoto Asakawa
Tsuneaki Sakata
Mamoru Hasegawa
Tatsuo Shioda
Original Assignee
Dnavec Research Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dnavec Research Inc. filed Critical Dnavec Research Inc.
Priority to HK99103082.5A priority Critical patent/HK1018287B/xx
Priority to CA002236113A priority patent/CA2236113C/en
Priority to DE69634904T priority patent/DE69634904T2/de
Priority to KR1019980703189A priority patent/KR100552387B1/ko
Priority to AU73351/96A priority patent/AU7335196A/en
Priority to EP96935402A priority patent/EP0864645B9/en
Priority to DK96935402T priority patent/DK0864645T3/da
Priority to AT96935402T priority patent/ATE298789T1/de
Publication of WO1997016538A1 publication Critical patent/WO1997016538A1/ja
Priority to US09/070,938 priority patent/US6723532B2/en

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    • C12N2760/18851—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/18852—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Definitions

  • the present invention relates to a virus vector used for gene therapy and the like. Specifically, the present invention relates to a (1) strand RNA virus vector.
  • viruses vectors obtained by recombining the genes of a virus may cause genes to be inserted into unspecified positions in chromosomal DNA, even if a therapeutic effect is observed. If the possibility of recombinant virus or pathogenic virus being released into the natural world or the inability to control the expression of a gene introduced into cells cannot be ruled out, it is necessary to take extremely careful treatment. . At present, many gene therapies using recombinant viruses have already been performed. Many gene therapy clinical protocols have been submitted. The nature of these recombinant virus vectors depends largely on the nature of the virus from which the vector is derived.
  • the basic principle of the virus vector is a method of introducing a target gene into target cells using the infectivity of a virus.
  • the term “infectivity” refers to “the ability to introduce a nucleic acid or the like inside a virus into cells by retaining the ability to adhere to cells and the ability to fuse membranes”.
  • Virus-derived nucleocapsid envelope protein, etc. is present on the surface of a recombinant virus vector that has been subjected to genetic manipulation such as insertion of a target gene into a virus gene, and infection of the virus from which it is derived. It has the ability to introduce recombinant genes inside cells into cells.
  • Such a recombinant virus vector Can be used not only for the purpose of gene therapy, but also for the production of cells expressing the target gene and the production of transgenic animals.
  • Virus vectors are classified into three groups: retrovirus vectors, DNA virus vectors, and RNA virus vectors.
  • Retrovirus vector derived from a retrovirus. Retroviruses replicate through the following process. First, after infection is established, complement RNA is generated by using its own RNA as type II and autologous reverse transcriptase as at least a part of the catalyst to generate complementary strand DNA (cDNA). Into a provirus. Blovirus is transcribed by a DNA-dependent RNA transcriptase from the host species, producing viral RNA. Viral RNA is packaged by the gene products that it encodes and becomes virus particles.
  • Retroviral vectors that are generally used for gene therapy, etc., retain their ability up to the process of provirus generation, but are defective viruses that remove the genes required for packaging. It is constructed so that no particles are formed.
  • retrovirus examples include mouse leukemia virus, feline leukemia virus, baboon type C oncovirus, human immunodeficiency virus, and adult T-cell leukemia virus.
  • retrovirus vectors include those based on mouse leukemia virus [Virology, 65, 1202 (1991), Biotechniques, 9, 980 (1989), Nucleic Acids Research].
  • a retrovirus vector is a vector created for the purpose of efficiently integrating specific DNA into chromosomal DNA.However, since the insertion position of the target gene cannot be predicted, the normal gene is lost due to insertion inactivation. The possibility of damage, activation of oncogenes, or overexpression or suppression of the target gene cannot be ruled out. To overcome this problem, the development of a transient expression system using a DNA virus vector that can be used as an extrachromosomal gene was promoted.
  • a DNA virus vector is a vector derived from a DNA virus.
  • a DNA virus retains DNA as genetic information in a virus particle, and its DNA is replicated with its own DNA as type III and with a host-derived DNA-dependent DNA replication enzyme as at least a part of the catalyst. This is accomplished by repeating the process of generating a complementary strand.
  • a DNA virus vector that can be used as an extrachromosomal gene for example, in the case of Adenovirus vector, “Nature Genetics, 3, 2 (1993)” can be exemplified as an example of actual gene therapy.
  • RNA virus vectors based on RNA viruses which are considered to be safer than the above-described virus vectors, are being developed.
  • RNA virus replication is performed by repeating the process of generating a complementary strand by using its own RNA as type II and catalyzing an autologous RNA-dependent RNA replication enzyme as a catalyst.
  • Genomic RNA of (+) strand RNA virus simultaneously functions as messenger RNA (hereinafter simply referred to as “mRM”) and produces proteins required for replication and particle formation depending on the translation function of host cells. can do.
  • the genomic RNA of the (+)-strand RNA virus itself has propagating power.
  • the term “propagation power” refers to “infectious particles or a complex equivalent thereto” after the nucleic acid present in the cell is replicated after the nucleic acid is introduced into the cell by infection or artificial techniques. The ability to form a body and spread to other cells.
  • (+) Strand RNA classified as RNA virus Sendai virus which is classified as Dobis virus or (single-strand) RNA virus, has infectivity and spreadability.
  • Adeno-associated viruses classified in the parvoviridae family are infectious, but not transmissible (co-infection with an adenovirus is necessary for the formation of virus particles).
  • the (+) strand RNA derived from Sindbis virus artificially transcribed in a test tube has a propagating power (forms virus particles when introduced into cells), but is artificially transcribed in a test tube.
  • the transcribed Sendai virus MA has no propagating power in both the (+) and (1) chains (it does not form virus particles when introduced into cells).
  • RNA virus vector in (+) strand RNA virus Due to the advantage that genomic RNA is also mRNA, the development of an RNA virus vector in (+) strand RNA virus has preceded the development of [Bio / Technology, 11, 916-920 (1993), Nucleic Acids Research, 23, 1495-1501 (1995), Human Gene Therapy, 6, 1161-1167 (1995), Methods in Cell Biology, 43, 43-53 (1994), Methods in Cell Biology, 43, 55-78, 1994] .
  • an RNA virus vector derived from Semliki forest virus (SFV) or Sindbis virus deletes a structural gene region related to a virus structure from genomic RNA, and the virus It has a basic structure consisting of a gene that retains the transcription / replication protein gene group and RNA in which a desired exogenous gene is connected downstream of the transcription promoter.
  • RNA or cDM capable of transcribing the RNA is introduced into cells by direct injection or the like.
  • the autonomous replication of the RNA vector containing the foreign gene and the transcription of the foreign gene downstream of the transcription promoter occur, and the desired foreign gene product is expressed in the cell.
  • a cDNA unit helper
  • a cDNA unit expressing the above-mentioned RNA vector coexist in a packaging cell, it has infectivity but has no transmitting power.
  • the complex was successfully made.
  • recombination occurred between the helper-derived RNA and the vector RNA, causing the appearance of infectious particles.
  • the positive (+) strand RNA virus It was found that a spike protein present in the cuboidal cabsid catalyzes this recombination. Therefore, attempts have been made to solve this problem by introducing a mutation into the spike protein [Bio / Technology, 11, 916-920 (1993)].
  • RNA virus vector As described above, a (+)-strand RNA virus vector is expected as a vector having RNA autonomous replication ability, but the following problems exist when used as a vector for gene therapy.
  • ⁇ ⁇ Because it is derived from a virus transmitted by insects such as mosquitoes, if a wild-type virus is mixedly infected with an animal into which a vector gene has been introduced, there is a possibility that a recombinant capable of transmitting the virus will be produced. In addition, there is a risk that the recombinant may be scattered by insects into nature.
  • RNA virus vector derived from a (1) strand RNA virus is constructed. That is, it is known that ( ⁇ )-strand RNA virus does not retain the icosahedral capsid, and that the size of the particle envelope changes depending on the content of RNA contained therein. When used as a vector, it is presumed that the size of the exogenous gene is not easily restricted.
  • a group of transcription-replication proteins is packaged in the particle, the cell contact is made before the nucleic acid is released from the packaged complex to the cell and is replicated. Only two stages are required: dressing and membrane fusion.
  • viral RNA alone has no propagating power, and that particles having propagating power easily cause membrane fusion and are amplified in cells. Inspection is easy. Also, (1) strand RNA viruses are not transmitted by insects.
  • (1) strand RNA viruses have many advantages that can be used as materials for industrially useful viral vectors
  • the (1) strands useful for gene therapy to date have been used.
  • substitution of virus particles refers to artificially producing nucleic acid of the virus genome and producing the original virus or recombinant virus in a test tube or in a cell.
  • Influenza virus is a (single-strand) RNA virus composed of an eight-segment genome. According to these reports, the exogenous gene was inserted into one of the cDNAs in advance, and the RNA transcribed from all eight cDNAs including the exogenous gene was previously associated with the NP protein derived from the virus. RNP. By supplying these RNPs and RNA-dependent RNA polymerase into cells, reconstitution was established.
  • rabies virus belonging to the family Rhabdovirus reconstituted from cDNA (J. Virol. 68, 713-719 (1994)).
  • the reconstituted virus has only been confirmed by marker gene expression, RT-PCR, etc., and a reconstitution system that can be sufficiently used as a vector virus in terms of production volume has not been established.
  • viruses such as natural viruses and recombinant vaccinia viruses are simultaneously infected into cells into which cDNA is introduced. Separation is not easy.
  • RNA virus vectors in general, RNA replication does not affect host replication or transcription when a large amount of replicated and transcribed RNA has an undesirable effect on the treated human or animal. It is thought that it is necessary to prepare a viral vector replication inhibitor in advance, but no such inhibitor has been developed. Disclosure of the invention
  • the problem to be solved by the present invention is to develop a (1) strand RNA virus vector that can be put to practical use. Another object is to develop a method for efficiently producing the vector. Another object is to develop an inhibitor of the growth of the vector.
  • the present inventors firstly developed a Sendai virus from the nucleic acid of Sendai virus, which is considered to be the most representative of (1) strand RNA virus, and which is considered to be the most useful industrially in terms of safety and convenience. Tried to reconfigure. First, for application to the reconstitution test, cDNA derived from Sendai virus DI particles (see Defective interfering particles / EMBO J., 10, 3079-3085 (1991)) or cDNA of the Sendai virus minigenome should be used as the test material. Various studies were carried out by.
  • vaccinia virus which is a cDNA group related to cDM, transcription and replication, and T7 RNA polymerase expression unit to be introduced into cells.
  • the present inventors further obtain both Sendai virus full-length cDNAs of both the (+) and (1) strands of cDNA, and intracellularly synthesize (+) or ( ⁇ ) strand Sendai virus RNA.
  • Such a plasmid was constructed and introduced into cells expressing a group of cDNAs related to transcriptional replication. As a result, we succeeded in reconstructing Sendai virus particles from Sendai virus cDNA for the first time.
  • the present inventors have found that the Sendai virus can be reconstituted without using a recombinant vector virus, which is a T7 RNA polymerase expression unit. That is, when the Sendai virus full-length RNA transcribed in a test tube was introduced into cells, and the cDNA of the initial transcriptase group was transcribed under the control of the T7 promoter, the virus particles were reconstituted. This means that if cells are constructed that express all of the initial transcriptases, the recombinant Sendai virus, and thus the complex described above, will be produced without using any helper virus such as vaccinia virus. It is possible that Cells expressing all of the initial transcriptase groups are described in "J.
  • Virology, 688413-8417 (1994) Can be created.
  • the cells described in the literature are cells derived from 293 cells having three NPs and P / L on the chromosome among the Sendai virus genes. It expresses three proteins, C and L.
  • the virus particles can be efficiently reconstituted from the nucleic acid, the desired viral gene is recombined, a foreign gene is inserted, or the desired viral gene is inactivated.
  • deletion is an easy task for those skilled in the art. For example, if at least a portion of the Sendai virus structural gene is deleted and the RNA of the replication enzyme group is introduced into the cell, the enzymes required for initial transcription and replication are transferred into the cell. It is clear from the report using DI particles (J. Virol. 68, 8413-8417 (1994)) that subsequent autonomous replication is possible if supplied.
  • an RNA containing an exogenous gene transcribed from a specific viral cDNA that lacks at least a portion of the structural gene and the genes of the group of replication enzymes are normal, including an early transcriptase
  • it can be wrapped in a virus structure, it is possible to create a complex that functions as a vector for an exogenous gene that has cell infectivity and RNA autonomous replication ability but lacks the ability to propagate.
  • Such a complex is extremely effective as a vector for gene therapy. That is, according to the present invention, in the (-) strand RNA virus, production of a complex having cell infectivity and RNA autonomous replication ability, but lacking the propagating ability, for example, production of a complex containing an early transcriptase is required. It has become possible.
  • the present inventors further infect a cell expressing a structural protein corresponding to a gene in which RNA has been deleted or inactivated in the complex with the complex, and amplify the complex to amplify the same complex.
  • Method developed In order to amplify the above-mentioned complex, we focused on bird eggs, which are one of the most suitable sites for the growth of Sendai virus, and identified at least one gene among the M, F, and HN genes of Sendai virus. The transgenic birds and their eggs and their cells, which are retained on the chromosome, were found to be suitable for complex amplification.
  • Methods for producing transgenic birds are known [Poltry Sc i, 65, 1445-1458 (1986), Bio / Technology, 12, 60-63 (1994)], M, F, and HN genes. Creating genetic birds is within the skill of the art. It is preferable that, among the M, F, and HN genes, a protein encoded by a gene involved in the lack of transmissibility of RNA contained in the complex is produced in transgenic birds.
  • the inventor has further developed a method for producing the composite described above.
  • the following is an example of the case of Sendai virus.
  • the genome of Sendai virus strain Z (Viology, 108, 318-324 (1981)) is a single-stranded RNA consisting of 15384 nucleotides. Its entire nucleotide sequence has been determined from cDNA clones using reverse transcriptase (Nucleic Acids Research, 11, 7317-7330 (1983), Nucleic Acids Research, 12, 7965-7972 (1984), Nucleic Acids Research, 14, 1545-1563 (1986)). Since genomic RNA is a (one) strand, the transcriptases present in the virus particle perform transcription and replication with the genomic RNA as type II.
  • NP proteins encoded by genomic RNA
  • M proteins encoded by genomic RNA
  • F proteins encoded by genomic RNA
  • HN proteins encoded by genomic RNA
  • L proteins encoded by genomic RNA
  • RNA virus from which RNA is derived is Sendai virus
  • all of the genes involved in autonomous replication, NP, P / C, and L, and the transmission of RNA among the MsF and HN genes In a cell that expresses a group of genes related to lack of power, (1) cDNA that is transcribed into DNA, (2) a gene that encodes the RNA polymerase required to transcribe the cDNA in cells
  • the RNA itself transcribed from the cDNA in a test tube can be introduced together to reconstitute the infectious complex.
  • all genes related to autonomous replication, NP, P / C, and L, and genes related to lack of RNA transmissibility among M, F, and HN genes encode these genes.
  • Transient expression such as intracellular transfection of plasmin may be acceptable, but it is preferable that at least the genes related to the lack of RNA transmissibility be integrated into chromosomes and stably expressed.
  • the present inventors have further developed a method for producing the reconstituted complex in large quantities. Specifically, the complex is infected to a cell that does not have a gene group involved in autonomous replication, but expresses a gene group that is associated with a lack of transmissibility of M among M, F, and HN genes, This is a method for producing the complex. In this case, cells that do not have genes related to autonomous replication and that express genes related to the lack of RNA transmissibility among the M, F, and HN genes are required to transfer the genes for mass production. Expressing transgenic bird eggs are preferred.
  • the present inventors have further created cells for growing the complex containing the RNA and the protein.
  • the cell is a cell holding a gene corresponding to a group of genes involved in the lack of propagating power of RNA held by the complex, and a protein group encoding the gene is intracellularly contained therein.
  • the M, F, and HN genes do not need to be wild-type, but may be any as long as they have the same function as the wild-type.
  • the cell is preferably a cell used as a host of Sendai virus.
  • the proteins encoded by the genes corresponding to the genes associated with the lack of transmissibility in the vector virus RNA be produced intracellularly.
  • RNA-dependent RNA replication and RNA-dependent RM transcription are specifically inhibited without affecting the transcription or translation of cell-derived RNA.
  • An agent that suppresses only sex A replication was developed as an inhibitor of (1) strand RNA virus vector. That is, the present invention includes the following.
  • RNA containing Sendai virus RNA or Sendai virus cRNA in which at least one gene among genes corresponding to M, F, HN proteins is deleted or inactivated
  • a complex comprising the RNA according to (4) and a virus construct containing no Sendai virus-derived nucleic acid, the complex having cell infectivity and RNA autonomous replication ability but lacking propagating power,
  • (12) a host to which the complex according to any one of (1) to (3), (5), (7) or (8) can be transmitted; (13) A chromosome containing a group of genes related to infectivity of the complex according to any one of (1) to (3), (5), (7) or (8), and infecting the complex
  • a host that has at least one gene of the Sendai virus M gene, F gene, HN gene or a gene having the same function on the chromosome,
  • RNA contained in the complex according to any one of (1) to (3), (5), (7) or (8), cRNA of the RNA, or production of the RNA or the cRNA Synthetic unit
  • RNA contained in the complex according to any one of (1) to (3), (5), (7) or (8), cRNA of the RNA, or production of the RNA or the cRNA Synthetic unit
  • RNA contained in the complex according to any one of (3), (5) and (8) or cRNA of the RNA, or a unit capable of biosynthesizing the RNA or the cRNA b) Sendai All of the viral NP, P / C, and L proteins, or units that biosynthesize these proteins
  • the host is a cell that expresses a gene group lacking in RNA contained in the complex according to (7), among the transgenes related to transmitting power, A method for producing an exogenous protein,
  • a culture solution or an allantoic fluid containing an expressed exogenous protein which can be obtained by introducing the complex according to (7) into a host and collecting the culture solution or the allantoic fluid.
  • Any (1) strand RNA virus used as a material can be used as long as it has a propagating power. Incomplete viruses, such as DI particles, and synthesized oligonucleotides can naturally be used as a part of the material, but they must retain the same sequence as a virus having a transmitting power as a whole.
  • viruses included in the (1) strand RNA virus of the present invention include Sendai virus (Sendai virus) of the family Paramyxoviridae, Newcastle disease virus, Newcastle disease virus, Mumps virus, and Mumps virus.
  • Measles virus (RS), Respiratory syncytial virus (RS), Rinderpest virus (rrinderpest virus) distenno ⁇ ⁇ —— ⁇ Isores (distemper virus), Influenza virus from the Orthomyxoviridae family ), Rhabdoviridae vesicular stomatitis virus (Vesicular S), rabies virus (Rabies virus), and the like.
  • RNA virus As the material (single-strand RNA virus), a recombinant (single-strand) RNA virus having a transmitting power derived from any of the above viruses may be used. Recombinant
  • the strand RNA virus may have a partially modified gene, for example, in order to inactivate a gene involved in immunogenicity or to increase the efficiency of RNA transcription or replication.
  • the RNA contained in the complex of the RNA and the protein of the present invention can be obtained by transcribing a modified cDNA of any of the above viruses or recombinant viruses in a test tube or in a cell. Can be.
  • the RNA obtained at this time must have at least one gene involved in the transmissibility of the derived virus deleted or inactivated, but if the gene involved in autonomous replication is deleted or inactivated, No.
  • cDNAs with both ends of the viral genome, such as DI molecules are artificially replicated autonomously.
  • An RNA molecule having an artificial sequence obtained by transcribing the DNA into which the related gene group is inserted in a test tube or in a cell can also be used.
  • RNA of Sendai virus strain Z in which only the M gene has been deleted is suitable as a component contained in the complex j of the present invention.
  • all genes of M, F and HN are deleted. Those lost or inactivated are also suitable as components included in the “composite” of the present invention.
  • it is necessary that the genes encoding NP, P / C, and L are expressed from RNA.
  • these gene groups are not the virus-derived sequences as they are, if the activity in transcription and replication is equal to or higher than that of the natural type, mutations can be introduced or the corresponding genes of other viruses can be substituted. May be.
  • the “nucleic acid-free virus structure” of the present invention includes, for example, a virus obtained by removing only RNA from a virus.
  • a virus obtained by removing only RNA from a virus As this structure, one that complements the infectivity and the initial autonomous replication ability, but does not complement the propagation power is used.
  • Sendai virus a complex consisting of Sendai virus RNA from which only the M gene has been deleted and Sendai virus from which only RNA has been removed has infectivity and autonomous replication, but is transmitted. It is a composite without force.
  • the composite may contain other materials as long as it does not impart a propagation force.
  • the envelope surface may contain an adhesion factor, a ligand, a receptor, or the like that can adhere to a specific cell.
  • the RNA contained in the complex may have a foreign gene inserted into an appropriate site.
  • a foreign gene encoding the desired protein is inserted.
  • Sendai virus RNA it is desirable to insert a sequence having a multiple of 6 times the base between the R1 sequence (5'-AGGGTCAAAGT-3 ') and the R2 sequence (5, -GTAAGAAAA A_3,) (Journal of Virology, Vol .67 , No. 8, (1993) p.4822-4830).
  • Expression Efficiency The expression level of the inserted foreign gene can be adjusted by the position of the gene insertion and the RNA base sequence before and after the gene.
  • the host used to introduce the complex and express the protein is preferably a cell expressing a group of genes lacking in the RNA contained in the complex among the genes related to the transmissibility. Used.
  • transgenic bird eggs expressing the genes are particularly suitable for mass production.
  • the expressed protein can be recovered by a conventional method, for example, from a culture solution when using cultured cells as a host, or from serum when using a chicken egg as a host.
  • a complex having an infectivity was used. It will be appreciated by those skilled in the art that if a cell expressing a group of genes lacking in the RNA contained in the complex is used as a host, the same results as those of the complex having transmissibility in the Examples can be obtained. it is obvious.
  • the form of cDNA to be introduced into cells should be circular rather than linear, and (single-stranded) RNA would be better than transcribed in cells.
  • the present inventors have confirmed that the efficiency of particle formation is higher when (+) strand RNA is transcribed in cells.
  • These conditions are not always applicable to the reconstitution of all other (-) strand RNA viruses.
  • the conditions are also based on the contents described in this specification and common technical knowledge. It is possible to search for the conditions as appropriate, and by doing so, it is possible to establish a technology for producing the basic material of the desired (1) strand RNA virus vector, that is, to establish a virus reconstitution system. Clearly there is.
  • RNA replication inhibitor in the present invention, any agent that inhibits RNA-dependent RNA replication can be applied.
  • Ribavirin, TJ13025 and the like are preferably used.
  • a complex contained in the present invention is produced from Sendai virus cDNA deficient in the M gene (process of A ⁇ B), and the complex is further amplified (process of BC) The process is illustrated in FIG. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 illustrates the steps of producing a complex contained in the present invention from the Sendai virus cDNA lacking the M gene (process A ⁇ B), and further amplifying the complex (process B ⁇ C).
  • FIG. 1 illustrates the steps of producing a complex contained in the present invention from the Sendai virus cDNA lacking the M gene (process A ⁇ B), and further amplifying the complex (process B ⁇ C).
  • FIG. 2 shows the structure of pUC18 / T7 (+) HVJRz.DNA.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of pUC18 / T7 ( ⁇ ) HVJRz.DNA.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the time after infection of CV-1 cells with SeVgpl20, the HAU value and the expression level of gpl20.
  • Plasmid pUC18 / T7 (-) HVJRz.DNA in which a T7 promoter, Sendai virus cDNA designed to transcribe (-) strand RNA, and DNA containing a ribozyme gene in this order were inserted into plIC18 plasmid.
  • T7 Promoter Plasmid pUC18 / T7 (+) inserted into pUC18 plasmid with a Sendai virus cDNA designed to transcribe (+)-strand RNA and DM carrying ribozyme gene in this order HVJRz.DNA was prepared.
  • Figure 2 shows the structures of pUC18 / T7 (-) HVJRz.DNA and pUC18 / T7 (+) HVJRz.DNA.
  • the cells were cultured for 24 hours under the following conditions. After removing the culture solution and washing with 1 ml of PBS, the recombinant vaccinia virus expressing T7 polymerase vTF7 was prepared so that the multiplicity of infection (moi / multiplicity of infection) became 2. -3 was added to 0.1 ml of PBS and the suspension was added. The petri dish was shaken every 15 minutes so that the virus solution spread over the whole, and the infection was performed for 1 hour. The virus solution was removed and washed with 1 ml of PBS. A medium containing a cDNA solution was added to the petri dish. The medium containing the cDNA solution was prepared as follows.
  • nucleic acids listed in the table including plasmids that express factors necessary for Sendai virus replication, including pGEM-L, pGEM-P / C, and pGEM-NP
  • HBS Hepes buffered saline
  • 20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl 20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl
  • (+) cDNA in the table indicates brasmid pUC18 / T7 (-) HVJRz.DNA or pUC18 / T7 (+) HVJRz.DNA itself, / C remains circular, / L is restricted This indicates that the cells were linearized with the enzyme Mlul and then introduced into cells.
  • the HAU (hemmaglutinin unit) and PFU (plaque forming unit) of the recovered wheel solution were measured by the following methods.
  • the measurement of HAU was performed as follows. Chicken blood was centrifuged at 400 xg for 10 minutes, and the supernatant was discarded. The remaining precipitate was turbid with 100 times the volume of PBS (-), and the mixture was further centrifuged at 400 xg for 10 minutes, and the supernatant was discarded. This operation was repeated twice more to prepare a 0.1% blood cell solution.
  • the virus solution was diluted two-fold by the serial dilution method, and 0.05 ml of the solution was dispensed into a 96-well Thai evening plate. In the evening, 0.05 ml of a blood cell solution was further dispensed to the plate, mixed gently by gentle shaking, and allowed to stand at 4 ° C for 40 minutes. Thereafter, red blood cell aggregation was observed with the naked eye, and among the aggregated red blood cells, the dilution ratio of the highest dilution of the virus solution was indicated as HAU.
  • the measurement of PFU was performed as follows. CV-1 cells were grown as monolayers on 6-well culture plates. The culture medium in the culture plate was spread, and 0.1 ml each of the virus solution diluted 10-fold by a serial dilution method was dispensed into each culture plate and infected at 37 ° C for 1 hour. Serum-free 2 XMEM and 2% agar 55 during infection. C. The mixture was mixed with C, and tribine was further added to a final concentration of 0.0075 mg / ml. After 'infection 1 hour, the virus solution was removed, added in culture locations 3ml mixed with agar to each culture plate Ueru, 37 in 5% C0 2 conditions. C Insulated for 3 days. 0.2 ml of 0.1% phenol red was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 3 hours and then removed. The number of uncolored plaques was counted and the virus titer was evaluated as PFU / ml.
  • Table 1 shows Sendai virus cDNA and RNA replication of type II introduced into LLC-MK2 cells.
  • the amounts of pGEM-L, pGEM-P / C, and pGEM-NP, which are the cDNAs of the factors required for the incubation, incubation time, the number of cells inoculated into chicken eggs, HAU, and PFU are shown.
  • the Sendai virus can be reconstituted by introducing cDNA into cells.
  • virus particles were formed more efficiently than when cDNA transcribing the (-) strand was introduced.
  • the virus particles were reconstituted more efficiently than when the cDNA was introduced in a linear form.
  • Table 2 shows the amounts and incubations of gun-shaped Sendai virus cDNA introduced into LLC-MK2 cells, pGEM-L, pGEM-P / C and pGEM-NP, which are cDNAs of factors required for RNA replication. The numbers of cells inoculated into the eggs, HAU and PFU are shown.
  • Example 2 it was shown that Sendai virus was reconstituted from cDNA. However, it was further examined whether or not products obtained by transcribed cMA in vitro, that is, vRNA and cRNA could be used in the same manner.
  • Sendai virus transcription unit pUC18 / T7 (-) HVJRz.DNA and pUC18 / T7 (+) HVJRz.MA were linearized with the restriction enzyme Mlul, they were used as type III and purified T7 polymerase (EPICENTRE TECHNOLOGIES: Ampliscribe T7 Transcription Kit) was used for in vitro RNA synthesis.
  • the method of in vitro RNA synthesis followed the kit protocol.
  • the RNA product obtained here was used in place of the cDNA of Example 2, and a similar experiment was performed. Evaluation of virus production was performed by an HA test.
  • Primer a (5'-TGCGGCCGCCGTACGGTGGCAATGAGTGAAGGAGAAGT-3 ') (SEQ ID NO: 1) and primer d (5'-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTVTTACTACGGC GTACGTCATCTTTTTTCTCTCTGC-3p)
  • the gpl20 gene was amplified by standard PCR. TA cloning was performed, digested with Notl, and inserted into Notl-digested “pSeV18 +”. Next, this was transformed into E.Coli, DM of each colony of E.Coli was extracted by the “Miniprep” method, Drall II digestion was performed, and electrophoresis was performed.
  • a positive clone was obtained by selecting a clone that was confirmed to contain a DNA fragment of the required size (hereinafter, this positive clone is referred to as “clone 9”). After confirming that the desired nucleotide sequence was obtained, the DNA was purified by cesium chloride density gradient centrifugation. The obtained pSeV18 + into which pl20 was inserted is referred to as “pSeVgpl20j”.
  • pSeVgpl20 was further introduced into LLCMK2 cells, and the serum collected from the developing chicken eggs was collected in the same manner as in Example 2 to measure HAU and examine gpl20 expression (ELISA ). HAU measurement was performed in the same manner as in Example 2.
  • ELISA was performed as follows. A 100 ⁇ 1 sample was added to a 96 ⁇ 1 plate covered with a monoclonal antibody against HIV-1 and reacted at 37 ° C for 60 minutes. After washing with PBS, 100 ⁇ 1 HRP-conjugated anti-HIV-1 antibody was added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. After washing with PBS, tetramethylbenzidine was added, and the expression E of gpl20 was measured by detecting Si, a reaction product converted by HRP activity, at 450 nm absorbance under acidic conditions. The results are shown in Table 4 left.
  • the obtained virus solution was used to infect CV-1 cells, and the same examination was performed.
  • CV-1 cells were grown at 5 x 10 s cells per plate, the medium was discarded, washed with PBS (-), virus solution was added at a multiplicity of infection of 10, and the cells were infected at room temperature for 1 hour. .
  • the virus solution was discarded, the plate was washed with PBS (-), plain MEM medium (MEM medium supplemented with antibiotics AraC, Rif and trypsin) was added, and reacted at 37 ° C for 48 hours. After the reaction, the medium was recovered, and HAU was measured (the same method as in Example 2) and gpl20 expression was examined (ELISA).
  • the results are shown in the center of Table 4. Regenerate the culture supernatant of CV-1 cells. Table 4 right shows the HAU measurement results and gpl20 expression analysis (ELISA) results of the virus solution obtained after inoculating chicken eggs.
  • gpl20 was analyzed by Western plotting.
  • the medium of CV-1 cells infected with SeVgpl20 is centrifuged at 20,000 rpm for 1 hour to precipitate the virus, and TCA (10% (v / v), 15 minutes on ice) or 70% with TCA Treat with ethanol (-20 C), centrifuge at 5,000 rpni for 15 minutes, mix the precipitated protein K with “SDS-PAGE Sample buffer j (Chemistry)”, and allow to react at 90 ° C for 3 minutes.
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was carried out on a% acrylamide gel, proteins were transferred to PVDF membrane (Daiichi Kagaku) and reacted with monoclonal antibody 902 at room temperature for 1 hour. Then, the cells were washed with T-TBS, reacted with anti-mlgG (Amersham) for 1 hour at room temperature, washed with T-TBS, and reacted with HRP-bound protein A (Amersham) for 1 hour at room temperature. After washing with T-TBS, 4-chloro-1--1-naphthol (4CNPlus) (Daiichi Kagaku) was added to detect gpl20. As a result, a band was detected at the position of the expected molecular weight of gpl20.
  • Example 6 Propagation of SeVCTl20 and analysis of gpl20 expression in cells of various types HAU measurement and examination of gpl20 expression (ELISA) in the same manner as in Example 5 except that cells of various types were used. ). Table 5 shows the results.
  • the table on the left shows the time after infection of various types of cells with SeVgpl20. As a result, proliferation of SeVgpl20 and expression of gpl20 were detected in all cells examined.
  • primers (5'-AAG CGGCCGCCAAAGTTCACGATGGAAGAC-3 '(30mer)) (sequence ⁇ : 3) and primers (5'-TGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGATTATTACAGCTGCCTTCC) Using (SEQ ID NO: 4) and “pHvluciRT4” as type III, a luciferase gene having NotI sites added at both ends was isolated by standard PCR. Next Then, this was inserted into pSeV18 + digested with Notl to obtain a Sendai virus vector into which the luciferase gene was inserted.
  • the cells were introduced into LLCMK2 cells and inoculated into embryonated chicken eggs.
  • the chorioallantoic membrane of the developing egg was cut off, washed twice with cold PBS (-), added with “lysis buf ferj (Picagene WACO) 251-1, mixed well, and centrifuged at 15000 rpm for 2 minutes.
  • a sample of 51 was collected, added to a substrate (IATRON), placed in a 96-well plate, and the fluorescence intensity was measured with a luminometer (Luminous CT-9000D, DIA-IATRON).
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
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Description

明細書 自律複製能を有する （一） 鎖 RNAウィルスベクタ一
本発明は、 遺伝子治療等に用いられるウィルスベクターに関する。 詳しくは、 本発明は （一） 鎖 RNAウィルスベクターに関する。 技術背景
ヒトゃ動物に対する遺伝子治療において、 治療効果と安全性は極めて重要な課 題である。 特に、 ウィルスの遺伝子を組換えることにより得られる 「ウィルスべ ク夕一」 を用いて行われる治療は、 たとえ治療効果が認められる場合でも、 遺伝 子が染色体 DNAの不特定な位置に挿入されたり、 組換え体ウィルスや病原性ウィル スが自然界に放出されたり、 細胞内に導入された遺伝子発現の制御ができない等 の可能性を否定できない場合には、 治療行為を極めて慎重に行う必要がある。 現在、 組換え体ウィルスを用いた遺伝子治療がすでに多数行われている。 遺伝 子治療臨床プロトコールも数多く提出されている。 これらの組換え型ウィルスべ クタ一の性質は、 該ベクターが由来するウィルスの性質に多くを依存している。 ゥィルスべクタ一の基本原理は、 ウィルスの感染能を利用して目的遺伝子を標 的細胞内に導入する方法である。 なお、 「感染能」 とは、 本明細書においては 「 細胞への接着能および膜融合能等を保持していることにより、 細胞内にウィルス 内部の核酸等を導入することのできる能力」 のことを言う。 ウィルス遺伝子に目 的遺伝子を挿入する等の遺伝子操作を施した組換え型ウィルスベクターの表面に は、 ウィルス由来のヌクレオキヤプシドゃエンベロープ蛋白質等が存在しており 、 それが由来するウィルスの感染能を保有しているので、 その内部の組換え遺伝 子を細胞内に導入することが可能となる。 このような組換え型ウィルスベクタ一 は、 遗伝子治療の目的のみならず、 目的遺伝子発現細胞の作製、 卜ランスジェニ ック動物作製等の目的に使用することが可能である。
ウィルスベクターは、 レトロウイルスベクター、 DNAウィルスベクター、 RNAゥ ィルスべクタ一の 3者に分類される。
遺伝子治療において現在もっとも頻度高く用いられているベクタ一は、 レトロ ウィルスに由来するレトロウイルスベクタ一である。 レトロウイルスは、 以下の 過程を経て複製する。 まず、 感染成立後、 自己の RNAを銬型とし自己由来の逆転写 酵素を触媒の少なくとも一部とすることにより相補鎖 DNA (cDNA) を生成し、 いく つかの過程を経た後、 宿主染色体 DNAに挿入され、 プロウィルスとなる。 ブロウィ ルスは宿種由来の DNA依存性 RNA転写酵素により転写され、 ウィルス RNAが生成され る。 ウィルス RNAは、 自己のコードする遺伝子産物群によりパッケージされ、 ウイ ルス粒子となる。
一般に遺伝子治療等に利用されているレトロウィルスベクターとは、 プロウイ ルス生成の過程までの能力を保持するが、 パッケージに必要な遺伝子を除去して いる欠損型ウィルスであるために、 プロウィルスからウィルス粒子が形成される ことがないように構築されている。 レ トロウイルスとしては、 例えばマウス白血 病ウィルス、 ネコ白血病ウィルス、 ヒヒ C型オンコウィルス、 ヒト免疫不全ウィル ス、 成人 T細胞白血病ウィルス等を例示することができる。 さらには、 組換え型レ トロウィルスベクターとして報告されているものには、 マウス白血病ウィルスを 基本としたもの [Virology, 65， 1202( 1991 )、 Biotechniques, 9， 980( 1989)、 Nucle ic Acids Research, 18, 3587( 1990)、 Molecular and Cel lular Biology, 7,887( 19 87)、 Proceedings of National Academy of Sciences of United States of Ame rica，90, 3539( 1993)、 Proceedings of National Academy of Sciences of Unite d States of America, 86, 3519( 1989)等] 、 また、 ヒト免疫不全ウィルスを基本と したもの [Journal of Clinical Investigation, 88， 1043( 1991 )] 等が挙げられる レトロウィルスベクターはこのように、 特定の DNAを効率よく染色体 DNAに組込 むことを目的に作出されたベクターであるが、 目的遺伝子の挿入位置が予想でき ないため、 挿入失活により正常遺伝子が損傷を受けたり、 癌遺伝子を活性化した り、 目的遗伝子が過剰発現したり発現が抑制されたりする可能性を否定できない 。 この問題点を克服するために、 染色体外遺伝子として利用できる DNAウィルスべ クタ一を利用した一時的 （transient) な発現系の開発が進められた。
DNAウィルスベクタ一は、 DNAウィルスに由来するべクタ一である。 DNAウィルス は、 ウィルス粒子内に DNAを遺伝情報として保持するものであり、 その DNAの複製 は、 自己の DNAを铸型とし、 宿主由来の DNA依存性 DNA複製酵素を触媒の少なくとも 一部とすることにより、 相補鎖を生成するという過程の繰り返しによりなされる 。 染色体外遺伝子として利用できる DNAウィルスベクターとして、 例えばアデノウ ィルスべクタ一（Adenovirus vector)では、 実際の遺伝子治療例として 「Nature Genetics, 3,卜 2( 1993)」 を例示することができる。 しかしながら、 DNAウィルスべ クタ一の場合も、 核内で染色体 DNAとの望ましくない組換えが生じる可能性が高く 、 遺伝子治療用べクタ一として用いる場合には、 十分に注意を払う必要がある。 近年、 上述のウィルスベクターに比べて安全性の高いと考えられる、 RNAウィル スを基本とした RNAウィルスベクターが開発されつつある。 RNAウィルスの複製は 、 自己の RNAを錶型とし、 自己由来の RNA依存性 RNA複製酵素を触媒とすることによ り、 相補鎖を生成するという過程の繰り返しによりなされる。
( + ) 鎖 RNAウィルスが有するゲノム RNAは、 同時にメッセンジャー RNA (以下単 に 「mRM」 と称する） としても機能し、 複製や粒子形成に必要な蛋白質を宿主細 胞の翻訳機能に依存して生産することができる。 言い換えれば、 （+ ) 鎖 RNAウイ ルスが有するゲノム RNA自体が伝播力を有する。 なお、 本明細書において 「伝播力 」 とは、 「感染や人工的な手法で核酸が細胞内に導入された後、 細胞内に存在す る該核酸が複製後、 感染性粒子またはそれに準ずる複合体を形成し、 別の細胞に 伝播することのできる能力」 を意味する。 （+ ) 鎖 RNAウィルスに分類されるシン ドビスウィルスや （一） 鎖 RNAウィルスに分類されるセンダイウィルスは、 感染能 と伝播力とを有する。 パルボウイルス科に分類されるアデノ随伴ウィルスは、 感 染能を有するが、 伝播力を有しない （ウィルス粒子が形成されるためには、 アデ ノウィルスの同時感染が必要である） 。 また、 試験管内で人工的に転写されたシ ンドビスウィルス由来の （+ ) 鎖 RNAは伝播力を有する （細胞内に導 入されると ウィルス粒子を形成する） が、 試験管内で人工的に転写されたセンダイウィルス MAは （+ ) 鎖、 （一） 鎖ともに伝播力を有しない （細胞内に導入さ れてもウイ ルス粒子を形成しない） 。
ゲノム RNAが同時に mRNAであるという利点により、 （+ ) 鎖 RNAウィルスにおけ る RNAウィルスベクタ一の開発が先行した [Bio/Technology, 11 , 916-920( 1993 ), Nuc leic Acids Research，23, 1495-1501 ( 1995 )、 Human Gene Therapy, 6, 1161-116 7( 1995 )、 Methods in Cel l Biology, 43, 43- 53( 1994 )、 Methods in Ce l l Biology , 43, 55-78, 1994] 。 例えば、 セムリキ森林ウィルス（Seml iki forest vi rus ; SFV )やシンドビスウィルス（Sindbis virus)に由来する RNAウィルスベクターは、 ゲノ ム RNAのうち、 ウィルス構造体に関わる構造遺伝子領域を欠失させ、 ウィルスの転 写複製蛋白質遺伝子群を残したものと、 転写プロモーター下流に所望の外来性遺 伝子を接続した RNAを基本的な構造としている。 このような RNAまたは該 RNAを転写 せしめうる cDM [Nucleic Acids Research, 23, 1495- 1501 ( 1995 )、 Human Gene Th erapy, 6, 1161-1167( 1995 )] を直接注射等で細胞内に導入すると、 外来性 遺伝子 を含む RNAベクターの自律複製と転写プロモー夕一下流の外来性遺伝子の 転写と が起こり、 目的とする外来性遺伝子産物が細胞内に発現する。 さらに、 構造遺伝 子を発現する cDNAユニッ ト （ヘルパー） と、 上記の RNAベクタ一を発現す る cDNA ュニットとをパッケージング細胞内で共存させることにより、 感染能を有するが 、 伝播力を有しない複合体を作製することに成功した。 しかし、 パッケージング の途中でヘルパー由来の RNAとべクタ一 RNAとの間で組換えが起こり、 感染粒子が 出現するという現象が現れた。 そして、 （+ ) 鎖 RNAウィルスに特徴的な 正二十 面体構造のカブシド内に存在するスパイク蛋白質がこの組換えを触媒することが 判明した。 そこで、 スパイク蛋白質に変異を導入することによりこの問題を解決 することが試みられている [Bio/Technology, 11 , 916-920( 1993)] 。
このように RNA自律複製能を有するベクターとして、 （+ ) 鎖 RNAウィルスべク 夕一は期待されるが、 遺伝子治療用べクタ一として利用するには、 以下のような 問題点が存在する。
① 正二十面体構造のカブシドを有するため、 外来性遺伝子として挿入できるサ ィズが、 最大約 3700ヌクレオチドと限られている。
② パッケージされた複合体から核酸が細胞に放出され複製されるまでに、 細胞 接着、 エンドサイ トーシス、 膜融合、 脱殻、 複製酵素の翻訳という 5段階もの過 程が必要である。
③ パッケージングのときに伝播力のあるウィルス粒子がごく微量形成されると いう可能性が否定できない。 とくに、 感染力が弱まったウィルス粒子でも、 内部 の RNA自体は伝播力を持つので、 遅発的に増幅する可能性があり、 チェックするこ とが困難である。
④ 蚊等の昆虫により媒介されるウィルスに由来するため、 ベクター遺伝子を導 入された動物ゃヒ卜に野生型のウィルスが混合感染した場合、 伝播力を有する組 換え体ができる可能性があり、 さらにその組換え体が昆虫により自然界に飛散す る危険性がある。
以上の問題点は、 もし （一） 鎖 RNAウィルスに由来する RNAウィルスベクターが 構築されれば基本的に解決されると考えられる。 すなわち、 （―） 鎖 RNAウィルス は正二十面体構造のカプシドを保持せず、 しかも粒子のエンベロープの大きさは その内部に含まれる RNAの含畺によって変化することが知られており、 RNAウィル スベクターとして使用する場合に、 外来性遺伝子の大きさの制限は受けにくいこ とが推定される。 また、 粒子内に転写複製蛋白質群がパッケージされているため 、 パッケージされた複合体から核酸が細胞に放出され複製されるまでに、 細胞接 着、 膜融合の 2段階しか要しない。 さらには、 ウィルス RNA単独では伝播力を有せ ず、 かつ伝播力を有する粒子は容易に膜融合を起こして細胞内で増幅することが 確認できるため、 伝播力を有する粒子が存在するかどうかの検査が容易である。 また、 （一） 鎖 RNAウィルスは昆虫によって媒介されることはない。
このように （一） 鎖 RNAウィルスには産業的に有用なウィルスベクターの材料と して利用しうる長所を多数有しているにもかかわらず、 現在まで有用な遺伝子治 療用 （一） 鎖 RNAウィルスベクタ一は存在していない。 それは、 ウィルス cDNAを絰 由したウィルス粒子の再構成を行うことが極めて困難だったことに起因すると考 えられる。 即ち、 外来性遺伝子をべクタ一に導入するためには、 DNAレベル での 遗伝子操作が必要であるので、 外来性遺伝子を組込んだウィルス cDNAからウィル ス粒子が再構成されない限りは、 （―） 鎖 RNAウィルスをべクタ一として利 用す ることは困難であるのである。 なお、 「ウィルス粒子の再構成」 とは、 ウィルス ゲノムの核酸を人工的に作製し、 試験管内または細胞内において、 もとのウィル スまたは組換え体ウィルスを作製することである。
前述したように （一） 鎖 RNAウィルスの RNA(vRNA; viral RNA)またはその相補鎖 NA(cRNA; complementary RNA)を単独で細胞内に導入しても （一） 鎖 RNAウィルス は生成されないことが明らかにされている。 このことは、 （+ ) 鎖 RNAウィルスの 場合と決定的に違う点である。 なお、 特開平 4-211377号公報には、 「負鎖 RNAウイ ルスのゲノムに対応する cDNAおよび感染性の負鎖 RNAウィルスの製造方法」 につい て記載があるが、 該公報の実験内容がそのまま記載されている 「EMB0.J.，9，379- 384( 1990)」 は、 実験の再現性がないことが明らかとなり、 筆者みずから 論文内 容を全面的に取り下げている （EMB0.J, 10, 3558( 1991 )参照） ことからして、 特開 平 4-211377号公報に記載の技術が本発明の先行技術に該当しないのは明らかであ o
(一） 鎖 RNAウィルスの再構成系について、 インフルエンザウイルスに関しては 報告がある (Annu.Rev. Microbiol. ,47, 765-790( 1993)、 Curr. Op in. Genet. D EV. , 2, 77-81( 1992)) 。 インフルエンザウイルスは、 8分節ゲノムより構成される (一） 鎖 RNAウィルスである。 これらの報告によれば、 あらかじめそのうちの 1つ の cDNAに外来性遺伝子を挿入し、 また外来性遺伝子を含む 8本すベての cDNAから 転写された RNAをあらかじめウィルス由来の NP蛋白質と会合させて RNPとした。 こ れらの RNPと、 RNA依存性 RNAポリメラ一ゼとを細胞内に供給することによ り、 再 構成が成立した。 また、 （一） 鎖一本鎖 RNAウィルスについては、 ラブド ウィル ス科に属する狂犬病ウィルスで cDNAからのウィルス再構成についての報告がある (J. Virol . 68， 713-719( 1994))。
しかし、 これらの再構成技術を遺伝子治療用のベクタ一構築枝術としてそのま ま用いることは、 以下の問題から困難であった。
① 再構成されたウィルスは、 マーカー遺伝子の発現や RT-PCR等で確認を行なつ ているだけであり、 生産量の面からベクターウィルスとして十分利用できる再構 成系が確立されていない。
② 遺伝子治療用のベクターとして、 感染能を有するが伝播力を欠如した複合体 を作製するためには、 （+ ) 鎖 RNAウィルスの場合とは異なり、 複合体内部に初期 転写、 複製に必要な因子を包含させる必要があり、 このような複合体を大量に増 幅させる技術は知られていない。
③ 再構成に必要な因子を細胞内で供給する目的で、 天然型のウィルスや組換え 型のワクチニァウィルス等のウィルスを cDNAが導入される細胞に同時に感染させ ており、 それら天然型ウィルスの分離が容易でない。
さらには、 RNAウィルスベクター全般に関する事項として、 大量に複製、 転写し た RNAが治療を施したヒトゃ動物に対して望ましくない効果をもたらした場合に、 宿主の複製や転写には影響しない、 RNAウィルスベクターの複製阻害剤をあらかじ め用意しておく必要があると考えられるが、 該阻害剤の開発は行われていなかつ た。 発明の開示
本発明が解決しょうとする課題は、 実用に耐えうる （一） 鎖 RNAウィルスベクタ 一を開発することである。 また、 該ベクターを効率よく製造する方法を開発する ことである。 更に、 該ベクターの増殖の阻害剤を開発することである。
本発明者らはまず、 （一） 鎖 RNAウィルスの代表格であり、 安全性や利便性の点 からべク夕一として産業上最も有用であると考えられるセンダイウィルスをセン ダイウィルスの核酸から再構成することを試みた。 まず、 再構成試験に適用する ため、 センダイウィルス DI粒子 （defective interfering particle/EMBO J. , 10, 3079-3085( 1991 )参照） 由来の cDNAまたはセンダイウィルスミニゲノムの cDNAを実 験材料として用いることにより、 種々の検討を行なった。 その結果、 細胞内に導 入する、 cDM、 転写複製に関する cDNA群、 および T7RNAポリメラ一ゼ発現ユニット である組換え体ワクチニァウィルスの量比について、 効率の良い条件を見いだし た。 本発明者らは更に、 センダイウィルス全長の cDNAを （+ ) 鎖と （一） 鎖の両 者とも取得し、 細胞内で （+ ) 鎖または （―） 鎖のセンダイウィルス RNA が生合 成されるようなプラスミ ドを構築し、 転写複製に関する cDNA群を発現している細 胞内に導入した。 その結果センダイウィルス cDNAよりセンダイウィルス粒子を再 構成することに初めて成功した。
さらに、 本発明者らは、 T7RNAポリメラ一ゼ発現ユニットである組換え体ヮクチ ニァウィルスを用いない場合でもセンダイウィルスの再構成を行いうることを見 い出した。 すなわち、 試験管内で転写したセンダイウィルス全長 RNAを細胞内に導 入し、 初期転写複製酵素群の cDNAを T7プロモー夕一支配下で転写させた場合、 ゥ ィルス粒子が再構成された。 このことは、 初期転写複製酵素群をすベて発現する 細胞を構築すれば、 ワクチニァウィルスのようなヘルパーゥィルスを全く使用せ ずに組換え体センダイウィルス、 ひいては上述の複合体を作出することが可能で あることを示している。 なお、 初期転写複製酵素群をすベて発現する細胞は、 「 J. Virology, 68 8413-8417( 1994)」 に記載されており、 該記載を参照して当業者 が作出することが可能である。 なお、 該文献記載の細胞は、 センダイウィルス遗 伝子のうち、 NP、 P/ L の 3者を染色体上に有している 293細胞由来の細胞であ り、 このものは、 NP、 P/C、 Lの 3者の蛋白質を発現している。
多くのウィルスベクタ一の例から、 核酸からウイルス粒子の再構成が効率よく できるならば、 所望のウィルス遺伝子を組換えたり、 外来性遺伝子を挿入したり 、 または所望のウィルス遺伝子を不活化させたり、 欠失させることは、 当業者に とって容易になしうることであることは明らかである。 たとえば、 センダイウイ ルス構造体遺伝子の少なくとも一部を欠如させ、 複製酵素群の遺伝子は正常であ るような RNAを細胞内に導入した場合、 初期転写および初期複製に必要な酵素群を 細胞内に供給すれば、 その後の自律複製が可能であることは、 D I粒子を用いた報 告 （J. Virol . 68， 8413-8417( 1994) ) から明らかである。 従って、 例えば 「構造 体遺伝子の少なくとも一部を欠如させ、 複製酵素群の遺伝子は正常であるような 特定のウィルス cDNA」 から転写された外来性遺伝子を含む RNAを、 初期転写複製酵 素を含むウィルス構造体に包み込むことができれば、 細胞感染能と RNA自律複製能 とを有するが伝播力を欠如する外来性遺伝子のベクターとして機能する複合体を' 作出することができる。 このような複合体は、 遺伝子治療用のベクタ一としては 極めて有効なものである。 即ち、 本発明によって、 （- ) 鎖 RNAウィル スにおい て、 細胞感染能と RNA自律複製能とを有するが伝播力を欠如する複合体 の製造、 例えば初期転写複製酵素を含む複合体の製造が可能となった。
本発明者らは更に、 複合体中の RNAの欠失または不活化した遺伝子に相当する構 造蛋白質を発現する細胞に該複合体を感染させて、 同一の複合体を増幅する複合 体の増幅方法を開発した。 また、 上記の複合体を増幅させるために、 センダイゥ ィルスの増殖にもっとも適する場の一つである鳥類の卵に着目し、 センダイウイ ルスの M、 F、 HN 遺伝子のうち少なくとも 1種類以上の遺伝子を染色体上に保持す るトランスジエニック鳥類およびその卵およびその細胞が複合体の増幅に適して いることを見い出した。 トランスジエニック鳥類の作出法は公知であり [Poltry Sc i，， 65 , 1445-1458( 1986 )、 Bio/Technology, 12, 60-63( 1994)] 、 M、 F、 HN 遗伝 子のうち少なくとも 1種類以上の遺伝子を染色体上に保持するトランスジェニッ ク鳥類を作出することは、 当業者が適宜なしうることである。 M、 F、 HN 遺伝子の うち、 複合体に含まれる RNAの伝播力の欠如に関わる遺伝子のコードする蛋白質が トランスジエニック鳥類内に生産されることが好適である。
本発明者は更に、 以上に記載した複合体を製造する方法を開発した。 以下、 セ ンダイウィルスに関する場合を例示する。 センダイウィルス Z株 （Viology, 108, 318-324( 1981 ) ) のゲノムは 15384ヌクレオチドよりなる一本鎖 RNAである。 その全 塩基配列は逆転写酵素を用いた cDNAのクローンから決定されている （Nucleic Ac ids Research, 11 , 7317-7330( 1983)、 Nucleic Acids Research, 12, 7965-7972( 19 84)、 Nucleic Acids Research, 14, 1545-1563( 1986 ) ) 。 ゲノム RNAは （一） 鎖であ るから、 ウィルス粒子内に存在する転写複製酵素群はゲノム RNAを錶型とした転写 と複製とを行なう。 ゲノム RNAがコードする蛋白質としては少なくとも、 NP、 P/C 、 M、 F、 HN、 L の 6種類が知られているが、 このうち NPと P/Cと Lの 3者が複製に 必要十分な因子であることが知られており （Journal of Virology, 68, 8413-8417 ( 1994) ) 、 M、 F、 HNは、 ウィルス構造体を構成するために必要な成分であること が判明している。 以上のことから、 RNAの由来する特定の RNAウィルスがセンダイ ウィルスである場合は、 自律複製に関わる遺伝子群である NP、 P/C, L 全 てと、 Ms F、 HN遺伝子のうち RNAの伝播力の欠如に関わる遺伝子群を共に発現している細 胞中に、 ① DNAに転写される cDNA、 ②該 cDNAを細胞内で転写する際に 必要な RN Aポリメラ一ゼをコ一ドする遺伝子または試験管内で cDNAより転写した RNAそのも のを共に導入し感染性のある複合体を再構成することができる。 この場合自律複 製に関わる遺伝子群、 NP、 P/C、 L をすべてと、 M、 F、 HN遺伝子のうち RNAの伝播 力の欠如に関わる遺伝子群はたとえばこれらの遺伝子をコ一ドしてい るブラスミ ドの細胞内導入などの一過性の発現でもかまわないが、 すくなくとも RNAの伝播力 の欠如に関わる遺伝子群は染色体に組込まれて安定に発現する方が 好適である。 本発明者らは更に、 こうして再構成した該複合体を大量に生産する方法を開発 した。 具体的には、 該複合体を、 自律複製に関わる遗伝子群は持たず、 M、 F、 HN 遺伝子のうち ίΙΝΑの伝播力の欠如に関わる遺伝子群を発現している細胞に感染させ 、 該複合体を生産する方法である。 この場合、 自律複製に関わる遺伝子群は持た ず、 M、 F、 HN遺伝子のうち RNAの伝播力の欠如に関わる遺伝子群を発現している細 胞は、 大量生産のためには該遺伝子群を発現しているトランスジエニック鳥類の 卵が好適である。
本発明者らは更に、 前記の RNAと蛋白質とを含む複合体を増殖させるための細 胞を作出した。 具体的には、 該細胞は、 該複合体の保持する RNAの伝播力の欠如 に関わる遺伝子群に相当する遺伝子を保持する細胞で、 かつ該遺伝子のコ一ドす る蛋白質群を細胞内に生産することができる細胞である。 RNAの由来する特定の R NAウィルスがセンダイウィルスである場合は、 センダイウィルスの M、 F、 HN遺伝 子のうち少なくとも 1種類以上の遺伝子を染色体上に保持する細胞およびその細 胞を有する動物が用いられる。 なお、 M、 F、 HN遺伝子は、 野生型のものである必 要はなく、 野生型と同等の機能を有するものであればよい。 即ち、 遺伝子が細胞 に機能的に導入された際、 欠損ウィルスに対して、 野生型と同等の相補能を有す るものであればよい。 細胞は、 センダイウィルスの宿主とする細胞が好適である 。 M、 F、 HN遺伝子のうちべクタ一ウィルスの RNAにおいて伝播力の欠如に関わる遺 伝子群に相当する遺伝子のコードする蛋白質群が細胞内に生産されることが好ま しい。
また、 本発明者らは既存の RNAウィルスベクターにおいて、 発現効率を高めるこ とだけが重視されており、 過剰発現により不本意な結果を招いたときに、 RNAの複 製を抑制する化合物の開発が行われていない点に鑑み、 細胞由来の RNAの転写や翻 訳には影響せず、 RNA依存性 RNA複製や、 RNA依存性 RM転写を特異的に阻害するこ とにより、 結果として RNA依存性 A複製のみを抑制するような薬剤を、 （一） 鎖 RNAウィルスベクターの阻害剤として開発した。 すなわち本発明は以下のものを含む。
( 1) 伝播力を有する特定の （一） 鎖 RNAウィルスに由来する RNAと、 核酸を含ま ないウィルス構造体とを含む複合体で、 細胞感染能と RNA自律複製能とを有するが 伝播力を欠如する複合体、
(2) 特定の RNAウィルスが非分節型 （一） 鎖 RNAウィルスであることを特徴とす る （ 2 ) 記載の複合体、
(3) 特定の ΪΙΝΑウィルスがセンダイウィルスであることを特徴とする （3) 記載 の複合体、
(4) センダイウィルス RNAまたはセンダイウィルス cRNAを含む RNAで、 M,F,HN 蛋 白質に相当する遺伝子のうち少なくとも 1つ以上の遺伝子が欠失または不活化し ている RNA、
(5) (4) 記載の RNAと、 センダイウィルス由来の核酸を含まないウィルス構造 体とを含む複合体で、 細胞感染能と RNA自律複製能とを有するが伝播力を欠如する 複合体、
(6) (4) 記載の RNAを試験管内または細胞内で転写することのできる銪型 DNA を含む DM、
(7) 複合体内に含まれる ίΙΝΑが外来性遺伝子を含むことを特徴とする （ 1) 〜 (3) または （5) のいずれかに記載の複合体、
(8) 複合体内に含まれる RNAが外来性遺伝子を含むことを特徴とする （3) ま たは （5) に記載の複合体、
(9) 外来性遗伝子を含むことを特徴とする （4) に記載の RNA、
( 1 0) 外来性遗伝子を含むことを特徴とする （6) に記載の DNA、
( 1 1) RM依存性 MA複製を阻害する薬剤を含む、 （ 1) 〜 （3) 、 （5) 、 (7) または （8) のいずれかに記載の複合体に含まれる RNAの複製阻害剤、
( 1 2) ( 1) 〜 （3) 、 （5) 、 （7) または （8) のいずれかに記載の複 合体が伝播しうる宿主、 ( 13) ( 1) 〜 （3) 、 （5) 、 （7) または （8) のいずれかに記載の複 合体の、 感染能に関わる遺伝子群を染色体上に有し、 該複合体を感染せしめたと き、 該複合体と同一のものを複製しうることを特徴とする （ 12) に記載の宿主
( 14) 宿主が動物、 動物に由来する細胞、 動物の組織または動物の卵である ことを特徴とする （ 12) または （ 13) に記載の宿主、
( 15) 動物が哺乳類であることを特徴とする （ 14) に記載の宿主、
( 16) 動物が鳥類であることを特徴とする （ 14) に記載の宿主、
( 1 7) (3) 、 （5) または （8) のいずれかに記載の複合体の、 感染能に 関わる遺伝子群を染色体上に有し、 該複合体を感染せしめたとき、 該複合体と同 一のものを複製しうることを特徴とする宿主、
( 18) センダイウィルスの M遺伝子、 F遺伝子、 HN遺伝子またはそれらと同等 の機能を有する遺伝子のうち少なくとも 1つ以上の遺伝子を染色体上に有する宿 主、
( 19) センダイウィルスの M遺伝子または同等の機能を打する遺伝子を染色体 上に有する宿主、
(20) センダイウィルスの M遺伝子， NP遺伝子， P/C遺伝子および L遺伝子 （ 各遺伝子は同等の機能を有する遺伝子で置換されていてもよい） を染色体上に有 する宿主、
(2 1) センダイウィルスの M遺伝子， F遺伝子および HN遺伝子 （各遺伝子は同 等の機能を有する遺伝子で置換されていてもよい） を染色体上に有する宿主、
(22) センダイウィルスの M遺伝子， F遺伝子， HN遺伝子， NP遺伝子， P/C遺伝 子および L遺伝子 （各遺伝子は同等の機能を有する遺伝子で置換されていてもよい ) を染色体上に有する宿主、
(23) 宿主が動物、 動物に由来する細胞、 動物の組織または動物の卵である ことを特徴とする （ 17) 〜 （22) のいずれかに記載の宿主、 (24) 動物が哺乳類であることを特徴とする （23) に記載の宿主、
(25) 動物が鳥類であることを特徴とする （23) に記載の宿主、
(26) a) ( l) 〜 （3) 、 （5) 、 （ 7 ) または （ 8 ) のいずれかに記載の 複合体に含まれる RNAもしくは該 RNAの cRNA、 または該 RNAもしくは該 cRNAを生合成 しうるュニット
b)該 RNAもしくは該 cRNAの複製に必要な酵素群、 または該酵素群を生合成しうるュ ニッ ト
c)該複合体の、 感染能に関わる蛋白質群、 または該蛋白質群を生合成しうるュニ ッ卜
の 3者を含むキット、
(27) a) ( l) 〜 （3) 、 （5) 、 （ 7 ) または （ 8 ) のいずれかに記載の 複合体に含まれる RNAもしくは該 RNAの cRNA、 または該 RNAもしくは該 cRNAを生合成 しうるュニット
b)該 RNAもしくは該 cRNAの複製に必要な酵素群、 または該酵素群を生合成しうるュ ニッ ト
c) ( 1 2 ) 〜 （ 25 ) のいずれかに記載の宿主
の 3者を含むキット、
(28) a) ( l) 〜 （3) 、 （5) 、 （ 7 ) または （ 8 ) のいずれかに記載の 複合体
b) ( 1 2 ) 〜 （ 25 ) のいずれかに記載の宿主
の 2者を含むキット、
(29) a) (3) 、 (5) または （8) のいずれかに記載の複合体に含まれる RNAもしくは該 RNAの cRNA、 または該 RNAもしくは該 cRNAを生合成しうるユニッ ト b)センダイウィルスの NP，P/C, L蛋白質のすべて、 または該蛋白質群を生合成しう るュニヅト
c)該複合体の感染能に関わる蛋白質群、 または該蛋白質群を生合成しうるュニッ h
の 3者を含むキット、
(30) a) (3) 、 (5) または （8) のいずれかに記載の複合体に含まれる RNAもしくは該 RNAの cRNA、 または該 RNAもしくは該 cRNAを生合成しうるュニヅト b)センダイウィルスの NP， P/C, L蛋白質のすべて、 または該蛋白質群を生合成し うるュニッ ト
c) ( 1 7) 〜 （25) のいずれかに記載の宿主
の 3者を含むキット、
(3 1 ) a) (3) 、 （5) または （8) のいずれかに記載の複合体
b) ( 1 7 ) 〜 （ 25 ) のいずれかに記載の宿主
の 2者を含むキット、
(32) 宿主内に、 （26) a), b)および c)に記載の 3者を導入することにより 、 （ 1) 〜 （3) 、 （ 5) 、 （7) または （8) のいずれかに記載の複合体を製 造する方法、
(33) (27) c)に記載の宿主内に、 （27) a)および b)に記載の両者を導 入することにより、 （ 1 ) 〜 （3) 、 （5) 、 （7) または （8) のいずれかに 記載の複合体を製造する方法、
(34) (28) a)に記載の複合体を、 （28) b)に記載の宿主に感染させる ことにより、 該複合体を増幅し製造する方法、
(35) 宿主内に、 （29) a), b)および c)に記載の 3者を導入することにより 、 （3) 、 (5) または （8) のいずれかに記載の複合体を製造する方法、
(36) (30) c)に記載の宿主に、 （30) a)および b)に記載の両者を導入 することにより、 （3) 、 (5) または （8) のいずれかに記載の複合体を製造 する方法、
(37) (3 1 ) a)に記載の複合体を、 （3 1 ) b)に記載の宿主に感染させる ことにより、 該複合体を増幅し製造する方法、 (38) Mに相当する遗伝子が欠失または不活化していることを特徴とする （9 に記載の RNA、
(39) M,F,HN に相当する遺伝子がすべて欠失または不活化していることを特 徴とする （9) に記載の RNA、
(40) a) (38) に記載の RNA
b) (20) に記載の宿主
c) ( 19) に記載の宿主
の 3者を含むキット、
(4 1) (40) a)に記載の RNAを、 （40) b)に記載の宿主に導入することに より得られる複合体を、 （40) c)に記載の宿主に感染させて該複合体を増幅し 製造する方法、
(42) (4 1 ) の方法により製造された複合体、
(43) a) (39) に記載の RNA
b) (22) に記載の宿主
c) (2 1 ) に記載の宿主
の 3者を含むキッ ト、
(44) (43) a)に記載の RNAを、 （43) b)に記載の宿主に導入することに より得られる複合体を、 （43) c)に記載の宿主に感染させて該複合体を増幅し 製造する方法、
(45) (44) の方法により製造された複合体、 および
(46) RNA依存性 RNA複製を阻害する薬剤を含む、 （42) 、 （45) のいず れかに記載の複合体に含まれる RNAの複製阻害剤、
(47) (7) 記載の複合体を宿主に導入し、 発現した外来性タンパク質を回 収する工程を含む、 外来性タンパク質の製造方法、
(48) 宿主が、 伝播力に関する遠伝子のうち、 （7) 記載の複合体に含まれる RNAにおいて欠如している遺伝子群を発現している細胞である、 （47) 記載の外 来性タンパク質の製造方法、
( 4 9 ) ( 7 ) 記載の複合体を宿主に導入し、 培養液または漿尿液を回収するこ とによって取得しうる、 発現した外来性タンパク質を含む培養液または漿尿液。 材料となる （一） 鎖 RNAウィルスとしては伝播力を保持するものであればいかな るものでも用いられる。 DI粒子等の不完全ウィルスや、 合成したオリゴヌクレオ チド等も、 材料の一部として当然使用することはできるが、 全体として、 伝播力 を有するウィルスと同等の配列を保持していなければならない。 本発明の （一） 鎖 RNAウィルスに含まれるウィルスとしては、 例えばパラミクソウィルス科の（Pa rajnyxoviridae)のセンダイウィルス (Sendai virus)、 ニューカッスル病ゥイノレス (Newcastle disease virus)、 おたふくかぜウイゾレス (Mumps virus)、 麻疼ウイソレ ス (Measles virus)、 RSウイリレス (Respiratory syncytial virus )、 牛疫ウイノレス ^rinderpest virus) ジステンノヽ ·——ゥイソレス (distemper virus)、 才リレト ミク V ウィルス科（Orthomyxoviridae)のイ ンフルエンザウイルス（Influenza virus) 、 ラブドウィルス科（rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウィルス（Vesicular S)、 狂犬 病ウィルス（Rabies virus)等が挙げられる。
材料となる （一） 鎖 RNAウィルスとしては、 上記のいずれかのウィルスに由来 する伝播力を保持する組換え体 （一） 鎖 RNAウィルスを用いてもよい。 組換え体
(一） 鎖 RNAウィルスは、 たとえば免疫原性に関与する遺伝子を不活性化したり 、 RNAの転写効率や複製効率を高めるために、 一部の遺伝子を改変したものでも よい。
本発明の RNAと蛋白質との複合体含まれる RNAは、 前記のいずれかのウィルスま たは組換え体ウィルスの cDNAを改変したものを試験管内または細胞内で転写せし めることにより得ることができる。 このとき得られる RNAは、 由来するウィルスの 伝播力に関わる少なくとも 1つの遺伝子が欠失または不活化していることが必要 であるが、 自律複製に関わる遺伝子が欠失または不活化していてはならない。 ま た、 DI分子など、 ウィルスゲノムの両端構造を持つ cDNAに、 人工的に自律複製に 関わる遺伝子群を挿入した DNAを試験管内または細胞内で転写せしめることにより 得られる人工的な配列を持つ RNA分子も、 同様に用いることが可能である。
前述のように、 センダイウィルスの場合は、 「自律複製に関わる遺伝子」 とは 、 NP、 P/C、 Lのいずれかの遺伝子であり、 「伝播力に関わる遗伝子」 とは、 M、 F 、 HNのいずれかの追伝子である。 したがって、 例えば M遣伝子のみを欠失させたセ ンダイウィルス Z株の RNAは、 本発明の 「複合体 j に含まれる成分として適当で ある。 また、 M、 F、 HNすべての遺伝子が欠失や不活化させたものも、 本発明の 「 複合体」 に含まれる成分として適当である。 一方、 NP、 P/C、 Lをコードする遺伝 子群が RNAから発現されることが必要である。 ただし、 これらの遺伝子群はウィル ス由来の配列そのままでなくとも、 転写、 複製における活性が天然型のそれと同 等かそれ以上ならば、 変異を導入したり、 あるいはほかのウィルスの相当遺伝子 で代用してもよい。
本発明の 「核酸を含まないウィルス構造体」 とは、 例えばウィルスから RNAだけ を除去したものが含まれる。 この構造体としては、 感染能と初期の自律複製能を 相補するが、 伝播力は相補しないものが用いられる。 センダイウィルスを例に挙 げれば、 M遺伝子のみを欠失させたセンダイウィルスの RNAと、 センダイウィルス から RNAだけを除去したものとからなる複合体は、 感染能と自律複製能を有するが 伝播力は有しない複合体である。 複合体は、 伝播力を付与しないものであれば、 これら以外のものを含んでいても構わない。 例えば、 エンベロープ表面に特定の 細胞に接着しうるような接着因子、 リガンド、 受容体等が含まれていても構わな い。
複合体に含まれる RNAは、 適当な部位に外来性遺伝子が挿入されたものでもよい 。 所望のタンパク質を発現させるためには、 所望のタンパク質をコードする外来 性遺伝子を挿入する。 センダイウィルス RNAにおいては、 R1配列 （5' -A G G G T C A A A G T -3' ) と R2配列 （5， - G T A A G A A A A A_3，） との間に、 6の倍数 の塩基数を有する配列を挿入することが望ましい （Journal of Virology, Vol .67 , No.8, (1993 )p.4822-4830) 。 発現効率挿入した外来性遺伝子の発現量は、 遺伝子 挿入の位置、 また遗伝子の前後の RNA塩基配列により調節しうる。 例えば、 センダ ィウィルス RNAにおいては、 挿入位置が NP遺伝子に近いほど、 挿入された遺伝子の 発現量が多いことが知られている。 なお、 複合体を導入し、 タンパク質を発現さ せるために用いる宿主としては、 伝播力に関する遺伝子のうち、 複合体に含まれ る RNAにおいて欠如している遺伝子群を発現している細胞が好適に用いられる。 こ の場合、 大量生産のためには該遺伝子群を発現しているトランスジエニック鳥類 の卵が特に好適である。 発現されたタンパク質は、 例えば、 培養細胞を宿主とす る場合には培養液から、 鶏卵を宿主とする場合には尿漿液から、 常法によって回 収しうる。 なお、 実施例 5および 6においては、 本出願の複合体の代わりに、 伝 播力のある複合体が用いられているが、 本出願の複合体においても、 前記の 「伝 播カに関する遺伝子のうち、 複合体に含まれる RNAにおいて欠如している遺伝子群 を発現している細胞」 を宿主として用いれば、 実施例における伝播力のある複合 体と同様の結果が得られることは、 当業者に明らかである。
なお、 センダイウィルスの効率良い粒子再構成のためには、 細胞内に導入す'る cDNAの形態が線状よりも環状のほうが良く、 また （一） 鎖 RNAが細胞内で転写され るよりも、 （+ ) 鎖 RNAが細胞内で転写されるほうが粒子形成効率が高いことが、 本発明者によって確認された。 これらの条件が他のすべての （一） 鎖 RNAウィルス 再構成に適用できるとは限らないが、 他の （―） 鎖 RNAウィルス再構成に際しても 、 本明細書の記載内容および技術常識に基づいて適宜条件を検索することは可能 であり、 そのことにより、 目的とする （一） 鎖 RNAウィルスベクターの 基本材料 を作出する技術を確立すること、 すなわちウィルスの再構成系を確立することが 可能であることは明らかである。
本発明における 「RNAの複製阻害剤」 としては、 RNA依存性 RNA複製を阻害する薬 剤であれば、 いかなるものでも適用可能であるが、 例えば、 リバビリン （Ribavi rin) 、 TJ13025等が好適に用いられる。 かかる複製阻害剤は、 例えば、 細胞内で の組換え体 RNAの増幅に伴う健康状態悪化が観察されたとき、 または細胞内での組 換え体 RNA由来の外来性遗伝子等の発現を制御したい場合等に有効である。
なお、 本発明の一態様としての、 M遺伝子が欠損したセンダイウィルス cDNAから 本発明に含まれる複合体を製造し （A→Bの過程） 、 更に該複合体を増幅する （ B~ Cの過程） 工程を、 図 1として例示する。 図面の簡単な説明
図 1は、 M遺伝子が欠損したセンダイウィルス cDNAから本発明に含まれる複合体 を製造し （A→Bの過程） 、 更に該複合体を増幅する （B→Cの過程） 工程を説 明する図である。
図 2は pUC18/T7( + )HVJRz.DNAの構成を示す図である。
図 3は pUC18/T7(-)HVJRz.DNAの構成を示す図である。
図 4は CV-1細胞への SeVgpl20の感染後の時間と HAUの値及び gpl20の発現量との 関係を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限 定されるものではない。
[実施例 1 ] センダイウィルス転写ュニッ ト pUC18/T7(-)HVJRz.DNAおよび pUCl 8/T7( + )HVJRz.DNAの作製
T7 プロモーター、 （-)鎖 RNAが転写されるように設計されたセンダイウィルス c DNA、 リボザィム遺伝子をこの順に保持する DNAを、 plIC18プラスミ ドに挿入したブ ラスミ ド pUC18/T7(-)HVJRz.DNAを作製した。 また、 T7 プロモー夕一、 （+ )鎖 RNAが 転写されるように設計されたセンダイウィルス cDNA、 リボザィム遺伝子をこの順 に保持する DMを、 pUC18ブラスミ ドに挿入したプラスミ ド pUC18/T7( + )HVJRz.DNA を作製した。 pUC18/T7(-)HVJRz.DNAおよび pUC18/T7( + )HVJRz.DNAの構成を図 2お よび図 3に示した。
[実施例 2 ] cDNAからのセンダイウイルス再構成実験
直径 6 c mのプラスチックシャーレに通常のトリブシン処理を施した LLC-MK2細 胞を 2， 000, 000個と MEM培地 (MEM +FBS 10% ) 2mlとを添加し、 C02 5%, 37°Cの条件 下で 24時間培養した。 培養液を取り除き、 1mlの PBSを用いて洗浄した後、 多重感 染度 （moi/multipl icity of infection) が 2となるように調製した、 T7ポリメ ラ一ゼを発現する組換えワクチニァウィルス vTF7- 3を 0. 1mlの PBSに 濁したもの を添加した。 15分毎にウィルス液が全体にいきわたるようにシャーレを揺らし、 1時間の感染を行った。 ウィルス溶液を除去し、 1mlの PBSを用いて洗浄した。 この シャーレに、 cDNA溶液を含む培地を添加した。 cDNA溶液を含む培地の作製は、 以 下のように行なった。
表に記した核酸 （センダイウィルスの複製に必要な因子を発現するブラスミ ド 、 pGEM-L, pGEM-P/C, pGEM-NP を含む） を 1.5mlのサンプリングチューブにとり、 HBS(Hepes buffered sal ine ; 20mM Hepes pH7.4, 150mM NaCl )を加えて総量を 0. lmlにした。 表中の （- )または（ + )cDNAは、 ブラスミ ド pUC18/T7( - )HVJRz.DNAまた は pUC18/T7( + )HVJRz.DNAそのものを示し、 /Cは環状のまま、 /Lは制限酵素 Mlulに より直鎖化した後に細胞に導入していることを示す。
他方、 ポリスチレンチューブの中で、 HBS 0.07ml , D0TAP (ベ一リンガーマンハ ィム社製） 0.03mlを調合し、 核酸溶液をこのポリスチレンチューブに移した。 この 状態で、 10分静置した。 これに、 細胞培養液 （2ml MEM +FBS 10%) を添加した。 さらにこの中にワクチニァ ィルスの阻害剤であるリファンビシン （Rifampicin ) とシトシンァラビノシド C (Cytosin arabinoside C/Ara C) を最終濃度がそ れぞれ 0. 1mg/inl， 0.04mg/mlとなるように添加した。 これにより、 cDNA溶液を含む 培地が作製された。
前記のシャーレを 40時間 C02 5%， 37°Cの条件下で培養した。 ラバ一ポリスマン を用いてシャーレ内の細胞をかき取り、 エツベンドルフチューブに移し 6000rpm、 5分間の遠心を行って細胞成分だけを沈殿し、 再度 lmlの PBSに憋濁した。 この細胞 液の一部をそのままの状態、 あるいは希釈して 1 0日齢の発育鶏卵に接種した。 この細胞液を第 1表に示した細胞数となるように PBSで希釈し、 0.5ml 接種した卵 を 35°C72時間培養後 4 °Cに移して一晩置いた。 この卵の漿尿液をウィルス液とし て注射器と注射針を用いて回収した。
回収したウィ レス液の HAU (hemmaglutinin unit)と、 PFU(plaque forming uni t )の測定を以下に示す方法で行った。
HAUの測定は以下のように行なった。 鶏の血液を、 400x g，10分間遠心し、 上清 を捨てた。 残る沈殿を、 沈殿の 100倍量の PBS ( - )で 濁し、 これをさらに 400x g， 10分間遠心し、 上清を捨てた。 この操作をさらに 2回、 繰り返し、 0. 1 %血球溶 液を作製した。 ウィルス溶液を段階希釈法により 2倍ずつに希釈し、 その 0.05ml ずつを、 96穴のタイ夕一プレートに分注した。 この夕イタ一プレートに、 さらに 0.05mlずつの血球溶液を分注し、 軽く振動させてよく混ぜた後、 4°Cで 40分静置し た。 その後、 赤血球の凝集を肉眼で観察し、 凝集したもののうち、 もっともウイ ルス溶液の希釈率の高いものの希釈率を、 HAUとして示した。
PFUの測定は以下のように行なった。 CV- 1細胞を、 6穴のカルチャープレート上 に単層になるように生育させた。 カルチャープレートの培地を ½て、 段階希釈法 により 10倍づつに希釈したウィルス溶液 0.1mlずつをそれぞれのカルチャーブレー ト内ゥエルに分注し、 37°C、 1時間感染させた。 感染中に血清の含まれていない 2 XMEMと 2%寒天を 55。Cで混ぜ合わせ、 さらに最終濃度 0.0075mg/mlとなるように卜 リブシンを加えた。 1時間の'感染後、 ウィルス溶液を取り除き、 寒天と混合した培 地 3mlずつをそれぞれのカルチャープレート内ゥエルに加え、 5 %C02条件下で 37 。C3日間保温した。 0.2mlの 0.1%フエノールレヅ ドを加え、 37°C 3時間保 温した 後、 取り除いた。 色の付いていないプラークの数を数え、 ウィルスの力価を PFU/ mlとして評価しだ。
表 1には、 LLC-MK2細胞に導入した銪型となるセンダイウィルス cDNA、 RNA複製 に必要な因子の cDNAである pGEM-L、 pGEM-P/Cおよび pGEM-NPの量、 インキュベーシ ヨン時間、 鶏卵に接種した細胞数、 HAU、 PFU をそれぞれ示した。
表 1
pGE - pGEM- 钫型 cD 合計 g) 時問 ' 細胞数 HAU PFU
Uug) P/C(ug)
(+) cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00 105 512 2 109
(+) cDNAC 10 4 2 4 40 1.00X 105 256 9 108
(+ cONA/C 10 4 2 4 40 1.00X106 256 9X 108
(+) cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00 105 <2 <10
(+) cDNAL 10 4 2 4 40 1.00X 105 <2 く 10
(+) cDNA/L 10 4 2 4 40 oox】o6 2 く 10
(-) cDNA/L 10 4 2 4 40 I .0OXI04 <2 <Ι0
(-) cDNA L 10 4 2 4 40 1.00X 105 <2 <10
(-) cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00 106 <2 <10
(-) cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00X I04 <2 <10
(-) cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00X 105 <2 <10
(-) cDNA/C 10 4 2 4 40 し oox】o6 4 8 X 103
HAU, PFUをともに示したサンブルを超遠心で沈 とした 、 TO; 遊して 20%〜 60%のショ糖密度勾配遠心で 製し、 12.5%^5_? 0£で0^1¾を分離したところ 、 ここに含まれる蛋白質は、 センダイウィルスの蛋白 Γ1と冋じ大きさのものであ つた。
この結果から、 cDNAを細胞に導入してセンダイウィルスを再構成できることが 示された。 また、 （+ )鎖を転写する cDNAを細胞内に導入したときには、 （-)鎖を転 写する cDNAを導入したとき ίこ比べてゥィルス粒子が効率よく 榀成されることが 示された。 さらに、 cDNAを環状のままで導入したときには、 直鎖状にして導入し たときに比べてウィルス粒子が効率よく再構成されることが示された。
[実施例 3 ] センダイウイルス再構成に必要な RNA複製因子の検討
L, P/C, NPを発現するプラスミ ドが三者ともに必耍かどうかを調べる実験を行 つた。 方法は実施例 2と同様であるが、 実施例 2では cDNAとともに、 pGEM_L， pG EM-P/C, pGEM-NPの 3者を細胞内に導入したのに対し、 本実験では、 pGEM-L， pGE M - P/C， pGEM-NPのうちの任意の 2者または一者のみを cDNAと もに細胞内に導入 した。
表 2は、 LLC-MK2細胞に導入した銃型となるセンダイウィルス cDNA、 RNA複製に 必要な因子の cDNAである pGEM- L、 pGEM-P/Cおよび pGEM-NPの量、 インキュべ一ショ ン時圓、 鵝卵に接種した細胞数、 HAU、 PFU をそれぞれ示した。
表 2 mcMA 合^ i g) PGEM-し pGEM-P/C pGEM-NP ^時 （時） 細胞数 HAD PFU
(+) cDNA/C 10 40 1.00XI05 256 6X JO8 (+)cDNAC 10 40 1.00 106 512 4XJ09
(+) cDNA/C 10 40 1.00X106 <2 :10 (+) cDNA/C 10 40 1.00X106 <2 :10
(+) cDNA/C 10 40 1.00XI06 <2 :10 (+) cDNAC 10 40 1.00XI06 <2 :10
(+) cDNA/C 10 40 1.00X106 <2 :10 (+) cDNA/C 10 40 1.00 I06 <2 :10
(+) cDNA/C 10 40 1.00 106 <2 :10 (+) cDNA/C 10 40 I.OO 106 <2 :10
(+) cDNAC 10 40 】.00X10 <2 :10 (+) cDNAC 10 40 l.OOXiO' <2 :10
(+) cDNA/C 10 40 <2 :10 (+) cDNA/C 10 40 1,00X1 06 <2 :10
衷 2から、 どの組合わせの 2者を導入した場合もウィルスの生産が認められな かった。 この結果、 この 3種の蛋白質すべてが、 再構成には必須であることが確 c?れた ο 60
[実施例 4] in vitro転写 RNAからのセンダイウィルス再構成実験
実施例 2で、 cDNAからセンダイウィルスが再構成されるこ'とを示したが、 さら に cMAを in vitroで転写した産物、 すなわち vRNA および cRNAでも同様のことが できうるかどうかを検討した。
センダイウィルス転写ュニヅ ト pUC18/T7(-)HVJRz.DNAおよび pUC18/T7( + )HVJRz .MAを制限酵素 Mlulで直鎖状にした後、 これを鍺型として用い、 精製 T7ポリメラ ーゼ（EPICENTRE TECHNOLOGIES: Ampliscribe T7 Transcription Kit)による in v itro RNA合成を行った。 in vitro RNA合成の方法はキッ 卜のプロトコルに従った 。 ここで得られた RNA産物を、 実施例 2の cDNAの代わりに用い、 同様の実験を行い 、 ウィルス生産の評価は HA試験により行った。
結 ¾を表 3に示す。
表 3
合計 g) pGEM-L(uS) pGEM-P/C(ug) pGEM-NP(uS) 培 ¾時 |¾] (時） 細 ¾数 HAU PFU in vitro(-)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 512 2X109 in vitro(-)RNA 10 4 2 4 40 1.OOE+06 512 ^ in vitro(+)RNA 10 4 2 4 40 I .OOE+06 2 5 χ 1Q3 in vitro(+)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 <2 ND この結果より、 どちらのセンスの UNAを細胞内に^;入しても、 ウィルスを 構成 することができた。
[実施例 5 ] センダイウィルスベクター内に挿入した外来遗伝子の宿主内での発 現の検討 '
(1) 外来遺伝子 （HIV- 1 gP120遺伝子） が挿入されたセンダイウィルスベクタ 一 pSeVgpl20j の調製
プライマ一 a (5' -TGCGGCCGCCGTACGGTGGCAATGAGTGAAGGAGAAGT-3' ) (配列番号 ： 1 ) 及びブライマー d (5'-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTVTTACTACGGC GTACGTCATCTTTTTTCTCTCTGC-3' ) (配列番号： 2) を用い、 「pNI432j 上の HIV-1 gpl20遺伝子を標準的な PCR法により増幅した。 TAクローニングを行い、 Notlで消 化し、 これを Notlで消化した 「pSeV18+」 に挿入した。 次いで、 これを E.Coliに形 質転換し、 E.Col iの各コロニーの DMを 「Miniprep」 法で抽出し、 Dral l l消化後電 気泳動を行い、 泳動された DNAのうち挿入により期待される大きさの DNA断片を含 んでいることが確認されたクローンを選抜することで、 陽性クローンを得た （以 下、 この陽性クローンを 「クローン 9」 と称する） 。 目的の塩基配列であることを 確認後、 塩化セシウム密度勾配遠心により、 DNAを精製した。 なお、 これにより得 られた、 pl20の挿入された pSeV18+を 「pSeVgpl20j と称する。
(2) pSeVgpl20を保持するセンダイウィルス （SeVgpl20) の再構成及び gpl20の 発現の解析
LLCMK2細胞に pGEM NP, P，Lの他に、 さらに pSeVgpl20を導入した以外は、 実施例 2と同様の方法で、 発育鶏卵のしょう尿液を回収し、 HAUの測定及び gpl20発現の 検討 （ELISA) を行った。 HAUの測定は、 実施例 2と同様の方法で行った。
また、 ELISAは以下のように行った。 HIV-1に対するモノクロナ一ル抗体で覆つ た 96ゥエルプレートに 100〃1の試料を添加し、 37°Cで 60分反応させた。 PBSで洗^ 後、 100〃1の HRP結合抗 HIV- 1抗体を添加し、 37°Cで 60分反応させた。 これを PBSで 洗浄後、 テトラメチルベンチジンを添加し、 HRP活性で転換される反応生成物の Si を酸性条件下、 450nmの吸光度で検出することにより gpl20の発現 Eを測定した。 この結果を表 4左に示す。
また、 得られたウィルス液は、 CV-1細胞に感染させ、 同様の検討を行った。 CV -1細胞を 1プレート当たり 5x10s細胞となるようにまいて生育させ、 培地を捨て、 PBS (- )で洗浄し、 感染多重度 10でウィルス液を添加し、 室温で 1時間感染させた 。 ウィルス液を捨て PBS ( - )で洗浄し、 plainMEM培地 （MEM培地に抗生物質 AraC、Ri f及びトリブシンを添加したもの） を添加して、 37°Cで 48時間反応させた。 反応後 、 培地を回収し、 ' HAUの測定 （実施例 2と同様の方法） 及び gpl20発現の検討 （EL ISA) を行った。 この結果を表 4中央に示す。 なお、 CV- 1細胞の培養上清を再度発 育鶏卵に接種し、 これにより得たウイルス液の HAUの測定結果及び gpl20発現の検 討 （ELISA) 結果を表 4右に示す。
表 4
(μβ ml)
Figure imgf000029_0001
表 4から明らかなように、 CV-1細胞で特に高濃度の gpl20が生産され （表中央） 、 また再度 ¾育鶏卵に接種した尿しょう液からも高濃度の gpl20が検出された （表 右） 。 なお、 表 4左と表 4中央には 3クローンの結果を示してある。
さらに、 gpl20の発現をウエスタンプロティング法により解析した。 SeVgpl20を 感染させた CV-1細胞の培地を 20, 000rpmで 1時問遠心し、 ウィルスを沈殿させ、 そ の上 を TCA ( 10% (v/v)、 氷上で 15分） またはで 70%エタノール （- 20 C) で処 ¾ し、 】5，000rpniで 15分遠心し、 沈降した蛋白 Kを 「SDS-PAGE Sample buffer j ( —化学） と混合し 90°Cで 3分反応させ、 10%アクリルアミ ドゲル上で SDS-ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （SDS-PAGE) を行った。 泳動後、 蛋白質を PVDF膜 （第一 化学） に転写し、 モノクロナール抗体 902を室温で 1時間反応させた。 次いで、 T- TBSで洗浄し、 抗 mlgG (アマ'シャム社） を室温で 1時間反応させ、 T- TBSで洗净した 。 さらに、 HRP結合プロテイン A (アマシャム社） を室温で 1時間反応させ、 T-TBS で洗浄した。 これに 4-クロ口- 1-ナフトール （4CNPlus) (第一化学） を添加し、 gpl20を検出した。 この結果、 予想される gpl20の分子量の位置にバンドが検出さ れた。 、
さらに、 CV-1細胞への SeVgpl20の感染後の時問と HAUの値及び gpl20の発現量と の関係を解析した。 10cmプレートに 5xl06細胞となるように CV- 1細胞をまき、 感染 多重度 10で SeVgpl20を感染させ、 その後 30,43，53，70時間目に lmlの培地を回収し 、 等量の新鮮培地と混合して、 HAUの測定、 pl20発現の検討 （ELISA) およびゥェ スタンプ口ティングを行った。 この結果を図 4に示す。 図 4から明らかなように 、 センダイウィルスの HAタイ夕一の増加に伴って gpl20生産量も増加する傾向を示 した。
[実施例 6 ] 種々の型の細胞における SeVCTl20の增殖及び gpl20の発現の解析 種々の型の細胞を用いた以外は実施例 5と同様の方法で、 HAUの測及び gpl20発 現の検討 （ELISA) を行った。 この結果を表 5に示す。
表 5
Figure imgf000030_0001
なお、 表左は種々の型の細胞への SeVgpl20の感染後の時問を示す。 この結 ¾、 検討を行ったすべての細胞で SeVgpl20の増殖及び gpl20の ¾現が検出された。
[実施例 7 ] センダイウィルスベクタ一内に挿入したルシフェラ一ゼ遗伝子の 宿主内での発現の検討 '
ベクタ一挿入用のルシフェラーゼ遗伝子を単離するため、 ブライマー （5' -AAG CGGCCGCCAAAGTTCACGATGGAAGAC-3' ( 30mer ) ) (配列 Φ号： 3 ) 及びブライマー （5 ' -TGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGATTATTACAATTTGGACTTTCCGCCC- 3' (69mer)) (配列番号： 4 ) を用い、 鈸型として 「pHvluciRT4」 を用いて、 標準 的な PCR法により両端に Not I部位の付加したルシフェラ一ゼ遺伝子を単離した。 次 いで、 これを Notlで消化した pSeV18+に挿入し、 ルシフェラ一ゼ遺伝子が挿入され たセンダイウィルスベクターを得た。 次いで、 LLCMK2細胞に導入し、 発育鷄卵に 接種した。 発育卵のしょう尿膜を切り取り、 冷 PBS ( -)で 2回洗净し、 「lysis buf ferj (Picagene WACO) 25〃1を添加し、 よく搅拌してから 15000rpmで 2分間遠心 した。 その上清を 5 1を採取し、 基質 （IATRON) を添加し、 96ゥエルプレ一 トに入れ、 ルミノメーター （Luminous CT-9000D, DIA-IATRON) で蛍光強度を測定 した。 活性は、 cps (counts per second) で表した。 この結果、 感染後 24時間目 の CV_1細胞で、 特に高いルシフヱラーゼ活性が検出された （表 6 ) 。 なお、 ルシ フェラ一ゼ遺伝子の導入されていないセンダイウィルスを対照として用いた （表 中の 「SeV」 で示してある） 。 また、 表には 2クローンの検出結果を示した。
表 6
¾光強 JJ (counts/10 sec)
CV-1 (感染¾ 24 Β,' fU] 0 )
Luc/ScV 669187
2891560 R70781
SeV 69 48
23 49
産業上の利用の可能性
( - ) 鎖 RNAウィルス cDNAより効率よくウィルス粒子を再構成する系を確立し、 「伝播力を有する特定の （―） 鎖 UNAウィルスに由来する RNAと、 核酸を含まない ウィルス構造体とを含む複合体で、 細胞感染能と RNA自律複製能とを有するが伝播 力を欠如するもの j を製造し増幅する方法等を開発した。 該複合体は、 細胞に感 染したのち細胞内でのみ増殖するので、 遗伝子治疥等安全性の耍求される分野で 、 特に有用である。 配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 3 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGCGGCCGCC GTACGGTGGC AATGAGTGAA GGAGAAGT 38 配列番号： 2
配列の長さ ： 6 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TTGCGGCCGC GATGAACTTT CACCCTAAGT TTTTVTTACT ACGGCGTACG TCATCTTTTT 60 TCTCTCTGC 69
配列番号： 3
配列の長さ： 3 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
AAGCGGCCGC CAAAGTTCAC GATGGAAGAC 30 配列番号： 4
配列の長さ ： 6 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGCGGCCGCG ATGAACTTTC ACCCTAAGTT TTTCTTACTA CGGATTATTA CAATTTGGAC 60 TTTCCGCCC 69

Claims

請求の範囲
1 . 伝播力を有する特定の （一） 鎖 RNAウィルスに由来する RNAと、 核酸を含まな いウィルス構造体とを含む複合体で、 細胞感染能と RNA自律複製能とを有するが伝 播カを欠如する複合体。
2 . 特定の RNAウィルスが非分節型 （―） 鎖 RNAウィルスであることを特徴とする 、 請求の範囲 1記載の複合体。
3 . 特定の RNAウィルスがセンダイウィルスであることを特徴とする、 請求の範囲 1記載の複合体。
4 . センダイウィルス RNAまたはセンダイウィルス cRNAを含む RNAで、 M, F，HN 蛋白 質に相当する遺伝子のうち少なくとも 1つ以上の遺伝子が欠失 または不活化して いる RNA。
5 . 請求の範囲 4記載の RNAと、 センダイウィルス由来の核酸を含まないウィルス 構造体とを含む複合体で、 細胞感染能と RNA自律複製能とを有するが伝播力を欠如 する複合体。
6 . 請求の範囲 4記載の RNAを試験管内または細胞内で転写することのできる銃型 DNAを含む DM。
7 . 複合体内に含まれる RNAが外来性遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲 1 〜 3または 5のいずれかに記載の複合体。
8 . 複合体内に含まれる RNAが外来性遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲 3 または 5に記載の複合体。 '
9 . 外来性遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲 4に記載の RNA
1 0 . 外来性遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲 6に記載の DNA。
1 1 . RNA依存性 RNA複製を阻害する薬剤を含む、 請求の範囲 1〜3、 5、 7また は 8のいずれかに記載の複合体に含まれる RNAの複製阻害剤。
1 2 . 請求の範囲 1〜3、 5、 7または 8のいずれかに記載の複合体が伝播しう る宿主。
1 3 . 請求の範囲 1〜3、 5、 7または 8のいずれかに記載の複合体の、 感染能 に関わる遺伝子群を染色体上に有し、 該複合体を感染せしめたとき、 該複合体と 同一のものを複製しうることを特徴とする請求の範囲 1 2に記載の宿主。
1 4 . 宿主が動物、 動物に由来する細胞、 動物の組織または動物の卵であること を特徴とする請求の範囲 1 2または 1 3に記載の宿主。
1 5 . 動物が哺乳類であることを特徴とする請求の範囲 1 4に記載の宿主。
1 6 . 動物が鳥類であることを特徴とする請求の範囲 1 4に記載の宿主。
1 7 . 請求の範囲 3、 5または 8のいずれかに記載の複合体の、 感染能に関わる 遺伝子群を発現しており、 該複合体を感染せしめたとき、 該複合体と同一のもの を複製しうることを特徴とする宿主。
1 8 . センダイウィルスの M遺伝子， F遺伝子， HN遺伝子またはそれらと同等の機 能を有する遺伝子のうち少なくとも 1つ以上の遺伝子を染色体上に有する宿主。
1 9 . センダイウィルスの M迫伝子または同等の機能を有する遗伝子を染色体上に 有する宿主。
2 0 . センダイウィルスの M遺伝子， NP遺伝子， P/C遺伝子および L遺伝子 （各造 伝子は同等の機能を有する遺伝子で置換されていてもよい） を染色体上に有する 宿主。
2 1 . センダイウィルスの M遺伝子， F遺伝子および HN遺伝子 （各遺伝子は同等の 機能を有する遺伝子で置換されていてもよい） を染色体上に有する宿主。
2 2 . センダイウィルスの M遺伝子， F遺伝子， HN遺伝子， NP遺伝子， P/C遺伝子お よび L遺伝子 （各遺伝子は同等の機能を有する遺伝子で置換されていてもよい） を 染色体上に有する宿主。
2 3 . 宿主が動物、 動物に由来する細胞、 動物の組織または動物の卵であること を特徴とする請求の範囲 1 7〜2 2のいずれかに記載の宿主。
2 4 . 動物が哺乳類であることを特徴とする請求の範囲 2 3に記載の宿主。
2 5 . 動物が鳥類であることを特徴とする請求の範囲 2 3に記載の宿主。
2 6 . a)請求の範囲 1〜3、 5、 7または 8のいずれかに記載の複合体に含まれ る RNAもしくは該 RNAの cRNA、 または該 RNAもしくは該 cRNAを生合成しうるュニヅト b )該 RNAもしくは該 cRNAの複製に必要な酵素群、 または該酵素群を生合成しうる ュニヅ ト
c )該複合体の、 感染能に関わる蛋白質群、 または該蛋白質群を生合成しうるュニ 'ソ卜
の 3者を含むキット。
2 7 . a)請求の範囲 1〜 3、 5、 7または 8のいずれかに記載の複合体に含まれ る RNAもしくは該 RNAの cRNA、 または該 RNAもしくは該 cRNAを生合成し うるュニッ h
b )該 RNAもしくは該 cRNAの複製に必要な酵素群、 または該酵素群を生合成しうるュ ニッ ト
c )請求の範囲 1 2〜2 5のいずれかに記載の宿主
の 3者を含むキット。
2 8 . a)請求の範囲 1〜3、 5、 7または 8のいずれかに記載の複合体 b )請求の範囲 1 2〜2 5のいずれかに記載の宿主
の 2者を含むキッ ト。
2 9 . a)請求の範囲 3、 5または 8のいずれかに記載の複合体に含まれる RNAも しくは該 RNAの cRNA、 または該 RNAもしくは該 cRNAを生合成しうるュニ ット b )センダイウィルスの NP，P/C, L蛋白質のすべて、 または該蛋白質群を生合成しう るュニッ 卜
c )該複合体の感染能に関わる蛋白質群、 または該蛋白質群を生合成しうるュニッ 卜
の 3者を含むキット。
3 0 . a)請求の範囲 3、 5または 8のいずれかに記載の複合体に含まれる RNAも しくは該 RNAの cRNA、 または該 RNAもしくは該 cRNAを生合成しうるュニ ヅト b)センダイウィルスの NP， P/C, L蛋白質のすべて、 または該蛋白質群を生合成し うるュニット
c)請求の範囲 1 7〜25のいずれかに記載の宿主
の 3者を含むキット。
3 1. a)請求の範囲 3、 5または 8のいずれかに記載の複合体
b)請求の範囲 1 7〜25のいずれかに記載の宿主
の 2者を含むキット。
32. 宿主内に、 請求の範囲 26a), b)および c)に記載の 3者を導入 することに より、 請求の範囲 1〜3、 5、 7または 8のいずれかに記載の複合体を製造する 方 。
33. 請求の範囲 27 c)に記載の宿主内に、 請求の範囲 27 a)および b)に記載の 両者を導入することにより、 請求の範囲 1〜3、 5、 7または 8のいずれかに記 載の複合体を製造する方法。
34. 請求の範囲 28 a)に記載の複合体を、 請求の範囲 28b)に記載の宿主に感 染させることにより、 該複合体を増幅し製造する方法。
35. 宿主内に、 請求の範囲 29a)，b)および c)に記載の 3者を導入 することに より、 請求の範囲 3、 5または 8のいずれかに記載の複合体を製造する方法。
36. 請求の範囲 3 Oc)に記載の宿主に、 請求の範囲 3 Oa)および b)に記載の両 者を導入することにより、 請求の範囲 3、 5または 8のいずれかに記載の複合体 を製造する方法。 '
37. 請求の範囲 3 la)に記載の複合体を、 請求の範囲 3 lb)に記載の宿主に感 染させることにより、 該複合体を増幅し製造する方法。
38. Mに相当する遺伝子が欠失または不活化していることを特 徴とする請求の 範囲 9に記載の RNA。
39. M，F，HN に相当する遺伝子がすべて欠失または不活化して いることを特徴 とする請求の範囲 9に記載の RNA。
40. a)請求の範囲 38に記載の RNA
b)請求の範囲 20に記載の宿主
c)請求の範囲 19に記載の宿主
の 3者を含むキット。
4 1. 請求の範囲 4 Oa)に記載の RNAを、 請求の範囲 4 Ob)に記載の宿主 に導入 することにより得られる複合体を、 請求の範囲 4 Oc)に記載の宿主に感染させて 該複合体を増幅し製造する方法。
42. 請求の範囲 4 1の方法により製造された複合体。
43. a)請求の範囲 39に記載の RNA
b)請求の範囲 22に記載の宿主
c)請求の範囲 2 1に記載の宿主
の 3者を含むキッ ト。
44. 請求の範囲 43 a)に記載の RNAを、 請求の範囲 43b)に記載の宿主 に導入 することにより得られる複合体を、 請求の範囲 43c)に記載の宿主に感染させて 該複合体を増幅し製造する方法。
45. 請求の範囲 44の方法により製造された複合体。
46. RNA依存性 RNA複製を阻害する薬剤を含む、 請求の 5囲 42、 45のいずれ かに記載の複合体に含まれる RNAの複製阻害剤。
47. 請求の範囲 7記載の複合体を宿主に導入し、 発現した外来性タンパク質を 回収する工程を含む、 外来 タンパク質の製造方法。
48. 宿主が、 伝播力に関する遺伝子のうち、 請求の範囲 7記載の複合体に含ま れる RNAにおいて欠如している遺伝子群を発現している細胞である、 請求の範囲 4 7記載の外来性夕ンパク質の製造方法。
49. 請求の範 ¾ 7記載の複合体を宿主に導入し、 培養液または漿尿液を回収す ることによって取得しうる、 発現した外来性タンパク質を含む培養液または漿尿 液 c
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