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WO1997030082A2 - Peptide antibacterien et antifongique - Google Patents

Peptide antibacterien et antifongique Download PDF

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Publication number
WO1997030082A2
WO1997030082A2 PCT/FR1997/000295 FR9700295W WO9730082A2 WO 1997030082 A2 WO1997030082 A2 WO 1997030082A2 FR 9700295 W FR9700295 W FR 9700295W WO 9730082 A2 WO9730082 A2 WO 9730082A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
active material
compositions
usable
water
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/000295
Other languages
English (en)
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WO1997030082A3 (fr
Inventor
Philippe Bulet
Charles Hetru
Jules Hoffmann
Laurence Sabatier
Original Assignee
Rhone-Poulenc Agrochimie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Agrochimie filed Critical Rhone-Poulenc Agrochimie
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Priority to US09/125,234 priority patent/US6127336A/en
Priority to EP97905217A priority patent/EP0882063A2/fr
Priority to BR9707292A priority patent/BR9707292A/pt
Priority to JP9529059A priority patent/JP2000505440A/ja
Priority to EA199800731A priority patent/EA000843B1/ru
Priority to IL12577897A priority patent/IL125778A/en
Priority to PL97328579A priority patent/PL328579A1/xx
Publication of WO1997030082A2 publication Critical patent/WO1997030082A2/fr
Publication of WO1997030082A3 publication Critical patent/WO1997030082A3/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43522—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from scorpions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the present invention is a new protein-rich peptide having antibacterial and antifungal properties, compositions which can be used in agriculture and in human or animal therapy containing this peptide as active material.
  • the invention also relates to methods of treating plants using these compositions as well as methods of preparing this peptide.
  • insects have an effective resistance against bacteria.
  • This defense is largely based on the rapid synthesis of several families of peptides. This defense is due to the rapid synthesis of several families of peptides with a broad spectrum of activity. This synthesis is induced by a septic injury or by the injection of a small dose of bacteria.
  • the antibacterial peptides induced the best characterized are the cecropins and defensins of insects.
  • Several other antibacterial peptides have been partially characterized.
  • Scorpions are animals older than insects on a philogenic level.
  • a first aspect of the invention relates to the peptide of formula I:
  • the molecule of formula I will be called androctonine.
  • This molecule contains 4 cysteine residues engaged in two intramolecular bridges.
  • Another aspect of the invention relates to a first method for obtaining and isolating the above peptide, which is characterized in that successively: a) the hemolymp of the scorpion Androctonus australis is taken; b) the extraction is carried out by bringing the hemolymph of Androctonus australis obtained previously into contact with an acid medium with stirring, then by centrifugation; c) the supernatant is fractionated with separation by washing of the hydrophilic molecules and elution of the hydrophobic molecules by suitable elements on a separating column d) the extracts are purified. e) characterizing the peptide.
  • the hemolymph is removed by cuticular incision. It is collected in a tube containing a protease inhibitor. After centrifugation to remove the blood cells, the plasma is stored at -30 ° C.
  • the second step (extraction) the hemolymph of Androctonus australis is brought into contact with an acid medium, consisting of an acid solution of an acid (pH 2).
  • the solution can be a solution of a mineral or organic acid such as, for example, trifluoroacetic acid.
  • the extract obtained is then centrifuged cold at a speed of 30,000 g at 4 ° C, for 25 min.
  • the extract is deposited on a reverse phase cartridge to carry out a solid phase extraction.
  • the water-soluble molecules are washed with a dilute acid solution and the hydrophobic molecules are eluted with an appropriate eluent. Good results are obtained with trifluoroacetic acid for washing and an eluent containing increasing amounts of acetonitrile in dilute acid solution.
  • the fourth step (purification) is carried out with a suitable eluent which may be different or identical to that of the previous phase.
  • a suitable eluent which may be different or identical to that of the previous phase.
  • the nature of the peptide is analyzed according to the method of sequencing by degradation of Edman (Acta Chemica Scandinavia 10 (1956) p; 761-768). According to this method, the following structures are obtained:
  • the measured masses of androctonine above are respectively: 3076.65 ⁇ 0.24 Da;
  • the mass defect corresponds to the formation of two intramolecular disulfide bridges.
  • the molecule was cleaved by an enzyme, the endoproteinase Lys-C, which breaks the peptide chain after lysine.
  • the peptides obtained were isolated and mass spectrometry showed that they were two peptides linked by a disulfide bridge.
  • the deduced sequences were Arg Ser Val Cys Arg Gin Ile Lys plus Cys Thr Asn Arg Asn Pro Tyr and Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys Tyr Tyr.
  • the peptides according to the invention can also be obtained without difficulty according to a second method, by chemical synthesis FMOC (Atherton and Sheppard RC (1989), Solid Phase Peptide Synthesis (IRL, Oxford, UK) followed by renaturation in a 100 mM solution of ammonium acetate at pH 8.5 for 24 h with stirring at room temperature
  • the androctonine obtained has the same chromatographic properties as the native molecule and the connectivity of the disulfide bridges is identical to that of the natural molecule. measured after renaturation (3076, 61 ⁇ 0.67) is very similar to that of the native molecule.
  • the synthetic molecule has the same antibacterial activity as the native molecule on the bacterium Micrococcus liteus. All antibacterial and hemolytic tests are performed with the synthetic molecule.
  • Gram negative, and Gram negative see Table 1
  • phytopathogenic bacteria and phytopathogenic fungi.
  • Example 1 Isolation and characterization of the peptide the following steps are followed: - extraction and purification: The hemolymph (3.8 ml) is removed by incision from the cuticle. It is transferred to a tube kept cold in the presence of a protease inhibitor (aprotinin) and then centrifuged at 30,000 g for 25 minutes at 4 ° C. The supernatant thus obtained is immediately subjected to the various stages of purification. Fractionation of the extract on Sep-Pak CJ8 cartridges After depositing the extract on Sep-Pak C ⁇ g cartridges, the hydrophilic molecules are eliminated by a simple washing with 5 ml of acidified water with trifluoacetic acid (TFA) at 0.05%.
  • TFA trifluoacetic acid
  • Aquapore OD 300 Ci8 with a linear gradient of 2 to 52% acetonitrile in acidified water (TFA at 0.05%) in 90 minutes (i.e. an increase of 0.44% of acetonitrile per minute) for a flow rate 1 ml / min.
  • HPI High Pressure Inert
  • the elution is carried out in a linear biphasic gradient of acetonitrile from 2 to 11% in acidified water (6 mM HCl) in 10 minutes and from 11 to 21% in 50 min at a flow rate of 1 ml / min.
  • the purity of the active fraction is controlled by capillary electrophoresis before determining the sequence by Edman degradation and analysis by mass spectrometry.
  • PB medium Poor Broth, Luria Bertani medium devoid of yeast extract
  • DIFCO yeast extract
  • the bacteria to be tested are brought to an optical density at 600 nm of 0.001 in a fresh culture medium.
  • LOul of each fraction is deposited in microtiter plates in the presence of 100 ⁇ l of the bacterial suspension. After 24 hours of incubation at 25 ° C., the growth is evaluated by measuring the absorbance at 600 nm using a microtiter plate reader. Under these conditions, 50% inhibition is observed at the concentrations, expressed in ⁇ M, indicated in the following table:
  • cultures which can be the subject of an antibacterial treatment using a compound according to the invention mention may be made, for example, of rice, cereals, in particular wheat and barley, as well as arboreal, fruit and vegetable plants.
  • cultures which can be the subject of an antifungal treatment with the aid of a compound according to the invention mention may be made, by way of examples, of cucurbits, floral crops (petunia), and vegetable crops. (carrots, tomatoes, cabbage).
  • the present invention also relates to compositions, usable as antibacterial agents, containing as active material (s) one (or more) compound according to the invention as described above, in admixture with solid or liquid carriers, acceptable in agriculture and surfactants also acceptable in agriculture.
  • active material s
  • solid or liquid carriers acceptable in agriculture and surfactants also acceptable in agriculture.
  • surfactants also acceptable in agriculture.
  • these compositions cover not only the compositions ready to be applied to the culture to be treated by means of a suitable device, such as a spraying device, but also the concentrated commercial compositions which must be diluted before application to the culture.
  • compositions can also contain all kinds of other ingredients such as, for example, protective colloids, adhesives, thickeners, thixotropic agents, penetration agents, stabilizers, sequestrants, etc. More generally the compounds used in the invention can be combined with all the solid or liquid additives corresponding to the usual techniques of formulation.
  • compositions according to the invention usually contain from 0.05 to 95% approximately (by weight) of a compound according to the invention (hereinafter called active material), one or more solid or liquid carriers and, optionally, one or more surfactants.
  • support in the present description, is meant an organic or mineral, natural or synthetic material, with which the compound is combined to facilitate its application to the plant, to seeds or to the soil.
  • This support is therefore generally inert and it must be acceptable in agriculture, in particular on the treated plant.
  • the support can be solid (clays, natural or synthetic silicates, silica, resins, waxes, solid fertilizers, etc.) or liquid (water, alcohols, in particular butanol, etc.).
  • the surfactant can be an emulsifying, dispersing or wetting agent of ionic or nonionic type or a mixture of such surfactants. Mention may be made, for example, of salts of polyacrylic acids, salts of lignosulfonic acids, salts of phenolsulfonic or naphthalene sulfonic acids, polycondensates of ethylene oxide on fatty alcohols or on fatty acids or on fatty amines , substituted phenols (in particular alkylphenols or arylphenols), ester salts sulfosuccinic acids, taurine derivatives (in particular alkyltaurates), phosphoric esters of polyoxyethylated alcohols or phenols, esters of fatty acids and polyols, the derivatives containing sulfates, sulfonates and phosphates of the above compounds.
  • the presence of at least one surfactant is generally essential when the compound and / or the inert support
  • compositions for agricultural use according to the invention can contain the active materials according to the invention within very wide limits, ranging from 0.05% to 95% (by weight).
  • Their content of surfactant is advantageously between 5% and 40% by weight.
  • compositions according to the invention are themselves in fairly diverse forms, solid or liquid.
  • dusting powders with compound content of up to 100%
  • granules in particular those obtained by extrusion, by compacting, by impregnation of a granulated support, by from a powder (the compound content in these granules being between 0.5 and 80% for the latter cases), the effervescent tablets or tablets.
  • the peptide according to the invention can also be used in the form of powders for dusting; one can also use a composition comprising 50 g of active material and 950 g of talc; one can also use a composition comprising 20 g of active material, 10 g of finely divided silica and 970 g of talc; these constituents are mixed and ground and the mixture is applied by dusting.
  • liquid compositions or intended to constitute liquid compositions during application, mention may be made of solutions, in particular water-soluble concentrates, emulsifiable concentrates, emulsions, concentrated suspensions, aerosols, powders wettable (or spray powder), pastes, gels.
  • solutions in particular water-soluble concentrates, emulsifiable concentrates, emulsions, concentrated suspensions, aerosols, powders wettable (or spray powder), pastes, gels.
  • the emulsifiable or soluble concentrates most often comprise 10 to 80% of active material, the emulsions or solutions ready for application containing, for their part, 0.001 to 20% of active material.
  • the emulsifiable concentrates can contain, when necessary, 2 to 20% of suitable additives such as stabilizers, surfactants, penetration agents, corrosion inhibitors, dyes or adhesives previously cited.
  • emulsions with any desired concentration can be obtained by dilution with water, which are particularly suitable for application to crops.
  • emulsifiable concentrates here is the composition of some emulsifiable concentrates:
  • the concentrated suspensions are prepared so as to obtain a stable fluid product which does not deposit and they usually contain from 10 to 75% of active material, from 0.5 to 15% of surfactants, from 0 , 1 to 10% of thixotropic agents, 0 to 10% of suitable additives, such as defoamers, corrosion inhibitors, stabilizers, penetrating agents and adhesives and, as support, water or an organic liquid in which the active ingredient is sparingly or not very soluble: certain organic solids or mineral salts can be dissolved in the support to help prevent sedimentation or as antifreeze for water.
  • Example SC 1 - active ingredient 500 g
  • Wettable powders are usually prepared so that they contain 20 to 95% of active ingredient, and they usually contain, in addition to the solid support, 0 to 30% of a wetting agent, 3 20% of a dispersing agent, and, when necessary, 0.1 to 10% of one or more stabilizers and / or other additives, such as penetrating agents, adhesives, or anti-caking agents, dyes, etc ...
  • the active ingredients are intimately mixed in the appropriate mixers with the additional substances and ground with mills or other suitable grinders.
  • pasta can be made.
  • the conditions and methods of making and using these pastes are similar to those of wettable powders or spraying powders.
  • compositions of wettable powders As an example, here are various compositions of wettable powders (or spraying powders):
  • This wettable powder contains the same ingredients as in the previous example, in the following proportions: - active material 75%
  • aqueous dispersions and emulsions for example the compositions obtained by diluting with water a wettable powder or an emulsifiable concentrate according to the invention, are included in the general scope of the present invention.
  • the emulsions can be of the water-in-oil or oil-in-water type and they can have a thick consistency like that of a "mayonnaise".
  • the compounds according to the invention can be formulated in the form of water-dispersible granules also included within the scope of the invention.
  • the active material content of these granules is generally between approximately 1% and 90%, and preferably between 25% and 90%.
  • the rest of the granule is essentially composed of a solid filler and optionally surfactant additives giving the granule properties of dispersibility in water.
  • These granules can be essentially of two distinct types depending on whether the selected filler is soluble or not in water.
  • the filler When the filler is water-soluble, it can be mineral or, preferably, organic. We got excellent results with urea.
  • an insoluble filler it is preferably mineral, such as for example kaolin or bentonite.
  • surfactants at a rate of 2 to 20% by weight of the granule of which more than half is, for example, constituted by at least one dispersing agent, essentially anionic, such as a polynaphthalene alkaline or alkaline earth sulfonate or an alkaline or alkaline earth lignosulfonate, the remainder being nonionic or anionic wetting agents such as an alkali or alkaline earth alkyl naphthalene sulfonate.
  • dispersing agent essentially anionic, such as a polynaphthalene alkaline or alkaline earth sulfonate or an alkaline or alkaline earth lignosulfonate, the remainder being nonionic or anionic wetting agents such as an alkali or alkaline earth alkyl naphthalene sulfonate.
  • the granule according to the invention can be prepared by mixing the necessary ingredients and then granulation according to several techniques known per se (bezel, fluid bed, atomizer, extrusion, etc.). It generally ends with a crushing followed by sieving to the particle size chosen within the limits mentioned above. Can also be used granules obtained as above and then impregnated with a composition containing the active material.
  • Example GDI Dispersible granules
  • a mixer 90% by weight of active material and 10% urea pearls are mixed. The mixture is then ground in a pin mill. A powder is obtained which is moistened with approximately 8% by weight of water. The wet powder is extruded in a perforated roller extruder. A granule is obtained which is dried, then crushed and sieved, so as to keep respectively only the granules of a size between 150 and 2000 microns.
  • Example QD2 Dispersible granules In a mixer, the following constituents are mixed: - active material 75%
  • This mixture is granulated in a fluid bed, in the presence of water, then dried, crushed and sieved so as to obtain granules of size between 0.15 and 0.80 mm.
  • These granules can be used alone, in solution or dispersion in water so as to obtain the desired dose. They can also be used to prepare combinations with other active materials, in particular antibacterials, the latter being in the form of wettable powders, or aqueous granules or suspensions.
  • the compositions suitable for storage and transport they more advantageously contain from 0.5 to 95% (by weight) of active substance.
  • the invention also relates to a method for the therapeutic antibacterial treatment for humans or animals by administration of an effective dose of the peptide according to the invention, in free form or, where appropriate, in the form of addition salts. with an acid, of Andallic salts or of addition salts with a pharmaceutically acceptable base, in the pure state or in the form of a composition in which it is associated with any other pharmaceutically compatible product, which may be inert or physiologically active.
  • the medicaments according to the invention can be administered by oral, parenteral, rectal or topical route.
  • compositions for oral administration tablets, pills, powders (especially in gelatin capsules or cachets) or granules can be used.
  • the active product according to the invention is mixed with one or more inert diluents, such as starch, cellulose, sucrose, lactose or silica.
  • these compositions can also comprise other substances, for example one or more lubricants such as magnesium stearate or talc, a colorant, a coating (dragees) or a varnish.
  • compositions for oral administration use may be made of pharmaceutically acceptable solutions, suspensions, emulsions, syrups and elixirs containing inert diluents such as water, ethanol, glycerol, vegetable oils or the like. paraffin oil.
  • inert diluents such as water, ethanol, glycerol, vegetable oils or the like. paraffin oil.
  • These compositions can also include other substances, for example wetting, sweetening, thickening, flavoring or stabilizing products.
  • the sterile compositions for parenteral administration may preferably be aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions.
  • solvent or vehicle water, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, in particular olive oil, suitable organic esters can be used.
  • These compositions can also contain adjuvants, in particular wetting agents, isotonizers, emulsifiers, dispersants and stabilizers. Sterilization can be done in different ways, for example by aseptic filtration, by incorporating sterilizing agents into the composition, by irradiation or by heating. They can also be prepared in the form of sterile solid compositions, which can be dissolved at the time of use in a sterile injectable medium.
  • the compositions for rectal administration are suppositories or rectal capsules, which contain, in addition to the active peptide, excipients such as cocoa butter, semi-synthetic glycerides or polyethylene glycols.
  • compositions for topical administration can be, for example, creams, ointments, lotions, eye drops, mouthwashes, nasal drops or aerosols.
  • the peptide according to the invention is particularly useful in antibacterial treatments.
  • the doses depend on the desired effect and on the duration of the treatment; they are generally between 50 and 1000 mg per day orally for an adult in one or more drills. In general, the doctor will determine the dosage he considers most appropriate based on age, weight and all other factors specific to the subject to be treated.
  • Example A is given without implied limitation illustrating the compositions according to the invention.
  • Tablets containing 50 mg of active peptide having the following composition are prepared according to the usual technique:
  • a solution for injection containing 20 mg of active peptide having the following composition is prepared: - androctonine peptide M 2 22.4 mg

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Abstract

Peptide antibactérien et antifongique de la formule (I), utilisable comme antibactérien et antifongique.

Description

Peptide antibactérien et antifongique
La présente invention a pour objet un nouveau peptide riche en protéines ayant des propriétés antibactériennes et antifongiques, des compositions utilisables en agriculture et en thérapie humaine ou animale contenant ce peptide comme matière active. L'invention concerne également des procédés de traitement des plantes à l'aide de ces compositions ainsi que des procédés de préparation de ce peptide.
On sait de longue date que les insectes présentent une résistance efficace contre les bactéries. Cette défense est pour une large part basée sur la synthèse rapide de plusieurs familles de peptides. Cette défense est due à la synthèse rapide de plusieurs familles de peptides à large spectre d'activité. Cette synthèse est induite par une blessure septique ou par l'injection d'une faible dose de bactéries. Parmi les peptides antibactériens induits, les mieux caractérisés sont les cécropines et les défensines d'insectes. Plusieurs autres peptides antibactériens ont été partiellement caractérisés.
A côté de la classe des insectes peu de choses sont connues concernant d'autres arthropodes. Les scorpions sont des animaux plus anciens que les insectes au niveau philogénique.
Il a maintenant été isolé, à partir d'une induction chez le scorpion Androconus australis, un peptide, qui présente des caractéristiques remarquables ainsi que des propriétés antibactériennes et antifongiques.
Plus particulièrement un premier aspect de l'invention concerne le peptide de formule I:
Arg Ser Val Cys Arg Gin Ile Lys Ile Cys Arg
Arg Arg Tyr Pro Arg Asn Thr Cys Lys Tyr Tyr Cys Gly Gly
Dans la suite, la molécule de formule I sera appelée androctonine. Cette molécule, de taille réduite, comporte de 4 résidus cystéine engagés dans deux ponts intramoléculaires. Un autre aspect de l'invention concerne un premier procédé pour l'obtention et l'isolement du peptide ci-dessus, qui est caractérisé en ce que successivement: a) on prélève de l'hémolympe du scorpion Androctonus australis ; b) on effectue l'extraction par mise en contact d'hémolymphe de Androctonus australis obtenue précédemment avec un milieu acide sous agitation, puis par centrifugation; c) on fractionne le surnageant avec séparation par lavage des molécules hydrophiles et élution des molécules hydrophobes par des éléments appropriés sur colonne séparatrice d) on purifie les extraits. e) on caractérise le peptide.
L'hémolymphe est prélevée par incision cuticulaire. Elle est recueillie dans un tube contenant un inhibiteur de protéase. Après centrifugation pour éliminer les cellules sanguines, le plasma est stocké à -30°C.
De manière préférée la seconde étape (extraction) on met en contact l'hémolymphe de Androctonus australis avec un milieu acide, constitué d'une solution acide d'un acide (de pH de 2). La solution peut être une solution d'un acide minéral ou organique comme par exemple d'acide trifluoroacétique. L'extrait obtenu est ensuite centrifugé à froid à une vitesse de 30.000 g à 4°C, pendant 25 min.
De manière préférée la troisième étape (fractionnement), l'extrait est déposé sur une cartouche de phase inverse pour réaliser une extraction en phase solide. Le lavage des molécules solubles dans l'eau est effectué avec une solution acide diluée et l'élution des molécules hydrophobes avec un éluant approprié. On obtient de bons résultats avec de l'acide trifluoroacétique pour le lavage et un éluant contenant des quantités croissantes d'acétonitrile en solution acide diluée.
De manière préférée la quatrième étape (purification) est effectuée avec un éluant convenable qui peut être différent ou identique à celui de la phase précédente. De manière préférée, dans la dernière étape (caractérisation), la nature du peptide est analysée selon la méthode de séquençage par dégradation d' Edman (Acta Chemica Scandinavia 10 (1956) p; 761-768). Selon cette méthode on obtient les structures suivantes:
Figure imgf000004_0001
Aucun signal n'était détectable dans les positions 4, 10, 16 et 20. (dégradation d'Edman). La présence de cystéines dans ces positions a été montrée par spectrométrie de masse, la structure alors obtenue étant la suivante: Arg Ser Val Cys Arg Gin Ile Lys Ile Cys Arg
Arg
Àrg Tyr Pro Arg Asn Thr Cys Lys Tyr Tyr Cys Gly Gly
Les masses mesurées de l'androctonine ci-dessus sont respectivement de: 3076,65 ± 0,24 Da;
Or les masses calculées sur la base des données de séquence sont respectivement de: 3080,65 ± 0,24 Da;
Le défaut de masse correspond à la formation de deux pont disulfure intramoléculaires.
Afin d'établir la connectivité des ponts disulfure, la molécule a été clivée par une enzyme, l'endoprotéinase Lys-C, qui rompt la chaîne peptidique après la lysine. Les peptides obtenus ont été isolés et la spectrométrie de masse a montré qu'il s'agissait de deux peptides liés par un pont disulfure. Les séquences déduites étaient Arg Ser Val Cys Arg Gin Ile Lys plus Cys Thr Asn Arg Asn Pro Tyr et Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys Tyr Tyr.
La connectivité des ponts disulfure est ainsi établie et la cystéine 1 est liée à la cystéine 4, la cystéine 2 à la cystéine 3. Ce résultat peut être schématisé ainsi:
Figure imgf000005_0001
Ces bonnes corrélations confirment les séquences proposées.
Les peptides selon l'invention peuvent également être obtenus sans difficulté selon un second procédé, par synthèse chimique FMOC (Atherton and Sheppard R.C. (1989), Solid Phase Peptide Synthesis (IRL, Oxford, UK) suivie d'une renaturation dans une solution lOOmM d'acétate d'ammonium à pH 8,5 pendant 24 h sous agitation à température ambiante. L'androctonine obtenue présente les mêmes propriétés chromatographiques que la molécule native et la connectivité des ponts disulfure est identique à celle de la molécule naturelle. La masse mesurée après renaturation (3076, 61 ± 0,67) est très semblable à celle de la molécule native. La molécule synthétique présente la même activité antibactérienne que la molécule native sur la bactérie Micrococcus liteus. L'ensemble des tests antibactériens et hémolytiques est réalisé avec la molécule synthétique.
1. L'androctonine ne présente aucun effet lytique sur des hématies de porc ou de boeuf. 2. Ces molécules ont des propriétés antibactériennes vis-à-vis des bactéries à
Gram négatif, et à Gram négatif (cf tableau 1), des bactéries phytopathogènes et des champignons phytopathogènes.
Les exemples suivants illustrent l'obtention et les propriétés antibactériennes des peptides et des compositions selon l'invention.
Exemple 1 : Isolement et caractérisation du peptide on procède selon les étapes suivantes: - extraction et de purification : L'hémolymphe (3,8 ml) est prélevée par incision de la cuticule. Elle est transférée dans un tube maintenu au froid en présence d'un inhibiteur de protéases (aprotinine) puis centrifugée à 30.000 g pendant 25 minutes à 4°C. Le surnageant ainsi obtenu est immédiatement soumis aux différentes étapes de la purification. Fractionnement de l'extrait sur cartouches Sep-Pak CJ8 Après dépôt de l'extrait sur des cartouches Sep-Pak C\g, les molécules à caractère hydrophile sont éliminées par un simple lavage par 5 ml d'eau acidifiée à l'acide trifluoacétique (TFA) à 0,05%.
L'élution des molécules hydrophobes est réalisée avec des solutions à 10, 40 et 80% d'acétonitrile en eau acidifiée (TFA 0,05%, 5 ml par cartouche). Les fractions recueillies sont dénommées "Elution 10%", "Elution 40%" et
"Elution 80%" et concentrées sous vide. Les fractions sont ensuite reconstituées avec de l'eau qualité HPLC avant l'analyse en HPLC.
Purification par HPLC des molécules à activité antibactérienne première étape: La fraction "Elution 40% est analysée sur une colonne de phase inverse
Aquapore OD 300 Ci8 avec un gradient linéaire d'acétonitrile de 2 à 52% dans l'eau acidifiée (TFA à 0,05%) en 90 minutes (soit une augmentation de 0,44% d'acétonitrile par minute) pour un débit de 1 ml/min.
Les fractions actives résultantes sont ensuite purifiées sur une colonne "High Pressure Inert" (HPI) Delta Pak C18 (150*3,9 mm).
L'élution est réalisée dans un gradient linéaire biphasique d'acétonitrile de 2 à 11% dans l'eau acidifiée (HC1 6mM) en 10 minutes et de 11 à 21% en 50 min à un débit de 1 ml/min. La pureté de la fraction active est contrôlée par électrophorèse capillaire avant la détermination de la séquence par dégradation d'Edman et analyse en spectrométrie de masse.
Exemple 2: Test in vitro: Mesure de l'activité antibactérienne par microspectrophotométrie
Pur chaque souche de bactérie utilisée (E.coli ; M.luteus) une colonne isolée est mise en suspension dans 10 ml de milieu PB (Poor Broth, milieu Luria Bertani dépourvu d'extrait de levure) DIFCO et incubée à 30°C pendant une nuit sous agitation lente. Les bactéries à tester sont ramenées à une densité optique à 600 nm de 0,001 dans un milieu de culture frais. On dépose lOul de chaque fraction dasn des plaques de microtitration en présence de 100 μl de la suspension bactérienne. Au bout de 24 heures d'incibation à 25°C, on évalue la croissance par la mesure de l'absorbance à 600 nm à l'aide d'un lecteur de plaque de microtitration. Dans ces conditions on observe une inhibition à 50% aux concentrations, exprimées en μM, indiquées dans le tableau suivant:
Tableau 1
Figure imgf000007_0001
En utilisant le même protocole mais avec des bactéries phytopathogènes, on obtient les résultats suivants: Tableau 2
Figure imgf000008_0001
En utilisant le même protocole mais avec des champignons phytopathogènes, on obtient les résultats suivants:
Tableau 3
Figure imgf000008_0002
* milieu supplémenté avec ImM CaC12 et 20 mM KG
Parmi les cultures pouvant faire l'objet d'un traitement antibactérien à l'aide d'un composé selon l'invention, on peut citer à titre d'exemples le riz, les céréales, notamment le blé et l'orge, ainsi que les plantes arboricoles, fruitières, légumières. Parmi les cultures pouvant faire l'objet d'un traitement antifongiques à l'aide d'un composé selon l'invention, on peut citer, à titre d'exemples, les cucurbitacées, les cultures florales (pétunia), et les cultures maraîchères (carottes, tomates, choux).
Ces résultats montrent l'excellente activité antibactérienne du peptide selon l'invention, qui peut s'appliquer aux domaines humain, animal et végétal.
La présente invention a également pour objet des compositions, utilisables comme agents antibactériens, contenant comme matière(s) active(s) un (ou plusieurs) composé selon l'invention tel que décrit précédemment, en mélange avec les supports solides ou liquides, acceptables en agriculture et les agents tensio- actifs également acceptables en agriculture. En particulier sont utilisables les supports inertes et usuels et les agents tensio-actifs usuels. Ces compositions recouvrent non seulement les compositions prêtes à être appliquées sur la culture à traiter au moyen d'un dispositif adapté, tel qu'un dispositif de pulvérisation, mais également les compositions concentrées commerciales qui doivent être diluées avant application sur la culture.
Ces compositions peuvent contenir aussi toute sorte d'autres ingrédients tels que, par exemple, des colloïdes protecteurs, des adhésifs, des épaississants, des agents thixotropes, des agents de pénétration, des stabilisants, des séquestrants, etc... Plus généralement les composés utilisés dans l'invention peuvent être combinés à tous les additifs solides ou liquides correspondant aux techniques habituelles de la mise en formulation.
D'une façon générale, les compositions selon l'invention contiennent habituellement de 0,05 à 95 % environ (en poids) d'un composé selon l'invention (appelé par la suite matière active), un ou plusieurs supports solides ou liquides et, éventuellement, un ou plusieurs agents tensioactifs.
Par le terme "support", dans le présent exposé, on désigne une matière organique ou minérale, naturelle ou synthétique, avec laquelle le composé est combiné pour faciliter son application sur la plante, sur des graines ou sur le sol. Ce support est donc généralement inerte et il doit être acceptable en agriculture, notamment sur la plante traitée. Le support peut être solide (argiles, silicates naturels ou synthétiques, silice, résines, cires, engrais solides, etc...) ou liquide (eau, alcools, notamment le butanol etc.).
L'agent tensioactif peut être un agent émulsionnant, dispersant ou mouillant de type ionique ou non ionique ou un mélange de tels agents tensioactifs. On peut citer par exemple des sels d'acides polyacryliques, des sels d'acides lignosulfoniques, des sels d'acides phénolsulfoniques ou naphtalènesulfoniques, des polycondensats d'oxyde d'éthylene sur des alcools gras ou sur des acides gras ou sur des aminés grasses, des phénols substitués (notamment des alkylphénols ou des arylphénols), des sels d'esters d'acides sulfosucciniques, des dérivés de la taurine (notamment des alkyltaurates), des esters phosphoriques d'alcools ou de phénols polyoxyéthylés, des esters d'acides gras et de polyols, les dérivés à fonction sulfates, sulfonates et phosphates des composés précédents. La présence d'au moins un agent tensioactif est généralement indispensable lorsque le composé et/ou le support inerte ne sont pas solubles dans l'eau et que l'agent vecteur de l'application est l'eau.
Ainsi donc, les compositions à usage agricole selon l'invention peuvent contenir les matières actives selon l'invention dans de très larges limites, allant de 0,05 % à 95 % (en poids). Leur teneur en agent tensio-actif est avantageusement comprise entre 5 % et 40 % en poids.
Ces compositions selon l'invention sont elles-mêmes sous des formes assez diverses, solides ou liquides.
Comme formes de compositions solides, on peut citer les poudres pour poudrage (à teneur en composé pouvant aller jusqu'à 100 %) et les granulés, notamment ceux obtenus par extrusion, par compactage, par imprégnation d'un support granulé, par granulation à partir d'une poudre (la teneur en composé dans ces granulés étant entre 0,5 et 80 % pour ces derniers cas), les comprimés ou tablettes effervescents.
Le peptide selon l'invention peuvent encore être utilisés sous forme de poudres pour poudrage; on peut aussi utiliser une composition comprenant 50 g de matière active et 950 g de talc; on peut aussi utiliser une composition comprenant 20 g de matière active, 10 g de silice finement divisée et 970 g de talc; on mélange et broie ces constituants et on applique le mélange par poudrage.
Comme formes de compositions liquides ou destinées à constituer des compositions liquides lors de l'application, on peut citer les solutions, en particulier les concentrés solubles dans l'eau, les concentrés émulsionnables, les émulsions, les suspensions concentrées, les aérosols, les poudres mouillables (ou poudre à pulvériser), les pâtes, les gels.
Les concentrés émulsionnables ou solubles comprennent le plus souvent 10 à 80 % de matière active, les émulsions ou solutions prêtes à l'application contenant, quant à elles, 0,001 à 20 % de matière active.
En plus du solvant, les concentrés émulsionnables peuvent contenir quand c'est nécessaire, 2 à 20 % d'additifs appropriés comme les stabilisants, les agents tensio¬ actifs, les agents de pénétration, les inhibiteurs de corrosion, les colorants ou les adhésifs précédemment cités.
A partir de ces concentrés, on peut obtenir par dilution avec de l'eau des émulsions de toute concentration désirée, qui conviennent particulièrement à l'application sur les cultures. A titre d'exemple, voici la composition de quelques concentrés émulsionnables :
Exemple CE 1 :
- matière active 400 g/1
- dodécylbenzène sulfonate alcalin 24 g/1
- nonylphénol oxyéthylé à 10 molécules d'oxyde d'éthylene 16 g/l
- cyclohexanone 200 g/1
- solvant aromatique q.s.p.l litre
Selon une autre formule de concentré émulsionnable, on utilise
Exemple CE 2
- matière active 250 g
- huile végétale époxydée 25 g
- mélange de sulfonate d'alcoylaryle et d'éther de poly glycol et d'alcools gras 100 g
- diAndhylformamide 50 g
- xylène 575 g
Les suspensions concentrées, également applicables en pulvérisation, sont préparées de manière à obtenir un produit fluide stable ne se déposant pas et elles contiennent habituellement de 10 à 75 % de matière active, de 0,5 à 15 % d'agents tensioactifs, de 0,1 à 10 % d'agents thixotropes, de 0 à 10 % d'additifs appropriés, comme des anti-mousses, des inhibiteurs de corrosion, des stabilisants, des agents de pénétration et des adhésifs et, comme support, de l'eau ou un liquide organique dans lequel la matière active est peu ou pas soluble : certaines matières solides organiques ou des sels minéraux peuvent être dissous dans le support pour aider à empêcher la sédimentation ou comme antigels pour l'eau.
A titre d'exemple, voici une composition de suspension concentrée :
Exemple SC 1 : - matière active 500 g
- phosphate de tristyrylphénol polyéthoxylé 50 g
- alkylphénol polyéthoxylé 50 g
- polycarboxylate de sodium 20 g - ethylène glycol 50 g
- huile organopolysiloxanique (antimousse) l g
- polysaccharide L5 g
- eau 316,5 g
Les poudres mouillables (ou poudre à pulvériser) sont habituellement préparées de manière qu'elles contiennent 20 à 95 % de matière active, et elles contiennent habituellement, en plus du support solide, de 0 à 30 % d'un agent mouillant, de 3 à 20 % d'un agent dispersant, et, quand c'est nécessaire, de 0,1 à 10 % d'un ou plusieurs stabilisants et/ou autres additifs, comme des agents de pénétration, des adhésifs, ou des agents antimottants, colorants, etc...
Pour obtenir les poudres à pulvériser ou poudres mouillables, on mélange intimement les matières actives dans les mélangeurs appropriés avec les substances additionnelles et on broie avec des moulins ou autres broyeurs appropriés. On obtient par là des poudres à pulvériser dont la mouillabilité et la mise en suspension sont avantageuses ; on peut les mettre en suspension avec de l'eau à toute concentration désirée et ces suspensions sont utilisables très avantageusement en particulier pour l'application sur les feuilles des végétaux.
A la place des poudres mouillables, on peut réaliser des pâtes. Les conditions et modalités de réalisation et d'utilisation de ces pâtes sont semblables à celles des poudres mouillables ou poudres à pulvériser.
A titre d'exemple, voici diverses compositions de poudres mouillables (ou poudres à pulvériser) :
Exemple PM 1
- matière active 50%
- alcool gras éthoxy lé (agent mouillant) 2,5%
- phényléthylphénol éthoxylé (agent dispersant) 5%
- craie (support inerte) 42,5%
Exemple PM 2 :
- matière active 10%
- alcool synthétique oxo de type ramifié, en Cl 3 éthoxylé par 8 à 10 oxyde d'éthylene (agent mouillant) 0,75%
- lignosulfonate de calcium neutre (agent dispersant) 12%
- carbonate de calcium (charge inerte) q.s.p. 100 % Exemple PM 3 :
Cette poudre mouillable contient les mêmes ingrédients que dans l'exemple précédent, dans les proportions ci-après : - matière active 75%
- agent mouillant 1 ,50%
- agent dispersant 8%
- carbonate de calcium (charge inerte) q.s.p. 100%
Exemple PM 4 :
- matière active 90%
- alcool gras éthoxylé (agent mouillant) 4%
- phényléthylphénol éthoxylé (agent dispersant) 6%
Exemple PM 5 :
- matière active 50%
- mélange de tensio-actifs anioniques et non ioniques (agent mouillant) 2,5%
- lignosulfonate de sodium (agent dispersant) 5% - argile kaolinique (support inerte) 42,5%
Les dispersions et émulsions aqueuses, par exemple les compositions obtenues en diluant à l'aide d'eau une poudre mouillable ou un concentré émulsionnable selon l'invention, sont comprises dans le cadre général de la présente invention. Les émulsions peuvent être du type eau-dans-l'huile ou huile-dans-l'eau et elles peuvent avoir une consistance épaisse comme celle d'une "mayonnaise".
Les composés selon l'invention peuvent être formulés sous la forme de granulés dispersibles dans l'eau également compris dans le cadre de l'invention.
Ces granulés dispersibles, de densité apparente généralement comprise entre environ 0,3 et 0,6 ont une dimension de particules généralement comprise entre environ 150 et 2000 et de préférence entre 300 et 1500 microns.
La teneur en matière active de ces granulés est généralement comprise entre environ 1 % et 90 %, et de préférence entre 25 % et 90 %.
Le reste du granulé est essentiellement composé d'une charge solide et éventuellement d'adjuvants tensio-actifs conférant au granulé des propriétés de dispersibilité dans l'eau. Ces granulés peuvent être essentiellement de deux types distincts selon que la charge retenue est soluble ou non dans l'eau. Lorsque la charge est hydrosoluble, elle peut être minérale ou, de préférence, organique. On a obtenu d'excellents résultats avec l'urée. Dans le cas d'une charge insoluble, celle-ci est de préférence minérale, comme par exemple le kaolin ou la bentonite. Elle est alors avantageusement accompagnée d'agents tensio-actifs (à raison de 2 à 20 % en poids du granulé) dont plus de la moitié est, par exemple, constituée par au moins un agent dispersant, essentiellement anionique, tel qu'un polynaphtalène sulfonate alcalin ou alcalino terreux ou un lignosulfonate alcalin ou alcalino-terreux, le reste étant constitué par des mouillants non ioniques ou anioniques tel qu'un alcoyl naphtalène sulfonate alcalin ou alcalino-terreux.
Par ailleurs, bien que cela ne soit pas indispensable, on peut ajouter d'autres adjuvants tels que des agents anti-mousse.
Le granulé selon l'invention peut être préparé par mélange des ingrédients nécessaires puis granulation selon plusieurs techniques en soi connues (drageoir, lit fluide, atomiseur, extrusion, etc.). On termine généralement par un concassage suivi d'un tamisage à la dimension de particule choisie dans les limites mentionnées ci- dessus. On peut encore utilisé des granulés obtenus comme précédemment puis imprégnés avec une composition contenant la matière active.
De préférence, il est obtenu par extrusion, en opérant comme indiqué dans les exemples ci-après.
Exemple GDI : Granulés dispersibles
Dans un mélangeur, on mélange 90 % en poids de matière active et 10 % d'urée en perles. Le mélange est ensuite broyé dans un broyeur à broches. On obtient une poudre que l'on humidifie avec environ 8 % en poids d'eau. La poudre humide est extradée dans une extrudeuse à rouleau perforé. On obtient un granulé qui est séché, puis concassé et tamisé, de façon à ne garder respectivement que les granulés d'une dimension comprise entre 150 et 2000 microns.
Exemple QD2 : Granulés dispersibles Dans un mélangeur, on mélange les constituants suivants : - matière active 75%
- agent mouillant (alkylnaphtalène sulfonate de sodium) 2%
- agent dispersant (polynaphtalène sulfonate de sodium) 8%
- charge inerte insoluble dans l'eau (kaolin) 15%
Ce mélange est granulé en lit fluide, en présence d'eau, puis séché, concassé et tamisé de manière à obtenir des granulés de dimension comprise entre 0,15 et 0,80 mm. Ces granulés peuvent être utilisés seuls, en solution ou dispersion dans de l'eau de manière à obtenir la dose cherchée. Ils peuvent aussi être utilisés pour préparer des associations avec d'autres matières actives, notamment antibactériens, ces dernières étant sous la forme de poudres mouillables, ou de granulés ou suspensions aqueuses. En ce qui concerne les compositions adaptées au stockage et au transport, elles contiennent plus avantageusement de 0,5 à 95 % (en poids) de substance active.
L'invention concerne également un procédé pour le traitement antibactérien thérapeutique pour l'homme ou l'animal par administration d'une dose efficace du peptide selon l'invention, sous forme libre ou, le cas échéant, sous forme de sels d'addition avec un acide, de sels Andalliques ou de sels d'addition avec une base pharmaceutiquement acceptables, à l'état pur ou sous forme d'une composition dans laquelle il est associé à tout autre produit pharmaceutiquement compatible, pouvant être inerte ou physiologiquement actif. Les médicaments selon l'invention peuvent être administrés par voie orale, parentérale, rectale ou topique.
Comme compositions solides pour administration orale peuvent être utilisés des comprimés, pilules, poudres (notamment dans des capsules de gélatine ou des cachets) ou granulés. Dans ces compositions, le produit actif selon l'invention est mélangé à un ou plusieurs diluants inertes, tels que amidon, cellulose, saccharose, lactose ou silice. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres , par exemple un ou plusieurs lubrifiants tel que le stéarate de magnésium ou la talc, un colorant, un enrobage(dragées) ou un vernis.
Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des solutions, des suspensions, des émulsions, des sirops, et des élixirs pharmaceutiquement acceptable contenant des diluants inertes tels que l'eau, l'ethanol, le glycérol, les huiles végétales ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres, par exemple des produits mouillants, édulcorants, épaississants, aromatisants ou stabilisants..
Les compositions stériles pour administration parentérale peuvent être de préférence des solutions aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer l'eau, le propylèneglycol, un polyéthylène glycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, des esters organiques convenables. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, isotonisants, émulsifiants, dispersants et stabilisants. La stérilisation peut se faire de différentes façons, par exemple par filtration aseptisante, en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage. Elles peuvent être également préparées sous forme de compositions solides stériles, qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans un milieu stérile injectable. Les compositions pour administration rectale sont les suppositoires ou les capsules rectales, qui contiennent, outre le peptide actif, des excipients tels que le beurre de cacao, des glycérides semi-synthétiques ou des polyéthylène glycols.
Les compositions stériles pour administration topique peuvent être par exemple des crèmes, pommades, lotions, collyres, collutoires, gouttes nasales ou aérosols.
En thérapeutique humaine, le peptide selon l'invention est particulièrement utile dans les traitement antibactériens. Les doses dépendent de l'effet recherché et de la durée du traitement; elles sont genéralment comprises entre 50 et 1000 mg par jour par voie orale pour un adulte en une ou plusieurs perises. D'une façon générale, le médecin déterminera la posologie qu'il estime la plus appropriée en fonction de l'âge, du poids et de tous les autres facteurs propres au sujet à traiter.
Les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif illustrent les compositions selon l'invention. Exemple A:
On prépare, selon la technique habituelle, des comprimés dosés à 50 mg de peptide actif ayant la composition suivante:
- peptide androctonine Ml 50 mg
- amidon 60 mg - lactose 50 mg
- stéarate de magnésium 2 mg Exemple B:
On prépare une solution injectable contanant 20 mg de peptide actif ayant la composition suivante: - peptide androctonine M 2 22,4 mg
- eau distillée q.s.p. 2 cπw

Claims

REVENDICATIONS
1. Peptide de formule:
Figure imgf000017_0001
2. Composition antibactérienne, caractérisée en ce qu'elle contient comme matière active un peptide selon la revendication 1.
3. Composition selon la revendication 2, utilisable pour la protection des plantes contre les bactéries pathogènes.
4. Composition selon la revendication 2, utilisable pour le traitement thérapeutique du corps humain ou animal.
5. Composition antifongique, caractérisée en ce qu'elle contient comme matière active un peptide selon la revendication 1.
6. Composition selon la revendication 5, utilisable pour la protection des plantes contre les bactéries pathogènes.
7. Composition selon la revendication 5, utilisable pour le traitement thérapeutique du corps humain ou animal.
8. Procédé pour la protection des plantes contre les maladies bactériennes, caractérisé en ce qu'on applique, comme matière active, un peptide selon la revendication 1.
9. Procédé pour la protection des plantes contre les maladies fongiques, caractérisé en ce qu'on applique, comme matière active, un peptide selon la revendication 1.
10. Procédé de préparation du peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que, successivement: a) on prélève de l'hémolymphe du scorpion Androctonus australis ; b) on effectue l'extraction par mise en contact d'hémolymphe ou d'un broyât de Androctonus australis obtenues précédemment avec un milieu acide à neutre sous agitation, puis par centrifugation; c) on fractionne le surnageant avec séparation par lavage des molécules hydrophiles et elution des molécules hydrophobes par des éléments appropriés, sur colonne séparatrice; d) on purifie les extraits; e) on effectue le séquençage.
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