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WO1997035024A1 - Combinaisons d'enzymes pour la destruction des cellules proliferatives - Google Patents

Combinaisons d'enzymes pour la destruction des cellules proliferatives Download PDF

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Publication number
WO1997035024A1
WO1997035024A1 PCT/FR1997/000436 FR9700436W WO9735024A1 WO 1997035024 A1 WO1997035024 A1 WO 1997035024A1 FR 9700436 W FR9700436 W FR 9700436W WO 9735024 A1 WO9735024 A1 WO 9735024A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
kinase
nucleoside
analog
acid coding
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/000436
Other languages
English (en)
Inventor
Francis Blanche
Béatrice Cameron
Michel Couder
Jöel CROUZET
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S.A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority to EP97914376A priority Critical patent/EP0910654A1/fr
Priority to US09/125,576 priority patent/US6518062B1/en
Priority to BR9708194A priority patent/BR9708194A/pt
Priority to KR1019980707184A priority patent/KR20000064581A/ko
Priority to JP9533187A priority patent/JP2000507814A/ja
Priority to IL12615497A priority patent/IL126154A0/xx
Priority to AU21642/97A priority patent/AU732432B2/en
Priority to SK1245-98A priority patent/SK124598A3/sk
Publication of WO1997035024A1 publication Critical patent/WO1997035024A1/fr
Priority to NO984132A priority patent/NO984132L/no

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C12N9/1211—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to the field of gene and cell therapy. It relates in particular to combinations of enzymes which can be used for the destruction of cells, in particular proliferative cells. It also relates to vectors allowing the transfer and the intracellular expression of these combinations of enzymes, as well as their therapeutic use, in particular in anti-cancer gene therapy.
  • Gene therapy which consists of introducing genetic information into an organism or cell, has experienced extraordinary development in recent years.
  • numerous clinical trials of gene or cell therapy have been undertaken in Europe as in the United States, in fields such as monogenic diseases (hemophilia, cystic fibrosis), cancer, cardiovascular pathologies or still nervous system disorders.
  • tumor suppressor genes p53, Rb
  • myc, Ras antisense directed against oncogenes
  • immunotherapy administration of antigens tumor cells or specific immune cells, etc.
  • Another approach consists in introducing into the cells concerned a toxic or suicide gene capable of inducing the destruction of said cells.
  • genes are for example genes capable of sensitize cells to a pharmaceutical agent. They are generally genes coding for non-mammalian and non-toxic enzymes which, when expressed in mammalian cells, transform a prodrug, initially slightly or not toxic, into a highly toxic agent.
  • Such a prodrug activation mechanism is advantageous for several reasons: it makes it possible to optimize the therapeutic index by adjusting the concentration of prodrug or the expression of the enzyme, to interrupt the toxicity by no longer administering the prodrug and assess the mortality rate.
  • the use of these suicide genes offers the advantage of not being specific for a particular type of tumor, but of general application.
  • the strategies based on the use of tumor suppressor genes or anti-oncogenic antisense are applicable only to tumors having a deficiency in said suppressor gene or an overexpression of said oncogene.
  • approaches based on immunotherapy must be developed patient by patient, to take into account immune restrictions and skills.
  • a strategy based on the use of a suicide gene is applicable to any type of tumor, and, more generally, to practically any type of cell.
  • suicide genes are described in the literature, for example the genes coding for cytosine deaminase, purine nucleoside phophorylase or thymidine kinase, such as, for example, thymidine kinases from the varicella virus or from the herpes simplex virus type 1. .
  • Escherichia coli cytosine deaminase is capable of catalyzing the deamination of cytosine to uracil.
  • Cells that express the E. coli gene are therefore able to convert 5-fluorocytosine to 5-fluorouracil, which is a toxic metabolite (Mullen et al. 1992 Proc. Natl. Acad. USA 89 ⁇ 33).
  • the purine nucleoside phophorylase from Escherichia coli allows the conversion of non-toxic deoxyadenosine analogs to very toxic adenine analogs.
  • deoxyadenine analogs such as 6-methyl-purine-2'-deoxyribonucleoside is transformed into a toxic product for these cells (Sorscher et al. . 1994 Gene Therapy 1 p233).
  • the thymidine kinase of the chickenpox virus allows the monophosphorylation of 6-methoxypurine arabinoside. If mammalian cells express this viral gene, this monophosphate is produced and then metabolized by cellular enzymes into a toxic compound (Huber et al.
  • TK thymidine kinase
  • the viral thymidine kinase, and in particular the varicella virus or herpes simplex virus type 1 thymidine kinases have a different substrate specificity from the cellular enzyme, and it has been shown that they are the target of guanosine analogs such as acyclovir or ganciclovir (Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276).
  • ganciclovir is phosphorylated to ganciclovir monophosphate only when mammalian cells produce the enzyme HSV1-TK, then cellular kinases allow the metabolism of ganciclovir monophosphate to diphosphate then triphosphate which causes the stop of DNA synthesis and leads to cell death (Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276; Mullen 1994 Pharmac. Ther. 63 pl99). The same mechanism occurs with other thymidine kinases and other guanosine analogs.
  • TK a propagated toxicity effect
  • This effect is manifested by the destruction not only of cells having incorporated the TK gene, but also of neighboring cells.
  • the mechanism of this process can be explained in three ways: i) the formation of apoptotic vesicles which contain phosphorylated ganciclovir or thymidine kinase, originating from dead cells, then the phagocytosis of these vesicles by neighboring cells; ii) the passage of prodrug metabolized by thymidine kinase, by a process of metabolic cooperation from cells containing the suicide gene to cells not containing it and / or iii) an immune response linked to tumor regression (Marini et al . 1995 Gene Therapy 2 p655).
  • the use of the suicide gene coding for the herpes virus thymidine kinase is very widely documented.
  • the first in vivo studies in rats with a glioma show tumor regressions when the HSV1-TK gene is expressed and doses of 150 mg / kg of ganciclovir are injected [K. Culver et al. 1992 Science 256 pl550].
  • these doses are highly toxic in mice [T. Osaki et al. 1994 Cancer Research 54 p5258] and therefore totally proscribed in gene therapy in humans.
  • TK gene is delivered to cells by means of various vectors such as in particular retroviral or adenoviral vectors.
  • various vectors such as in particular retroviral or adenoviral vectors.
  • undesirable side effects of toxicity are indeed observed.
  • the present invention provides an improved method of gene therapy by suicide gene.
  • the present invention describes in particular a method making it possible to improve the efficiency of phosphorylation of guanosine analogues by thymidine kinase and thus, to improve the therapeutic potential of this treatment.
  • the present invention provides in particular a method for triphosphorylating nucleoside analogs such as ganciclovir or acyclovir so that the triphosphorylation of these analogs is very significantly increased at doses of ganciclovir (resp.
  • Acyclovir i) significantly lower; ii) or likely to cause a more pronounced "bystander”effect; iii) or not leading to a cellular toxicity which could occur when wild thymidine kinase is overexpressed.
  • This method can be applied to cancer, to cardiovascular diseases, or to any application requiring the death of certain cells such as cells infected with a virus; this virus can be a virus of the type
  • HIV human immunodeficiency virus
  • CMV cytomegalovirus
  • VCR respiratory syncytial virus
  • the present invention is based in particular on the use of a combination of enzymes, making it possible to improve in vivo the phosphorylation reaction of nucleoside analogs.
  • a first subject of the invention therefore resides in a composition comprising:
  • the enzyme capable of phosphorylating a nucleoside analog, to generate a monophosphate analog is a thymidine kinase
  • the enzyme capable of phosphorylating said monophosphate analog, to generate a diphosphate analog is a guanylate kinase
  • the enzyme capable of phosphorylating said diphosphate analog to generate a triphosphate analog is a nucleoside diphosphate kinase.
  • the compositions according to the invention can comprise, not directly the enzyme, but a nucleic acid coding for the enzyme.
  • the subject of the invention is also a composition which can be used for the delivery and the in vivo production of a combination of enzymes, comprising:
  • a third nucleic acid encoding an enzyme capable of phosphorylating said diphosphate analog, to generate a toxic triphosphate analog.
  • the first nucleic acid codes for a thymidine kinase
  • the second nucleic acid codes for a guanylate kinase
  • the third nucleic acid codes for a nucleoside diphosphate kinase.
  • the nucleoside analog is generally a guanosine analog, such as, for example, ganciclovir, acyclovir or penciclovir.
  • Other nucleoside analogs are, for example, compounds of the trifluorothymidine, 1- [2- deoxy, 2-fluoro, beta-D-arabino furanosyl] -5-iodouracil, ara-A, 1-beta-D- arabinofuranosyl thymidine type. (araT), 5-ethyl-2'deoxyuridine, iodouridine, AZT, AIU, dideoxycytidine, AraC and bromovinyldesoxyuridine (BVDU).
  • the preferred analogs are ganciclovir, acyclovir, penciclovir and BVDU, preferably ganciclovir and acyclovir.
  • the triphosphated form is toxic in the sense that it causes, directly or indirectly, cell death.
  • thymidine kinase HSV1-TK for example
  • ganciclovir nucleoside analogue
  • cellular kinases allow the metabolism of this ganciclovir monophosphate successively into diphosphate then triphosphate.
  • the ganciclovir triphosphate thus generated, then produces toxic effects by incorporating into the DNA and partially inhibits the cellular DNA polymerase alpha which causes the arrest of DNA synthesis and therefore leads to the death of the cell. .
  • the present invention now shows that it is possible to improve the effectiveness of treatment by administering, in combination with a thymidine kinase, other enzymes involved in the phosphorylation of nucleoside analogs.
  • the present invention thus relates to different combinations of enzymes making it possible to optimize the intracellular reaction of triphosphorylation of nucleoside analogs.
  • Another aspect of the present invention relates to vectors for the introduction and intracellular expression of these combinations of enzymes. It may in particular be several vectors each allowing the production of an enzyme, or one or more vectors each allowing the production of several enzymes or all enzymes.
  • the present invention also relates to a process for triphosphorylation of nucleoside analogs in the presence of a combination of enzymes, possibly produced in situ by expression of corresponding genes, as well as a process for the destruction of proliferative cells.
  • nucleoside monophosphates into nucleoside diphosphates and then triphosphates has been documented in vitro. These phosphorylations are carried out in the presence of i) human erythrocyte lysate in the case of ganciclovir (Cheng et al. 1983 J. Biol. Chem. 258 pl2460) or ii) enzymatic preparations of guanylate kinase and nucleoside diphosphate kinase human erythrocytes, in the case of ganciclovir and acyclovir (Miller et al. 1980 J. Biol. Chem. 255 p720; Smée et al. 1985 Biochem. Pharmac.
  • compositions making it possible to improve the therapeutic efficacy of a thymidine kinase in vivo.
  • the first enzyme used in the compositions and methods according to the invention capable of phosphorylating a nucleoside analog to generate a monophosphate analog, is advantageously a non-thymidine kinase mammal. It is preferably a thymidine kinase of viral origin, and in particular herpetic.
  • herpetic thymidine kinases that may be mentioned in particular are herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV1-TK), herpes simplex virus type 2 thymidine kinase (HSV2-TK), thymidine kinase chickenpox virus (VZV-TK), thymidine kinase from Eppstein Barr virus (EBV-TK), or thymidine kinase from herpes viruses of bovine origin (Mittal et al., J. Virol 70 (1989 ) 2901), equine Robertson et al., NAR 16 (1988) 11303), feline (Nunberg et al., J. Virol. 63 (1989) 3240) or simian (Otsuka et al., Virology 135 (1984) 316) .
  • HSV1-TK herpes simplex virus type 1 thymidine kinase
  • the sequence of the gene coding for the thymidine kinase enzyme of the herpes simplex virus type 1 has been described in the literature (see in particular McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5931). There are natural variants leading to proteins with comparable enzymatic activity on thymidine, or ganciclovir (M. Michael et al. 1995 Biochem. Biophys. Res. Commun 209 p966). The sequence of the gene coding for the herpes simplex virus type 2 thymidine kinase enzyme has also been described (Swain et al., J. Virol. 46 (1983) 1045).
  • the thymidine kinase used in the present invention can be a native thymidine kinase (the natural form of the enzyme or one of its natural variants), or a derivative form, that is to say resulting from structural modification (s) of the native form.
  • various mutants or derivatives have been described in the literature. Although their intrinsic properties do not seem to be significantly modified, these molecules can be used in the context of the present invention. They are for example mutants having a modification close to the DRH region of the interaction site of a nucleoside (W 095/30007).
  • the HRD region corresponds to the aspartic residues, arginine and histidine at positions 163, 164 and 165 of the TK.
  • TK derivatives can be prepared according to conventional techniques of molecular biology, and used in the combinations of the invention. These mutants can be prepared, for example, by mutagenesis on a nucleic acid coding for a native thymidine kinase, preferably herpetic, or one of its variants.
  • a TK originating from the thymidine kinase of the herpes simplex virus type 1 (HSV1-TK) or a corresponding coding nucleic acid is used. It is more particularly HSV1-TK or one of its variants, such as natural variants or artificial variants. Among the artificial variants, there may be mentioned more particularly the variants P155A / F161V and F161I (Biochemistry 32 (1993) p.11618), the A168S variant (Prot. Engine. 7 (1994) p.83) or the variants having a modification at the ATP binding site such as the M60I variant. Even more preferably, a nucleic acid coding for the thymidine kinase of the herpes simplex virus type 1 (HSV1-TK) is used.
  • the second enzyme used in the compositions and methods according to the invention capable of phosphorylating a nucleoside analog monophosphate to generate a diphosphate analog, is advantageously a guanylate kinase.
  • Guanylate kinase (GMPK) has been purified from different organisms (man, rat, beef, yeast). The gene coding for GMPK has also been cloned into various cell types, and in particular into the yeast Saccharomyces cerevisae. GUK1 gene (M. Konrad 1992 J. Biol. Chem. 267 p25652). From this gene, the 20 kDa GMPK enzyme was also purified.
  • the GMPK gene designated gmk, has also been isolated and overexpressed in Escherichia coli (D. Gentry et al. 1993 J. Biol. Chem. 268 pi 4316). This enzyme is different from the enzyme of S. cerevisae in terms of cooperativity and oligomerization, while the sequences have strong regions of identity 46.2% on 182 residues.
  • the sequence Al 1042 identified as coding for a factor having hematopoietic cell growth potential activity (EP0274560), has 51.9% identity over 180 residues with the GUK1 gene of S. cerevisae. and appears to be the human counterpart to GMPK, although no biochemical data have been published.
  • the third enzyme used in the compositions and methods according to the invention capable of phosphorylating a nucleoside diphosphate analog to generate a triphosphate analog, is advantageously a nucleoside diphosphate kinase.
  • Nucleoside diphosphate kinase (NDPK) is a broad substrate specific enzyme and has been purified from a wide variety of sources (M. Inouye et al. 1991 Gene 105 p31). For various organisms (Myxococcus xanthus, Drosophila melanogaster, Dictyostelium discoideum, rat, beef, man, E. coli and S.
  • NDPK neuropeptide coding for NDPK
  • the human genes described coding for an NDPK activity are in particular nm23-Hl and nm23-H2. It is suggested that the nm23-H2 gene codes for a bifunctional protein with two independent functions which are NDPK activity and transcription factor (E. Postel et al. 1994 J. Biol. Chem. 269 p8627).
  • the YNK gene of S-cerevisae is not an essential gene for yeast and codes for NDPK which is probably a tetrameric protein whose molecular weight of the monomers is 19 kDa (A. Jong et al. 1991 Arch. Biochem. Biophys. 291 p241).
  • nucleic sequences coding for GMPK or NDPK used in the context of the invention can be of human, animal, viral, synthetic or semi-synthetic origin.
  • nucleic acid sequences of the invention can be prepared according to any technique known to those skilled in the art. As an illustration of these techniques, we can notably mention:
  • the nucleic acid sequences used in the context of the invention are cDNA or gDNA sequences.
  • the cDNA sequences are sequences lacking introns, obtained from RNA.
  • GDNA sequences are regions of chromosome. In eukaryotes, they include one or more introns.
  • the gDNA sequences used in the context of the invention may comprise all or part of the introns present in the natural gene, or one or more introns artificially introduced into a cDNA to increase, for example, the efficiency of expression in mammalian cells.
  • the nucleic acids can code for native enzymes or for variants or derivatives having the same type of activity. These analog nucleic acids can be obtained by conventional techniques of molecular biology, well known to those skilled in the art.
  • a particular composition within the meaning of the invention comprises a first nucleic acid coding for a thymidine kinase and a second nucleic acid coding for a nucleoside diphosphate kinase.
  • the nucleoside diphosphate kinase is preferably of non-human eukaryotic origin.
  • non-human enzyme is meant an enzyme not naturally present in human cells. It can be a viral, animal enzyme, or from a lower eukaryotic organism (such as a yeast). It can also be an unnatural derivative of a human enzyme, having one or more structural modifications. More preferably, it the NDPK used in the present invention is chosen from the yeast or beef NDPK.
  • These compositions can also comprise a nucleic acid coding for a guanylate kinase, such as for example a yeast guanylate kinase.
  • compositions within the meaning of the invention comprises a first nucleic acid coding for a thymidine kinase and a second nucleic acid coding for a non-human guanylate kinase.
  • the non-human GMPK can be chosen from rat, beouf, yeast, bacteria GMPKs or derivatives thereof.
  • GMPK comes from a lower eukaryote, in particular from yeast.
  • the nucleoside diphosphate kinase used in the context of the present invention is of eukaryotic or animal origin. Even more preferably, it is a yeast or beef nucleoside diphosphate kinase.
  • the yeast nucleoside diphosphate kinase and in particular that of Saccharomyces cerevisae or that of beef, makes it possible to phosphorylate analogs of nucleoside diphosphates, such as ganciclovir diphosphate or acyclovir diphosphate , into nucleoside triphosphates.
  • the results present in the examples clearly show that these enzymes have on these substrates an activity much superior to the human enzyme.
  • the percentage of GCV triphosphate obtained is 1.5%, while in the presence of 0.75 ⁇ g of yeast enzyme, it is 82.9%.
  • the percentage of GCV triphosphate obtained is 24%, while in the presence of 1.5 ⁇ g of yeast enzyme, it is 91.1% and in the presence of 5 ⁇ g of beef enzyme, it is 92%.
  • the same results are obtained with another nucleoside analog, acyclovir.
  • the percentage of ACV triphosphate obtained is less than 0.4%, while in the presence of 1.5 ⁇ g of yeast enzyme, it is 8%, in presence of 15 ⁇ g of yeast enzyme, it is 81% and in the presence of 5 ⁇ g of beef enzyme, it is 1.3%.
  • the yeast guanylate kinase and in particular of Saccharomyces cerevisae. also made it possible to phosphorylate analogs of nucleoside monophosphates, such as ganciclovir monophosphate or acyclovir monophosphate, into nucleoside diphosphates with good activity.
  • nucleoside monophosphates such as ganciclovir monophosphate or acyclovir monophosphate
  • the percentage of GCV diphosphate obtained can exceed 92% and in the presence of 74 ⁇ g of yeast enzyme, the percentage of ACV diphosphate obtained is 54%.
  • the present results show that the yeast guanylate kinase has a GCVMP phosphorylation rate 2 times greater than the human enzyme.
  • Vmax / Km of the yeast enzyme for the GCVMP is 4.4 times greater than the value of the enzyme human.
  • Vmax / Km of the yeast enzyme is 7 to 9 times greater than the value that the human enzyme has for this substrate.
  • thymidine kinase for example the herpes virus type I thymidine kinase made it possible to phosphorylate nucleoside analogs such as ganciclovir or acyclovir in triphosphate derivatives, with very high efficiency.
  • compositions of the invention comprise sequences coding for yeast guanylate kinase (EC-2.7.4.8) and / or the nucleoside diphosphate kinase (EC-2.7.4.6). More preferably, these are the enzymes of the yeast S. cerevisae. These sequences are used simultaneously with a sequence (HSV1-TK) coding for the thymidine kinase of the herpes simplex virus type 1 (EC-2.7.1.21) to allow triphosphorylating the nucleoside analogs such as ganciclovir or the acyclovir.
  • compositions according to the invention may comprise a combination of enzymes or nucleic acids allowing the production in vivo of the enzymes. They are advantageously nucleic acids. This mode of implementation is preferred since it allows in vivo production of higher levels of enzymes and thus a greater therapeutic effect.
  • the nucleic acids are carried by the same expression vector.
  • This embodiment is particularly advantageous since it suffices to introduce a single vector into a mammalian cell to obtain the desired therapeutic effect.
  • the different nucleic acids can constitute three distinct expression cassettes within the same expression vector.
  • the different nucleic acids can each be placed under the control of a transcriptional promoter, a transcriptional terminator and distinct translation signals. It is also possible to insert several nucleic acids in the form of a polycistron, the expression of which is directed by a single promoter and a single transcriptional terminator.
  • the expression vectors of the invention may comprise a bicistronic unit directing the expression of two nucleic acids, and optionally a separate nucleic acid coding for the third enzyme.
  • the vectors of the invention can also comprise a tricistronic unit directing the expression of the three nucleic acids.
  • Preferred expression vectors within the meaning of the invention are in particular:
  • a second nucleic acid encoding a non-human guanylate kinase. It is preferably a yeast guanylate kinase.
  • a second nucleic acid encoding a nucleoside diphosphate kinase. It is preferably a nucleoside diphosphate kinase non-human eukaryote. More preferably, it is a NDPK of bovine or yeast origin.
  • this vector also comprises a nucleic acid coding for a guanylate kinase.
  • the thymidine kinase used in the vectors of the invention is advantageously a thymidine kinase of viral origin, in particular herpes. It is preferably a thymidine kinase originating from the TK of the HSV-1 or HSV-2 virus.
  • the different nucleic acids can be placed under the control of distinct promoters, or constitute a polycistronic unit under the control of a single promoter.
  • the enzymes can also be produced in coupled form, the different nucleic acids being coupled to produce a protein carrying the different enzymatic activities.
  • a particular embodiment of the vectors according to the invention is characterized in that the nucleic acid coding for thymidine kinase of viral origin and the nucleic acid coding for non-human guanylate kinase are coupled and code for a protein carrying both TK and GUK activities.
  • the nucleic acid coding for the thymidine kinase of viral origin and the nucleic acid coding for the nucleoside diphosphate kinase are coupled and code for a protein carrying both the activities TK and NDPK.
  • the coupling between the enzymes is carried out by means of a peptide linker, for example of structure (G 4 S),
  • the nucleic acids are carried by several expression vectors.
  • the expression vectors can be of plasmid or viral origin. As they are vectors of viral origin, they are advantageously retroviruses or adenoviruses.
  • promoters can be used in the context of the invention. These are sequences allowing the expression of a nucleic acid in a mammalian cell.
  • the promoter is advantageously chosen from functional promoters in human cells. More preferably, it is a promoter allowing the expression of a nucleic acid sequence in a hyperproliferative cell (cancerous, restenosis, etc.).
  • different promoters can be used. It may for example be the own promoter of the gene considered (TK, GMPK, NDPK). They can also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • It can thus be any promoter or derived sequence stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not, inducible or not, strong or weak. Mention may in particular be made of the promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences originating from the genome of the target cell.
  • ubiquitous promoters can be used in particular (promoter of the HPRT, PGK genes, a-actin, tubulin, DHFR, etc.), promoters of intermediate filaments (promoter of the GFAP genes, desmin, vimentin, neurofilaments, keratin, etc), promoters of therapeutic genes (for example the promoter of the MDR, CFTR genes, Factor VIII, ApoAI, etc.), tissue-specific promoters (promoter of the pyruvate kinase gene, villin, intestinal fatty acid binding protein, alpha -actin from smooth muscle, etc.), promoters of specific cells of the dividing cell type such as cancer cells or of promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, glucocorticoid receptor, etc.) or so-called inducible.
  • promoters of specific cells of the dividing cell type such as cancer cells or of promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, reti
  • promoter sequences originating from the genome of a virus such as for example the promoters of the El A and MLP genes of adenovirus, the early promoter of CMV, or also the promoter of the RSV LTR, etc.
  • these promoter regions can be modified by adding activation or regulatory sequences, or allowing tissue-specific or majority expression.
  • Another object of the invention relates to a product comprising a combination of enzymes capable of tri phosphorylating a guanosine analog, and said guanosine analog, for simultaneous, separate or spread over time administration.
  • the invention also relates to a composition for the in vivo production of a toxic nucleoside triphosphate analog comprising, packaged separately or together:
  • nucleic acid coding for a guanylate kinase and, - a nucleic acid coding for a nucleoside diphosphate kinase.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising a combination of enzymes involved in the phosphorylation of nucleosides, possibly generated in situ by expression of nucleic sequences, at least one of these enzymes being of non-human eukaryotic origin.
  • the enzyme combination includes in particular a TK and an NDPK; a TK and a GMPK or a TK, a GMPK and an NDPK.
  • the present invention also relates to a method for the destruction of proliferative cells comprising the administration to said cells of a combination of enzymes comprising a TK and an NDPK.
  • the combination further comprises a guanylate kinase.
  • the invention also relates to a method for the destruction of proliferative cells comprising administering to said cells a combination of enzymes comprising a TK and a GMPK.
  • the cells are contacted with a nucleoside analog, preferably a guanosine analog, which is converted in cells expressing the combination of enzymes into a toxic compound.
  • a nucleoside analog preferably a guanosine analog
  • the enzymes can be administered to the cells by administration of nucleic acids coding for said enzymes.
  • the invention also resides in the use of the nucleoside diphosphate kinase or of a nucleic acid coding for it, in combination with a thymidine kinase or a nucleic acid coding for a thymidine kinase, for the preparation of a pharmaceutical composition. intended for the destruction of proliferative cells.
  • the invention also relates to a method of triphosphorylation of a nucleoside analog comprising bringing said analog into contact with a combination of enzymes, at least one of which being of non-human eukaryotic origin.
  • the present invention now provides new therapeutic agents for interfering with many cellular dysfunctions.
  • the nucleic acids or cassettes according to the invention can be injected as such at the site to be treated, or incubated directly with the cells to be destroyed or treated. It has in fact been described that naked nucleic acids can penetrate cells without any particular vector. Nevertheless, it is preferred in the context of the present invention to use an administration vector, making it possible to improve (i) the efficiency of cell penetration, (ii) targeting (iii) extra- and intracellular stability.
  • the nucleic sequences are incorporated into a transfer vector.
  • the vector used can be of chemical, plasmid or viral origin.
  • chemical vector is meant within the meaning of the invention, any non-viral agent capable of promoting the transfer and expression of nucleic sequences in eukaryotic cells.
  • These chemical or biochemical vectors, synthetic or natural, represent an interesting alternative to natural viruses in particular for reasons of convenience, safety and also by the absence of theoretical limit as regards the size of the DNA to be transfected.
  • These synthetic vectors have two main functions, to compact the nucleic acid to be transfected and to promote its cellular fixation as well as its passage through the plasma membrane and, where appropriate, the two nuclear membranes.
  • the non-viral vectors all have polycationic charges.
  • viruses as vectors for gene transfer has emerged as a promising alternative to these physical transfection techniques.
  • different viruses have been tested for their ability to infect certain cell populations.
  • retroviruses RSV, HMS, MMS, etc.
  • the HSV virus adeno-associated viruses
  • adenoviruses adenoviruses
  • the nucleic acid or vector used in the present invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the nucleic acid sequence or the vector is used in an injectable form. It can therefore be mixed with any pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection at the site to be treated. They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • nucleic acid sequences used can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the vector, the mode of administration used, the pathology concerned or even the duration of the treatment sought.
  • the invention also relates to any pharmaceutical composition comprising a combination of enzymes as defined above. It also relates to any pharmaceutical composition comprising at least one vector as defined above.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are very particularly suitable for the treatment of hyperproliferative disorders, such as in particular cancers and restenosis.
  • the present invention thus provides a particularly effective method for the destruction of cells, in particular hyperproliferative cells. It is thus applicable to the destruction of tumor cells or smooth muscle cells of the vascular wall (restenosis). It is particularly suitable for the treatment of cancers.
  • colon adenocarcinomas thyroid cancer, lung carcinoma, myeloid leukemia, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, gastric cancer, cancer esophagus, B lymphomas, ovarian cancer, bladder cancer, glioblastoma, hepatocarcinoma, bone, skin, pancreatic cancer or kidney and prostate cancer, cancer esophagus, laryngeal cancers, head and neck cancers, HPV positive anogenital cancers, EBV positive nasopharyngeal cancers, etc.
  • the subject of the invention is also a method of destroying hyperproliferative cells comprising bringing said cells or a part of them into contact with a combination of enzymes or nucleic sequences as defined above. before, in the presence of a nucleoside analog.
  • Figure 1 Schematic representation of the pcDNA3-TK vector
  • Figure 2 Schematic representation of the vector pXL2854
  • Figure 3 Schematic representation of the vector pXL2967
  • Figure 4 Schematic representation of the vector pXL3081
  • Figure 6 Schematic representation of the vector pXL3098
  • ACV acyclovir
  • GCV ganciclovir
  • GMPK guanylate kinase
  • HSV1-TK herpes simplex virus type 1 thymidine kinase.
  • NDPK nucleoside diphosphate kinase
  • the pUC type plasmids and phages of the M13 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories), the plasmids pBSK or pBKS come from Stratagen.
  • the enzymatic amplification of DNA fragments by the so-called PCR technique [Polymerase-catalyzed £ hain Reaction] can be carried out using a "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer's recommendations.
  • the electroporation of plasmid DNA in E. llH cells can be carried out using an electroporator (Bio-Rad) according to the supplier's recommendations.
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5477] using the kit distributed by Amersham or the one distributed by Applied Biosystems.
  • This example describes various methods for the construction of expression and transfer vectors of the nucleic sequences of the invention in vitro or in vivo.
  • plasmid vectors For the construction of plasmid vectors, different types of expression vectors can be used. 2 types of vectors are more particularly preferred: - The vector pSV2, described in DNA Cloning, A practical approach Vol.2, DM Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. This vector is a eukaryotic expression vector. The nucleic acids encoding the combinations of enzymes of the invention can be inserted into this vector at the Hpal-EcoRV sites. They are thus placed under the control of the promoter to enhance the SV40 virus.
  • the vector pCDNA3 (Invitrogen). It is also a eukaryotic expression vector.
  • the nucleic sequences coding for the enzymes or the combinations of enzymes of the invention are placed, in this vector, under the control of the CMV early promoter.
  • the invention resides in the construction and the use of viral vectors allowing the transfer and the expression in vivo of nucleic acids as defined above.
  • adenoviruses various serotypes, the structure and properties of which vary somewhat, have been characterized.
  • serotypes it is preferred to use, within the framework of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO94 / 26914).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise ITRs, a sequence allowing the encapsidation and a nucleic acid according to the invention.
  • the El region at least is non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to a person skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, by means of genetic engineering techniques, or by treatment with mutagenic agents.
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the regions E1 and E4.
  • it comprises a deletion in region E1 at the level of which the region E4 and the nucleic sequence of the invention are inserted (Cf FR94 13355).
  • the deletion in the E1 region preferably extends from nucleotides 455 to 3329 on the sequence of the adenovirus Ad5.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia a nucleic sequence or a combination of nucleic sequences of the invention. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risk of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the E1 and E4 functions as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697 or in Yeh et al., J. Virol. 70 (19%) 559.
  • the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by co-transfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing a nucleic sequence or a combination of nucleic sequences of the invention bordered by two inverted repeat regions (ITR) of AAV, and of a plasmid carrying the encapsulation genes (rep and cap genes) of AAV.
  • a usable cell line is, for example, line 293.
  • Other production systems are described, for example, in applications WO95 / 14771; WO95 / 13365; WO95 / 13392 or WO95 / 06743.
  • the recombinant AAVs produced are then purified by conventional techniques.
  • retroviruses are integrative viruses, selectively infecting dividing cells. They therefore constitute vectors of interest for cancer applications.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
  • the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine Moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine Moloney sarcoma virus”), HaSV ("Harvey sarcoma virus”) ; SNV (“spleen necrosis virus”); RSV (“Rous sarcoma virus”) or the Friend virus.
  • a plasmid comprising in particular the LTRs
  • the packaging sequence and said nucleic sequence is constructed, then used to transfect a line so-called packaging cell, capable of providing trans retroviral functions deficient in the plasmid.
  • the packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • Such packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861,719); the PsiCRIP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150).
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences, comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
  • the recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • a defective recombinant adenovirus or retrovirus indeed have properties which are particularly advantageous for the transfer of suicide genes into tumor cells.
  • nucleic acids or the plasmid expression vectors described in this example (1.1) and in example 2 can be administered as such in vivo or ex vivo. It has indeed been shown that naked nucleic acids can transfect cells. However, to improve the transfer efficiency, it is preferred to use, within the framework of the invention, a transfer vector. It can be a viral vector (example 1.2.) Or a synthetic transfection agent.
  • cationic polymers of polylysine type (LKLK) n, (LKKL) n, (PCT / FR / 00098) polyethylene imine (WO96 / 02655) and DEAE dextran or cationic or lipofectant lipids. They have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane. Among these, mention may be made of lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc.), different cationic or neutral lipids (DOTMA, DOGS, DOPE, etc.) as well as peptides of nuclear origin.
  • lipopolyamines lipofectamine, transfectam, etc.
  • DOTMA cationic or neutral lipids
  • DOGS DOGS
  • DOPE DOPE
  • the concept of targeted transfection has been developed, mediated by a receptor, which takes advantage of the principle of condensing DNA thanks to the cationic polymer while directing the binding of the complex to the membrane thanks to a chemical coupling between the cationic polymer and the ligand of a membrane receptor, present on the surface of the cell type that is to be grafted.
  • the targeting of the transferrin, insulin or hepatocyte asialoglycoprotein receptor has thus been described.
  • the preparation of a composition according to the invention using such a chemical vector is carried out according to any technique known to those skilled in the art, generally by simple contacting of the various components.
  • This example describes a particular embodiment of the invention, using a plasmid expression vector system to produce in situ the combinations of enzymes of the invention.
  • the vectors of the invention described below comprise the following signals i) a promoter / enhancer such as the CMV promoter which is well expressed in human cells; ii) a Kozak sequence, the consensus of which is (G / A) NNAUG (G / A); iii) the gene to be expressed; followed iv) by a polyadenylation sequence (V. Chisholm 1995 DNA cloning Vol.4, ed. D. Glover and B. Hames pi).
  • a promoter / enhancer such as the CMV promoter which is well expressed in human cells
  • ii) a Kozak sequence, the consensus of which is (G / A) NNAUG (G / A);
  • iii) the gene to be expressed followed iv) by a polyadenylation sequence (V. Chisholm 1995 DNA cloning Vol.4, ed. D. Glover and B. Hames pi).
  • Such constructions are possible using commercial vectors such as
  • the HSV1-TK gene coding for thymidine kinase of the herpes simplex virus type 1, derived from the plasmid pHSV-106 (Gibco-BRL) was cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3 (Invitrogen).
  • This 6936 bp pcDNA3-TK plasmid was constructed by introducing the 1.5 kb EcoRI-NotI insert originating from pBTKl between the EcoRI and NotI sites of pcDNA3, see figure.
  • the plasmid pBTKl was obtained in the following manner: After making the ends blunt, the insert BglII-NcoI of 1.5 kb originating from pHSV-106 and containing the gene HSVl-TK, the sequence of which is published by McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5931, was cloned at the Smal site of pBSK.
  • the insert of the plasmid pcDNA3-TK contains i) 60 bp upstream of the HSVl-TK gene comprising the Kozak sequence (CGTATGG), ii) the gene sequence (1.13 kb) which is identical to that published by McKnight 1980 Nucl . Acids Res. 8 p5931, iii) the 3 'sequence to the gene (0.3 kb) which is also described by McKnight.
  • This plasmid pXL2854 was obtained in the following manner.
  • the Xbal-BamHI insert of pGUK-1 containing the GUK1 gene was cloned into the plasmid pSL301 (Invitrogen) between the Xbal-BamHI sites so that the GUKl gene can then be excised by the enzymes HindIII and BamHI and be donated between the HindIII and BamHI sites of pcDNA3 to generate a plasmid pcDNA3-GUK1. Between the HindIII and PflMI sites of this plasmid is cloned a HindHI-PflMI fragment of 150 bp containing a Kozak consensus and the 5 'region of GUK1 to form the plasmid pXL2854 of 6001 bp see FIG.
  • the HindHI-PflMI fragment of 150 bp was isolated from a 280 bp fragment amplified by PCR using the plasmid pGUK-1 and sense oligonucleotides 6915 5 '(GAG AAG CTT GCC ATG GCC CGT CCT ATC GTA A) 3' (SEQ ID n . 1) and antisense 6916 5 '(GAG GAT CCG TTT GAC GGA AGC GAC AGT A) 3' (SEQ ID n.2), hybridization taking place at 45 ° C (the Kozak consensus being emphasized on the oligonucleotide 6915 ).
  • the nucleic sequence amplified by PCR has been sequenced and has two differences compared to the published sequence (M. Konrad 1992 J. Biol. Chem. 267 p25652) corresponding to the changes S2A (Serine in position 2 replaced by an alanine) and V34A ( Valine in position 34 replaced by an alanine).
  • This plasmid pXL2967 was obtained in the following manner. PCR amplification was carried out with the plasmid pAD1-YNK for template and sense oligonucleotides 7017 5 '(AAG GAT CCA CCA TGG CTA GTC AAA CAG AAA) 3' (SEQ ID n.
  • the amplified fragment of 477 bp is digested with BamHI and EingerRI then cloned between the BamHI and EcoRI sites of pcDNA3 to generate the plasmid pXL2967 of 5861 bp, see FIG. 3.
  • the sequence of the fragment amplified by PCR is the same as that published for the YNK gene except at position 4 which corresponds to a change S2A S2A (Serine in position 2 replaced by an alanine) for the protein NDPK (K. Watanabe et al. 1993 Gene 29 pl41).
  • Gene coexpression can be achieved in several ways known to those skilled in the art.
  • a preferred embodiment consists in introducing, between the sequences to be expressed, internal ribosome entry sites, IRES sequences (Mountford et al., TIG 11 (1995) 179).
  • IRES sequences Mountford et al., TIG 11 (1995) 179.
  • An IRES sequence and the YNK gene are introduced 3 ′ of the GUK1 gene cloned into pcDNA3 to generate a vector allowing the co-expression of GUK1 and YNK, in the form of a bicistronic unit (vector pGUKl-YNK).
  • TIRES internai ribosome entry site
  • EMCV encephalomyocartis virus
  • plasmid pCITE Novagen
  • the 477 bp NcoI-EcoRV fragment containing the YNK gene derived from the plasmid pXL2967 is cloned between the NcoI and EcoRV sites of pXL3065 to form the plasmid pXL3079.
  • the 1 kb BamHI-EcoRV fragment containing the IRES and the YNK gene of the plasmid pXL3079 is then cloned between the BamHI and EcoRV sites of the plasmid pXL2854 to generate the plasmid pXL3081.
  • This plasmid contains the CMV and T7 promoters upstream of the GUK1 gene coding for guanylate kinase of S. cerevisae itself followed by TIRES and the YNK gene coding for the nucleoside diphosphokinase of S. cerevisae see FIG. 4.
  • the expression of the proteins GMPK and NDPK was tested using the plasmids pXL2854, pXL2967 and pXL3081 a transcription / translation system for reticulocytes originating from Promega, see FIG. 5. The results obtained show that the GMPK and NDPK proteins are coexpressed with the plasmid pXL3081.
  • TK and YNK vector coexpressing TK and YNK
  • TK and GUKl vector coexpressing TK and GUKl
  • the sequence coding for TK is inserted into the vector pGUKl-YNK of example 2.4 above to generate a vector capable of expressing the 3 enzymatic activities (vector pTK-GUKl-YNK).
  • fusion protein is well known to those skilled in the art and is accomplished by the creation of a peptide linker between the C-terminal part of one protein and the N-terminal part of the other protein (1989 Nature 339 p394).
  • a peptide linker between the C-terminal part of one protein and the N-terminal part of the other protein (1989 Nature 339 p394).
  • Such a protein allows the cellular co-localization of enzymes and can also favor the "tunneling" of substrate (Ljungcrantz et al. 1989 Biochemistry 28 p8786).
  • a fusion protein was produced by linking using the linker - (Gly) 4-Ser-
  • the 3 'sequence of the HSVl-TK gene was cloned by hybridization of the 5 'sense oligonucleotides (CCG GGA GAT GGG GGA GGC TAA CGG AGG TGG CGG TTC TGG TGG CGG AGG CTC CG) 3' (SEQ ID n ° 5) and antisense 5 '(GAT CCG GAG CCT CCG CCA CCA GAA CCG CCA CCT CCG TTA GCC TCC CCC ATC TC) 3 '(SEQ ID No.
  • the 0.58 kb BspEI-Xbal fragment of pGUKL- is inserted between the BspEI and Xbal sites of pTKL + to create pTKLGUK.
  • the 0.63 kb Xmal-BamHI insert of pTKLGUK is then cloned between the Xmal and BamHI sites of the expression vector pET11a, to form the plasmid pXL3098, see FIG. 6.
  • This plasmid is then introduced into the strain BL21DE3met- and leads to the production of the protein TK- ((Gly) 4Ser) 3-GMPK.
  • the fusion protein is then purified to homogeneity and the kinetic parameters of GCV and TACV phosphorylation of this enzyme are compared to the kinetic parameters obtained with the HSV1-TK and GMPK proteins of S. cerevisiae. 2.7 - Transfer and expression in vivo
  • compositions comprising said vectors are prepared:
  • composition comprising the vector pcDNA3-TK, the vector pXL2854 and the
  • composition comprising the vector pcDNA3-TK, the vector pXL2967 and the Lipofectamine,
  • composition comprising the vector pcDNA3-TK, the vector pXL2854, the vector pXL2967 and Lipofectamine
  • composition comprising the vector pTK-GUKl and the Lipofectamine, optionally in combination with the vector pXL2967,
  • composition comprising the vector pTK-YNK and the Lipofectamine, optionally in combination with the vector pXL2854, and,
  • composition comprising the vector pTK-GUKl-YNK and Lipofectamine
  • Lipofectamine can be replaced by another chemical vector as described in Example 1.3.
  • compositions are used in vivo or ex vivo for the intracellular transfer and expression of combinations of enzymes according to the invention. They can also be used on cell cultures, and for example on cultures of NIH3T3 fibroblast cells or cells of human colon carcinoma, HCT116. After transfer of the vectors, the nucleoside analog is administered and cell destruction is demonstrated.
  • the acellular extracts of the E. coli strains overexpressing the GMPK of S. cerevisae can be prepared in various ways, among which there may be mentioned, lysozyme lysis in the presence of EDTA, the use of Menton type grinding devices -Golin, French Press, X-Press, or the action of ultrasound. More particularly, the acellular extracts of the L ⁇ coli strains overexpressing the GMPK of S. cerevisae were prepared in the following manner:
  • the E. coli BL21 (DE3) pGUK-1 strain is cultivated as described by M. Konrad in J. Biol. Chem. 267 p25652 in 1992. After centrifugation (5000 xg; 20 min), the cells obtained from 1 l of culture are resuspended in 20 ml of Tris / HCl buffer 20 mM pH 7.5, containing ImM EDTA and sonicated for 4 min at 4 ° C. . After centrifugation (50,000 x g; 1 h), the supernatant is injected onto a MONO Q HR 10/10 column (Pharmacia) equilibrated in 20 mM Tris / HCl buffer pH 7.5.
  • the proteins are eluted with a linear gradient from 0 to 500 mM NaCl in the 20 mM Tris / HCl buffer pH 7.5.
  • the fractions containing the GMPK activity are combined and concentrated, then chromatographed on a column of Superdex 75 HR16 / 10 (Pharmacia) eluted with Tris / HCl buffer 50 mM pH 7.5, 150 mM NaCl.
  • the fractions containing the GuK activity are grouped together. After this stage, the preparation has a single visible band on SDS-PAGE, after revelation with Coomassie Blue, and this band migrates with an apparent molecular weight of approximately 21,000.
  • the kinetic constants of the yeast GMP kinase purified as described in Example 3 are determined under the following enzymatic assay conditions:
  • the yeast GMP kinase is incubated for 10 min at 30 ° C in 100 ⁇ l of 50 mM Tris / HCl buffer pH 7.8 containing 4 mM ATP, 10 mM Mg C12, 100 mM KC1, 1 mg / ml BSA (bovine albumin serum) and 5-100 ⁇ M [8-3H] GCVMP (40 nCi / nmol) or 200-3200 ⁇ M [8-3HJACVMP (40 nCi / nmol).
  • the reaction is stopped by heating the reaction mixture for 3 min at 80 ° C, 50 ⁇ l of 10 mM potassium phosphate buffer pH 3.5 are added, and after centrifugation for 2 min at 10,000 xg, 100 ⁇ l of supernatant are analyzed by high pressure liquid chromatography (HPLC) in the following system:
  • Buffer A KH2PO40.01 M pH3.5 (adjusted using concentrated H3PO4)
  • Buffer B KH2PO40.75 M ⁇ H3.5 (adjusted using concentrated H3PO4)
  • the quantity of yeast GMP kinase introduced into the enzymatic reaction is adjusted so as to transform at most 10% of the substrate introduced at the start.
  • the Michaelis curves are adjusted to the experimental points using the Grafit software (Sigma).
  • the results are presented in Table 1. They show that the yeast GMP kinase is capable of phosphorylating GCVMP and TACVMP. In addition, it has a GCVMP phosphorylation rate 2 times greater than the human enzyme. Likewise, its affinity for GCVMP is greater by a factor at least equal to 2 than the affinity that the human enzyme has for this substrate. In total, the value of Vmax / Km of yeast Tenzyme for GCVMP is 4.4 times greater than the value of human Tenzyme.
  • Vmax / Km determines the specificity of Tenzyme with respect to these substrates. She is known as "constant specificity" [A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 1985, WH Fréeman an Co., London].
  • yeast GMP kinase has a capacity to phosphorylate TACVMP much superior to the human enzyme.
  • the value of the Vmax / Km of yeast Tenzyme for TACVMP is 7 to 9 times higher than the value that the human Tenzyme has for this substrate.
  • the incubation is carried out in 100 ⁇ l of Tris / HCl buffer 50 mM pH 7.8, containing 1 mg / ml of BSA (bovine serum albumin), 5 mM ATP, 4 mM MgCl 2, 12 mM KCl, 2 mM DTT, 600 ⁇ M EDTA , lOO ⁇ M [8-3H] -GCV (40nCi / nmol) or lOO ⁇ M [2-3H] -ACV 40nCi / nmol and different amounts of TK, GuK and NDPK (Cf Table 2).
  • the NDPKs of 3 organisms were used (enzymes marketed by SIGMA), as indicated in Table 2.
  • the coupling of the HSVl-TK and GMPK enzymes of S. cerevisae allows 90% phosphorylation of ganciclovir to ganciclovir diphosphate.
  • the nucleoside diphosphokinase from baker's yeast i.e. from S. cerevisae. coupled with the enzymes HSVl-TK and GMPK, allows phosphorylation to ganciclovir triphosphate with better activity than does the human nucleoside diphosphokinase of erythrocytes. Comparable results are obtained with acyclovir.
  • the acellular extracts of the E. llH strains overexpressing the fusion protein can be prepared in various ways, among which may be mentioned, lysozyme lysis in the presence of EDTA, the use of Menton-Golin type grinding devices , French Press, X-Press, or the action of ultrasound. More particularly, the acellular extracts of the E. coli strains overexpressing the fusion protein were prepared as follows:
  • the E. coli BL21 DE3 pXL3098 strain is cultured in LB medium. After centrifugation (5000xg; 20 min), the cells obtained from 11 of culture are resuspended in 20 ml of buffer A: 50 mM Tris / HCl pH 7.8, containing 5 mM DTT, 4 mM MgCl 2 , 10% glycerol (v / v), Benzamidine 2mM, E64 50 ⁇ l / l (lOO ⁇ g / 1 solution N- [N- (L-3-trû ⁇ s-carboxyoxiran-2-carbonyl) -L-leucyl] -4-aminobutylgua nidine, Péfabloc 0,2mM, STI (Soybeam trypsin inhibitor), Leupeptin 2mg / ml, and sonicated for 4 min at 4 ° C.
  • buffer A 50 mM Tris / HCl pH 7.8, containing
  • the supernatant is injected onto a MONO Q HR 10/10 column (Pharmacia) balanced in buffer A.
  • the proteins are eluted with a linear gradient from 0 to 400 mM NaCl in the Tris / HCl buffer 20 mM pH 7.5.
  • the fractions containing the TK and GMPK activity are combined and concentrated then chromatographed on a column of Superdex 200 HILoad 26/60 (Pharmacia) eluted with buffer A containing 150 mM NaCl.
  • the fractions containing the TK and GMPK activity are combined.
  • This example describes a study of the kinetic parameters of phosphorylation of GCV and of TACV of the fusion, compared with the kinetic parameters obtained with the proteins HSV1-TK and GMPK of S. cerevisiae.
  • TK The activity of TK is assayed as follows: an enzymatic extract containing approximately 0.1 unit of TK is incubated for 15 min at 37 ° C. in 100 ⁇ l of Tris / HCl buffer 50 mm pH 7.8 containing lmg / ml of BSA ( bovine serum albumin), 5mM ATP, 4mM MgC12, 12mM Kcl, 2mM DTT, 600 ⁇ M EDTA and lOO ⁇ M GCV + [8-3H] -GCV 40nCi / nmol. The reaction is stopped by the addition of 10 ⁇ l of 50 mM Tris / HCl buffer pH 7.8 containing ImM of non-radioactive thymidine.
  • BSA bovine serum albumin
  • the phosphorylated species are fixed on a DEAE sephadex column (400 ⁇ l of gel) then, after washing the column, these species are eluted with 2 ml of 1M HCl. The radioactivity in the sample is then counted by liquid scintillation.
  • the capacity of the TK-GMPK fusion protein to transform GCV or TACV into GCVDP or ACVDP relative to a synthetic mixture of TK and GMPK is determined as follows: Incubation takes place in 200 ⁇ l of Tris / HCl buffer 50 mM pH 7.8 containing 1 mg / ml of BSA (bovine serum albumin), 5 mM ATP, 4 mM MgC12, 12 m MKC1, 2 mM DTT, 600 ⁇ M EDTA, 1 to 100 ⁇ M of GCV + [8-3H ] GCV (40nCi / nmol) or 1 to 100 ⁇ M ACV + [2-3H] ACV 40nCi / nmol and different amounts of TK, GMPK and equivalent amounts of fusion protein. The reaction is stopped by heating for 3 min at 80 ° C., after centrifugation 100 ⁇ l of incubate are analyzed in the following system:
  • SAX Partisphere (WHATMAN) - particle diameter: 5 ⁇ m.
  • Buffer A KH2PO40.01 M pH3.5 (adjusted using concentrated H3PO4)
  • Buffer B KH2PO40.75 M pH3.5 (adjusted using concentrated H3PO4)
  • Radiochemical detection of tritium flow of scintillant (Optisafe 1 from Berthold) 1ml / min
  • the TK-GMPK fusion protein retains the properties of the two original enzymes.
  • the TK-GMPK fusion protein brings a significant improvement in phosphorylation a) up to a factor of 1.8, for GCV b) up to a factor of 1.2 for TACV versus the coincubation of the wild-type TK and GMPK enzymes.
  • the fusion protein allows in vivo co-localization of enzymatic activities in the cell, the separate enzymes being distributed, in the nucleus for THSVl-TK and in the cytosol for GMPK. This construction therefore makes it possible to increase the effectiveness of treatments by suicide gene.
  • NAME RHONE POULENC RORER S.A.

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Abstract

La présente invention concerne des combinaisons d'enzymes, utilisables pour la destruction de cellules, notamment de cellules prolifératives. Elle concerne également des vecteurs permettant le transfert et l'expression intracellulaire de ces combinaisons d'enzymes, ainsi que leur utilisation thérapeutique, en particulier en thérapie génique anti-cancéreuse.

Description

Combinaisons d'enzvmes pour la destruction des cellules proliferatives
La présente invention concerne le domaine de la thérapie génique et cellulaire. Elle concerne en particulier des combinaisons d'enzymes, utilisables pour la destruction de cellules, notamment de cellules proliferatives. Elle concerne Également des vecteurs permettant le transfert et l'expression intracellulaire de ces combinaisons d'enzymes, ainsi que leur utilisation thérapeutique, en particulier en thérapie génique anti-cancéreuse.
La thérapie génique, qui consiste à introduire dans un organisme ou une cellule une information génétique, a connu ces dernières années un développement extraordinaire. L'identification de gènes impliqués dans des pathologies, la mise au point de vecteurs d'administration de gènes, le développement de systèmes d'expression contrôles ou tissu-spécifiques notamment ont contribué au développement de ces nouvelles approches thérapeutiques. Ainsi, au cours des 5 dernières années, de nombreux essais cliniques de thérapie génique ou cellulaire ont été entrepris en Europe comme aux Etats-Unis, dans des domaines tels que les maladies monogéniques (hémophilie, mucoviscidose), le cancer, les pathologies cardiovasculaires ou encore les troubles du système nerveux.
Dans le domaine des pathologies liées à une hyperproliferation cellulaire (cancer, resténose, etc), différentes approches ont été développées. Certaines reposent sur l'utilisation de genes suppresseur de tumeurs (p53, Rb), d'autres sur l'emploi d'antisens diriges contre des oncogenes (myc, Ras), d'autres encore sur l'immunothérapie (administration d'antigènes tumoraux ou de cellules immunitaires spécifiques, etc). Une autre approche consiste a introduire dans les cellules concernées un gène toxique ou suicide capable d'induire la destruction des dites cellules. De tels genes sont par exemple des genes susceptibles de sensibiliser les cellules a un agent pharmaceutique. Il s'agit généralement de gènes codant pour des enzymes non mammifères et non toxiques qui, lorsqu'ils sont exprimés dans des cellules de mammifères, transforment une prodrogue, initialement peu ou pas toxique, en un agent hautement toxique. Un tel mécanisme d'activation de prodrogues est avantageux à plusieurs titres: il permet d'optimiser l'indice thérapeutique en ajustant la concentration en prodrogue ou l'expression de l'enzyme, d'interrompre la toxicité en n'administrant plus la prodrogue et d'évaluer le taux de mortalité. En outre, l'utilisation de ces genes suicide offre l'avantage de ne pas être spécifique pour un type particulier de tumeur, mais d'application générale. Ainsi, les stratégies basées sur l'utilisation de genes suppresseurs de tumeurs ou d'antisens anti- oncogene sont applicables uniquement aux tumeurs présentant une déficience dans ledit gène suppresseur ou une surexpression dudit oncogene. De même, les approches basées sur l'immunothérapie doivent être développes patient par patient, pour tenir compte des restrictions et des compétences immunitaires. Au contraire, une stratégie basée sur l'emploi d'un gène suicide est applicable a tout type de tumeur, et, plus généralement, a pratiquement tout type de cellule.
De nombreux gènes suicides sont décrits dans la littérature comme par exemple les gènes codant pour la cytosine désaminase, la purine nucléoside phophorylase ou la thymidine kinase comme par exemple les thymidines kinases du virus de la varicelle ou du virus de l'herpès simplex de type 1.
La cytosine désaminase de Escherichia coli est capable de catalyser la désamination de la cytosine en uracile. Les cellules qui expriment le gène de E. coli sont donc capables de convertir la 5-fluorocytosine en 5-fluorouracile, qui est un métabolite toxique (Mullen et coll. 1992 Proc. Natl. Acad. USA 89 ρ33). La purine nucléoside phophorylase de Escherichia coli permet la conversion d'analogues non toxiques de déoxyadénosine en analogues d'adénine très toxiques. Comme l'enzyme eucaryote ne présente pas cette activité, si les cellules mammifères expriment le gène bactérien les analogues de déoxyadénine tels que le 6-méthyle-purine-2'-déoxyribo-nucléoside est transformé en produit toxique pour ces cellules (Sorscher et coll. 1994 Gène Therapy 1 p233).
La thymidine kinase du virus de la varicelle permet la monophosphorylation du 6-méthoxypurine arabinoside. Si les cellules mammifères expriment ce gène viral, ce monophosphate est produit puis métabolisé par les enzymes cellulaires en un composé toxique (Huber et coll.
1991 Proc. Natl. Acad. USA 88 p8039).
Parmi ces gènes, le gène codant pour la thymidine kinase (TK) est tout particulièrement intéressant sur le plan thérapeutique car, à la différence des autres gènes suicides, il génère une enzyme capable d'éliminer spécifiquement les cellules en cours de division, puisque la prodrogue est transformée en un produit non diffusible qui inhibe la synthèse d'ADN. La thymidine kinase virale, et notamment les thymidines kinases du virus de la varicelle ou du virus de l'herpès simplex de type 1 ont une spécificité de substrat différente de l'enzyme cellulaire, et il a été montré qu'elles étaient la cible d'analogues de guanosine tels que l'acyclovir ou le ganciclovir (Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276). Ainsi, le ganciclovir est phosphorylé en ganciclovir monophosphate uniquement quand les cellules mammifères produisent l'enzyme HSV1-TK, puis des kinases cellulaires permettent la métabolisation du ganciclovir monophosphate en diphosphate puis triphosphate qui provoque l'arrêt de la synthèse d'ADN et conduit à la mort de la cellule (Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276 ; Mullen 1994 Pharmac. Ther. 63 pl99). Le même mécanisme se produit avec d'autres thymidine kinases et d'autres analogues de guanosine.
Par ailleurs, un effet de toxicité propagée (effet "by-stander") a été observe lors de l'utilisation de la TK. Cet effet se manifeste par la destruction non seulement des cellules ayant incorpore le gène TK, mais également des cellules avoisinnantes. Le mécanisme de ce processus peut s'expliquer de trois façons : i) la formation de vésicules apoptotiques qui contiennent du ganciclovir phosphorylé ou la thymidine kinase, provenant des cellules mortes, puis la phagocytose de ces vésicules par les cellules voisines; ii) le passage de prodrogue métabolisée par la thymidine kinase, par un processus de coopération métabolique des cellules contenant le gène suicide vers les cellules ne le contenant pas et/ou iii) une réponse immunitaire liée à la régression de la tumeur (Marini et coll. 1995 Gène Therapy 2 p655).
Pour l'Homme de l'art, l'utilisation du gène suicide codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès est très largement documentée. En particulier, les premières études in vivo sur des rats ayant un gliome montrent des régressions de tumeur lorsque le gène HSV1-TK est exprimé et que des doses de 150 mg/kg de ganciclovir sont injectées [K. Culver et coll. 1992 Science 256 pl550]. Toutefois, ces doses sont hautement toxiques chez la souris [T. Osaki et coll. 1994 Cancer Research 54 p5258] et donc totalement proscrites en thérapie génique chez l'Homme.
Un certain nombre d'essais thérapeutiques sont également en cours chez l'homme, dans lesquels le gène TK est délivre aux cellules au moyen de différents vecteurs tels que notamment des vecteur retroviraux ou adenoviraux. Dans les essais cliniques de thérapie génique chez l'Homme, ce sont des doses beaucoup plus faibles qui doivent être administrées, de l'ordre de 5 mg/kg et pour une durée du traitement courte (14 jours) (E. Oldfield et coll. 1995 Human Gène Therapy 6 p55). Pour des doses plus élevées ou des traitements plus prolongés dans le temps, des effets secondaires indésirables de toxicité sont en effet observes.
Pour remédier a ces inconvénients, il a été propose de synthétiser des dérives de la thymidine kinase plus spécifiques ou plus actifs pour phosphoryler les analogues de guanosine. Ainsi ont été décrits des dérivés obtenus par mutagénèse dirigée. Toutefois, aucune caractérisation biochimique précise sur les enzymes pures n'a été réalisée, aucun test cellulaire utilisant ces mutants n'a été publié et aucune amélioration fonctionnelle n'a été rapportée (WO95/30007; Black et coll., 1993 Biochemistry 32 pll618). En outre, l'expression inductible d'un gène HSV1-TK, délété de ses 45 premiers codons, a été réalisée dans des cellules eucaryotes mais les doses en prodrogue utilisées demeurent comparables à celles décrites dans tous les essais de la littérature (B. Salomon et coll. 1995 Mol. Cell. Biol. 15 p5322). En conséquence, aucun des variants décrits jusqu'ici ne présente une activité améliorée à l'égard de la thymidine ou vis à vis du ganciclovir.
La présente invention propose une méthode améliorée de thérapie génique par gène suicide. La présente invention décrit en particulier une méthode permettant d'améliorer l'efficacité de phosphorylation des analogues de guanosine par les thymidine kinase et ainsi, d'améliorer le potentiel thérapeutique de ce traitement. La présente invention propose notamment une méthode pour triphosphoryler des analogues de nucléosides tels que le ganciclovir ou l'acyclovir pour que la triphosphorylation de ces analogues soit très significativement augmentée à des doses de ganciclovir (resp. acyclovir) i) significativement plus faibles ; ii) ou susceptibles de provoquer un effet "by- stander" plus prononcé ; iii) ou bien ne conduisant pas à une toxicité cellulaire qui pourrait se produire lorsque la thymidine kinase sauvage est surexprimée .
Cette méthode peut être appliquée au cancer, aux maladies cardiovasculaires, ou à toute application nécessitant la mort de certaines cellules telles que des cellules infectées par un virus ; ce virus peut être un virus de type
VIH (virus d'immunodéficience humain), CMV (cytomegalovirus) VCR (virus respiratoire syncytial).
La présente invention repose en particulier sur l'utilisation d'une combinaison d'enzymes, permettant d'améliorer in vivo la reaction de phosphorylation des analogues de nucléosides.
Un premier objet de l'invention réside donc dans une composition comprenant :
- une enzyme capable de phosphoryler un analogue de nucleoside, pour générer un analogue monophosphate,
- une enzyme capable de phosphoryler ledit analogue monophosphate, pour générer un analogue diphosphate, et,
- une enzyme capable de phosphoryler ledit analogue diphosphate, pour générer un analogue triphosphate toxique.
Plus particulièrement, l'enzyme capable de phosphoryler un analogue de nucleoside, pour générer un analogue monophosphate est une thymidine kinase, l'enzyme capable de phosphoryler ledit analogue monophosphate, pour générer un analogue diphosphate est une guanylate kinase et l'enzyme capable de phosphoryler ledit analogue diphosphate pour générer un analogue triphosphate est une nucleoside diphosphate kinase. Par ailleurs, les compositions selon l'invention peuvent comprendre, non pas directement l'enzyme, mais un acide nucléique codant pour l'enzyme. A cet égard, l'invention a également pour objet une composition utilisable pour la délivrance et la production in vivo d'une combinaison d'enzymes, comprenant:
. un premier acide nucléique codant pour une enzyme capable de phosphoryler un analogue de nucleoside, pour générer un analogue monophosphate,
- un deuxième acide nucléique codant pour une enzyme capable de phosphoryler ledit analogue monophosphate, pour générer un analogue diphosphate, et,
- un troisième acide nucléique codant pour une enzyme capable de phosphoryler ledit analogue diphosphate, pour générer un analogue triphosphate toxique.
Avantageusement, le premier acide nucléique code pour une thymidine kinase, le deuxième acide nucléique code pour une guanylate kinase et le troisième acide nucléique code pour une nucleoside diphosphate kinase.
L'analogue de nucleoside est généralement un analogue de guanosine, tel que par exemple le ganciclovir, l'acyclovir ou le penciclovir. D'autres analogues de nucléosides sont par exemple des composés de type trifluorothymidine, l-[2- deoxy, 2-fluoro, beta-D-arabino furanosyl]-5-iodouracil, ara-A, 1-beta-D- arabinofuranosyl thymidine (araT), 5-éthyl-2'déoxyuridine, iodouridine, AZT, AIU, didéoxycytidine, AraC et le bromovinyldésoxyuridine (BVDU). Les analogues préfères sont le ganciclovir, l'acyclovir, le penciclovir et le BVDU, de préférence le ganciclovir et l'acyclovir. La forme triphosphatée est toxique en ce sens qu'elle entraine, directement ou indirectement, la mort cellulaire.
Lorsque les cellules de mammifères, modifiées pour exprimer la thymidine kinase (HSV1-TK par exemple), sont mises en présence d'un analogue de nucleoside (ganciclovir par exemple), elles deviennent capables d'effectuer la phosphorylation du ganciclovir pour conduire au ganciclovir monophosphate. Ultérieurement, des kinases cellulaires permettent la métabolisation de ce ganciclovir monophosphate sucessivement en diphosphate puis triphosphate. Le ganciclovir triphosphate ainsi généré, produit alors des effets toxiques en s'incorporant à l'ADN et inhibe en partie l'ADN polymérase alpha cellulaire ce qui provoque l'arrêt de la synthèse d'ADN et donc conduit à la mort de la cellule. Dans ce mécanisme, l'étape de monophosphorylation de l'analogue de nucleoside est considérée comme l'étape limitante. C'est pour cette raison que différentes approches ont été décrites dans l'art antérieur pour tenter d'améliorer les propriétés intrinsèques de la thymidine kinase (création de mutants de la TK, recherche de systèmes d'expression et d'administration plus performants, etc).
La présente invention montre maintenant qu'il est possible d'améliorer l'efficacité du traitement en administrant, en combinaison avec une thymidine kinase, d'autres enzymes impliquées dans la phosphorylation des analogues de nucléosides. La présente invention a ainsi pour objet différentes combinaisons d'enzymes permettant d'optimiser la reaction intracellulaire de triphosphorylation d'analogues de nucléosides. Un autre aspect de la présente invention concerne des vecteurs permettant l'introduction et l'expression intracellulaire de ces combinaisons d'enzymes. Il peut s'agir en particulier de plusieurs vecteurs permettant chacun la production d'une enzyme, ou d'un ou plusieurs vecteurs permettant chacun la production de plusieurs enzymes ou de toutes les enzymes. La présente invention concerne également un procède de triphosphorylation d'analogues de nucléosides en présence d'une combinaison d'enzymes, éventuellement produites in situ par expression de genes correspondants, ainsi qu'un procède pour la destruction de cellules proliferatives.
La phosphorylation des nucléosides monophosphates en nucléosides diphosphates puis triphosphates a été documentée in vitro. Ces phosphorylations sont effectuées en présence i) de lysat d'érythrocytes humains dans le cas du ganciclovir (Cheng et coll. 1983 J. Biol. Chem. 258 pl2460) ou ii) de préparations enzymatiques de la guanylate kinase et de la nucleoside diphosphate kinase d'érythrocytes humains, dans le cas du ganciclovir et de l'acyclovir (Miller et coll. 1980 J. Biol. Chem. 255 p720 ; Smée et coll. 1985 Biochem. Pharmac. 34 pl049). Bien que la phosphorylation des nucléosides monophosphates en diphosphates puis triphosphates ait été mise en évidence dans les cellules mammifères, ces conversions ne semblent pas totales avec le ganciclovir monophosphate ou l'acyclovir monophosphate (Agbaria et coll. 1994 Mol. Pharmacol. 45 p777; Caruso et coll. 1995 Virology 206 p495; Salomon et coll. 1995 Mol. Cell. Biol. 15 p5322).
La présente demande décrit maintenant des compositions permettant d'améliorer l'efficacité thérapeutique d'un thymidine kinase in vivo.
La première enzyme utilisée dans les compositions et méthodes selon l'invention, capable de phosphoryler un analogue de nucleoside pour générer un analogue monophosphate, est avantageusement une thymidine kinase non mammifère. Il s'agit préférentiellement d'une thymidine kinase d'origine virale, et en particulier herpétique. Parmi les thymidine kinases herpétiques on peut mentionner notamment la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV1-TK), la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 2 (HSV2-TK), la thymidine kinase du virus de la varicelle (VZV-TK), la thymidine kinase du virus d'Eppstein Barr (EBV-TK), ou encore la thymidine kinase de virus herpétiques d'origine bovine (Mittal et al., J. Virol 70 (1989) 2901), equine Robertson et al., NAR 16 (1988) 11303), féline (Nunberg et al., J.Virol. 63 (1989) 3240) ou simienne (Otsuka et al., Virology 135 (1984) 316).
La séquence du gène codant pour l'enzyme thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1 a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5931). Il en existe des variants naturels conduisant à des protéines ayant une activité enzymatique comparable sur la thymidine, ou le ganciclovir (M. Michael et coll. 1995 Biochem. Biophys. Res. Commun 209 p966). La séquence du gène codant pour l'enzyme thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 2 a également été décrite (Swain et al., J. Virol. 46 (1983) 1045).
La thymidine kinase utilisée dans la présente invention peut être une thymidine kinase native (la forme naturelle de l'enzyme ou un de ses variants naturels), ou une forme dérivée, c'est a dire résultant de modification(s) structurale(s) de la forme native. Comme indique ci-avant, différents mutants ou dérives ont été décrits dans la littérature. Bien que leurs propriétés intrinsèques ne semblent pas significativement modifiées, ces molécules peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention. Il s'agit par exemple de mutants possédant une modification proche de la région DRH du site d'interaction d'un nucleoside (W 095/ 30007). La région DRH correspond aux résidus aspartique, arginine et histidine aux positions 163, 164 et 165 de la TK. Ces trois positions sont très conservées entre les TK herpétiques. Différents mutants ont été décrits sur les positions 160-162 et 168-170 (WO95/ 30007). D'autres variant artificiels possèdent une modification au niveau du site de liaison de l'ATP (FR96 01603). Par ailleurs, d'autres dérives de TK peuvent être prépares selon les techniques classiques de la biologie moléculaire, et utilises dans les combinaisons de l'invention. Ces mutants peuvent être prépares par exemple par mutagenese sur un acide nucléique codant pour une thymidine kinase native, de préférence herpétique, ou un de ses variants. De nombreuses méthodes permettant de réaliser la mutagénèse dirigée ou au hasard sont connues de l'homme de l'art et on peut citer la mutagénèse dirigée par PCR ou par oligonucléotide, la mutagénèse au hasard in vitro par des agents chimiques comme par exemple l'hydroy lamine ou in vivo dans des souches de E. coli imitatrices (Miller "A short course in bacterial genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1992). Les séquences ainsi mutées sont alors exprimées dans un système cellulaire ou acellulaire et le produit d'expression est teste pour la présence d'une activité de type thymidine kinase, dans les conditions décrites notamment dans les exemples. Toute enzyme résultant de ce procède, ayant la capacité de phosphoryler un analogue de nucleoside, pour générer un analogue monophosphate, peut être utilisée dans la présente invention.
Préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention une TK issue de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV1- TK) ou un acide nucléique codant correspondant II s'agit plus particulièrement de la HSV1-TK ou un de ses variants, tels que les variants naturels ou les variants artificiels. Parmi les variants artificiels, on peut citer plus particulièrement les variants P155A/F161V et F161I (Biochemistry 32 (1993) p.11618), le variant A168S (Prot. Engin. 7 (1994) p.83) ou les variants possédant une modification au niveau du site de liaison de l'ATP tel que le variant M60I. Encore plus préférentiellement, on utilise un acide nucléique codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV1-TK).
La deuxième enzyme utilisée dans les compositions et méthodes selon l'invention, capable de phosphoryler un analogue de nucleoside monophosphate pour générer un analogue diphosphate, est avantageusement une guanylate kinase. La guanylate kinase (GMPK) a été purifiée a partir de différents organismes (homme, rat, boeuf, levure). Le gène codant pour la GMPK a été clone également dans différents types cellulaires, et notamment dans la levure Saccharomyces cerevisae. gène GUKl (M. Konrad 1992 J. Biol. Chem. 267 p25652). A partir de ce gène, l'enzyme GMPK de 20 kDa a également été purifiée. Le gène de la GMPK, désigne gmk, a également été isolé et surexprimé chez Escherichia coli (D. Gentry et coll. 1993 J. Biol. Chem. 268 pi 4316). Cette enzyme est différente de l'enzyme de S. cerevisae en terme de coopérativité et d'oligomérisation, alors que les séquences présentent de fortes régions d'identité 46,2% sur 182 résidus. La séquence Al 1042, identifiée comme codant pour un facteur ayant une activité de potentialité de croissance de cellules hématopoéi tiques (EP0274560), présente 51,9% d'identité sur 180 résidus avec le gène GUKl de S. cerevisae. et semble constituer l'homologue humain de la GMPK, bien qu'aucune donnée biochimique n'ait été publiée.
La troisième enzyme utilisée dans les compositions et méthodes selon l'invention, capable de phosphoryler un analogue de nucleoside diphosphate pour générer un analogue triphosphate, est avantageusement une nucleoside diphosphate kinase. La nucleoside diphosphate kinase (NDPK) est une enzyme à large spécificité de subtrat et a été purifiée à partir de sources très variées (M. Inouye et coll. 1991 Gène 105 p31). Pour divers organismes (Myxococcus xanthus, Drosophila melanogaster, Dictyostelium discoideum, rat, boeuf, homme, E. coli et S. cerevisae) le gène codant pour la NDPK a été clone et les enzymes correspondantes sont très homologues (K. Watanabe et coll. 1993 Gène 29 pl41). Néanmoins seules les enzymes des eucaryotes supérieurs possèdent une séquence "leucine zipper". Les gènes humains décrits codant pour une activité NDPK sont en particulier nm23-Hl et nm23-H2. Il est suggéré que le gène nm23-H2 code pour une protéine bifonctionnelle avec deux fonctions indépendantes qui sont activité NDPK et facteur de transcription (E. Postel et coll. 1994 J. Biol. Chem. 269 p8627). Le gène YNK de S- cerevisae n'est pas un gène essentiel pour la levure et code pour la NDPK qui est probablement une protéine tétramérique dont le poids moléculaire des monomères est de 19 kDa (A. Jong et coll. 1991 Arch. Biochem. Biophys. 291 p241).
Les séquences nucléiques codant pour la GMPK ou la NDPK utilisées dans le cadre de l'invention peuvent être d'origine humaine, animale, virale, synthétique ou semi-synthétique.
D'une manière générale, les séquences nucléiques de l'invention peuvent être préparées selon toute technique connue de l'homme du métier. A titre illustratif de ces techniques on peut notamment mentionner:
- la synthèse chimique, en utilisant les séquences décrites dans la littérature et par exemple un synthétiseur d'acides nucléiques,
- le criblage de banques au moyen de sondes spécifiques, notamment telles que décrites dans la littérature, ou encore - les techniques mixtes incluant la modification chimique (élongation, délétion, substitution, etc) de séquences criblées à partir de banques.
Avantageusement, les séquences nucléiques utilisées dans le cadre de l'invention sont des séquences d'ADNc ou d'ADNg. Les séquences d'ADNc sont des séquences dépourvues d'introns, obtenues a partir d'ARN. Les séquences d'ADNg sont des régions de chromosome. Chez les eucaryotes, elles comprennent un ou plusieurs introns. Les séquences d'ADNg utilisées dans le cadre de l'invention peuvent comprendre tout ou partie des introns présents dans le gène naturel, ou un ou plusieurs introns artificiellement introduits dans un ADNc pour augmenter par exemple l'efficacité d'expression dans les cellules mammifères. Les acides nucléiques peuvent coder pour les enzymes natives ou pour des variants ou dérives présentant une activité de même type. Ces acides nucléiques analogues peuvent être obtenus par les techniques classiques de la biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier. Il peut s'agir de mutagénèse, dirigée ou non, d'hybridation a partir de banques, de deletion ou d'insertion, de la construction de molécules hybrides, etc. Généralement, les modification portent sur moins de 20% des bases de l'acide nucléique. La fonctionnalité des acides nucléiques analogues est déterminée comme décrit dans les exemples par dosage de l'activité enzymatique du produit d'expression.
Une composition particulière au sens de l'invention comprend un premier acide nucléique codant pour une thymidine kinase et un second acide nucléique codant pour une nucleoside diphosphate kinase. Dans ce mode de réalisation, la nucleoside diphosphate kinase est préférentiellement d'origine eucaryote non-humaine. On entend par enzyme non-humaine une enzyme non présente naturellement dans les cellules humaines. Il peut s'agir d'une enzyme virale, animale, ou issue d'un organisme eucaryote inférieur (tel qu'une levure). Il peut également s'agir d'un dérive non naturel d'une enzyme humaine, présentant une ou plusieurs modifications structurales. Plus préférentiellement, elle la NDPK utilisée dans la présente invention est choisie parmi la NDPK de levure ou de boeuf. Ces compositions peuvent en outre comprendre un acide nucléique codant pour une guanylate kinase, comme par exemple une guanylate kinase de levure.
Une autre composition particulière au sens de l'invention comprend un premier acide nucléique codant pour une thymidine kinase et un second acide nucléique codant pour une guanylate kinase non humaine. La GMPK non- humaine peut être choisie parmi les GMPK de rat, de beouf, de levure, de bactérie, ou des dérives de celles-ci. Préférentiellement, la GMPK est issue d'un eucaryote inférieur, notamment de levure.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la nucleoside diphosphate kinase utilisée dans le cadre de la présente invention est d'origine eucaryote ou animale. Encore plus préférentiellement, il s'agit d'une nucleoside diphosphate kinase de levure ou de boeuf. La demanderesse a en effet mis en évidence que, de manière surprenante, la nucleoside diphosphate kinase de levure, et notamment de Saccharomyces cerevisae ou celle de boeuf, permettaient de phosphoryler des analogues de nucléosides diphosphates, tels que le ganciclovir diphosphate ou l'acyclovir diphosphate, en nucléosides triphosphates. En outre, les résultats présentes dans les exemples montrent clairement que ces enzymes possèdent sur ces substrats une activité très supérieure a l'enzyme humaine. Ainsi, en présence de 0,675 μg d'enzyme humaine, le pourcentage de GCV triphosphate obtenu est de 1,5%, alors qu'en présence de 0,75 μg d'enzyme de levure, il est de 82.9%. De même, en présence de 6,75 μg d'enzyme humaine, le pourcentage de GCV triphosphate obtenu est de 24%, alors qu'en présence de 1,5 μg d'enzyme de levure, il est de 91.1% et en présence de 5 μg d'enzyme de boeuf, il est de 92 %. Les mêmes résultats sont obtenus avec un autre analogue de nucleoside, l'acyclovir. Ainsi, en présence de 6,75 μg d'enzyme humaine, le pourcentage d'ACV triphosphate obtenu est inférieur a 0.4%, alors qu'en présence de 1,5 μg d'enzyme de levure, il est de 8%, en présence de 15 μg d'enzyme de levure, il est de 81% et en présence de 5 μg d'enzyme de boeuf, il est de 1.3%. Ces résultats mettent clairement en évidence l'avantage d'utiliser, dans les combinaisons selon l'invention, une nucleoside diphosphate kinase de levure ou de boeuf. Ces résultats montrent également que la première étape de phosphorylation de l'analogue en monophosphate n'est pas forcement l'étape limitante du processus et que l'utilisation d'une combinaison d'enzymes selon l'invention permet d'augmenter le potentiel thérapeutique du traitement.
Par ailleurs, la demanderesse a également montre que la guanylate kinase de levure, et notamment de Saccharomyces cerevisae. permettait également de phosphoryler des analogues de nucléosides monophosphates, tels que le ganciclovir monophosphate ou l'acyclovir monophosphate, en nucléosides diphosphates avec une bonne activité. Ainsi, en présence de 2,5 μg d'enzyme de levure, le pourcentage de GCV diphosphate obtenu peut dépasser 92% et en présence de 74 μg d'enzyme de levure, le pourcentage d'ACV diphosphate obtenu est de 54%. De plus, les résultats présentes montrent que la guanylate kinase de levure présente une vitesse de phosphorylation du GCVMP 2 fois supérieure à l'enzyme humaine. De même, son affinité pour le GCVMP est supérieure d'un facteur au moins égal à 2 à l'affinité que présente l'enzyme humaine pour ce substrat. Au total, la valeur du Vmax/Km de l'enzyme de levure pour le GCVMP est 4,4 fois supérieure à la valeur que présente l'enzyme humaine. Pour l'ACVMP, la valeur du Vmax/Km de l'enzyme de levure est 7 a 9 fois supérieure à la valeur que présente l'enzyme humaine pour ce substrat.
La demanderesse a aussi mis en évidence qu'un couplage de ces deux enzymes non-humaines avec une thymidine kinase, par exemple la thymidine kinase du virus de herpès de type I permettait de phosphoryler des analogues de nucléosides tels que le ganciclovir ou l'acyclovir en dérivés triphosphates, avec une efficacité très importante.
Selon un mode de réalisation préfère, les compositions de l'invention comprennent des séquences codant pour la guanylate kinase (EC-2.7.4.8) et/ou la nucleoside diphosphate kinase (EC-2.7.4.6) de levure. Plus préférentiellement, il s'agit des enzymes de la levure S. cerevisae. Ces séquences sont utilisées simultanément avec une séquence (HSV1-TK) codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1 (EC-2.7.1.21) pour permettre de triphosphoryler les analogues de nucléosides tels que le ganciclovir ou l'acyclovir.
Comme indique ci-avant, les compositions selon l'invention peuvent comprendre une combinaison d'enzymes ou d'acides nucléiques permettant la production in vivo des enzymes. Il s'agit avantageusement d'acides nucléiques. Ce mode de mise en oeuvre est préfère puisqu'il permet une production in vivo de niveaux supérieurs d'enzymes et ainsi un effet thérapeutique plus important.
Selon un premier mode de réalisation, dans les composition de l'invention, les acides nucléiques sont portes par un même vecteur d'expression. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux car il suffit d'introduire un seul vecteur dans une cellule mammifère pour obtenir l'effet thérapeutique recherche. Dans ce mode de réalisation, les différents acides nucléiques peuvent constituer trois cassettes d'expression distinctes au sein du même vecteur d'expression. Ainsi, les différents acides nucléiques peuvent chacun être place sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, d'un terminateur transcriptionnel et de signaux de traduction distincts. Il est également possible d'insérer plusieurs acides nucléiques sous forme d'un polycistron dont l'expression est dirigée par un seul promoteur et un seul terminateur transcriptionnels. Ceci peut être realise notamment par l'utilisation de séquences IRES ("Internai Ribosome Entry Site") positionnées entre les séquences nucléiques. A cet égard, les vecteurs d'expression de l'invention peuvent comprendre une unité bicistronique dirigeant l'expression de deux acides nucléiques, et éventuellement un acide nucléique sépare codant pour la troisième enzyme. Les vecteurs de l'invention peuvent également comprendre une unité tricistronique dirigeant l'expression des trois acides nucléiques. Ces différents modes de réalisation sont illustres dans les exemples.
Des vecteurs d'expression préfères au sens de l'invention sont notamment:
- Un vecteur comprenant:
. un premier acide nucléique codant pour une thymidine kinase, et,
. un deuxième acide nucléique codant pour une guanylate kinase non- humaine. Il s'agit préférentiellement d'une guanylate kinase de levure.
- Un vecteur comprenant:
. un premier acide nucléique codant pour une thymidine kinase, et,
. un deuxième acide nucléique codant pour une nucleoside diphosphate kinase. Il s'agit préférentiellement d'une nucleoside diphosphate kinase eucaryote non-humaine. Plus preferentielement, il s'agit d'une NDPK d'origine bovine ou levure.
Avantageusement, ce vecteur comprend en outre un acide nucléique codant pour une guanylate kinase.
La thymidine kinase utilisée dans les vecteurs de l'invention est avantageusement une thymidine kinase d'origine virale, notamment herpétique. Il s'agit préférentiellement d'une thymidine kinase issue de la TK du virus HSV- 1 ou HSV-2.
Comme indique ci-avant, dans les vecteurs selon l'invention, les différents acides nucléiques peuvent être places sous le contrôle de promoteurs disctincts, ou constituer une unité polycistronique sous le contrôle d'un promoteur unique. A cet égard, comme indiqué ci-avant, les enzymes peuvent également être produites sous forme couplées, les différents acides nucléiques étant couplés pour produire une protéine portant les différentes activités enzymatiques. En particulier, un mode de réalisation particulier des vecteurs selon l'invention est caractérisé en ce que l'acide nucléique codant pour la thymidine kinase d'origine virale et l'acide nucléique codant pour la guanylate kinase non-humaine sont couplés et codent pour une protéine portant à la fois les activités TK et GUK. Selon une autre variante, dans les vecteurs de l'invention, l'acide nucléique codant pour la thymidine kinase d'origine virale et l'acide nucléique codant pour la nucleoside diphosphate kinase sont couplés et codent pour une protéine portant à la fois les activités TK et NDPK. A titre illustratif, le couplage entre les enzymes est réalisé au moyen d'un linker peptidique, par exemple de structure (G4S), Selon un autre mode de réalisation, dans les composition de l'invention, les acides nucléiques sont portes par plusieurs vecteurs d'expression.
Comme indique ci-apres, les vecteurs d'expression peuvent être d'origine plasmidique ou virale. S'agisant de vecteurs d'origine virale, il s'agit avantageusement de retrovirus ou d'adenovirus.
Différents promoteurs peuvent être utilises dans le cadre de l'invention. Il s'agit de séquences permettant l'expression d'un acide nucléique dans une cellule mammifère. Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules humaines. Plus préférentiellement, il s'agit d'un promoteur permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés. Il peut s'agir par exemple du propre promoteur du gène considère (TK, GMPK, NDPK). Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, DHFR etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAI, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, alpha-actine du muscle lisse, etc), des promoteurs cellules spécifiques de type cellules en division comme les cellules cancéreuses ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, récepteur de glucocorticoïdes, etc) ou dits inductibles. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes El A et MLP d'adenovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire.
Un autre objet de l'invention concerne un produit comprenant une combinaison d'enzymes capables de tri phosphoryler un analogue de guanosine, et ledit analogue de guanosine, en vue d'une administration simultanée, séparée, ou étalée dans le temps.
L'invention concerne également une composition pour la production in vivo d'un analogue de nucleoside triphosphate toxique comprenant, conditionnes séparément ou ensemble :
- un analogue de nucleoside
- un acide nucléique codant pour une thymidine kinase
- un acide nucléique codant pour une guanylate kinase, et, - un acide nucléique codant pour une nucleoside diphosphate kinase.
L'invention a encore pour objet une composition comprenant une combinaison d'enzymes impliquées dans la phosphorylation de nucléosides, éventuellement générées in situ par expression de séquences nucléiques, l'une au moins de ces enzymes étant d'origine eucaryote non-humaine. La combinaison d'enzyme comprend notamment une TK et une NDPK; une TK et une GMPK ou une TK, une GMPK et une NDPK.
La présente invention concerne encore une méthode pour la destruction de cellules proliferatives comprenant l'administration auxdites cellules d'une combinaison d'enzymes comprenant une TK et une NDPK. Préférentiellement, la combinaison comprend en outre une guanylate kinase. L'invention concerne également une méthode pour la destruction de cellules proliferatives comprenant l'administration auxdites cellules d'une combinaison d'enzymes comprenant une TK et une GMPK.
Selon cette méthode, les cellules sont mises en contact avec un analogue de nucleoside, de préférence un analogue de guanosine, qui est converti dans les cellules exprimant la combinaison d'enzymes en un compose toxique.
Selon l'invention, les enzymes peuvent être administrées aux cellules par administration d'acides nucléiques codant pour lesdites enzymes.
L'invention réside également dans l'utilisation de la nucleoside diphosphate kinase ou d'un acide nucléique codant pour celle-ci, en combinaison avec une thymidine kinase ou un acide nucléique codant pour une thymidine kinase, pour la préparation d'une compositioon pharmaceutique destinée a la destruction des cellules proliferatives.
L'invention concerne encore un procède de triphosphorylation d'un analogue de nucleoside comprenant la mise en présence dudit analogue avec une combinaison d'enzymes, l'une au moins d'entre elles étant d'origine eucaryote non-humaine. La présente invention fournit maintenant de nouveaux agents thérapeutiques permettant d'interférer avec de nombreux dysfonctionnements cellulaires. Dans ce but, les acides nucléiques ou cassettes selon l'invention peuvent être injectés tels quels au niveau du site à traiter, ou incubés directement avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier. Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) l'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires. Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré de la présente invention, les séquences nucléiques sont incorporées dans un vecteur de transfert. Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique, plasmidique ou virale.
Par vecteur chimique, on entend couvrir au sens de l'invention, tout agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression de séquences nucléiques dans des cellules eucaryotes. Ces vecteurs chimiques ou biochimiques, synthétiques ou naturels, représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques. A titre représentatif de ce type de techniques de transfection non virales, actuellement développées pour l'introduction d'une information génétique, on peut ainsi mentionner celles impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc.
L'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
L'acide nucléique ou le vecteur utilisé dans la présente invention peut être formulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, la séquence nucléique ou le vecteur est utilisé sous une forme injectable. Il peut donc être mélangé à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Une injection directe de la séquence d'acides nucléiques dans la tumeur du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses en séquences nucléiques utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant une combinaison d'enzymes telle que définie ci-avant. Elle concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur tel que défini ci-avant.
Elle concerne aussi l'utilisation d'une NDPK d'origine levure ou d'une GMPK d'origine levure pour la phosphorylation in vivo d'analogues de nucléosides.
En raison de leurs propriétés antiprolifératives, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le traitement des désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la resténose. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour la destruction de cellules, notamment de cellules hyperprolifératives. Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules de muscle lisse de la paroi vasculaire (resténose). Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloïdes, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la peau, du pancréas ou encore les cancers du rein et de la prostate, les cancers de l'oesophage, les cancers du larynx, les cancers tête et cou, les cancers ano-génitaux HPV positifs, les cancers du nasopharynx EBV positifs, etc.
Elle peut être utilisée in vitro ou ex vivo. Ex vivo, elle consiste essentiellement à incuber les cellules en présence d'une séquence nucléique (ou d'un vecteur, ou cassette ou directement du dérivé). In vivo, elle consiste à administrer à l'organisme une quantité active d'un vecteur (ou d'une cassette) selon l'invention, de préférence directement au niveau du site à traiter (tumeur notamment), préalablement, simultanément et/ou après l'injection de la prodrogue considérée c'est à dire le ganciclovir ou un analogue nucleoside. A cet égard, l'invention a également pour objet une méthode de destruction de cellules hyperprolifératives comprenant la mise en contact desdites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec une combinaison d'enzymes ou de séquences nucléiques telles que définies ci-avant, en présence d'un analogue de nucleoside.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES:
Figure 1 : Représentation schématique du vecteur pcDNA3-TK
Figure 2 : Représentation schématique du vecteur pXL2854
Figure 3 : Représentation schématique du vecteur pXL2967
Figure 4 : Représentation schématique du vecteur pXL3081
Figure 5 : Mise en évidence de l'expression des protéines GMPK et NDPK
Figure 6 : Représentation schématique du vecteur pXL3098
Tableau 1 : Constantes cinétiques des GMPK de levure et d'érythrocytes humaine sur le GCVMP et l'ACVMP. Valeurs pubiées: [D.F.Smée et al. (1985) Biochem.Pharmacol. 34:1049-1056] a ; [R. E. Boehme (1984) /. Biol. Chem. 259:12346-
12349] b; [W. H. Miller and R. L. Miller (1980) /. Biol. Chem. 255:7204-7207 ]c Tableau 2 : Couplage TK-GMPK-NDPK : % des produits formes
MATERIELS ET METHODES
Abréviations
ACV : acyclovir
GCV : ganciclovir
GMPK : guanylate kinase
HSV1-TK : thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1.
NDPK : nucleoside diphosphate kinase
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature (Sambrook et coll. "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel et coll. "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987). Les plasmides de type pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories), les plasmides pBSK ou pBKS proviennent de Stratagen.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymerase-catalyzed £hain Reaction] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les recommandations du fabricant.
L'électroporation d'ADN plasmidique dans des cellules de E. çoH peut-être réalisée à l'aide d'un électroporateur (Bio-Rad) selon les recommandations du fournisseur.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham ou celui distribué par Applied Biosystems.
EXEMPLE 1 - Construction des vecteurs d'expression des combinaisons d'enzymes
Cet exemple décrit différentes méthodes pour la construction de vecteurs d'expression et de transfert des séquences nucléiques de l'invention in vitro ou in vivo.
1.1 - Construction de vecteurs plasmidiques
Pour la construction de vecteurs plasmidiques, différents types de vecteurs d'expression peuvent être utilises. 2 types de vecteurs sont plus particulièrement préfères : - Le vecteur pSV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Ce vecteur est un vecteur d'expression eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les combinaisons d'enzymes de l'invention peuvent être insérés dans ce vecteur aux sites Hpal- EcoRV. Ils sont ainsi placés sous le contrôle du promoteur de renhancer du virus SV40.
- Le vecteur pCDNA3 (Invitrogen). Il s'agit également d'un vecteur d'expression eucaryote. Les séquences nucléiques codant pour les enzymes ou les combinaisons d'enzymes de l'invention sont placées, dans ce vecteur, sous le contrôle du promoteur précoce du CMV.
1.2 - Construction de vecteurs viraux
Selon un mode particulier, l'invention réside dans la construction et l'utilisation de vecteurs viraux permettant le transfert et l'expression in vivo des acides nucléiques tels que définis ci-avant.
S'agissant plus particulièrement d'adenovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/ 26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et un acide nucléique selon l'invention. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, dêlétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/ 12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une dêlétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une dêlétion dans région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence nucléique de l'invention (Cf FR94 13355). Dans les virus de l'invention, la dêlétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre une séquence nucléique ou une combinaison de séquences nucléiques de l'invention. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697 ou dans Yeh et al., J. Virol. 70 (19%) 559.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239;
US 4,797,368, US5, 139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant une séquence nucléique ou une combinaison de séquences nucléiques de l'invention bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsi dation (gènes rep et cap) d'AAV. Une lignée cellulaire utilisable est par exemple la lignée 293. D'autres systèmes de production sont décrits par exemple dans les demandes W095/14771; WO95/13365; WO95/13392 ou WO95/06743. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Us constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rctrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine Moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine Moloney sarcoma virus"), le HaSV ("Harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("Rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend. Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention comportant une séquence nucléique nucléique ou une combinaison de séquences nucléiques selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence nucléique est construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes suicides dans les cellules tumorales.
1.3 - Vecteurs chimiques
Les acides nucléiques ou les vecteurs d'expression plasmidiques décrits dans cet exemple (1.1) et dans l'exemple 2 peuvent être administres tels quels in vivo ou ex vivo. Il a en effet été montre que les acides nucléiques nus pouvaient transfecter les cellules. Cependant, pour améliorer l'efficacité de transfert, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention un vecteur de transfert. Il peut s'agir d'un vecteur viral (exemple 1.2.) ou d'un agent de transfection synthétique. Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, (PCT/FR/00098) polyéthylène imine (WO96/02655) et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucléaire. En outre, le concept de la transfection ciblée a été développé, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants.
EXEMPLE 2 - Clonage de HSV1-TK et/ou de la guanylate kinase et/ou de la nucleoside diphosphokinase dans un vecteur d'expression eucaryote
Cet exemple décrit un mode particulier de réalisation de l'invention, utilisant un système de vecteur d'expression plasmidique pour produire in situ les combinaisons d'enzymes de l'invention.
L'expression de gènes procaryotes ou eucaryotes dans les cellules mammifères est connue de l'homme du métier. Pour optimiser cette expression, les vecteurs de l'invention décrit ci-apres comportent les signaux suivants i) un promoteur/ enhanceur tel que le promoteur CMV qui est bien exprimé dans les cellules humaines; ii) une séquence de Kozak, dont le consensus est (G/A)NNAUG(G/A); iii) le gène à exprimer; suivi iv) d'une séquence de polyadénylation (V. Chisholm 1995 DNA cloning Vol.4, éd. D. Glover et B. Hames pi). De telles constructions sont possibles à l'aide de vecteurs commerciaux tels que les vecteurs pZeoSV, pcDNA3... et ont été réalisées avec les gènes codant pour HSVl-TK, GMPK et NDK de S. cerevisae.
2.1 - Vecteur d'expression de HSVl-TK
Le gène HSVl-TK codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1, issu du plasmide pHSV-106 (Gibco-BRL) a été clone dans le vecteur d'expression eucaryote pcDNA3 (Invitrogen). Ce plasmide pcDNA3-TK de 6936 bp a été construit en introduisant l'insert EcoRI-Notl de 1,5 kb provenant de pBTKl entre les sites EcoRI et Notl du pcDNA3, voir figurel. Le plasmide pBTKl a été obtenue de la manière suivante : Après avoir rendu les extrémités franches, l'insert BglII-NcoI de 1,5 kb provenant de pHSV-106 et contenant le gène HSVl-TK, dont la séquence est publiée par McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5931, a été clone au site Smal du pBSK.
L'insert du plasmide pcDNA3-TK contient i) 60 bp en amont du gène HSVl-TK comprenant la séquence Kozak (CGTATGG), ii) la séquence du gène (1,13 kb) qui est identique à celle publiée par McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5931, iii) la séquence 3' au gène (0,3 kb) qui est décrite aussi par McKnight.
2.2 - Vecteur d'expression de la guanylate kinase
Le gène GUKl de 561 pb codant pour la guanylate kinase de S. cerevisae issu de pGUK-1 (voir exemple 3), a été clone dans le vecteur d'expression eucaryote pcDNA3 (Invitrogen) après avoir introduit un consensus Kozak. Ce plasmide pXL2854 a été obtenu de la façon suivante. L'insert Xbal-BamHI du pGUK-1 contenant le gène GUKl a été clone dans le plasmide pSL301 (Invitrogen) entre les sites Xbal-BamHI de telle sorte que le gène GUKl peut alors être excisé par les enzymes HindIII et BamHI et être doné entre les sites HindIII et BamHI du pcDNA3 pour générer un plasmide pcDNA3-GUKl. Entre les sites HindIII et PflMI de ce plasmide est clone un fragment HindHI-PflMI de 150 bp contenant un consensus Kozak et la région 5' de GUKl pour former le plasmide pXL2854 de 6001 pb voir figure 2. Le fragment HindHI-PflMI de 150 bp a été isolé à partir d'un fragment de 280 bp amplifié par PCR à l'aide du plasmide pGUK-1 et des oligonucléotides sens 6915 5'(GAG AAG CTT GCC ATG GCC CGT CCT ATC GTA A)3' (SEQ ID n. 1) et antisens 6916 5' (GAG GAT CCG TTT GAC GGA AGC GAC AGT A)3' (SEQ ID n.2), l'hybridation ayant lieu à 45°C (le consensus Kozak étant souligné sur l'oligonucléotide 6915). La séquence nucléique amplifiée par PCR a été séquencée et présente deux différences par rapport à la séquence publiée (M. Konrad 1992 J. Biol. Chem. 267 p25652) correspondant aux changements S2A (Serine en position 2 remplacée par une alanine) et V34A (Valine en position 34 remplacée par une alanine).
2.3 - Vecteur d'expression de la nucleoside diphosphokinase
Le gène YNK codant pour la nucleoside diphosphokinase de S. cerevisae. issu du plasmide pADl-YNK (K. Watanabe et coll. 1993 Gène 29 pl41), a été clone dans le vecteur d'expression eucaryote pcDNA3 (Invitrogen) après avoir introduit un consensus Kozak. Ce plasmide pXL2967 a été obtenu de la façon suivante. Une amplification par PCR a été effectuée avec le plasmide pADl-YNK pour matrice et les oligonucléotides sens 7017 5'(AAG GAT CCA CCA TGG CTA GTC AAA CAG AAA)3' (SEQ ID n. 3.) et antisens 7038 5' (AAG AAT TCA GAT CTT CAT TCA TAA ATC CA)3' (SEQ ID n. 4) à la température d'hybridation de 40°C (le consensus Kozak étant souligné sur l'oligonucléotide 7017). Le fragment amplifié de 477 bp est digéré par BamHI et EçoRI puis clone entre les sites BamHI et EcoRI du pcDNA3 pour générer le plasmide pXL2967 de 5861 pb, voir figure 3. La séquence du fragment amplifié par PCR est la même que celle publiée pour le gène YNK sauf à la position 4 ce qui correspond à un changement S2A S2A (Serine en position 2 remplacée par une alanine) pour la protéine NDPK (K. Watanabe et coll. 1993 Gène 29 pl41).
2.4 - Vecteur pour la co-expression de 2 genes
La coexpression de genes peut être réalisée de plusieurs façons connues de l'homme du métier. Une mode de mise en oeuvre préfère consiste a introduire, entre les séquences a exprimer, des sites internes d'entrée des ribosomes, séquences IRES (Mountford ét al., TIG 11 (1995) 179). Une séquence IRES et le gène YNK sont introduits en 3' du gène GUKl clone dans pcDNA3 pour générer un vecteur permettant la co-expression de GUKl et YNK, sous forme d'une unité bicistronique (vecteur pGUKl-YNK). Plus précisément, la séquence de TIRES (internai ribosome entry site) de l'EMCV (encephalomyocartis virus) provenant du plasmide pCITE (Novagen) a été reclonée par PCR entre des sites EcoRI et Ncol et introduite aux sites EcoRI et EcoRV du plasmide pBluescript (Stratagene) pour générer le plasmide pXL3065. Le fragment NcoI-EcoRV de 477 bp contenant le gène YNK issu du plasmide pXL2967 est clone entre les sites Ncol et EcoRV du pXL3065 pour former le plasmide pXL3079. Le fragment BamHI-EcoRV de 1 kb contenant l'IRES et le gène YNK du plasmide pXL3079 est alors clone entre les sites BamHI et EcoRV du plasmide pXL2854 pour générer le plasmide pXL3081. Ce plasmide contient les promoteurs CMV et T7 en amont du gène GUKl codant pour la guanylate kinase de S. cerevisae lui même suivi par TIRES et le gène YNK codant pour la nucleoside diphosphokinase de S. cerevisae voir figure 4. L'expression des protéines GMPK et NDPK a été testée à l'aide des plasmides pXL2854, pXL2967 et pXL3081 dans un système de transcription/ traduction de réticulocytes provenant de Promega, voir figure 5 . Les résultats obtenus montrent que les protéines GMPK et NDPK sont coexprimées avec le plasmide pXL3081.
La même approche est utilisée pour générer un vecteur coexprimant la TK et la YNK (vecteur pTK-YNK). ou la TK et la GUKl (vecteur pTK-GUKl).
2.5 - Vecteur pour la co-expression de 3 genes
La séquence codant pour la TK est insérée dans le vecteur pGUKl-YNK de l'exemple 2.4 ci-dessus pour générer un vecteur capable d'exprimer les 3 activités enzymatiques (vecteur pTK-GUKl-YNK).
2.6 - Vecteur pour l'expression d'une fusion HSVl-TK/S.cerevisiae GMPK
La construction de protéine fusion est bien connue de l'homme de l'art et se réalise par la création d'un linker peptidique entre la partie C-terminale d'une protéine et la partie N-terminale de l'autre protéine (1989 Nature 339 p394). Une telle protéine permet la co-localisation cellulaire des enzymes et peut aussi favoriser le "tunnelage" de substrat (Ljungcrantz et coll. 1989 Biochemistry 28 p8786). Une protéine fusion a été réalisée en reliant à l'aide du linker -(Gly)4-Ser-
(Gly)4-Ser-(Gly)4 (SEQ ID n° 9) la séquence C-terminale de la HSVl-TK (Asn376) et la séquence N-terminale de la GMPK de S. cerevisiae (Ser2). Le plasmide pXL3098 permettant la production de cette protéine fusion a été construit de la façon suivante. La séquence 3' du gène HSVl-TK (positions 1108 à 1128) a été clonée par hybridation des oligonucléotides sens 5'(CCG GGA GAT GGG GGA GGC TAA CGG AGG TGG CGG TTC TGG TGG CGG AGG CTC CG)3' (SEQ ID n° 5) et antisens 5' (GAT CCG GAG CCT CCG CCA CCA GAA CCG CCA CCT CCG TTA GCC TCC CCC ATC TC)3' (SEQ ID n° 6), de telle sorte que le codon Asn du gène HSVl-TK (position 1128 bp) est suivi des codons codant pour les acides aminés ((Gly)4Ser)2Gly. Le fragment de 58 bp est ainsi clone entre les sites Xmal et BamHI du pNEB193 (Biolabs) pour générer le plasmide pTKL+. La séquence 5' du gène GUKl de S. cerevisiae est amplifiée par PCR à l'aide de la matrice pXL2854 et des oligonucléotides sens 5'(GAG AAT TCC GGA GGC GGT GGC TCC CGT CCT ATC GTA)3' (SEQ ID n° 7) et antisens 5' (GAG GAT CCG TTT GAC GGA AGC GAC AGT A)3' (SEQ ID n° 8), de telle sorte que le codon Ser à la position 2 de la GMPK est précédé des codons (Gly)3Ser. Ce fragment de 0,27 kb est clone entre les sites BamHI et EcoRI du pUC19 (Biolabs) pour former un plasmide qui est alors coupé par PflMI et BamHI afin d' y introduire le fragment PflMI-BamHI de 0,44 kb du pXL2854 contenant la séquence 3' de GUKl. et générer le plasmide pGUKL-. Le fragment BspEI-Xbal de 0,58 kb du pGUKL- est inséré entre les sites BspEI et Xbal du pTKL+ pour créer pTKLGUK. L'insert Xmal-BamHl de 0,63 kb du pTKLGUK est alors clone entre les sites Xmal et BamHI du vecteur d'expression pETlla, pour former le plasmide pXL3098, voir figure 6. Ce plasmide est alors introduit dans la souche BL21DE3met- et conduit à la production de la protéine TK- ((Gly)4Ser)3-GMPK.
La protéine fusion est alors purifiée jusqu'à homogénéité et les paramètres cinétiques de phosphorylation du GCV et de TACV de cette enzyme sont comparés aux paramètres cinétiques obtenus avec les protéines HSVl-TK et GMPK de S. cerevisiae. 2.7 - Transfert et expression in vivo
Les vecteurs décrits dans les exemples 2.1 a 2.6 sont utilisés pour le transfert et l'expression in vivo de combinaisons d'enzymes selon l'invention. Dans ce but, différentes compositions comprenant lesdits vecteurs sont préparées :
- une composition comprenant le vecteur pcDNA3-TK, le vecteur pXL2854 et la
Lipofectamine,
- une composition comprenant le vecteur pcDNA3-TK, le vecteur pXL2967et la Lipofectamine,
- une composition comprenant le vecteur pcDNA3-TK, le vecteur pXL2854, le vecteur pXL2967 et la Lipofectamine
- une composition comprenant le vecteur pTK-GUKl et la Lipofectamine, éventuellement en combinaison avec le vecteur pXL2967,
- une composition comprenant le vecteur pTK-YNK et la Lipofectamine, éventuellement en combinaison avec le vecteur pXL2854, et,
- une composition comprenant le vecteur pTK-GUKl-YNK et la Lipofectamine
La Lipofectamine peut être remplacée par un autre vecteur chimique tel que décrit dans l'exemple 1.3.
Ces différentes compositions sont utilisées in vivo ou ex vivo pour le transfert et l'expression intracellulaires de combinaisons d'enzymes selon l'invention. Elles peuvent également être utilisées sur cultures cellulaires, et par exemple sur cultures de cellules de fibroblastes NIH3T3 ou de cellules de carcinome humain du colon, HCT116. Apres transfert des vecteurs, l'analogue de nucleoside est administre et la destruction cellulaire est mise en évidence.
EXEMPLE 3 - Purification de la guanylate kinase
Les extraits acellulaires des souches de E. coli surexprimant la GMPK de S. cerevisae peuvent être préparés de diverses façons, parmi lesquelles on peut citer, la lyse au lysozyme en présence d'EDTA, l'utilisation d'appareils de broyage de type Menton-Golin, French Press, X-Press, ou l'action des ultrasons. Plus particulièrement, les extraits acellulaires des souches de L\ coli surexprimant la GMPK de S. cerevisae ont été préparés de la façon suivante :
La souche de E. coli BL21 (DE3) pGUK-1 est cultivée comme cela est décrit par M. Konrad dans J. Biol. Chem. 267 p25652 en 1992. Après centrifugation (5000 x g ; 20min), les cellules obtenues à partir de 1 1 de culture sont resuspendues dans 20 ml de tampon Tris/HCl 20mM pH 7.5, contenant ImM EDTA et soniquées durant 4 min à 4°C. Après centrifigation (50 000 x g ; Ih) le surnageant est injecté sur une colonne MONO Q HR 10/10 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon Tris/HCl 20 mM pH 7.5. Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de 0 à 500 mM NaCl dans le tampon Tris/HCl 20mM pH 7.5. Les fractions contenant l'activité GMPK sont regroupées et concentrées, puis chromatographiées sur une colonne de Superdex 75 HR16/10 (Pharmacia) éluée par du tampon Tris/HCl 50mM pH 7.5, 150 mM NaCl. Les fractions contenant l'activité GuK sont regroupées. Après cette étape la préparation présente une seule bande visible en SDS-PAGE, après révélation au Bleu de Coomassie, et cette bande migre avec un poids moléculaire apparent de 21 000 environ.
L'activité de la GMPK est classiquement dosée en utilisant un protocole de dosage décrit dans la littérature, Agarwal et coll. 1978 Meth. Enzymol. vol.LI p 483. EXEMPLE 4 - Détermination des constantes cinétiques de la guanylate kinase de S. cerevisae.
Les constantes cinétiques de la GMP kinase de levure purifiée comme décrit à l'exemple 3 sont déterminées dans les conditions de dosage enzymatique suivantes:
La GMP kinase de levure est incubée durant 10 min à 30°C dans 100 μl de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7,8 contenant 4 mM ATP, 10 mM Mg C12, 100 mM KC1, 1 mg/ml BSA (albumine bovine sérique) et 5-100 μM [8-3H]GCVMP (40 nCi/nmol) ou 200-3200 μM [8-3HJACVMP (40 nCi/nmol). La réaction est stoppée par chauffage du mélange reactionnel durant 3 min à 80°C, 50 μl de tampon 10 mM phosphate de potassium pH 3,5 sont ajoutés, et après centrifugation durant 2 min à 10 000 x g , 100 μl de surnageant sont analysés par chromatographie liquide haute pression (CLHP) dans le système suivant:
Phase stationnaire: Partisphère SAX (WHATMAN) - diamètre des particules : 5μm - Dimensions : 4,6 x 125 mm.
Phase mobile:
Tampon A: KH2PO40,01 M pH3,5 (ajusté à l'aide de H3PO4 concentré)
Tampon B: KH2PO40,75 M ρH3,5 (ajusté à l'aide de H3PO4 concentré)
Débit: lml/min
Gradient:
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
Détection:
UV: 265 nm
Radiochimique: détection du tritium
débit du scintillant (Optisafe 1 de Berthold) 1ml/ min
our le calcul des constantes cinétiques, la quantité de GMP kinase de levure introduite dans la réaction enzymatique est ajustée de façon à transformer au maximum 10% du substrat introduit au départ. Les courbes de Michaelis sont ajustées aux points expérimentaux à l'aide du logiciel Grafit (Sigma). Les résultats sont présentes dans le Tableau 1. Ils montrent que la GMP kinase de levure est capable de phosphoryler le GCVMP et TACVMP. De plus, elle présente une vitesse de phosphorylation du GCVMP 2 fois supérieure à Tenzyme humaine. De même, son affinité pour le GCVMP est supérieure d'un facteur au moins égal à 2 à l'affinité que présente Tenzyme humaine pour ce substrat. Au total, la valeur du Vmax/Km de Tenzyme de levure pour le GCVMP est 4,4 fois supérieure à la valeur que présente Tenzyme humaine. Pour des substrats entrant en compétition, la constante Vmax/Km détermine la spécificité de Tenzyme vis à vis de ces substrats. Elle est connue sous le nom de " specificity constant " [A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 1985, W. H. Fréeman an Co., London].
De la même manière, la GMP kinase de levure présente un capacité à phosphoryler TACVMP très supérieure à Tenzyme humaine. La valeur du Vmax/Km de Tenzyme de levure pour TACVMP est 7 a 9 fois supérieure à la valeur que présente Tenzyme humaine pour ce substrat.
EXEMPLE 5 - Couplage des activité enzvmatiques TK. GMPK et NDK :
Dans un mode préférentiel de couplage, l'incubation est effectuée dans 100 μl de tampon Tris/HCl 50mM pH 7.8, contenant lmg/ml de BSA (albumine sérique bovine), 5mM ATP, 4mM MgC12, 12mM KCl, 2mM DTT, 600μM EDTA, lOOμM [8- 3H]-GCV (40nCi/nmol) ou lOOμM [2-3H]-ACV 40nCi/nmol et différentes quantités de TK, GuK et NDPK (Cf Tableau 2). Les NDPK de 3 organismes ont été utilisées (enzymes commercialisées par SIGMA), comme indiqué dans le tableau 2.
Le couplage des enzymes HSVl-TK et GMPK de S. cerevisae permet une phosphorylation à 90% du ganciclovir en ganciclovir diphosphate. Et la nucleoside diphosphokinase de levure de boulanger, c'est-à-dire de S. cerevisae. couplée aux enzymes HSVl-TK et GMPK, permet la phosphorylation en ganciclovir triphosphate avec une meilleure activité que ne le permet la nucleoside diphosphokinase humaine d'érythrocytes. Des résultats comparables sont obtenus avec l'acyclovir. Ces résultats démontrent clairement (a) que la combinaison d'enzymes selon l'invention apporte une amélioration significative de la phosphorylation, indiquant que la seule modification de la TK ne pourrait suffire pour améliorer les propriétés du système, (b) que le système de l'invention permet d'augmenter l'efficacité de traitement par gène suicide TK (c) que certaines enzymes non-humaines possèdent une meilleure activité pour les analogues de nucléosides, rendant leur utilisation particulièrement avantageuse.
EXEMPLE 6 - Purification de la protéine de fusion HSVl-TK/ S.cerevisiaeGMPK
Les extraits acellulaires des souches de E. çoH surexprimant la protéine de fusion peuvent être préparés de diverses façon, parmi lesquelles on peut citer, la lyse au lysozyme en présence d'EDTA, l'utilisation d'appareils de broyage de type Menton- Golin, French Press, X-Press, ou l'action des ultrasons. Plus particulièrement, les extraits acellulaires des souches de E. coli surexprimant la protéine de fusion ont été préparés de la façon suivante:
La souche de E. coli BL21 DE3 pXL3098 est cultivée en milieu LB. Après centrifugation (5000xg; 20min), les cellules obtenues à partir de 11 de culture sont resuspendues dans 20ml de tampon A:Tris/HCl 50mM pH 7.8, contenant DTT 5mM, MgCl2 4mM, Glycérol 10% (v/v), Benzamidine 2mM, E64 50μl/l (solution à lOOμg/1 N-[N-(L-3-trûπs-carboxyoxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]-4-aminobutylgua nidine, Péfabloc 0,2mM, STI (Soybeam trypsin inhibitor), Leupeptin 2mg/ml, et soniquées durant 4min à 4°C. Après centrifigation (50000xg; lh) le surnageant est injecté sur une colonne MONO Q HR 10/10 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon A. Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de 0 à 400 mM NaCl dans le tamponTris/HCl 20mM pH 7.5. Les fractions contenant l'activité TK et GMPK sont regroupées et concentrées puis chromatographiées sur une colonne de Superdex 200 HILoad 26/60 (Pharmacia) éluée par du tampon A contenant 150mM de NaCl.Les fractions contenant l'activité TK et GMPK sont regroupées. A cette étape la préparation présente une seule bande visible en SDS-PAGE, après révélation au Bleu de Coomassie, et cette bande migre avec un poids moléculaire apparent de 61000 environ. EXEMPLE 7 - Etude de phosphorylation par la fusion HSV1-TK/GMPK
Cet exemple décrit une étude des paramètres cinétiques de phosphorylation du GCV et de TACV de la fusion, comparée aux paramètres cinétiques obtenus avec les protéines HSVl-TK et GMPK de S. cerevisiae.
7.1. Dosage de l'activité TK
L'activité de la TK est dosée comme suit: un extrait enzymatique contenant environ 0,1 unité de TK est incubé durant 15min à 37°C dans lOOμl de tampon Tris/HCl 50 mm pH 7,8 contenant lmg/ml de BSA (albumine bovine sérique), 5mM ATP, 4mM MgC12, 12mM Kcl, 2mM DTT, 600μM EDTA et lOOμM de GCV + [8-3H]-GCV 40nCi/nmol. La réaction est arrêtée par l'ajout de lOμl de tampon Tris/HCl 50mM pH 7,8 contenant ImM de thymidine non radioactive. Les espèces phosphorylées sont fixées sur une colonne de DEAE sephadex (400μl de gel) puis, après lavage de la colonne, ces espèces sont éluées par 2ml d'HCl 1M. La radioactivité dans l'échantillon est ensuite comptée par scintillation liquide.
7.2. Dosage de l'activité GMPK
L'activité de la GMPK est classiquement dosée en utilisant un protocole de dosage décrit dans la littérature, K.C.Agarwal et al. (Methods In Enzymology (1978) Vol. LI 483-490).
7.3. Dosage de l'activité de la protéine de fusion et de la co-incubation des enzymes TK et GMPK
La capacité de la protéine de fusion TK-GMPK à transformer le GCV ou TACV en GCVDP ou ACVDP par rapport à un mélange synthétique de TK et de GMPK est déterminée de la façon suivante: L'incubation a lieu dans 200μl de tampon Tris/HCl 50mM pH 7.8 contenant lmg/ml de BSA (sérum albumine bovine), 5mM ATP, 4mM MgC12, 12m MKC1, 2mM DTT, 600μM EDTA, 1 àlOOμM de GCV+[8-3H]GCV (40nCi/nmol) ou 1 à lOOμM d'ACV+[2-3H] ACV 40nCi/nmol et de différentes quantités de TK, GMPK et les quantités équivalentes en protéine de fusion. La réaction est arrêtée en chauffant 3min à 80°C, après centrifugation lOOμl d'incubat sont analysés dans le système suivant:
Phase stationna ire: Partisphère SAX (WHATMAN) - diamètre des particules : 5μm.
Dimensions : 4,6 x 125 mm.
Phase mobile:
Tampon A: KH2PO40,01 M pH3,5 (ajusté à l'aide de H3PO4 concentré) Tampon B: KH2PO40,75 M pH3,5 (ajusté à l'aide de H3PO4 concentré)
Débit: 1ml/ min
Gradient:
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Détection:
UV: 265 nm
Radiochimiquc: détection du tritium débit du scintillant (Optisafe 1 de Berthold) 1ml /min
Le couplage et la combinaison des enzymes HSVl-TK et GMPK de S. cerevisiae permettent la phosphorylation du ganciclovir en ganciclovir diphosphate (voir tableau 3). Des résultats comparables sont obtenus avec l'acyclovir (voir tableau 3).
Ces résultats montrent clairement que la protéine de fusion TK-GMPK conserve les propriétés des deux enzymes originales. De plus, suivant les conditions opératoires, la protéine de fusion TK-GMPK apporte une amélioration significative de la phosphorylation a) allant jusqu'à un facteur 1,8, pour le GCV b) allant jusqu'à'un facteur 1,2 pour TACV par rapport à la coincubation des enzymes TK sauvage et GMPK.
La protéine de fusion permet in vivo une colocalisation des activités enzymatiques dans la cellule, les enzymes séparées se répartissant , dans le noyau pour THSVl-TK et dans le cytosol pour la GMPK. Cette construction permet donc d'augmenter l'efficacité de traitements par gène suicide.
L'ensemble de ces résultats démontre clairement Tinteret thérapeutique de la présente invention, permettant a la fois de diminuer les doses de nucleoside et d'enzymes et d'obtenir un bénéfice pharmacologique important.
LISTE DE SEQUENCES
(1 ) INFORMATIONS GENERALES:
(α) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron
(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: 01.55.71.70.36 (H) TELECOPIE: (01.55.71.72.91 (ii) TITRE DE L' INVENTION: COMBINAISONS D'ENZYMES POUR LA DESTRUCTION DE CELLULES PROLIFERATIVES
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 9 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GAGAAGCTTG CCATGGCCCG TCCTATCGTA A 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 28 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GAGGATCCGT TTGACGGAAG CGACAGTA 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (n) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: AAGGATCCAC CATGGCTAGT CAAACAGAAA 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: AAGAATTCAG ATCTTCATTC ATAAATCCA 29
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 53 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CCGGGAGATG GGGGAGGCTA ACGGAGGTGG CGGTTCTGGT GGCGGAGGCT CCG 53
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 53 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (11) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: GATCCGGAGC CTCCGCCACC AGAACCGCCA CCTCCGTTAG CCTCCCCCAT CTC 53
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: GAGAATTCCG GAGGCGGTGG CTCCCGTCCT ATCGTA 36
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (n) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: GAGGATCCGT TTGACGGAAG CGACAGTA 28
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 acides aminés
(B) TYPE: acides aminés (D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE:peptιde
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 VO
Tableau 1 - CONSTANTES CINETIQUES DES GUANYLATE KINASES DE LEVURE tΛ o ET D'ERYTHROCYTES HUMAINS POUR LE GCVMP et l'ACVMP
ro
Figure imgf000054_0001
π
H
VO
Os
Tableau 2 - COUPLAGE TK-GMPK-NDPK : % PAR NI DES PRODUITS FORMES
Figure imgf000055_0001
vo
Figure imgf000055_0002
Tableau 3: Phosphorylation du GCV et de l'ACV par le couplage ou la combinaison des enzymes TK et GMPK
(Λ
O
*-
Figure imgf000056_0001
4>
t
Figure imgf000056_0002
n H
""pmmol de GCVDP formées 73

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pour la délivrance et la production in vivo d'une combinaison d'enzymes, comprenant:
- un premier acide nucléique codant pour une enzyme capable de phosphoryler un analogue de nucleoside, pour générer un analogue monophosphate,
- un deuxième acide nucléique codant pour une enzyme capable de phosphoryler ledit analogue monophosphate, pour générer un analogue diphosphate, et,
- un troisième acide nucléique codant pour une enzyme capable de phosphoryler ledit analogue diphosphate, pour générer un analogue triphosphate toxique.
2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que le premier acide nucléique code pour une thymidine kinase.
3. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que le deuxième acide nucléique code pour une guanylate kinase.
4. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que le troisième acide nucléique code pour une nucleoside diphosphate kinase.
5. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les acides nucléiques sont portes par un même vecteur.
6. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les acides nucléiques sont portes par plusieurs vecteurs.
7. Composition selon la revendication 5 ou 6 caractérisée en ce que les vecteurs sont des vecteurs plasmidiques ou viraux.
8. Composition comprenant un acide nucléique codant pour une thymidine kinase et un second acide nucléique codant pour une nucleoside diphosphate kinase.
9. Composition selon la revendication 8 caractérisée en ce que la nucleoside diphosphate kinase est d'origine eucaryote non-humaine.
10. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce que la nucleoside diphosphate kinase est choisie parmi la NDPK de levure ou de boeuf.
11. Composition selon la revendication 10 caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour la thymidine kinase et l'acide nucléique codant pour la nucleoside diphosphate kinase sont couplés et codent pour une protéine portant à la fois les activités TK et NDPK.
12. Composition selon la revendication 8 comprenant en outre un acide nucléique codant pour une guanylate kinase.
13. Composition selon la revendication 12 caractérisée en ce que l'acide nucléique code pour une guanylate kinase de levure.
14. Composition comprenant un acide nucléique codant pour une thymidine kinase et un second acide nucléique codant pour une guanylate kinase non humaine.
15. Composition selon la revendication 14 caractérisée en ce que la guanylate kinase est d'origine levure.
16. Composition selon la revendication 15 caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour la thymidine kinase et l'acide nucléique codant pour la guanylate kinase sont couplés et codent pour une protéine portant à la fois les activités TK et GUK.
17. Composition selon l'une des revendications 1 a 16 caractérisée en ce que la thymidine kinase est d'origine virale.
18. Vecteur comprenant:
- un premier acide nucléique codant pour une thymidine kinase, et,
- un deuxième acide nucléique codant pour une guanylate kinase non- humaine.
19. Vecteur comprenant:
- un premier acide nucléique codant pour une thymidine kinase, et,
- un deuxième acide nucléique codant pour une nucleoside diphosphate kinase.
20. Vecteur selon la revendication 19 caractérise en ce que la nucleoside diphosphate kinase est d'origine eucaryote non-humaine, de préférence bovine ou levure.
21. Vecteur selon la revendication 19 ou 20 caractérise en ce qu'il comprend en outre un acide nucléique codant pour une guanylate kinase.
22. Vecteur selon l'une des revendications 18 a 21 caractérise en ce que la thymidine kinase est d'origine virale.
23. Vecteur selon les revendications 18 a 22 caractérise en ce que les différents acides nucléiques sont places sous le contrôle de promoteurs disctincts.
24. Vecteur selon les revendications 18 a 22 caractérise en ce que les différents acides nucléiques forment une unité polycistronique sous le contrôle d'un promoteur unique.
25. Vecteur selon les revendications 18, 22 et 24 comprenant un premier acide nucléique codant pour une thymidine kinase d'origine virale et un deuxième acide nucléique codant pour une guanylate kinase non-humaine, lesdits acides nucléiques étant couplés et codant pour une protéine portant à la fois l'activitÈ TK et GUK.
26. Vecteur selon les revendications 18 a 25 caractérise en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique ou viral.
27. Composition comprenant
. une combinaison d'enzymes capables de triphosphoryler un analogue de nucleoside, et
. ledit analogue de nucleoside,
en vue d'une administration simultanée, séparée, ou étalée dans le temps.
28. Composition pour la production in vivo d'un analogue de nucleoside triphosphate comprenant, conditionnes séparément ou ensemble : - un analogue de nucleoside
- un acide nucléique codant pour une thymidine kinase
- un acide nucléique codant pour une guanylate kinase, et,
- un acide nucléique codant pour une nucleoside diphosphate kinase.
29. Composition pour la production in vivo d'un analogue de nucleoside triphosphate comprenant, conditionnes séparément ou ensemble :
- un analogue de nucleoside
- un acide nucléique codant pour une thymidine kinase, et
- un acide nucléique codant pour une nucleoside diphosphate kinase.
30. Composition selon les revendications 27 a 29 caractérisée en ce que l'analogue de nucleoside est un analogue de guanosine.
31. Composition selon la revendication 30 caractérisée en ce que l'analogue de guanosine est choisi parmi le ganciclovir, l'acyclovir et le penciclovir.
32. Composition comprenant une combinaison d'enzymes impliquées dans la phosphorylation de nucléosides, l'une au moins de ces enzymes étant d'origine eucaryote non-humaine.
33. Méthode pour la destruction de cellules proliferatives comprenant l'administration auxdites cellules d'une combinaison d'enzymes comprenant une TK et une NDPK et d'un analogue de nucleoside.
34. Méthode selon la revendication 33 caractérisée en ce que la combinaison comprend en outre une guanylate kinase.
35. Méthode pour la destruction de cellules proliferatives comprenant l'administration auxdites cellules d'une combinaison d'enzymes comprenant une TK et une GMPK non-humaine et d'un analogue de nucleoside.
36. Méthode selon les revendications 33 a 35 caractérisée en ce que l'analogue de nucleoside est un analogue de guanosine.
37. Méthode selon la revendication 36 caractérisée en ce que l'analogue de guanosine est choisi parmi le ganciclovir, lacyclovir et le penciclovir.
38. Méthode selon les revendications 33 a 37 caractérisée en ce que les enzymes sont administrées aux cellules par administration d'acides nucléiques codant pour lesdites enzymes.
39. Procède de triphosphorylation d'un analogue de nucleoside comprenant la mise en présence dudit analogue avec une combinaison d'enzymes, l'une au moins d'entre elles étant d'origine levure.
40. Utilisation de la nucleoside diphosphate kinase ou d'un acide nucléique codant pour celle-ci, en combinaison avec une thymidine kinase ou un acide nucléique codant pour une thymidine kinase et un analogue de nucleoside, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée a la destruction des cellules proliferatives.
41. Acide nucléique codant pour une protéine de couplage entre une thymidine kinase d'origine virale et une guanylate kinase.
42. Acide nucléique selon la revendication 41 caractérisé en ce que la guanylate kinase est d'origine levure.
43. Acide nucléique codant pour une protéine de couplage entre une thymidine kinase d'origine virale et une nucleoside diphosphate kinase.
44. Protéine codée par un acide nucléique selon les revendications 41 à 43.
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