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WO1997035970A1 - Oligonucleotides utilises pour detecter vibrio parahaemolyticus et procede de detection - Google Patents

Oligonucleotides utilises pour detecter vibrio parahaemolyticus et procede de detection Download PDF

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Publication number
WO1997035970A1
WO1997035970A1 PCT/JP1997/000991 JP9700991W WO9735970A1 WO 1997035970 A1 WO1997035970 A1 WO 1997035970A1 JP 9700991 W JP9700991 W JP 9700991W WO 9735970 A1 WO9735970 A1 WO 9735970A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vibrio
nucleic acid
vibrio parahaemolyticus
sequence
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/000991
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Venkateswaran Kasthuri
Nobuhiko Doumoto
Original Assignee
Nippon Suisan Kaisha, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Suisan Kaisha, Ltd. filed Critical Nippon Suisan Kaisha, Ltd.
Priority to EP97907459A priority Critical patent/EP0965636A4/en
Priority to US09/155,200 priority patent/US6048697A/en
Publication of WO1997035970A1 publication Critical patent/WO1997035970A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide primer for widening a nucleic acid target sequence characteristic of Vibrio parahaemolyticus (hereinafter sometimes abbreviated as "VP").
  • the present invention provides a method for the production of Vibrio parahaemolyticus by polymerase chain reaction (PCR) using a ply specific to a DNA gyrase B subunit (hereinafter, referred to as gyr BJ) specific to a DNA jyrase subunit B gene. About the detection method.
  • Vibrio parahaemolyticus is known as a food poisoning bacterium in many countries. It is also found in parts other than the intestinal tract and in postoperative scars. Vibrio parahaemolyticus is a gram-negative polymorphic rod-shaped bacterium, which is a halophilic facultative anaerobic bacterium that produces gas by fermenting carbohydrates. A dark blue mouth is formed on a thiosulfate monoquat-monobile salt-sugar (TCBS) agar medium.
  • TCBS thiosulfate monoquat-monobile salt-sugar
  • Vibrio parahaemolyticus is indistinguishable from Vibrio alginolyticus and Vibrio harveyi. There was only a time-consuming method to identify Vibrio alginolyticus. Vibrio consists of 37 species. All are derived from aqueous environments. According to the phylogenetic data of rRNA, known as V. anguillarum, V. ordalli, and V. darase 1a® have been transferred to newly established Listonel la ⁇ and Ph. tobacterium ⁇ . Ten species are associated with gastroenteritis, wound infection, and human sepsis, and seven are known to be pathogenic to fish.
  • Vibrio parahaemolyticus usually inhabits estuarine and marine environments, and is often isolated from seawater and seafood during summer. To isolate and identify Vibrio parahaemolyticus, the sample is inoculated on a selective medium such as bromothymolbluc-teepol agar or TCBS agar, and a bluish-green colony is isolated and examined for its biochemical properties. Unfortunately, many Vibrio species respond in a similar manner, and further identification requires more detailed biochemical tests. Examining the wide range of biochemical properties of a large number of isolated strains requires a lot of effort, time and expense ( serologic identification of Vibrio parahaemolyticus shows cross-reactivity with other Vibrio strains.
  • a DNA probe has been developed to identify Vibrio species from V. cholerae 01 by using a DNA probe that can specifically identify this strain by expanding the cholera beron from V. cholerae 01. Cholera that produces toxins ⁇ Interacts with other Vibrio 3 ⁇ 4 Optical label ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (Wright, ⁇ . C. et al., Appl. Environ. Microbiol. 59: 541-546, 1993), as well as a portion of the V. vulnificus cytolysin gene (h1yA) sequence.
  • a covalently labeled oligonucleotide DNA probe was generated from these probes, which did not react with non-toxic V. vulnificus and therefore did not detect all V. vulnificus .
  • TDH virulence factor
  • TRH virulence factor
  • An object of the present invention is to provide a detection method capable of distinguishing Vibrio parahaemolyticus from other 36 Vibrio species.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for detecting a 285-bp gyrB ⁇ gene fragment unique to Vibrio parahaemolyticus from bacterial cells by a PCR method without the need for DNA extraction or other procedures using a Vibrio parahaemolyticus-specific primer .
  • the present invention provides an oligonucleotide primer for the widening of 61 columns of nucleic acid targets characteristic of Vibrio parahaemolyticus. . Sequence numbers 5 and 6 are exemplified as these primers, and they are characteristic of the osteomyelitis biburi as a primer set. Used for the detection of a specific acid target sequence.
  • the frimmerset is used in a method for determining the presence or absence of a nucleic acid target sequence characteristic of Vibrio parahaemolyticus. )]
  • Vibrio parahaemolyticus-specific primers can be detected by the PCR method using Vibrio parahaemolyticus-specific primers.
  • a “primer” is a synthetic or biologically produced oligonucleotide that contains a specific nucleotide sequence that allows hybridization to a section of the target nucleic acid sequence. It is.
  • Primers can be transcribed by polymerase or similar enzymes to replicate the complete target nucleic acid sequence.
  • Primers are used in nucleic acid sequence amplification methods, such as the PCR method and strand displacement amplification (SDA).
  • Certain primers especially those that are useful in SDA technology, include sequences that are capable of hybridizing to the target nucleic acid, as well as restriction endonuclease recognition sequences, and polymerases or polymerases.
  • Other enzymes that maintain zeo-like activity themselves contain additional sequences to direct the initiation of their type-specific oligonucleotide synthesis.
  • “hybridization” refers to a specific reaction in which partially or completely complementary nucleic acid strands face each other under predetermined reaction conditions in an antiparallel (antiparallel) manner. This is the step of forming the nucleic acid of the present axe by stable hydrogen bonding.
  • the wood invention relates to an oligonucleotide primer which is useful for determining the presence or absence of a nucleic acid sequence specific to Flammable vibrio. If you want to make a decision like Not only that, it can also be used as a profile for the Southern Hybridization method, which is a conventional technology.
  • the primers of the present invention are unique to the gyrB subunit h sequence of Vibrio parahaemolyticus.
  • the probe is specific for an internal consensus sequence within the primer spread product.
  • the present inventors use a gyr B vector encoding a B subunit protein of DNA gyrase (Topoisomerase) as a highly specific probe to solve the above-mentioned problem of the prior art.
  • the method was examined. There has been recently reported a method for detecting and classifying Pseudomonas putida with a universal primer that directly sequences the gyrBit gene. Using these universal primers, the yrB gene portions of various Gram-negative and positive bacteria were amplified by PCR. Using the existing primers, the present inventors expanded the 1.2 kb gyrB portion of the 37-pole vibrio. Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 strain of AT. The gyr B nucleotide sequence of) is shown. The present inventors further amplified only the gyrB gene of Vibrio parahaemolyticus and prepared a PCR primer capable of identification.
  • the gyrB gene amplified from Vibrio parahaemolyticus ATCC 1780.2 strain and Vibrio alginoriticus ATCC 17749 strain was recombined by a 71 ⁇ method (Sambrook et al., Molecular cloning Cloning with a suitable vector according to a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 1989).
  • a preferred vector is pGEMzf (+), but any general vector can be appropriately selected and used.
  • Propagation of the probe is also performed by a conventional method (Sambrook et al., 1989).
  • a plasmid is used as a vector, and Escherichia coli is transformed by an effective method such as calcium chloride.
  • the transformed cells are cultured under appropriate conditions.
  • the target gene is collected by dissolving the bacterial cells and purified by the alkaline method. Use the purified plasmid as a sample.
  • a PCR method was used. This method increases the sensitivity of the probe, and thus effectively increases the sensitivity.
  • Oligonucleotide synthesized according to the nucleotide sequence of the probe Reimer not only 3 ⁇ 4 pressurized three sensitivity to amplify the DN A only if the salt 3 ⁇ 4 sequence of interest in the sample ⁇ exists, using specific oligo nucleocapsid click Reochi de based on the nucleotide sequence of the DNA probe By doing so, absolute specificity is obtained.
  • the nucleotide sequences of pVP gyr B and p VA gyr were determined using a DNA sequencer in a conventional manner.
  • the N-terminal and C-terminal portions of the amplified fragment were also used as UP-1S and UP-2S r primers (Yamamoto, Harayama, Appl.
  • This new primer is useful in Atsushi fears (Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988) that ffl existing PCRs.
  • This primer is used to amplify the target DNA in the sample, so that the DNA can be sufficiently detected.
  • the detection stage can be any method that is effective for detecting DNA. For example, agarose gel and m swimming can be used.
  • the i-like DNA functions as a template.
  • the width of the template DNA in the sample is the length of the primer bear.”. This is performed by treating with DNA. By this treatment, a sequence complementary to each nucleic acid sequence is extended. The extended and generated sequence further functions as a primer template.
  • This process involves denaturation of DNA, annealing of the primer to a complementary sequence, and extension of the primer by a DNA polymerase (eg, Taq polymerase), which is necessary to detect the presence of the target sequence. Repeat until an amount of DNA has been generated.
  • a DNA polymerase eg, Taq polymerase
  • the width conditions by the PCR method are summarized in Example 3 described later.
  • the amplified sequence is detected by agarose gel electrophoresis.
  • the primer pair [VP1 (SEQ ID NO: 5), VP2 (SEQ ID NO: 6)] amplifies a 285 bp sequence when the yrB gene sequence is used as a target portion.
  • the present invention relates to an oligonucleotide having the nucleic acid sequence obtained from SEQ ID NO: 1 and comprising at least one site that can extend the nucleic acid sequence characteristic of Vibrio parahaemolyticus.
  • the present invention is characterized in that it comprises at least one site capable of amplifying a nucleic acid sequence characteristic of Vibrio parahaemolyticus having a strength obtained from SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid sequence not obtainable from SEQ ID NO: 3 Includes oligonucleotides.
  • Aeroraonas Al teromonas, Mar inomonas, Shigella,
  • Vibrio parahaemolyticus A probe specific to thermostable hemolysin, one of the elements produced by Vibrio parahaemolyticus, is Reported (Nishibuchi et al., FEMS Microbiol. Lett. 55: 251-256 , 1990) ⁇ ; Specific to these toxins. Is clinically important, but cannot detect all types of Vibrio paraphylaxis. ⁇ Contamination of the product with Vibrio parahaemolyticus !; To pass, it is necessary to detect food or all types of Vibrio parahaemolyticus in its environment, from zen.
  • the isolated Vibrio parahaemolyticus was examined for its phenotype, blood type and toxicity. PCR was performed on all of these 118 strains of Vibrio parahaemolyticus using the primers VP1 and VP2. A 28.5 bp sequence was amplified in Akiraka.
  • Table 3 The results are shown in Table 3.
  • the strains in Table 3 were isolated and identified from food, soil, water, or feces, and some were obtained from Dr. Shinoda of Okayama University and Dr. Yamamoto of Kyushu University. As shown in Table 3, in the 20 strains of Vibrio alginolyticus similarly isolated from various species, no variation in the sequence of 285 bp was observed.
  • the present invention has a nucleic acid sequence obtained from SEQ ID NO: 1 and comprises at least one site capable of amplifying a nucleic acid sequence characteristic of Vibrio parahaemolyticus, but it is a nucleic acid derived from Vibrio alginoliticus and Vibrio harveyi This is an oligonucleotide characterized by the fact that the sequence cannot be very long.
  • the present invention comprises a nucleic acid sequence obtained from SEQ ID NO: 1 but not obtained from SEQ ID NO: 3, and comprises at least one site capable of extending a nucleic acid sequence characteristic of Vibrio parahaemolyticus. Oligonucleotides characterized by the fact that nucleic acid sequences derived from lyticus and Vibrio harvey cannot be extended. Table 3
  • a diluent of genomic DNA of B. parahaemolyticus ATCC 1780.2 ⁇ was prepared, and 1 ng of genomic DNA was used as a template for PCR.
  • VP1 and VP2 were also detected from the diluent containing only DNA.
  • 7-migrated DNA was applied to a southern block.
  • the detection limit was about 1 cfu / reaction tube. Detection limit field by the way PCR method was 1 cfu / 1 0 1 or 1 0 3 cfu Z m 1. Plated and selective medium detection has the sensitivity to detect viable cells, but requires labor and time.
  • the Atsey system by the PCR method is useful because it has an excellent balance of speed, sensitivity, and specificity required for the bacterial detection method compared to the conventional detection method.
  • Example 1 The present invention will be described with reference to Examples.
  • the embodiment is an embodiment of the present invention, and does not limit the present invention.
  • Example 1
  • Vibrio parahaemolyticus Positive for oxidase, lenticarboxylase, orchidinase carboxylase, seratinase, ribase, chitinase; indole production; solid salt concentration 0.5-8 %, Growing at 42 ° C; sensitivity to 0/129 (150 g); producing acid from glucose, mannitol, mannose; arginine dehydrogenase, arginase Negative; does not grow at a salt concentration of 0%; does not produce acid from sucrose, lactose, and saline.
  • Example 2 Example 2
  • the Vibrio parahaemolyticus strain was cultured in TSB medium (manufactured by Eiken) at 37 ° C with shaking for about 24 hours. Cells are collected by centrifugation (manufactured by Tomi Issei) (15, 000 rPm, 15 minutes, 4 ° C), and 10 ml of sterile TE buffer (10 mM ris, 1 mM EDTA, pH 8.0) The cells were lysed with lysozyme (final concentration: 1 mg Zm1; manufactured by Wako), and shaken gently at 37 ° C.
  • the Vibrio parahaemolyticus-specific primer can be used to detect a Vibrio parahaemolyticus-specific 285 bp gyrB gene fragment from cells without PCR or other procedures.
  • Sequence type nucleic acid
  • AACAAAACAC CAATCATCGA GAAAATCTTC CACTTCGACT TAGAACGTGA AGACGGCATT 480
  • ACGCCACTAG CCGTTGTGGG TGATACGGAT AAAACCGGTA CACAAATTCG TTTCTGGCCA 240 AGTGCCGAGA CGTTCTCTAA CACTGAGTTC CACTATGACA TTCTGGCGAA ACGCCTGCGT 300
  • Sequence type nucleic acid

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Description

Ιί
腸炎ビブリオ検出のためのォリ ゴヌク レオチドおよびそれを fflいた検出 法 技術分野
本発明は、 I 炎ビブリォ 明（ Vibrio parahaemolyt icus, 以下、 Γ V P」 と略称することもある。 ） に特徴的な核酸標的配列の增幅のためのオリ ゴヌ ク レオチ ドプライ マーに関する。 本発明は、 D N Aジ ャ ィ レースサ ブュニッ 卜 B遺伝子 (Nucleotide sequence of 醒 gyrase B subunit, 以下、 Γ g y r B J という。 ） 特異的プライ を用いたボリメ ラーゼ チェイ ン . リアクショ ン （ P C R ) による腸炎ビブリオの検出方法に関 する。
背景技術
腸炎ビブリォは多くの国で食中毒菌として知られている。 腸管以外の 部位や術後慯にも認められる。 腸炎ビブリォはグラム陰性多形性棹状菌 であり、 好塩性通性嫌気性菌で炭水化物を発酵してガスを発生する。 チ ォ硫酸一クェン酸塩一胆汁酸塩ー蔗掂 ( T C B S ) 寒天培地上に綠色の コ口 を形成する。
11¾炎ビブリオを検出するには通 ' 、 菌 .地を用いて培養し、 選択的 平板培 こより ^離する方法が fflいられる (， 従来の検出 は 1週問を 要するので、 もつと迅速な方法が望まれている。
リブ 活性を測定する ' 光ァ セィ は腸炎ビブりォを迅速に検 出するが、 腸炎ビブリォをビブリォ アルジノ リティ カス、 ビブリォ ハーベイと区別できない 腸炎ビブリオとビブりォ ァルジノ リティ 力 スの 1 6 S Γ R N A配列は 9 9. 7 %の相同性を示すので腸炎ビブリ ォとビブリオ アルジノ リティ カスを同定するには時間のかかる方法し か無かった。 ビブリォ厲は 3 7の種からなる。 いずれも水性環境に由来するもので ある。 r R N Aの系統学的デ—夕によると V. anguillarum, V. ordalli, V. darase 1 aとして-知られている ®は新しく設立された Listonel la厲、 Phリ tobacterium厲に移されている。 1 0種が胃腸炎、 傷の感染、 ヒ トの 敗血症に関連しており、 7種が魚の病原菌として知られている。 腸炎ビ ブリォは通常河口や海といつた環境に生息しており、 しばしば夏期に海 水や魚介類から単離される。 腸炎ビブリオを単離、 同定するには、 検体を bromothymolbluc- teepol 寒天培地または T C B S寒天培地等の選択培地に接種し、 青みがかった 緑色のコロニーを単離し、 そのコロニーの生化学的性質を調べる。 残念 ながら、 多くのビブリオの種が同様の反応を示すので、 確かな同定をす るにはさらに詳細な生化学的試験が必要になる。 多数の単離菌株につい て広範囲な生化学的性質を調べるには多くの労力と時問と費用を要する ( 腸炎ビブリォの血清学的同定法は他のビブリォと交差反応を示す。 先に D Ν Αを利用するビブリォの種の同定法が開発されている，， V. cholerae 01からのコレラ ォベロンを增幅させて特異的にこの菌 を同定できる D N Aプローブが用いられた . これらのフローブはコ レラ 毒素を生産するコレラ ¾以外のビブリォとも交^反応する ¾光ラベル した リ ゴ ヌ ク レオチ ド フ ロ ーフ'を用いてメ ンブラ ン フ ィ ルタ ー ヒで ハイフ リ グイセー ジ ヨ ンを Γ (■、 V. vulnif icusを同定するノ //j:も研宂さ れている （Wright, Λ. C. et al. , Appl. Environ. Microbiol. 59： 541 -546, 1993) , さらに V. vulnificusのサイ ト リ ジ ン遺伝子 ( h 1 y A ) 配列の部分 からの共有結合でラベル したオ リ ゴヌ ク レオチ ド D N Aプロ一ブが作製 された。 これらのプローブは非毒素性 V. vulnificusとは反応せず、 し たがって全ての V. vulnificusを検出しない。
同様に、 毒性因子 （T D H、 T R H) の迠伝子をタ一ゲッ トにした他 の分子学的方法も毒素を産生する腸炎ビブリォを検出することはできる, しかし、 この毒性因子を用いた場合、 すべての) IS炎ビブリオを検出する ことはできない。
発明の開示
本発明は腸炎ビブリォを他の 3 6種のビブリォ厲の菌と区別できる検 出法の提供を目的とする。
腸炎ビブリォ特異的プライマ一により D N Aの抽出等の操作なしで、 菌細胞からの腸炎ビブリォ特興的な 2 8 5 b pの g y r B遗伝子断片を P C R法により検出する方法の提供を 的とする。
P C Rに有用なォ リ ゴヌ ク レオチ ドブロ ーブを提供するため、 本発 は、 腸炎ビブリ オに特徴的な核酸標的 61列の增幅のためのオ リ コ ヌ ク レ ォチ ドブライマーに閱する。 これらのブライマーとして、 配列岙号 5、 6が例示され、 それらはプラ イ マ ーセ ッ 卜として、 股炎ビブ リ -に特徴 的な抆酸標的配列の検出に使用される。 フライマーセッ トは、 腸炎ビブリォに特徴的な核酸標的配列の在否の 决定に関する方法に使 fflする。 ）] 炎ビブリォ特異的プライマーにより、 腸炎ビブリォ特異的な ^ JL旦遗伝子断）;·が P C R法により検出できる。 本発明において、 「プライマー」 は、 標的核酸配列のあるセクシ ヨ ン へのハイブリ ダイ ズを許す特異的ヌク レオチド配列を含む、 合成による かまたは生物学的に生産されたォ リ ゴヌ ク レオチ ドである。
プライマーは、 ポリ メ ラ一ゼまたは同様な酵素により仲長合成されて 完全な標的核酸配列を複製することができる。
プライマーは核酸配列増幅法、 例えば P C R法および鎖置換増幅 （ S D A ) において利用される。 特定のプライマーに、 特に S D A技術にお いて有用なものは、 標的核酸にハイブリ ダィズ可能な配列に加えて、 制 限エン ドヌ ク レア一ゼの認識配列、 およびポリ メ ラ一ゼまたはポリメ ラ ーゼ様活性を継続する他の酵素がそれ自身その銥型特異的ォリ ゴヌ ク レ ォチド合成の開始を指示するための任 の配列を含む。 本発明において、 「ハイブリ ダィゼーシ ヨ ン』 は、 予め決定された反 応条件下にて部分的または完全に相補的な核酸鎖が逆平行 （ァンチパラ レ ル〉 様式にて向かい合うようにして、 特異的かつ安定な水素結合によ り—本鉞の核酸を形成する工程である。
J-. ¾のとおり、 木発明は、 炎ビブリ オに特 的な核酸 的配列の在 否を決定するために有用なオ リ ゴヌ ク レオチ ドブライ マーに関する。 モのような决; を行うための方 は、 P C Rを fflいた in伝子增幅法に とどまらず、 従来技術であるサザンハィブリ ダィゼーシ ヨ ン法等のプロ ーフ と しての使用も^む。 本発明のプライマーは腸炎ビブリォの g y r Bサブュニッ ト逍伝 h配 列に特與的である。 プローブはプライマ一增幅産物内の内部コ ンセ ンサ ス配列に特異的である。 本発明者らは従来技術の上記問題を解決するために高特異性プローブ として DN Aジャィ レース （ 卜ポイ ソ メ ラ一ゼ Π ) の Bサブュニッ ト蛋 白をコードする g y r B逍伝子を用いる方法を検討した。 g y r B it伝子を直接シークエンス したユニバーサルプライマ一で Pseudomonas put i daを検出、 分類する方法が最近報告されている。 これ らのユニバーサルプライマ一を用いて種々のグラム陰性菌、 陽性菌の y r B遺伝子部分が P C R法により増幅された。 本発明者らはこれら既 存のプライマ一を用いて 3 7極のビブリオ厲の g y r Bの部分 1 . 2 k bを增幅した。 腸炎ビブリオ A T C C 1 7 8 0 2株 （Vibrio parahaemolyticus ATCC17802) 、 ビ'フ " リ オ ァノレジ ノ リ テ ィ カ ス A T C C 1 7 7 4 9株 （Vibrio alginolyticus ATCC 17749, 以下、 「 V A」 と略称することもある。 ） の g y r B塩基配列を示した。 本発明者-らはさらに腸炎ビブリォの g y r B遺伝子のみを増幅し、 同 定できる P C Rプライマ一を作製した。 これら腸炎ビブリオ特異的ブラ イマ一の感度を調べるために 1 1 8嵇の腸炎ビブリオの菌株、 2 0種の ビフ リオ ァルジ ノ リ ティ カスの菌株および、 その他の菌株 7 8械につ いて険討した,， 山本， 原山 （Appi. Environ. Microbiol. 61 ； 1104-1109, 1995) ら は D N A g y r a s e Bサブュニッ ト蛋 のァ ミ ノ酸配列の保存された 部位 2力所から g y r B追伝子を增幅させる P C Rプラ イ マーを作製し ナ これらのブライ マ一を川いて、 Mi々 の細菌からおよそ 1. 2 k bの g y r B遣伝子部分が增幅された。
腸炎ビブ リ オ A T C C 1 7 8 0 2株とビブリ オ アルジ ノ リ ティ カス AT C C 1 7 74 9株から増幅された g y r B遺伝子部分を遺伝子組 換んの 71ί法 ( Sambrook et al. , Molecular cloning : a laboratory manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York. 1989 ) に従って適当なベクターによりク ロ 一ン化した。
好ましいベクターとして p G EM z f ( + ) があげられるが、 一般的 なべクターであれば適宜選択して用いることができる。
p G E M z f ( + ) によリ クローン化された腸炎ビブリオの 1. 2 k bの g y r B遺伝子部分はブラ ス ミ ド p V P g y r B、 ビブリオ アル ジ ノ リ ティ カ スからのものは p V A g y r Bと呼ぶ。
プローブの増殖も常法 （Sambrook et al. , 1989) によりなされる。 例 えば、 プラ ス ミ ドをベクターに揷人し、 塩化カルシウムなどの有効な方 法により大腸菌を形質転換する。 形質転換した細胞は適正条件下で培養 する。
目的とする遣伝子は菌体を溶解して回収し、 アルカ リ法等により精製 する。 精製したブラ ス ミ ドをサンプルとして用いる。
腸炎ビブリオをビフリオ アルジノ リティ カスを含む他のビブリォか ら検出、 区別するために P C R法を,试みた。 この方法はプローブに相^] 性のある配列を增幅するので、 事実上、 感度を堦すことになる。
ブローブの塩基配列にしたがって、 合成されたォリ ゴヌク レオチ ドプ ライマーは、 サンプル屮に目的とする塩¾配列が存在する場合のみ DN Aを増幅する 3 感度を ¾加するだけでなく、 D N Aプローブの塩基配列 に基づく特異的なオリ ゴヌ ク レオチ ドを使用することにより絶対的な特 異性が得られる。 有効なプライマーを作製するために、 p V P g y r Bと p V A g y r 旦の塩基配列を D N Aシークェンサ一を用いて常法に従って決定した。
g y r Bの塩基配列を决定するために、 増幅断片の N末端と C末端部 分も U P— 1 S、 U P— 2 S rプライマー （山本、 原山， Appl.
Environ. Microbiol. 61 : 1104-1109， 1995 ) を用いて决定した。 さら に決定配列を伸展するために U P— 1 Sを用いて得られた塩基配列から 他のブライマ—を作製した。 増幅断片の全塩基配列は 1 2 5 8 b pであ り、 配列番号 1 ( p V P g y r B) 、 配列番号 3 ( p V A g y r B ) に 示した。 配列番号 1がコードするア ミ ノ酸配列を配列 2に、 配列番号 3 がコードするァ ミ ノ酸配列を配列 4に示した。 この塩基配列の情報を用いて、 腸炎ビブリオを他の細菌から検出、 同 定する 2 1 b pのプライマーを作製した。 これらのプライマーは、 配列 番号 5および配列番号 6を含み、 そしてプライマーセッ 卜として利用可 能である。
この新規のプライマ一は既存の P C Rを fflいたアツセィ怯 （Saiki et al. , Science 239： 487-491, 1988) において有用である。 このプライ マーはサンブル中の目的とする D N Aを增幅するのに用いられ、 D N A を十分検出できるようにする。 '幅段階に^いて、 検出段階は DN A 検出に有効な方法であればどんな方法でもよい。 例えば、 ァガロースゲ ル m 泳 などが )fjいられる。 「i的とする DN Aはテ ンヅレー 卜として機能する。 サ ン プル中のテ ン ブレー 卜 D N Aの^幅はブライマ ーベア一を.」. ¾D N Aと処理すること により行われる。 この処理により各核酸配列に相補的な配列が伸長する。 この伸長し生成した配列はさらにブライマーのテンプレー 卜として機能 する。 この処理プロセスは、 DNAの変性、 ブライマーと相補的な配列 とのアニーリ ング、 D N Aポリ メ ラーゼ （例、 Taq polymerase) による ブライマーの伸長からなり、 目的とする配列の存在を検出するのに必要 な量の DN Aが生成されるまで繰り返す。 P C R法による增幅条件は後 述の実施例 3にまとめた。 増幅に次いで增幅した配列をァガロースゲル電気泳動により検出する。 プライマーペア 〔V P 1 (配列番号 5 ) , V P 2 (配列番号 6 ) 〕 は y r B遺伝子配列を目的部分として用いた場合 28 5 b pの配列を増幅 する。
A T C C, J CM, C D C, N C 1 MBのコレクショ ンから得たビブ リオ厲の 3 7種の株について 2 8 5 b pの D NAの增幅を行った。 これ らの細菌の染色体 D N Aは常法 （Sambrook et al. , Molecular cloning ： a laboratory manual , 2nd ed..Cold Spring Harbour aboratory Press, Cold Spring Harbour, New York. 1989) にしたがって調製した。 1 gの目的 D N Aを用い、 P C R法を行った。 2 8 5 b pの特異的な パン ドは ^炎ビブリオにのみ認められ、 他の ϋ稀ではいずれにおいても 認められなかった （¾ 1 ) 。 しかし、 山本， 原山 （ 1 9 9 5 ) らによる ブライマ ーセ ッ ト （ U Ρ— 1、 U Ρ— 2 r ) を用いた P C R增幅では 1. 2 k bの y r B部分を検出したので、 D N A g y r a s e Bサフユ二 つ 卜の存在は確かめられた" これらの知^から本発明のプライマ —は腸 炎ビブリォ特異的であり、 この病原! ¾を検出するのに ίΐ]いることができ る。
本発明は、 配列番号 1から得られる核酸配列をもち、 腸炎ビブリォに 特徴的な核酸配列を增幅し得る少なく とも 1 の部位を含むことを特徴と するオ リ ゴヌ ク レオチ ドである。 本発明は、 配列番号 1から得られる力べ、 配列番号 3から得られない核酸配列をもち、 腸炎ビブリォに特徴的な核 酸配列を増幅し得る少なく とも 1の部位を含むことを特徴とする含むォ リ ゴヌ ク レオチ ドである。
Figure imgf000012_0001
同様に、 Aeroraonas, Al teromonas, Mar inomonas, Shigella,
Shewanel la, Salmonella, Escher i ch i a/ または Staphylococcus aureus の標準株についても g y r Bと腸炎ビブリォ特異的な 2 8 5 b p配列の 検出を つた。 表 2に示したようにいずれの株においても g y r Bの存 在は認められたが、 腸炎ビブリォ特異的 2 8 5 b p配列は認められなか つた。 表 2
Figure imgf000013_0001
腸炎ビブリオには種々の ¾現型、 血 、 素産生型が報告されてい るつ 腸炎ビブリオによつて 生される^素の一-つである熱安定なへモリ ジ ンに特異的なプローブが報告されている （Nishibuchi et al. , FEMS Microbiol. Lett. 55： 251 -256, 1990) ί; これらの毒素特異.的フ ローブ は臨床的には重要であるが、 すべてのタィプの 1¾炎ビブリォを検出する ことはできない。 ^品の腸炎ビブリオによる汚染を!；方ぐには、 食品、 あ るいはその環境中のすべてのタィプの腸炎ビブリォを検出する必要があ る,： 品、 水、 土壌など禅.々のものから -離された腸炎ビブリオについ てその表現型、 血 型、 毒性を調べた。 これら 1 1 8侏すベての腸炎ビ ブリオの株についてブライマ一 V P 1 、 V P 2を川いた P C R法を行つ た。 あきらカ、に 2 8 5 b pの配列が増幅された。
結果を ¾ 3に示す。 表 3の株は食品、 土、 水または糞便から分離同定 した株であり、 一部は岡山大学篠田先生、 九州大学山本先生から譲り受 けた。 表 3に示すように、 同様に種々のものから単離された 2 0株のビ ブリオ アルジノ リティ カスにおいては 2 8 5 b pの配列の增幅は認め られなかった。 本発明は、 配列番号 1から得られる核酸配列をもち、 腸炎ビブリオに 特徴的な核酸配列を増幅し得る少なく とも 1 の部位を含むが、 ビブリォ アルジ ノ リ テ ィ カスおよびビブリオ ハーベイに由来する核酸配列を 增幅し得ないことを特徴とするオリ ゴヌ ク レオチ ドである。
本発明は、 配列番号 1から得られるが、 配列番号 3から得られない核 酸配列をもち、 腸炎ビブリ ォに特徴的な核酸配列を增幅し得る少なく と も 1の部位を含むが、 ビブリオ アルジノ リティ カスおよびビブリオ ハーベイに由来する核酸配列を增幅し得ないことを特徴とするォリ ゴヌ ク レオチ ドである。 表 3
Figure imgf000015_0001
P C R法を用いた丁ッセィ系の評価を行うために、 腸炎ビフ リオ A T C C 1 7 8 0 2侏のゲノ ム D N Aの希釈液を調製し、 P C R增幅のテン ブレー 卜 として用いた c 1 n gのゲノ ム D N A しか含 ·しない希釈液か らもブライマ ー V P 1 、 V P 2を用いた增幅により検出できた。 感度を n g レベルから p g レベルにあげるために、 7 気泳動した D N Aをサザ ンブロッ 卜にかけた。 腸炎ビブリオ A T C C 1 7 8 0 2株の培養細胞の 希釈液で上記プライマーによる増幅を行ったところ、 およそ 1 c f u / reaction tubeの検出限界であった。 このように P C R法による検出限 界は 1 c f u / 1 0 1 または 1 03 c f u Z m 1であった。 プレーテ ィ ング、 選択的浓天培地による検出は 1生存細胞を検出する感度を持つ が労力と時間を必要とする。
P C R法によるア ツセィ系は從来の検出法に比べ、 細菌の検出法に必 須の速度、 感度、 特異性のバラ ンスにおいて優れており、 有用である。
発明を ¾施するための最良の形態
本発明を卖施例によって説明する。 実施例は実施の 1態様であり、 木 発明を限定するものではない。 実施例 1
従来法による^品中の腸炎ビブリ ォの ^離
2 5 gの 品サ ンフルにアル力 リ べプ 卜 ン水 〔 F」水製薬 （株） 製〕 を 加え (IS炎ビブリオ A T C C 1 7 8 0 2株を接種し、 3 7 で 1 8時間培 ¾した。 1 1金耳^の培養液を T C B S寒天培地に画線接種し、 3 7 °C で 2 4時問培 した。 すべての緑色コロニーをさらに T i Ν ,. ¾天培地 (Bacto iryptone 1 %, N a C 1 1 %, 596 打 ¾留水） 上で ¾ mした。 よく ϋί離されたコ πニーをゾ 1-:化学的試験にかけた： 以下 の性 を示す菌株を典型的な腸炎ビブリオと同定した。 ォキシグ一ゼ、 リ ン ンテカルボキシ ラ ーゼ、 オル二チ ンデ力ルボキシ ラーゼ、 セラチナ ーセ、 リ バ一セ、 キチナ一ゼ陽性 ； ィ ン ド一ル産生 ； 愈塩濃度 0. 5 - 8 %、 4 2 °Cで生育する ； 0 / 1 2 9 ( 1 5 0 g ) に対する感受性有 り ； グルコース、 マ ンニトール、 マ ン ノースから酸を生成 ； アルギニ ン デヒ ドロゲナ一ゼ、 アルギナ一ゼ陰性 ； 愈塩濃度 0 %では生育しない ； 蔗糖、 乳糖、 サ リ ン ンから酸を生成しない。 実施例 2
染色体 D N Aの単離
腸炎ビブリォの株を T S B培地 （栄研製） 中で 3 7 °C、 約 2 4時間振 とう培 ¾した。 細胞は遠心分離 （ ト ミ 一精ェ製〉 して （ 1 5 , 0 0 0 r P m, 1 5分間、 4 °C) 採取し、 1 0 m 1 の滅菌 T E緩衝液 （ 1 0 mM T r i s、 1 mM E D T A、 p H 8. 0 ) に懸濁させた。 細胞をリ ゾ チーム （最終濃度 1 m g Zm 1 ； 和光製） により溶解し、 静かに振とう しながら、 3 7 °Cに 2 0分間保持した。 この ¾解した細胞に S D S (最 終遴度 0. 5 %) を加え、 6 5 °Cでイ ンキュベー ト した。 蛋白と R N A を分解させるために、 それぞれプロティ ナ一ゼ K (最終濃度 5 0 0 g /m l ) と R N a s e (最終濃度 5 // g /m l ) を加え、 3 7 °Cでそれ ぞれ 3 0分間、 6 0分問イ ンキュベー ト した,， サ ンフルは緩衝フ エ ノ ー ル （ G I B C 0 /' B R L ) で 3 、 フ ニ ノ ール ： ク ロ 口ホルム （ 1 ： 1 ) で 】 「|J1、 ク ロ口ホルム ： イ ソ了 ミ アルコール （ 2 4 ： 1 〉 で 1回抽出 したつ ^^な上½を るために遠心分離を行い、 D Ν Αは 2倍 の氷冷 エ タ ノ ール ： 3 M酢酸ナ 卜 リ ウム （ 1 0 : 1 ) で沈殿させた.:. この反応 液を— 2 0でで一晩保存した。 沈殿した D N Aは 心分離で 縮し、 ェ ク ノ 一ルを減 {£留去した。 この乾燥 D N Aを T E緩衝液に ί 解し、 D Ν Αテ ζ ブレ一 卜 と して川いた, > D N Aの純度はァガ口一スゲル ^気泳動 により調べ、 D N A濃度は分光光度計によって測定した。 実施例 3
P C R法によるア ツセィ
サンプル調製
D N Aを抽出しない菌の全細胞もテンプレー トとして用いた。 この場 合、 寒天培地で生育した新鲊な菌細胞を用いた。 液体培地で生育した細 胞を用いる場合には遠心分離により菌細胞を分離し、 P B S緩衝液 ( p H 7. 5 ) で 1度洗浄し、 適当な数の菌細胞を用いた。 場合によっては フエ ノ ール · クロ口ホルムにより D N Aを抽出し、 P C R増幅のテンプ レー トとして用いた。
P C R增幅条件
P C Rアツセィは D N A T h e r m a l C y c l e r (
P e r k i n E l m e r ) で行った。 反応液 1 0 0 ^ 1 ( T r i s - H C 1 1 0 0 mM, M g C 1 2 1 5 mM, K C 1 5 0 0 mM、 p H 8. 3 ) は、 ゲノム D N A 1 0 0 n g、 2 0 0 / Mの d N T P s、 1 Mのプライマ一を含有する。 D N A変性は 9 4 ° (：、 6 0秒間、 ァニ一 リ ングは 6 0 °C、 6 0秒問、 D N A伸 βは 7 2 °C、 1 2 0秒間で、 3 0 サイ クル つた。 ¾ Φ ,に次いで、 検出はゲル ¾ il泳動によって行つた。 卄ンプル 2 0 u I はァガロースゲル 泳! 1¾ ( 1 %ァガロース、
S e a K e m M E , F M C B i o p r o d u c t s ,
R o c k l a n d , M a i n e ) に力、けた。 D N Aハ ン ドはェチジゥ L、 ブ口マイ ド溶液で 1 0分問染色後、 紫外線照射して観察した„
産業上の利用可能性
腸炎ビブリオの g y r B遗伝子に特異的に反応して、 他のビブリォ種 及びビブリォ厲以外の菌株から区別、 同定できるようなプライマ一を提 供することができた。
腸炎ビブリォ特異的ブライマ一により、 D N Aの抽出等の操作なしで, ¾細胞からの腸炎ビブリォ特異的な 2 8 5 b pの g y r B迠伝子断片を P C R法により検出できる。
配列 ¾ 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 1 2 5 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポ ロ ジー ： 直線状
配列の種類 ： ゲノ ミ ッ ク D N A 配列
GAAGTCATCA TGACCGTTCT GCATGCCGGT GGTAAATTCG ATGATAACTC GTACAAAGTA 60 TCAGGCGGTC TTCACGGCGT GGGTGTTTCG GTAGTAAACG CACTGTCAGA AAAAGTGGTA 120 CTAACCATCC ATCGTGGCGG TCATATCCAC ACGCAAACTT ACCGTCATGG TGAGCCTGAA 180
ACGCCTCTAG CGGTTGTGGG TGATGCGGAT AAAACTGGTA CACAAATTCG TTTCTGGCCA 240 AGTGCAGAAA CTTTCTCTAA CACTGAATTC CATTACGACA TCCTAGCAAA ACGTCTGCGT 300
GAGCTATCGT TCTTGAACTC AGGCGTTTCT ATCAAGCTTA TTGATGAGCG CGAAGCGGAC 360
AAGCAAGATC ACTTCATGTA TCAAGGTGGT ATTCAAGCGT TCGTTCAGCA CTTAAACACC 420
AACAAAACAC CAATCATCGA GAAAATCTTC CACTTCGACT TAGAACGTGA AGACGGCATT 480
TCGGTAGAAG TGGCAATGCA GTGGAACGAT GGTTTCCAAG AGAACATCTT CTGTTTCACC 540 AACAACATTC CACAGCGCGA TGGTGGTACT CACCTTGCTG GTTTCCGTGC GGCAATAACA 600
CGTACGCTAA ACAGCTTTAT GGATAAAGAA GGCTTCTCGA AGAAAGCGAA AACGGCAACG 660
TCAGGCGACG ATGCGCGTGA AGGTTTGACT GCCGTTGTTT CAGTAAAAGT GCCTGATCCA 720
AAATTCTCGA GCCAAACAAA AGACAAACTG GTTTCTTCTG AAGTGAAATC AGCGGTTGAA 780
TCGGCGATGG GTGAGAAGCT ATCTGAGTTC TTGGTCGAAA ACCCAAGTGA AGCGAAAATG 840 GTTTGTTCGA AAATCATCGA TGCAGCACGT GCACGTGAAG CCGCACGTAA AGCGCGTGAA 900
ATGACTCGTC GTAAAGGCGC GCTAGACCTA GCAGGCCTAC CAGGCAAACT TGCAGACTGT 960 CAGGAAAAAG ATCCGGCACT CTCTGAACTA TACATTGTGG AGGGTGACTC TGCGGGTGGT 1020
TCAGCTAAGC AGGGTCGTAA TCGTAAGAAT CAGGCAATCC TACCACTGAA AGGTAAGATC 1080
CTGAACGTAG AAAAAGCACG TTTCGACAAG ATGTTGTCTT CGCAAGAAGT TGCAACGCTT 1 140
ATTACAGCAC TTGGCTGTGG TATCGGTCGT GACGAGCACA ACCCGGACAA ACTGCGTTAC 1200
CACAACATCA TCATCATGAC CGACGCAGAC GTAGAGGCTC GCACATCCGT ACCCTGCT 1258
配列番 ： 2
配列の長さ ： 4 1 9
配列の型 ： ア ミ ノ酸
トポロジー ： 直線状
配列の種類 ： 配列
EVIMTVLHAG GKFDDNSYKV SGGLHGVGVS VVNALSEKVV LTIHRGGHIH TQTYEHGEPE 60 TPLAVVGDAD KTGTQIRFWP SAETFSNTEF HYDILAKELR ELSFLNSGVS IKUDEBEAD 120 KQDHFMYEGG IQAFVQHLNT NKTPI IEKIF HFDLEEEDG I SVEVAMQWND GFQENIFCFT 180
NNIPQRDGGT HLAGFEAA IT RTLNSFMDKE GFSKKAKTAT SGDDAREGLT AVVSVKVPDP 240
KFSSQTKDKL VSSEVKSAVE SAMGEKLSEF LVENPSEAKM VCSK I IDAAE AEEAARKAEE 300
MTERKGALDL AGLPGKLADC QEKDPALSEL YIVEGDSAGG SAKQGRNRKN QAILPLKGKI 360
LNVEKARFDK MLSSQEVATL ITALGCG IGR DEHNPDKLEY HNI I IMTDAD VEAETSVPC 419
配列番号 ： 3
配列の βさ ： 1 2 5 8
配列の ¾ ： 核酸 鎖の数 ： -本鎖
卜ボ口ジ一： 直線状
配列の榷類 ： ゲ ノ ミ ッ ク D N A
配列
GAAGTCATCA TGACCGTTCT GCATGCAGGT GGTAAATTCG ACGATAACAC AAACAAATTA 60 TCGGGTGGTC TCCACGGGGT ACGTGTCTCA GTAATAAACG CACTATCAGA GAAAGTTGAG 120 CTAACGATTC ATCGTGGTGG CCATATCCAT ACGCAAACCT ACCGCCATGG TGAGCCTGCA 180
ACGCCACTAG CCGTTGTGGG TGATACGGAT AAAACCGGTA CACAAATTCG TTTCTGGCCA 240 AGTGCCGAGA CGTTCTCTAA CACTGAGTTC CACTATGACA TTCTGGCGAA ACGCCTGCGT 300
GAACTGTCAT TCCTGAACTC TGGTGTGTCG ATCAAATTGG TTGATGAACG TGAAGCGGAC 360
AAACATGATC ACTTCATGTA TGAAGGTGGT ATTCAAGCGT TCGTTGATCA CCTAAACACC 420
AACAAAACGC CAATCATCGA GAGGGTCTTC CACTTTAACT CTGAGCGTGA AGACGGCATT 480
TCAGTTGAAG TGGCGATGCA ATGGAACGAT GGTTTCCAAG AGAACATCTT CTGCTTTACC 540 AACAATATCC CACAGCGTGA TGGTGGTACT CACCTTGCTG GTTTCCGTGC TGCGCTAACA 600
CGTACATTGA ACAGCTTTAT GGATAAAGAA GGTTTCTCGA AGAAAGCGAA AACAGCGACT 660
TCAGGCGACG ATGCGCGTGA AGGTCTAACT GCGGTTGTTT CGGTGAAAGT GCCTGATCCT 720
AAGTTCTCAA GCCAAACAAA AGACAAACTG GTTTCTTCTG AAGTGAAATC AGCTGTTGAG 780
TCTGCAATGG GTGAAAAACT GTCTGAGTTC TTGATTGAGA ACCCGACAGA AGCGAAGATG 840 GTTTGTTCGA AAATCATCAA TGCAGCACGT GCATCTGAAG CAGCGCCTAA AGCTCGTGAA 900
ATGACGCGCC GTAAAGGTGC ACTAGACCTA GCAGGCCTTC CAGGTAAAGT TGCAGACTGT 960
CAGGAAAAAG ATCCGGCACT CTTTGAACTA TACATAGTGG AGGGTGAATC GGCAGGCGGT 1020
TCCGCAAAAC AAGGCCGTAA CCGTAAGAAC CAAGCGATCA CACCGCTAAA AGGTAAGATT 1080
CTTAACGTAG AAAAAGCACG TTTCGACAAG ATGCTATCTT CTCTAGAAGT AGTAACACTG 1140 ATCACCGCAT TAGGTTGTGG TATCGGTCGT GACGAGGACA ACCCGGACAA GCCTCGGGAC 1200
CACAACATAA TCATCATGAC CGACGCAGAC GTAGAGGCTC GCACATCCGT ACCCTGCT 1258 配列 ¾号 ： 4
配列の畏さ ： 4 1 9
配列の型 ： ア ミ ノ酸
卜 ボロ ジ一： 直線状
配列の禅類 ： 配列
EVIMTVLHAG GKFDDNTNKL SGGLHGVKVS VINALSEKVE LTIHRGGHIH TQTYRHGEPA 60 TPLAVVGDTD KTGTQIRFWP SAETFSNTEF HYDILAKELR ELSFLNSGVS IKLVDEEEAD 120 KHDHFMYEGG IQAFVDHLNT NKTPIIEEVF HFNSEREDGI SVEVAMQWND GFQENIFCFT 180
NNIPQRDGGT HLAGFEAALT ETLNSFMDKE GFSKKAKTAT SGDDAREGLT AVVSVKVPDP 240
KFSSQTKDKL VSSEVKSAVB SAMGEKLSEF LIENPTEAKM VCSKIINAAR ASEAAPKARE 300
MT8RKGALDL AGLPGKVADC QEKDPALFEL YIVEGESAGG SAKQGRNRKN QAITPLKGKI 360
LNVEKARFDK MLSSLEVVTL ITALGCGIGE DEDNPDKPSD HNIIIMTDAD VEAETSVPC 419
配列番号 ： 5
配列の長さ ： 2 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポロ ジー ： 直線状
配列の栩類 ： ゲノ ミ ク D N A 配列
C G G C G T G G G TG T TT C G G T A G T W /35
2 2 配列番号 ： 6
配列の 1έさ ： 2 1
配列の型 ： 隱
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポ口ジー ： 直線状
配列の種類 ： ゲノ ミ ッ ク D N A 配列
T C C G C T T C G C G C T C A T C A A T A

Claims

求 の 範 1用
1 . 配列番号 1から得られる核酸配列をもち、 腸炎ビブリォに特徴的な 核酸配列を増幅し得る少なく ともひとつの部位を含むことを特徴とする オ リ ゴヌ ク レオチ ド。
2 . 配列番号 3から得られない核酸配列である請求 ¾ 1のオリ ゴヌ ク レ ォチド。
3 . ビブリ オ アルジ ノ リ ティ カ スおよびビブ リ オ ハーベイ に由来す る核酸配列を増幅し得ない 求¾ 1または 2のオリ ゴヌ ク レオ + ド。
4 . 配列番号 5または配列番号 6で示される請求項 1、 2または 3のォ リ ゴヌ ク レオチ ド。
5 . 請求頃 1ないし 4のいずれかのォリ ゴヌク レオチドを 2種類組み合 わせたプライマーセ ッ 卜を用いて、 検体中の D N Aジャ ィ レースサブュ 二ッ ト B遺伝子配列を標的とし、 当該標的核酸配列を選択的に増幅させ. 検体中に腸炎ビブリォに特異的な g y r Bュニッ 卜が存在するか否かを 決定することで腸炎ビブリォの検出を行う方法。
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