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WO1998003645A1 - Techniques de piegeage transmembranaire - Google Patents

Techniques de piegeage transmembranaire Download PDF

Info

Publication number
WO1998003645A1
WO1998003645A1 PCT/JP1997/002502 JP9702502W WO9803645A1 WO 1998003645 A1 WO1998003645 A1 WO 1998003645A1 JP 9702502 W JP9702502 W JP 9702502W WO 9803645 A1 WO9803645 A1 WO 9803645A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
membrane protein
protein
cloning
sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/002502
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiromitsu Nakauchi
Yukio Nakamura
Sousuke Miyoshi
Dong Ku Kim
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to US09/230,378 priority Critical patent/US6582905B1/en
Priority to EP97930840A priority patent/EP0939119A4/en
Publication of WO1998003645A1 publication Critical patent/WO1998003645A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1051—Gene trapping, e.g. exon-, intron-, IRES-, signal sequence-trap cloning, trap vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to a method for cloning a protein encoding such a membrane protein without requiring any antibody or ligand. Specifically, the present invention relates to a method for cloning a protein having a transmembrane region.
  • a cDNA library prepared with an animal cell expression vector is introduced into Cos7 cells by using transient expression using an expression vector containing the replication origin of Cos7 cells and SV40, and the cells are transferred to the cell surface.
  • a cDNA library prepared with an animal cell expression vector is introduced into Cos7 cells by using transient expression using an expression vector containing the replication origin of Cos7 cells and SV40, and the cells are transferred to the cell surface.
  • Cells expressing the target membrane molecule are concentrated by Banning or FACS using an antibody or a ligand against the membrane molecule, the plasmid DNA is recovered, and transfection to Cos7 cells is performed again.
  • Another method is to divide the expression vector cDNA library into several small pools, introduce them into Cos7 cells, detect the expression of membrane molecules using isotope-labeled antibodies and ligands, and further pool the positive pool.
  • This is a method in which the cloning is repeated by dividing the pool into pools consisting of a small number of plasmids and repeating the transfection (sibu selection method).
  • the present invention is a DNA cloning method encoding a membrane protein, comprising the following steps.
  • the present invention also relates to cDNA obtained by using these methods, a vector containing the DNA, a transformant transformed with the vector, and a transcript of the DNA produced by the transformant. Things.
  • the present inventors have found that using the method of the present invention makes it difficult to produce antibodies, It is clear that it is possible to clone a completely new membrane molecule for which no ligand has been identified.
  • a protein having a signal sequence is selected, and a DNA (reporter gene) encoding the signal sequence and N-terminal sequence of the protein is prepared.
  • the protein having a signal sequence is a protein that permeates a membrane, and includes, for example, a membrane protein and a secretory protein.
  • the reporter gene include a DNA obtained by selecting a known membrane protein and removing the transmembrane region (transmembrane region) and its downstream from DNA encoding the membrane protein.
  • a known membrane protein is a membrane protein for which the nucleic acid sequence encoding the protein is known (for example, the cDNA sequence of the protein is known, the chromosomal DNA sequence is known, etc.) and the transmembrane region can be estimated.
  • proteins derived from the same species are derived from mammals.
  • a known membrane protein is preferably derived from a mammal).
  • specific examples of such known membrane proteins include known mammalian cell surface antigens such as mouse L3T4, human CD4, and human HLA antigen, receptor tyrosine kinases present on cell surfaces, and receptor types.
  • receptor proteins such as serine threonine kinase and cytokine receptor are exemplified.
  • the DNA excluding the transmembrane region and its downstream from the DNA encoding these known membrane proteins can be subjected to general genetic engineering techniques (eg, DNA synthesis, degradation / purification of cDNA using restriction enzymes, etc.). It is prepared using
  • the DNA library containing the DNA encoding the target membrane protein may be a cDNA library or a chromosomal DNA library.
  • the DNA library can be obtained by a general method used in genetic engineering.
  • the novel membrane protein expressed in hepatocytes is the desired membrane protein
  • mRNA is obtained from hepatocytes
  • brain Obtain mRNA from cells, make cDNA with reverse transcriptase
  • a double-stranded DNA molecule is converted to a double-stranded DNA molecule by a DNA polymerase, and the double-stranded DNA molecule is inserted into a vector such as an appropriate plasmid or phage to prepare a cDNA library.
  • a commercially available DNA library may be used.
  • the DNA was concentrated by degenerated PCR using a common sequence such as a motif sequence present in the family gene.
  • a cDNA library is used.
  • an expression vector is prepared in which the DNA of the DNA library obtained in B) is linked downstream of the reporter gene obtained in A).
  • vectors used to construct such expression vectors include pCD (Okayama et. Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) and pCD—SR (Takebeet. Mol. Cell). Biol. 8: 466, 1988), pCDM8 (Funakoshi), pBMG, pEF, pMAM (Toyobo) and the like.
  • pCDM8 Frakoshi
  • pBMG pEG
  • pEF pMAM
  • Construct an expression vector Downstream of the promoters present in these vectors, a library containing the reporter gene and the DNA of the target membrane protein or a DNA obtained by randomly hydrolyzing the DNA is linked so as to be sequentially linked, Construct an expression vector.
  • a cDNA sequence reduced by degenerated PCR using a common sequence it is advantageous since the reading frame can be combined with the reporter gene in
  • cells transformed with an expression vector containing cDNA for all or a part of the target membrane protein can be selected.
  • the host cell for example, when the target membrane protein is derived from an animal cell, it is preferable to use an animal cell as the host, for example, a host capable of transient expression such as COS 7 is preferable.
  • Reporter gene Cells that are expressed on the membrane surface are selected by using a baning method using an antibody against a reporter protein, a sorting method using FACS, or the like. These transformation, expression, and selection operations can be repeated several times as necessary to enrich transformants (positive cells) that express the target membrane protein.
  • the vector is recovered from the obtained positive cells to obtain a clone containing a part or all of the DNA encoding the target membrane protein. If necessary, determine the nucleotide sequence of the fragment encoding the target membrane protein, and analyze the sequence of the target membrane protein using analysis software such as GENETYX (software development company). Determine if the desired DNA has been cloned.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a specific example of the transmembrane trap method of the present invention.
  • lxlO 7 Ba / F3 cells (RIKEN Cell Bank, Cell No. RCB0805) were washed twice with a phosphate buffer, centrifuged and the supernatant was removed. Stir well and leave at room temperature for 5 minutes.
  • To the suspension was added 0.2 ml of black-mouthed form, stirred well, allowed to stand at room temperature for 3 minutes, and centrifuged at 5,000 rpm for 5 minutes 4.
  • the aqueous phase was recovered and allowed to stand it in 2-propanol 0.5m] were added stirring at room temperature for 10 minutes, centrifuged at 15,000 rpm 15 min 4 e C went. Add 1 ml of 0.75% ethanol to the precipitate, stir and remove 15,000 rpm
  • mRNA was prepared using Quick prep raaicro mRNA purification kit (Pharmacia) II according to the attached manual.
  • cDNA synthesis was performed according to the Superscript preampli- fication system (GIBC0 BR or other manual).
  • mRNA was added with 11/1 DEPC water and 30 ⁇ 30 5′-UNI-XhoI-random primer 1 ⁇ 1 and incubated at 70 ° C. for 10 minutes, and then immediately left on ice for 1 minute.
  • the conditions of PCR were set as follows, and the reaction was started by the hot start method.
  • Taq polymerase (Taq polymerase) l ⁇ ⁇
  • Example 4 The PCR reaction product obtained in Example 4 was subjected to purification such as desalting and removal of primers using Wizard PCR peps resin (Promega), and eluted with water 501.
  • reaction solution was desalted and purified using Wizard DNApurification resin (Promega), and the DNA was eluted with 50/1 water.
  • reaction solution was electrophoresed on a low-temperature melting agarose gel to cut out the vector band, and then left at 68 ° C for 10 minutes.
  • ligation reaction mixture I Ligation Kit Ver.2, Takara Shuzo
  • DNA 21 was added to E. coli DH10B48 / Z1 and transferred to a Gene Pulser cuvvete (Bio-Rad, 1 mm). Lml of SOB solution was added, transferred to a 15 ml tube, and shaken at 37 ° C for 1 hour to perform transformation.
  • FACS sorting was performed basically according to the manual attached to the FACS apparatus (Vantage, Vecton Dickinson).
  • the method of staining cells basically followed “Basic technology for immunological research” (Seiji Takatsu, Shinsuke Taki, Yodosha).
  • Example 13 Determination of 3 nucleotide sequence
  • Plasmid DNA was recovered from the positive cells by the Hirt Extraction method, transformed into Escherichia coli, and seeded on an LB plate.
  • the design of the WSXWS degenerated primer using the WSXWS motif was modified to use human IL-3 or human GM—CSF-dependent human leukemia cell line F36P cells (RIKEN Cell Bank, Cell No. RCB0775). The procedure was performed in the same manner as in Examples 1 to 13.
  • the KH97 (IL-13R / 3 unit) gene can be efficiently cloned from the primer (1), and the IL-12Ry, IL-4Ra, IL-4 — 6 R ⁇ gene, GM—CGFR ⁇ gene from primer (3), IL—13 Ra gene from primer (4), Epo R gene from primer (5) 9 efficiently .
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • N A, C, G and T
  • N A, C, G and T
  • N A, C, G and T
  • N A, C, G and T
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • N A, C, G and T
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • N A, C, G and T
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • N A, C, G and T
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • N A, C, G and T Array

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Description

明細書
トランスメンブレントラップ法 技術分野
細胞の分化と増殖機構において、その細胞の表面に表現される膜蛋白質は生 物学的に非常に重要な意味を持っている。 サイ トカイン、 ペプチドホルモンや 神経伝達物質の受容体及び細胞接着分子などは細胞から細胞への情報伝達を 担っている。 本発明は、 この様な膜蛋白質をコードする蛋白質を、 全く抗体や リガンドを必要とすることなしにクローニングをする方法に関する。詳細には、 トランスメンブレン領域をもつタンパク質をクローニングする方法に関する。 背景技術
膜分子のクロ一ユング方法として現在最も広く利用されている方法は 1 9 8 7年 Seed & Aruffoi (Proc. Acad. Sci . USA 84 : 3365-3369 1987)らによつ て考案された発現クローニング方法を改良したいくつかの変法である。 その方 法は、例えば Cos7細胞と SV40の複製起点を含んだ発現ベクターによる一過性 発現を利用して、 動物細胞発現ベクターで作製された cDNA ライブラリーを Cos7細胞に導入し、 細胞表面上に cDNAライブラリー由来の膜蛋白質を発現さ せる。 目的とする膜分子を発現している細胞をその膜分子に対する抗体やリガ ンドを用いてバニングあるいは FACSで濃縮し、 プラスミ ド DNAを回収して再 び Cos7細胞にトランスフエクシヨンし、 濃縮操作を繰り返す （それぞれ、 パ ニング法、 ソーティング法） 。 もう一つの方法は、 発現ベクター cDNA ライブ ラリ一をいくつかの小さなプールに分け、 Cos7 細胞に導入し、 アイソトープ で標識した抗体やリガンドを用いて膜分子の発現を検出し、陽性プールをさら に少数のプラスミ ドからなるプールに分けてトランスフエクシヨンを繰り返 しクローン化する方法 （シブセレクション法） である。
しかし、レ、ずれの方法も目的とする細胞上に発現している膜分子の抗体やリ ガンドが明白な場合にのみ有効であるのに対して、本方法は全く抗体やリガン ドを必要とすることなしに細胞上の膜分子のクローユングが行うことができ る画期的な方法である。 抗体やリガンドを必要としないことは、 生物活性を指 標とするやっかいなアツセィ系の樹立を避けて細胞間情報伝達物質のクロー ニングが行えるという点で非常に有利である。 また、 サイ トカインレセプター においては細胞膜上での発現量が極めて低いため （数百〜数千コ κ細胞） 、 細 胞可溶化分画を免疫することによって得られるモノクローナル抗体の作製も 困難が伴い、従来の慣用法である蛋白質の精製によるアミノ酸配列決定からの アプローチもほとんど不可能である。本方法は従来法とは異なつて抗体作製が 困難であり、 リガンドも同定されていないような全く新規な膜分子に関しても クローニングを行うことができる新規な方法である。 発明の開示
本発明は、 以下のステップからなる膜蛋白質をコ一ドする DNAのクロ一 ニング方法である。
Α) シグナル配列を持つ蛋白質を選定し、 その蛋白質のシグナル配列と Ν末 端配列をコードする DNA (レポ一タ一遺伝子） を作製する、
Β) 目的の膜蛋白質をコードする DN Αを含む DN Αライブラリ一を作製す る、
C) A) で得たレポーター遺伝子の下流に B) で得た DN Aライブラリ一を 結合するようにした発現ベクターを作製し、
D) 適当な宿主に C) で得た発現べクタ一を形質転換し、 レポーター遺伝子 が膜表面に発現している細胞を選択する、
E)得られた陽性細胞よりベクターを回収して目的の膜蛋白質をコ一ドして いる DNAの一部又は全部を含むクローンを得、
F) E) で得られた DNAが目的の膜蛋白質の一部のみを含む場合は、 配列 に基づき完全な DNAのクローンを得る。
また、 本発明はこれらの方法を用いることにより得られた c DNA、 該 DN Aを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体および該形質転換 体が産生する該 DN Aの転写産物に関するものである。
本発明者等は、 本発明の方法を用いることにより、 抗体作製が困難であり、 リガンドも同定されていないような全く新規の膜分子に対してもクロ一ニン グが行えることを、 明らかにしたものである。
本発明のクローニング法について各ステップごとに、以下に詳細に説明する。
A) まず最初に、 シグナル配列を持つ蛋白質を選定し、 その蛋白質のシグ ナル配列と N末端配列をコードする DNA (レポ一タ一遺伝子） を作製する。 シグナル配列を持つ蛋白質とは、 膜透過を行うような蛋白質であり、 例えば膜 蛋白質や分泌型蛋白質が挙げられる。 レポーター遺伝子としては、 例えば、 既 知の膜蛋白質を選定し、その膜蛋白質をコードする DN Aより トランスメンブ レン領域 （膜貫通領域） およびその下流を除いた DNAが挙げられる。 既知の 膜蛋白質とは、 該蛋白質をコードする核酸配列が既知であり （例えば該蛋白質 の c DNA配列が既知、 染色体 DN A配列が既知等） 、 トランスメンブレン領 域が推定できる膜蛋白質であって、膜表面に発現していることを確認できる膜 蛋白質であれば特に限定されないが、 同種由来の蛋白質 （例えば、 クローニン グしょうとしている新規な膜蛋白質 （目的の膜蛋白質） が哺乳動物由来であれ ば、 既知の膜蛋白質も哺乳動物由来） であることが好ましい。 この様な既知の 膜蛋白質の具体的な例としてはマウス L 3T4、 ヒ ト CD4、 ヒ ト HLA抗原 等の哺乳動物の既知の細胞表面抗原や、細胞表面に存在する受容体型チロシン キナーゼ、 受容体型セリンスレオニンキナーゼ、 サイ トカイン受容体等の種々 の受容体蛋白質が挙げられる。 これらの既知の膜蛋白質をコードする DNAよ り トランスメンブレン領域およびその下流を除いた DNAを遺伝子工学の一 般的手法（例えば DNA合成法、 cDNAの制限酵素等を用いた分解 ·精製等） を用いて作製する。
B) 次に、 目的の膜蛋白質をコードする DNAを含む DNAライブラリ一 を作製する。 目的の膜蛋白質をコ一ドする DNAを含む DNAライブラリーは、 c DN Aライブラリーであっても良いし、染色体 DN Aライブラリーであって も良い。 DN Aライブラリ一は、 遺伝子工学で用いられる一般的な方法で得ら れる。 例えば、 肝細胞で発現している新規な膜蛋白質が目的の膜蛋白質であれ ば、 肝細胞から mRNAを得、 脳細胞で発現している新規な膜蛋白が目的の蛋 白質であれば、 脳細胞から mRNAを得、 逆転写酵素により c DNAを作製し、 さらに DN Aポリメラーゼにより二本鎖 DN A分子とし、 この二本鎖 DN Aを、 適当なプラスミ ド又はファージ等のベクターに組み込み c DN Aライブラリ —を作製する。 また、 市販の DNAライブラリーを使用してもよい。 特定のフ ァミリ一遣伝子起源の膜蛋白質の c DNAを得ることを目的とする場合には、 ファ ミ リ一遣伝子に存在するモチーフ配列等の共通配列を利用 した degenerated PCRで濃縮した c DNAライブラリ一を用いるのが有利である。
C) そして、 A) で得たレポ一ター遺伝子の下流に B) で得た DNAライブ ラリ一の DN Aを結合した発現べクターを作製する。 この様な発現べクターの 作製に用いられるベクタ一の具体的な例としては、 p CD (Okayama et. Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) 、 p C D — S R (Takebeet. Mol. Cell. Biol.8:466, 1988)、 p CDM8 (フナコシ） 、 p BMG、 p E F、 pMAM (東 洋紡） 等があげられる。 これらのベクターに存在するプロモーターの下流に、 レポ一ター遺伝子および目的の膜蛋白質の DN Aを含むライブラリーの DN Aまたはそれをランダムに加水分解した DN Aが順次結合するように結合さ せ、 発現ベクターを構築する。 共通配列を利用した degenerated PCRで澳縮し た c DN A配列を用いる時は、 レポ一ター遺伝子に予めリ一ディングフレーム を合わせて c DN Aを結合することができるので有利である。
D) 適当な宿主に C) で得た発現ベクターを形質転換し、 レポ一ター遺伝子 が膜表面に発現している細胞を選択する。 DNAライブラリ一中のトランスメン プレン領域をコードする DNA が既知の膜蛋白質との融合蛋白質を形成してい る場合は、 細胞膜にトラップされ、 宿主細胞膜表面の既知の膜蛋白質のェピト ープに対する抗体で陽性となる。 トランスメンブレン領域を持たない cDNAで は既知の膜蛋白質との融合蛋白質が細胞膜上に保持されないため、分泌型融合 蛋白質となり既知の膜蛋白質に対する抗体では染まらない。 したがって、 既知 の膜蛋白質に対する抗体と結合する細胞を選択することにより、 目的の膜蛋白 質の全部又は一部の c D N Aを含む発現べクターで形質転換された細胞を選 択することができる。 宿主細胞としては、 たとえば、 目的の膜蛋白質が動物細 胞由来の場合は、 宿主として動物細胞を用いるのが好ましく、 例えば、 CO S 7の様に一過性に発現させることができる宿主が好ましい。 レポーター遺伝子 が膜表面に発現している細胞の選択には、 レポ一ター蛋白質に対する抗体を利 用したバニング法、 FACS等によるソーティング法等が用いられる。 これら の形質転換 ·発現 ·選択の操作は、 必要により数回繰り返すことにより、 目的 の膜蛋白質を発現する形質転換体 （陽性細胞） を濃縮することができる。
E)得られた陽性細胞よりベクタ一を回収して目的の膜蛋白質をコードして いる DNAの一部又は全部を含むクローンを得る。 必要により、 目的の膜蛋白質 をコードしている断片の塩基配列を決定し、 目的の膜蛋白質を例えば GENETYX (ソフトウエア開発会社） 等の解析ソフト等を利用して配列を解析 '検 索し、 目的の DN Aがクローニングされているかどうかを判断する。
F) E) で得られた DNAが目的の膜蛋白質の一部のみを含む場合は、 配列 に基づき、 c DNAライブラリーや染色体 DNAライブラリ一等の DNAライ ブラリーより完全な DNAのクローンの得る。 図面の簡単な説明
第 1図は、本発明のトランスメンブレントラップ法の具体例の概略示す図で ある。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例によりさらに具体的に説明する。本実施例において特 に断 ^のなレヽ限りは、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Man i at is 等 、 ColdSpring Harbor Laboratory, 1983) に基本的に従い実施した。 実施例 1 全 RNA (Total RNA) の調製
すなわち、 lxlO7個の Ba/F3細胞 （RIKEN Cell Bank, Cell No. RCB0805) を リン酸緩衝液で 2回洗浄し遠心により上淸を除いた後、 ペレットに IS0GEN (二 ツボンジーン） lml を加えてよく撹拌し、 室温で 5分間放置した。 懸濁液に、 クロ口ホルム 0.2mlを加えよく撹拌した後、 室温で 3分間放置した後、 5,000 rpml5分間 4 で遠心を行った。水相を回収し、 これに 2-プロパノール 0.5m】 を加えて撹拌し室温で 10分間放置した後、 15,000 rpm 15分間 4eCで遠心を 行った。 上淸を除き、 沈殿に 0.75%エタノール lmlを加えて撹拌し 15, 000 rpm
5 分間 4°Cで再び遠心を行い、 上清を除いた後にエタノールをよくとばして 水 20μ 1を加えて全 RNAを調製した。
実施例 2 mRNAの調製
mRNAの調製は Quick prep raaicro mRNA purification kit (Pharmacia) ¾· 用いて添付のマニュアルに従って行った。
( 1 ) 実施例 1で得られた全 RNA 溶液 20μ 1 に抽出緩衝液 （Extraction buffer ) 0.4mlを加え、 更に流出緩衝液 （Elution buffer) 0.8mlを加えて 撹拌し 15, 000 rpm 10秒間 4 °Cで遠心した。
(2) また別に、 オリゴ dT ビーズ lml をとり、 15,000 rpm 10秒間 4。じで 遠心を行った後、 上淸を除き、 2-1の上清 1.2mlを加えて穏やかに 3分間撹拌 した。
(3) 試料を 15， 000 rpm 10秒間 4°Cで遠心を行った後、 上清を除き、 髙塩 濃度緩衝液 （High- salt buffer) lmlを加えて撹拌した。 更に、 この操作を 5 回繰り返した。
(4) 高塩濃度 (High-salt buffer) を低塩濃度緩衝液 （Low- salt- buffer) に変えて、 （3) の操作を 2回行った。
(5) 試料を付属のカラムに移し 15, 000 rpm 5秒間 4°Cで遠心を行った。 更 に、 低塩漉度緩衝液 （Low-salt- buffer) 0.5mlをカラムに加え遠心する操作 を 3回行った。
(6) カラムに 65。Cの溶出緩衝液 （Elution buffer) 0.2mlを加えて、 15,000 rpm 5秒間 4°Cで遠心を行い mRNAを溶出する操作を 2回を行った。
(7) 溶出液に 3M 酢酸ナトリゥム溶液 40μ 1 とダリコーゲン 10μ 1 を加え て撹拌し、 更に 99.5%エタノール lmlを加えて- で 1時間放置した。
(8 ) 15,000 rpm 15分間 41で遠心を行った後、 上清を完全に除いて mRNA を得た。
実施例 3 cDNAの合成
cDNAの合成は Superscript preamplif ication system (GIBC0 BRい ¾r用レヽて マニュアルに従って つた。 すなわち、 ( 1 ) mRNAに DEPC水 11/ 1及び 30μΜ 5' -UNI-Xho I-ランダムプライマー 1 β 1を加えて、 70°C 10分間ィンキュベ一トした後、 直ちに氷上で 1分間放置 した。
5' -UNI-Xho I-ランダムプライマー （配列表の配列番号 1 )
5，- CCT- CTG- AAG- GTT- CCA- GAA- TCG- ATA- CTC- GAG- [N] [N] [N] - [N] GG - 3, 一 UNI sequence - Xho I -
(2) これに 0.1Mジチオスレィ トール （DTT) 溶液 2 // I、 25mM塩化マグネシ ゥム （MgCl) 溶液 2μ 1、 10χ逆転写酵素緩衝液 （RTase buffer) 2μ 1, 10mM dNTP 溶液 1 μ 1 を加えて室温で 5 分間放置した後、 逆転写酵素
(SuperScriptll) 1 μ 1を加えて室温で 10分間反応させ、 さらに 42°C 50分 間反応させた。
(3) 反応の停止を 70°C 15分間にて行った後、 E. coli リボヌクレア一ゼ H (RNaseH) 1μ 1を加えて 37°C 20分間反応させた。
実施例 4 ポリメラーゼチヱーンリアクション （P CR)
P C Rの条件を以下のように設定し、反応の開始はホッ トスタ一ト法にて行 つた。
P C Rの条件
94°C30秒 60°C30秒 72°C90秒 30 サイクル
P C R溶液
2.5mM dNTP 8 μ 1
1 O X緩衝液 （10X Buffer) 10μ 1
5，プライマ一 (5'primer) 1 μ 1
3，プライマー （3'primer) 1 μ 1
水 78 1
铸型 DNA (Template DNA) 1 μ 1
Taq ポジメラーゼ (Taq polymerase) l μ \
合計 100 μ ΐ P C Rプライマー
WSXWS degenerated プライマー （配列番号 2)
5' -TGG-AG(C/T)-(C/G) (A/C) (C/G) - TGG- AG (C/T)
UNI ブライマー （配列番号 3)
5' - CCT- CTG-AAG-GTT CCA - GAA- TCG-ΛΤΑ- G
実施例 5 ィンサ一ト cDNAの調製
(1 ) 実施例 4で得られた PC R反応物は Wizard PCR peps resin (Promega) を用いて脱塩、 プライマ一の除去等の精製を行い、 水 50 1 で溶出させた。
(2) この DNA溶液 50/z 1に 25mM dNTP 1μ 1、 1 0 X緩衝液 （10X Buffer) 6 μ1,Τ4 DNA ポリメラ一ゼ Ι ΐ を加え、 さらに水を加えて 60μ1 にした後、 37°C 15分間反応させた。
(3) Wizard DNApurification resin (Promega)により、 反応液の脱塩精製 を行い、 水 50 / 1で DNAを溶出させた。
(4) この溶液に制限酵素の Xhol \ μ ί, 1 OX緩衝液 OXbuffer) 6μ 1 を加え、 更に水を加えて 60μ1にした後、 37°C 60分間反応させた。
(5) Wizard DNApurif ication resinにより、 反応液の脱塩精製を行い水 20 β 1で DNAを溶出させた。 実施例 6 ベクター DNAの調製
(1) マウス し 3T4 cDNAのトランスメンブレン領域下流を除いた SacI〜HaeI 領域をクローニングベクターである pBluescriptn (東洋紡） 中のマルチクロ 一二ングサイ ト SacI〜SmaIサイ ト に挿入した。
(2) これを SacI〜ApaIサイ トで切り出して、 T4 DNAポリメラ一ゼ処理によ り末端を平滑化させた後、 動物細胞発現ベクターである pCAGGS (Gene, 108(1991) 193-200) の EcoRI サイ トを開いて平滑化させたサイ トに挿入した (pCAGGS- L3T4)。 （第 1図参照）
( 3 ) pCAGGS- L3T4ベクター 2 μ gに制限酵素 EcoRV及び Xholそれぞれ 1 μ 1と lOXBuffer 5μ 1を加え、 さらに水を加えて 50μ 1にした後、 37 °C 1時間 反応させた。
(4) 反応液を低温融解ァガロースゲルで電気泳動して、ベクターのバンドを 切り出した後、 68°C 10分間放置させた。
(5) Wizard PCR peps resinを用いて DNAを精製し水 20 μ 1で溶出させた。 実施例 7 ライゲ一シヨン反応
(1) インサート DNA 9μ 1 とベクター DNA 1// 1を混合させた後、 ライゲ一 ション反応液 I (ライゲーシヨンキット Ver.2,宝酒造） 10 1を加えて 16°C 30 分間反応させた。
(2) 反応液を Wizard DNApurification resinにより脱塩精製を行い、 水 20 μ 1で DNAを溶出させた。 実施例 8 cDNAの大量調整
(1) コンビテント大腸菌 DH10B 48/Z 1 に DNA 2 1 を加えて Gene Pulser cuvvete(Bio-Rad, 1mm)に移し、 1.25kV， 400Ω， 25 μ FDでエレク トロポレーショ ンを行った後、 直ちに 37 の SOB溶液 lmlを加え、 15mlのチューブに移して 37°C 1時間振盪させて形質転換を行った。
( 2 ) 上記で得られた培養液を LB培地 200mlに加えて 37°C 1夜振盪培養を行 つた。
(3) 6, OOOrpra 10分間 4°C で遠心して大腸菌を集菌後、 塩化セシウム法に て cDNAを回収した。 実施例 9 トランスフエクシヨン
(1) 6ゥヱルディッシュに lwell当たり 1X106の Cos7細胞を播き、 DMEM培 地（GIBC0)で 1夜培養する。
(2) Opti- MEM培地（GIBCO)100 i 1 と DNA 5 zgを混合させ、 また別に Opti - MEM培地 100μ 1と Lipofectin(GIBCO) 5/x 1を混合させた。 更に、 両液を混合 させて室温で 30分間放置した。
(3) これに 800/X 1の 0pti_MEM培地を加えて、 Opt i- MEM培地で 2回洗浄し た Cos7細胞にかけ、 8時間培養した。
(4) 培養液を DMEM培地に交換してさらに 2日間培養した。 実施例 1 0 FACS ソーティング
FACSソーティングは基本的には FACS装置 （Vantage, Vecton Dickinson ) に添付のマニュアルに従って行った。 また、 細胞の染色法は 「免疫研究の基礎 技術」 （高津聖志、 瀧伸介編 羊土社） に基本的に従った。
(1) 6ゥヱルディッシュに 1 ゥェル当たり 5mM EDTA - PBS溶液 1mlを加え て、 室温で 10分間放置し、 ピペッティングを行うことにより Cos7細胞をデ ィッシュよりはがした。
(2) 細胞を 5%FCS-PBS溶液で洗浄後、 1, 500rpm 5分間 室温で遠心を行い、 上清を除き、 ペレッ トに FITC標識抗 L3T4モノクローナル抗体（Pharmingen) 1 μ 1を加えて氷上に 30分間放置した。
( 3 ) 5%FCS-PBS 溶液で 2回洗浄後、 上清を除き、 lmg/ml の Popidium lodide-PBS溶液に懸濁して FACS (Vantage, Vecton Dickinson)にて L3T4 (FITC) 陽性細胞をソーティングした。 実施例 1 1 ハートェクス トラクシヨン （Hirt Extraction)
(1) ソーティングした細胞を 5, OOrpm 5分間 4 で遠心を行い、 上清を除い た後、 0.6%SDS- lOmMEDTA溶液 0.4mlを加えて室温で 分間放置後、 5M食塩 水 0. lmlを加えて氷上で 1夜放置した。
(2) 4°C 15,000rpm 30分間で遠心を行った後、 上清を回収して、 フエノー ルクロロホルム抽出処理を行い、 更にエタノール沈殿を行った。 水 5 tl を加 えることにより DNA沈殿を溶かした。 実施例 1 2
実施例 8から 1 1の操作を 3回繰り返すことにより陽性細胞を濃縮した。 実施例 1 3 塩基配列の決定
(1) 澳縮した陽性細胞より Hirt Extraction法にてプラスミ ド DNAを回収し、 大腸菌を形質転換させて LBプレ一ト上に播いた。
(2)プレートよりシングルコロニーを拾いアル力リ法にてプラスミ ド DNAを 回収して、 Wizard DNApurif ication resinで DNAを精製した。
、3 Cycle seqenceによる Dye terminator法 (Perkin Elmer) 行つ； Γこ後、 自動塩基配列分析機（アプライ ド バイオシステムズ 373Α)にて DNA塩基配列 の決定を行った。
(4)決定した DNA塩基配列を Gen-Bankに照会して相同性検索を行った結果、 得られた DNAはインターロイキン 3受容体をコードしていた。
実施例 14
WSXWSモチーフを利用した WSXWS degenerated primerの設計を変更して、 ヒ ト I L— 3またはヒ ト GM— C S F依存性ヒ ト白血病細胞株である F36P細 胞 （RIKEN Cell Bank, Cell No. RCB0775) を用いて、 実施例 1から 1 3と同 様に行った。
その結果、 プライマ一（ 1 )より KH 97 ( I L一 3 R/3ユニッ ト） 遺伝子を 効率的にクローニングすることができ、 さらにプライマー（2)より I L一 2 R y , I L— 4 Ra、 I L— 6 R α遺伝子、 プライマ一（ 3 )より GM— C G F R α遣伝子、 プライマー（4)より I L— 1 3 R a遺伝子、 プライマー（5) 9より E p o R遺伝子が効率的にクローニングされた。
WSXWS デイジエネレーティッドプライマ一（degenerated primer)
(1) 5'- TGG- AG(C/T)- GAN-TGG- AGT (配列番号 4)
(2) 5'- TGG- AG(C/T)-GAN- TGG- AGC (配列番号 5)
(3) 5' -TGG-AG (C/T) -NCC-TGG-AGT (配列番号 6)
(4) 5' -TGG- AG (C/T)- AAN- TGG- AGT (配列番号 7 )
(5) 5' -TGG-AG (C/T) -NCC-TGG-TC (配列番号 8) 配列表
配列の数： 8
配列番号： 1
配列の長さ ： 36
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列の特徴
存在位置： 31
他の情報： N=A,C,Gおよび T
存在位置： 32
他の情報： N=A, C， Gおよび T
存在位置： 33
他の情報： N=A， C, Gおよび T
存在位置： 34
他の情報： N=A,C，Gおよび T
配列：
CCTCTGAAGG TTCCAGAATC GATACTCGAG NNNNGG 36 配列番号： 2
配列の長さ ： 15
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列の特徴
存在位置： 6
他の情報： N および T 存在位置： 7
他の情報： N=Cおよび G
存在位置： 8
他の情報： N=Aおよび C
存在位置： 9
他の情報： N および G
存在位置： 15
他の情報： N=Cおよび T
配列：
TGGAGNNNNT GGAGN 15 配列番号： 3
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列：
CCTCTGAAGG TTCCAGAATC GATAG 25 配列番号： 4
配列の長さ ： 15
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
存在位置： 6
他の情報： N-Cおよび T 存在位置： 9
他の情報： N=A,C,Gおよび T
配列：
TGGAGNGANT GGAGT 15 配列番号： 5
配列の長さ ： 15
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列の特徴
存在位置： 6
他の情報： N=Cおよび T
存在位置： 9
他の情報： N=A,C，Gおよび T
配列：
TGGAGNGANT GGAGC 15 配列番号： 6
配列の長さ ： 15
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列の特徴
存在位置： 6
他の情報： N=Cおよび T
存在位置： 7 他の情報： N=A,C, Gおよび T
配列：
TGGAGNNCCT GGAGT 15 配列番号： 7
配列の長さ ： 15
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列の特徴
存在位置 6
他の情報 N-Cおよび T
存在位置 9
他の情報 N=A，C,Gおよび T
配列：
TGGAGNAANT GGAGT 15 配列番号： 8
配列の長さ ： 14
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列の特徴
存在位置： 6
他の情報： N=Cおよび T
存在位置： 7
他の情報： N=A,C,Gおよび T 配列：
TGGAGNNCCT GGTC 14

Claims

請求の範囲
1. 以下のステップからなる膜蛋白質をコードする DNAのクローニング方法。
A) シグナル配列を持つ蛋白質を選定し、 その蛋白質のシグナル配列と N末 端配列をコードする DNA (レポーター遺伝子） を作製する、
B) 目的の膜蛋白質をコ一ドする DNAを含む DNAライブラリーを作製す る、
C) A) で得たレポーター遺伝子の下流に B) で得た DN Aライブラリ一を 結合するようにした発現べクタ一を作製し、
D) 適当な宿主に C) で得た発現ベクターを形質転換し、 レポーター遺伝子 が膜表面に発現している細胞を選択する、
E)得られた陽性細胞よりベクタ一を回収して目的の膜蛋白質をコードして いる DNAの一部又は全部を含むクローンを得、
F) E) で得られた DN Aが目的の膜蛋白質の一部を含む場合は、 得られた 配列に基づき完全な DNAのクローンを得る。
2. レポーター遺伝子が、 既知の膜蛋白質をコードする DNAより トランスメ ンブレン領域およびその下流を除いた DN Aであるところの請求の範囲第 1 項記載の膜蛋白をコ一ドする DNAのクローニング方法。
3. 既知の膜蛋白質が、 哺乳動物細胞の細胞表面抗原蛋白質であるところの請 求の範囲第 2項記載の膜蛋白質をコ一ドする DN Aのクローニング方法。
4. 既知の膜蛋白質が、 マウス L 3T4であるところの請求の範囲第 2項記載 の膜蛋白質をコードする DNAのクローニング方法。
5. 目的の膜蛋白質の DNAを含む DNAライブラリーがフアミリー遺伝子に 存在するモチーフ配列を利用した degenerated PCRで澳縮した c D N Aライブ ラリーを用いるところの請求の範囲第 1項記載の膜蛋白質の DN Aのクロ一 ニング方法。
6.適当な宿主が動物細胞宿主であるところの請求の範囲第 1項記載の膜蛋白 質の DN Aのクロ一ニング方法。
7.請求の範囲第 1項から第 6項記載の方法で得られた新規な膜蛋白質をコ一 ドする DNA。
8. 請求の範囲第 7項に記載の DN Aを含む発現ベクター。
9. 請求の範囲第 8項に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
1 0. 請求の範囲第 9項に記載の形質転換体を培養して得られた膜蛋白質。
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