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WO1998003667A1 - SYSTEMES DE PRODUCTION DE GRANDES QUANTITES DE PROTEINES OU DE PEPTIDES A L'AIDE DE MICRO-ORGANISMES DU GENRE $i(HUMICOLA) - Google Patents

SYSTEMES DE PRODUCTION DE GRANDES QUANTITES DE PROTEINES OU DE PEPTIDES A L'AIDE DE MICRO-ORGANISMES DU GENRE $i(HUMICOLA) Download PDF

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Publication number
WO1998003667A1
WO1998003667A1 PCT/JP1997/002560 JP9702560W WO9803667A1 WO 1998003667 A1 WO1998003667 A1 WO 1998003667A1 JP 9702560 W JP9702560 W JP 9702560W WO 9803667 A1 WO9803667 A1 WO 9803667A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
expression vector
terminus
gene
plasmid
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/002560
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tatsuki Moriya
Kouichirou Murashima
Kaoru Aoyagi
Naomi Sumida
Manabu Watanabe
Toru Hamaya
Jinichiro Koga
Toshiaki Kono
Takeshi Murakami
Original Assignee
Meiji Seika Kaisha, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Seika Kaisha, Ltd. filed Critical Meiji Seika Kaisha, Ltd.
Priority to US09/230,225 priority Critical patent/US6403362B1/en
Priority to DK97933002T priority patent/DK0953644T3/da
Priority to AU36346/97A priority patent/AU3634697A/en
Priority to JP50680898A priority patent/JP3593134B2/ja
Priority to EP97933002A priority patent/EP0953644B1/en
Priority to DE69738079T priority patent/DE69738079D1/de
Publication of WO1998003667A1 publication Critical patent/WO1998003667A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/823—Lower fungi, e.g. mold

Definitions

  • the present invention relates to microorganisms belonging to the genus Humicola, in particular, Humicola 'insolens
  • Filamentous fungi are known to secrete proteins extracellularly. Therefore, with regard to filamentous fungi, high-producing cells and culture methods for efficiently producing proteins have been studied and developed.
  • the main method is to create artificial mutations by UV irradiation, mutagenic agents, etc., and select a strain that produces a large amount of the target protein from them.
  • thermophilic filamentous fungus Humicola insolens also has excellent protein secretion ability. It is also known that Humicola insolens produces a variety of industrially useful cellulases (W091 / 17,243, JP-T-5-509,223). ).
  • the useful component in the total secreted protein of Shimadori, Shinaikikura and Humicola insolens is only a few percent. Establishing a method to express and secrete large amounts of these trace useful components will dramatically improve the performance of the final product. In addition, if a method for expressing large amounts of heterologous genes in Humicola insolens is established, various enzymes and useful proteins can be produced by a single method, which will result in a cheaper supply capacity.
  • Humicola insolens as a useful protein production host is a thermophilic filamentous fungus, so the optimal culture temperature is around 37 ° C, and it is less susceptible to contamination by other bacteria during culture. There are advantages.
  • the present inventors have now established a method for mass-producing a substance belonging to the genus Humicola, particularly a target protein in Humicola insolens.
  • an object of the present invention is to provide a substance belonging to the genus Humicola, particularly an expression system which enables large-scale production of proteins in Humicola insolens, particularly a host-to-host system, and a method for producing a protein using the same.
  • an extremely efficient protein production system in which the productivity of the target protein is 10 to 16 times that of the parent strain and the production amount is about 4.5 g per liter of the culture solution. Is done.
  • FIG. 1 is a restriction enzyme diagram of plasmid pM3_1.
  • Figure 2 shows the restriction map of plasmid pMl4-1.
  • FIG. 3 is a restriction map of the plasmid vector pMKDO1.
  • FIG. 4 is a restriction map of the plasmid vector pEGDO1.
  • FIG. 5 is a restriction map of the plasmid vector pIED02.
  • the Escherichia coli J M109 strain transformed with the plasmid pM3-1 represented by the map shown in Fig. 1 was FERM BP-5971 (Original deposit: FE RM P-14459, Original deposit date: August 1994) It has been deposited with the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Life Science and Industrial Technology Research Institute (1-1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) under the accession number 3).
  • the strain JM109 transformed with the plasmid pMl4-1 represented by the map shown in FIG. 2 was FERM BP-5972 (original deposit: FE RM P-1458). 5, Original deposit date: October 18, 1994), deposited under the Ministry of International Trade and Industry's Industrial Technology ⁇ Life Engineering Industrial Technology Research Institute under the accession number.
  • the E. coli JMl09 strain transformed with the expression vector pMKDO1 according to the present invention was traded under the accession number of FERM BP-5974 (original deposit: FERM P-15730, current deposit date: July 12, 1996). It has been deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Ministry of Industry.
  • the Escherichia coli J Ml09 strain transformed with the expression vector pEGDO1 according to the present invention was traded under the accession number of FERM BP-5973 (Original deposit: FERM P-15729, Original deposit date: July 12, 1996). It has been deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Ministry of Industry.
  • the E. coli JMl09 strain transformed with the expression vector p I EDO2 according to the present invention has the accession number of FERM BP-5975 (original deposit: FERM P-15731, original deposit: July 12, 1996). And deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry.
  • the E. coli JM109 strain transformed with the expression vector pNCE4Sa1 according to the present invention was deposited under FERM BP-5976 (original deposit: F ERM P-15732; Hara deposit: July 12, 1996). It is deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry under the number.
  • Humicola insolens MN 200-1 which can be a host of the expression vector according to the present invention, was traded under the accession number of FERM BP-5977 (Original deposit: F ERM P-15736, Original deposit date: July 15, 1996). Ministry of Industry, Technology and Technology Deposited with the Institute of Technology.
  • proteins and peptides are used synonymously unless otherwise specified.
  • the modified sequence refers to a base sequence or an amino acid sequence.
  • amino acid sequence it means that one or several bases or amino acids have been inserted, substituted or deleted, or 3 ⁇ 4 has been added to one or both ends thereof.
  • control sequence derived from Humicola insolens is used.
  • the control sequence means at least one selected from the group consisting of a promoter, a signal sequence, and a terminator.
  • the control sequence according to the present invention is preferably a control sequence of the cellulase NCE1 gene derived from Humicola insolens described in JP-A-8-56663, and furthermore, a Humicola 'insolenz described in JP-A-8-126492.
  • This is a regulatory sequence of a cellulase NCE2 gene derived therefrom. More specifically, NCE 1 and 2 within plasmids pM3-1 and pMl4-1 in the strains deposited under FERM BP-5971 and FERM BP-5972. This is the control array.
  • Examples of preferred promoter sequences in the present invention include a sequence present in a region from the N-terminus of the NCE1 gene up to about 1500 bP in the plasmid pM3-1 shown in the map of FIG. The sequence from the N-terminus of NCE 1 site to the BgIII site upstream is shown in the figure.
  • a preferred promoter sequence in the present invention is a plasmid pMl4-1 shown in the map of FIG. 2 in the region from the N-terminus of the NCE2 gene up to about 1500 bp upstream.
  • the sequence from the N-terminus of the NCE2 gene to the upstream EcoRI site in the figure is a plasmid pMl4-1 shown in the map of FIG. 2 in the region from the N-terminus of the NCE2 gene up to about 1500 bp upstream.
  • the promoter sequence according to the present invention includes not only the entire sequence of these regions but also its modified sequence that retains high promoter activity.
  • high motor activity means high expression in NCE4 gene expression described below. More specifically, a promoter activity that expresses 2.Og, preferably 4.Og, more preferably 4.5g of NCE4 per liter of medium.
  • examples of a preferable signal sequence in the present invention include a signal sequence of cellulase NCE 1 or 2. More specifically, a sequence encoding the sequence of amino acids 22 to 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and the sequence of amino acids 23 to 1 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Code the array ⁇ Arrays are listed.
  • the invention further includes modified sequences thereof that encode an amino acid sequence that still retains signal sequence activity. Such modified sequences are also described in the Examples described below, the strains deposited under FERM BP-5971 and FER BP-5972, and those skilled in the art given the mapping ability of FIG. 1 or 2. If so, it is clear that the presence of such a modified sequence can be easily predicted, and that it can be easily produced.
  • the target protein is obtained as a fusion protein with a peptide consisting of several amino acids at the N-terminal side of NCE1 or NCE2, and further as a fusion protein with NCE1 or NCE2. You may be.
  • a preferred terminator sequence in the present invention is the plasmid pM3-1 shown in the map of FIG. Sequences existing in a region of up to 00 bp, for example, a sequence from the C-terminus of NCE ⁇ to a downstream Bgill site. Another example is a sequence present in a region from the C-terminus of NCE 2 ⁇ to about 500 bp downstream of NCE 2 ⁇ in the plasmid pM14-1 shown in the map of FIG. 2, for example, the NCE 1 gene. From the C-terminus to the downstream Bg1II site.
  • the terminator sequence according to the present invention includes not only the entire sequence of these regions but also a modified sequence that retains the terminator activity.
  • control sequence preferably used for expression of the NCE4 gene is 10 to 16 times that of the parent strain from which the enzyme is derived, and the production amount is 1 liter of culture solution. Each reaches 2.0 g, preferably 4.0 g, more preferably about 4.5 g.
  • Expression vector and host is 10 to 16 times that of the parent strain from which the enzyme is derived, and the production amount is 1 liter of culture solution. Each reaches 2.0 g, preferably 4.0 g, more preferably about 4.5 g.
  • an expression vector for expressing a target protein using the control sequence is provided.
  • the expression vector according to the present invention comprises the above-mentioned control sequence and, in some cases, a gene marker. Furthermore, an expression vector according to the present invention comprises the expression vector of the first aspect, and further comprises a base sequence encoding a target protein operably linked to its control sequence. Therefore, an expression vector comprising at least one selected from the group consisting of the above-mentioned promoter, signal sequence, and terminator according to the present invention is included in the scope of the present invention.
  • the promoter sequence according to the present invention has extremely high utility.
  • an expression vector comprising at least the promoter sequence of the present invention.
  • the signal sequence and the terminator sequence may be other than the signal sequence and the terminator sequence according to the present invention. Use is preferred.
  • Specific examples of these vectors include the expression vectors pMKD01, pEGD01, and p1ED02 constructed in Examples described later, in which the NEC3 and NCE4 genes are removed. Is mentioned.
  • the expression vector according to the present invention is preferably constructed on the basis of a vector capable of replicating in a host cell, for example, a plasmid.
  • a vector capable of replicating in a host cell for example, a plasmid.
  • examples of such vectors include pUC Vector, pTV Vector. PBluescript, and pBR322, which are vectors that can be replicated in E. coli.
  • a technique required for constructing the vector according to the present invention a method commonly used in the field of gene recombination can be used.
  • the gene may be appropriately selected depending on the method of selecting a transformant.
  • a gene encoding drug resistance and a gene complementing auxotrophy can be used.
  • the drug resistance gene used in the present invention is not limited as long as it relates to a drug to which a host cell is sensitive.
  • a destomycin-resistant gene derived from Streptomyces rimofaciens, Escherichia E. coli-derived digromycin B resistance gene, Streptococcus hi ndustanus-derived bleomycin resistance gene, and Streptomyces hygroscopicus-derived bialaphos resistance gene can be preferably used.
  • the promoter and terminator of the trp C gene derived from Aspergillus niduians are obtained by a known method.
  • the ability to use a cassette which is capable of expressing a destomycin resistance gene Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 59-175889) is preferably used.
  • the expression vector according to the present invention can be used for expression production of various target proteins or peptides.
  • the target protein or peptide means not only a so-called foreign protein that is not present in Humicola insolens, but also a protein that is expressed in Humicola insolens but is a quantity thereof.
  • the residue encoding the target protein in the expression vector according to the present invention includes a residue encoding an industrially useful protein such as cellulase, amylase, lipase, lipase, phytase and the like. . Genes obtained by artificially improving these can also be used as target proteins.
  • the expression vector according to the present invention is used as an expression system in combination with a host belonging to the genus Humicola as a host.
  • a host belonging to the genus Humicola as a host.
  • Humicola insolens is used as a substance belonging to the genus Humicola.
  • the expression system according to the present invention can be preferably used for producing cellulase NCE4 derived from Humicola insolens or a modified protein thereof as a target protein.
  • the cellulase NCE4 derived from Humicola insolens means the protein described in SEQ ID NO: 3. This is a cellulase enzyme isolated by the present inventors, as described in Examples below.
  • the modified protein is a protein in which amino acid addition, insertion, deletion of IJ, deletion, or substitution has occurred in the amino acid sequence of the above protein, and is still the same as cellulase NCE4. That retain cellulase activity, especially endoglucanase activity.
  • an expression vector constructed according to an example described later is used as a specific example of a vector preferable as an expression system for these cellulase NCE4.
  • an expression vector constructed according to an example described later is used as a specific example of a vector preferable as an expression system for these cellulase NCE4.
  • Transformation of host cells with the expression vector according to the present invention can be carried out by a method commonly used in the field of genetic recombination, for example, according to the method described in JP-A-8-56663. Can be implemented. It may also be implemented by electroporation.
  • the production of the target protein according to the present invention is carried out by culturing a host cell transformed with the above-described expression vector according to the present invention in a suitable medium, and collecting the target protein or the peptide from the culture. .
  • the productivity of the target protein is 10 to 16 times that of the parent strain, and the production amount is 2.0 g, preferably 4.0 g, per liter of culture.
  • a very efficient protein production system more preferably up to about 4.5 g, is provided.
  • the host cell is Humicola 'insolens, it can produce 2.O g, preferably 4.O g, more preferably 4.5 g or more of the target protein per liter of the culture.
  • This amount is extremely large as compared with conventionally known protein expression systems. This indicates that the expression system of the target protein according to the present invention has extremely high utility.
  • the protein of interest is cellulase NCE3 or NCE4, these enzymes are inherently highly active, but can produce them in larger quantities. As a result, there is obtained an advantage that it is possible to efficiently produce a cellulase preparation useful for removing fluff of cellulose-containing fibers, reducing the weight thereof, and decolorizing denim-dyed cellulose-containing fibers.
  • the transformant is cultured in a liquid medium containing conventional components such as a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and a growth factor component under aerobic conditions, Perform by shaking culture, electric stirring culture or submerged culture be able to.
  • the pH of the medium is, for example, about 7 to 8.
  • Culturing is carried out under the usual conditions customary for culturing Humicola insolens, for example when the host cell is Humicola insolens, for example 15 ° C to 45 ° C, preferably 35 to 40.
  • the cultivation time can be about 24 to 240 hours.
  • ordinary separation means utilizing the properties thereof, such as a solvent extraction method, an ion exchange resin method, an adsorption or distribution column chromatography method, and a gel filtration method , Dialysis, precipitation, etc. can be used alone or in appropriate combination.
  • Example A 1 Isolation and Purification of a Component Active in Removing Tencel Fuzz from Humicola Insolens
  • Humicola Insolens MN 200-1 in (N) medium (5.0% Avicel, 2.0% yeast extract, 0.1% polypeptone, 0.03% calcium chloride, 0.03% magnesium sulfate, pH 6.8 ), And cultured at 37 ° C. After culturing for 7 days, the resulting culture was centrifuged at 7000 rpm for 20 minutes to remove the cells, and the culture supernatant was used as a crude cellulase preparation.
  • This crude cellulase preparation was subjected to hydrophobic mouth chromatography (Pheny Sepharose High Performance 6/100, manufactured by Pharmacia Biotech) and subjected to a concentration gradient of 110 M in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0). Eluted with the ammonium sulfate solution and fractionated. Among them, the fraction obtained at a concentration gradient of 0.1 to 0 M showed strong activity to remove Tencel fuzz, and the fraction was again subjected to hydrophobic chromatography (Phenyl-Sepharose High Performancel 6/100). Ammonium sulfate in a concentration gradient of 0.4-0 M in 5 OmM phosphate buffer (pH 7.0) The active fraction was eluted with the solution and collected.
  • the fraction was subjected to reverse phase chromatography (Sourcel5 IS0, manufactured by Falman Biotech), and ammonium sulfate subjected to a concentration gradient of 110 M in 5 OmM phosphate buffer (pH 7.0). Eluted with the solution and fractionated. Among them, the fraction obtained at 0M portability showed strong tencel fuzz removal activity, and the fraction was subjected to reverse phase chromatography (Source 15 PHE, manufactured by Pharmacia Biotech). Elution with ammonium sulfate solution with a concentration gradient of 1 to 0 M in 5 OmM phosphate buffer (pH 7.0) was performed, and the fraction with high tencel fuzz removal activity was isolated as a purified enzyme NCE 4. did. This NCE 4 showed a single band with a molecular weight of 43 kDa in SDS-PAGE.
  • N-terminal amino acid sequence Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp- (Cys)-(Cys) -Lys-Pro-Ser (15 residues)
  • the protein purified by the FPLC of the above (1) was lyophilized and then dissolved in 100 mM ammonium bicarbonate buffer (pH 8.0). About 1 to 20 moles of trypsin (Promega) was added to the protein and reacted at 37 ° C for 48 hours. This degradation product was subjected to column chromatography using a Model 172 preparative HPLC system (manufactured by PerkinElmer) (column: C8220 2.1 mm, 0.1% TFA, 0% acetonitrile to 0.085% TFA, 35% acetonitrile gradient) and three kinds of peptides were collected. The amino acid sequence of the obtained peptide fragment was determined by the aforementioned protein sequencer. The results were as follows.
  • the N-terminal amino acid sequence and the amino acid sequence obtained by peptide mating were obtained from the 43KDa endoglucanase obtained from Humicola insolens DSM1800 described in W091Z17243 (Tokuhyo Hei 5-509223).
  • the protein showed homology to the amino acid sequence of the above, strongly suggesting that the protein was a kind of cellulase.
  • Genomic DNA was isolated according to the method of Horiuchi et al. (Hiroyuki Horiuchi et al., J. Bacteriol., 170: 272-278, 1988).
  • Humicola insolens MN200-1 was cultured at 37 ° C. in the aforementioned (N) medium. After culturing for 2 days, cells were collected by centrifugation (3500 rpm, 10 minutes). The obtained cells were treated with phenol, treated with proteinase and ribonuclease A, and further subjected to polyethylene glycol (PEG) precipitation to obtain genomic DNA.
  • N aforementioned (N) medium.
  • PEG polyethylene glycol
  • Humicola insolens genomic DNA was digested with Sau3A I, and after agarose gel electrophoresis was confirmed to be partially degraded in the range of 9 to 23 kbp, this was recovered by ethanol precipitation.
  • This DNA fragment was ligated to a BamHI arm of a phage vector, EMBL3 cloning kit (Stratagene) using T4 ligase (Toyobo Co., Ltd.). After precipitation with ethanol, this was dissolved in a TE (1 OmM Tris-HCl (pH 8.0), lmM EDTA) buffer solution.
  • the entire ligation mixture was frozen and packaged as described in the method of Hohn. B. (Hohn, B. Methods Enzymol., 68: 299-309, 1979) and the Gigapack II Packaging Kit (Stratagene). Phage), and the resulting phage was used to infect E. coli strain LE392. Using the 5 ⁇ 1 CT phage library obtained by this method, the target gene was cloned.
  • a long probe was prepared by PCR using the total DNA of Humicola 'insolens type II and used. Each primer synthesized DNA corresponding to the amino acid indicated by * at the N-terminus and the peptide TP-3.
  • the sequence of the prepared synthetic oligonucleotide was as shown below.
  • NCE4N1 5'-GCXGA (CT) GGXAA (AG) TC (AGCT) AC-3 '(17mer)
  • NCE4N2 5 'GCXGA (CT) GGXAA (AG) AG (CT) AC-3' (17mer)
  • NCE4C 5- 'CXGC (AG) TT (CT) TT (AG) AACCA (AG) TC-3' (19mer)
  • the PCR reaction was performed under the following conditions. First, two sets of tubes were added to the Humicola insolens genome D NAl zg, with 1 M each of NCE4N1 and NCE4C added as primers, and 1 M each of NCE4 N2 and NCE4C added as primers. Heat denaturation was performed at 5 ° C for 5 minutes. Thereafter, Taq polymerase (Recombinant Taq, manufactured by Takara Shuzo) was added, and amplification was performed by repeating the reaction conditions of 94 ° C for 1 minute, 45 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes 25 times. As a result, about 750 bp of DNA was amplified only when NCE4NK NCE4C was used as a primer. This was used as a probe for subsequent screening.
  • Taq polymerase Recombinant Taq, manufactured by Takara Shuzo
  • the phage plaques prepared according to the method described in Example 2 were transferred to Hybond Nylon Trans-Farm Membrane (manufactured by Amersham), denatured with 0.4N sodium hydroxide, and then denatured with 5-fold concentration SSC (15 mM The mixture was washed with trisodium acid (15 OmM sodium chloride), dried, and the DNA was fixed. Following the kit procedure, pre-hybridization (42 ° C) for 1 hour, followed by labeling The probe thus obtained was added, and hybridization was performed for 4 hours (42.C). Label washing was performed according to the kit method described above. First, wash twice for 20 minutes at 42 ° C with 0.5% SSC containing 0.4% SDS and 6 M urea, and then wash twice for 5 minutes at room temperature with 2% concentration SSC. Was.
  • the membrane was immersed in the attached detection solution for 1 minute and exposed to Hyperfilm-ECL (Amersham) to obtain 4 positive clones.
  • E. coli LE 392 was infected with phage, and after 8 hours, phage particles were collected and treated with proteinase K and phenol by Grossberger's method (Grossberger, D., Nucleic Acids. Res. 156737.1987), followed by ethanol precipitation. Phage DNA was isolated.
  • the four phage DNAs were digested with SalI and subjected to agarose electrophoresis.
  • the DNA was transferred to a nylon membrane by the Southern method (Southern, EM, J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975), under the same conditions as the plaque hybridization of the previous method (1). Then, hybridization was performed using a probe of about 750 bp, and a DNA fragment containing the 5.2 kbp target gene was detected. As a result, four kinds of phage DNAs had Sal I fragments of the same size.
  • the nucleotide sequence was determined as follows.
  • A.L.F. DNA Sequencer II (Pharmacia Biotech) was used as a base sequence analyzer.
  • a sequencing gel an acrylic amide carrier available as a ready-mix gel (manufactured by Pharmaman Biotech) or a hide-mouth link long ranger (manufactured by FMC) was used.
  • A.L.F grade reagents (Pharmacia Biotech) were used as various gel preparation reagents (N, N, K, N'-tetramethylethylenediamine, urea, ammonium persulfate). Nucleotide sequence analysis was performed using an autoread sequencing kit (Pharmacia Biotech). Gel preparation conditions, reaction conditions, and electrophoresis conditions were set with reference to the details of each instruction manual.
  • the template DNA, pNCE4Sa1 was alkali-denatured with 10 g of 2 M sodium hydroxide, and then annealed with the universal primer attached to the autoleading-genesis kit to perform an extension reaction. Decoding the reaction product with a sequencer revealed a nucleotide sequence of 546 bp. Based on these results, a FITC-labeled sequencing primer MNEG01 was prepared, reacted with pNCE4Sa1, and further decoded. Based on the obtained results, the following primers were further prepared, and as a result of decoding, the full length of NCE4 was decoded. The prepared FITC-labeled sequencing primer was as shown below.
  • FITC-labeled sequencing primers DNA of MNEG-05 to MNEG-08 were synthesized.
  • the prepared FITC-labeled sequencing primer was as shown below.
  • NEG-05 5'-GACCTGACGGAAGCTGAAGCTCG-3 '(23mer)
  • mRNA was prepared from Humicola insolens MN200-1 and cDNA was synthesized by reverse transcription ⁇ , and this was compared with the genomic base sequence to determine the same region.
  • Humicola insolens MN200-1 was cultured in a cellulase induction medium, preferably the above (N) medium, for 2 days, and the cells were collected by centrifugation (3500 rpm, 10 minutes). 2 g of the cells were washed with sterile water, and frozen with liquid nitrogen and pulverized with a blender (Nippon Seiki homogenizer AM-3). This was mixed with 10 ml of a denaturing solution containing 4 M guanidine thiosuccinate (4 M guanidine thiocyanate, 25 mM trisodium citrate, 0.5% N-sodium lauryl sarcosine, 0.1 M mercaptoethanol ).
  • mRNA Pure Kit manufactured by Falman Abbiotech.
  • RNA RNA was dissolved in an lm1 lysis buffer, and subjected to a heat denaturation treatment at 65 ° C for 10 minutes. After quenching in ice, 0.2 ml of sample buffer was added. The entire amount of the RNA solution was charged into an oligo (dT) cellulose column, washed three times with Neusalt buffer and three times with low salt buffer, and eluted with an elimination buffer heated to 65 ° C. . This column operation was repeated twice to obtain an mRNA fraction. The yield was 19.2 g and the yield was 2%.
  • cDNA synthesis was carried out using a Timesaver cDNA synthesis kit (Falman Biotech).
  • Oligonucleotide primers having the following sequences were prepared as N-terminal and C-terminal primers.
  • NCE4-CN 5 '-ATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCCGCTCCGCC-3' (30mer)
  • NCE4-CC 5 '-TACAGGCACTGATGGTACCAGTCATTAATC-3' (30mer)
  • the PCR reaction was performed under the following conditions. First, 1 M of each primer was added to Humicola insolens cDN Al / zg, and heat denaturation was performed at 94 ° (:, 10 minutes in the presence of dNTP. Thereafter, Taq polymerase (recombinant Taq, Takara Shuzo Ne ⁇ 0 was added and amplified by repeating the reaction conditions at 94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes 30. ⁇ The amplified fragment was analyzed by agarose gel electrophoresis and found to be 0.9 kbp. This was concentrated by ethanol precipitation, and cloned with pT7 blue vector kit (Novagen), and this plasmid was designated as pCNCE4.
  • the sequencing reaction was performed using the automatic lead sequencing kit as described above. Plasmid p CNCE 4 was alkali-denatured with 2M sodium hydroxide and precipitated with ethanol. This single-stranded plasmid was used as a template and reacted with T7 polymerase. A reaction was performed using the synthetic primers MNEG01, MNEG02 NEG03. MNEG04. MNEG05, MNEG06> MNEG07, and MNEG08, and the universal primer and reverse primer attached to the kit, and the sequence was decoded. As a result, there was one intronic force of 56 bp, '.
  • the non-translation initiation sequence, its termination sequence, and the regulatory sequence within the intron are as follows (the numbers are the sequence position numbers of SEQ ID NO: 3).
  • LB agar medium containing 100 g / ml ampicillin, lmMI PTG, 0.004% X-ga 1 1% polypeptone, 0.5% yeast extract, l% NaCl, A white colony capable of growing on 1.5% agar was selected and further added to an LB medium containing 100 1111 ampicillin (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, l% The cells were cultured at 37 ° C in NaCl). Plasmid DNA was recovered from the resulting culture using the alkaline SDS method.
  • This plasmid DNA was cut with BamHI and subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to select a plasmid DNA in which the BaniHI site of PUC118 DNA was disrupted.
  • This plasmid DNA was designated as pUC118B.
  • pUC118BK DNA was cut with SphI, and a plasmid DNA in which the SphI site of PUC118BN was disrupted was obtained in the same manner as described above.
  • This plasmid DNA was designated as pUC118BSN.
  • a full-length 3.4 Kbp pstI-XbaI fragment with the sequence was ligated into the PstI-XbaI site of pUC118BSN above.
  • the obtained rasmid DNA was designated as PUC118BSN-PX.
  • a BamHI site was introduced by site-directed mutation as follows, downstream of the N-terminus of the NCE2 gene and immediately downstream of the stop codon.
  • E. coli J Ml09 strain After transforming E. coli J Ml09 strain with plasmid pUC118BSN-PX and further infecting helper phage Ml3KO7, ampicillin and kanamycin were added at 150 g / m1 and 70 ygZm1, respectively.
  • the cells were cultured for 16 to 20 hours at 37 in 1 ml of 2xYT liquid medium (1.6% pactotryptone, 0.8% yeast extract, 0.5% NaCi) containing 30 ml 1 at a concentration.
  • Ml3 single-stranded DNA (ssDNA) was recovered from the culture supernatant.
  • the site-directed mutagenized DNA mixture is introduced into E. coli TGI, and the resulting transformant is transformed into an LB medium containing 100 / m1 ampicillin (1% polypeptone, The cells were cultured in 0.5% yeast extract and 1% NaCi), and plasmid DNA was recovered.
  • the plasmid DNA was digested with BamHI, subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the plasmid pUC118BSN—PX in which two BamHI sites had been introduced was selected. This plasmid DNA was designated as pM21.
  • Genomic DNA of Humicola 'Insolens MN 200-1 was obtained by the method of Example A3.
  • the PCR reaction was performed according to the following method according to LA PCR Kit Ver.2 (Takara Shuzo). First, to 1 ⁇ g of Humicola insolens genomic DNA obtained by the above-mentioned method, add 1 400, 400 / ⁇ dNTP, and 2.5 U of LA Taq polymerase to each primer, and add 94UC for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, Amplification was performed by repeating the reaction conditions for 3 minutes for 30 times. 0.8K agarose gel electrophoresis results: 1.6K Amplification of bp DNA was confirmed. The 1.6 Kbp DNA fragment was recovered using a Sephagras band prep kit (Pharmacia Biotech) and ligated to a pT7 blue II-vector kit (Novagen). This plasmid DNA was designated as ⁇ 21.
  • Plasmid pK21 DNA was digested with BamHI, and a 1.6 Kbp DNA fragment was recovered.
  • plasmid pM21 DNA was digested with BamHI and further treated at 70 ° C for 10 minutes to inactivate the restriction. This was dephosphorylated with calf-derived alkaline phosphatase (Takara Shuzo) and further separated by 0.8% agarose gel electrophoresis to recover a 5.2 Kbp DNA fragment.
  • a 1.6 Kb ⁇ DNA fragment derived from PK21 and a 5.2 Kbp DNA fragment derived from ⁇ ⁇ 2 ⁇ were ligated to obtain plasmid pKM04.
  • a highly concentrated purified product of pMKD01 was prepared. ⁇ 1 ⁇ : 001 to 5;. Coli J Ml 09 Then, the cells were cultured at 37 ° C. in a 10 Om 1 LB medium containing 100 gZm1 of ampicillin. The resulting culture solution was purified using a Flexiprep kit (Pharmacia Biotech) to obtain 1 ng / 1 pMKD01 plasmid DNA.
  • Humicola insolens MN200-1 was cultured in (S) medium at 37 ° C, and after 24 hours, cells were collected by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes.
  • the composition of the (S) medium is obtained by adding glucose (3.0%) to the above (N) medium and excluding Abyssel.
  • the obtained cells were washed with 0.5 M sucrose and filtered through a 0.45 m filter.
  • the protoplast-forming enzyme solution (5 mg / m 1
  • Novozyme 234 (NL Ioz
  • the protoplasts prepared as described above were suspended in lm1 of SUTC buffer, and 10 ⁇ g of DNA (TE) solution (10 1) was added to 1001 of this, and the mixture was allowed to stand on ice for 5 minutes. .
  • a 400 ⁇ 1 PEG solution (60% PEG4000, 10 mM calcium chloride, 1 OmM Tris-HCl (pH 7.5)) was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 20 minutes.
  • 10 ml of SUTC buffer was added. Centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes. After suspending the collected protoplasts in lm1 SUTC buffer, the suspension was centrifuged at 4,000 rpm for 5 minutes and finally suspended in 1001 SUTC buffer.
  • Protoplasts treated as above were added to 200 gZm1 of hygromycin.
  • plasmid pMKD Ol was introduced into Humicola insolens MN200-1 to select 50 strains showing hygromycin resistance. These were cultured in (N) medium at 37 ° C for 5 days. When the obtained culture supernatant was analyzed by SDS-PAGE, the protein band presumed to be NCE3 was increased by 3 to 4 times from the parent strain in 5 clones among the pMKD O1-transformed strains.
  • the N-terminal amino acid sequence of this protein was determined in order to confirm that the expressed protein band was derived from the NCE3 gene.
  • the culture supernatants obtained from the parent strain and the NCE3 high expression strain were subjected to column chromatography using an FPLC system according to the method of Example A2, and the main peaks were compared.
  • the peak that increased particularly in the NCE3 high expression strain was collected and freeze-dried. This was dissolved in a small amount of water, and electrophoresed using 8% Gel SDS-PAGE mini (manufactured by Tefco).
  • the protein was electrically transferred to a PVDF membrane according to the method of Example A2 described above, stained with Koji Brilliant Blue R-250, decolorized, and washed with water. From this, the portion where the protein with a molecular weight of 66 KD was blocked was cut out, and the resulting protein was purified by the method of Podeil, DN et al. (Podell, DN et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 81: 176, 1978), the modified N-terminal residue was removed.
  • the target protein is cut out, and incubated at 37 ° C for 30 minutes in a small amount of 0.5% polyvinylpyrrolidone (molecular weight: 40,000, manufactured by Sigma) / 10 OmM ⁇ acid solution. Well washed. next, The modified N-terminal residue was removed with Pfu pyroglutamate aminopeptidase (Takara Shuzo), washed with water, and air-dried. This was supplied to a protein sequencer Model 492, and the N-terminal amino acid sequence was determined at 15 residues. The resulting sequence was as shown below.
  • N-terminal amino acid sequence Asn-Cys-Gly-Ser-Leu-Thr-Thr-Glu-Arg-His-Pro-Ser-Leu-Ser-Trp (15 residues)
  • Plasmid pMKDOl was digested with BamHI, and the restriction enzyme was inactivated by heat treatment at 70 ° C, followed by dephosphorylation, and an 8.2 Kbp DNA fragment was recovered.
  • NCE 4 i3 ⁇ 4F was amplified by the PCR method.
  • This PCR product containing NCE4 was designed so that each primer contained a BaraHI site in advance so that it could be ligated in frame with the 8.2 Kbp BamHI fragment of the plasmid pMKDOl.
  • Synthetic oligonucleotides having the following sequences were prepared as primers.
  • NCE4-N 5- 'CCGGTGTTGGCCGGATCCGCTGATGGCAAG-3' (30mer)
  • NCE4-C 5'-TAAGGCCCTCAAGGATCCCTGCGTCTACAG-3 '(30mer)
  • the PCR reaction was performed as follows. To 1 g of Humicola insolens genomic DNA, add 1 M each, 400 M dNTPs, and 2.5 U of Pfu DNA polymerase (manufactured by Stratagene) to each 1 g of the primers, and add 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 minutes. By repeating the reaction conditions at 3 ° C. for 25 minutes 25 times, a 0.8 Kbp DNA fragment was amplified. The 8 Kbp p DNA fragment was recovered and ligated to the 8.2 Kb p BamE I fragment of pMKD01 described above. This plasmid DNA was designated as pEGDO1.
  • the N-terminal amino acid sequence of this protein was determined in order to confirm that the expressed protein band was derived from the NCE4 gene.
  • the culture supernatant obtained from the parent strain and the NCE4 high-expressing strain was subjected to column chromatography using an FPLC system, and the main peaks were compared. The conditions were the same as in Example B2 above.
  • the peak which particularly increased in the NCE4 high expression strain was collected and freeze-dried. This was dissolved in a small amount of water. After removing the modified N-terminal residue according to the method of Example B2, the N-terminal amino acid sequence was determined by the aforementioned protein sequencer.
  • N-terminal amino acid sequences were obtained at a ratio of about 7: 3.
  • the resulting sequence was as shown below.
  • the amino acid sequence at the N-terminal was determined using the above-mentioned protein sequencer without removing the modified N-terminal. As a result, only the amino acid sequence 1 shown below was obtained.
  • N-terminal amino acid sequence 1 Val-Val-Glu-Glu-Arg-Gln-Asn-Cys-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp (20 residues )
  • N-terminal amino acid sequence 2 Asn- (Cys) -Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp- (Cys)-(Cys) -Lys-Pro- Ser- (Cys) (20 residues)
  • N-terminal amino acid sequences matched the amino acid sequences of the cellulase NCE2 and NCE4 fusion proteins deduced from the nucleotide sequence of plasmid pEGD01. The fact that two types of N-terminal amino acid sequences were obtained revealed that the fusion protein was processed at multiple positions when the signal sequence was cleaved.
  • Humicola Insolens MN2 00-1 (parent stock) 0.28 g
  • Production volume is the production volume per 1 L of culture solution. ⁇ ⁇
  • Example B5 Plasmid p I £ 002
  • Plasmid pEGD01 was digested with HindIII and BamHI to recover a 7.2 Kbp pNA fragment.
  • NCE1 ⁇ derived from Humicola insolens obtained by the method described in JP-A-8-5663
  • the promoter and signal sequence of NCE1 ⁇ were copied by PCR.
  • the portion of the DNA to be loaded was widened.
  • the PCR product containing the NCE1 promoter and the signal sequence was previously provided with HindIII and BamHI sites in each primer so that it could be ligated to the 7.2 kb HindIII to BamHI fragment of the plasmid pEGD01. Designed to include A synthetic oligonucleotide having the following sequence was used as a primer.
  • PNCE1-N 5 '-GTCATGAAGCTTCATTAAGGTACGTATGCAAC-3' (32mer)
  • PNCE1-C 5'-GGTGATGGATCCGGCCTGCTGGGCAGCGACGC-3 '(32mer)
  • the PCR reaction was performed in the same manner as in Example 3.
  • This PCR product was digested with HindIII and BamHI to recover a 1.5 Kbp DNA fragment. This was ligated to the 7.2 Kbp HindIII to BamHI fragment of pEGD01 described above. This The plasmid DNA was designated as pID01.
  • Plasmid pID01 was digested with BamHI, the restriction fragment was inactivated by heat treatment at 70 ° C, and further dephosphorylated, after which a 8.6 Kbp DNA fragment was recovered.
  • the plasmid pEGDO1 was digested with BamHI, and a 0.8 Kbp DNA fragment containing NCE4 fragment fc ⁇ was recovered. The two fragments were ligated to obtain plasmid pIED02.
  • Example B6 Expression of plasmid pI EDO2
  • the N-terminal amino acid sequence of this protein was determined in order to confirm that the expressed protein band was derived from the NCE4 gene.
  • the culture supernatant obtained from the parent strain and the NCE4 high-expressing strain was subjected to column chromatography using an FPLC system, and the NCE4 peak was collected and lyophilized. did. Dissolve this in a small amount of water did.
  • 15 residues of the N-terminal amino acid sequence were determined by the aforementioned protein sequencer. The resulting sequence was as shown below.
  • N-terminal amino acid sequence Gln-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp
  • This N-terminal amino acid sequence coincided with the amino acid sequence of the cellulase NCE1 and NCE4 fusion protein deduced from the nucleotide sequence of plasmid pIDE02.
  • Production volume is the production volume per 1 L of culture solution ⁇
  • Organism name Humicola insolens
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Humicola insolens
  • ATC GTC GAC CAG GGC CGC AGC GGC AAG CAG CCC ACC GGC CAG AAG GAA 1737 lie Val Asp Gin Gly Arg Ser Gly Lys Gin Pro Thr Gly Gin Lys Glu
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Humicola insoiens
  • Fragment type N-terminal fragment origin
  • Fragment type N-terminal fragment
  • Organism name Humicola insolens
  • Fragment type N-terminal fragment
  • Fragment type N-terminal fragment
  • Organism name Humicola insolens

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Description

明 細 書 フミコ一ラ属 ¾ΐ物におけるタンパク質またはべプチドの大量生産系
[発明の背景]
発明の分野
本発明は、 フミコーラ属に属する微生物、 とりわけフミコーラ 'インソレンス
(Humicola insolens ) において、 タンパク質またはペプチドを大量発現または 分泌させる生産系に関する。
背景技術
糸状菌は、 タンパク質を菌体外に分泌することが知られている。 よって、 糸状 菌について、 タンパク質を効率よく生産させるための高生産細胞や培養方 ¾ϋが 検討され、 開発されてきた。
その主要なものとしては、 U V照射、 変異誘導剤等により、 人工突然変 を 作出し、 それらの中から目的とするタンパク質を多量に生産する株を選抜すると いう手法が挙げられる。
しかしこの手法は、 複数のタンパク質の協調作用により活性が発現される様な ^の発現およびその特性を向上させたい場合には利用が難しくなる。 更に、 生 育に悪影響を及ぼす例えば致死性の夕ンパク質等を生産する場合には、 目的タン パク質を生産する細胞にいかなる変異処理を用いても生産性の向上が図れないこ とが多く見受けられる。
—方、 最近になつて遺 fe^組み換えの技術を用いて目的タンパク質を生産させ る方法が検討され、 一部の糸状菌においては、 異種由来のタンパク質、 または、 同種にお t、て ¾fi発現しているタンパク質を； *Λに生産することが可能となつた。 例えば、 Aspergil lus nidulans (G. L. Gray, et al. , Gene. 48, 41, 1986)、 Aspergillus oryzae (T. Christensen, et al. , Bio/Technology, 6, 1419, 1988 )、 Trichoderma reesei (Taina Karhunen, et al. , Mol. Gen. Genet. 241, 515- 522, 1993)、 Trichoderma viride ( Cheng, et al. , Agric. Biol. Chem. , 55, 1817, 1991 ) 等に おいて成功しており、 その生産量は、 培養液 1 L当たり 1 . 0〜3. 3 g ^で あ
好温性糸状菌フミコーラ ·インソレンス （Humicoia insolens ) も優れたタン パク質分泌能を有する。 また、 フミコーラ ·インソレンスは、 種々の産業上有用 なセルラーゼを産生することも知られている （W0 9 1 / 1 7 2 4 3号公報 （特 表平 5— 5 0 9 2 2 3号公報） ） 。
し力、しな力くら、 フミコーラ ·インソレンスの全分泌タンパク質における有用成 分はわずか数％程度である。 これら微量有用成分を大量発現、 大量分泌させる方 法を確立すれば、 最終産物の能力は飛躍的に向上する。 また、 フミコーラ ·イン ソレンスにおいて異種由来の遺伝子を大量発現する方法を確立すれば、 種々の酵 素および有用タンパク質を単一の方法で生産でき、 より安価な提供力河能となる。 さらに、 有用タンパク質の生産宿主としてフミコーラ ·ィンソレンスは、 好温性 糸状菌であることから、 至適培養' fi¾が 3 7 °C付近であり、 培養の際、 他の雑菌 の汚染を受けにくいという利点がある。
—方、 フミコーラ ·インソレンスにおいても、 本発明者等の一部によって、 特 開平 8— 5 6 6 6 3号公報に記載されているように、 形質転換系が ¾ΟΪされ、 遺 組み換えの技術の使用力可能となつた。
しかし、 フミコーラ 'インソレンスに関し、 目的タンパク質を高レベルで発現、 分泌できるような有効な発現べクタ一系の開発が依然として求められていたとい んる。 [発明の概要]
本発明者らは、 今般、 フミコーラ属に属する 物、 とりわけフミコーラ 'ィ ンソレンスにおける目的タンパク質の大 産方法を確立した。
従って、 本発明はフミコーラ属に属する 物、 とりわけフミコーラ ·ィンソ レンスにおけるタンパク質の大量生産を可能にする発現系、 とりわけ宿主一べク 夕一系およびそれを利用したタンパク質の製造方法の提供をその目的としている。 本発明の好ましい態様によれば、 目的タンパク質の生産性は親株の 10〜16 倍となり、 またその生産量は培養液 1リットルあたり約 4. 5 gに達する極めて 効率のよいタンパク質の生産系が提供される。
[図面の簡単な説明] '
図 1は、 プラスミ ド pM3_lの制限酵¾¾図である。
図 2は、 プラスミ ド pMl 4— 1の制限^地図である。
図 3は、 プラスミ ドベクター pMKDO 1の制限酵素地図である。
図 4は、 プラスミ ドベクター pEGDO 1の制限酵素地図である。
図 5は、 プラスミ ドベクター p I E D 02の制限酵素地図である。
[発明の具体的説明]
微生物の寄託
図 1に記載の地図で表されるブラスミ ド p M 3— 1で形 換された大腸菌 J M109株は、 FERM B P— 5971 (原寄託： F E RM P— 14459、 原寄託日： 1994年 8月 3日） の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命ェ 学工業技術研究所 (日本国茨城県つくば市東 1-1-3) に寄託されている。 図 2に記載の地図で表されるプラスミ ド pMl 4—1で形質転換された ^菌 JM109株は、 FERM B P— 5972 (原寄託： F E RM P- 1458 5, 原寄託日： 1994年 10月 18日） の受託番号のもと通商産業省工業技術 ^^命工学工業技術研究所に寄託されている。
本発明による発現ベクター pMKDO 1で形質転換された大腸菌 J Ml 09株 は、 FERM BP— 5974 (原寄託： FERM P— 15730、 現寄託日： 1996年 7月 12日） の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技 術研究所に寄託されている。
本発明による発現ベクター pEGDO 1で形質転換された大腸菌 J Ml 09株 は、 FERM BP— 5973 (原寄託： FERM P— 15729、 原寄託日： 1996年 7月 12日） の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技 術研究所に寄託されている。
本発明による発現ベクター p I EDO 2で形質転換された大腸菌 J Ml 09株 は、 FERM BP— 5975 (原寄託： FERM P— 15731、 原寄託日： 1996年 7月 12日） の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技 術研究所に寄託されている。
本発明による発現ベクター pNCE 4 S a 1で形質転換された大腸菌 J M 10 9株は、 FERM BP— 5976 (原寄託： F ERM P— 15732、 原寄 託曰 ： 1996年 7月 12日） の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学 工業技術研究所に寄託されている。
本発明による発現ベクターの宿主となりうるフミコーラ ·ィンソレンス MN 200— 1は、 FERM B P— 5977 (原寄託： F ERM P— 15736、 原寄託日： 1996年 7月 15日） の受託番号のもと通商産業省工業技術 命 工学工業技術研究所に寄託されている。
定 義
本明細害において、 タンパク質およびペプチドは特に断らない限り、 同義に用 いることとする。 また、 本明細書において、 改変配列とは、塩基配列またはアミ ノ酸配列において、一〜数個の塩基またはアミノ酸の挿入、 置換または欠失、 も しくはその一方または両末端への ¾□がなされたものを意味する。
フミコーラ ·インソレンスにおける制御配列
本発明におけるフミコーラ属に属する 物における発現系にあっては、 フミ コーラ ·インソレンス由来の制御配列を用いる。 本発明において制御配列とは、 プロモーター、 シグナル配列、 およびターミネ一ターからなる群から選ばれる少 なくとも一つを意味する。
本発明による制御配列とは、 好ましくは特開平 8— 56663号公報に記載の フミコーラ ·インソレンス由来のセルラ一ゼ NC E 1遺伝子の制御配列、 さらに 特開平 8—126492号公報に記載のフミコーラ 'インソレンス由来のセルラ ーゼ NCE 2遺伝子の制御配列である。 より具体的には、 FERM BP— 59 71および F ERM B P- 5972のもと寄託されている菌株中のプラスミ ド pM 3—1およびプラスミ ド pMl 4—1内にある、 NCE 1および 2の制御配 列である。
本発明において好ましいプロモーター配列の例としては、 図 1の地図で表され るプラスミ ド pM3— 1中の、 NCE 1遺伝子の N末端から上流の約 1500 b Pまでの領域中に存在する配列、 例えば図中の N C E 1遺^?の N末端から上流 の Bg IIIサイ 卜までの配列が挙げられる。
また、 本発明において好ましいプロモーター配列の別の例としては、 図 2の地 図で表されるプラスミ ド pMl 4—1中の、 NC E 2遺伝子の N末端から上流の 約 1500 b pまでの領域中に存在する配列、 例えば図中の NCE 2遺伝子の N 末端から上流の E c oR Iサイ 卜までの配列が挙げられる。
さらに、 本発明によるプロモーター配列には、 これら領域の全配列のみならず、 高プロモーター活性を保持するその改変配列も含まれる。 本発明において、 高プ 口モーター活性とは、 後記する NCE 4遺伝子の発現において、 高発現を実現 する強いプロモーター活性を意味し、 より具体的には、 培地 1リッ トルあたり 2. Og、 好ましくは 4. O g、 より好ましくは 4. 5gの NCE4の発現を実 現するプロモーター活性を意味するものとする。 後記する実施例に記載の知見、 FERM BP— 5971および FERM B P— 5972のもと寄託されてい る菌株、 および図 1または 2の地図が与えられた当業者であれば、 そのような改 変配列力 <存在することは容易に予測でき、 また容易に製造することが可能である ことは明らかである。
また、 本発明において好ましいシグナル配列の例としては、 セルラ一ゼ NCE 1または 2のシグナル配列が挙げられる。 より具体的には配列番号 1に記載のァ ミノ酸配列の一 22から一 1までの配列をコ一ドする 配列、 および配列番号 2に記載の了ミノ酸配列の— 23から— 1までの配列をコ一ドする ^配列が挙 げられる。 更に本発明には、 その改変配列であって、 依然としてシグナル配列活 性を保持するァミノ酸配列をコ一ドするものも包含される。 このような改変配列 についても、 後記する実施例に記載の知見、 FERM BP— 5971および F ER BP- 5972のもと寄託されている菌株、 および図 1または 2の地図 力与えられた当業者であれば、 そのような改変配列が存在することは容易に予測 でき、 また容易に製造することが可能であることは明らかである。
なお、 これら配列の実際の利用にあたり上記のシグナル配列に加えてさらに N CE 1または 2の N末端側のいくつかのァミノ酸が付加されてもよいことは当業 者に明らかである。 すなわち、 これらシグナル配列の利用にあたり、 目的タンパ ク質が、 NCE1または 2の N末端側の 、くつかのアミノ酸からなるぺプチドと の融合タンパク質、 さらには N C E 1または N C E 2との融合タンパク質として 得られてもよい。
さらに、 本発明において好ましいターミネータ一配列としては、 図 1の地図で 表されるプラスミ ド pM3— 1中の、 NCE 1遺伝子の C末端から下流の約 14 00 b pまでの領域中に存在する配列、 例えば NCE ^の C末端から下流 の Bg illサイ 卜までの配列が挙げられる。 また、 別の例としては、 図 2の地図 で表されるプラスミ ド pM14— 1中の、 NCE 2遗 の C末端から下流の約 500 b pまでの領域中に存在する配列、 例えば例えば NCE 1遺伝子の C末端 から下流の B g 1 IIサイ 卜までの配列が挙げられる。
さらに、 本発明によるターミネータ一配列には、 これら領域の全配列のみなら ず、 そのターミネータ一活性を保持する改変配列も含まれる。
これら制御配列、 とりわけ NCE 1または NCE 2のプロモーター配列は、 N CE 4遺伝子を極めて高効率で発現させる。 従って、 本発明の好ましい態様によ れば、 NCE 4遺伝子の発現に好ましく用いられる制御配列、 とりわけ NCE4 遺伝子の発現に好ましく用いられるプロモーター配列が提供される。.本発明の好 ましい態様によれば、 セルラ一ゼ NCE 4の生産性は、 この酵素の由来である親 株における生産性の 10〜16倍となり、 またその生産量は培養液 1リッ トルあ たり 2. 0g、 好ましくは 4, 0 g、 より好ましくは約 4. 5 gに達する。 発現べクタ一および宿主■
本発明によれば、 上記制御配列を用いて目的タンパク質を発現するための発現 ベクターが提供される。
本発明による発現ベクターは、 その第一の態様によれば、 上記制御配列と、 場 合によって遺伝子マーカーとを含んでなるものである。 さらに、 本発明による発 現ベクターは、 第一の態様の発現ベクターに、 さらにその制御配列に作動可能に 連結された目的タンパク質をコードする塩基配列を含んでなるものである。 従つ て、 上記した本発明によるプロモーター、 シグナル配列、 およびターミネータ一 からなる群から選ばれる少なくとも一つを含んでなる発現ベクターは本発明の範 囲に包含されるものである。
前記したように、 本発明によるプロモーター配列は極めて有用性の高 、もので あることから、 本発明の好ましい態様によれば、 本発明によるプロモーター配列 を少なくとも含んでなる発現べクタ一が提供される。 この発現ベクターにあって、 シグナル配列、 ターミネータ一配列は本発明によるシグナル配列およびタ一ミネ ―夕一配列以外のものであってもよいが、 上記した上記本発明によるシグナル配 列およびターミネーター配列の利用が好ましい。 これらベクターの具体例として は、 後記する実施例において構築された発現ベクター p MK D 0 1、 p E G D 0 1、 および p 1 E D 0 2から N E C 3および N C E 4遺伝子を除いた形態のべク ターが挙げられる。
本発明による発現ベクターは、 宿主細胞において複製可能なベクター、 例えば プラスミ ドを基本に構築されるのが好ましい。 そのようなベクタ一として、 大腸 菌で複製可能なベクターである、 pUC Vector, pTV Vector. pBluescript 、 pBR3 22などが挙げられる。 本発明によるベクターの構築に必要な手法は、 遺伝子組み 替えの分野において慣用されている方法を用いることができる。
また遺伝子マ一力一は、 形質転換体の選択の手法に応じて適宜選択されてよい が、 例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、 栄養要求性を相補する遺伝子を利用す ることができる。 本発明に用いる薬剤耐性遣 ^は、 宿主細胞が感受性を示す薬 剤に関するものならば限定されないが、 例えば、 宿主としてフミコーラ ·ィンソ レンスを用いる場合、 Streptomyces rimofaciens由来のデストマイシン耐性遗伝 子、 Escherichia coli由来のノヽィグロマイシン B 耐性遺伝子、 Streptococcus hi ndustanus 由来のブレオマイシン耐性遺 fe^、 Streptomyces hygroscopicus由来 のビアラフォス耐性遗 を好ましく用いることができる。
本発明の好ましい態様によれば、 公知の方法により、 Aspergi l lus niduians由 来 trp C遺伝子のプロモーターとターミネータ一（Mul laney, E. J. et al. , Mol. Gen. Genet. 199 :37-45, 1985) 力く得られ、 これを用いて、 デストマイシン耐性 遺伝子 （特開昭 59-175889 ) を発現可能にしたカセッ トを利用するの力 <好ましい。 本発明による発現ベクターは、 種々の目的タンパク質またはべプチドの発現生 産に利用することができる。 本発明において目的タンパク質またはべプチドとは、 フミコーラ ·ィンソレンスに存在しないいわゆる外来タンパク質のみならず、 フ ミコーラ ·インソレンスにおいて発現してはいるがその量力 であるタンパク 質をも意味するものとする。 例えば、 本発明による発現ベクターにおける目的夕 ンパク質をコードする遺 fe?としては、 セルラ一ゼ、 アミラーゼ、 リパーゼ、 プ 口テア一ゼ、 フィターゼ等産業上有用なタンパク質をコードする遺 が挙げら れる。 また、 これらを人為的に改良した遣伝子についても同様に目的タンパク質 とすることができる。
本発明による発現べクタ一は、 宿主としてフミコーラ属に属する ¾ ^物と組み 合わされて発現系とされる。 本発明の好ましい態様によれば、 フミコ一ラ属に属 する 物としてフミコーラ ·インソレンスを利用する。
N C E 4遣
本発明の好ましい態様によれば、 本発明による発現系は、 フミコーラ ·ィンソ レンス由来のセルラーゼ N C E 4またはそれらの改変タンパク質を目的夕ンパク 質として、 その生産のために好ましく用いることができる。 ここで、 フミコーラ •ィンソレンス由来のセルラーゼ N C E 4とは、 配列番号 3に記載のタンパク質 を意味する。 これは後記する実施例に記載の通り、 今般、 本発明者等によって単 離されたセルラーゼ酵素である。 なおここで、 改変タンパク質とは、 上記タンパ ク質のアミノ酸配列において、 アミノ酸の付加、 挿入、 肖 IJ除、 欠失、 または置換 などの改変が生じたタンパク質であって、 依然としてセルラーゼ N C E 4と同様 のセルラーゼ活性、 とりわけェンドグルカナーゼ活性を保持するものを意味する ものとする。
本発明の好ましい態様によれば、 これらセルラーゼ N C E 4の発現系として好 ましいベクタ一の具体例としては、 後記する 例によつて構築された発現べク ター p MK D O 1、 p E G D O 1、 または p I E D O 2が挙げられる。
本発明による発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、 遺伝子組み替えの分 野で慣用されている手法を用いることができ、 例えば、 特開平 8— 5 6 6 6 3号 公報に記載の方法に準じて実施することができる。 また、 エレク トロポレーショ ンによつて実施されてもよい。
目的タンパク質の生産
本発明による目的タンパク質の生産は、 上記した本発明による発現ベクターで 形質転換された宿主細胞を適当な培地中で培養し、 培養物から目的タンパク質ま たはべプチドを採取することによって実施される。
本発明の好ましい態様によれば、 目的夕ンパク質の生産性は親株の 1 0 ~ 1 6倍となり、 またその生産量は培養液 1リッ トルあたり 2. 0 g、 好ましくは 4. 0 g、 より好ましくは約 4. 5 gに達する極めて効率のよいタンパク質の生 産系が提供される。 例えば、 宿主細胞がフミコーラ 'インソレンスである場合、 その培養液 1 リッ トルあたり 2. O g、 好ましくは 4. O g、 より好ましくは 4. 5 g以上の目的タンパク質を生産することができる。 この量は、 従来知られ たタンパク質の発現系と比較して、 極めて多量である。 このことは、 本発明によ る目的タンパク質の発現系力極めて高い有用性を有していることを示している。 例えば、 目的タンパク質がセルラーゼ N C E 3または N C E 4である場合、 こ れら酵素は本来的に高活性であるが、 それを更に大量に生産することができる。 その結果、 セルロース含有繊維の毛羽除去、 減量加工、 およびデニム染めセル口 ース含有繊維の脱色加工などに有用なセルラーゼ調製物を効率よく生産すること が可能となるとの利点が得られる。
本発明による目的タンパク質の生産法において、 形質転換体の培養は、 慣用の 成分、 例えば炭素原、 窒素原、 無機塩、 増殖因子成分などを含む液体培地で、 好 気的条件での培養法、 振盪培養法、 電気撹拌培養法または深部培養法により行う ことができる。 培地の pHは例えば 7〜8程度である。 培養は宿主細胞がフミ コ ーラ ·インソレンスである場合、 フミコーラ ·インソレンスの培養に慣用される 通常の条件、 例えば 15 °C〜 45 °C、 好ましくは 35で〜 40。C、 培養時間は 2 4〜 240時間程度の条件で行うことができる。
本発明によって得られるタンパク質あるいはべプチドの培養物からの回収にあ たっては、 その性状を利用した通常の分離手段、 例えば溶剤抽出法、 イオン交換 樹脂法、 吸着または分配カラムクロマ卜法、 ゲル濾過法、 透析法、 沈殿法等を単 独で、 または適宜組み合わせて用いることができる。
[実施例]
本発明を以下の実施例によって詳細に説明する力 \ 本発明はこれら実施例に限 定されるものではない。
実施例 A 1 ： フミコーラ ·インソレンスからのテンセル毛羽除去に活性を有する 成分の単離精製
フミコーラ ·インソレンス MN 200— 1を、 （N) 培地 （5. 0%アビセル、 2. 0%酵母エキス、 0. 1%ポリペプトン、 0. 03%塩化カルシウム、 0. 03%硫酸マグネシウム、 pH6. 8) 中、 37°Cで培養した。 7日間培養 の後、 得られた培養液を 7000 r pmで 20分間遠心することにより菌体を除 き、 培養上清液を粗精製セルラーゼ調製液とした。
この粗精製セルラーゼ調製液を疎水ク口マトグラフィー （Pheny卜 SepharoseHi gh Performancel6/100 フアルマシアバイオテク社製） に供し、 50mMリン酸 緩衝液 （pH7. 0) 中、 1一 0Mの濃度勾配をかけた硫酸アンモニゥム溶液で 溶出し、 分画した。 このうち、 0. 1— 0Mの濃度勾配のときに得られた画分に テンセル毛羽除去活性が強く認められたので、 その画分を再び、 疎水クロマトグ ラフィー （Phenyl- Sepharose High Performancel 6/100 ) に供し、 5 OmMリ ン 酸緩衝液 （pH7. 0) 中、 0. 4— 0Mの'濃度勾配をかけた硫酸アンモニゥム 溶液で溶出し、 活性画分を分取した。
次に、 その画分を逆相クロマトグラフィー （Sourcel5 IS0、 ファルマンアバイ ォテク社製） に供し、 5 OmMリン酸緩衝液 （p H 7. 0) 中、 1一 0Mの濃度 勾配をかけた硫酸アンモニゥム溶液で溶出し、 分画した。 このうち、 0Mの港度 のときに得られた画分にテンセル毛羽除去活性が強く認められたので、 その画分 を逆相クロマトグラフィー （Source 15 PHE 、 フアルマシアバイオテク社製） に 供し、 5 OmMリン酸緩衝液 （p H7. 0) 中、 1— 0 Mの濃度勾配をかけた硫 酸アンモニゥム溶液で溶出し、 テンセル毛羽除去活性の強レ、画分を精製酵素 N C E 4として単離した。 この NC E 4は SD S— PAG Eにおいて分子量 4 3 kD aの単一なバンドを示した。
¾SS A 2 ：セルラーゼ NC E 4の部分アミノ酸配列
(1) N末端アミノ酸残基の同定
実施例 1において精製したタンパク質の N末端アミノ酸配列を決定するため、 、 F P L Cシステム （フアルマシアバイオテク社製） でカラムクロマトグラフィー を行い （カラム ： RE S OURC E (商品名） RP C 3m i、 0. 1%の TF Aを含む 5 %〜 60%ァセトニトリルグラジヱント） 、 主要なピークを分取し た。
これを凍結乾燥した後、 少量の水に溶解し、 8%Gei SDS- PAGE mini (テフコ 社製） を用いて電気泳動した。 マルチフォー II電気泳動装置 （フアルマシアバイ ォテク社製） を用いて、 これを PVDF膜 （ミ リポア社製） に、 タンパク質を電 気的にうつしとり、 コマジ一ブリ リアントブルー β - 250 (ナカライテスク社製） で染色した後、 脱色し、 水で洗浄し、 風乾した。 ここから 量 4 3 Da のタン パク質がブロッ 卜された部分を切り出し、 これをプロテインシーケンサ一 Model 492 (パーキンエルマ一社製） に供し、 N末端側アミノ酸配列を 1 5残基決定し た。 得られた配列は以下の通りであった。 N末端ァミノ酸配列： Ala- Asp- Gly- Lys-Ser- Thr-Arg- Tyr- Trp- Asp-(Cys)-(Cys) -Lys-Pro-Ser (15残基）
(2) ペプチドマッピング
前記 （1) の FPLCによって精製されたタンパク質を凍結乾燥後、 100m M重炭酸アンモニゥム緩衝液 （pH 8. 0) に溶解した。 タンパク質に対し約 1ノ20モル量のトリプシン （プロメガ社製） を添加し、 37°Cで、 48時間反 応させた。 この分解産物を Model 172 プレパラティブ HPLCシステム （パーキ ンエルマ社製） でカラムクロマトグラフィ一を行い （カラム ： C 8 220 2. 1 mm, 0. 1%TFA、 0%ァセトニトリル〜一 0. 085%TFA、 3 5%ァセトニトリルグラジェン卜） 、 3種のペプチドを分取した。 得られたぺプ チド断片のアミノ酸配列を前述のプロテインシーケンサ一により決定した。 その 結果は、 以下の通りであった。
TP- 1： Tyr-Gly-Gly-Ile-Ser-Ser (6残基）
TP - 2： Phe- Pro- Asp- Ala- Leu- Lys (6残基）
TP- 3： Phe- Asp-Trp-Phe- Lys- Asn-Ala- Asp- Asn- Pro- Ser- Phe- Ser- Phe-Arg
(15残基）
これら N末端ァミノ酸配列およびべプチドマツビングによって得られたァミノ 酸配列は、 W091Z17243号公報 （特表平 5— 509223号公報） に記 載されているフミコーラ ·インソレンス DSM1800から得られた 43KD a ェンドグルカナーゼのァミノ酸配列と相同性を示すことから、 同夕ンパク質はセ ルラーゼの一種であることが強く示唆された。
また、 上記配列を Protein Identification Resource (PIR) R44.0, March, 1995、 または SWISS- PB0T E31.0, March 1995 に登録されている配列と比較したと ころ、 相同性を示す配列はあるものの、 同一ではなく、 新規なタンパク質である ことが明らかとなった。
!¾例八3 ：ゲノム DNAライブラリーの作製
ゲノム DN Aの単離は Horiuchiらの方法 (Hiroyuki Horiuchi et aし， J. Bac teriol., 170:272-278,1988 ) に従った。
まず、 フミコーラ ·インソレンス MN200— 1を前述 (N) 培地中、 37°C で培養した。 2日間培養の後、 遠心分離 （3500 r pm、 10分） によって菌 体を回収した。 得られた菌体をフエノール処理、 プロティナ一ゼ 、 およびリボ ヌクレアーゼ A処理、 さらにポリエチレングリコール （PEG) 沈殿化によりゲ ノム DN Aを得た。
つぎに、 フミコーラ ·インソレンスゲノム DNAを Sau3A I により消化し、 ァ ガロースゲル電気泳動によって、 9〜23 k b pの範囲で部分的に分解されたこ とを確認した後、 これをエタノール沈殿によって回収した。 この DN A断片をフ ァ一ジベクター、 EMBL3 クローニングキッ ト （ストラタジーン社製） の BamH Iァ ームに T4リガーゼ （東洋紡績社製） を用いて連結させた。 これをエタノール沈殿 後、 TE (1 OmMトリス塩酸 （pH8. 0) 、 lmM EDTA)緩衝液に溶 解した。
連結混合物の全量を Hohn. B.の方法 ( Hohn, B. Methods Enzymol. , 68:299- 309, 1979 ) に記載されている様に凍結したパッケージ成分およびギガパック II パッケージングキッ ト （ストラタジーン社製） を用いて、 ラムダへッ ドにパッケ ージし、 得られたファージを大腸菌 LE 392株に感染させた。 この方法により 得られた 5 X 1 CT個のファージライブラリーを用いて目的遺伝子のクローニン グを行った。
実施例 Α4 ： P CR法による長鎖プローブの作製
DN Αプローブとして、 フミコーラ 'インソレンスの全 DNAを铸型に P CR 法により増幅されたロングプローブを作製し、 これを用いた。 各プライマーは、 N末端およびべプチド TP-3において *で示したアミノ酸に対 応する DN Aを合成した。 作製した合成オリゴヌクレオチドの配列は以下に示さ れる通りであった。
NCE4N1： 5'-GCXGA(CT)GGXAA(AG)TC(AGCT) AC-3 ' (17mer)
NCE4N2:5' GCXGA (CT) GGXAA (AG) AG (CT) AC-3 ' (17mer)
NCE4C: 5- ' CXGC (AG) TT (CT) TT (AG) AACCA (AG) TC-3 ' (19mer)
(X: イノシン）
P CR反応は以下の条件で行った。 まず、 フミコーラ ·インソレンスゲノム D NAl z gに対し、 プライマーとして NCE4N1、 NCE4C各 1 M加えたもの、 NCE4 N2、 NCE4C各 1 M加えたものの 2組のチューブを作製し、 これらを、 dNTP 存在下、 95 °C、 5分間熱変性を行つた。 その後、 Taq ポリメラーゼ （リコンビ ナント Taq、 宝酒造社製） を加え、 94°C1分間、 45°C2分間、 72°C3分間 の反応条件を 25回繰り返すことにより増幅した。 その結果、 プライマーとして NCE4NK NCE4C を用いた場合のみ、 約 750 b pの DNAが増幅された。 これを 以降のスクリ一二ングのプローブとして用いた。
実施例 A 5 しセルラーゼ成分 N C E 4遺 fe?のクロ一ニング
(1) プラークハイブリダィゼーションによるスクリーニング
P CR法により增幅させた約 750 b pの DNA断片 100 n gを、 あらかじ め ECL ダイレク 卜 DNA/RNA ラベリ ング検出システム （アマシャム社製） により、 標識化しておいた。
実施例 2に記載の方法に準じて作製したファージプラークは、 ハイボンド ナ イロン 卜ランスフアーメンブラン （アマシャム社製） にうつしとり、 0. 4N水 酸化ナトリゥムで変性した後、 5 倍濃度 S S C (15mMクェン酸三ナトリゥム、 15 OmM塩化ナトリウム） で洗浄し、 乾燥させ DN Aを固定した。 キッ 卜の方 法に従って、 1時間のプレハイブリダィゼーシヨ ン （42°C) の後、 先の標識化 したプローブを添加し、 4時間 （42。C) ハイブリダィゼーシヨンを行った。 ラ ベルの洗浄は前述キッ トの方法に従った。 まず、 0. 4%SDS、 6 M尿素添加 0, 5倍濃度 S S Cにより 42°Cで 20分間の洗浄を 2回繰り返し、 次に 2倍濃 度 S S Cにより室温で 5分間の洗浄を 2回行った。
プロ一ブの洗浄を行つたナイ口ン膜は、 添付されている検出溶液に 1分間浸し たあと、 ハイパーフィルム一 ECL (アマシャム社製） に感光させ、 4個の陽性ク ローンを得た。
(2) ファージ DNAの調製
E. coli LE 392にファージを感染させ、 8時間後ファージ粒子を集め、 Grossbergerの方法 (Grossberger, D. , Nucleic Acids. Res. 156737.1987 ) に より、 プロティナ一ゼ Kおよびフヱノール処理後、 エタノール沈殿により、 ファ —ジ DNAを分離した。
(3) 目的遺伝子のサブクロ一ニング
4種のファージ DNAを Sal Iで切断し、 ァガロース電気泳動に供した。 DN Aを Southernの方法 (Southern, E. M. , J. Mol.Biol. 98:503-517, 1975) に より、 ナイロンメンブランにうつしとり、 前言己 (1) のプラークハイプリダイゼ —ションと同一の条件で、 約 750 b pのプローブを用いハイプリダイズさせ、 5. 2 k b pの目的遺伝子を含む DNA断片を検出した。 その結果、 4種のファ ージ DN Aが同一サイズの Sal I断片を有していた。
この 5. 2 k b pの DN A断片をセファグラスバン ドプレップキッ ト （フアル マシアバイオテク社製） を用いて分離し、 E. coli J Ml 09を用いプラスミ ド pUC 119の Sal Iサイ卜にサブクローニングを行った。 得られたプラスミ ド を pNCE4Sa 1とした。 実施例 A 6 ：塩基配列の決定
(1) ゲノム DN Aの塩基配列解析
塩基配列決定は以下の様に実施した。
塩基配列解析装置は、 A.L.F. DNAシーケンサー II (フアルマシアバイオテク社 製） を用いた。 シーゲンシングゲルとしては、 レディ ミックスゲル （ファルマン ァバイオテク社製） または、 ハイ ド口リンクロングレンジャー （FMC社製） と して入手可能なアクリルアミ ド担体を使用した。 ゲル作成用各種試薬 （N, N, K , N' - テトラメチルエチレンジァミン、 尿素、 過硫酸アンモニゥム） としては、 A. L.F グレードの試薬 （フアルマシアバイオテク社製） を用いた。 塩基配列解 応は、 オートリードシ一ゲンシングキッ 卜 （フアルマシアバイオテク社製） を用 いた。 ゲル作製条件、 反応条件と泳動条件の各々は、 各説明書の詳細を参照し、 設定した。
テンペレート DNAである p NC E 4 S a 1を、 10 gの 2 M水酸化ナトリ ゥムでアルカリ変性した後、 オートリードン一ゲンシングキッ 卜添付のュニバー サルプライマーとアニーリングさせ、 伸長反応を行った。 反応産物をシーケンサ 一で解読したところ、 546 b pの塩基配列が判明した。 この結果から、 MNEG01 なる FITC標識シ一ゲンシングプライマーを作製し、 pNCE4 S a 1に対して反 応させ、 さらに解読を進めた。 得られた結果から、 さらに次のプライマーを作製 してゆき、 解読を進めた結果、 NCE 4の全長が解読された。 作製した FITC標識 シーゲンシングプライマーは以下に示される通りであった。
MNEG-01： 5 ' -GTGATGAGGGCTGGCGACAGGCC-3 ' (23mer)
MNEG-02: 5 '-CTGCCACCTCTAnGCCGGCAGC-3 ' (23mer)
MNEG-03： 5 ' -CCCGACGCCCTCAAGCCCGGCTG-3 ' (23mer)
MNEG-04： 5 ' -GGCTGGAGCGGCTGCACCACCTG-3 ' (23mer) (2) 塩基配列決定
上記 （1) の結果をもとに、 MNEG-05 〜MNEG-08 なる FITC標識シ一ゲンシング プライマ一 DN Aを合成した。 作製した FITC標識シーゲンシングプライマ一は以 下に示される通りであった。
NEG-05: 5 ' -GACCTGACGGAAGCTGAAGCTCG-3 ' (23mer)
MNEG-06: 5 ' -AGCAGTGCAGCCGCTGGGAGTCG-3 ' (23mer)
MNEG-07: 5 ' -TGGCAGATGAGGACGTGGTGTTG-3 ' (23mer)
MNEG-08： 5 ' -CGCAGCCGGACTTGGCGTCGAAG-3 ' (23mer)
これらプライマーと pNCE 4 S a 1 とのォ一卜リードシーゲンシングキッ ト による反応を行った。 まず、 l O gのプラスミ ドをアルカリ変性し、 これを各 々のプライマーとアニーリングし、 T 7ポリメラーゼで反応させた。 その結果、 Sail断片の内、 1257 b pの塩基配列が決定できた。 その配列は配列番号 3に 示される通りであった。
¾¾例 7 ： イン トロンの決定
イン 卜ロンの決定には、 フミ コーラ ·インソレンス MN 200— 1から mRN Aを調製し、 逆転写^により c DN Aを合成し、 これとゲノムの塩基配列を比 較し同領域を判定した。
(1) 全 RNAの調製
フミコーラ ·ィンソレンス MN 200— 1をセルラ一ゼ誘導培地、 好ましくは 前述 (N ) 培地において 2日間培養し、 菌体を遠心分離 （3500 r pm、 10 分） により回収した。 そのうち 2 gの菌体を滅菌水で洗浄し、 液体窒素で凍結し たままプレンダ一 （日本精機社製ホモジナイザー AM-3) で粉砕した。 これを 4M グァニジンチオシァン酸塩を含む変性溶液 10m l (4Mグァニジンチォシアン 酸塩、 25mMクェン酸三ナトリウム、 0. 5%N—ラウリルサルコシン酸ナ卜 リウム、 0. 1 Mメルカプトエタノール） に懸濁した。 室温で数分間撹拌の後、 lm 1の 2M|^酸ナトリウム （pH4. 5) で中和し、 10m Iの TE飽和フエ ノ一ルを加えさらに撹拌した。 これに 2 m 1のクロロホルム一ィソァミルアルコ ール （24 : 1) を加え、 よく撹拌した後、 遠心分離 （3500 r pm、 10分） によりフエノールで変性した菌体成分を除去した。 上層 （水層） を吸い取り、 10m 1のィソプロパノールで核酸を沈殿化した。 同沈殿を遠心分離 （3500 r pm、 10分） して核酸として回収し、 70%エタノール一水で再遠心分離に より沈殿を洗った。
この沈殿を 3. 5m lの TEに溶解の後、 溶液に 880 1の 10M塩化リチ ゥム溶液を加え、 5 °Cで 2時間冷蔵の後、 遠心分離 （12000 r pm、 10分） により沈殿を回収した。 同沈殿は 70%エタノールで洗い、 これを全 RN A画分 とした。 収量は 2. 7mg、 収率は 0. 14%であった。
(2) ポリ Aティル +RNA ( = mRNA) の調製
mRNAの調製は、 mRNAピュアリフィケーシヨンキッ ト （ファルマンアバ ィォテク社製） を用いて行った。
まず上記 （1) で調製した全 RN Aのうち、 lmgを lm lのエリユーシヨン バッファ一に溶解し、 これに 65°C、 10分間の熱変性処理を加えた。 氷中で急 冷の後、 0. 2m 1のサンプルバッファーを加えた。 この全量の RN A溶液をォ リゴ （dT) セルロースカラムにチャージし、 ノヽィソルトバッファーで 3回、 ロウ ソルトバッファーで 3回カラムを洗浄の後、 65°Cに加温したエリユーションバ ッファーで溶出した。 このカラム操作を 2回繰り返し、 mRNA画分とした。 収 量は 19. 2 g、 収率は 2%であった。
(3) cDNAの合成
cDNA合成は、 タイムセーバー cDNA合成キッ ト （ファルマンァバイオテク社 製） を用いて行った。
まず、 5 gの mRN Aを 20 1のサンプルバッファ一に溶解した。 65°C、 10分間の熱処理の後、 ファーストス卜ランド合成ミックスにジチオスレィ トー ル溶液およびオリゴ （dT) プライマーと共に添加し、 37°Cで 1時間反応させた c 次に、 この全量をセカンドストランドミックスに加え、 12で、 30分間、 次い で 22°C、 1時間反応させ、 これを c DNAとした。
(4) セルラーゼ NCE 4 c DNAの P CR法による增幅
合成した c DNAのうち 1 μ gを铸型とし、 目的の c DNAのみを P CR法に より増幅した。 N末端および C末端のブライマ一として以下の様な配列のォリゴ ヌクレオチドプライマ一を作製した。
NCE4-CN: 5' -ATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCCGCTCCGCC-3' (30mer)
NCE4-CC: 5' -TACAGGCACTGATGGTACCAGTCATTAATC-3' (30mer)
P CR反応は、 以下の条件で行った。 まず、 フミ コーラ ·インソレンス c DN Al /z gに対し、 プライマーを各 1 M加え、 dNTP存在下、 94° (：、 10分間熱 変性を行つた。 その後、 Taq ポリメラーゼ （リコンピナン卜 Taq 、 宝酒造ネ ±ϋ0 を加え、 94°C1分間、 50°C2分間、 72 °C 3分間の反応条件を 30回繰り返 すことにより増幅した。 增幅された断片は、 ァガロースゲル電気泳動の結果、 0. 9 k b pの大きさであった。 これをエタノール沈殿化により濃縮し、 pT7 ブ ル一 Τ —ベクターキッ ト （ノバジェン社製） によりクローン化した。 このプラス ミ ドを p CNCE 4とした。
(5) cDNAの塩基配列解析
シーゲンシング反応は前述同様ォ一トリードシーゲンシングキッ トを用いた。 プラスミ ド p CNCE 4を 2M水酸化ナトリウムでアルカリ変性し、 エタノー ルで沈殿化した。 この一本鎖プラスミ ドをテンペレートとし、 T 7ポリメラ一ゼ で反応させた。 前記合成プライマー MNEG01、 MNEG02 NEG03. MNEG04. MNEG05、 MNEG06> MNEG07、 および MNEG08ならびにキッ ト添付のユニバーサルプライマー、 リバースプライマーを用いて反応を行い、 配列を解読した。 その結果、 56 b pの一つのィントロン力、'存在した。 配列番号 3の配列におい て、 非翻訳開始配列およびその終了配列、 イントロン内部の調整配列は下記の通 りである （数字は配列番号 3の配列位置番号である） 。
Introne : 453~458、 506〜 508、 491〜 497
実施例 B 1 ： プラスミ ド pMKD 01の作製
( 1 ) プラスミ ド p U C 118 B Nの作製
pUC 118 DNA 1 gを BamH Iによって切断後、 フエノール処理によ つて制限酵素を失活させた。 これをエタノール沈殿し、 少量の TE (l OmMト リス塩酸 （pH8. ◦)、 ImM EDT A) 緩衝液に溶解した。 この DNAを DNA ブランチング キッ ト（宝酒造社製） によって末端を平滑化した。 これをさ らに DNA ライゲイシヨン キッ ト （宝酒造社製） によって連結し、 自己閉環させ た。 得られた連結混合物を E. coli competent cells J Ml 09 (宝酒造社製） に形質転換した。 形質転換体について、 100 g/m lのアンピシリン、 lm M I PTG、 0. 004% X— ga 1を含む L B寒天培地 （1%ポリぺプト ン、 0. 5%酵母エキス、 l%Na C l、 1. 5 %寒天） 上で生育可能で、 かつ 白色のコロニーを呈するものを選抜し、 これを更に、 100 1111のァンピ シリンを含む LB培地 （1%ポリペプトン、 0. 5%酵母エキス、 l%NaC l) において一晚、 37°Cで培養した。 得られた培養液から、 アルカリ一 SDS法を 用いてプラスミ ド DN Aを回収した。 このプラスミ ド DNAを BamH Iによって切 断し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 PUC 118 DNAの BaniH I 部位を破壊したプラスミ ド DN Aを選択した。 このプラスミ ド DNAを pUC l 18 BNとした。
(2) プラスミ ド pUC 118 BS Nの作製
p U C 118 B K DNA 1 u gを Sph I によって切断し、 前述と同様の方 法により、 PUC 118 BN の Sph I 部位を破壊したプラスミ ド DNAを得た。 このプラスミ ド DNAを pUC 118 B SNとした。
(3) プラスミ ド pM21の作製
(A) セルラーゼ NCE 2遺伝子の単離
フミコーラ ·インソレンスから、 特開平 8—126492号公報に記載の方法 によって得られる、 セルラーゼ NC E 2遺伝子、 ならびにそのプロモータ一およ びターミネータ一領域として上流に 1. 4Kb、 下流に 0. 5Kbの DNA配列 を有する全長 3. 4Kb pの Pst I〜Xba I断片を、 先の pUC 118 B SNの Pst I〜Xba I部位に連結した。 得られたラスミ ド DNAを PUC118BSN 一 PXとした。
(B) プラスミ ド pUC 118 B SN— PXの部位指定変異処理
NCE 2遺伝子の N末端の下流および終止コドンのすぐ下流に、 BamH I部位を 以下のように部位指定変異により導入した。 プラスミ ド pUC 118 B SN— P Xにより E. coli J Ml 09株を形質転換し、 さらにヘルパーファージ Ml 3 KO 7を感染させた後、 アンピシリン、 カナマイシンをそれぞれ 150 g/m 1、 70 y gZm 1の濃度で含む 30m 1の、 2xYT液体培地 （1. 6%パク ト トリプトン、 0. 8%酵母エキス、 0. 5%NaC i) において、 37でで、 16〜20時間培養した。 培養上清より Ml 3の一本鎖 DNA (s s DNA) を 回収した。 この s s DNAと 2種の合成オリゴヌクレオチドを用い、 スカルプ夕 一インビ卜ロミュー夕ジエネシスシステム （アマシャム社製） を使用して、 部位 指定変異処理を行った。 作製した合成ォリゴヌクレオチドプライマ一の配列は以 下に示されるとおりであった。
NC-02 5 ' -GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAATG-3 ' (36mer)
NC-03 5 ' -TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3 ' (35mer)
部位指定変異処理した DNA混合液を、 E. coli TGIに導入し、 得られた形 ¾¾換体を 100 /m 1のアンピシリンを含む L B培地 （1%ボリペプトン、 0. 5%酵母エキス、 l%Na C i) にて培養し、 プラスミ ド DNAを回収した。 このプラスミ ド DN Aを BamH Iによって切断し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳 動に供し、 プラスミ ド pUC 118 B SN— PXに二箇所 BamH I部位の導入され たプラスミ ド DN Aを選択した。 このプラスミ ド DNAを pM21とした。 (4) セルラーゼ NCE 3遺伝子の単離
公知の Humicola grisea 由来のセロビォハイドロラーゼ遺伝子 (de Oliviera Alzevedo, M. et al. , J. General Microbiol. , 136:2569-2576, 1990 ) の配列をもと に、 フミコーラ ·インソレンス由来のセロピオハイ ドロラーゼ遺伝子 (NC E 3) を PC R法により単離した。
(A) ゲノム DN Aの単離
前記実施例 A 3の方法によりフミコーラ 'インソレンス MN 200—1のゲノ ム DNAを得た。
(B) セルラーゼ NC E 3遺伝子の P CR法による增幅
Humicola grisea 由来のセロピオハイドロラ一ゼ遺&？の配列をもとに、 フミ コーラ ·インソレンスの NCE 3遺伝子を PCR法により単離した。 この NCE 3を含む PCR産物が、 プラスミ ド pM21の BamH I部位にフレームを合わせて 連結できるように、 各プライマーにはあらかじめ BamH I部位を含む形で設計した。 プライマーとして以下のような配列の合成ォリゴヌクレオチドを作製した。
M A-05： 5 ' -GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAGG-3 ' (36mer)
A-06： 5 ' -TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCAC-3 ' (36mer)
PCR反応は LA PCR Kit Ver.2 (宝酒造社製） に従い、 以下の方法で行った。 まず、 前述の方法によって得られるフミコーラ ·インソレンスゲノム DNA1 μ gに対し、 プライマーを各 1〃Μ、 400 / Μ dNTP、 LA Taqポリメラーゼ 2. 5Uを加え、 94°C1分間、 55°C2分間、 72て 3分間の反応条件を 30回繰 り返すことにより増幅した。 0. 8%ァガロースゲル電気泳動の結果、 1. 6K b pの DNAの増幅が確認された。 この 1. 6Kb pの DNA断片をセフアグラ スバン ドプレップ キッ ト （フアルマシアバイオテク社製） を用いて回収し、 こ れを pT7 ブルー Τ -ベクター キッ 卜 （ノバジェン社製） に連結した。 このプラス ミ ド DNAを ρΚ21とした。
(5) プラスミ ド p KM 04の作製
プラスミ ド pK21 DNAを BamH Iによって消化し、 1. 6Kbpの DNA断 片を回収した。 次に、 プラスミ ド pM21 DNAを BamH Iによって消化し、 さら に 70°Cで 10分間処理し、 制限 を失活させた。 これを子牛由来のアルカリ フォスファターゼ （宝酒造社製） によって脱リン酸化し、 さらに、 これを 0. 8 %ァガロースゲル電気泳動により分離し、 5. 2 Kb pの DNA断片を回収した。 PK21由来の 1. 6Kb ρの DNA断片と ρΜ2丄由来の 5. 2Kbpの DN A断片を連結し、 プラスミ ド p KM 04を得た。
(6) プラスミ ド pMKDO lの作製
まず、 公知の方法により得られる Aspergillus nidulans由来 1 ρ C遺伝子のプ 口モーターおよびターミネータ一 （liullaney, E.J. et al. , ol. Gen. Genet. 199:37-45.1985 ) を用いて、 特開昭 59 - 175889号公報に記載されてい るデス卜マイシン耐性遺伝子をフミコーラ ·インソレンスで発現可能にした遗伝 子を作製した。 これを、 プラスミ ド pKM04の Xba I部位に導入し、 プラスミ ド pMKD 01を作製した。 実施例 B 2 ： ブラスミ _ど p MKD 01に _よるフ -—ラ ，インソレンスの形質 ϋ
(1) プラスミ ド pMKDO lの高濃度精製標品の調製
プラスミ ド pMKD 01をフミコーラ，ィンソレンスに導入するために、 まず pMKD 01の高濃度精製標品を調製した。 ^1<：001を5；. coli J Ml 09 に導入し、 100 gZm 1のアンピシリンを含む 10 Om 1 L B培地におい て一晚、 37°Cで培養した。 得られた培養液をフレキシプレップ キッ ト （ファ ルマシアバイオテク社製） を用いて精製し、 1 n g/ 1の pMKD 01プラス ミ ド DNAを得た。
(2) フミコーラ 'インソレンスの形質転換
フ ミコーラ · インソレンス MN 200—1を （S) 培地中 37°Cで培養し、 24時間後、 3000 rpm、 10分間遠心分離により集菌した。 ここで、 （S) 培地の組成は、 前述 （N)培地にグルコース （3. 0%) を加え、 かつアビセ ルを除いたものである。 得られた菌体を 0. 5Mシュークロースで洗浄し、 0. 45 mのフィル夕一で濾過したプロ トプラスト化酵素溶液 (5mg/m 1
Novozyme 234 (NL I¾|S0 、 5mgZml Cellulase Onozuka R-10 (ャク ルト社製） 、 0. 5M シユークロース） 10mlに懸濁した。 30 で60〜 90分間振盪し、 菌糸をプロ 卜プラス卜化させた。 この懸濁液を據過した後、 2500 r pm、 10分間遠心分離してプロ トプラストを回収し、 SUTC緩衝 液 （0. 5 Mシユークロース、 10mM塩化カルシウム、 10mMト リス塩酸
(pH7. 5) ) で洗浄した。
以上のように調製したプロトプラス卜を lm 1の SUTC緩衝液に懸濁し、 こ の 100 1に対し 10^gの DNA (TE) 溶液 （10 1) を加え、 氷中に 5分間静置した。 つぎに、 400〃 1の P EG溶液 （60% PEG4000、 10mM塩化カルシウム、 1 OmMトリス塩酸 （pH7. 5) ) を加え、 氷中に 20分間静置した後、 10m 1の SUTC緩衝液を加え、 2500 r p m、 10 分間遠心分離した。 集めたプロ トプラス卜を lm 1の SUTC緩衝液に懸濁した 後、 4◦ 00 r pmで 5分間遠心分離して、 最終的に 100 1の SUTC緩衝 液に懸濁した。
以上の処理を加えたプロトプラストを、 200 gZm 1のハイグロマイシン Bを含む YMG培地 （1%グルコース、 0. 4%酵母エキス、 0. 2%モルトェ キス、 1%寒天 （p H6, 8) ) 上に、 YMG砍寒天とともに重層し、 3 7°Cで 5日間培養した後、 形成したコロニーを形質転換体とした。
(3) pMKD O 1による形質転換株の培養および S D S— PAGEによる評 価
前記のようにプラスミ ド pMKD O lをフミコ一ラ ·インソレンス MN2 0 0 — 1に導入し、 ハイグロマイシン耐性を示す株を 5 0株選抜した。 これらを （N) 培地で 3 7 °Cで 5日間培養した。 得られた培養上澄を S D S— PAGEにより解 析したところ、 pMKD O 1による形質転換株のうち 5クローンにおいて、 N C E 3と推定されるタンパク質バンドが、 親株より 3〜 4倍増加していた。
(4) 組み換え NC E 3の N末端アミノ酸残基の同定
SD S— PAGEの結果から、 * *発現したタンパク質バンドが NC E 3遺伝 子由来であることを確認するために、 このタンパク質の N末端アミノ酸配列を決 定した。 まず、 親株と NC E 3高発現株から得られた培養上澄について、 前記実 施例 A 2の方法に従い FPLCシステムを用いたカラムクロマトグラフィーを行い、 主要なピークを比較した。 N C E 3高発現株において特に増加しているピークを 分取し、 凍結乾燥した。 これを少量の水に溶解し、 8 %Gel SDS-PAGE mini (テ フコ社製） を用いて電気泳動した。 これを前記実施例 A 2の方法に従って PVDF膜 に、 タンパク質を電気的にうつしとり、 コマジ一ブリ リアントブルー R- 250 で染 色した後、 脱色し、 水で洗净した。 ここから、 分子量 66 KDのタンパク質がブ ロッ トされた部分を切り出し、 プロッ トされたタンパク質を、 Podeil, D. N. ら の方法 （Podell, D. N. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 81:176, 197 8 ) に従い、 修飾 N末端残基を除去した。 まず、 目的タンパク質を切り出し、 少 量の 0. 5%ポリビニルピロリ ドン （分子量 40, 0 00、 シグマ社製） /1 0 OmMl^酸溶液中で、 37°Cで 3 0分間保温した後、 水でよく洗浄した。 次に、 Pfu ピログルタミン酸アミノぺプチダーゼ （宝酒造社製） により修飾 N末端残基 を除去し、 水で洗浄、 風乾した。 これをプロテインシーケンサー Model 492に供 し、 N末端側アミノ酸配列を 15残基決定した。 得られた配列は以下に示される 通りであった。
N末端ァミノ酸配列： Asn-Cys- Gly-Ser- Leu-Thr- Thr-Glu- Arg-His- Pro-Ser -Leu-Ser-Trp (15残基）
この N末端側アミノ酸配列は、 プラスミ ド pMKDO 1の塩基配列から推定さ れるセルラーゼ NCE2、 NCE 3融合タンパク質のアミノ酸配列と一致した。
(5) pMKDO 1による形質転換株の FPLCよる評価
前述の様に SDS— PAGEで NCE3の; *Λ発現が確認された 5クローンの 培養上澄をさらに定量するために、 F PLCシステムによりカラムクロマトグラ フィーを行った。 その条件は前記 （4) と同一とした。 NCE3のピークを分取 し、 これを凍結乾燥し、 重量を測定して高発現株と親株の生産性を比較した。 そ の結果は、 次の表に示されるとおりであった。
• 第 1表
NC E 3生産量 *
フミコ一ラ ·インソレンス MN200— 1 (親株） 0. 46 g
フミコーラ ·インソレンス pMKDO l 1. 8 g
* ：生産量は培養液 1 Lあたりの生産量である。 例 B3 ：プラスミ ド pEGDO 1の作製
プラスミ ド pMKDO lを BamH Iによって消化し、 さらに 70 °Cの熱処理によ つて制限酵素を失活させ、 脱リン酸化処理し、 8. 2Kbpの DNA断片を回収 した。
次に、 上記 例 A 1〜7で得られたフミコーラ ·インソレンス由来の NCE 4遣伝子の配列をもとに、 P CR法により NCE 4遺 i¾Fを増幅した。 この NC E 4を含む P C R産物は、 前述ブラスミ ド pMKDO lの 8. 2Kb pの BamH I 断片にフレームを合わせて連結できるように、 各プライマーにはあらかじめ BaraH I部位を含む形で設計した。 プライマーとして以下の配列の合成ォリゴヌクレオ チドを作製した。
NCE4-N: 5- ' CCGGTGTTGGCCGGATCCGCTGATGGCAAG-3 ' (30mer)
NCE4-C： 5 ' -TAAGGCCCTCAAGGATCCCTGCGTCTACAG-3 ' (30mer)
P CR反応は、 以下のように行った。 フミコーラ ·ィンソレンスゲノム DNA 1 gに対し、 ブライマ一を各 1 M、 400 M dNTP、 Pfu DNAポリメラー ゼ （ストラタジーン社製） 2. 5Uを加え、 94°C1分間、 55°C2分間、 72 °C3分間の反応条件を 25回繰り返すことにより 0. 8Kb pの DNA断片を增 幅した。 この 8Kb pの DN A断片を回収し、 これを前述 pMKD 01の 8. 2Kb p BamE I断片に連結した。 このプラスミ ド DNAを p EGDO 1とした。
例 B4： プラスミ ド pEGDO 1の発現
(1) プラスミ ド pEGDO lによるフミコーラ ·インソレンスの形質転換 プラスミ ド p E GD 01によるフミコーラ ·インソレンス MN 200 - 1の形 質転換は、 実施例 B 2の方法に従って行った。 まず、 pEGDO lの高濃度精製 標品を調製し、 1 1の p EGD 01プラスミ ド DNAを得た。 この pE GD 01溶液を 10 / i使用して、 フミコーラ ·ィンソレンス MN 200— 1を 形質転換し、 ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株を 50株選抜した。 これら を （N) 培地で 37°Cで 5日間培養した。 得られた培養上澄を SDS— PAGE により解析したところ、 p EGD 01による形質転換株のうち 10クロ一ンにお いて、 NCE4と推定されるタンパク質バンドが、 親株より 10〜16倍增加し ていた。 (2) 組み換え NCE 4の N末端アミノ酸残基の同定
SD S— PAGEの結果から、 ^発現したタンパク質バンドが NC E 4遺伝 子由来であることを確認するために、 このタンパク質の N末端ァミノ酸配列を決 定した。 まず、 親株、 NCE4高発現株から得られた培養上澄を F PLCシステ ムでカラムクロマトグラフィーを行い、 主要なピークを比較した。 条件は上記実 施例 B 2と同一とした。 N C E 4高発現株にお 、て特に増加しているピークを分 取し、 凍結乾燥した。 これを少量の水に溶解した。 実施例 B 2の方法に従って修 飾 N末端残基を除去した後、 前述のプロテインシーケンサーによって、 N末端側 アミノ酸配列を決定した。 その結果、 2種類の N末端側アミノ酸配列がおよそ 7 ： 3の割合で得られた。 得られた配列は以下に示される通りであった。 次に、 修飾 N末端を除去せずに前述のプロテインシーケンサーによって、 N末端側ァミノ酸 配列を決定した。 その結果、 以下に示されるアミノ酸配列 1のみが得られた。
N末端ァミノ酸配列 1 ： Val-Val- Glu-Glu- Arg-Gln- Asn- Cys- Gly- Ser- Ala-Asp- Gly-Lys-Ser -Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp (20残基）
N末端ァミノ酸配列 2 ： Asn-(Cys)-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Ty r-Trp-Asp- (Cys)― (Cys) -Lys-Pro-Ser- (Cys) (20残基）
これらの N末端側ァミノ酸配列は、 プラスミ ド p E G D 01の塩基配列から推 定されるセルラーゼ NCE 2および NCE 4融合タンパク質のァミノ酸配列と一 致した。 N末端側アミノ酸配列が 2種類得られたことで、 本融合タンパク質のシ グナル配列力切断される際、 複数の位置でプロセスされることが明らかとなつた。
(3) p EGD O lによる形質転換株の FPLCよる評価
前述の様に SDS— PAGEで NCE4の 発現が確認された 5クローンの 培養上澄をさらに定量するために、 F PL Cシステムでカラムクロマトグラフィ 一を行い、 NCE 4のピークを分取した。 これを凍結乾燥し、 重量を測定し、 高 発現株と親株の生産性を比較した。 その結果は、 次の表に示される通りであった n 第 2表
NC E 4生産量 *
フミコーラ ·インソレンス MN2 00— 1 (親株） 0. 28 g
フミ コーラ ·インソレンス pMKEG 1 4. 5 g
* ：生産量は培養液 1 Lあたりの生産量である。 宪拖例 B 5 ： プラスミ ド p I £ 002の
(1) プラスミ ド p I D O 1の作製
プラスミ ド p E GD 0 1を Hind IIIおよび BamH Iによって消化し、 7. 2Kb pの DN A断片を回収した。
次に、 特開平 8— 5663号公報に記載の方法で得られるフミ コーラ ·ィンソ レンス由来の NCE 1遗 の配列をもとに、 P CR法により NC E 1遗 の プロモーターおよびシグナル配列をコ一ドする部分の D N Aを增幅した。 この N C E 1プロモーターおよびシグナル配列を含む P CR産物は、 前述プラスミ ド p EGD 01の 7. 2Kb の Hind III〜BamH I断片に連結できるように、 各ブラ イマ一にはあらかじめ Hind III、 BamH I部位を含む形で設計した。 プライマーと して以下の配列の合成ォリゴヌクレオチドを ^した。
PNCE1-N: 5 ' -GTCATGAAGCTTCATTAAGGTACGTATGCAAC-3 ' (32mer)
PNCE1-C: 5 ' -GGTGATGGATCCGGCCTGCTGGGCAGCGACGC-3 ' (32mer)
P CR反応は、 実施例 3と同様に行った。 フミ コーラ 'インソレンスゲノム D NA 1 対し、 プライマー各 1 //Μ、 400 Μ dNTP、 Pfu DNA ポリメラー ゼ 2. 5 Uを加え、 94°C1分間、 55°C2分間、 72 °C 4分間の反応条件を 2 3回繰り返すことにより 1. 5 Kbの DNA断片を増幅した。 この P CR産物を Hind IIIおよび BamH Iによって消化し、 1. 5 K b pの D N A断片を回収した。 これを前述 p E GD O 1の 7. 2Kb pの Hind III〜BamH I断片に連結した。 こ のプラスミ ド DNAを p I D 01とした。
(2) プラスミ I EDO 2の作製
プラスミ ド p I D 01を BamH Iによって消化し、 70°Cの熱処理で制限^を 失活させ、 さらに脱リン酸化処理した後、 8. 6 Kb pの DN A断片を回収した。 次に、 プラスミ ド pEGDO 1を BamH Iによって消化した後、 NCE4遺fcίを 含む 0. 8Kb pの DNA断片を回収した。 2つの断片を連結し、 プラスミ ド p I ED02を得た。 実施例 B6 ： プラスミ ド p I EDO 2の発現
(1) プラスミ ド p I ED02によるフミコーラ 'インソレンスの形質転換 プラスミ ド p I EDO 2によるフミコーラ ·インソレンスの MN 200— 1形 質転換は、 実施例 B 2の方法に従って行った。 まず、 P I EDO 2の高濃度精製 標品を調製し、 H / a iの p I ED 02プラスミ ド DNAを得た。 この p I ED 02溶液を 10 / 1使用して、 フミコーラ 'インソレンス MN 200— 1を 形質転換し、 ハイグロマイシン耐性を示す形 ΚΙέ換株を 50株選抜した。 これら を （Ν)培地で 37°Cで 5日間培養した。 得られた培養上澄を SDS— PAGE により解析したところ、 p I EDO 2による形質転換株のうち 5クローンにおい て、 NCE 4と推定されるタンパク質バンドが、 親株より 5〜10倍増加してい た。
(2)組み換え NCE 4の N末端ァミノ酸残基の同定
SDS-PAGEの結果から、 発現したタンパク質バンドが N C E 4遺伝 子由来であることを確認するために、 このタンパク質の N末端アミノ酸配列を決 定した。 まず、 実施例 B 2と同様の方法によって、 親株および NCE 4高発現株 から得られた培養上澄について F P L Cシステムを用いたカラムクロマ卜グラフ ィーを行い、 NCE4のピークを分取し、 凍結乾燥した。 これを少量の水に溶解 した。 実施例 B 2の方法に従って修飾 N末端残基を除去した後、 前述のプロティ ンシーケンサ一によって、 N末端側アミノ酸配列を 15残基決定した。 得られた 配列は以下に示される通りであつた。
N末端ァミノ酸配列： Gln-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp
-Asp-(Cys) (15残基）
この N末端側アミノ酸配列は、 プラスミ ド p I ED 02の塩基配列から推定さ れるセルラーゼ NCE 1、 NCE4融合タンパク質のアミノ酸配列と一致した。
(3) PEGD02による形質転換株の FPLCよる評価
前述の様に SDS— PAGEで NCE4の大量発現が確認された 5クローンの 培養上澄をさらに定量するために、 F P L Cシステムでカラムクロマトグラフィ 一を行い、 NCE4のピークを分取した。 これを凍結乾燥し、 重量を測定し、 高 発現株と親株の生産性を比較した。 その結果は、 次の表に示されるとおりであつ た。
第 3表
NCE4牟産量木 フミ コーラ ·ィンソレンス MN 200- 騰） 0. 28 g フミコーラ ·インソレンス p I ED02 2. 9 g
* ：生産量は培養液 1 Lあたりの生産量である <
配 列 表 配列番号： 1
配列の長さ ： 2285
配列の型 ·.核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： G e n om i c DN A 起源
生物名： Humicola insolens
配列の特徴
特徵を表す言己号： s i g p e p t i d e 存在位置 ： 310. . 375 特徴を決定した方法： E
特徴を表す記号： m a t p e p t l d e 存在位置 ： 376 1890 特徵を決定した方法： E
特徴を表す記号： i n t r 0 n
存在位置 ： 880. . 936 特徴を決定した方法： E
特徵を表す記号： i n t r 0 n
存在位置 ： 1290. . 1348 特徴を決定した方法： E
特徴を表す記号： i n t r o n
存在位置 ： 1780. . 1863 特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： c l e a v a g e— s i t e
存在位置 ： 240. . 245
他の情報 ： S a 1 I
特徵を表す記号： c l e a v a g e— s i t e
存在位置 ： 603. . 608
他の情報 ： S a 1 I
特徴^:表す記 ： c l e a v a g e— s i t e
存在位置 ： 760. . 765
他の情報 ： S a 1 I
特^:を表す記号： c l e a v a g e— s i t e
存在位置 ： 1152. . 1157
他の情報 ： K p n I
特 表す記号 .- c l e a v a g e— s i t e
存在位置 ： 1267. . 1272
他の情報 ： S a 1 I
配列
TCTCCAATAA CGACGAAGCG ACTGHGGCT GATCAATTAG CTGGCGATGG GTCTGTGGTA 60 TGGAACGTCG GCTGAGTCTT CCATCTCCCA CCGTAGACGT GTTCCGCGGA TCAAGGTCTC 120 CCGCTCCGTA ACCGCCCAGG TGGCTCGGTT CTTGATGATG GGAAAGGGGC CGACGGCAGT 180 ATAAAGAGCC ATGGAAGCAT CCCTCGAGGC CGGAAGGAAA TCTTGCTCAG CCACCCGCAG 240 TCGACTTGTC TATCGATCTG AGCAGCAGTT GACCGGTCTT CTCTGTCATC TCAGCAGCAG 300 TCTTTCAAG ATG CAG ATC AAG AGC TAC ATC CAG TAC CTG GCC GCG 345
Met Gin He Lys Ser Tyr lie Gin Tyr Leu Ala Ala
-20 -15 GCT CTG CCG CTC CTG AGC AGC GTC GCT GCC CAG CAG GCC GGC ACC ATC 393
Ala Leu Pro Leu Leu Ser Ser Val Ala Ala Gin Gin Ala Gly Thr lie
-10 -5 1 5
ACC GCC GAG AAC CAC CCC AGG ATG ACC TGG AAG AGG TGC TCG GGC CCC 441
Thr Ala Glu Asn His Pro Arg Met Thr Trp Lys Arg Cys Ser Gly Pro
10 15 20
GGC AAC TGC CAG ACC GTG CAG GGC GAG GTC GTC ATC GAC GCC AAC TGG 489 Gly Asn Cys Gin Thr Val Gin Gly Glu Val Val l ie Asp Ala Asn Trp
25 30 35
CGC TGG CTG CAC AAC AAC GGC CAG AAC TGC TAT GAG GGC AAC AAG TGG 537 Arg Trp Leu His Asn Asn Gly Gin Asn Cys Tyr Glu Gly Asn Lys Trp
40 45 50
ACC AGC CAG TGC AGC TCG GCC ACC GAC TGC GCG CAG AGG TGC GCC CTC 585 Thr Ser Gin Cys Ser Ser Ala Thr Asp Cys Ala Gin Arg Cys Ala Leu
55 60 65 70
GAC GGT GCC AAC TAC CAG TCG ACC TAC GGC GCC TCG ACC AGC GGC GAC 633 Asp Gly Ala Asn Tyr Gin Ser Thr Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly Asp
75 80 85
TCC CTG ACG CTC AAG TTC GTC ACC AAG CAC GAG TAC GGC ACC AAC ATC 681 Ser Leu Thr Leu Lys Phe Val Thr Lys His Glu Tyr Gly Thr Asn l ie
90 95 100
GGC TCG CGC TTC TAC CTC ATG GCC AAC CAG AAC AAG TAC CAG ATG TTC 729 Gly Ser Arg Phe Tyr Leu Met Ala Asn Gin Asn Lys Tyr Gin Met Phe
105 110 115 oc2 ozz m ュ ^19 s BIV STH Old J¾ sqd ^IV ュ人 1 ^IVュ ¾IV usy n]g
30V 303 301 3D3 DVD 333 33V 311 330 IVi IDO IVl 330 OVV DDI 0V9
01Z SOS 002 丄 Λ dsy 3Π πΐΰ eiv s s efv ^ΐθ 。 ん if) Ι¾Λ ^IO ^ΐΥ
HOI ooi no ανο DIV OVO ιαο DOI 301 oao 100 oiv DOD IDO DID m 339
561 06T 981 usy ° dsy usy OJJ 3jy dJi an usy eiv ^ΐθ
920T OVV 333 DV3 OVV 3DV 301 033 303 391 333 OVD 11V 3VV 300 OVV 393
081 SLT O I
ϊθ an 9qd s ri9i dsy 3jy eiv s BIV dsy SAQ 丄
8A6 093 IIV Oil OVV 313 3V3 IDO 333 301 VV3 333 IVO 331 DVX 3V3V 3LL
J¾
626 1D3V01DD10 31DVD1V10V VVVD3V1D33 30D33103DI 3131X93V10 300 33V
591 091 S9I
sA BIV ^io BIV 3-iV usvュ ojj αλχ JQS BJ V SK AJ3 Aii)
SL8 300 3V1 9VV 333 19D 130 IOD OVV 30V D3D DVl DOV 333 01V 330 109
OST OH 9CT dsv nig n]g： jj BIV ΐ^Λ 3¾d ^TVュ USV 3I I ^10 nio 8 IVO 0V3 0V3 OIV 333 310 Dll OVl 0X3 IDO D9V OVV 31V 100 301 3V9 oei ΐ ΟΖΐ
IBA sA jsg na dsy I^A dsy aqj eiv s d nyg usy usy \^ nsq jq LLL 113 9VV 331 313 3V0 310 IVO Dll 339 311 OVO OVV OVV 31V 013 33V
9 ε
SZ0^6df/XDd L99C0/86 ΟΛ AAG AAC CGC TAC CAC ATC TGC GAG ACC AAC AAC TGC GGT GGT ACC TAC 1170 Lys Asn Arg Tyr His lie Cys Glu Thr Asn Asn Cys Gly Gly Thr Tyr
235 240 245
TCG GAT GAC CGC TTC GCC GGC TAC TGC GAC GCC AAC GGC TGC GAC TAC 1218 Ser Asp Asp Arg Phe Ala Gly Tyr Cys Asp Ala Asn Gly Cys Asp Tyr
250 255 260
AAC CCC TAC CGC ATG GGC AAC AAG GAC TTC TAT GGC AAG GGC AAG ACC 1266 Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Lys Asp Phe Tyr Gly Lys Gly Lys Thr
265 270 275
GTC GAC ACC AAC CGC AAG TTC AC GTAAGTTCCC TGGCCGCCTC TTCGACGACG CAG 1322 Val Asp Thr Asn Arg Lys Phe Th
280 285
AATGTCCGGA TGCTGACCCA GAACAG C GTT GTC TCC CGC TTC GAG CGT AAC AGG 1376 r Val Val Ser Arg Phe Glu Arg Asn Arg
290 295 CTC TCT CAG TTC TTC GTC CAG GAC GGC CGC AAG ATC GAG GTG CCC CCT 1424 Leu Ser Gin Phe Phe Val Gin Asp Gly Arg Lys l ie Glu Val Pro Pro
300 305 310
CCG ACC TGG CCC GGC CTC CCG AAC AGC GCC GAC ATC ACC CCT GAG CTC 1472 Pro Thr Trp Pro Gly Leu Pro Asn Ser Ala Asp l ie Thr Pro Glu Leu
315 320 325
TGC GAT GCT CAG TTC CGC GTC TTC GAT GAC CGC AAC CGC TTC GCC GAG 1520 Cys Asp Ala Gin Phe Arg Val Phe Asp Asp Arg Asn Arg Phe Ala Glu
330 335 340 ACC GGT GGC TTC GAT GCT CTG AAC GAG GCC CTC ACC ATT CCC ATG GTC 1568 Thr Gly Gly Phe Asp Ala Leu Asn Glu Ala Leu Thr lie Pro Met Val
345 350 355
CTT GTC ATG TCC ATC TGG GAT GAC GTATGTGGCA CCAACCTCCA ACCGGGCATG AG 1624 Leu Val Met Ser lie Trp Asp Asp
360 365
ACCTGTACTG ACGTGTCHG ACAG CAC CAC TCC AAC ATG CTC TGG CTC GAC TCC 1678
His His Ser Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser
370 375
AGC TAC CCG CCC GAG AAG GCC GGC CTC CCC GGT GGC GAC CGT GGC CCG 1726 Ser Tyr Pro Pro Glu Lys Ala Gly Leu Pro Gly Gly Asp Arg Gly Pro
380 385 390
TGC CCG ACC ACC TCT GGT GTC CCT GCC GAG GTC GAG GCT CAG TAC CCC 1774 Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Gin Tyr Pro
395 400 405
AAT GC GTACGTTACT ACCGCCGCTG CATCTGCAAA AAATACCGGT GCTAACCATT GTG 1832 Asn Al
410
CAG T CAG GTC GTC TGG TCC AAC ATC CGC TTC GGC CCC ATC GGC TCG ACC 1881 a Gin Val Val Trp Ser Asn He Arg Phe Gly Pro lie Gly Ser Thr
415 420 425
GTC AAC GTC TAAGCTATCA CGGCTCAAAA TCAGCGCCCG CTCTGCTCGT CCTGTTCGGC 1940 Val Asn Val
GCGCCAGTAG GGGGATATGG GGCATTTCTT TGTTCAAGCA TTTTTCTCTT CGTCCTGCTA 2000 CATATTGAGA TTGTGTATCG TATGCACGCG TACAAAGTAG AAACCATGAT CAAGTCTCAT 2060 TGAACTATAC TGCTGCTCCC AAGATTAATT ATGCCGTAAT GGTCTGTTTG CTTTTTTTTT 2120 TTTTTTTTTT TGGTGCACTT GATCGTGTGG CACATTGGCC GCTGTATGTA TGGCTTCCCT 2180 CAATCGCCGA CTGACTCAAA ACGGCAGTAC AACAGAAGCC CCATTGCATC AGAAGAGAGG 2240 TTTTATAATG CCATGAGGTG TTCTCAGATG AAAGACTTCG AGTAT 2285 配列番号： 2
配列の長さ ： 2409
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名： Humicola insolens
配列の特徴
特徴を表す記号： s i g p e p t i d e
存在位置： 389. . 457
特徴を決定した方法： E
特徴を表す記号： m a t p e p t i d e
存在位置： 458. . 2098
特徴を決定した方法： E
特徴を表す記号： i n t r 0 n
存在位置： 478. . 535
特徴を決定した方法： E
特徴を表す記号： i n t r 0 n
存在位置： 1030. . 1141
特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： i n t r 0 n
存在位置： 1762. . 1815
特徴を決定した方法： E
特徵を表す記号： i n t r 0 n
存在位置： 1990. . 2044
特徵を決定した方法： E
特徴を表す記亏： c l e a v e g e- s i t e
存在位置： 688. . 693
他の情報： Sma I
特徴 表す記号： c l e a v e g e-s i t e
存在位置： 1253. . 1259
他の情報： B amH I
特 ¾す記号 : c l e a v e g e-s i t e
存在位置： 1505. . 1510
他の情報： B g 1 II
特 表す記亏： c l e a v e g e- s i t e
存在位置： 1643. . 1648
他の情報： S t u I
配列
TGCTGGACCT TGGATGCGTC TGCCGAGCTG TGCGTGCGGA AGAGTCGAGC GTGATTCCGG 60 CATCACTGAA CACTCGCTGG TTGCTGGTTC TGGAAGCGGT ACGTCCGGCG CAAACCAGCA 120 AAAGCAGGTT TGCGCTGCCT TGGCCTCCGT GAGAGGCATG ATGCCAAGGA TGAATGGTTC 180 CTCTGCGGAC TCAACCATCC GCACTTCGAG CCCGACGATC CGGGCCCCCT GCTCCGGCGC 240 GGAGAGCCGT GGTGAGCTCC AAGTGATGCG GAATCGGTGA TGTGCAAGAT GCGGAGGGCA 300 TAAAAAGGCT GTTTCCCACA CGAAGCATTC TCCAGCTTGT TTCCTCACGG CACACGGTCA 360 AACAAGTCTG TGCAGTACCT GGGACAAG ATG GCC AAG TTC TTC CTT ACT GCT 412
Met Ala Lys Phe Phe Leu Thr Ala
- 20
GCC TTT GCG GCT GCC GCT CTC GCC GCT CCC GTI GTT GAG GAG CGC CAG 460 Ala Phe Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ala Pro Val Val Glu Glu Arg Gin
-15 -10 -5 1
AAC TGT GCC CCG ACT TG GTGAGCAATG GTGTTTCATG GATCGTGTCT TTGGATGTGC 517 Asn Cys Ala Pro Thr Tr
5
GGCTAACAAC CATTCCAG G GGC CAG TGC GGT GGC ATC GGC TTC AAT GGC 566 p Gly Gin Cys Gly Gly l ie Gly Phe Asn Gly
10 15
CCG ACT TGC TGC CAG TCT GGT AGC ACC TGC GTG AAG CAG AAC GAC TGG 614 Pro Thr Cys Cys Gin Ser Gly Ser Thr Cys Val Lys Gin Asn Asp Trp
20 25 30
TAC TCC CAG TGC TTG CCC GGT AGC CAG GTC ACC ACG ACC TCG ACT ACG 662 Tyr Ser Gin Cys Leu Pro Gly Ser Gin Val Thr Thr Thr Ser Thr Thr
35 40 45
TCG ACT TCG AGC TCG TCG ACC ACC TCC CGG GCC ACC TCG ACC ACC AGG 710 Ser Thr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ser Arg Ala Thr Ser Thr Thr Arg
50 55 60 65
ACC GGT GGT GTG ACC TCG ATC ACC ACT GCT CCC ACC CGC ACC GTC ACC 758 Thr Gly Gly Val Thr Ser He Thr Thr Ala Pro Thr Arg Thr Val Thr
70 75 80 ATC CCT GGC GGT GCC ACC ACC ACG GCC AGC TAC AAC GGC AAC CCC TTC 806 lie Pro Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ser Tyr Asn Gly Asn Pro Phe
85 90 95
GAG GGT GTC CAG CTC TGG GCC AAC AAC TAC TAC CGC TCT GAG GTC CAC 854 Glu Gly Val Gin Leu Trp Ala Asn Asn Tyr Tyr Arg Ser Glu Val His
100 105 110
ACC CTC GCC ATT CCT CAG ATC ACC GAC CCT GCC TTG AGG GCT GCG GCC 902 Thr Leu Ala l ie Pro Gin l ie Thr Asp Pro Ala Leu Arg Ala Ala Ala
115 120 125
TCG GCC GTC GCT GAG GTC CCG AGC TTC CAG TGG CTC GAC CGC AAC GTC 950 Ser Ala Val Ala Glu Val Pro Ser Phe Gin Trp Leu Asp Arg Asn Val
130 135 140 145
ACG GTC GAC ACC CTG CTC GTC GAG ACC CTC TCT GAG ATC CGC GCC GCG 998 Thr Val Asp Thr Leu Leu Val Glu Thr Leu Ser Glu lie Arg Ala Ala
150 155 160
AAC CAG GCG GGC GCG AAC CCC CCG TAT GCC G GTAAGTGCGG TGTCACCACC 1049 Asn Gin Ala Gly Ala Asn Pro Pro Tyr Ala A
165 170
ACCAACCCTA ACCCTGACCC CTGACCACCA CATCATCAAC ATCACCACAC ATCTCCCACA 1109 TCATTCTGGA CGCAAATTAA CGCCAAATCC AG CC CAG ATC GTC GTT TAC GAC 1161 la Gin lie Val Val Tyr Asp
175
CTT CCT GAC CGC GAC TGC GCT GCC GCG GCT TCG AAC GGC GAG TGG GCG 1209 Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Trp Ala
180 185 190 ATC GCC AAC AAC GGC GCC AAC AAC TAC AAG GGA TAC ATC AAC CGG ATC 1257 lie Ala Asn Asn Gly Ala Asn Asn Tyr Lys Gly Tyr lie Asn Arg lie
195 200 205 210
CGC GAG ATT CTC ATT TCG TTC TCG GAT GTC CGC ACG ATT CTG GTT ATC 1305
Arg Glu He Leu lie Ser Phe Ser Asp Val Arg Thr l ie Leu Val lie
215 220 225
GAG CCC GAC TCG CTG GCC AAC ATG GTC ACC AAC ATG AAC GTC GCC AAG 1353 Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Met Val Thr Asn Met Asn Val Ala Lys
230 235 240
TGC AGC GGT GCC GCC TCG ACC TAC CGC GAG TTG ACC ATC TAT GCC CTC 1401 Cys Ser Gly Ala Ala Ser Thr Tyr Arg Glu Leu Thr He Tyr Ala Leu
245 250 255
AAG CAG CTC GAC CTC CCG CAC GTC GCC ATG TAC ATG GAC GCC GGC CAC 1449 Lys Gin Leu Asp Leu Pro His Val Ala Met Tyr Met Asp Ala Gly His
260 265 270
GCT GGC TGG CTT GGC TGG CCC GCC AAC ATC CAG CCC GCT GCT GAG CTC 1497 Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn lie Gin Pro Ala Ala Glu Leu
275 280 285 290
TTC GCC AAG ATC TAC GAG GAT GCC GGC AAG CCC CGC GCC GTC CGC GGT 1545 Phe Ala Lys l ie Tyr Glu Asp Ala Gly Lys Pro Arg Ala Val Arg Gly
295 300 305
CTC GCC ACC AAC GTC GCC AAC TAC AAC GCC TGG AGC ATC TCG AGC CCG 1593 Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser lie Ser Ser Pro
310 315 320 CCG CCG TAC ACC AGC CCC AAC CCC AAC TAC GAC GAG AAG CAC TAC ATC 1641 Pro Pro Tyr Thr Ser Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Glu Lys His Tyr lie
325 330 335
GAG GCC TTC CGC CCT CTC CTC GAG GCC CGC GGC TTC CCC GCC CAG TTC 1689 Glu Ala Phe Arg Pro Leu Leu Glu Ala Arg Gly Phe Pro Ala Gin Phe
340 345 350
ATC GTC GAC CAG GGC CGC AGC GGC AAG CAG CCC ACC GGC CAG AAG GAA 1737 lie Val Asp Gin Gly Arg Ser Gly Lys Gin Pro Thr Gly Gin Lys Glu
355 360 365 370
TGG GGC CAC TGG TGC AAT GCC ATT GTACGTTAAG GTTAGGGTTA CATATTTGCG 1791 Trp Gly His Trp Cys Asn Ala lie
375
TTCCCATGAC TAACATCCTT CCAG GGC ACC GGC TTC GGT ATG CGC CCG ACT 1842
Gly Thr Gly Phe Gly Met Arg Pro Thr
380 385
GCC AAC ACC GGC CAC CAG TAC GTC GAC GCC TTC GTC TGG GTC AAG CCC 1890 Ala Asn Thr Gly His Gin Tyr Val Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro
390 395 400
GGC GGT GAG TGC GAC GGC ACC AGC GAC ACG ACC GCT GCC CGC TAC GAC 1938 Gly Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asp Thr Thr Ala Ala Arg Tyr Asp
405 410 415
TAC CAC TGC GGT CTC GAG GAC GCC CTC AAG CCC GCC CCT GAG GCC GGC 1986 Tyr His Cys Gly Leu Glu Asp Ala Leu Lys Pro Ala Pro Glu Ala Gly
420 425 430 435 CAG GTGAGCACCA AACCCGACCA CAACAAGAAA TGTACCAAAG GCTAACCAAC TCCAG 2044 Gin
TGG TTC CAA GCC TAC TTT GAG CAA TTA CTT CGT AAT GCC AAT CCG CCG 2092 Trp Phe Gin Ala Tyr Phe Glu Gin Leu Leu Arg Asn Ala Asn Pro Pro
440 445 450
TTC TGA GCGGTTTGAG GCGTHGGCG CGATGHGGC GATGTTTAGG ATCAAAAAGG 2148 Phe
GGGGGAAAAG GCGAAAAGGG GCCGGTCCGG GAGGCCCCAC AATATCGGCC CCACCCTCCG 2208 ATCACGTGCT CCCCGCATCG GCACAGACGT CGCTTAATGC ATTGAGGGGG TTGACAAAAT 2268 TCAAGTCTTC HCTGTAAAT AGTTGGCATC TGCCATTGTT GGACAAGATT TAGTCTTTCG 2328 AGTATATACA CTTTGTTCCA ACGGGGTCTA GTAACTTCCG AGGTCATCTC ATCAAGCATT 2388 GTTTGAGTCT CGCGTTTATA C 2409 配列番号： 3
配列の長さ ： 1 2 5 7
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： G e n o m i c D N A
起源
生物名： Humicola insoiens
配列の特徴
特徴を表す記号： intron
存在位置： 4 5 3. . 5 0 9
特徴を決定した方法： E
配列 06 58 08
10 丄 sA3 eiv sXo sAo dJi B]V "TO usy A ¾IV ¾11 ュ》S VO DVl 331 330 DDI 301 ODX DOD 000 DV3 IVV DDV 309 D39 11V 131 5A 01 S9 09 j¾ BIV BTV aqa Aio 3iy B]v dsy dsy usy ΐ BI V ¾ OJJ jq丄
501^ ODV 330 130 111 1D0 311 0D9 311 3V0 3V3 DVV 919 130 0D1 VOD 33V
95 09 ^
UT3 dsy eiv s J9S ιΑχ eiv ΪΒΛ Λ ΪΟ 0Jd n s ^13 sAq 3V3 3V3 303 001 031 3VI 339 313 139 333 333 0V3 331 009 331 OVV οί^ 5ε οε
BIV dsy sqd dsv -"il nsi 3jy UI 9¾I USV eiV usy s J9S s i
60ε 330 3V3 311 3V9 13V 313 103 0V3 Oil DVV 333 DVV 301 DDI 31X 313
02 51
0Jd uio usv ΐ^Λ 。 eiV sAq s BTV dJi 人 sA〕 s OIJ sAq SAQ
192 103 OVO OVV 010 333 130 OVV 9VV 333 D01 DOO 391 031 133 DVV 391
Οΐ S I s- sA3 dsy dJi αΑχ Say Jqi J9S sAq AJO dsy BJ V BJV ns B IV naq 八 D01 DVO 001 DVX 303 33V DDI OVV ODD 1VO 139 333 110 3D0 311 313
01 - 51- 02- oid ns BTV ^IV ΙΒΛ ΐ^Λ ^TV 3JV 0J-d J9S 3JV 3H
991 03D 313 330 330 319 113 300 331 303 DID D13 133 331 331 130 01V 丄 ίΐ 3VV311V 33010VVD1D 133VI333V0 0I3301330D V1DV11D1D3 13001 13I
09 313X03Di)9V OV I110D1I 103011313V VDOOOOOODO 0DDDID3VV3 000D3VDIVV
9 V
0/L6dr/JDd ム 99謂 6 OM 002 961 06ΐ dsy usy 3JV Sjy SA^ ·ΐ¾ Bay Bf V Τ^Λ η9Ί NI3 ^TV o s^) ^I 3V3 DVV 333 303 031 VOO DDV 333 IDD 313 313 OVD 330 VOO 331 WD
081 SiT
IBA ulO ^Md -I9S 9¾j J9S 0Jd USV dsy ^IV usy sAq s j cLi丄 dsy LQL 313 DVD 13D Oil ODV Dll ODV 333 OVV DVO 330 DVV OVV 311 9D1 3VO
Oi,I 991 091
aqj Sjy ΰα ιΧ s A|g OJJ sXq ng BJV dsy OIJ gqj gjy dsy SAQ
6 Oil DD3 931 3VI 031 DOS D3D OVV DID 330 3V3 030 Dll 033 IVO 331
OST 5H
nio usy SJVュ d\i Ajg J gjy ui A OJJ nsq Ιΰί DVO OVV 303 331 331 31V D99 333 DVl 030 9V3 DOD 333 313 100 309
S8T Οδΐ SSI sqd UT 3 ojj jqx s Aio dsy aqj d\ I BA A IO Αιο Λ OJJ an
9S9 311 OVD 333 IDV 301 V03 DVO Dll 3IV 303 313 D93 ODD 333 333 OIV
OZl SU Oil usv nsi dsy 9¾j STH usy J9S ^13 naq dsv ^13 ^IO m J3S 509 3VV 313 IVO Dll 3V3 DVV 30V 333 113 IVO 109 300 IDV 30V 33V 33X
SOI 001 56
UI3 ΪΒΛ ;9JI sAi sAq BTV T^A OJJ Λΐ9 J3S J¾ 9qj Jqi naq i,S9 9V0 319 DID OIV OVV OVV D90 103 119 IDD 109 331 VDV 311 DDV 313 n
60S 0 3VD331 33V33VV13V D3VIV333VD OIOIDVDVVI 013I0D3D10 OILIOOVVIO
L
SrO/ ,6df/XDd GAC GGC AAC TTC CCT GCC GTC CAG ATC CCC TCC AGC AGC ACC AGC TCT 893 Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gin lie Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser
205 210 215
CCG GTC GGC CAG CCT ACC AGT ACC AGC ACC ACC TCC ACC TCC ACC ACC 941 Pro Val Gly Gin Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr 220 225 230 235
TCG AGC CCG CCC GTC CAG CCT ACG ACT CCC AGC GGC TGC ACT GCT GAG 989 Ser Ser Pro Pro Val Gin Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu
240 245 250
AGG TGG GCT CAG TGC GGC GGC AAT GGC TGG AGC GGC TGC ACC ACC TGC 1037 Arg Trp Ala Gin Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys
255 260 265
GTC GCT GGC AGC ACC TGC ACG AAG ATT AAT GAC TGG TAC CAT CAG TGC 1085 Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys He Asn Asp Trp Tyr His Gin Cys
270 275 280
CTG TAA ACGCAGGGCA GCCTGAGAAC CTTACTGGTT GCGCAACGAA ATGACACTCC 1141 Leu
CAATCACTGT ATTAGTTCTT GTACATAATT TCGTCATCCC TCCAGGGATT GTCACATATA 1201 TGCAATGATG AATACTGAAC ACAAACCTGG CCGCTTGAAC TGGCCGAAGG AATGCC 1257 配列番号 4
配列の長さ ： 1 6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
フラグメント型： N末端フラグメント 起源
生物名 ·· Humicola insolens
配列
Gin Asn Cys Gly Ser Leu Thr Thr Glu Arg His Pro Ser Leu Ser Trp 1 5 10 15 配列番号 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型： N末端フラグメン卜
起源
生物名： Humicola insolens
配列
Val Val Glu Glu Arg Gin Asn Cys Gly Ser Ala Asp Gly Lys Ser Thr 1 5 10 15
Arg Tyr Trp Asp
20
配列番号 6
配列の長さ ： 2 1
配列の型： アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
フラグメント型： N末端フラグメント
起源 生物名： Humicola insolens
配列
Gin Asn Cys Gly Ser Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys 1 5 10 15
Cys Lys Pro Ser Cys
20
配列番号 7
配列の長さ： 1 6
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の ：ぺプチド
フラグメント型： N末端フラグメ ント
起源
生物名： Humicola insolens
配列
Gin Gin Ala Gly Ser Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys

Claims

請求の範囲
1. フミコーラ ·ィンソレンス由来のセルラーゼ NC E 1遺伝子または NC E 2遗 feiの制御配列を含んでなる、 発現べクタ一。
2. フミコーラ 'ィンソレンス由来のセルラーゼ NC E 1遺伝子または NC E2遺 の制御配列が、 プラスミ ド pM3— 1またはプラスミ ド pM14— 1 内にある NCE 1および 2の制御配列である、 請求項 1記載の発現ベクター。
3. 前記制御配列が、 プロモータ一、 シグナル配列、 およびターミネータ一 力、らなる群から選ばれる少なくとも一つである、 請求項 1または 2記載の発現べ クタ一。
4. 前記プロモーター配列が、 プラスミ ド pM3— 1中の、 NCE1遣伝子 の N末端から上流の約 1500 b pまでの領域中に存在する配列または高プロモ 一タ一活性を保持するその改変配列である、 請求項 3記載の発現べクタ一。
5. NCE 1遺^の N末端から上流の約 1500 b pまでの領域中に存在 する配列が、 プラスミ ド pM3— 1中の NCE 1遺伝子の N末端から上流の B g IIIサイ卜までの配列である、 請求項 4記載の発現ベクター。
6. 前記プロモーター配列が、 プラスミ ド p Ml 4—1中の、 NCE2遗伝 子の N末端から上流の約 1500 b pまでの領域中に存在する配列または高プロ モーター活性を保持するその改変配列である、 請求項 3記載の発現ベクター。
7. NCE 2遺^の N末端から上流の約 1500 b pまでの領域中に存在 する配列が、 プラスミ ド p M 14— 1中の N C E 2遗 の N末端から上流の E c oR Iサイ卜までの配列である、 請求項 6記載の発現ベクター。
8. 前記シグナル配列が、 配列番号 1に記載のアミノ酸配列の一 22から一 1までの配列をコードする塩基配列もしくは配列番号 2に記載のァミノ酸配列の -23から一 1までの配列をコードする塩基配列、 またはこれら塩基配列の改変 配列であって、 シグナル配列活性を保持するアミノ酸配列をコードする塩基配列 である、 請求項 3記載の発現ベクター。
9. 前記タ一ミネーター配列が、 プラスミ ド p M 3— 1中の、 N C E 1遺伝 子の C末端から下流の約 1400 b pまでの領域中に存在する配列またはターミ ネータ一機能を保持するその改変配列である、 請求項 3記載の発現べクタ一。
10. NCE 1遺伝子の C末端から下流の約 1400 b pまでの領域中に存 在する配列が、 N C E 1遺伝子の C末端から下流の B g 1 IIサイ卜までの配列で ある、 請求項 9記載の発現べクタ一。
11. 前記ターミネータ一配列が、 プラスミ ド pM14— 1中の、 N C E 2 遺伝子の C末端から下流の約 500 b pまでの領域中に存在する配列またはター ミネ一夕一機能を保持するその改変配列である、 請求項 3記載の発現べクタ一。
12. NCE 2遺伝子の C末端から下流の約 500 b pまでの領域中に存在 する配列が、 NCE2遗 の C末端から下流の Bg Iサイ 卜までの配列であ る、 請求項 11記載の発現ベクター。
13. 前記制御配列に作動可能に連結された目的タンパク質をコードする塩 基配列を更に含んでなる、 請求項 1〜12のいずれか一項に記載の発現ベクター。
14. 前記目的タンパク質が、 セルラーゼ NCE 4またはそれらの改変タン パク質である、 請求項 13に記載の発現ベクター。
15. 遺伝子マーカーを更に含んでなる、 請求項 1〜14のいずれか一項に 記載の発現ベクター。
16. 遣伝子マーカ一が薬剤耐性遗^?である、 請求項 15に記載の発現べ クタ一。
17. 遗 ί云十マーカーが Streptomyces rimofaciens由来のァス卜マイシン耐 性遺伝子である、 請求項 15に記載の発現ベクター。
18. 発現ベクター pMKD 01、 pEGD01、 または p I ED02。
1 9. 請求項 1 0〜1 8のいずれか一項に言己載のベクターによって形質転換 された、 フミコーラ属に属する 物。
2 0. フミコーラ属に属する^物がフミコーラ ·インソレンスである、 請 求項 1 8記載の胜物。
2 1 . フミコ一ラ属に属する^^物において目的タンパク質を発現させる方 法であって、
請求項 1 9または 2 0に記載の ¾ ^物を培養し、 培養物から前記目的タンパク 質またはペプチドを採取する工程を含んでなる、 方法。
2 2. «物がフミコーラ ·ィンソレンスであり、 その培養液 1 リッ トルあ たり 4. 5 g以上のタンパク質を^する、 請求項 2 1記載の方法。
2 3. 請求項 2 1または 2 2に記載の方法によって生産されたタンパク質も しくはべプチドまたはそれを含んでなる組成物。
2 4. 請求項 2 1または 2 2に記載の方法によって、 発現ベクターとして発 現ベクター p MK D O lを用いた場合に得られる、 N末端に配列番号 4に記載の アミノ酸配列を有する、 タンパク質。
2 5 . 請求項 2 0または 2 1に記載の方法によって、 発現ベクターとして発 現ベクター p E G D 0 1を用いた場合に得られる、 N末端に配列番号 5または 6 に記載のァミノ酸配列を有するタンパク質。
2 6. 請求項 2 1または 2 2に記載の方法によって、 発現べクタ一として発 現ベクター p I E D 0 2を用いた場合に得られる、 N末端に配列番号 7に記載の アミノ酸配列を有する、 タンパク質。
2 7. プラスミ ド p M 3— 1中の、 N C E 1遗伝子の N末端から上流の約 1 5 0 0 b pまでの領域中に存在する配列または高プロモーター活性を保持するそ の改変配列を含んでなる、 プロモーター配列。
2 8. N C E 1遣伝子の N末端から上流の約 1 5 0 0 b pまでの領域中に存 在する配列が、 プラスミ ド pM3— 1中の NCE 1遺伝子の N末端から上流の B 1 Πサイ卜までの配列である、 請求項 27記載のプロモーター配列。
29. プラスミ ド p Ml 4—1中の、 NCE 2遗 の N末端から上流の約 1500 b pまでの領域中に存在する配列または高プロモーター活性を保持する その改変配列を含んでなる、 プロモーター配列。
30. NCE 2遺伝子の N末端から上流の約 1500 b pまでの領域中に存 在する配列が、 プラスミ ド pMl 4— 1中の NCE2遺伝子の N末端から上流の E c oR Iサイトまでの配列である、 請求項 29記載のプロモータ一配列。
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