WO1998017785A1

WO1998017785A1 - Antigenes de rotavirus, vaccins et medicaments servant a diagnostiquer l'infection par rotavirus et leurs procedes de preparation

Info

Publication number: WO1998017785A1
Application number: PCT/JP1997/003777
Authority: WO
Inventors: Osamu Nakagomi; Toyoko Nakagomi; Shigeki Murakami; Tadashi Imakawa
Original assignee: The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University
Priority date: 1996-10-18
Filing date: 1997-10-20
Publication date: 1998-04-30
Also published as: PE72699A1; KR19990072201A; US6110724A; CN1209837A; EP0878541A4; ID20581A; EP0878541A1

Description

明細ロタウィルス抗原、ロタウィルス感染症ワクチン及び診断剤、並びにこれらの製造方法技術分野

この発明は、細胞培養による量産が困難なロタウィルス抗原、ロタウィルス感染症ワクチン及び診断剤、並びにこれらの製造方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、ロタウィルス感染症の予防と診断に有用なワクチン及び診断剤と、これらの有効成分であるロタウィルス抗原に関するものである。とりわけ、この発明は、ヒト'ロタウィルス感染症の予防と診断に寄与するものである。背景技術

ロタウィルスは、ヒト、サル、ィヌ、ネコ、ゥマ、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ゥサギ、ネズミ、ニヮトリ、シチメンチヨウ等の下痢症の病原体であり、全世界に広く分布している。特にヒ卜でのロタウィルス感染症は乳児嘔吐下痢症、冬季乳児下痢症、白色便下痢症、小児仮性コレラ等として注目されており、その予防及び診断が今や世界的規模で待望されている。

このロタウィルスについては、以下が明らかになつている。形態とゲノム構造-.

国際ウィルス分類委員会の第 6回報告によれば、このウィルスは、レオウイルス科に属し、エンベロープを有さず、内外二重（その中間層を含め合計 3 層）のキヤプシド構造からなる直径約 70 n m の正 20面体であり、内側キヤプシドの中心部に直径約 50 n m のコアを有する。このコア内部にゲノムが存在し、そのゲノムは 11 分節の線状 2本鎖 RNAからなリ、これ等のゲノム分節の大きさは 0.6— 3.3 kbpの範囲にある（"Virus Taxonomy: Sixth Report of the International Committee of Taxonomy of Viruses , Archives of Virology, Supplement 10， pp.219-222, 1995)。遺伝子型と血清型

上記の 1 1ゲノム分節のうち、特に、第 4ゲノム分節、及び第 9ゲノム分節 (株によリ第フ又は第 8ゲノム分節のことがある）がワクチン及び診断剤の開発では注目されている。また、世界各地で分離されるロタウィルス株は Aから Fまでの 6群（serogroupes)に、各群は種々の血清型（ se roty pes )に分類され、また、遺伝子型（genotypes)による大別も便宜的に試みられいる。これ等の分離株の抗原性及び遺伝子型は共に多様であるに Fields Virology", 3rd ed., vol.2, pp.1625-1629, B.N. Fields ら編， Lippincott - Raven Publishers 1996,USA)。以下、この点につて説明する。

第 4ゲノム分節はウィルス粒子の表面にスパイク状に露出している構造タンノク VP4をコードし、この VP4の機能は、血球凝集素、中和抗原、プロテアーゼが促進する感染性、病原性、膜融合、細胞への付着等にあることが報告ないしは推定されている。ロタウィルス株は、この VP4のアミノ酸配列とその遺伝子 RNAあるいは cDNAの相同性に基づき、現在、 20の遺伝子型（以下、 ΓΡ遺伝子型」という）に、また、中和試験に基づき 10又は 14の血清型（以下、

ΓΡ血清子型」という）にそれぞれ分類されている。

第 9ゲノム分節（株によっては第 7又は第 8ゲノム分節）は、ウィルス粒子の外側キヤプシド VP7をコードし、この VP7の機能は、中和抗原ェピト一プ、 2 つの疎水性領域等の保有にあることが報告ないしは推定されている。口タウィルス株は、この VP7の中和試験に基づき 14の血清型（以下、「G血清子型」という）に分類されている。ウィルス株の分類-.

既報の多数の多様な分離株（前記" Fields Virology", 3rd ed., vol.2, p.1627)のうち、前記の A群に属するヒト■ロタウィルス代表株と、本発明者らが分離し報告した次の 3株： AU-1 (Journal of Clinical Microbiology, 25, 1159-1164, 1987 )； AU32 (Microbiology and Immunology, 34, 77-82, 1990) ; AU 64 (Archives of Virology, 19, 67-81 , 1991 )の分類の概要は表 1に例示したとおりである。

表 1

1^ -σ G血清型 Ρ血清型 [遺伝子型]

Wa G1 P1 A[8]

DS-1 G2P1 B [4]

P G3P1 A[8]

AU-1 G3P3 [9]

Hocn I G4P1 A[8]

ST3 G4P2A [6]

AU32 G9P1 A[8]

AU64 G1 P1 B [4] 血清型の検出頻度-.

世界各地のロタウィルスの G血清型の検出頻度に関する約 20の研究報告によれば、日本、欧米諸国、オーストラリア、中央アフリカ等では G1型が約 60 - 85%と主流を占め、残りは主に G2型と G3型である。一方、インド、タイ、バングラディッシュ、メキシコ等では G1、 G2、 G3及び G4型が散発して検出され、これらの合計率が約 20- 80%にわたると共に、これ等以外の他の型の散在が顕著に見られる。ウィルスの培養：

サルゃ家畜等から分離されたロタウィルスは通常、培養細胞で比較的容易に増殖するので、その培養ないし継代培養は必ずしも困難ではない。ところが, ヒト■ロタウィルスの細胞培養による培養では、ウィルス抗原が生産されても感染性ウィルス粒子は連続して継代され得ないという、いわゆる不発感染 (abortive i nfe cti on )により、その継代培養は極めて困難である。そのため、低増殖能ヒト 'ロタウィルスとサルゃゥシ等の高増殖能ロタウィルスとの間でリアソ一タント（reassortant)を作成し、ヒト■ロタウィルスの増殖能の向上を図る工夫や、また、トリプシンで前処理したヒト 'ロタウィルスをサル由来の細胞株 MA104 ( ECACC N o.85102918 )や AGMK( African Green Monkey Kidney)細胞に接種した後、トリプシンを添加混合した維持培地を用いて回転培養する等の工夫が図られている。現在では後者の回転培養により、ほとんどの A群に属するヒト■ロタウィルスの実験室内での直接培養や分離が可能になっている。し力、し、この回転培養であっても、ワクチンや診断剤の製造に必要な量のウィルス抗原を得ることはできない。また、上記の A群以外の口タウィルスの培養あるいは継代培養は、現在もなお困難な状態にある。ウィルス培養の宿主'.

ロタウィルスの増殖を許容する（permissive)感受性細胞培養としては、前記の MA104 や GMK 細胞以外に、 FBK( Fetal Bovine Kidney) , CMK ( Cercopithecus Monkey Kidney) _x MK(Crab-eating Macaque Kidney) 等の各細胞、また、サル由来の CV- 1、 FRh L2、 BSC- 1、 Vero、ィヌ由来の MDCK、ヒト小腸上皮由来の CaCO- 2 等の各細胞株が知られている（ WO 92/01784、特開平 06- 328107、前記" Fields Virology", 3rd ed., vol.2, pp.1647-1648, pp.1661- 1662 )。さらに、ワクチンの製造を目的とするロタウィルス抗原の量産においては、他のウィルスワクチンの製造に用いられてしヽる Vero、 DBS— FLC— 1 、 DBS— FLC— 2、 DBS— FRh L2、 ESK— 4、 HEし、 IMR_90、 MRG- 5、 MRC- 9、 W卜 38、 WRL68 等の細胞株が利用できる ( " ATCC Microbes & Cells at Work" , 2nd ed., p.144, American Type Culture Collection 1991, USA)。ワクチン：

ヒト■ロタウィルス感染症ワクチンは、 1985 年頃から種々の開発が試みられている。その主流は、天然痘ワクチンと同様に、抗原性が類似の非ヒ卜由来の弱毒ウィルスをワクチンとして代用する、いわゆるジエンナ一方式 ( Jennerian Approach )による生ワクチンの開発である。例えば、ゥシ又はサル由来の弱毒ウィルス、ヒト■ゥシ両者又はヒト 'サル両者由来のウィルス 2株間での弱毒リアソータント等を用いる生ワクチンの臨床試験が知られている ( W0 92/01784; EP0 130906; 特開平 06-328107; " Modern Vaccinology " , pp.213-229, E.Kurstak 編， Plenum Medical Book Company 1994, USA; "Vaccines", 2nd ed., pp.809-822, S.A.PIotokin and E.A.Mortimer編， W.B.Saunders Company 1994, USA; "The Jordan Re port— Acce larated Development of Vaccines 1996", p.46 and p.68, National Institute of Health 発行， USA)。し力、しな力《ら、これ等の生ワクチンあるいはその経口投与に関する臨床試験データが蓄積するにつれ、予防効果が不十分であるという判断が強まり、現在では上記ジエンナ一方式とは別の着想に基づくワクチン製造が模索されている。診断剤-.

ポリクロ一ナルあるいはモノクローナル抗体を用いる抗原検出が主流になつており、例ば、 EIA tnzyme Immunoassay なし \し ELIS A Enzyme- linked Immunosorent Assay)、ラテックス凝集法、受身赤血球凝集反応等のキット力《市販されてしヽる。また、 PAGE— SS ( polyacrylamide gel electrophoresis with silver stain) -> PCR ( polymerase chain reaction ) 等による遺伝子レベルでの診断が開発されている（"Priciples and Practice of Infectious Disease' , 4th ed.,vol.2, pp.1450-1451 , G.L.Mandellら編， Churchill Livingstone 1995, USA)。しかし、ウィルス抗原を用いて抗体検出する診断剤は流布していないので、患者における各種抗体の消長に関するデータは、ロタウィルス感染症の解明並びに予防と治療の対策に極めて有用であるにも拘らず不足ぎみである。

この発明は、以上のとおりのヒト 'ロタウィルスに関する事情に鑑みてなされたものであって、細胞培養によるロタウィル抗原の量産が困難な現状を克服し、ロタウィルス感染症ワクチン及び診断剤の製造に必要なロタウィルス抗原の多量製造法を提供することを目的としている。

またこの発明は、上記方法により得られた抗原、この抗原を用いて製造したロタウィルス感染症ワクチン及び診断剤を提供することを目的としている。発明の開示

この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の発明を提供する。すなわち、第 1の発明は、ロタウィルスの増殖を高度に許容する細胞を培養細胞からクローニングし、得られた細胞クロ一ン株にロタウィルスを継代し馴化させることにより細胞クローン馴化ロタウィルス株を作成し、この馴化ロタウィルス株又はこれを親株に用いて作成したリアソ一タントをシードウィルスとして培養し、このシードウィルスの培養培地よりロタウィルス抗原を単離-精製することを特徴とするロタウィルス抗原の製造方法である。

この第 1発明は、培養細胞が Vero細胞（ATCC CCL 81 )であることを好ましい態様としている。

また、この第 1発明は、細胞クローン株力《 Vero CL— 9(FERM BP— 6028)であることを別の好ましい態様としている。

さらにまた、この第 1発明は、ロタウィルスがヒ卜-ロタウィルス株 AU32n 及び Z又は AU64nであることをさらに別の好ましい態様としている。

第 2の発明は、上記の方法により得られたロタウィルス抗原である。

第 3の発明は、上記第 2発明のロタウィルス抗原をさらに不活化剤で不活化することにより調製された不活化抗原である。

第 4の発明は、上記第 2発明のロタウィルス抗原、又は第 3発明の不活化抗原を、免疫を奏する量含有するロタウィルス感染症ワクチンである。

第 5の発明は、上記第 2発明のロタウィルス抗原、又は第 3発明の不活化抗原であって、血清型又は遺伝子型が互いに異なる 2種以上の抗原をそれぞれ、免疫を奏する量含有する混合多価ロタウィルス感染症ワクチンである。第 6の発明は、上記第 2発明のロタウィルス抗原、又は第 3発明の不活化抗原を、抗原抗体反応を呈する量含有する診断剤である。

第 7の発明は、細胞クロ一ン株 Vero CL-9(FERM BP— 6028)である。第 8の発明は、細胞クローン馴化ヒト 'ロタウィルス株 AU32nである。

第 9の発明は、細胞クローン馴化ヒト 'ロタウィルス株 AU64nである。

なお、この出願において、「細胞クローン株」とは、単一細胞の子孫のみからなるクローンの培養細胞を意味する。

「馴化 Jとは、ウィルス培養に用いる細胞の種類や温度等が一定の条件下でウィルスの量産が可能になるよう、ウィルス増殖能の変異又は選択を図り、その増殖能を合目的化することを意味する。例えば、或る細胞に馴化させたウィルスはその細胞で、また、低温馴化ウィルスはその低温でそれぞれ良好に増殖する。

「感受性」とは、ウィルスの増殖を許容する細胞の性質 "permissive"を意味する。例えば、「ロタウィルス感受性細胞」とは、その細胞においてロタウイルスの増殖あるいは培養が可能なことを意味する。

「細胞クローン馴化ウィルス株」とは、細胞クローン株に継代培養し、馴化させたウィルスを意味する。その他の用語については、以下の発明の最良形態の説明において明らかにする。発明を実施するための最良の形態

この出願の各発明は、以下の第 1〜第 4工程を順次行うことによリ実施される。

第 1工程：細胞培養からロタウィルスの増殖を高度に許容する細胞、すなわち、高度感受性細胞をクローニングする。

第 2工程：前工程で得られた細胞クローン株にロタウィルスを継代培養し、馴化させることにより細胞クローン馴化ロタウィルス株、すなわち、細胞クローン株おいて極めて旺盛あるいは高度に増殖する馴化ロタウィルス株を作成する。必要に応じて、この馴化ロタウィルス株を親株に用いてリアソ一タントを作成する。なお、第 1行程で使用するロタウィルスは、この第 2行程で培養する口タウィルスと同一のものである必要なない。

第 3工程：前工程で得られた馴化株又はリアソ一タントをシードウィルスとし、このシードウィルスを大量培養することにより、ロタウィルス抗原、すなわち、ロタウィルスの完全粒子、不完全粒子、抗原性タンパク、ゲノム、遺伝子等を重産する。

第 4工程：前工程で得られた完全粒子、不完全粒子、抗原性タンパク、ゲノム、遺伝子等を精製、加工ないしは修飾することによりワクチン、診断剤、試薬等を調製 '製造する。

上記の工程順に以下、順を追って説明する。第 1工程で用いる培養細胞'.

ロタウィルスの増殖を高度に許容する細胞をクローニングするための対象となる培養細胞としては、先に、背景技術の "ウルス薆の^主"の欄に記載した種々の細胞あるいは細胞株を用いることができる。なお、使用に際しては、これ等のうち、為害性迷入因子や癌遺伝子の存在が否定された培養細胞、例えば、 Vero細胞（ATCC CCL 81 )の使用が望ましい。第 2工程で用いるロタウィルス'.

前工程で得た細胞クローン株に継代し、馴化させるロタウィルスとしては、前記文献（ " Fields Virology " , 3rd ed., vol.2, p.1627, Arch i es of Virology, 19, 67-81, 1991 等）に記載の分離株、あるいは任意のロタウィルス株が使用できる。特に、細胞培養での継代が困難な株、あるいは抗原生産量の増収が期待されるウィルス株への適用が好ましい。例えば、 AU - 1、 AU32、 AU64 等の公知株、並ぴにこの発明が提供する、ワクチン製造用ウイルス株としての継代歴が的確な新規ヒト 'ロタウィルス株 AU32n及び AU64n 等である。細胞培養培地とゥィルス増殖培地：

公知や市販の培地、例えば、 199±咅地、 MEM (Eagle's Minimum Essential Medium)培地、 BME ( Eagle's Basal Medium)± 地、 Hanks液、 Dulbecco のリン酸緩衝液（PBS)等を使用できる。これ等の組成と調製法は、ウィルス実験、細胞培養、組織培養等に関する常用テキスト（例えば、 "Cells & Tissue Culture; Laboratory Procedures , 全 2巻， A.Doyle et al.編， John Wiley & Sons 1993, U S A )や市販製品カタログ等に詳述されている。また、このような培地や塩類溶液は、補助剤ないしは添加剤を添加混合して修飾することもできる。添加剤としては、常用の物質、例えば、市販のヒト血清、ゥシ胎児血清 FCS(Fetal Calf Serum),抗生物質、炭酸水素ナトリゥム溶液、塩化ナトリウム、非必須アミノ酸等から適宜選択し、適量使用できる。例えば、培地 1リットル当たりに添加混合する添加剤の最終濃度は、血清類は約 3- 25%(V/V)、炭酸水素ナトリウムは約 1-6 _g、塩化ナトリウムは約 0.1-0.25 モル、また非必須アミノ酸は製品カタログに記載の標準量が望ましい。特に、ロタウィルス増殖培地にはプロテアーゼあるいはトリプシンを添加混合するのが好ましいことが知られている。なお、ロタウィルス増殖培地中のトリプシンの最終濃度は約 0.1- 10 ;u g/ml である。細胞培養と細胞クロー二ング：

細胞株の植え継ぎないしは継代は、通常、細胞培養培地で約 10⁵- 4 x 10⁵ 細胞 Zml の細胞浮遊液を調製し、この浮遊液を培養容器の容積の約 1/10 一 1/5容、例えば 100ml容器なら約 10-20 ml植え込み、約 37°Cで培養する。また、容器内の底面上でモノシートを形成した細胞を培養容器面から剥離し、細胞を分散させるには、通常、 Ca及び Mg両イオンを除いた PBSで調製した最終濃度約 0.25%(W/V)トリプシン液により行う。

細胞のクロ一ニングは、常法（前記" Cells & Tissue Culture; Laboratory Procedures", vol.1 , pp.4 B： 3 )により行うことができる。例えば、培養細胞モノシートをトリプシン液で剥離した後、細胞培養培地に分散させ、遊離単一細胞の浮遊液（約 1-5 細胞/ ml)を調製の後、これを培養容器、例えば、シヤーレゃマイクロテストプレート等に植え込み、培養することにより、単一細胞の子孫のみからなるクローンを作成する方法（コロニー形成法）により行うことができる。得られたコロニーごとに個別に培養して細胞数を増やせば、クロ一ン化細胞ないしは細胞クローン株が得られる。ウィルスの培養と継代馴化：

細胞培養を宿主とするウィルス培養の温度は通常、約 20- 37°Cであり、培養日数は約 2— 16日である。静置培養や回転培養を採用できる。培養後の培養液上清はウィルス浮遊液としてウィルス継代に供する。ウィルス継代は、ウィルス浮遊液を、順次、新たに培養した細胞に接種しウィルスを増殖させることにより行う。このウィルス継代を特定細胞において約 2— 50回、好ましくは約 3 _ 20回繰り返し行うことにより、そ細胞で優れて高度に増殖する特定細胞馴化ウィルス株を得ることができる。また、この馴化ウィルス株を親株に用い、他のウィルス株との間でリアソ一タントを作成することにより、馴化ゥィルス株の高度増殖能を別のウィルス株に移入できる。例えば、紫外線（UV 波長 280nm)を照射して感染性を失活させたロタウィル株と、上記馴化ウイルス株（親株）とを混合培養し、両株ウィルスのゲノム分節の reassortment を誘導した後、抗親株中和抗体で親株ウィルスを失活させ除去することによリ、生き残りの感染性ウィルスがリアソータントとして得られる。口タウィルスに対する高度感受性細胞クロ—ン株の選別：

細胞クローンごとにロタウィルスを接種して培養し、ウィルスの増殖により生産される感染ウィルス数、ウィルス粒子数、又はウィルス抗原量を測定する。この場合、 MOI(multiplicity of i nf e cti on)の違しヽによる増殖の程度、しゝわゆる、ウィルス接種量の違いによるウィルス生産量の高低を後述の方法で測定することも大切である。このような測定値を指標としてウィルスが高度に増殖する細胞クローンをスクリーニングすることにより、高度感受性細胞クロ一ン株を得ることができる。上記の測定は、例えば、ブラック形成法（PFU: plaue forming unitの §十 ¾5U、フ； j カス开$成法（FFU: focus forming unit の計数）、 ELISA、 IME(immune elctron m i crosco py )等により行うことができる。なお、 FFUの計数はウィルスの感染 ·増殖により形成される感染細胞領域を蛍光色素 FITC( fluorescein is oth i ocy anate )で標識した抗体で染 βする ffi光 ί几体法、 El A ( enzyme i m m u noass ay ) により if了つことが、でさる。ウィルスとその抗原の量産 '調製'.

高度感受性細胞クローン株の細胞培養を宿主に用い、この細胞株への馴化ウィルス株を培養することにより、ウィルス及びその抗原を量産する。具体的には、培養終了後、例えば、ウィルス培養液を低速遠心した上清（例えば、ドライアイスと有機溶媒で凍結融解したウィルス感染細胞の浮遊液を低速遠心した上清等）を採取することにより、完全ウィルス粒子とその抗原を調製できる。なお、このような調製物は、ウィルス浮遊液をそのまま使用することもできる。この浮遊液は、膜濾過法によリ除菌可能であり、抗生物質を添加することもできる。また、これ等の浮遊液液中のウィルス抗原は、膜濃縮法、密度勾配超遠心法、蔗糖クッションを用いる超遠心法等により濃縮かつ精製できる。例えば、蔗糖溶液層をクッションとして、その上にウィルス浮遊液を重層し、超遠心にかけ、ウィルス抗原を遠心管底に沈降させた後、その沈降物を再浮遊液して精製ウィルス抗原を調製できる。ワクチン原液の調製'.

上記ウィルス浮遊液又は精製ウィルス抗原を用いてワクチン原液を調製できる。なお、ワクチン用抗原として、ウィルス浮遊液中の完全ウィルス粒子、不完全ウィルス粒子、ビリオン構造タンパク、例えば V P 4、 V P 7、中和反応ェピトープ領域、構造タンパクの翻訳後修飾体等、またビリオン非構造タンパクとその翻訳後修飾体、感染防御抗原等を使用できる。かかるワクチン用抗原は常用の不活化剤で固定化することにより立体構造を安定化できる。不活化剤としては、例えば、ホルマリン、フエノール、グルタルジアルデヒド、 β一プロピオラクトン等をワクチン原液の調製の前又は後に添加して用いることができる。ホルマリンを使用する場合、その添加量は約 0.005 - 0.5 % ( V /V：)、不活化温度は約 2 - 38 °C、不活化時間は、約 5 - 1 80 日である。ただし、不活化により抗原性が損なわれる場合には、不活化条件を緩和するための創意工夫を要する。例えば、不活化剤の減量、中性アミノ酸や塩基性アミノ酸等の添加、不活化温度の低下等である。また、不活化工程で残存する遊離ホルムアルデヒドは、必要なら、等量の亜硫酸水素ナトリウムを添加してこれを中和するか、透析により除去できる。以上により得られた調製物をワクチン原液として次の工程に供する。ワクチンの調製:

前記のワクチン原液を、例えば培地 B M E で希釈し、ワクチン中の抗原量が抗体産生に必要な量になるよう調整する。

その際、ワクチンの耐熱性を増強する安定化剤や、免疫原性を高める補助剤としてのアジュバントを添加混合できる。例えば、安定化剤として糖類ゃァミノ酸類、また、アジュバントとして鉱物油、植物油、ミヨウバン、リン酸アルミ二ゥ厶、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サイモシン、インタ一ロイキン等を利用できる。

また、粘膜免疫あるいは局所免疫の誘導を目的として、ワクチン原液中のウィルス抗原を加工あるいは修飾できる。これには、例えばリボソーム、エマルジョン、マイクロカプセル、マイクロスフヱァー、ポリ乳酸、ポリグコール酸等を用いる D D S ( d ru g d e l i v e ry s y ste m )に関係した技術を適用できる。

次いで、上記のワクチン溶液を適当な容積、例えば約 1 - 20 m l 容のバイァルに分注し、密栓 '密封した後、ワクチンとして使用に供する。このワクチンは、液状のみならず、分注後に凍結乾燥を行うことにより、乾燥製剤として使用に供することができる。また、経口投与を目的として、ワクチン原液を、例えばシ口ップ状や飴玉状等に加工することも可能である。

なお、調製したワクチン製剤は、使用に供する前、すなわち、その製造工程下及び小分品の段階でその品質を保証するため、安全性と有効性に関する検定を行い、ワクチンとしての適格性を確認する必要がある。このような検定は、この発明のロタウィルスワクチンと類似の製剤に関する基準、例えば、薬事法（昭和 3 5年法律第 1 4 5号）並びに昭和 3 5年'厚生省告示第 3 1 5号及び昭和 3 6年■厚生省告示第 3 3 7号改正に基づく「生物学的製剤基準」に定める「不活化急性灰白髄炎ワクチン基準」の規程、上記薬事法並びに平成 5 年-厚生省告示第 2 1 7号に基づく「生物学的製剤基準」に定める「日本脳炎ワクチン」及び「乾燥日本脳炎ワクチン」の両規程、あるいは上記薬事法並びに平成 6年■厚生省告示第 3 3 2号に基づく「生物学的製剤基準」に定める「乾燥組織培養不活化 A型肝炎ワクチン」の規程等に準拠して行うことができる。ワクチンの用法'.

ワクチン接種は、例えば、 1ドーズ約 0.25 - 0.5 m lを皮下接種する； 1ドーズ約 1 .0 m lを飲用する；約 0.05 m lを口腔内に注入する等により行うことができる。なお、これらの接種は約 2— 4週間隔で 1 _ 3回程度行うのが好ましい。ただし、ワクチンの用法は上記の例にのみ限定される分けではない。診断剤の調製

前記と同様にして、ウィルス浮遊液、精製抗原等を調製し、これ等を診断用抗原（例えば、沈降反応、凝集反応、中和反応、蛍光抗体法、酵素免疫測定法、ラジオィムノアッセィ等の抗原）として提供できる。また、診断用抗原ゃヮクチン原液を動物（例えば、ゥサギ、モルモット、マウス等）の腹腔内、皮下、筋肉内等に接種し、この動物の血清から抗体を作成できる。この抗体は、例えば、上記の各種診断法での抗原検出用として提供できる。なお、この発明に係る診断用の抗原や抗体は、これ等の診断剤中の含量が、抗原抗体反応を生じるに必要な量となるよう希釈調整し使用に供する。さらに、この発明に係るロタウィルスのゲノム及び遺伝子断片は、例えば、遺伝子診断におけるプローブ試薬や同定試薬として提供できる。

以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。実施例 1

(1 ) 細胞のクローニング：

細胞培養培地として最終濃度 9%(V/V)の FCS(Gibco社製'米国）を添加混合した MEMを用い、培養面積 25 cm²の容器内で Vero細胞（ATGC CCL 81 )を 37 °Cで培養し、モノシートを形成させた。そのモノシートを 0.25% (W/V)トリプシン（卜リブシン 1:250; Difco社製'米国）液で培養容器面から剥離し、細胞を分散させて遊離単一細胞にした後、低速遠心（1，500r_Pm, 5分）により細胞を集め、上記の培養培地にて細胞数 2細胞/ mlの遊離単一細胞の浮遊液を調製した。この浮遊液を、組織培養用 96ゥヱルのマイクロテストプレ一卜（Falcon Microtest ΙΠ Plate; Becton Di c ki ns on社製'米国）の各ゥエルに 0.2 mlずつ植え込み、炭酸ガス培養器内で 37°C、 14 日間培養し、各ゥエル面に単一細胞の子孫のみからなるコロニーを形成させた。これ等の各コロニーの細胞を順次、より大きな培養容器を用いて 3回植え継ぎ、細胞数を増やすことにより、合計 40の各 Vero細胞クローンの細胞浮遊液を得た。

(2) ロタウイスル感受性細胞クローン株のスクリーニング：

上記（1 )で得た合計 40の各細胞クローンごとにロタウィルスを培養 '増殖させ、各培養上清の中のロタウィルス抗原量を ELISAで測定し、クローニング前の Vero細胞に比べ、著しく抗原価の高い細胞クローン株の検索を、以下の a)- c)のとおりに行った。

a) 各細胞クローンにおけるウィルスの培養：

上記の各細胞クローンごとに前記マイクロテストプレート（96ゥ Iル：横 8 X 縦 12ゥ: Lル）の横列 8ゥエルを割り当て、合計 40の各クローンの細胞浮遊液をそれぞれ 0.2ml/ゥ； ι:ル植え込み、 37°Cで培養し、各クローンのモノシートを形成させた後、各ゥヱルの培養液を血清無添加の新鮮 MEM と交換し、さらに —夜培養した。次に、これ等の各ゥエル内の細胞に、後述するウィルス増殖培地（ただし、卜リブシン最終濃度 20 μ g/ml)で 37°C、 20分間の卜リブシン処理により活性化したロタウィルス AU64株を 0.05 ml/ゥエル接種し、 37°C で 30分間、静置して細胞にウィルスを吸着させた後、ウィルス増殖培地として最終濃度 0.5 μ g/ml のトリプシン（卜リブシン type K; S ma社製-米国）を加えた MEMを 0.2 ml/ゥエル添加し、 37°Cで 7日間、ウィルスを培養し増殖させた。培養終了後の各ゥエル内の培養液はウィルス浮遊液（検体）として下述のウィルス抗原量の測定に供した。なお、比較対照として、クロ一ニング前の前記 Vero細胞を用いた。

b) ウィルス抗原量の測定（一次スクリーニング）：

PH9.6の 50 mM炭酸緩衝液にて A群ロタウィルスに対する抗体（モルモット過免疫血清から精製した IgG)を希釈し、濃度 1.0 g/mlの抗体液を調製した。この抗体液を E LI S A用 96ゥエルの亍ストプレート（ ELISA-PLATE; Greiner社製.ドイツ）に 0.1 ml/ゥヱル添加し、 4°Cで一夜静置し、抗体をゥェル表面に吸着させた。吸着後、洗浄液 [最終濃度 0.05%(W/V)の tween 20 含有 PBS]で各ゥエルを洗浄した。一方、前述の各ウィルス浮遊液を抗原希釈液 [ブロックエース（雪印乳業社製）を脱イオン水で 10 倍希釈]で 5倍希釈し調製した各検体を上記の各ゥヱルに 0.1 ml添加し、 25°Cで 90分間、 1次反応させた。次いで、上記洗浄液でゥエルを洗浄の後、前記の抗原希釈液で 2,000 倍希釈したペルォキシダ一ゼ標識抗 rotavirus ャギ抗体（Viro Stat 社製 '米国）を 0.1 ml/ゥ; Lル加え、再度 25°Cで 90分間、 2次反応させた。次いで、各ゥルは前記の洗浄液で洗浄の後、基質溶液 [最終濃度 0.4 mg/ml の 0-フエ二レンジァミン（和光純薬社製）及び 35%(V/V)の過酸化水素液 (和光純薬社製）含有 0.5M クェン酸一リン酸緩衝液（PH5.0)]を 0.1ml/ゥェル添カ []し、室温で 10分間、ペルォキシダーゼによる発色反応を行い、 4規定の硫酸を 0.05ml/ゥ Xル追加して反応を停止させた。反応停止後、波長 490nm の単色光で各ゥエルの吸光度（ 0 D )を計測した。以上の一次スクリーニングの結果、比較対照の ODに比べ、 5倍以上の ODを示す 6検体を、細胞クローン株の候補として選定し、下述する二次スクリーニングに供した。

c) ウィルス抗原量の測定（二次スクリーニング）：

前述（ 1 )と同様にして上記候補 6株の各細胞クローンをマイクロ亍ストプレ —卜で培養すると共に、各ゥエル内の細胞で AUe4株ウィルスを培養し増殖させた。ただし、ウィルス浮遊液は MOI の違いによる増殖の程度を見るため、 4倍階段希釈し、希釈 1段階につき縦 1列 '横列 2ゥヱルを割り当てた。また、ウィルス抗原量の測定は一次スクリーニングと同様に ELISAで行った。その結果、ロタウィルスの増殖を高度に許容する高度感受性の細胞クローン 3株を得、これ等の株をそれぞれ Vero CL-9( FERM BP- 6028)、 Vero CL - 16、及び Vero C卜 81-7と命名した。実施例 2

ロタウィルスの馴化：

実施例 1で得た Vero CL- 9、 Vero CL- 16、及び Vero C卜 81-7の各細胞クローン株、並びに比較対照としてのクローニング前の Vero細胞をそれぞれ、細胞培養培地として MEM [最終濃度 9%(V/V)の FCS(Gibco社製'米国）含有]を用い、 37°Cで培養し、各細胞のモノシートを形成させた。なお、培養容器として組織培養用試験管を各細胞株につき 2本用いた。モノシート形成後、各容器の培地を血清無添加の新鮮な MEMと交換し、さらに一夜培養した。次に、各容器内の細胞に AU64株ウィルス浮遊液 0.2 mlを接種し、 37°Cで 60 分間、静置して細胞にウィルスを吸着させた後、接種液を除き、ウィルス増殖培她として MEM [最終濃度 0.5 g/mlのトリプシン type K(Sigma社製' 米国）含有]を 1 ml/容器に添加し、 37°Cで 7日間、ウィルスを回転培養した。培養終了後、培養液を採取し、ウィルス浮遊液として一 80°Cで保存した。これ等の各ウィルス浮遊液を用いて同様のウィルス培養を繰り返し行うことにより、ウィルスを 7代継代した。各継代のウィルス浮遊液につき、下述の蛍光抗体法（FA)及び酵素抗体法（EIA)により感染価 FFUを測定した。

チェンバースライド（Nunc 社製'米国）内で上記と同様の方法により培養した各細胞クローン株及び比較対照細胞に 10倍階段希釈した各継代のウィルス浮遊液を接種し、 37°Cで 2日間培養の後、各細胞を固定し、次いで、間接 FA及び EIAにより、 FFUを計数した。細胞の固定は、 PBS及び脱イオン水で順次、細胞を静かに洗浄の後、最終濃度 10%(V/V)メタノール添加アセトン中に室温で 5分間、浸潰し行った。

なお、上記 FAは、一次反応に抗ヒト rotavirus モルモット過免疫血清を、二次反応には FITC標識モルモット IgGャギ l_gG(Cappel社製'米国）をそれぞれ用いて行った。

—方、 EIAは、一次反応に A群 rotavirus に対するモルモット過免疫血清を、二次反応にはペルォキシダーゼ標識抗モルモット IgG ャギ血清（Cappel 社製'米国）を、そして、発色反応には基質溶液 [最終濃度 1 mg/mlの 4-クロ口— 1—ナフトール（ Bio— Rad 社製 '米国）、 20 % (V/V)メタノール、及び 1 /1,000容の 35 %(V/V)過酸化水素水加卜リス塩酸緩衝液]をそれぞれ用いて行った。

以上に基づく FFUカウントの結果を表 2に示す。実施例 1で得た高度感受性の各細胞クローン株におけるロタウィルスの馴化は順調に進み、感染ウイルス量 log(FFU/ml)力《、 6.5以上の継代ウィルスをクローン化 Ve ro細胞馴化ウィルス株として一 80°Cに保存した。表 2

ウィルス細胞クローン株比較対照継代数 Vero CL-9 Vero CL-16 Vero CL81 -" Vero CCL 81

1 5.3 4.8 5.1 2.7 2 5.8 5.3 5.5 2.7 3 6.0 5.4 5.7 2.8 4 6.7 6.0 6.2

5 6.9 6.1 6.4

6 7.2 6.2 6.6

7.3 6.5 6.8 数値： log (FFU/ml)

一：実施せず

Vero CCL 81：クロ一ニング前の Ve ro細胞（ AT G G CCL 81) 実施例 3

( 1 ) 新規ヒト■ロタウィルス株 AU64nの分離：

AGMK( African Green Monkey Ki d ney )細胞を培養用試験管内で実施例 1と同様にして培養し、モノシートを形成させた後、後述するウィルス分離材料を接種する前日に新鮮な無血清 MEMと培地交換した。

一方、ウィルス分離材料を次の通り調製した。ロタウィルス感染幼児の下痢便 0.1 gを MEMO.9 mlに浮遊し、この浮遊液に前述のトリプシン type K を最終濃度が 10 μ g/mlになるよう添加混合の後、 37°Cで 20分間保温した。次に、これを微量高速遠心機で遠心（10,000rpm, 30秒）し、その上清を採取し、 MEM で 10倍希釈の後、経口 0.22 μ m のフィルタ一で除菌濾過した。この濾液をウィルス増殖用培地（最終濃度 0.5 g/mlの卜リブシン type Kを添加混合した MEM)で 10倍階段希釈し、ウィルス分離材料とした。

次に前記の AGMK細胞の培地を捨て、各試験管内の細胞に上記ウィルス分離材料を 1 mlずつ接種した。これを 37°Cで 1時間保温し、分離材料中のゥィルスを細胞に吸着させた後、接種液を捨て、ウィルス増殖用培地（1 ml/試験管）で細胞を 1 回洗浄した。次いで洗浄液を捨て、各細胞に新鮮なウィルス増殖用培地（1 ml/試験管）を添加し、回転培養した。この培養下で CPEが観察された細胞をその培養液と共に凍結融解することにより検体を調製し、各検体について ELISA (実施例 1 )により、ロタウィルス抗原の検出を行い、この抗原が陽性の検体を得、その検体の低速遠心上清を初代ウィルスとして下記の継代に供した。

(2) 新規ヒト■ロタウィルス株の継代：

上記の初代ウィルスに、最終濃度が 10 μ g/mlになるようトリプシン type IXを添加混合し、 37°Cで 90 分間、保温処理（以下「ウィルスの活性化」という）を行った後、これを MEMで 10倍希釈し、前記（ 1 )と同様にして、新鮮な下記の細胞に接種して培養し、ウィルスを連続継代した。その結果、 AGMK 細胞 5代、次に Vero細胞（ATCC CCL81 ) 5代、さらに Vero C卜 9細胞（FERM BP - 6028) 2代（以下、継代歴を" AGMK/5, Vero CCL81 /5, Vero CL-9/2" の要領で表記する）からなるヒト'ロタウィルス株を得た。

なお、この新たに分離したヒト 'ロタウィルス株の血清型及び遺伝子型は、発明者らによる既報（ Microbiology and Immunology, 38(4), p.317-320, 1994)に記載された血清型及びウィルスゲノム RN Aの電気泳動パターンを用いる方法により解析した結果、 G1 P1 B[4]であることが確認された。この血清型及び遺伝子型は、表 1に示した分類に従えば、 AU64 株と同一であるため、この新規ヒト.ロタウィルス株を AU64nと命名した。

(3) AU64n株ウィルス" AG M K/5 , Vero CCL81/5, Vero C L— 9/2 "の |JI|化：プラーククロ一ニングにより次の通り行った。炭酸ガス培養器中で、 Vero

CL— 9細胞を 6ウエレ Falcon プレー卜（ Becton D i cki nson社製'米国）上でモノシートになるまで培養の後、培地を無血清 MEMに置換し、さらに一昼夜培養した。次に、前述の通りトリプシンで活性化した AU64n株ウィルスをウイルス増殖用培地で 10倍希釈の後、これを上記の細胞に 1ml/ゥヱルずつ接種した。 37°Cで 1時間保温して細胞にウィルスを吸着させた後、接種液を捨て、ァガー培地 [最終濃度 0.7(W/V)%ァガロース ME(FMCBIO PRODUCTS社製-米国）及び 0.5 μ g/ml トリプシン type Kを添加混合の 199培地]を 2ml/ゥエルずつ重層し、ァガーが固化した後、プレートを反転し培養を続けた。ウィルス接種の後、 4 日目及び 7日目にそれぞれ上記のァガー培地を繰り返し重層して培養を続け、さらに 11 日目に色素 [最終濃度 0.003(W/V)ニュ一卜ラルレッド（和光純薬社社製）を添加混合したァガ一培地]を重層して培養し、細胞染色によりプラークを形成させ、 12日目に直径が大きく分離独立したブラ —クを採取（クローニング）した。次に、このプラークを MEMに浮遊し、前述 (2)のウィルス継代と同様の方法により、 Vero C L- 9細胞で一度ウィルスを増幅の後、再度、プラーククローニングを行った。このクローニングとウィルス増幅の操作を合計 3回繰り返し行った後、さらに Vero CL- 9細胞で 2代継代し、次いで 4回目のプラーククローニングと増幅をそれぞれ行い、得られた AU64n株ウィルスをさらに Vero CL- 9細胞に 1 代継代し、ヒト 'ロタウィルス AU64n 株のオリジナノレシ一ド（継代歴は" AG M K/5 , Vero CCL81/5, Vero CL- 9/12)を作成した。各継代レベルでの感染価は、実施例 2の記載と同様にして log(FFU/ml)を測定した結果、継代順に次の通りであった：

2.5, 3.7, 4.6, 5.4, 5.8 ( AG M Kに 5代継代）；

2.8, 3.5, 3.6, 4.0, 4.4( Vero CCL81 に 5代継代）；

5.9, 6.4, 6.8, 7.0, 7.1 , 7.1 , 7.1 , 7.2, 7.2, 7.2, 7.2， 7.2

(Vero CL-9 に 12 代継代）。実施例 4

( 1 ) AU64n株ウィルスの大量培養：

培養 1回につきローラ一ボトル 10本を用いてウィルスを大量培養し、これを合計 8回繰り返し行った。すなわち、 Falcon ローラーボトル（ B e cto n Dickinson社製 '米国、製品番号 3027)で回転培養した Vero CL-9細胞の培地を無血清 MEMと置換し、さらに一夜培養した後、培地を捨て、各ボトルの細胞に実施例 3で得た AU64n株オリジナルシードを 20ml/ボトル接種した。なお、このオリジナルシードはトリプシン type Kで事前に活性化した。次に、 37°Cで 1 時間、回転下で保温して細胞にウィルスを吸着させた後、接種液を捨て、新鮮なウィルス増殖用培地を 80ml/ボトル添加し、 37°Cで 2日間、回転培養した。培養終了後、各ボトルの培養物を凍結融解してウィルス浮遊液を調製し、これ等をプールした。次に、このウィルス浮遊液を低速遠心 (3,000rpm, 10 分）の後、その上清（培養 1回につき 800m I )を採取し、粗精製ウィルス浮遊液とした。合計 8回培養により得られた各粗精製ウィルス浮遊液につき、実施例 3の（ 3)記載と同様にしてウィルス感染価（ X 10 ⁶ FFU/ml)を測定した。その結果、得られた log(FFU/ml)はそれぞれ、 4.9, 5.5, 10.0, 7.0, 7.5, 8.0, 4.2, 及び 4.0であった。

(2) AU64n株ウィルスの精製：

上記の粗精製ウィルス浮遊液を用い、 1.2 リットルを 1ロットとする合計 4口ッ卜を編成し、各ロットのウィルスを次の通り精製した。各ロットの粗精製ウイルス浮遊液を遠心（ 10.000rpm, 10 分）した後、その上清を採取し、さらに超遠心（ 19,000rpm、 6時間）を行い、その沈降物を 15mM PBS(pH7.5)に浮遊して 40mlとし、 30倍濃縮液とした。この濃縮液を遠心（10,000rpm、 10分）した後、その上清を採取し、これを 30(W/V)%蔗糖クッションに重層して超遠心 (38,000rpm、 3 時間）し、この超遠心後の沈降画分を 15mM PBS(pH7.5)に再浮遊し、精製 AU64n 株ウィルスを得た。再浮遊（6ml/ロット）した合計 4口ットにっき、ウィルス感染価を測定すると共に、フエノール試薬法で蛋白量を定量した。その結果、各ロット（#1 ~#4)のウィルス感染価（ X 10 ⁸ PFU/ml) と [蛋白量（mg/ml)]はそれぞれ、 #1： 3·8[1·36]、 #2： 4.8 [ 1.10]、 #3 : 3.3[0.94]、 #4: 1.3[1.57]であった。 (3) AU64n株ウィルスの不活化：

上記の各ロット（#1〜#4)から再浮遊液（精製 AU64n 株ウィルス）を 3ml ずつ採取し、プールした合計 12mlの再浮遊液当の蛋白量が 100 μ g/ml になるよう 15mM PBS(pH7.5)で希釈調整の後、最終濃度が 0. V/V) %になるようホルマリンを添加混合し、 4 °Cで 2週間静置した。次に、 15m M PBS(pH7.5)に対し 5°Cで 30時間透析を行った。透析完了後の不活化ウィルス含有液につき、不活化ロタワクチン原液としての適格性を確認するため、各種試験を行った。すなわち、前述の生物学的製剤基準に定める「日本脳炎ヮクチン」の規程に準拠し、たん白質含量試験、染色試験、無菌試験、不活化試験、及び異常毒性否定試験を行った。ただし、不活化試験は Vero CL-9細胞を用いて行った。その結果、上記の不活化ウィルス含有液は、ワクチン原液として適格であることが確認された。

(4) ロタウィルス感染症ワクチンの調製：

上記のワクチン原液を 15mM PBS(pH7.5)で希釈し、蛋白量を 50 g/ml に調整することにより、不活化 AU64n ワクチンを調製した。一方、不活化しない前記 4ロットから各々 0.5mlずつ採取し、プールした再浮遊（精製 AU64n株ウィルス）の蛋白量を上記と同様にして 50 g/mlに調整し、生 AU64n含有液とした。

(5) 不活化 AU64nワクチンの免疫原性の測定：

不活化 AU64nワクチンを、蛋白量 10 g/ドーズにて 2週間隔で 2回、 4-5 週齢の ddY マウス（7匹）に接種し、その 2週間目に全採血を行った。比較対照として、上記の生 AU 64 n含有液及び 15mMPBS(_PH7.5)の両者を用い、不活化 AU64nワクチンと同様、前者は 19匹の、後者は 10匹のマウスにそれぞれ接種の後、全採血した。得られた各血清の AU64n 株に対する中和抗体価を 60<½ブラック減少法により測定した。結果は表 3に示したとおりであり、このワクチンの優れた免疫原性が確認された。表 3

に用し、ナ'枯 IS Φ fD杭休価 +偉頼限床

不活化 AU64n ワクチン 2.20± 0 .23

生 AU64n含有液 2.30± 0 . 12

15mM PBS (pH7.5) ≤ 1 .60

中和抗体価：個々のマウスの抗体価（常用対数）の幾何平均値

信頼限界：危険率 5%

(6) 不活化 AU64nワクチンの免疫特性：

不活化 AU64n ワクチンによる上記のマウス免疫血清（7 匹分）の、血清型又は遺伝子型が異なるロタウィルスに対する中和能を 60%フォ一カス減少法により測定した。その結果を表 4に示す。 AU64n株を有効成分として用いるヮクチンは、 AU64n 株だけではなく、 P血清型と遺伝子型とが異なる Wa株、及び G血清型が異なる DS - 1 株の両者の感染防御に有効であるとことが示唆された。

表 4

攻撃ウィルス G-P血清型 [遺伝子型] 中和抗体 ±信頼限度

A U 6 4 n G 1 P 1 B [4] 2. 19±0.52

W a G 1 P 1 A [8] 2.43 + 0.43

D S - 1 G 2 P 1 B [4] 1.90±0.25

信頼限界：危険率 5% 実施例 5

新規ヒト 'ロタウィルス株 AU32nの取得：

実施例 3の記載と同様の方法により、新規ヒ卜 'ロタウィルス株を分離かつ継代し、感染価を測定すると共に、血清型及び遺伝子型を解析した。すなわち、ロタウィルス感染幼児の下利便から、 AGMK 細胞を用いてヒト 'ロタウイルス株を分離し、さらに同細胞で 2代継代の後、 Vero CL - 9 細胞に合計 8代継代 [第 1〜 3代（プラーククローニング）、第 4代（静置培養）、第 5代（ブラ —ククローニング）、第 6代（静置培養）、第 7〜8代（回転培養）] することにより、細胞クローン馴化ヒト 'ロタウィルス株（継代歴は、 AGMK/3、 Vero CL- 9/8)を得た。このヒト 'ロタウィルス株の感染価 log(FFU/ml)は 6.0であつた。また、血清型 [遺伝子型]は G9P1 A[8]であり、 AU32 株と同一であるため（表 1参照）、この新規ヒト 'ロタウィルス株を AU32nと命名した。実施例 6

Vero CL- 9細胞によるロタウィルスの分離：

実施例 3( 1 )の記載と同様の方法によリロタウィルスの分離を行う。ただし、 AGMK細胞の代わりに Vero CL-9細胞を用いて行う。産業上の利用可能性

この発明は、ロタウィルス感染症に係るワクチン、診断剤、試薬及びこれらの製造方法を提供するものであり、人類の保健、世界の医療行政、環境衛生、畜産、及びロタウィルス感染症に関する基礎■臨床■応用の各研究に寄与するものである。特に、この発明は、小児嘔吐下痢症、白色便下痢症、小児仮性コレラ等の病名で恐れられている感染症に対する強力な予防手段としてのワクチンの提供により、世界の一般家庭のみならず、世界保健機構（WHO)を始めとする全世界の医療■保健従事者に待望の福音をもたらす。

Claims

請求の範囲

1. ロタウィルスの増殖を高度に許容する細胞を培養細胞からクローニングし、得られた細胞クローン株にロタウィルスを継代し馴化させることによリ細胞クローン馴化ロタウィルス株を作成し、この馴化ロタウィルス株又はこれを親株に用いて作成したリアソ一タントをシードウィルスとして培養し、このシードウィルスの培養培地よりロタウィルス抗原を単離■精製することを特徴とするロタウィルス抗原の製造方法。

2. 培養細胞が Vero細胞（ATCC CCL 81 )である請求項 1のロタウィルス抗原の製造方法。

3. 細胞クローン株力《 Vero CL— 9(FERM BP - 6028)である言青求項 1又は 2 のロタウィルス抗原の製造方法。

4. ロタウィルスがヒト■ロタウィルス株 AU32n及びノ又は AU64nである請求項 1、 2又は 3のロタウィルス抗原の製造方法。

5. 請求項 1から 4のいずれかの方法により得られたロタウィルス抗原。

6. 請求項 5のロタウィルス抗原をさらに不活化剤で不活化することにより調製された不活化抗原。

7. 請求項 5のロタウィルス抗原、又は請求項 6の不活化抗原を、免疫を奏する量含有するロタウィルス感染症ワクチン。

8. 請求項 5のロタウィルス抗原、又は請求項 6の不活化抗原であって、血清型又は遺伝子型が互いに異なる 2種以上の抗原をそれぞれ、免疫を奏する量含有する混合多価ロタウィルス感染症ワクチン。

9. 請求項 5のロタウィルス抗原、又は請求項 6の不活化抗原を、抗原抗体反応を呈する量含有する診断剤。

10. 細胞クローン株 Vero CL-9(FERM BP-6028) ₀

1 1. 細胞クローン馴化ヒト 'ロタウィルス株 AU32n。

12. 細胞クローン馴化ヒト 'ロタウィルス株 AU64n。