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WO1998018953A1 - Nouveau procede de fabrication de fr900482 et de composes analogues - Google Patents

Nouveau procede de fabrication de fr900482 et de composes analogues Download PDF

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Publication number
WO1998018953A1
WO1998018953A1 PCT/JP1997/003907 JP9703907W WO9818953A1 WO 1998018953 A1 WO1998018953 A1 WO 1998018953A1 JP 9703907 W JP9703907 W JP 9703907W WO 9818953 A1 WO9818953 A1 WO 9818953A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fusarium
culture
white
agar
strain
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/003907
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masaru Tsuboi
Shiho Shimizu
Michio Yamashita
Yasuhisa Tsurumi
Seiji Hashimoto
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to US09/284,481 priority Critical patent/US6204031B1/en
Priority to CA002270181A priority patent/CA2270181A1/en
Priority to EP97909655A priority patent/EP0943689A4/en
Priority to AU47247/97A priority patent/AU725546B2/en
Publication of WO1998018953A1 publication Critical patent/WO1998018953A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/929—Fusarium

Definitions

  • the present invention relates to enzyme technology.
  • the present invention relates to an alcohol of the following compound ( ⁇ ) produced by the microorganism Streptomyces sandaensis No. 6897 (FERM BP-792) or produced by chemical conversion of the product.
  • the present invention relates to a method for oxidizing a side chain to convert it into the following compound (I) having an aldehyde side chain.
  • Compound (I) itself has a strong antitumor activity, is also an intermediate of other compounds having antitumor activity, and is a microorganism capable of easily converting compound (II) to compound (I). Was required. Disclosure of the invention
  • R 1 represents hydrogen, a lower alkanoyl group or a lower alkyl group
  • R 2 and R 3 represent hydrogen or a lower alkenyl group, respectively
  • the inventors of the present invention have intensively studied a microorganism capable of converting the alcohol side chain of the compound (II) into an aldehyde side chain. As a result, they newly found an oxidase-producing bacterium belonging to the microorganism Fusarium and succeeded in converting it to the following compound (I) having the desired aldehyde side chain.
  • FR900482 and FR066979 the compounds in which R 1 , R 2 and R 3 are each hydrogen are named FR900482 and FR066979, respectively. These compounds are produced by the microorganism Streptomyces sandaensis No. 6897 (FERM BP-792) and are described, for example, in Example 1 and 8 of JP-A-61-10590, respectively. It is a known substance having tumor activity and the like. FR066979 can also be produced by the method disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 1101893.
  • FR900482 and FR066979 are the most preferred target compounds and starting compounds of the present invention.
  • the compound in which R 1 , R 2 and R 3 are each an acetyl group is named FR066973, and R 1 and R 2 are each hydrogen and R 3 is an acetyl group.
  • One compound is named FR66980, and a compound in which R 1 is a methyl group and R 2 and R 3 are each acetyl is named FR073317. Examples 3 and 4 of JP-A-61-10590. (And 6) and Example 51, respectively.
  • Suitable ⁇ lower alkanol groups '' include, for example, alkanoyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutylinole, pareryl, isovalerinole, pinocloyl, and hexanoyl. More preferred properly is d -C 4 Arukanoiru group are particularly preferred include Asechiru group.
  • Suitable "lower alkyl groups” include, for example, methyl, ethyl, propyl, iso- Propyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, cyclohexyl and the like are mentioned to, more preferably d ⁇ C 4 alkyl group, particularly preferably a methyl group . The features of this method are described below.
  • No. 122 strain capable of converting compound (II) to compound (I) (hereinafter referred to as No. 122 strain) is a soil sample collected from Yakushima, Kagoshima Prefecture. It is newly separated from. The characteristics of No. 122 strain are shown below.
  • Filamentous fungus No. 122 was isolated from a soil sample collected at Yakushima, Kagoshima Prefecture. These microorganisms grow extensively and extensively on various media and produce colonies with a white to yellowish-white color. Strain No. 122 did not form teleomorphs on various media, but conidia-forming cells and two types of conidia, large and small, conidia that grow on the mycelium, i.e., large conidia in a boat shape and small conidia in an oblong shape. Caused an anamorph. The mode of conidium formation was a fibroid type. The bacteriological properties of No. 122 strain are shown below.
  • Table 1 summarizes the culture characteristics on various agar media. It grew extensively and broadly on potato dextrose agar, and after culturing at 25 ° C for 2 weeks, had grown to a size of 8.0 cm or more in diameter. The surface of the colonies was raised and had a wool-like, white to yellowish white color. Among the conidia, small conidia were abundant and large conidia were formed in small amounts. The back side was yellowish white. The colonies on cornmeal agar grew at the same speed as potato dextrose agar, and under the same conditions, spread over 8.0 cm in diameter. The settlement surface is raised, felt or wool, and white in color. Conidia, especially small conidia, were abundantly formed. The back side was white to yellowish white.
  • the morphological characteristics are: sporulation medium with good formation of large conidia (medium composition: glycerin lg; sodium nitrate 0.5 g; potassium phosphate 0.2 g; yeast extract O. lg; agar 15 g; distilled water 1 L).
  • medium composition glycerin lg; sodium nitrate 0.5 g; potassium phosphate 0.2 g; yeast extract O. lg; agar 15 g; distilled water 1 L.
  • No. 122 shares Conidia are indistinguishable from vegetative mycelia and conidia-forming cells (fialides) are directly lateralized as short branches of aerial hyphae and vegetative hyphae. In some cases, vegetative mycelia may be clustered like conidia, and phialides may form inside or at the top.
  • the fi laid is colorless, smooth and cylindrical, and has a size of 8-17 (-20) X 2-3 m.
  • Two large and small conidia are formed continuously from the tip.
  • Large conidia are colorless, smooth, 2-4 (-6) cells, hull-shaped or crescent-shaped to sausage-shaped, slightly curved at both ends and sharp, 25-35 (-42) X 3.5-4.5 (—5.5) im.
  • Small conidia are colorless, smooth, 1 (1 2) cells, slightly curved oval, and 6-16 (-20) x 2.5-4 im.
  • the vegetative mycelium has a smooth surface, septum, and is colorless and branched. Mycelial cells are cylindrical and 2-3-tztz wide. Chlamydospores are not formed. In culture on sub-a-dextrose agar, black and spherical sclerotia are formed.
  • the No.122 strain can grow at 2 to 31 ° C, and the optimum growth temperature is 21 to 25 ° C. These data were determined on potato dextrose agar (Nissi). The characteristics of the above No. 122 strain were reported by Baron (GR Barron: The Genera of Hyphomycetes from Soil. Pp. 239—241, Wi 11 iams & Wilkins, Baltimore, 1968), by von Arx (JA von Arx: The Genera of Fungi. Sporulating in Pure Culture, pp. 180-184, J. Cramer, Vaduz, 1974), KH Domsch, Gams & T.—H. Anderson: Compendium of Soil Fungi, pp. 517—524 , Academic Press, London, 1980).
  • the strain No.122 was considered to be a strain belonging to the genus Fusarium. Therefore, this strain was designated as Fusarium sp.
  • Potato dextroth Growth Large and wide, 8.0cm or more in diameter
  • Agar (Difco 0013) Surface: round, raised, wool-like, rich
  • Wapek's liquid agar * Growth Large and wide, 8. Ocra or larger
  • Emerson Yp Ss Agar Growth Large and wide, 8.0cm or more in diameter
  • Cornmeal agar Growth Large and large, 8.0cm or more in diameter
  • Fusarium sp. No. 104 strain (F-104 strain):
  • the filamentous fungus F-104 strain is owned by the applicant.
  • the microorganism grew widely and extensively on various media, and formed fluffy to wool-like colonies with white to reddish-white tones.
  • This strain formed anamorphs on some media, but did not produce teleomorphs.
  • the anamorph has a fibrous conidial structure with a slightly branched conidiophore, and is composed of two types of conidia (a large conidia with a ⁇ shape in 2 to 5 cells and an orchid in 1 or 2 cells). Small conidia).
  • JA von Arx The Genera of Fungi. Sporulating in Pure Culture. 3rd ed., Pp. 145-163, J. Cramer, Vaduz, 1974
  • the F-104 strain appeared to belong to the genus Fusarium Link 1809, a defective filamentous fungus. The following shows the mycological characteristics of the F-104 strain.
  • Table 2 summarizes the culture characteristics on various agar media. Cultures on potato dextrose agar were broad and extensive, 25, and expanded to 6.0-6.5 cm in diameter after two weeks, producing circular colonies. The colony surface was raised and fluffy to wool-like. The color of the village was white to reddish white, and the periphery was grayish red. The backside of the village was brownish purple to purpledish brown, and the periphery was dull red from challenging ash. No conidial structure was formed on this medium. The colonies on the cornmeal agar medium were even faster, spread over 9.0 cm in diameter under the same conditions, and reached the petri dish wall.
  • the F-104 strain was able to grow in the range of 2 to 32 ° C, and the optimal growth temperature was 21 to 24 ° C. These growth temperature data were determined on potato dextrose agar (Nissui Pharmaceutical). The mycological characteristics described above are based on the classification criteria for Fusarium II by the booth (C. Booth: The Genus Fusarium, pp. 237, Commonwealth Mycological Institute, ew, 1971), and by H. Domsch, W. Gams & T . -H. Anderson:
  • Emerson YpSs agar Wide and large, round, 7.0-8.0 cm in diameter
  • Oatmeal agar Growth Large and wide, round, 8.0-9.0cm in diameter
  • the production of compound (I) is not limited to using the specific microorganisms described herein for illustrative purposes only.
  • the present invention relates to a human mutant which can be produced from the microorganism by a conventional method such as spontaneous mutant bacterium and treatment with X-ray irradiation, ultraviolet irradiation, N-methyl-N, 12-nitro N-nitrosoguanidine, 2-aminopurine, or the like. It also encompasses the use of any mutant bacterium capable of converting compound (II) to compound (I), including mutant bacterium.
  • Examples of the bacteria producing 1 ⁇ 900482 substance include the following bacteria. Fusarium strains owned by the applicant:
  • the oxidase produced by the microorganism of the present invention can be obtained by oxidizing the alcohol side chain of the compound represented by the above formula ( ⁇ ) to give a compound represented by the following structural formula (I) (known in Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-10590). ) Is generated.
  • the oxidase does not necessarily have to be isolated in a pure state, and the producing strain is cultured together with the compound (II), or a culture solution of the microorganism of the present invention, a bacterial cell, or a solution obtained by removing the microorganism from the culture.
  • the target compound (I) can also be obtained by using a crude product of the above oxidase instead.
  • the culture solution or the bacterial cells used as the oxidase of the present invention, or the bacterial fluid removed from the culture may be a strain belonging to the genus Fusarium such as Fusarium. Sp. No. 122 or No. 104. Is cultured in a medium.
  • the novel microorganism can be produced by culturing in an aqueous medium containing an assimilable carbon source and a nitrogen source, preferably under aerobic conditions such as shaking culture and submerged culture.
  • Preferred carbon sources for the medium include carbohydrates such as glucose, maltose, sucrose, flattose, galactose, mannitol, glycerin, starch and the like.
  • Preferred nitrogen sources include organic nitrogen compounds such as soybean flour, cottonseed meal, wheat germ, gluten meal, corn steep powder, peanut flour, and linseed oil meal, and inorganic nitrogen compounds such as ammonium nitrate and ammonium sulfate.
  • inorganic salts such as potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, cobalt sulfate and the like may be added.
  • an antifoaming agent such as liquid paraffin, fatty acid, vegetable oil, mineral oil or silicone may be added as necessary.
  • a deep aerobic culture is preferable.
  • shaking culture or surface culture is performed in flasks or bottles.
  • the medium that produces this preculture inoculum may be substantially the same as the medium used in the large tank, or may be different.
  • Agitation and aeration of the culture mixture can be performed in various ways. Agitation can also be achieved by using a probe or equivalent stirring device, by rotating or shaking the fermenter, by using various pumping devices, or by passing sterile air through the medium. Can be. Aeration may be provided by passing sterile air through the fermentation mixture.
  • Fermentation is usually performed at a temperature in the range of about 20 ° C to 32 ° C, preferably 25 ° C to 30 ° C, preferably at a pH of 6 to 8, and is carried out for about 72 to 200 hours, but it may vary depending on fermentation conditions and scale. Let me do it.
  • the substrate FR066979 may be added as an aqueous solution at the start of culture or at an appropriate time, and a fermentation broth with low purity may be used.
  • the FR900482 converted in this way can be recovered from the culture medium by conventional methods commonly used for the recovery of other known biologically active substances.
  • the converted FR900482 is present in the culture solution, and can be separated and purified by a conventional method such as treatment with a conventional resin such as an adsorbed resin, crystallization or the like after the culture broth is passed or centrifuged.
  • a conventional resin such as an adsorbed resin, crystallization or the like after the culture broth is passed or centrifuged.
  • composition of cottonseed meal 1%, soybean flour 1%, ammonium nitrate 0.1%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, sodium chloride 0.1%, ferric sulfate heptahydrate 0.001% A 500-ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of a seed culture medium is sterilized at 121 ° C for 20 minutes, inoculated with one or two loops of Fusarium sp. No. 122 strain agar culture, and shaken at 25 for 2 days. The cells were cultured to form a seed culture.
  • a production medium consisting of maltose monohydrate 5%, soybean flour 2%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05% to pH 6.0, and include 10ml of this production medium.
  • the lOOml Erlenmeyer flask was sterilized at 121 ° C for 20 minutes, inoculated with the seed culture 0.5d, and cultured with shaking at 30 ° C for 3 days. Furthermore, 0.3 ml of a 10 mg / ml aqueous solution of FR066979 was added, and the cells were shake-cultured for another 3 days and converted to FR900482.
  • the culture solution was passed through Np.2 paper, and the production amount of FR900482 was determined by monitoring the production of FR900482 using a high-performance liquid chromatography (HPLC) with a UV detector (wavelength: 215 nm).
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • composition of cottonseed meal 1%, soybean flour 1%, ammonium nitrate 0.1%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, sodium chloride 0.1%, ferric sulfate heptahydrate 0.001% A 500-ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of a seed culture medium is sterilized at 121 ° C for 20 minutes, inoculated with one or two loops of agar agar culture of Fusarium sp. No. 122 strain, and shaken at 25 for 2 days. The cells were cultured to form a seed culture.
  • a production medium consisting of maltose monohydrate 5%, soybean flour 2%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05% was adjusted to pH 6.0, and this production medium 10ml Sterilize a 100 ml Erlenmeyer flask containing the above at 121 ° C for 20 minutes, inoculate 0.5 ml of the above seed culture, add 0.3 ml of FR066979 lOmgZml aqueous solution, shake culture for 8 days, and convert to FR900482.
  • a production medium consisting of maltose monohydrate 5%, soybean flour 2%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05% was adjusted to pH 6.0, and this production medium 10ml Sterilize a 100 ml Erlenmeyer flask containing the above at 121 ° C for 20 minutes, inoculate 0.5 ml of the above seed culture,
  • FR900482 was determined by monitoring the production of FR900482 using a high-performance liquid chromatography (HPLC) with a UV detector (wavelength: 215 nm). Conversion from FR066979 to FR900482 by No.122 strain
  • Seed culture medium composition Pharma media 1%, soybean flour 1%, NH H N0 3 0.1%,
  • the substrate was added using a pipe so that the final concentration was 300 gZral at the start of the culture.
  • Soybean paste 17 235 30 214 Soybean flour 103 128 136 97 Pharmaceutical 79 163 72 146 Corn cheese 0 178 0 154 Corn cheese powder 15 188 21 178 Dry yeast 79 146 105 95 Potato protein 30 215 49 131 defatted wheat germ 59 195 161 59 wheat germ 30 233 76 169 gluten mill 20 244 61 171 defatted soy flour 93 121 112 75 peanut flour 62 198 87 180 Amani oil cake 101 115 63 130
  • a culture solution 10 of Streptomyces sandaens is No. 6897, which was cultured according to the method of JP-A-1-101893, was passed, and a solution ⁇ was obtained after washing the cells with water.
  • FR066979 is present at a total concentration of about 1 tng / ml.
  • the solution was applied to 5 synthetic adsorption resins such as SEPABEADS SP850 and SEPABEADS SP207. After washing the resin with water to remove proteins, amino acids and salts, FR900482 and FR066979 were eluted with 20 50% methanol water.
  • 5 synthetic adsorption resins such as SEPABEADS SP850 and SEPABEADS SP207. After washing the resin with water to remove proteins, amino acids and salts, FR900482 and FR066979 were eluted with 20 50% methanol water.
  • the methanol aqueous solution was concentrated to 1.5, added to 10 £ of Fusarium sp. No. 122 culture solution, and reacted from FR066979 to FR900482. The reaction was terminated when FR066979 fell below the detection limit (about 15 hours).
  • the concentration of FR900482 was about 730 / igZml.
  • reaction solution was passed through the reaction solution to obtain “liquid 11 ⁇ ⁇ ”, which was applied to DIAION HP20 adsorption resin 2. After washing proteins, amino acids and salts with 10% methanol water, elution was carried out with 20N of 0.05N sulfuric acid. The concentration of FR900482 was 370 g / ml.
  • This active area was concentrated to 10 ⁇ and supplied to 5 A of DI AION HP1MG adsorption resin. After washing with 40 water, FR900482 was eluted with 50% methanol water15.
  • This ethyl acetate layer was concentrated to 75 ml, to which 75 ml of pyridine and 16 ml of acetic anhydride were added, and the reaction from FR066980 to FR066973 was carried out at 40 ° C. with stirring for 15 hours. After confirming that the conversion to FR066973 was 95% or more, the reaction was terminated by adjusting the pH to 3 with 6N hydrochloric acid. 500 ml of water was added, and pyridine was transferred to the aqueous layer under acidic conditions, followed by separation and removal. Further, 500 ml of a 10% sodium bicarbonate suspension was added, and unreacted anhydric anhydride / acetic acid was transferred to and removed from the aqueous layer. As a result, about 6 g of FR066973 was formed in the ethyl acetate layer.
  • HPLC tunable UV detector Shiadzu SPD - 10A
  • a pump Shiadzu LC- 10AD
  • the stationary phase TSKgel ODS 80T M 46 mm 150mm id grains Using a diameter of 5111
  • UV was detected at 220 nm.
  • the retention time of FR066973 was about 5.1 minutes, and that of FR073317 was about 4.7 minutes.
  • F. tricinctum (Fusarium. Sp. No. 104) has been deposited with the Institute of Life Science and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • the seed culture solution was inoculated into the main culture medium to which 300 g / ml of FR066979, which had been over-sterilized beforehand, was added, and cultured with shaking at 25 ° C for 8 days. After culturing, the 15N H 2 S0 4 50 1 was added, the FR900482 in the supernatant obtained by centrifugation 2800 rpm, 10 minutes was measured by HPLC.
  • FR900482 can be produced in high yield from FR066979.

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Description

明 細 書
FR900482および類似化合物の新規な製造法 技術分野
本発明は、 酵素技術に関するものである。
具体的には、 本発明は微生物ス トレプト ミセス ·サンダェンシス（Streptomyces sandaensis) No.6897 (FERM BP -792) によって産生され、 または該産生物の化 学変換によって製造される下記化合物 （Π) のアルコール側鎖を酸化し、 アルデ ヒ ド側鎖を有する下記化合物 （ I ) に変換する方法に関するものである。
化合物 （ I ) は、 それ自身強い抗腫瘍活性を有し、 また他の抗腫瘍活性を有す る化合物の中間体でもあり、 化合物 （II) を化合物 （ I ) に容易に変換し得る微 生物が求められていた。 発明の開示
Figure imgf000003_0001
(式中、 R1 は水素、 低級アルカノィル基または低級アルキル基、 R2および R3 はそれぞれ水素または低級アル力ノィル基を意味する）
本発明の発明者らは上記化合物 （II) のアルコール側鎖をアルデヒド側鎖に酸 化する変換能を有する微生物を求めて鋭意研究を行った。 その結果、 微生物フザ リウム （Fusarium) に属するォキシダーゼ生産菌を新たに見いだし、 目的とする アルデヒ ド側鎖を有する下記化合物 （ I ) に変換することに成功した。
(I)
Figure imgf000003_0002
(式中、 R1 、 R2 および R3 はそれぞれ前記と同じ意味）
化合物 （ I ) および （Π) のうち、 R1 、 R2 および R3 がそれぞれ水素であ る化合物はそれぞれ FR900482および FR066979と命名されている。 これらの化合物 は微生物ス ト レプト ミセス ' サンダェンシス （Streptomyces sandaensis) No. 6897 (FERM BP— 792) によって産生され、 例えば特開昭 61— 10590号公報の実施 例 1および 8においてそれぞれ開示された、 抗腫瘍活性等を有する公知の物質で ある。 また FR066979は特開平 1一 101893号公報に開示された方法によっても生産 することができる。
FR900482および FR066979が本願発明の目的化合物および原料化合物として最も 好ましいものである。
また、 化合物 （ I ) のうち、 R1 、 R2 および R3 がそれぞれァセチル基であ る化合物は FR066973と命名され、 また、 R1 および R2 がそれぞれ水素であり、 R 3 がァセチル基である化合物は FR66980と命名され、 さらに R1 がメチル基で あり、 R2 および R3 がそれぞれァセチルである化合物は FR073317と命名され、 特開昭 61— 10590号公報の実施例 3、 実施例 4 (および 6 ) および実施例 51にそ れぞれ記載されている。
尚、 化合物 （ I ) および （Π) はその化学構造中に不斉炭素原子を有している が、 この不斉炭素に基づく異性体もこの発明の化合物 （ I ) および （II) に含ま れるものとする。 上記式 （ I ) および （II) における定義の具体例およびそれらの好ましい実施 態様を以下に述べる。
特に指示のない限り、 この明細書に使用される 「低級」 なる語は、 1 ~ 6個の 炭素原子を意味するものとする。
好適な 「低級アルカノィル基」 としては、 例えば、 ホルミル、 ァセチル、 プロ ピオニル、 ブチリル、 イソブチリノレ、 パレリル、 イソバレリノレ、 ピノくロイル、 へ キサノィル等の炭素数 1〜 6個を有するアルカノィル基等が挙げられ、 より好ま しくは d 〜C4 アルカノィル基が、 特に好ましくはァセチル基が挙げられる。 好適な 「低級アルキル基」 としては、 例えばメチル、 ェチル、 プロピル、 イソ プロピル、 ブチル、 イソブチル、 第三級ブチル、 ペンチル、 へキシル等の炭素数 1 ~ 6個を有するアルキル基が挙げられ、 より好ましくは d 〜 C 4 アルキル基 が、 特に好ましくはメチル基が挙げられる。 この方法の特徴を以下に説明する。
まず本発明の微生物について説明する。
Fusa ri um sp. No. 122株 （F— 122株） ：
No. 122株の特徴
化合物 （II ) を化合物 （ I ) に変換する能力を有する微生物 Fusarium. sp. No. 122株と名付けた菌株 （以下、 No. 122株と咯称する） は、 鹿児島県屋久島で採取 された土壌試料から新しく分離されたものである。 以下に No. 122株の特徴を示 す。
糸状菌 No. 122株は鹿児島県屋久島で採集した土壌試料から分離された。 この微 生物は各種培地上で広く拡大的に生育し、 白から黄味白の色調のコロニーをつく る。 各種の培地上で No. 122株はテレオモルフを形成しなかったが、 菌糸に側生す る分生子形成細胞と大小二種類の分生子、 即ち船形の大型分生子と長楕円形の 小型分生子によるアナモルフを生じた。 分生子形成様式はフィァ口型であった。 No. 122株の菌学的性質を以下に示す。
種々の寒天培地上における培養的性質を表 1に要約した。 ポテトデキストロー ス寒天上では広く拡大的に生育し、 25°Cで 2週間培養後において直径 8. Ocm以上 の大きさまで拡がった。 コロニーの表面は盛り上がり、 羊毛状、 白から黄味白の 色調を示した。 分生子のうち小型分生子を豊富に、 大型分生子を少量形成した。 裏面は黄味白であった。 コーンミール寒天上での集落はポテトデキストロース寒 天上と同様の速度で生育し、 同一条件下で直径 8. 0cm以上に拡がった。 集落表面 は盛り上がり、 フェルト状または羊毛状、 色調は白色である。 分生子、 特に小型 分生子が豊富に形成された。 裏面は白から黄味白であった。
形態的特徴は、 大型分生子の形成が良好な胞子形成培地 （培地組成：グリセ リ ン l g ;硝酸ナ ト リウム 0. 5 g ； リ ン酸一力.リウム 0. 2 g ;酵母エキス O. l g ；寒天 15 g ；蒸留水 1 L ) 上での培養をもとに観察した。 No. 122株の 分生子柄は栄養菌糸との区別が不明瞭であり、 気中菌糸や栄養菌糸の短い分枝と して分生子形成細胞 （フィアライ ド） が直接側生する。 また、 栄養菌糸が分生子 座様に密集し、 その内部または上部にフィアライ ドが生ずる場合もある。 フィァ ライ ドは無色、 滑面、 円筒形からとつく り形で、 大きさは 8—17 (-20) X 2— 3 m、 先端から大小二種類の分生子を連続して形成する。 大型分生子は無色、 滑面で、 2— 4 (- 6 ) 細胞、 船形または三日月形からソーセージ形で、 両端が やや湾曲して尖り、 大きさは 25— 35 (-42) X 3.5-4.5 (—5.5) i mである。 ま た、 小型分生子は無色、 滑面で、 1 (一 2 ) 細胞、 やや湾曲した長楕円形で、 大 きさは 6— 16 (-20) x2.5— 4 imである。 栄養菌糸は滑面、 隔壁を持ち、 無色 で分枝する。 菌糸細胞は円筒形、 幅 2— 3.5tzmである。 厚膜胞子は形成されな い。 サブ口一デキス トロース寒天上などの培養では黒色、 球形の菌核が形成され ること力 ^ある。
No.122株は 2ないし 31°Cで生育可能で、 生育最適温度は 21ないし 25°Cである。 これらのデータはポテトデキストロース寒天 （二ッスィ製） 上で決定した。 以上の No.122株の特徵をバロン（G. R. Barron: The Genera of Hyphomycetes from Soil. pp. 239— 241， Wi 11 iams & Wi lkins, Bal timore, 1968)、 フォン ' ァ ークス (J. A. von Arx: The Genera of Fungi. Sporulating in Pure Culture, pp. 180- 184, J. Cramer, Vaduz, 1974) 、 ドムシュら （K. H. Domsch, . Gams & T.— H. Anderson: Compendium of Soil Fungi, pp. 517— 524, Academic Press, London, 1980) などの菌類分類書と比較した結果、 フザリウム属
(Fusarium Link 1809) の記載と一致したため、 No.122株はフザリウム属に所属 するー菌株と考えられた。 従って、 本菌株をフザリウム · エスピー · No.122株
(Fusarium sp. No.122) と称した。 本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究 所に寄託番号 FERM P— 15763 (受託日 ： 1996年 8月 2日） として寄託され、 さら にこの寄託物は寄託番号 FERM BP— 6156 (受託日 ： 1997年 10月 23日） としてブダ ぺス ト条約に基づく寄託へ移管された。 表 1. No.122株の培養的性質
培 地 培養的性質
麦芽抽出寒天 * 生育：広く拡大的、 直径 8.0cm以上
表面：円形、 平坦で、 フ ルト状から綿毛状、 豊富に分生子を形成し、 黄味白（4A2) 裏面：黄味白（3A2)から薄い黄（3A3)
ポテトデキス トロ一ス 生育：広く拡大的、 直径 8.0cm以上
寒天 （Difco 0013) 表面：円形、 盛り上がり、 羊毛状、 豊富に分
生子を形成する。 白（1A1)から黄味白
(4A2)
裏面：黄味白（4A2)
ッァペック氏液寒天 * 生育：広く拡大的、 直径 8. Ocra以上
表面：円形、 凸円状から隆起状、 綿毛状から
羊毛状、 豊富に分生子を形成し、 白
(1A1)から黄味白（4A2)
裏面：薄い黄 (4A3)から明るい黄（4A4)
サブローデキス ト口ース 生育：広く拡大的、 直径 8.0cm以上
寒天 (Difco 0190) 表面：円形、 平坦または隆起し、 フュルト状
から綿毛状で、 鈹を生じる、 分生子を 豊富に形成し、 橙味白（6A2)から薄い 橙 (6A3)
裏面：灰味橙（5B5- 5B6)
Emerson Yp Ss 寒天 生育：広く拡大的、 直径 8.0cm以上
(Difco 0739) 表面：円形、 凸円状から隆起状、 綿毛状から
羊毛状で、 桃色の浸出液を生ずる、 分 生子を豊富に形成し、 白（1A1)から黄 味白（4A2-3A2)
裏面：黄味白（3A2)
コーンミール寒天 生育：広く拡大的、 直径 8.0cm以上
(Difco 0386) 表面：円形、 盛り上がり、 フェルト状または
羊毛状、 分生子を豊富に形成し、 白
(1A1)
裏面：白（1A1)から黄味白（3A2)
MY20 寒天 * 生育：広く拡大的、 直径 8.0cm以上
表面：円形、 盛り上がり、 フェルト状、 分生
子を豊富に形成し、 黄味白（4A2)から 橙味白（5A2)
裏面：灰味橙（4B5-4B6)
* ：麦芽抽出寒天、 ッァペック氏液寒天、 MY20寒天の組成は、 JCMカタログ (Nakase, T. , 5th ed. , 503ρ. , Japan し ollection of Microorganisms and Life Science Research Information Section of the Institute of Physical and Chemical Research, Sai tama, 1992) に従った。
これらのデータは接種後 25°Cで 14日間培養後に観察した。 色調の記載は Methuen Handbook of Colour (Kornerup, A. and J. H. Wanscher, 3rd ed. , 525pp. , Methuen, London, 1978) をもとに行った。
Fusarium sp. No.104株 （F—104株） ：
生産菌 F - 104株の特徴
糸状菌 F— 104株は当出願人保有株である。 この微生物は各種培地上で広く拡 大的に生育し、 綿毛状から羊毛状で、 白から赤味白の色調の集落を形成した。 この菌株はいくつかの培地上でアナモルフを形成したが、 テレオモルフは生じな かった。 アナモルフはフィァ口型の分生子構造からなり、 わずかに分枝した分生 子柄から、 2種類の分生子 （ 2 ~ 5細胞で縑形の大型分生子と 1 ~ 2細胞で洋な し形の小型分生子） を生じた。 この形態的特徴から、 フォン ·アークス （J. A. von Arx: The Genera of Fungi. Sporulating in Pure Culture. 3rd ed. , pp. 145- 163, J. Cramer, Vaduz, 1974) による菌類分類書を検索した結果、 F— 10 4株は不完全糸状菌類のフザリウム属 （Fusarium Link 1809) に所属すると思わ れた。 以下に F - 104株の菌学的特徴を示す。
各種寒天培地上の培養性状を表 2に要約した。 ポテトデキストロース寒天上の 培養は広く拡大的で、 25で、 2週間後に直径 6.0— 6.5cmにまで拡がり、 円形のコ ロニ一を作った。 コロニー表面は隆起し、 綿毛状から羊毛状であった。 集落の色 調は白から赤味白で、 周縁部は灰味赤であった。 集落裏面は茶味紫から紫味茶 で、 周縁部は挑味灰から鈍い赤を示した。 この培地上では、 分生子構造は形成し なかった。 コーンミール寒天培地上での集落はさらに速やかで、 同一条件下で直 径 9.0cm以上に広がり、 シャーレ壁面にまで達した。 集落は円形に広がり、 表面 は平坦で薄く、 粉状、 色調は桃味白から桃で、 周縁部は白から挑味白であった。 栄養菌糸は培地中に埋没して伸長し、 少量の分生子構造と厚膜胞子が観察され た。 集落裏面は表面と同色であった。
形態的特徴は三浦 'ェ藤 （Miura. K. and M. Kudo: Trans. Mycol. So Japan, 11: 116—118， 1970) による LCA培地上での培養を元に決定した。 大型分 生子 ·小型分生子は、 分生子柄上に形成されたフィアラィ ドから生じた。 分生子 柄は無色、 滑面で隔壁を持ち、 比較的単純で、 数回分枝し、 分生子形成細胞 （フ ィァライ ド） を短い分枝として形成した。 フィアライ ドは無色、 滑面で、 円筒形 で先端部はやや細くなり、 10— 20X 3— 5 mの大きさである。 分生子は、 フィ ァライ ドの先端部から求心的に内生出芽して粘球をつくる。 大型分生子は無色、 滑面、 2— 4 (— 5 ) 細胞で、 両端または先端が顕著に湾曲し、 鎌形から舟形、 基部には脚胞を持つことがあり、 （15—） 23— 34 (—43) x 3— 4.5 (— 5 ) の大きさであった。 また、 しばしば大きさが （ 5—） 10— 15x2.5— 3.5 ^で、 円筒形かやや湾曲した舟形の分生子が混在した。 それらは、 無色、 滑面、 1細胞 で、 まれに隔壁を持つ 2細胞のものが観察された。 小型分生子は無色、 滑面で、
1 (- 2 ) 細胞、 洋なし形から楕円形で、 先端は丸みを帯びるが、 やや尖がり気 味の場合もあり、 9— 13.5 (— 18) X4.5- 5 (— 7 ) μ mの大きさであった。 栄 養菌糸は滑面、 隔壁を持ち、 無色で、 分枝した。 菌糸細胞は円筒形で、 幅 2— 6 mであった。 また、 コーンミール寒天上では亜球形から楕円形の厚膜胞子が菌 糸間に観察され、 その大きさは直径 5 - 10 mであった。
F一 104株は 2から 32°Cの範囲で生育可能で、 最適生育温度は 21から 24°Cで あった。 こ らの生育温度に関するデータはポテトデキストロース寒天培地 （日 水製薬） 上で決定した。 以上の菌学的特徴を、 ブース （C. Booth: The Genus Fusarium, pp. 237, Commonwealth Mycological Institute, ew, 1971) によるフザリウム厲の分類 基準、 およびドムシュら （ H. Domsch, W. Gams & T. -H. Anderson:
Compendium of Soil Fungi, pp. 303— 341, Academic Press, London, 1980) の 分類書の記載と比較したところ、 主に集落の色調、 生育の速度、 フィアライ ドの 特徴、 大型分生子および小型分生子の形態などから、 F— 104株はフザリウム♦ ト リキンクツム · コルダ ·サッカード（Fusarium tricinctum (Corda) Sacc. 188 6. )に所属すると思われた。 従って我々は、 この菌株をフザリウム . トリキンク ツムのー菌株として同定し、 フザリゥム · トリキンクツム · No.104 (Fusarium tricinctum No.104) と称した。 本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に 寄託番号 FERM BP— 6155 (受託日平成 9年 10月 23日） として寄託されている。 表 2 . No. 104株の培養性状
培 地 培養性状
麦芽抽出寒天 * やや抑制的、 円形、 直径 3. 0-3. 5cm
平坦で、 菌糸は埋没し、 湿潤して光沢を持つ、 アナモルフは形成しない、 灰味黄（4B4-4B5)か 生表生裏表生表裏生表 ら灰味橙（5B4-5B5)、 周縁部は茶味橙（5C6) 面面面育育面面育面育 灰味橙（5B4)から茶味橙（5C4)
ポテトデキスト 広く拡大的、 円形、 直径 6. 0-6. 5cm
ロース寒天 隆起し、 綿毛状から羊毛状で、 アナモルフは (Di f co 0013 ) 形成しない、 白から赤味白（9A2)、 周縁部は 灰味赤（8C5-9C5)
表面 茶味紫（11D7-11D8)から紫味茶（10E6-10F6)、 周縁部は祧味灰（10B2)から鈍い赤（10C3) ッァペック氏 生育 広く拡大的、 円形、 直径 7. 0-8. 0cm
液寒天 * 隆起し、 綿毛状から羊毛状、 アナモルフは形 成しない、 白から黄味白（4A2)、 周縁部は灰 味薔薇（11B4-11B5)から挑味白（10A2-11A2) 表 ¾ 中心部は薄い黄（4A3)から灰味黄（4B3)、 周縁 部は灰味薔薇（12B6)から灰味紅（12C6) サブローデキス ト 生育 広く拡大的、 円形、 直径 5. 0-6. 0cm
ロース寒天 表面 隆起状から頭状で、 綿毛状、 アナモルフは形 (Di f co 0190 ) 成しない、 白
表 放射状の溝を生じ、 灰味橙（5B4)、 周縁部は 明るい茶 (6D6)
Eme rson YpSs寒天 広く拡大的、 円形、 直径 7. 0-8. 0cm
(Di f co 0739 ) 隆起し、 綿毛状から羊毛状、 アナモルフを
形成する、 白から黄味白（4A2)、 周縁部は挑 味白（10A2)
黄味白（3A2-4A2)、 周縁部はパステル赤（10A4) から鈍い赤（10B4)
コーンミール寒天 広く拡大的、 円形、 直径 9. 0cra以上
(Di f co 0386) 平坦、 薄く、 菌糸は埋没し、 少量のアナモル フと厚膜胞子を形成する、 挑味白（11A2)から 挑（11A5)、 周緣部は白から桃味白（9A2) 表囬 表面と同じ色調 20寒天* 生育：広く拡大的、 円形、 直径 6.0-7.0cm
表面：平坦で、 フヱルト状、 放射状の溝を生じ、 ァ
ナモルフは形成しない、 白、 周縁部は薄い黄 (4A3)
裏面：赤味黄（4A6)から灰味黄（4B6)、 周縁部は茶味
黄（5C7)から明るい茶（5D6)
オートミール寒天 生育：広く拡大的、 円形、 直径 8.0-9.0cm
(Difco 0552) 表面：隆起し、 綿毛状から羊毛状、 無色の浸出液を
生じ、 アナモルフは形成しない、 灰味橙（6B3) から橙味灰（5B2 )および黄味白（3A2-4A2 )
* ： 羑芽抽出寒天、 ッァペック氏液寒天、 MY20寒天の組成は、 JCMカタログ (Nakase, T. , 5th ed. , 503ρ. , Japan Col lection of Microorganisms and Life Science Research Information Section of the Institute of Physical and Chemical Research, Sai tama, 1992) に従った。
これらのデータは接種後 25°Cで 14日間培養後に観察した。 色調の記載は Methuen Handbook of し olour (Kornerup, A. and J. H. Wanscher, 3rd ed. , 525p. , Methuen, London, 1978) をもとに行った。
化合物 （ I ) の生産はこの明細書に記載の、 例示のみの目的で示した特定の微 生物を使用することに限られない。 つまり本発明は、 自然突然変異菌並びに X線 照射、 紫外線照射、 N—メチルー N， 一二トロー N—ニトロソグァ二ジン、 2— ァミノプリン等処理といった常法により前記微生物から生産することができる人 ェ突然変異菌をも含む、 化合物 （II) を化合物 （ I ) に変換することができるあ らゆる突然変異菌の使用をも包含している。
フザリウ厶 ♦ エスピー · ^.122株ぁるぃは^.104株以外の？1^900482物質の生産 菌としては、 例えば以下の菌が挙げられる。 本出願人が保有するフザリゥム属の菌株：
Fusarium camptoceras ( F—0500)
Fusarium equi seti ( F—0499) Fusariura graminearum ( F― 0497)
Fusarium oxysporum f . sp. lycopersici ( F—0091)
Fusarium oxysporum f . sp. lini ( F -0092)
Fusarium oxysporum f . sp. lini ( F -0094)
Fusarium oxysporum ( F—0097)
Fusarium oxysporum f . sp. narcissi ( F—0105)
Fusarium poae ( F—0502)
Fusarium sambucinum ( F― 0498)
Fusarium solani var. coeruleum ( F—0496)
Fusarium sp. F3-1 ( F -0183)
Fusarium sporotrichioides ( F—0503)
(財） 発酵研究所が保有するフザリウム属の菌株：
Fusarium oxysporum IFO-5942
Fusarium anguioides IF0 4467
Gibberel la zeae (F. graminearum) IF0 9462
Fusariura pal 1 idoroseum IF0 30926
Fusarium roseum IF0 30966
Fusarium equiseti IF0 31095
Fusarium chlamydosporum IF0 31096 次にこの発明について以下に詳しく説明する。
Figure imgf000012_0001
(式中、 R1 、 R2 および R3 はそれぞれ前記と同じ意味） この発明の微生物の産生するォキシダ一ゼは上記式 （π ) で示される化合物 のアルコール側鎖を酸化して下記構造式 （ I ) で示される化合物 （特開昭 61— 10590号公報にて既知） を生成させる。 この際、 該ォキシダーゼは必ずしも純粋 に単離しなくてもよ く、 生産菌株を化合物 （II ) とともに培養する、 またはこの 発明の微生物の培養液あるいは 過菌体あるいは培養物から菌体を除いた 液な どの該ォキシダ一ゼの粗製物を代わりに用いても目的化合物 （ I ) を得ることが できる。
(I)
Figure imgf000013_0001
(式中、 R 1 、 R 2 および R 3 はそれぞれ前記と同じ意味）
この発明のォキシダ一ゼとして使用される培養液あるいは 過菌体、 または培 養物から菌体を除いた浐液は、 Fusarium. sp. No. 122や No. 104等のフザリウ厶属 に属する菌株を培地中で培養することにより得られる。
一般的には、 この新規微生物は同化しうる炭素源および窒素源を含有する水性 培地中で好ましくは、 たとえば振とう培養、 深部培養等の好気性条件下で培養す ることにより産生できる。
培地の好ましい炭素源としては、 グルコース、 マルトース、 シユークロース、 フラタ ト一ス、 ガラク ト一ス、 マンニトール、 グリセリン、 スターチ等のような 炭水化物が挙げられる。
好ましい窒素源としては大豆粉、 綿実粕、 小麦胚芽、 グルテンミール、 コーン スティープパウダー、 落花生粉、 亜麻仁油粕等の有機窒素化合物ならびに硝酸ァ ンモニゥム、 硫酸アンモニゥム等の無機窒素化合物が挙げられる。
炭素源および窒素源は都合良く組み合わせて使用するが、 純品を使用する必要 はなく、 相当量の無機栄養素を含有していれば純度の劣る物質も使用できる。 望むならば、 燐酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸鉄、 硫 酸コバルト等の無機塩を添加しても良い。 特に培養培地が著しく発泡する場合に は必要により液体パラフィン、 脂肪酸、 植物油、 鉱油またはシリコンの様な消泡 剤を添加しても良い。
この微生物を大量に培養する条件としては、 深部好気培養が好ましい。 少量生 産にはフラスコまたはびん中で振とう培養または表面培養が行われる。 さらにま た、 大型タンク内で生育をさせる場合には、 生育を促進する為に微生物の前培養 を用いて生産タンク中に菌を接種するのが好ましい。 すなわち、 比較的少量の培 養培地に微生物の分生子または菌糸を接種し、 その接種培地を培養して微生物の 前培養接種物をまず生産し、 次いで培養した前培養接種物を無菌的に大型タンク に移すのが望ましい。 この前培養接種物を生産する培地は、 大型タンクで使用す る培地と実質的に同じであってもよく、 また異なってもよい。
培養混合物の撹拌および通気は種々の方法で行うことができる。 撹拌はプロべ ラまたはこれに準ずる撹拌装置を用いるか、 発酵器を回転させるかまたは振とう するか、 種々のポンプ装置を用いるか、 または培地中に滅菌空気を通すことによ つても行う事ができる。 通気は滅菌空気を発酵混合物中を通過させることにより 行ってもよい。
発酵は通常、 約 20°C ~ 32°Cの温度範囲、 好ましくは 25°C〜30°Cで pHは 6〜 8が 好ましく、 約 72〜200時間行われるが、 発酵条件および規模によって適宜変化さ せればよい。
基質である FR066979は培養開始時あるいは適当な時期に水溶液として添加すれ ばよく、 純度の低い発酵浐液でもよい。
このようにして変換された FR900482は、 他の既知の生物学的活性物質の回収に 通常使用される慣用の方法で培養培地から回収することができる。 変換された FR900482は培養 液中に存在し、 培養ブロスの 過または遠心分離の後、 吸着樹 脂等の常用の樹脂による処理、 結晶化等の慣用の方法によって分離、 精製するこ とができる。 実施例
実施例 1
綿実粕 1 %、 大豆粉 1 %、 硝酸アンモニゥム 0.1%、 燐酸二水素カリウム 0.1 %、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.05%、 塩化ナト リウム 0.1%、 硫酸第二鉄 7水 和物 0.001%の組成からなる種培地 100mlを含む 500ml三角フラスコを 121°Cで 20分 間滅菌し、 Fusarium. sp. No.122株の斜面寒天培養の 1 ~ 2白金耳を接種し、 25 でで 2 日間振とう培養して種培養とした。
次いでマルトース 1水和物 5 %、 大豆粉 2%、 燐酸二水素カリウム 0.1%、 硫 酸マグネシウム 7水和物 0.05%の組成からなる生産培地を pH6.0に調整し、 この 生産培地 10mlを含む lOOml三角フラスコを 121°Cで 20分間滅菌し、 これに前記種培 養を 0.5d接種して、 30°Cで 3日間振とう培養した。 さらに FR066979 10mg/ml水 溶液を 0.3ml添加し、 さらに 3日間振とう培養し FR900482への変換を行った。 次いで培養液を Np.2浐紙で浐過し、 高速液体クロマトグラフィ一（HPLC)を使用 し UV検出器 （波長 215nm) で FR900482の生成をモニタ一することにより FR900482 の生成量を求めた。
実施例 2
綿実粕 1 %、 大豆粉 1 %、 硝酸アンモニゥム 0.1%、 燐酸二水素カリウム 0.1 %、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.05%、 塩化ナト リウム 0.1%、 硫酸第二鉄 7水 和物 0.001%の組成からなる種培地 100mlを含む 500ml三角フラスコを 121°Cで 20分 間滅菌し、 Fusarium. sp. No.122株の斜面寒天培養の 1 ~ 2白金耳を接種し、 25 でで 2 日間振とう培養して種培養とした。
次いでマルト一ス 1水和物 5%、 大豆粉 2%、 燐酸二水素カリウム 0.1%、 硫 酸マグネシウム 7水和物 0.05%の組成からなる生産培地を pH6.0に調整し、 この 生産培地 10mlを含む 100ml三角フラスコを 121°Cで 20分間滅菌し、 これに前記種培 養を 0.5ml接種して、 さらに FR066979 lOmgZml水溶液を 0.3ml添加し、 8日間振 とう培養し FR900482への変換を行った。
次いで培養液を No. 2浐紙で浐過し、 高速液体クロマトグラフィー （HPLC) を使用し UV検出器 （波長 215nm) で FR900482の生成をモニタ一することにより FR900482の生成量を求めた。 No.122株による FR066979から FR900482への変換
1. 培養条件
種培養 培地組成 ファーマメディア 1 %、 大豆粉 1 %、 NHHN03 0.1%、
KH2P04 0.1%、 MgS04-7H20 0.05%、 NaCl 0.1%、 FeS04'7H20 0.001% pH6.0 市水使用 121°C、 20分間ォートクレーブ滅菌
培養条件 500ml容三角フラスコに上記培地 100ml仕込 一白金耳 植え付け 25°C、 2日間、 260rpm、 2 inch stroak 本培養 培地組成 マルト一ス · 1H20 5%、 大豆粉 2%、 KH2P04 0.1%、
MgS04-7H20 0.05%
PH6.0修正 市水使用 121°C、 20分間ォ一トクレーブ 滅菌
培養条件 100ml容三角フラスコに上記培地 10ml仕込 種培養 5 % volume 植菌 30°C、 〜 8日間、 260rpm、 2 inch stroke
基質 FR066979 lOmgZml溶液 （浐過滅菌）
基質添加方法は上記培養開始時に終濃度 300 gZralとなるようピぺッ トを用い て添加した。
2. FR066979, FR900482の HPLCによる分離定量
カラム ： Mightysi I RP-18 75-4.6 ( 5 μ m) 関東化学 Κ· Κ.
移動相： 7.2mM SDS水溶液 （700) ： ァセトニト リル （300) リ ン酸 （ 1 ) 検 出 ： U.V.215nm
流 速 '· 1. Oml/min
3. 検討項目
1 ) 炭素源種類、 濃度
2 ) 有機窒素源種類
3 ) 培地 pH
4 ) 培養液量
5 ) 培養温度 6 ) FR066979添加量
7 ) 経過
4. 結果
4 - 1. 炭素源種類、 濃度の影響
10種類の炭素源について検討を行った。 その結果、 マルト一ス、 マンニトール を炭素源として用いた時、 変換量の顕著な増加が認められた。 （表 3 ) 。
表 3. 各種炭素源の影響 gZml
6th 8th
C source 482*) 979**) 482 979
Glucose 45 215 87 166
Sucrose 47 244 81 196
Soluble starch 34 214 45 178
Glycerol 73 181 91 142
Galactose 41 210 73 159
Mai tose 102 146 161 40
Dext rin 47 222 75 186
Sorbose 4 110 7 106
Manni tol 101 157 164 105
Fructose 26 183 50 160
*) 482： FR900482、 **) 979： FR066979
次いでマルトースについて濃度の影響をみた。 その結果、 5%濃度において最 も高い変換を示した （表 4 ) 。
表 4. Mai tose濃度の影響 μ g/tnl
6th 8th
Mai tose %
482 979 482 979
0 14 215 16 203
2.5 93 125 88 102
5 67 188 105 113
7.5 62 198 91 160
10 27 231 42 208 4 - 2. 有機窒素源種類の影響
12種類の有機窒素源について検討を行った。 その結果、 大豆粉、 乾燥酵母、 脱 脂小麦胚芽、 脱脂大豆粉を用いた時、 比較的高い変換を示した （表 5 ) 。
表 5 . 有機窒素源の影響 μ g/ml
6th 8th
N source
482 979 482 979 添カ卩 17 235 30 214 大豆粉 103 128 136 97 ファ一マメディァ 79 163 72 146 コーンスチィ一プリ力一 0 178 0 154 コーンスチイ一プパウダー 15 188 21 178 乾燥酵母 79 146 105 95 ポテトプロティン 30 215 49 131 脱脂小麦胚芽 59 195 161 59 小麦胚芽 30 233 76 169 グルテンミ一ル 20 244 61 171 脱脂大豆粉 93 121 112 75 落花生粉 62 198 87 180 アマ二油粕 101 115 63 130
4 - 3 . 培地初発 pHの影響 （表 6 ) 表 6 . PHの影響 μ g/ ml
6th 8th
H
482 979 482 979
5 70 202 103 158
5. 5 80 186 122 124
6 59 192 85 158
6. 5 60 193 76 167
7 52 198 77 159
7. 5 47 184 75 136
8 46 168 62 129 4 - 4. 培養液量の影響 （表 7 )
表 7. 培養液量の影響 /"g/ml
6th 8th
仕込み液量 ml
482 979 482 979
10 100 151 125 109
15 58 184 100 135
20. 56 189 75 166
25 30 206 48 175
30 39 210 52 183
4 - 5. 培養温度の影響 （表 8 )
表 8. 培養温度の影響
Figure imgf000020_0001
6th 8th
mix.
482 979 482 979
25 51 143
30 60 143 Not Tested
32 109 61
35 0 303
4一 6. FR066979添加濃度の影響 （表 9 )
表 9. FR066979添加濃度の影響 β g/ml
Figure imgf000020_0002
4一 7. 経過
25°Cおよび 30°Cの培養条件における FR066979から FR900482への変換の経過を調 ベた。 その結果、 8日間の培養によって約 40—50%の1¾066979が 1^900482へと変 換された （表 10 )
表 10. 経過 " g/m l
25°C 30°C
I I ΙΠ6 Q J
979 979
0 0 262 0 262
l 0 255 0 263
2 0 260 0 259
3 19 245 13 244
4 44 212 48 206
5 67 183 82 161
6 68 174 110 112
7 92 135 124 76
8 108 114 130 56 実施例 3
特開平 1 — 101893の方法に準じて培養した S t reptomyces sandaens i s No. 6897 の培養液 10 を 過し、 水で菌体洗浄後 液 ιο を得た。 液中には FR900482と
FR066979が合計約 1 tng/mlの濃度で存在する。
浐液を 5 の SEPABEADS SP850, SEPABEADS SP207等の合成吸着樹脂に供した。 樹脂を水洗しタンパク質、 アミノ酸や塩類を除去後、 20 の 50%メタノール水で FR900482および FR066979を溶出した。
このメタノール水活性区を 1. 5 まで濃縮し、 Fusari um sp. No. 122培養液 10 £ に添加し、 FR066979から FR900482への反応を行った。 FR066979が検出限界以下と なった時点 （約 15時間） で反応を終了した。 FR900482の濃度は約 730 /i gZmlで あった。
反応液を 過し、 '俨液 11 ·^を得、 DIAION HP20 吸着樹脂 2 に供した。 10%メ タノ一ル水でタンパク質、 アミノ酸や塩類を洗浄した後、 0. 05N硫酸 20 £で溶出 した。 FR900482の濃度は 370 g/mlであった。
この活性区を 10 ^まで濃縮し、 DI AION HP1MG吸着樹脂 5 £に供した。 40 の水 で洗浄後、 50%メタノール水 15 で FR900482を溶出した。
活性区を 8 Iまで濃縮し 6 Nの NaOHで pHを 7に調整後、 醉酸ェチルを 8 iおよ び撹拌下において無水酢酸 12mlを加え、 30分間室温で反応を行った。 残存する FR900482が検出されなくなった時点で反応を終了し、 生成してきた FR066980は酢 酸ェチル層に抽出された。
この酢酸ェチル層を 75mlまで濃縮し、 ピリジン 75mlおよび無水酢酸 16mlを加 え、 40°Cで 15時間撹拌下で FR066980から FR066973への反応を行った。 FR066973へ の反応率が 95%以上であることを確認後、 6 N塩酸で pHを 3にして反応を終了し た。 水を 500ml添加し、 酸性下でピリジンを水層に転溶し分液除去した。 さらに 10%重曹想濁液を 500ml加え、 未反応の無水醉酸ゃ酢酸を水層に転溶除去した。 その結果、 酢酸ェチル層に約 6 gの FR066973が生成していた。
得られた酢酸ェチル活性区 75mlに活性炭 6 gを加え脱色浐過後、 375mlの ri— へキサンを加えた。 この活性区を 5 mlのシリカゲル YMC— GEL (YMC CO. , LTD. ) 力 ラムに吸着させた後、 酢酸ェチル： n—へキサン （ 5 : 1 ) 25mlで溶出した。 溶出区を濃縮乾固したのち、 80mlのアセトンに溶解後、 室温、 撹拌下で n—^ « キサンを 120ml添加し、 約 2時間放置後 5 gの FR066973結晶を得た。
この FR066973 5 gを特開昭 61— 10590に記載の方法に則り合成を行い、 l g の FR073317を取得した。
FR066973, FR073317の HPLC測定
HPLCは波長可変 UV検出器 （島津 SPD - 10A) およびポンプ （島津 LC— 10AD) お よびインテグレ一タ （島津 C一 R6A) で構成し、 固定相には TSKgel ODS 80TM(4.6 mm 150mm i.d. 粒径 5 111) を使用し、 ァセトニト リル/ 0.1M過塩素酸塩緩衝 液 （PH3.0) = 1 ： 3からなる移動相によって 1.4mlZ分の流速で FR066973、 FR 073317を溶離させた。 UVは 220nmで検出した。 FR066973の保持時間は約 5.1分、 FR073317は約 4.7分であった。
実施例 4
( 1 ) 菌株 スクリーニングに用いた以下の 8菌株は、 全て （財） 発酵研究所
(IF0) より入手した。
Fusarium anguioides IFO 4467
Gibberel la zeae (F. graminearum) IFO 9462
Fusarium pal 1 idoroseum IFO 30926 Fusarium roseum IFO 30966
Fusarium equiseti IFO 31095
Fusarium chlamydosporum IFO 31096
また、 F. tricinctum ( F -104) (Fusarium. sp. No.104) は工業技術院生命ェ 学工業技術研究所に寄託されている。
( 2 ) 培地培養条件 種培養 本培養
培地組成 ファーマメディア 1 1 マルト ス 1水和物 5 1
脱脂大豆粉 1 % 脱脂大豆粉 2 1
NH4N03 0.1% KH2P04 0. U
KH2P04 0.1% MgS04 -7H20 0.5% gS0, -7H20 0.05%
PH 6
Figure imgf000023_0001
培養液量 100ml 10ml 培養容器 500ml容三角フラスコ 100ml容三 ：角フラスコ 植 菌 寒天培地より 10mm角植菌 種培養より^植菌 培養温度 25°C 25°C 培養日数 3曰 6~8日
( 3 ) スク リ一ニング方法
( 3 - 1 ) 予め 過滅菌した FR066979を 300 g/mlになるよう添加した本培養 培地に種培養液を植菌し、 25°Cで 8日間振とう培養した。 培養後、 15N H2S04 を 50 1添加し、 2800rpm、 10分間遠心して得た上清中の FR900482を HPLCにて測定 した。
( 3 — 2 ) 種培養液を、 本培養培地に植菌後、 25°Cで 3日間振とう培養した。 その後、 過滅菌した FR066979を 300^2/πι1になるよう添加し、 さらに 25°Cで 3 日間振とう培養した。 培養後は （ 1 ) と同様な方法で上清中の FR900482を HPLCで 測定した。 ( 4 ) 結果
表 11、 12の結果から、 FR066979のアルコール側鎖を酸化する酵素を有する菌は、
Fusarium属中に非常に高い確率で存在することがわかった。
表 11 培養開始時添加した FR066979からの FR900482の生成 （ 3— 1法による） 菌 株 FR900482 FR066979
Fusarium anguioides IFO 4467 147 6
Gibberel la zeae IFO 9462 121 29
Fusarium pal 1 idoroseum IFO 30926 97 69
Fusarium roseum IFO 30966 152 10
Fusarium equiseti IFO 31095 15 224
Fusarium chlamydosporum IFO 31096 19 0
Fusarium t ricinctum F-104 155 0 単位：；" gZml 表 12 培養途中添加した FR066979からの FR900482の生成 （ 3 - - 2法による） 株 FR900482 FR066979
Fusarium anguioides IFO 4467 163 15
Gibberel la zeae IFO 9462 — *
Fusarium pal 1 idoroseum IFO 30926 35 221
Fusarium roseum IFO 30966 196 6
Fusarium equiseti IFO 31095 0 298
Fusarium chlamydosporum IFO 31096 72 12
Fusarium tricinctum F-104 231 31 単位：； u g ΊηΙ — *:データ無し 以上に述べたように FR066979から高収率で FR900482を製造することが可能と なる。

Claims

請求の範囲
l . フザリウム属に属する菌株の培養液またはその 過菌体に、 一般式 （ii) ：
Figure imgf000025_0001
(式中、 R 1 は水素、 低級アルカノィル基または低級アルキル基、 R2 および 3 はそれぞれ水素または低級アルカノィル基を意味する）
で示される化合物を反応させることを特徴とする一般式 （ I ) ：
Figure imgf000025_0002
(式中、 R1 、 R2 および R3 はそれぞれ前記と同じ意味）
で示される化合物の製造法。
2. 一般式 （II) ：
Figure imgf000025_0003
(式中、 R1 は水素、 低級アルカノィル基または低級アルキル基、 R2および R3 はそれぞれ水素または低級アルカノィル基を意味する）
で示される化合物をフザリゥム厲に属する菌が産生するォキシダーゼと反応させ ることを特徴とする一般式 （ I ) ：
Figure imgf000026_0001
(式中、 R1 、 RZ および R3 はそれぞれ前記と同じ意味）
で示される化合物の製造法。
3. ォキシダーゼとしてフザリゥム属に属する菌の培養液あるいは沪過菌体を用 いることを特徴とする請求項 2に記載の製造法。
4. 化合物 （ II ) の R1 、 R2 および R3 がそれぞれ水素である FR066979を用 い、 化合物 （ I ) の R1 、 R2 および R3 がそれぞれ水素である FR900482を製造 する請求項 1または 2に記載の製造法。
5. フザリウム sp. No.122または No.104の生物学的純粋培養物。
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