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WO1998030077A1 - Semences bacterisees pretes a l'emploi et procede d'obtention - Google Patents

Semences bacterisees pretes a l'emploi et procede d'obtention Download PDF

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Publication number
WO1998030077A1
WO1998030077A1 PCT/FR1998/000041 FR9800041W WO9830077A1 WO 1998030077 A1 WO1998030077 A1 WO 1998030077A1 FR 9800041 W FR9800041 W FR 9800041W WO 9830077 A1 WO9830077 A1 WO 9830077A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bacteria
seeds
seed
polymer
agent
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/000041
Other languages
English (en)
Inventor
Bernard Digat
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) filed Critical Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Priority to AU58701/98A priority Critical patent/AU5870198A/en
Publication of WO1998030077A1 publication Critical patent/WO1998030077A1/fr

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting
    • A01C1/06—Coating or dressing seed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/27—Pseudomonas

Definitions

  • the present invention relates to ready-to-use bacteria seeds. It further relates to a process for obtaining such seeds.
  • the symbiotic bacteria of legumes of the genera Rhizobium and Bradyrhizobium fix nitrogen from the air and, by restoring it to plants, improve their growth.
  • certain non-symbiotic bacteria such as Pseudomonas fluorescens and Ps. Putida, avirulent mutants of Pseudomonas (such as Ps.solanacearum), Agrobacterium antagonists and A. tumefaciens, Bacillus, Azospirillum promote the growth of plants.
  • Plants in the broad sense such as seeds, tubers, bulbs, rhizomes and cuttings are favorable targets for bacteria because they represent individualized propagating material that can be effectively colonized by beneficial bacterial populations.
  • inoculants or bacterial inoculates by fixing the bacteria on supports such as particles of silica and silicates, sand, clay, peat, carbon. porous or salt minerals such as calcium sulphate, phosphate or carbonate (SMITH, 1992, Can.J. Microbiol. 38, 485-492).
  • the bacteria are mixed with an inert clay in powder form, and the mixture is allowed to dry.
  • an osmoprotective is added when the bacteria are mixed with the clay. Slow drying is then necessary.
  • the osmoprotective is produced by bacteria, which requires an even slower drying. This slowness in drying results in an imbibition of the seed, which reduces its germination power.
  • the subject of the present invention is therefore ready-to-use bactericidal seeds, coated with a biodegradable film-forming polymer, hydroretentant and adhering to the seed, said polymer comprising the bacteria and in addition at least one osmoprotective agent or increasing the intracellular osmotic pressure of the bacteria.
  • film coating should be understood in its usual sense of the art seeds, that is to say as signifying a thin layer, of thickness generally between approximately 10 and 100 ⁇ m preferably between 20 and 50 ⁇ m, deposited on the seed.
  • a “film-coated” seed the external shape is little modified compared to the original seed, which is not the case of so-called “coated” seeds, in which the coating layer containing the seed has a thickness greater than 1000 ⁇ m and changes the external shape of the seed, which then becomes approximately spherical.
  • the agent increasing the intracellular osmotic pressure of the bacteria is an amino acid, such as L-glutamic acid, L-proline, betaine, L-serine, or one of their salts or l 'one of their derivatives. It is preferably L-glutamic acid.
  • This agent can be used alone or in admixture with other aforementioned agents having the same function.
  • the bacteria likely to be included in the film coating are advantageously bacteria producing beneficial effects on the seedlings, or on their environment, and in particular the symbiotic or non-symbiotic bacteria mentioned above, such as bacteria of the genera Rhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus and Azospirillum. These bacteria can have various effects on plants and their environment. They can fix nitrogen in the air, protect plants from fungal and bacterial parasites, or even secrete insecticidal toxins.
  • the polymer forming the film is advantageously a biodegradable film-forming polymer. It can in particular be a chitosan, an alginate, a cellulose or one of their derivatives. It is chosen according to the type of exopolysaccharide (EPS) of the bacteria that one wishes to use.
  • EPS exopolysaccharide
  • a cationic biopolymer such as chitosan or better chitosan-glutamate sterilized by gamma rays is chosen.
  • the latter polymer alone forms a microcapsule visible under the electron microscope around the bacterial cells and quickly gives bacteria the ability to better resist dehydration. It contains excess glutamate ions in the form of salts (sodium, potassium, magnesium) which accumulate very quickly in bacterial cells.
  • salts sodium, potassium, magnesium
  • an anionic biopolymer is preferably chosen, such as a soluble alginate salt to which is added L-glutamic acid or one of its salts or another amino acid (L-proline, betaine, L- serine) or one of its salts.
  • L-proline, betaine, L- serine another amino acid
  • Bradyrhizobium it is also possible to choose a cellulose or one of its derivatives to which is added L-glutamic acid or one of its salts or another amino acid (L-proline, betaine, L-serine) or one of the salts of these acids.
  • L-proline, betaine, L-serine another amino acid
  • Those skilled in the art can, from a simple test, determine which polymer should preferably be used for a given type of bacteria.
  • Such a test may consist firstly in mixing the polymer and the bacteria and then in observing the evolution of the solution. If the bacteria aggregate by flocculating, the polymer is considered not to be compatible. On the contrary, if no flocculation is observed, it is considered that there may be compatibility. However, to precisely check the compatibility of the polymer with bacteria, it is necessary to carry out tests according to standardized methods well known to those skilled in the art in order to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) or the minimum bactericidal concentration (CMB) of the polymer.
  • MIC inhibitory concentration
  • CMB minimum bactericidal concentration
  • the coating formed around the seed constitutes a film or coating having a thickness generally between approximately 10 and 100 ⁇ m, preferably between 20 and 50 ⁇ m.
  • the concentrations of agent increasing the intracellular pressure of the bacteria can vary between wide limits within the coating polymer.
  • Some indications Illustrative are given in the following examples. For routine prior testing, those skilled in the art can optimize the concentration per seed, knowing the approximate number of seeds per kg for a given species and the volume of formulation required to film a given weight of seed.
  • the agents increasing the intracellular pressure of the bacteria are advantageously at a maximum concentration.
  • L-glutamic acid is present in the film-coating polymer at a concentration greater than about 8 g / l.
  • the proline is advantageously included at a concentration greater than approximately 150 g / l, the betaine at a concentration greater than approximately 1600 g / l and the serine at a concentration greater than approximately 50 g / l.
  • the amounts of bacteria per seed vary according to the nature of the bacteria and the surface and the volume of the seed. Routine tests are within the reach of those skilled in the art to determine the optimal number of bacteria actually present in the film surrounding the seed.
  • the bacteria seeds can be obtained by a manufacturing process comprising the following steps:
  • the application of the formulation and the drying are carried out in a fluidized bed processor or in a film-coating turbine.
  • the bacterial strains are kept in the lyophilized state and must be reactivated in a rich nutritive medium before inoculating the definitive culture medium suitable for the bacterial species.
  • the culture medium is continuously stirred to optimize oxygenation.
  • the temperature and pH conditions are determined for each bacterial species.
  • the bacterial inoculum is formed when the end of the stationary phase is reached: its final concentration must be greater than 10 10 cfu / ml.
  • the sterilized biopolymer is dissolved in sterile water at its specific concentration in the presence of the agent or agents increasing the osmotic pressure, for example glutamic acid at the minimum concentration of 8 g / l. It is necessary to adjust the pH from around 6.2 to 6.5 (depending on the polymer used) preferably using KOH 10N, avoiding any precipitation of the polymer. Finally, the concentrated bacterial suspension containing the osmoprotective agent (s) at the same concentration as in the polymer is gently dissolved in the polymer in a volume ratio close to 1: 1. It is left to stand for at least 1 hour at laboratory temperature.
  • the agent or agents increasing the osmotic pressure for example glutamic acid at the minimum concentration of 8 g / l. It is necessary to adjust the pH from around 6.2 to 6.5 (depending on the polymer used) preferably using KOH 10N, avoiding any precipitation of the polymer.
  • an industrial turbine or better a fluidized bed processor, or any other device suitable for this operation is used.
  • a fluidized bed processor or any other device suitable for this operation.
  • the temperature which must not be higher than 30 ° C, to avoid any clogging of filter or sticking of seeds between them. Drying should be as quick as possible.
  • FIG. 1 represents the survival of Pseudomonas fluorescens G92 bacteria on sunflower seeds stored at 12 ° C. as a function of the number of days, the seeds having been film-coated in a fluidized bed.
  • FIG. 2 represents the survival of Pseudomonas putida TL5 bacteria on sunflower seeds stored at 12 ° C., the seeds having been film-coated in a fluidized bed and in a turbine respectively.
  • FIGS. 3A, 3B and 3C show the quantities of glutamate, determined by enzymatic method, under different conditions, FIG.
  • FIG. 3A representing the evolution of the average quantity of L-glutamic acid, in or on 10 10 bacterial cells Pseudomonas putida TL5, as a function of the time of incubation in the osmoprotector (1, 30, and 60 minutes)
  • FIG. 3B representing the average percentage of L-glutamic acid and its salts (glutamates) in the formulation at pH 6.08 at two concentrations of chitosan (3 and 6%)
  • FIG. 3C representing the amount of L-glutamic acid and its salts (glutamates) present on film-coated sunflower seeds, after four months of storage, respectively with and without Pseudomonas fluorescens G 92 bacteria
  • FIG. 3A representing the evolution of the average quantity of L-glutamic acid, in or on 10 10 bacterial cells Pseudomonas putida TL5, as a function of the time of incubation in the osmoprotector (1, 30, and 60 minutes
  • FIG. 3B
  • FIGS 5A and 5B illustrate the survival of bacteria
  • Pseudomonas putida TL5 in the presence and absence of L-glutamic acid, respectively in sodium alginate (Manucol) and in a cellulosic polymer (Sepiret). The number of bacteria is expressed in cfu / ml.
  • the bacteria are grown in LPG medium (yeast extract 5 g / l, peptone 5 g / l, glucose 10 g / l) or in King's medium B (KING, WARD and RANEY, 1954, J. Lab. Clin. Med., 44: 301-307) or in the midst of MISAGHI (MISAGHI and GROGAN, 1969, Phytopathology 59: 1436-1450) at 26-27 ° C for 60 to 72 hours with continuous stirring and pH regulated at 6.5-6.8.
  • LPG medium yeast extract 5 g / l, peptone 5 g / l, glucose 10 g / l
  • King's medium B KING, WARD and RANEY, 1954, J. Lab. Clin. Med., 44: 301-307
  • MISAGHI MISAGHI and GROGAN, 1969, Phytopathology 59: 1436-1450
  • a solution of sterilized chitosan-glutamate (purity> 95%) is prepared in sterile water at a concentration of 6%.
  • the pH of the biopolymer solution is adjusted to 6.2 using 10N KOH.
  • the concentrated bacterial aqueous suspension is gently mixed with the biopolymer in a 1: 1 volume ratio. It is left to stand for at least 1 hour at laboratory temperature.
  • AW water activity
  • HRE equilibrium relative humidity
  • the volume of formulation required varies depending on the type of seed. Thus 200 to 300 liters of formulation are necessary to film 1 ton of sunflower seeds.
  • FIG. 3A illustrates the evolution of the amount of L-glutamic acid absorbed or adsorbed by 10 10 bacterial cells as a function of the incubation time in the solution.
  • FIG. 3B represents the variation in the quantity of glutamic acid and of glutamates in the formulation as a function of the concentration of chitosan.
  • FIG. 3C is a comparison of the evolution of the amounts of glutamate respectively on film-coated seeds without and with bacteria after 4 months of storage.
  • Rhizobium example; Rhizobium meliloti strain 2011
  • YEM medium VINCENT, 1970, A manual for practical study of root-nodule bacteria, IBP Handbook n ° 15, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 169 pp.
  • Rhizobium example: Rhizobium meliloti strain 2011
  • Bradyrhizobium example: B japonicum strain G49, IARI SB16, New Delhi
  • BURTON 1976, Symbiotic nitrogen fixatio, ed. PS Nutman, Cambridge University Press, 175-189
  • the bacterial suspensions are concentrated so as to obtain a useful concentration of approximately 10 11 cfu / ml.
  • sterile sodium alginate Manucol marketed by Kelco International
  • a cellulose derivative Sepiret O7G marketed by Seppic
  • l sterilized L-glutamic acid Sigma, purity 99-100%
  • the pH of the solution is adjusted to 6.4 using 10N KOH.
  • the concentrated bacterial aqueous suspension containing glutamic acid 0.86% is gently mixed with this polymer solution in a 1: 1 ratio by volume. It is left to stand for at least 1 hour at laboratory temperature.
  • Example 1 The same steps are carried out as in Example 1 for the coating.
  • the volume of formulation required varies depending on the type of seed. For example, to film 1 ton of soybean seed, approximately 1000 liters of formulation is required.
  • the inoculated pellets were subjected to 2 h and 4 h of dehydration by ventilation of dry air at 25 ° C. Then the number of bacteria (cfu / ml) was determined by the conventional method of dilutions on King's medium B.

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Abstract

Semences pelliculées par un polymère filmogène, biodégradable, hydrorétenteur et adhérant à la semence, compatible avec des bactéries incluses. Le polymère comprend en outre au moins un agent augmentant rapidement la pression osmotique intracellulaire des bactéries, ce qui permet de conserver les bactéries viables jusqu'au moment du semis.

Description

« Semences bactérisées prêtes à l'emploi et procédé d'obtention »
La présente invention est relative à des semences bactérisées prêtes à l'emploi . Elle a en outre pour objet un procédé d'obtention de telles semences.
Plusieurs genres et espèces bactériennes produisent des effets bénéfiques sur les plantes et leur environnement. Ainsi, les bactéries symbiotiques des légumineuses des genres Rhizobium et Bradyrhizobium fixent l'azote de l'air et, en le restituant aux plantes, améliorent la croissance de celles-ci. De même, certaines bactéries non symbiotiques, telles que les Pseudomonas fluorescens et Ps. putida,\es mutants avirulents des Pseudomonas (tels que Ps.solanacearum), les Agrobacterium antagonistes et A. tumefaciens, les Bacillus, les Azospirillum favorisent la croissance des plantes et les protègent vis-à- vis des parasites fongiques et bactériens directement par des mécanismes d'antagonisme ou indirectement en induisant une résistance systémique (DIGAT, 1994,C.R.Acad.Agric. Fr.80.2:113-122). Enfin, d'autres bactéries telles que Bacillus thuringiensis sécrètent des toxines insecticides permettant une lutte biologique contre les insectes.
Les « plants » au sens large tels que les graines, les tubercules, les bulbes, les rhizomes et les boutures constituent des cibles favorables pour la bactérisation, car ils représentent un matériel de multiplication individualisé pouvant être colonisé efficacement par des populations bactériennes bénéfiques.
Jusqu'à présent, le procédé le plus couramment utilisé pour la bactérisation consiste à immerger le matériel végétal dans une suspension bactérienne aqueuse juste avant la plantation. Cependant, les semences bactérisées par ce procédé doivent être semées immédiatement car les cellules bactériennes ne peuvent survivre que quelques minutes à quelques heures à l'état déshydraté.
Afin de prolonger la survie des micro-organismes, on a proposé de constituer des inoculants , ou inoculats bactériens en fixant les bactéries sur des supports tels que des particules de silice et de silicates, de sable, d'argile, de tourbe, de charbon poreux ou de sels minéraux tels que des sulfate, phosphate ou carbonate de calcium (SMITH , 1992, Can.J. Microbiol. 38, 485-492).
La survie des bactéries dans et/ou sur ces supports est relativement satisfaisante lorsque ceux-ci sont humides (activité de l'eau AW > 0.9). Cependant, lors du mélange de ces inoculants avec les semences, on constate que, comme précédemment, la majorité de la population bactérienne ne survit pas plus de quelques heures à la surface des semences (BROCKWELL et BOTTOMLEY, 1995, Soil Biol. Biochem, 27, 4-5:683-697) dont l'AW est fréquemment inférieur à 0.5. Par conséquent, le mélange de ces inoculants ainsi conditionnés avec les graines doit être effectué juste avant le semis. Il en résulte des inconvénients majeurs et notamment une impossibilité de conserver les semences ainsi bactérisées.
Dans ce domaine de la bactérisation, dite indirecte, une amélioration a été apportée grâce à l'utilisation de microgranulés à base d'argile, de tourbe, ou d'alginate enrichis éventuellement par une source de carbone (brevets FR-2.519.022 et FR-2.695.929). Ces moyens permettent d'augmenter quelque peu la survie bactérienne, mais les microgranulés doivent encore être inoculés par l'agriculteur au moment de leur emploi au champ, c'est-à-dire juste avant le semis, et être disposés à proximité des semences dans la raie de semis.
Par ailleurs, afin d'améliorer l'adhérence des bactéries à la semence et leur résistance à la déshydratation, on a proposé de mélanger divers adhésifs et agents filmogènes, tels que des polymères artificiels (polyvinyle, polyacrylamide) ou naturels tels que les polysaccharides (cellulose et ses dérivés, alginates et ses dérivés, xanthane ) avec les bactéries. La plupart de ces agents filmogènes ayant une capacité de rétention en eau assez élevée, cette propriété a été mise à profit pour améliorer la survie des bactéries. On a aussi tenté d'améliorer la tolérance de certaines bactéries à la déshydratation en les cultivant dans des milieux contenant du mannitol, du sorbitol, du fructose de la dextrine ou de l'amidon (brevet européen O.O83.267).
Cependant, ces deux dernières solutions n'entraînent pas une augmentation suffisante de la survie des bactéries. L'effet bénéfique sur les bactéries de diverses molécules osmorégulatrices a en outre été décrit, de manière générale, par- exemple dans l'article de CSONKA (1989, Microbiol. Rev., 53, 121-147). L'utilisation de polysaccharides non réticulés pour stabiliser des microorganismes pour l'inoculation de graines est décrite dans le brevet US 5 292 507. Ce brevet mentionne que les solutions de polysaccharide peuvent contenir des agents osmorégulateurs, tels que des tampons. De tels agents ne sont pas de nature à leur permettre d'assurer une fonction d'osmoprotection. La demande PCT WO 92/08 355 concerne elle aussi des semences inoculées. Les bactéries sont mélangées avec un argile inerte sous forme de poudre, et le mélange est mis à sécher. Selon un premier mode de réalisation, un osmoprotecteur est ajouté au moment du mélange des bactéries avec l'argile. Un séchage lent est alors nécessaire. Selon un autre mode de réalisation, l'osmoprotecteur est produit par les bactéries, ce qui nécessite un séchage encore plus lent. Cette lenteur dans le séchage entraîne une imbibition de la semence, qui réduit son pouvoir germinatif.
Il ressort de l'analyse de l'état de la technique que l'on ne connaissait pas de moyen industriellement applicable permettant d'obtenir des semences présentant en surface une pellicule de bactéries et pouvant être stockées pendant les périodes comprises entre leur fabrication et les semis, sans pour autant perdre leurs propriétés bénéfiques. Le demandeur s'est attaché à résoudre ce problème et a montré que des semences pelliculées par un polymère contenant un certain type d'agent augmentant la pression osmotique intracellulaire des bactéries, conservaient des bactéries viables jusqu'à leur semis.
La présente invention a donc pour objet des semences bactérisées prêtes à l'emploi, pelliculées par un polymère filmogène biodégradable, hydrorétenteur et adhérant à la semence, ledit polymère comprenant les bactéries et en outre au moins un agent osmoprotecteur ou augmentant la pression osmotique intracellulaire des bactéries.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « pelliculage » doit être compris dans son sens habituel de la technique des semences, c'est-à-dire comme signifiant une couche fine, d'épaisseur généralement comprise entre environ 10 et 100μm de préférence entre 20 et 50μm, déposée sur la semence. Dans une semence « pelliculée », la forme extérieure est peu modifiée par rapport à la semence d'origine, ce qui n'est pas le cas des semences dites « enrobées », dans lesquelles la couche d'enrobage contenant la semence a une épaisseur supérieure à 1000 μm et modifie la forme extérieure de la semence, qui devient alors approximativement sphérique. De manière préférentielle, l'agent augmentant la pression osmotique intracellulaire des bactéries est un acide aminé, tel que l'acide L-glutamique, la L-proline, la bétaïne, la L-sérine, ou l'un de leurs sels ou l'un de leurs dérivés. Il est préférentiellement l'acide L-glutamique. Cet agent peut être utilisé seul ou en mélange avec d'autres agents précités ayant la même fonction.
Les bactéries susceptibles d'être incluses dans le pelliculage sont avantageusement des bactéries produisant des effets bénéfiques sur les plants issus des semences, ou sur leur environnement, et en particulier des bactéries symbiotiques ou non symbiotiques mentionnées ci-dessus, telles que les bactéries des genres Rhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus et Azospirillum. Ces bactéries peuvent avoir divers effets sur les plantes et leur environnement. Elles peuvent fixer l'azote de l'air, protéger les plantes des parasites fongiques et bactériens, ou encore sécréter des toxines insecticides.
Le polymère formant la pellicule est avantageusement un polymère filmogène biodégradable. Il peut être en particulier un chitosan, un alginate , une cellulose ou un de leurs dérivés. Il est choisi en fonction du type d'exopolysaccharide (EPS) de la bactérie que l'on souhaite utiliser.
Ainsi, pour les bactéries telles que les Pseudomonas et les Bacillus, on choisit un biopolymère cationique comme le chitosan ou mieux le chitosan-glutamate stérilisé par les rayons gamma. Ce dernier polymère forme à lui seul une microcapsule visible au microscope électronique autour des cellules bactériennes et confère rapidement aux bactéries la capacité de mieux résister à la déshydratation. Il contient des ions glutamate en excès sous forme de sels (de sodium, de- potassium, de magnésium) qui s'accumulent très rapidement dans les cellules bactériennes. Pour d'autres bactéries, telles que les Rhizobium et
Bradyrhizobium, on choisit de préférence un biopolymère anionique, tel qu'un sel d'alginate soluble auquel on adjoint de l'acide L-glutamique ou l'un de ses sels ou un autre acide aminé (L-proline, bétaïne, L-sérine) ou un de ses sels. Pour les Pseudomonas, les Bacillus, les Rhizobium et les
Bradyrhizobium, il est aussi possible de choisir une cellulose ou l'un de ses dérivés auquel on adjoint de l'acide L-glutamique ou l'un de ses sels ou un autre acide aminé (L-proline, bétaïne, L-sérine) ou un des sels de ces acides. L'homme du métier peut à partir d'un simple test déterminer quel polymère doit être préférentiellement utilisé pour un type donné de bactérie.
Un tel test peut consister dans un premier temps à mélanger le polymère et les bactéries puis à observer l'évolution de la solution. Si les bactéries s'aggrègent en floculant, le polymère est considéré comme n'étant pas compatible. Au contraire, si aucune floculation n'est observée on considère qu'il peut y avoir compatibilité. Cependant, pour vérifier précisément la compatibilité du polymère avec les bactéries, il est nécessaire de réaliser des tests selon des procédés standardisés bien connus de l'homme du métier afin de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) ou la concentration minimale bactéricide (CMB) du polymère.
De manière avantageuse, le revêtement formé autour de la semence constitue une pellicule ou enrobage présentant une épaisseur généralement comprise entre environ 10 et 100μm, de préférence entre 20 et 50μm.
Dans les semences pelliculées selon l'invention, les concentrations d'agent augmentant la pression intracellulaire des bactéries, en particulier d'acide L-glutamique, peuvent varier entre de larges limites au sein du polymère de pelliculage. Des indications illustratives sont données dans les exemples qui suivent. Pour des essais préalables de routine, l'homme du métier peut optimiser la- concentration par semence, en connaissant le nombre approximatif de semences par kg pour une espèce donnée et le volume de formulation nécessaire pour pelliculer un poids donné de semences.
Au sein de la formulation de pelliculage, les agents augmentant la pression intracellulaire des bactéries sont avantageusement à une concentration maximale. Préférentiellement, l'acide L-glutamique est présent dans le polymère de pelliculage à une concentration supérieure à environ 8 g/1.
La proline est avantageusement comprise à une concentration supérieure à environ 150 g/l, la bétaïne à une concentration supérieure à environ 1600 g/l et la serine à une concentration supérieure à environ 50 g/l. Dans les semences pelliculées selon l'invention, les quantités de bactéries par semence varient selon la nature des bactéries et la surface et le volume de la semence. Des essais de routine sont à la portée de l'homme du métier pour déterminer le nombre optimal de bactéries effectivement présentes dans la pellicule entourant la semence.
La présente invention présente l'avantage de combiner:
- d'une part la formation d'une microcapsule autour des cellules bactériennes ralentissant les échanges d'eau et de gaz avec le milieu extérieur, et - d'autre part le déclenchement d'une rapide élévation de la pression osmotique intracellulaire dans les cellules bactériennes.
Les semences bactérisées peuvent être obtenues par un procédé de fabrication comprenant les étapes suivantes:
- mélange du polymère et de l'agent osmoprotecteur, puis mélange avec les bactéries,
- application sur les semences de la formulation ainsi obtenue , et par pelliculage et
- séchage des semences. De manière avantageuse, l'application de la formulation et le séchage sont effectués dans un processeur à lit fluidisé ou dans une- turbine de pelliculage.
Selon un mode de mise en oeuvre particulier, les souches bactériennes sont conservées à l'état lyophilisé et doivent être réactivées dans un milieu nutritif riche avant d'ensemencer le milieu de culture définitif convenant à l'espèce bactérienne. Dans un fermenteur à grande capacité, le milieu de culture est agité en continu pour optimiser l'oxygénation. Les conditions de température et de pH sont déterminées pour chaque espèce bactérienne. L'inoculum bactérien est constitué lorsqu'on atteint la fin de la phase stationnaire : sa concentration finale doit être supérieure à 1010cfu/ml.
Le biopolymère stérilisé est solubilisé dans l'eau stérile à sa concentration spécifique en présence du ou des agents augmentant la pression osmotique, par exemple d'acide glutamique à la concentration minimale de 8 g/l. Il est nécessaire d'ajuster le pH d'environ 6,2 à 6,5 (selon le polymère utilisé) préférentiellement à l'aide de KOH 10N en évitant toute précipitation du polymère. Enfin, la suspension bactérienne concentrée contenant le ou les agents osmoprotecteurs à la même concentration que dans le polymère est doucement dissoute dans le polymère dans un rapport en volume voisin de 1 :1. On laisse reposer au moins 1 heure à la température du laboratoire.
Pour le pelliculage des semences, on utilise une turbine industrielle, ou mieux un processeur à lit fluidisé, ou tout autre appareil convenant à cette opération. Durant ces opérations il est nécessaire de veiller au réglage de la température, qui ne doit pas être supérieure à 30°C, d'éviter tout colmatage de filtre ou de collage des semences entre elles. Le séchage doit être le plus rapide possible.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent, avec référence aux dessins annexés sur lesquels:
La figure 1 représente la survie de bactéries Pseudomonas fluorescens G92 sur des semences de tournesol conservées à 12°C en fonction du nombre de jours, les semences ayant été pelliculées en lit fluidisé. La figure 2 représente la survie de bactéries Pseudomonas putida TL5 sur des semences de tournesol conservées à 12°C, ies- semences ayant été respectivement pelliculées en lit fluidisé et en turbine. Les figures 3A, 3B et 3C mettent en évidence les quantités de glutamate, déterminées par méthode enzymatique, dans différentes conditions, la figure 3A représentant l'évolution de la quantité moyenne d'acide L-glutamique, dans ou sur 1010 cellules bactériennes de Pseudomonas putida TL5, en fonction du temps d'incubation dans l'osmoprotecteur(1 , 30, et 60 minutes), la figure 3B représentant le pourcentage moyen d'acide L- glutamique et de ses sels (glutamates) dans la formulation à pH 6,08 à deux concentrations en chitosan (3 et 6%), la figure 3C représentant la quantité d'acide L-glutamique et de ses sels (glutamates) présente sur des semences de tournesol pelliculées, après quatre mois de stockage, respectivement avec et sans bactéries Pseudomonas fluorescens G 92, la figure 4 illustre la survie de Bradyrhizobium japonicum G49 sur des semences de soja conservées à 12°C , et pelliculées respectivement par un polymère d'alginate de sodium (Manucol) et un dérivé cellulosique (Sepiret).
Les figures 5A et 5B illustrent la survie de bactéries
Pseudomonas putida TL5, en présence et en absence d'acide L- glutamique, respectivement dans de l'alginate de sodium (Manucol) et dans un polymère cellulosique (Sepiret). Le nombre de bactéries est exprimé en cfu/ml.
EXEMPLE 1 Bactérisation des semences par les Pseudomonas
Afin de constituer l'inoculum, les bactéries sont cultivées dans le milieu LPG (extrait de levure 5 g/l, peptone 5 g/l, glucose 10 g/l) ou dans le milieu B de King (KING, WARD and RANEY, 1954, J. Lab. Clin. Med., 44:301-307) ou dans le milieu de MISAGHI (MISAGHI et GROGAN, 1969, Phytopathology 59: 1436-1450)à 26-27°C durant 60 à 72 heures avec agitation en continu et pH régulé à 6,5-6,8. La fin de la- phase stationnaire étant atteinte, on concentre la suspension bactérienne de façon à obtenir une concentration utile d'environ 1011 cfu/ml.
On prépare une solution de chitosan-glutamate stérilisé (pureté > 95%) dans de l'eau stérile à la concentration de 6%. Le pH de la solution de biopolymère est ajusté à 6,2 à l'aide de KOH 10N. La suspension aqueuse bactérienne concentrée est mélangée doucement avec le biopolymère dans un rapport 1 :1 en volume. On laisse reposer au moins 1 heure à la température du laboratoire.
On mesure l'activité de l'eau (AW) ou l'humidité relative d'équilibre (HRE) d'un échantillon de semences à bactériser, l'optimum de AW à la fin de l'opération de pelliculage se situant vers 0,50. Les semences sont placées dans une turbine industrielle de type DUMOULIN ou dans un processeur à lit fluidisé muni d'une cuve WURSTER. On règle les paramètres suivants:
* température de l'air à l'entrée: 30°C,
* température de l'air à la sortie : 20°C, * pression de pulvérisation: 0,5 bar (lit fluidisé) ou 2 bars
(turbine),
* diamètre des buses de pulvérisation: 1 ,0 à 1 ,2 mm,
* pression de ventilation: -115 Pa (lit fluidisé) ou -200 Pa (turbine), * débit moyen de la pompe: 10 ml/minute.
Le volume de formulation nécessaire varie en fonction du type de semences. Ainsi 200 à 300 litres de formulation sont nécessaires pour pelliculer 1 tonne de semences de tournesol.
Lorsque le pelliculage est terminé, on procède à la numération sur le milieu B de King gélose de la population survivante sur la semence. On suit cette survie de la population bactérienne jusqu'à la commercialisation finale de façon à garantir à l'utilisateur une quantité de bactéries survivantes estimée suffisante pour produire l'effet biologique recherché. Les essais de pouvoir germinatif sont effectués selon les normes de l'ISTA (International Seed Testing Association). Selon cet exemple, à 12°C, la survie de Pseudomonas fluorescens G92 en surface des semences de tournesol, pelliculées à l'aide de la technologie du lit fluidisé selon le procédé décrit ci-avant, est suivie durant plus de 550 jours (figure 1). On observe qu'à cette date la perte de population est seulement d'1.5 log cfu.
D'autre part, le pelliculage des semences de tournesol à l'aide de la même formulation contenant Pseudomonas putida TL5 à 3 x 1010 cfu/ml est effectué simultanément dans un processeur à lit fluidisé (marque GLATT) et dans une turbine (marque DUMOULIN). La survie de la population bactérienne fixée sur les semences est suivie durant 70 jours (figure 2). On observe qu'à cette date la perte de population n'est que légèrement supérieure à 1 log cfu.
La quantité d'acide L-glutamique et de glutamates a en outre été mesurée dans diverses conditions et à différents moments comme décrit par Bernt et Bergmeyer (1965, Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, 384-388, 2nd printing). La figure 3A illustre l'évolution de la quantité d'acide L-glutamique absorbé ou adsorbé par 1010 cellules bactériennes en fonction du temps d'incubation dans la solution. La figure 3B représente la variation de la quantité d'acide glutamique et de glutamates dans la formulation en fonction de la concentration en chitosan. La figure 3C est une comparaison de l'évolution des quantités de glutamate respectivement sur des semences pelliculées sans et avec bactéries après 4 mois de stockage.
EXEMPLE 2
Bactérisation des semences de légumineuses par Rhizobium et Bradyrhizobium
Afin de constituer l'inoculum, les bactéries sont cultivées: pour les Rhizobium (exemple; Rhizobium meliloti souche 2011)dans le milieu YEM (VINCENT, 1970, A manual for practical study of root-nodule bacteria, IBP Handbook n°15, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 169 pp.) durant 6 jours à 28°C en agitation continue, pH régulé à 7 et pour les Bradyrhizobium (exemple:B japonicum souche G49, IARI SB16, New Delhi) dans le milieu de Burton (BURTON, 1976, Symbiotic nitrogen fixatio,ed. P. S. Nutman, Cambridge University Press, 175-189) durant 8- jours à 30°C en agitation continue, pH régulé à 6,5.
La fin des phases stationnaires étant atteinte, les suspensions bactériennes sont concentrées de façon à obtenir une concentration utile d'environ 1011 cfu/ml.
Pour la formulation, on utilise soit de l'alginate de sodium stérile (Manucol commercialisé par Kelco International) à la concentration de 1 ,0% , soit un dérivé cellulosique (Sepiret O7G commercialisé par Seppic) à 8% dans lesquels on ajoute de l'acide L-glutamique stérilisé (Sigma, pureté 99-100%) à la concentration finale de 0.86 %. On ajuste le pH de la solution à 6,4 à l'aide de KOH 10N. La suspension aqueuse bactérienne concentrée contenant l'acide glutamique à 0,86% est doucement mélangée à cette solution de polymère dans un rapport 1 :1 en volume. On laisse reposer au moins 1 heure à la température du laboratoire.
On procède aux mêmes étapes que dans l'exemple 1 pour le pelliculage.
Le volume de formulation nécessaire varie en fonction du type de semence. Par exemple, pour pelliculer 1 tonne de semence de soja, environ 1000 litres de formulation sont nécessaires.
Lorsque le pelliculage est terminé, on procède à la numération, respectivement sur milieu YEM ou milieu de BURTON géloses, de la population survivante sur la semence et on réalise des tests de nodulation (en conditions contrôlées) en notant le nombre de nodosités apparues sur les plantes. Les essais de pouvoir germinatif sont effectués selon les normes de l'ISTA (International Seed Testing Association).
Selon cet exemple, à 12°C, la survie de Bradyrhizobium japonicum G49 en surface des semences de soja pelliculées à l'aide d'un processeur à lit fluidisé selon le procédé décrit ci-dessus a été suivie durant 70 jours (figure 4). On observe qu'à cette date la perte dé¬ population est de 4 log environ dans les deux polymères (Manucol et Sepiret) utilisés pour la formulation. Chaque semence de soja devant être porteuse de 106 bactéries pour induire une nodulation suffisante, on estime que cette quantité est disponible jusqu'au 70ème jour. EXEMPLE 3:
Influence de la présence d'acide glutamique dans le revêtement sur la survie des bactéries.
Des tests comparatifs ont été effectués sur des supports inertes stériles représentés par des pastilles de « Téflon » de diamètre 10 mm afin de déterminer l'influence de l'acide L-glutamique sur la survie des bactéries. Dix microlitres d'un mélange d'alginate (Manucol) et de bactéries Pseudomonas putida TL5 à 104C cfu/ml, avec ou sans acide L- glutamique (8g/l) ont été déposés sur chaque pastille. Les pastilles ont été placées dans des boîtes de Nunclon delta stérilisées aux rayons gamma à raison de 12 pastilles par traitement (3 répétitions de 4). On a soumis les pastilles inoculées à 2 h et 4 h de déshydratation par ventilation d'air sec à 25°C. Puis le nombre de bactéries (cfu/ml) a été déterminé par la méthode classique des dilutions sur le milieu B de King.
Les résultats sont représentés sur la figure 5A.
Ils montrent clairement que l'ajout d'acide L-glutamique à l'alginate permet la survie des bactéries après 4 h de déshydratation, alors qu'en absence d'acide L-glutamique les bactéries ne survivent pas.
Des expérimentations comparables ont été effectuées avec la même souche bactérienne à 106 cfu/ml, dans un polymère cellulosique (Sepiret 07 G). La survie des bactéries a été estimée après I h et 2h de déshydratation dans les mêmes conditions que pour la figure 5A.
La conclusion est similaire pour ce polymère, l'acide L- glutamique exerçant un effet bénéfique très net sur la survie des bactéries, comme le montre la figure 5B.

Claims

REVENDICATIONS
1. Semence bactérisée prête à l'emploi pelliculée par un polymère filmogène biodégradable, hydrorétenteur et adhérant à la semence, comprenant les bactéries, ledit polymère comprenant en outre au moins un agent osmoprotecteur ou augmentant la pression osmotique intracellulaire des bactéries.
2. Semence selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit agent est un acide aminé.
3. Semence selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que ledit agent est l'acide L-glutamique, la L-proline, la bétaïne, la L-sérine ou l'un de leurs sels ou l'un de leurs dérivés, ou un mélange desdits acides, sels ou dérivés.
4. Semence selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que ledit agent est l'acide L-glutamique, l'un de ses sels ou l'un de ses dérivés, et en ce qu'il est compris à une concentration supérieure à environ 8 g/l.
5. Semence selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les bactéries sont du genre Rhizobium, Bradyrhizobium,
Pseudomonas , Agrobacterium, Bacillus ou Azospirillum.
6. Semence selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que ledit polymère est un chitosan, un alginate, une cellulose, ou un de leurs dérivés.
7. Semence selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que la pellicule entourant la semence possède une épaisseur comprise entre environ 10 et 100μm, de préférence entre environ 20 et 50 μm.
8. Procédé de fabrication de semences bactérisées selon l'une des revendications 1 à 7 comprenant les étapes suivantes: - mélange du polymère et de l'agent osmoprotecteur, puis mélange avec les bactéries,
- application sur les semences par pelliculage de la formulation ainsi obtenue,
- séchage des semences.
9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'application et le séchage sont effectués dans un processeur à lit fluidisé ou dans une turbine industrielle.
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