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WO1998030571A1 - Elektrokinetische probenvorbereitung - Google Patents

Elektrokinetische probenvorbereitung Download PDF

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Publication number
WO1998030571A1
WO1998030571A1 PCT/EP1997/007306 EP9707306W WO9830571A1 WO 1998030571 A1 WO1998030571 A1 WO 1998030571A1 EP 9707306 W EP9707306 W EP 9707306W WO 9830571 A1 WO9830571 A1 WO 9830571A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
membrane
nucleic acid
microchannel
analysis
macromolecules
Prior art date
Application number
PCT/EP1997/007306
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hansjörg Dürr
Ulf Brüggemeier
Karsten Dierksen
Hans-Robert Hehnen
Rainer Neumann
Eberhard Kuckert
Original Assignee
Bayer Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Aktiengesellschaft filed Critical Bayer Aktiengesellschaft
Priority to EP97954757A priority Critical patent/EP0958300A1/de
Priority to JP53051098A priority patent/JP2001509258A/ja
Priority to AU59857/98A priority patent/AU5985798A/en
Publication of WO1998030571A1 publication Critical patent/WO1998030571A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44743—Introducing samples

Definitions

  • Biomacromolecules such as Proteins and nucleic acids, but also small particles such as viruses and bacteria, are of great importance both diagnostically and for medical research.
  • the established methods for characterizing these substances from biological matrices are partly. very complex.
  • the target nucleic acid is isolated for nucleic acid analyzes, then amplified and evaluated using a suitable analysis method. Isolation is time consuming and difficult to automate.
  • the nucleic acid In order to obtain sufficient amounts of nucleic acid for the established analytical methods, the nucleic acid must be amplified in a further step. So far, only the polymerase chain reaction (PCR) has found wider application.
  • Isolation from a pure bacterial culture is a simple case for obtaining nucleic acid: in the case of E. coli, alkaline lysis releases the nucleic acid; After centrifugation and neutralization, this crude product can be used directly for PCR batches (Rolfs, A. et al. PCR: Clinical Diagnosis and Research,
  • sample material for medical diagnostics is more heterogeneous; Blood, urine, cerebrospinal fluid, swab material, sputum, tissue samples, faeces, e.g. call for specific digestion methods, which in turn depend on the question
  • Silicon microparticles which can also be embedded in membranes, can also be used for nucleic acid purification (WO 95/34569).
  • Ion exchange membranes US 832284
  • chemically modified silica phases EP
  • an isolation step usually follows the isolation of the nucleic acids (EP 229701).
  • Viruses are usually isolated and concentrated using the following methods: ultracentrifuge, electroextraction, size exclusion separation, affinity chromatography and precipitation (Polson, Alfred, Prep. Biochem., 1993; 23, Dekker, New York,
  • Bacteria are usually separated and raised by spreading on nutrient media.
  • immunological methods eg by fluorescent labeling -
  • nucleic acid determination methods after cell lysis - are available.
  • Capillary electrophoretic analysis methods have been used for several years to analyze biological macromolecules such as proteins (WO 93/22665), nucleic acids (Heller, C, J. Chromatogr. A, 1995, 698, 19-31) and more recently also viruses (DE 4438833) Detection is carried out either directly with UV or by means of fluorescence detection after marking the macromolecules (Pentoney, SL, Jr, et al Handbook of Capdlary Electrophoresis, S 147, Landers, JP (Ed) Boca Raton, CRC
  • a fundamental disadvantage of the CE is the low injection volume, which is only a few nanoliters. There are numerous attempts to compensate for this disadvantage (St. Claire R.L., Anal. Chem. 1996, 68, 569R-586R). This includes isotachophoretic concentration and stacking, both of which focus the sample components in the injection volume.
  • a patent was filed by Guzmann in 1993 for a specific solid phase adsorption in the capillary for sample concentration (WO 93/05390). Specific compounds in a sample are held or allowed to pass through specific molecular interactions. A further development of these methods was developed by Tomlinson et al. made with the membrane preconcentration capillary electrophoresis (Tomlinson, A.J., et al. J. High
  • Capillary array electrophoresis was developed by various working groups, mainly for nucleic acid sequencing, and a patent application was also filed in part (WO 96/04547).
  • fluorescent molecules were controlled and analyzed depending on the voltage.
  • Micromachines were also patented on the basis of chip technology, which enables process control of solutions for synthetic or analytical purposes through a network of channels and electrical switches (WO 96/15450).
  • Amplification-free nucleic acid analyzes
  • Fluorescence correlation spectroscopy was also used for biological screening methods using single molecule detection (EP 731173). High throughput nucleic acid sequencing is also processed based on this technology (Harding, J.D., et al. Trends in Biotechnology, 1992, 10, 55-57). These methods are based on the detection of a single fluorescent molecule in a very small volume element.
  • an automated method should be developed that allows macromolecules (nucleic acids, proteins, viruses and bacteria) from biological materials, such as e.g. Blood, blood plasma, serum, cerebrospinal fluid, urine, tissue samples, plants, cells, cell supernatants etc. and preparations from them to be isolated, concentrated and made available for analysis.
  • biological materials such as e.g. Blood, blood plasma, serum, cerebrospinal fluid, urine, tissue samples, plants, cells, cell supernatants etc. and preparations from them to be isolated, concentrated and made available for analysis.
  • the central component of the sample preparation module is a thermostattable microchannel with an inserted membrane.
  • This channel filled with a conductive liquid, is in contact with replaceable or fixed on both sides Installed vessels
  • a potential difference between the sample vessels charged molecules can be mobilized electrophoretically.
  • the possibility of applying a pressure difference can also generate a laminar flow in the microchannel.
  • a membrane (2) is introduced into a microchannel (1) and is suitable for retaining the desired macromolecule.
  • a pressure difference (6) and / or a voltage (5) to the ends of the microchannel (3,4), part of the sample becomes injected into the channel (Fig. 1) The injection is continued until there is a sufficient amount of the desired macromolecule in the microchannel.
  • the injection can be carried out be matched to the desired target molecule so that either only the desired macromolecule gets into the channel or is held by the membrane
  • the microchannel has an inner diameter of 10 - 100 ⁇ m and a total length of 3 - 50 cm.
  • the microchannel is made of an electrically non-conductive material such as polymer, ceramic, glass or quartz. In principle, all are synthetic
  • the polymer must be inside the buffer solutions used and is ideally transparent for optical detection methods (e.g. polycarbonate, polyester acrylate, polymethacrylate, polyurethane, polyacrylamide) but also PTFE is suitable.
  • the channel can be coated on the inside with a polymer in order to obtain favorable surface properties (e.g. polyacrylamide, silanol or polyvinyl alcohol)
  • membranes can be used that work on the principle of large size exclusion (ultrafiltration membrane).
  • the large size exclusion range must be adapted to the molecular size of the macromolecule. Range, for large nucleic acids and viruses, down to 0.45 mm, for bacteria and cells the membranes are microstructured polymers, preferably polyether sulfone (PES), polyester, fleece-based acrylic polymer, polytetrafluoroethylene (PTFE), polysulfone, polypropylene (PP), glass fiber, nylon or polycarbonate.
  • PES polyether sulfone
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • PP polypropylene
  • glass fiber nylon or polycarbonate
  • ion exchange membranes and adsorption phases can be used. The choice of these membranes depends on the type of
  • the injected macromolecule is concentrated in front of or in the membrane (2) by applying a pressure difference (6) and / or a voltage (5) (Fig. 2).
  • the desired macromolecule is then in a volume of a few nanoliters.
  • Pressure difference (6) and / or a voltage (5) are brought into the microchannel (1) (Fig. 3).
  • the conditions are chosen so that the target molecule remains concentrated. In this way, the target molecule can be modified enzymatically or chemically and / or specifically recognized by hybridization or immunological recognition.
  • the ability of the microchannel (1) to be thermostatted and the ability to change the reagent tubes several times allows complex implementations and cyclical processes. In this modification step, any derivatization reactions that may be necessary for fluorescence, chemiluminescence or laser-induced fluorescence detection are carried out.
  • the required reaction temperatures are achieved by thermostatting the microchannel (1).
  • either appropriately tempered air or liquid is directed past the microchannel.
  • the wall thickness of the microchannel is chosen so that sufficient heat dissipation is ensured.
  • the target molecule After optimally changing the reagent vessels (8,9) against the buffer vessels (10,1 1), the target molecule is mobilized by applying a pressure difference (6) and / or a voltage (5) (Fig. 4).
  • optical detection methods (12) such as Absorption or fluorescence, the molecule can be determined analytically directly in the microchannel (1) (13)
  • the analog detection methods are available as in the CE (St.Claire RL, Anal. Chem. 1996, 68, 569R-586R)
  • the microchannel is either made complete or transparent at one point for optical radiation.
  • the transmission of the excitation radiation and the fluorescent radiation must be ensured. These are preferably the non-conductive materials explained at the beginning.
  • the fluorescent radiation is perpendicular or at a defined angle of 0-180 ° measured in reflection to the irradiation wavelength.
  • the irradiation is preferably at 45 ° or 90 °.
  • the highly concentrated analysis target is, however, also available for further analysis (FIG. 5).
  • the target molecule can thus be fractionated into the analysis vessel (14) or into or onto any other analysis target
  • the analytical vessel (14) contains 1-1000 ml of a buffer suitable for further analysis.
  • a buffer suitable for further analysis is PBS buffer, Tris / borate or a tris-glycine buffer.
  • the analysis vessel (14) can also be a planar analysis target, for example a mass spectrometric sample holder. The electrical contact is either made directly via the conductive one
  • Analysis target reached or by wetting the surface between the electrode and microchannel with an electrically conductive liquid.
  • the concentrated target molecule can be brought into further channels for further analysis or conversion by switching over pressure or voltage and is therefore directly compatible with the CE chip technology (WO 96/04547)
  • the highly concentrated macromolecule is eluted in less than a microliter and can be applied directly to suitable liquid matrices or to solid sample carriers
  • a schematic representation of the parallel structure is shown in FIG. 6.
  • the microchannels (1) are produced from non-conductive materials, such as polymer, ceramic, glass, quartz or ceramic (15), and are coated if necessary.
  • the channel blocks are joined with an intermediate membrane layer (2) , so that the channels meet on the membrane The arrangement of the channels depends on the
  • thermostatic elements may be introduced to dissipate the Joule heat.
  • the channels are tapered at the ends so that they can be inserted into the respective vessels or are tightly connected to permanently installed vessels.
  • electrodes and supplied with a high voltage source are used for electrical contact, either on attached to the channel ends or in the vessels.
  • channels are placed in the analysis block that are perpendicular to the direction and between the levels of the microchannels. These channels allow air or liquid to be pumped at a suitable temperature
  • the height of the channel corresponds to the dimension of the microchannel (10-100 ⁇ m), so that the Joule heat can still be dissipated well.
  • the width of the channel (100 ⁇ m to 10 mm) allows rivers up to 10 3 higher than in the microchannel (1)
  • the membrane is clamped between the module blocks (15).
  • the entire module is 3 to 10 cm long, 1 to 50 mm wide and 0.1 to 50 mm thick
  • the channel ends are in turn connected either to exchangeable or permanently installed sample vessels.
  • a parallel arrangement can also be used to achieve an analog structure as in FIG. 6.
  • the macromolecules are concentrated in the channel (16) and then transferred via the transfer channel (17) to the microchannel and analogously the method from FIGS. 1-6 further processed.
  • the schematic enrichment of macromolecules with this rapid concentration is described below using the example of nucleic acids Nucleic acid from saline solution is enriched by applying a voltage to the flat channel (16) (Fig. 8a). In addition to the excess of small anions (small black balls), the nucleic acid is also injected from the sample. The anionic molecules migrate through the membrane (2 ) and are thus removed from the nucleic acid.
  • modification reactions can also be carried out simultaneously on the concentrated macromolecule
  • Nucleic acid is released from the sample to be examined using a suitable, established method (lysis, hydrolysis, ultrasound, etc.) and mixed with a suitable acidic extraction buffer.
  • the buffer must be designed in such a way that non-nucleotide components of the solution do not carry an anionic excess charge below one pH
  • a value of approx. 5 shows that proteins no longer have a negative excess charge.
  • Inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid or sulfuric acid as well as organic phosphoric acid derivatives or sulfonic acids can be used.
  • a polymer-bound, acidic ion exchanger eg polystyrene sulfonic acid
  • the acidic pH value is reached without additional anions being introduced into the solution. The electrokinetic nucleic acid extraction is thereby promoted
  • the nucleic acid is extracted electrophoretically from this acid buffered solution.
  • an electrode is introduced into the solution and brought to cationic potential.
  • the electrode in the buffer vessel (4) (FIG. 1) is brought to anodic potential and the Microchannel (1) is filled with an electrically conductive liquid.
  • the composition of the electrolyte depends on the type of immobilization technique. It is preferably an aqueous buffer based on borate, phosphate or citrate. Glycine is also a suitable buffer ion.
  • the buffer concentration is between 10 and 100 mmol / 1.
  • the pH is between 2.5 and 8.5.
  • a modifier, preferably a chaotropic agent, such as urea is optionally added in molar concentration.
  • the task can be carried out using UV or fluorescence detection - according to the previous one
  • Derivatization - can be followed in the microchannel (1).
  • the extracted nucleic acid is immobilized and concentrated in the channel with the aid of the membrane introduced while maintaining the tension (FIG. 2).
  • soft anion exchangers for example based on amines, are also suitable for nucleic acids. They are preferably alkylamine, imidazole or pyrollidone-substituted polymers.
  • the nucleic acids can also be retarded by adsorption on membranes.
  • the membranes contain nanoparticles, preferably silica-based or metal oxide pigments.
  • the nucleic acid concentrated to a few nanoliters can be modified and analyzed in many ways (FIG. 3).
  • the open channel system allows reagents to be added and removed using pressure or tension. The polarity of the voltage is maintained as in the extraction and focusing. Combined with a suitable temperature control, enzymatic cleavages, Sanger sequencing, gene probe hybridization, but also PCR reactions are possible in the microsystem.
  • the nucleic acid can be labeled with intercalating dyes.
  • fluorescent derivatives such as ethidium bromide, acridine orange, or their dimers, such as 1,1 '- (4,4,7,7-tetramethyl-4,7diazaundecamethylene) -bis-4- [3-methyl-2 , 3-dihydromethyl- (benzo-l, 3-oxazole) -2methylidene] quinolinium
  • Tetraiodide (YOYO)
  • the choice of the dye depends primarily on the selected detection unit YOYO is ideal, for example, for fluorescence detection after excitation with an argon laser, while the corresponding YOPRO dimer is ideally suited to the infrared laser. These dyes are also characterized by this from that hardly
  • the positively charged YOYO can be introduced electrokinetically, for example, from the reaction vessel (9) with the connection of the focusing voltage
  • the gene probe consists of a nucleotide sequence that is complementary to the target nucleic acid and carries one or more fluorescent dyes.
  • the choice of the dye is primarily based on the selected detection unit used after excitation with an argon laser
  • Enzyme-catalyzed reactions such as restriction enzyme digestion, PCR
  • Reaction and Sanger sequencing are carried out by transporting the necessary enzymes and required substrates to the nucleic acid in the microchannel
  • the concentrated nucleic acid can be in a suitable buffer
  • the voltage is reversed so that the anode is now in the analysis vessel (14) (FIG. 5).
  • the microchannel and the buffer vessel (11) are preferably filled beforehand with an aqueous buffer of the above-mentioned composition.
  • PCR reactions, CE separations, DNA sequencing, hybridization reactions, mass spectrometric analyzes or molecular biological methods can be carried out.
  • the nucleic acid can be analyzed electrophoretically within the microsystem (FIG. 4). As with the elution, the buffer vessel (10) is brought to anodic potential. In a suitable sieving medium, nucleic acid fragments can be separated depending on their size.
  • the buffer vessels (10, 11) and the microchannel (1) are filled with a polymer-containing buffer solution.
  • a polymer-containing buffer solution are preferably linear soluble polymers, for example acrylamide, polyvinyl alcohol, cellulose (modified and unmodified), dextran or agarose.
  • the other buffer composition corresponds to the general composition.
  • the virus-containing sample is brought to a pH such that the virus to be examined, or the viruses to be examined, carries a negative excess charge. If necessary, nuclei digestion or virus modifications can be carried out beforehand.
  • the suitable buffers have already been described in the general procedure. The pH of the buffer must be well above the pK of the virus. Acid buffers such as sodium citrate are therefore not used, and modification reagents are also not used. Nuclease digestion is preferably carried out by adding RNAses or DNAses
  • the benzonase modification reactions for example, are extremely suitable and can be carried out in the form of staining reactions with intercalating dyes (cf. 14) or by incubation with fluorescence-labeled antibodies. In both cases, the choice of dye depends on the type of detection chosen
  • the negatively charged viruses are electrophoretically extracted from this buffered solution.
  • An electrode is placed in the solution and brought to cationic potential
  • the buffer vessel (4) (Fig. 1) is brought to anodic potential and the microchannel (4) is filled with an electrically conductive liquid.
  • the composition of the electrolyte corresponds to the general buffer composition.
  • the task can be monitored by means of UV or fluorescence a
  • the extracted viruses are introduced into the channel using the
  • Membrane immobilized and concentrated (Fig. 2) The membrane works according to the principle of large exclusion, the pore size being between 10 and 200 nm depending on the virus
  • the viruses concentrated on a few nanoliters can be modified and analyzed in a variety of ways (FIG. 3).
  • the open channel system allows the supply and removal of reagents by means of pressure or
  • the size exclusion membrane In the case of virus lysis, the size exclusion membrane must be dimensioned so that the target proteins or nucleic acids are also retarded. In principle, any lysis protocol is suitable. Denaturing conditions such as extreme pH values, chaotropic reagents or detergents are preferably used. Examples are dilute sodium hydroxide solution, guanidinium hydrochloride or sodium dodecyl sulfate (SDS). Non-ionic detergents (eg NP-40) can be used to remove the lipoprotein membrane from enveloped viruses
  • the concentrated viruses can be eluted in a suitable buffer by applying pressure and / or voltage in a few nanoliters and are available for further analyzes
  • the microchannel (1) and the buffer vessel (11) are preferably filled beforehand with an aqueous buffer of the abovementioned composition.
  • the viruses can be used, for example, to carry out pathogenicity assays or CE separations. After fractionation on a planar analysis target (14), the viruses can be examined directly using electron microscopy, for example
  • the viruses can be analyzed electrophoretically within the microsystem. As with the elution, the buffer vessel (10) is brought to anodic potential (FIG. 4).
  • viruses can also be identified by fluorescence spectroscopy using fluorescent labeling methods for proteins or nucleic acids (cf. 1 4 and 3 4) 3. Proteins
  • the protein-containing sample is brought to a pH value which is at least one log level next to the pK value of the protein. If the solubility properties of the protein allow, the pH is set below the pK of the protein so that the protein is positively charged. In the following, this case will be discussed. For negatively charged proteins, the voltage relationships are reversed accordingly.
  • Suitable buffers meet the general conditions. Alkali-buffered phosphate and citrate buffers are preferably used, e.g. Sodium citrate, 20 mmol / 1, pH 2.5.
  • the positively charged proteins are extracted electrophoretically from this buffered solution.
  • an electrode is placed in the solution and brought to anionic potential.
  • the electrode in the buffer vessel (4) (Fig. 1) is brought to cathodic potential and the microchannel (4) is filled with the buffer.
  • the composition of the electrolyte depends on the type of immobilization technique and corresponds to the general conditions.
  • a modifier preferably an organic solvent, such as e.g. Methanol between 5 and 30% added.
  • the task can be followed in the microchannel (1) by means of UV or fluorescence detection - after prior derivatization.
  • ion exchange membranes are also suitable for proteins.
  • DEAE phases are preferably used as the soft anion exchanger for negatively charged proteins.
  • Quaternary ammonium phases are mainly found as strong anion exchangers Use.
  • carboxylic acid phases are suitable as soft exchangers and sulfonic acid phases are suitable as strong exchangers.
  • the membranes can be coated with appropriate antibodies and thus enriched for affinity.
  • the proteins concentrated on a few nanoliters can be modified and analyzed in many ways (FIG. 3).
  • the open channel system allows reagents to be added and removed using pressure or tension.
  • the polarity of the voltage becomes the same as for the extraction and
  • the protein can be reacted with reactive dyes. It is preferably amine-specific dyes such as e.g. Fluorescein isothiocyanate (FITC).
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • the choice of the dye depends primarily on the selected detection unit. For example, FITC is ideal for fluorescence detection after excitation with an argon laser.
  • the concentrated proteins can be eluted in a suitable buffer by applying pressure and / or voltage in a few nanoliters and are available for further analyzes.
  • the voltage is reversed so that the cathode is now in the analysis vessel (14) (Fig. 5).
  • the microchannel and the buffer vessel (11) previously filled with an aqueous buffer of the above composition.
  • CE analyzes, mass spectrometric analyzes, enzyme assays, binding studies or immunological processes can be carried out as subsequent analyzes.
  • the proteins can be analyzed electrophoretically within the microsystem (FIG. 4).
  • Enzyme substrates, fluorescent binding partners or derivatizing reagents, the proteins can also be identified by fluorescence spectroscopy.
  • the sample containing bacteria is brought to a pH such that the bacterium to be examined has a negative excess charge. If necessary, nuclease digestion or protein modifications can be carried out beforehand.
  • the appropriate buffers have already been described in the general procedure.
  • the pH of the buffer must be well above the pK of the bacterium. Acid buffers such as sodium citrate are therefore not used, and modification reagents are also not used.
  • Nuclease digests are preferably carried out by adding RNAses or DNAses. Benzonase, for example, is extremely suitable. Modification reactions can be carried out in the form of staining reactions with intercalating dyes (cf. 1.4) or by incubation with fluorescence-labeled antibodies. In both cases, the choice of dye depends on the type of detection chosen. 4.2.
  • the negatively charged bacteria are extracted electrophoretically from this buffered solution. For this purpose, an electrode is placed in the solution and brought to cationic potential. The electrode in the
  • Buffer vessel (4) (Fig. 1) is brought to anodic potential and the microchannel (4) is filled with an electrically conductive liquid.
  • the composition of the electrolyte depends on the type of immobilization technique.
  • the task can be followed using UV or fluorescence.
  • the extracted bacteria are immobilized and concentrated in the channel with the help of the membrane introduced (FIG. 2).
  • the membrane works according to the size exclusion principle (ultrafiltration membrane) or the ion exchanger principle (anion exchanger).
  • Membranes are preferably used for sterile filtration with an exclusion size of 0.1-1.45 ⁇ m.
  • anion exchangers as for the proteins can also be used (cf. 3.3.)
  • the bacteria concentrated on a few nanoliters can, for example, be lyophilized on the membrane and then the proteins or
  • Nucleic acids are modified and analyzed in many ways (Fig. 3).
  • the open channel system allows reagents to be added and removed using pressure or tension.
  • all derivatization methods for proteins and nucleic acids are possible in the microsystem (cf. 1.4 - 1.7 and 3.4 -
  • the size exclusion membrane In the case of bacterial lysis, the size exclusion membrane must be dimensioned such that the target proteins or nucleic acids are also retarded.
  • any lysis protocol is suitable. Denaturing conditions such as extreme pH values, chaotropic reagents or detergents are preferably used. Examples are dilute sodium hydroxide solution, guanidinium hydrochloride, urea or sodium dodecyl sulfate (SDS). 4.5.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the concentrated bacteria can be eluted in a suitable buffer by applying pressure and / or voltage in a few nanoliters and are available for further analyzes.
  • the microchannel (1) and the buffer vessel (11) are preferably filled beforehand with an aqueous buffer of the above-mentioned composition.
  • pathogenicity assays or electrophysiological experiments can be carried out with the bacteria, for example.
  • the bacteria can, for example, be examined directly by light or electron microscopy, or e.g. can be identified microbiologically on an agar plate via plaques.
  • the bacteria can be analyzed electrophoretically within the microsystem (FIG. 4).
  • the bacteria can also be identified by fluorescence spectroscopy using fluorescent-labeled antibodies or fluorescent binding partners.
  • the process is characterized above all by the simplified isolation and extreme enrichment rates. If the sample is eluted electrophoretically or with pressure from the microchannel, further nanoanalysis methods can then be carried out. After dilution, the isolated sample is also available for conventional macroscopic analysis methods. The method then represents a very efficient sample preparation module for these techniques
  • the method can thus replace PCR, for example.
  • the method can also be used as a digestion method for viruses, bacteria and other cells.
  • bacterial material is isolated, then the bacterium is digested in the microchannel and the released nucleic acid is derivatized and analyzed
  • the method can advantageously be used for direct nucleic acid sequencing for diagnostics and research.
  • an analysis for hereditary genetic defects, which are caused by deletions, mutations or translocations is possible here.
  • Possible areas of use are cystic fibrosis, Down 's Syndrome, sickle cell amia, Huntington 's chorea, hamophilia A and B
  • a further application of this nucleic acid analysis is in tumor diagnosis and general recognition for genetic predispositions to certain diseases.
  • the analysis of tumor suppressor genes and oncogenes is of particular interest
  • nucleic acid amplification methods such as PCR
  • the method can also be used for direct gene probe analysis of drug-resistant germs or for subclassification
  • the invention also enables the control of genetically engineered products in which freedom from nucleic acids must be guaranteed.
  • Proteins can be used for infection diagnosis. Nucleic acids or proteins from fungi or parasites can also be analyzed for these purposes.
  • the most important viral representatives in this case are HIV lu. 2, HTLV, HSV, CMV, HPV, hepatitis A, B, C, D, E, F, G, VZV, rotaviruses, EBV and adenoviruses.
  • the most important bacterial representatives include chlamydia, mycobacteria, shigella, campylobacter, salmonella, neisserie, staphylococci, streptococci, pneumococci.
  • the most important pathogens in fungi are Candida, Aspergillus and Cryptococcus.
  • Another area of application is the security monitoring of biological samples.
  • the meaning lies here e.g. when checking blood donations and all products made from blood.
  • the areas of application largely correspond to those of infection diagnostics.
  • this method allows the direct, highly sensitive detection of intact
  • Viruses Any, even unknown viruses can be measured directly. This is of enormous importance both for infection diagnosis and for the safety of products made from biological materials, since only special viruses can be detected individually with all other methods.
  • the proteins obtained by electrokinetic sample preparation are more easily accessible for subsequent immunodiagnostic analysis due to their enrichment and purification.
  • Here have different proteins in human diagnostics such.
  • DNA is injected into a microchannel by applying voltage and measured using UV.
  • the experiment should show that it is possible to extract nucleic acid electrokinetically.
  • the amount of DNA is limited to over 100 mg / 1 by the electric current and not by the DNA concentration. This showed that nucleic acid can be electrokinetically concentrated from a solution over a wide concentration range.
  • Table 1 Measurement parameters for electrokinetic nucleic acid injection.
  • pBr-DNA was electrokinetically injected into the microchannel and then electrophoretically mobilized in the channel to the anode. There was a UV between the injection end of the channel and the size exclusion membrane in the channel.
  • nucleic acid For the concentration of nucleic acid it is necessary to transfer the amount of nucleic acid from a particular solution into the microchannel as quantitatively as possible. If the entire nucleic acid is injected, only a very small amount of nucleic acid should be extractable from the same sample vessel after a 2 injection
  • the DNA was stained with the intercalating dye YOYO (Molecular Probes) and detected with laser-induced fluorescence detection (LIF).
  • YOYO (0.4 mmol / 1, in 76 ⁇ l TBE buffer) was placed in front of it and mixed with 1-4 ⁇ l of the pBr-DNA solution (1 mg / 1) and incubated at RT for at least 30 min before the measurement.
  • the measurement parameters are in Table 3
  • the detection profiles were such that after about 10 minutes there was a significant increase in fluorescence, which quickly reached a plateau. After about 30 minutes the fluorescence decreased again, combined with a gradual increase in the current in the channel. The height of the plateau correlated with the amount of DNA. In the second injection, no fluorescence was injected from any of the samples. The data demonstrate the complete extraction of the pBr DNA on the 1st injection. We conclude from the fluorescence course that the entire nucleic acid was completely injected after 30 min.
  • Nucleic acid was injected into the microchannel with the membrane installed using the measurement conditions in Table 2.
  • pBr-DNA 2.5 mg / 1, 50 ⁇ l
  • the separating buffer FIG. 2
  • the DNA was not directly detectable.
  • the voltage was reversed and the concentrated DNA migrated back through the detector as an intense peak after 12 min.
  • Virtually the entire DNA of the 50 ⁇ l sample (0.1 mg) was concentrated in less than 50 nl (1 cm in the capillary). The enrichment factor was therefore a factor of 1000.
  • pBr-DNA was electrokinetically injected as described above and immobilized on the membrane (Tab. 2). After immobilization, the tension was not immediately reversed, but that of DNA on the other side of the membrane.
  • Bran buffer vessel was replaced with a buffer solution containing cationic intercalating dye (YOYO, 0.4 mmol / 1, Molecular Probes). The tension was maintained for an additional 20 minutes with the dye migrating through the microchannel and through the membrane. The DNA was thus incubated on the membrane with YOYO. The mixture was then electrophoresed for another 10 min without dye in order to remove any remaining YOYO from the capillary. Then the voltage was reversed and the retarded and stained DNA was moved past the detector again.
  • YOYO cationic intercalating dye
  • the electrokinetically injected DNA migrated through the UV detector after 2 min.
  • the UV-VIS spectrum of the injected DNA generated by means of diode array detection (DAD) in the microchannel showed the typical UV spectrum with 2 absorption maxima at 200 and 260 nm. After incubation with YOYO on the membrane, the DNA also showed an absorption maximum at 490 nm. This corresponds exactly to the absorption maximum of the DNA intercalated with YOYO. This proved that macromolecules can be derivatized in the microchannel.
  • DAD diode array detection
  • Herpes simplex viruses (type 2) were stained with YOYO (Molecular Probes) and detected with laser-induced fluorescence detection (LIF).
  • YOYO (0.4 mmol / 1, in 76 ⁇ l TBE buffer) was introduced and 4 ⁇ l of the HSV-2 solution (5 ⁇ 10 5 viruses / ml) were added and incubated at RT for at least 30 min before the measurement.
  • the measurement parameters are in Table 3.
  • the few injected, intercalated viruses (10-20) were detected as individual signals. To identify the signals, the same sample was compared under The electrophoresis conditions on a Prince-CE (Lauerlabs) were analyzed with a nanofraction collector (Probot, BAI-Instruments). The end of the microchannel was fractionated in a time-controlled manner on different electron microscopy carriers and examined in the EM after negative contrasting with uranyl acetate.
  • FIG. 1 Schematic representation of the purification apparatus
  • a microchannel (1) with a built-in membrane (2) connects 2 buffer vessels (3,4). These buffer vessels can be brought to different voltage potentials by means of electrodes (5) )
  • the sample to be examined is in (3)
  • Fig. 2 Schematic representation of the concentration.
  • the macromolecule to be investigated was electrokinetically injected into the microchannel (1) with the membrane (2) installed.
  • the sample vessel was already replaced by the concentration buffer (7).
  • the macromolecules migrate to the membrane and are held there
  • Fig. 3 Schematic representation of the sample modification In the reaction vessels (8,9) are the derivatization reagents, which are brought either electrokinetically and / or with the help of pressure to the concentrated macromolecules
  • Fig. 4 Schematic representation of an on-line analysis method.
  • the concentrated and modified macromolecule becomes electrokinetic mobilized in the microchannel (1) past a detector window (12) so that the spectroscopic properties can be analyzed and evaluated (13).
  • Fig. 5 Schematic representation of the fractionation of the purified
  • the concentrated sample is collected in the sample vessel or on the analysis target (14) and is available for further analysis.
  • Fig. 6 Schematic representation of the high-throughput purification apparatus.
  • a variety of microchannels are arranged to be compatible with the sample format (e.g. microtiter plate).
  • the membrane (2) is introduced over the entire format and connected to a second microchannel array (15). The procedure of these multiple arrangements corresponds to Fig. 1-5.
  • Fig. 7 Schematic representation of the enrichment apparatus for fast
  • Fig. 8 Schematic representation of the rapid enrichment from saline

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, daß es erlaubt, Makromoleküle (Nukleinsäuren, Proteine, Viren und Bakterien) aus biologischen Materialien, wie Blut, Serum, Liquor, Urin, Pflanzen, Zellen, Zellüberständen etc. und Aufbereitungen daraus, zu isolieren, aufzukonzentrieren und analytisch zugänglich zu machen. Die Makromoleküle werden zunächst in einem Flachkanal an einer Membran elektrokinetisch aufkonzentriert. Die aufkonzentrierten Makromoleküle können elektrokinetisch über einen Transferkanal in einen analytischen Mikrokanal zur weiteren Prozessierung überführt werden.

Description

Elektrokinetische Probenvorbereitung
Biologische Makromoleküle wie z.B. Proteine und Nukleinsäuren, aber auch kleine Teilchen wie Viren und Bakterien sind sowohl diagnostisch, als auch für die medizi- nische Forschung, von großer Bedeutung.
Die etablierten Verfahren zur Charakterisierung dieser Substanzen aus biologischen Matrizes sind z.T. sehr aufwendig. So wird beispielsweise für Nukleinsäure- Analysen die Target-Nukleinsäure isoliert, anschließend amplifiziert und mit einem geeigneten Analysenverfahren ausgewertet. Die Isolierung ist zeitaufwendig und schwierig zu automatisieren. Um ausreichende Mengen Nukleinsäure für die etablierten Analysenverfahren zu erhalten, muß die Nukleinsäure in einem weiteren Schritt durch Ampli- fikation vervielfältigt werden. Breitere Anwendung hat hier bisher nur die Polymerase Kettenreaktion (PCR) gefunden.
Mit der „Elektrokinetischen Probenvorbereitung" kann die gesamte Nukleinsäure- Analytik von der Isolierung bis zur Auswertung, auch unter Vermeidung der zusätzlichen Amplifikation, mit bisher nicht gekannter Schnelligkeit und Automatisierung durchgeführt werden.
Aufreinigung und Diagnose von Proteinen
Da unterschiedliche Proteine individuelle physikalische Eigenschaften haben, gibt es keine universell anwendbaren Verfahren zur Aufreinigung. Anwendung finden überwiegend chromatographische und elektrophoretische Verfahren, Fällungen, Ultrafiltration, Ultrazentrifugation und die Größenauschlußchromatographie (Doonan, S., Methods Mol. Biol, 1996, 59, Totowa, N.J., Humana, 1996, 405ff). Für diagnostische Anwendungen haben sich immunologische Verfahren durchgesetzt, die das Zielprotein über spezifische Antikörpererkennung nachweisen. Aufreinigung und Diagnose von Nukleinsäuren
Um aus biologischen Material, für diagnostische Anwendungen, Nukleinsäuren zu isolieren, sind, je nach Beschaffenheit des Materials, unterschiedliche Aufschlußverfahren und anschließende Reinigungsverfahren nötig. Dabei muß wiederum gewährleistet sein, daß die zu isolierende Nukleinsäure nicht zerstört wird. Insbesondere R A kann leicht durch ubiquitäre RNAsen degradiert werden, so daß der Zusatz von Inhibitoren für diese störenden Enzyme nötig ist (Walker, J.M., Methods Mol. Biol., 1984, 2, Clifton, N.J., Humana, 1984, 113fϊ). Im folgenden werden die zur Zeit üblichen Ver- fahren umrissen:
Ein einfacher Fall für die Gewinnung von Nukleinsäure ist die Isolierung aus einer reinen Bakterienkultur: Im Falle von E. coli setzt alkalische Lyse die Nukleinsäure frei; nach Zentrifugation und Neutralisation kann dieses Rohprodukt direkt für PCR Ansätze verwendet werden (Rolfs, A. et al. PCR: Clinical Diagnosis and Research,
Berlin, Springer, 1992).
In der Regel ist das Probenmaterial für die medizinische Diagnostik aber heterogener aufgebaut; Blut, Urin, Liquor, Abstrichmaterial, Sputum, Gewebeproben, Faeces, z.B. verlangen nach spezifischen Aufschlußmethoden, die wiederum je nach Fragestellung
(Detektion von Bakterien, Pilzen, Viren oder genomischer Nukleinsäure aus dem Trägerorganismus) modifiziert werden müssen.
Nachfolgend eine kurze Zusammenfassung der gängigsten Aufreinigungsverfahren für diese Proben:
Phenolextraktion der Nukleinsäure mit Proteinase K-Behandlung.
Retardierung der Nukleinsäure an Membranfilter; wird aufgrund der Verstopfüngs- problematik nur für vorgereinigte Proben oder gering belastete Proben - wie Urin - angewandt. Festphasen, an die Nukleinsäuren gebunden werden können, ermöglichen Trennungen von Stör- und Begleitsubstanzen durch Waschschritte. Beispiele hierfür sind: a) Absorption an Glasmilch in Natriumjodidpuffer (Maiwald, M. et al., BlOforum 1994, 17, 232-237.). b) Anlagerung der negativ geladenen Nukleinsäure an schwach basische Polymere (EP 0707077 und US 5434270). c) Zellulosematrizes zur direkten Absorption von Blut, worauf dann alle Behandlungsschritte inklusive Nukleinsäurefreisetzung und Aufreinigung erfolgen. (Del Rio, S.A. et al. Biotechniques, 1996, 20, 970-974). d) Silicamikropartikel, welche auch in Membranen eingebettet sein können, können ebenfalls zur Nukleinsäure-Aufreinigung eingesetzt werden (WO 95/34569). Ionen- austauschermembranen (US 832284) oder chemisch modifizierte Silica-Phasen (EP
0648777) gehören ebenfalls zu dieser Gruppe.
Es sind auch Elektroelutionsapparaturen im Markt (z.B. von Biometra), um makroskopisch Proteine, Nukleinsäuren oder Viren aus Gelen zu extrahieren (EP 380357).
Um ausreichende Mengen an Nukleinsäure zu erhalten, schließt sich an die Isolierung der Nukleinsäuren üblicherweise ein Ampflifikationsschritt an (EP 229701).
Ansätze zur Automation der Nukleinsäure-Analytik gibt es in Form der Anionenaus- tauschchromatographie und der Nukleinsäure-Adsorption mit Pipettierrobotern (BioRobot von Quiagen). In einem japanischen Patent wird die Nukleinsäure in einer Kapillare immobilisiert, um darin die Amplifikation durchführen zu können (JP 7107962).
Aufreinigung und Diagnose von Viren
Viren werden üblicherweise mit folgenden Verfahren isoliert und aufkonzentriert: Ultrazentrifügation, Elektroextraktion, Größenausschlußtrennung, Affinitätschroma- tographie und Fällung (Polson, Alfred, Prep. Biochem., 1993; 23, Dekker, New York,
N. Y., 1993). Für diagnostische Zwecke werden entweder immunologische Verfahren auf die Proteinhulle oder nukleinsaureanalytische Verfahren nach Freisetzung der viralen Nukleinsäuren eingesetzt
Aufreinigung und Charakterisierung von Bakterien
Bakterien werden üblicherweise durch Austreichverfahren auf Nahrmedien vereinzelt und hochgezogen. Für die Isolierung und Charakterisierung stehen immunologische Verfahren - z B durch Fluoreszenzmarkierung - , Nukleinsaurebestimmungsmethoden - nach Zellyse - zur Verfügung.
Alle Verfahren, unabhängig vom Makromolekül, sind zeitaufwendig, beinhalten zahlreiche Verdunnungsschritte und gewährleisten häufig nicht die Abtrennung von Storfaktoren Im nachfolgenden soll der technische Stand der Mikrokanaltechnologie und der amplifikationslosen Nukleinsäure- Analytik kurz skizziert werden
Mikrokanäle
Die Kapillarelektrophorese ist eine relativ junge analytische Trenntechnik (St Claire
R L , Anal. Chem. 1996, 68, 569R-586R ) Das Prinzip beruht auf der Trennung von Analyten in einer elektrolytgefüllten Kapillare durch Anlegen eines Hochspannungsfelds zwischen den Kapillarenden
Kapillarelektrophoretische Analysenverfahren werden seit mehreren Jahren zur Analyse von biologischen Makromolekülen wie Proteinen (WO 93/22665), Nukleinsäuren (Heller, C , J. Chromatogr. A, 1995, 698, 19-31) und neuerdings auch Viren (DE 4438833) eingesetzt Die Detektion erfolgt entweder direkt mit UV oder mittels Flu- oreszenzdetektion nach Markierung der Makromoleküle (Pentoney, S L , Jr , et al Handbook ofCapdlary Electrophoresis, S 147, Landers, J P (Ed ) Boca Raton, CRC
Press, 1994) Fast alle Geratehersteller bieten Analysenkits für die Nukleinsäure- Analyse mit der CE an Seit 1995 gibt es auch einen vollautomatischen Nukleinsäure- Analysator auf Basis der CE, den ABI Prism 310 von Perkin-Elmer (Applied Biosystems). Die Injektion der Nukleinsäure in die Kapillare erfolgt üblicherweise elektrokinetisch durch Anlegen einer Spannung. Die elektrokinetische Aufgabemenge ist aber limitiert, da sonst Peakverbreiterung und Probendiskriminierung auftritt (Butler, J.M., et al. J. Chromatogr. B, 1994, 658, 271-280).
Durch Einführung der laserinduzierten Fluoreszenzdetektion in die Kapillarelektrophorese (St.Claire R.L., Anal. Chem. 1996, 68, 569R-586R), die von Beckman auch bereits kommerzialisiert ist, gelang eine deutliche Empfindlichkeitssteigerung. Damit lassen sich auch intakte Viren mittels CE analysieren (DE 4438833). Proteine können nur nach spezifischer Modifikation mit Fluoreszenz detektiert werden.
Aufkonzentrierung im Mikrokanal
Ein prinzipieller Nachteil der CE ist das geringe Injektionsvolumen, das nur wenige Nanoliter beträgt. Es gibt eine Vielzahl von Versuchen diesen Nachteil zu kompensieren (St.Claire R.L., Anal. Chem. 1996, 68, 569R-586R). Dazu gehören isotacho- phoretische Aufkonzentrierung und Stacking die beide zu einer Fokussierung der Pro- benbestandteile im Injektionsvolumen führen. Von Guzmann wurde 1993 eine spezifische Festphasenadsorption in der Kapillare zur Probenaufkonzentrierung zum Patent angemeldet (WO 93/05390). Durch spezifische molekulare Wechselwirkung werden spezielle Verbindungen einer Probe festgehalten oder durchgelassen. Eine Weiterentwicklung dieser Verfahren wurde von Tomlinson et al. mit der membrane preconcentration capillary electrophoresis gemacht (Tomlinson, A.J., et al. J. High
Res. Chromatogr. 1995, 18, 381-383). Durch Einführen einer Umkehrphasenmembran in die Kapillare werden lipophile Probenbestandteile in einer Festphasenextraktion in der Membran festgehalten, anschließend mit einem organischen Lösungsmittel durch die Membran eluiert und kapillarelektrophoretisch ge- trennt. CE-Chips
Capillary Array Electrophoresis wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen, hauptsächlich für die Nukleinsäure-Sequenzierung, entwickelt und zum Teil auch zum Patent angemeldet (WO 96/04547). In photolitographisch hergestellte Mikrokapillarsystemen wurden fluoreszierende Moleküle spannungsabhängig gesteuert und analysiert.
Ebenfalls auf Basis der Chiptechnologie wurden Mikromaschinen patentiert, die durch ein Netzwerk von Kanälen und elektrischen Schaltern eine Prozessteuerung von Lö- sungen zu synthetischen oder analytischen Zwecken möglich macht (WO 96/15450).
Amplifikationsfreie Nukleinsäure-Analysen
Auf Basis der hohen Empfindlichkeiten der Fluoreszenzdetektion wurde die Durch- flußzytometrie zur single molecule detection zum Patent angemeldet (WO 90/14589).
Die Fluoreszenzkorrelations Spektroskopie wurde ebenfalls für biologische Scree- ningverfahren über single molecule detection eingesetzt (EP 731173). Auch High Throughput Nukleinsäure-Sequenzierung wird auf Basis dieser Technologie bearbeitet (Harding, J.D., et al. Trends in Biotechnology, 1992, 10, 55-57). Diese Verfahren beruhen auf dem Nachweis eines einzelnen Fluoreszenzmoleküls in einem sehr kleinen Volumenelement.
Mit der vorliegenden Erfindung sollte ein automatisiertes Verfahren entwickelt werden, das es erlaubt Makromoleküle (Nukleinsäuren, Proteine, Viren und Bakterien) aus biologischen Materialien, wie z.B. Blut, Blutplasma, Serum, Liquor, Urin, Gewebeproben, Pflanzen, Zellen, Zellüberständen etc. und Aufbereitungen daraus, zu isolieren, aufzukonzentrieren und analytisch zugänglich zu machen.
Der zentrale Bestandteil des Probenvorbereitungsmoduls ist ein thermostatisierbarer Mikrokanal mit einer eingebrachten Membran. Dieser, mit einer leitenden Flüssigkeit gefüllte Kanal, steht auf beiden Seiten in Kontakt mit auswechselbaren oder fest installierten Gefäßen Durch das Anlegen einer Potentialdifferenz zwischen den Probengefaßen können geladene Moleküle elektrophoretisch mobilisiert werden Durch die Möglichkeit eine Druckdifferenz anzulegen kann zusatzlich ein laminarer Fluß im Mikrokanal erzeugt werden Eine vereinfachte schematische Darstellung befindet sich in Fig 1-5
In einem Mikrokanal (1) wird eine Membran (2) eingebracht die geeignet ist das gewünschte Makromolekül zurückzuhalten Durch Anlegen einer Druckdifferenz (6) und/oder einer Spannung (5) an die Enden des Mikrokanals (3,4) wird ein Teil der Probe in den Kanal injiziert (Fig 1) Die Injektion wird so lange fortgesetzt bis sich eine ausreichende Menge des gewünschten Makromoleküls im Mikrokanal befindet Durch die Kombination der Parameter pH- Wert, Membraneigenschaften, Beschaffenheit des Mikrokanals, Polarität der Spannung und Richtung des Druckgradienten kann die Injektion auf das gewünschte Zielmolekul abgestimmt werden, so daß entweder nur das gewünschte Makromolekül in den Kanal gelangt oder durch die Membran festgehalten wird
Der Mikrokanal hat einen Innendurchmesser von 10 - 100 μm und eine Gesamtlange von 3 - 50 cm Der Mikrokanal wird aus einem elektrisch nichtleitendem Material wie Polymer, Keramik, Glas oder Quarz gefertigt Es sind prinzipiell alle synthetischen
Polymere geeignet Das Polymer muß innert gegenüber den eingesetzten Pufferlosungen sein und ist idealerweise durchlassig für optische Detektionsverfahren (z B Polycarbonat, Polyesteracrylat, Polymethacrylat, Polyurethan, Polyacrylamid) aber auch PTFE ist geeignet Um gunstige Oberflacheneigenschaften zu erhalten kann der Kanal innen mit einem Polymer beschichtet werden (z B Polyacrylamid, Silanol oder Polyvinylalkohol)
Unabhängig vom Typ des untersuchten Makromoleküls können Membranen eingesetzt werden die nach dem Großenausschlußprinzip arbeiten (Ultrafiltrationsmem- bran) Der Großenauschlußbereich muß der Molekulgroße des Makromoleküls angepaßt werden Die Spannweite der Membranen reicht von Mw 3000, für kleine Proteine oder Nukleotide, über Großenausschlußbereiche im unteren nm-Bereich, für große Nukleinsäuren und Viren, bis hin zu 0,45 mm, für Bakterien und Zellen Bei den Membranen handelt es sich um mikrostrukturierte Polymere, vorzugsweise um Polyethersulfon (PES), Polyester, vliesgestütztem Acrylpolymer, Polytetrafluorethylen (PTFE), Polysulfon, Polypropylen (PP), Glasfaser, Nylon oder Polycarbonat. Zusätzlich können lonenaustauschmembranen und Adsorptionsphasen eingesetzt werden. Die Wahl dieser Membranen richtet sich aber nach der Art des
Makromoleküls und wird daher individuell behandelt.
Nach optimalem Wechsel des Probengefäßes (3) gegen ein Konzentrationspuffergefäß (7) wird das injizierte Makromolekül durch Anlegen einer Druckdifferenz (6) und/oder einer Spannung (5) vor oder in der Membran (2) aufkonzentriert (Fig. 2).
Das gewünschte Makromolekül befindet sich dann in einem Volumen von wenigen Nanolitern.
Nach optimalem Wechsel der Gefäße (4,7) gegen die Reagenziengefäße (8,9) können die dort enthaltenen Lösungen, oder Bestandteile daraus, durch Anlegen einer
Druckdifferenz (6) und/oder einer Spannung (5) in den Mikrokanal (1) gebracht werden (Fig. 3). Die Bedingungen werden so gewählt, daß das Zielmolekül dabei aufkonzentriert bleibt. Das Zielmolekül kann auf diese Weise enzymatisch oder chemisch modifiziert, und/oder durch Hybridisierung bzw. immunologische Erkennung spezifisch erkannt werden. Die Thermostatisierbarkeit des Mikrokanals (1) und die Möglichkeit die Reagenziengefäße mehrfach zu wechseln erlaubt komplexe Umsetzungen und zyklische Prozesse. In diesem Modifizierungsschritt werden auch eventuell notwendige Derivatisierungsreaktionen für eine Fluoreszenz, Chemielumineszens oder laserinduzierte Fluoreszenzdetektion durchgeführt.
Die erforderlichen Reaktionstemperaturen werden durch Thermostatisierung des Mikrokanals (1) erreicht. Dazu wird entweder entsprechend temperierte Luft oder Flüssigkeit am Mikrokanal vorbeigeleitet. Die Wandstärke des Mikrokanals wird dabei so gewählt, daß ausreichende Wärmeabführ gewährleistet ist.
Nach optimalem Wechsel der Reagenziengefäße (8,9) gegen die Puffergefäße (10,1 1) wird das Zielmolekül, durch Anlegen einer Druckdifferenz (6) und/oder einer Spannung (5) mobilisiert (Fig. 4). Durch optische Detektionsverfahren (12), wie Absorption oder Fluoreszenz, kann das Molekül direkt im Mikrokanal (1) analytisch bestimmt werden (13) Es stehen die analogen Detektionsverfahren wie in der CE zur Verfügung (St.Claire R.L , Anal. Chem. 1996, 68, 569R-586R)
Dazu wird der Mikrokanal entweder komplett oder an einer Stelle transparent für optische Strahlung gemacht Dazu muß die Transmission der Anregungsstrahlung und der Fluoreszenzstrahlung gewahrleistet sein Vorzugsweise handelt es sich um die eingangs erläuterten nichtleitenden Materialien Die Fluoreszenzstrahlung wird in einem definierten Winkel von 0-180° senkrecht oder in Reflexion zur Einstrahlwellenlange gemessen Vorzugsweise wird bei 45° oder 90° eingestrahlt.
Das hochkonzentrierte Analysentarget steht aber auch für weitergehende Analysen zur Verfügung (Fig 5) So kann das Zielmolekul in das Analysengefaß (14) oder in oder auf ein beliebiges anderes Analysentarget fraktioniert werden
Im Analysengefaß (14) befinden 1-1000 ml eines für die weitere Analyse geeigneten Puffers Beispielsweise handelt es sich um PBS-Puffer, Tris/Borat oder einen Tris- Glycin-Puffer. Bei dem Analysengefaß (14) kann es sich auch um ein planares Analysentarget handeln, beispielsweise um einen massenspektrometrischen Probentrager Der elektrische Kontakt wird entweder direkt über das leitende
Analysentarget erreicht oder durch Benetzung der Oberflache zwischen Elektrode und Mikrokanal mit einer elektrisch leitenden Flüssigkeit.
Wird der Kanal zusatzlich verzweigt kann das aufkonzentrierte Zielmolekül durch Umschalten von Druck oder Spannung in weitere Kanäle für weitergehende Analysen oder Umsetzungen gebracht werden und ist daher direkt kompatibel mit der CE-Chip- technologie (WO 96/04547)
Fraktionierte Makromoleküle können mit allen denkbaren Verfahren weiter analysiert werden Das hochkonzentrierte Makromolekül wird in weniger als einem Mikroliter eluiert und kann direkt in geeignete flüssige Matrizes oder auch auf feste Probentrager aufgebracht werden Eine schematische Darstellung des parallelen Aufbaus befindet sich in Fig 6 Die Mi- krokanale (1) werden aus nichtleitenden Materialien, wie Polymer, Keramik, Glas, Quarz oder Keramik (15) hergestellt und gegebenenfalls beschichtet Die Kanalblocke werden mit einer Membranzwischenschicht (2) zusammengefügt, so daß die Kanäle an der Membran aufeinanderstoßen Die Anordnung der Kanäle richtet sich nach dem
Probenformat Nicht dargestellt sind die nachfolgenden Zusatzeinrichtungen Zur Abführ der Joulschen Warme werden gegebenenfalls zusatzliche Thermostatisierelemente eingeführt Die Kanäle werden an den Enden so verjungt, daß Sie in jeweiligen Gefäße eingeführt werden können oder sind dicht mit fest installierten Gefäßen verbunden Für den elektrischen Kontakt werden, entweder an den Kanalenden oder in den Gefäßen, Elektroden angebracht und mit einer Hochspannungsquelle versorgt
Für die Thermostatisierung werden beispielsweise Kanäle in den Analysenblock gelegt, die senkrecht zur Richtung und zwischen den Ebenen der Mikrokanale liegen Durch diese Kanäle kann entsprechend temperierte Luft oder Flüssigkeit gepumpt werden
Für eine deutlich schnellere Aufkonzentrierung der Proben wurde eine parallele Kapillaranordnung entwickelt Die schematische Darstellung dieses Moduls befindet sich in Fig 7 Neben dem Mikrokanal (1) befindet sich der deutlich breitere Kanal
(16) Die Hohe des Kanals entspricht der Dimension des Mikrokanals (10-100 μm), so daß die Joulsche Warme nach wie vor gut abgeführt werden kann Die Breite des Kanals (100 μm bis 10 mm) erlaubt aber Flusse die um bis zu 103 hoher liegen als im Mikrokanal (1) Die Membran wird zwischen die Modulblocke (15) eingespannt Das gesamte Modul ist damit 3 bis 10 cm lang, 1 bis 50 mm breit und 0, 1 bis 50 mm stark
Die Kanalenden sind wiederum entweder mit austauschbaren oder fest installierten Probengefaßen verbunden Durch parallele Anordnung kann auch ein analoger Aufbau wie in Fig 6 erreicht werden Die Makromoleküle werden im Kanal (16) aufkonzentriert und dann über den Transferkanal (17) m den Mikrokanal überf hrt und analog den Verfahren aus Fig 1-6 weiter bearbeitet Die schematische Anreicherung von Makromolekülen mit dieser schnellen Aufkonzentπerung ist am Beispiel von Nukleinsäuren nachfolgend beschrieben Die Anreicherung von Nukleinsäure aus salzhaltiger Losung erfolgt durch Anlegen einer Spannung an den Flachkanal (16) (Fig 8a) Neben dem Überschuß an kleinen Anionen (kleine schwarze Kugeln) wird auch die Nukleinsäure aus der Probe injiziert Die anionischen Moleküle wandern durch die Membran (2) und werden damit von der Nukleinsäure entfernt Die Spannung wird so lange beibehalten, bis alle Nukleinsäuren an der Membranoberflache immobilisiert sind (Fig 8b) Wird nun zwischen dem Flachkanal (16) und dem Mikrokanal (1), wie angegeben eine Spannung angelegt, so wandert die aufgereinigte und aufkonzentrierte Nukleinsäure von der großen Membranoberfache des Flachkanals (16) zur Membran des Mikrokanals (Fig 8c) und steht anschließend für die weitere Behandlung und Analyse (Fig 3-6) zur Verfügung
Bei diesem Transferschritt können auch simultan Modifizierungsreaktionen am aufkonzentrierten Makromolekül durchgeführt werden
Beschreibung der Nukleinsäuren-Aufkonzentrierung
1 1 Nukleinsäure wird mit einem geeigneten, etablierten Verfahren (Lyse, Hydrolyse, Ultraschall, etc ) aus der zu untersuchenden Probe freigesetzt und mit einem geeigneten sauren Extraktionspuffer versetzt Der Puffer muß so konzipiert sein, daß nichtnukleotidische Bestandteile der Losung keine anionische Uberschußladung tragen Unterhalb eines pH-
Werts von ca 5 zeigen Proteine keine negative Uberschußladung mehr Es können anorganische Sauren wie Salzsaure, Phosphorsaure oder Schwefelsaure wie auch organische Phosphor saurederivate oder Sul- fonsauren eingesetzt werden Vorzugsweise wird aber ein polymerge- bundener, saurer Ionenaustauscher (z B Polystyrolsulfonsaure) eingesetzt Durch Verwendung des Ionenaustauschers wird der saure pH- Wert erreicht ohne zusatzlich Anionen in die Losung einzuführen Die elektrokinetische Nukleinsaure-Extraktion wird dadurch begünstigt
1 2 Die Nukleinsäure wird aus dieser sauer gepufferten Losung elektro- phoretisch extrahiert Dazu wird m die Losung eine Elektrode eingeführt und auf kationisches Potential gebracht Die Elektrode im Puffergefaß (4) (Fig 1) wird auf anodisches Potential gebracht und der Mikrokanal (1) wird mit einer elektrisch leitenden Flüssigkeit gefüllt. Die Zusammensetzung des Elektrolyts richtet sich nach der Art der Immobilisierungstechnik. Vorzugsweise handelt es sich um einen wäßrigen Puffer auf Borat-, Phosphat- oder Citrat-Basis. Auch Glycin ist ein geeignetes Pufferion. Die Pufferkonzentration liegt zwischen 10 und 100 mMol/1. Der pH-Wert liegt zwischen 2,5 und 8,5. Beispielsweise Natriumeitrat (20 mmol/1, pH 5.0) oder Tris/Borat (100 mmol/1, pH 8,5). Wahlweise wird ein Modifier, vorzugsweise ein chaotropes Agens, wie z.B. Harnstoff in molarer Konzentration zugesetzt. Die Aufgabe kann mittels UV- oder Fluoreszenzdetektion - nach vorheriger
Derivatisierung - im Mikrokanal (1) verfolgt werden.
1.3. Die extrahierte Nukleinsäure wird im Kanal mit Hilfe der eingebrachten Membran unter Beibehaltung der Spannung immobilisiert und konzen- triert (Fig. 2). Für Nukleinsäuren eignen sich zusätzlich zu den Größen- ausschlußmembranen auch weiche Anionenaustauscher beispielsweise auf Aminbasis. Vorzugsweise handelt es sich um Alkylamin-, Imidazol- oder Pyrollidon- substituierte Polymere. Die Nukleinsäuren können auch durch Adsorption an Membranen retardiert werden. Beispiels- weise enthalten die Membranen Nanopartikel, vorzugsweise Silica- basierend oder Metalloxidpigmente. Mit immobilisierten Oligonukleo- tiden werden spezifische Nukleinsäurestränge durch Festphasenhybridi- sierung immobilisiert.
1.4. Die auf wenige Nanoliter konzentrierte Nukleinsäure kann vielfältig modifiziert und analysiert werden (Fig. 3). Das offene Kanalsystem erlaubt die Zuführung und Abführung von Reagenzien mittels Druck oder Spannung. Die Polarität der Spannung wird wie bei der Extraktion und Fokussierung beibehalten. Kombiniert mit einer geeigneten Temperaturregelung sind in dem Mikrosystem enzymatische Spaltungen, Sanger-Sequenzierungen, Gensonden-Hybridisierung, aber auch PCR-Reaktionen möglich. Beispielsweise kann die Nukleinsäure mit interkalierenden Farbstoffen markiert werden. Vorzugsweise handelt es sich um fluoreszierende Derivate, wie Ethidiumbromid, Acridinorange, bzw deren Dimeren wie 1,1 '-(4,4,7,7-Tetramethyl-4,7diazaundecamethylen)-bis-4-[3-me- thyl-2,3-dihydromethyl-(benzo-l,3-oxazol)-2methyliden]-chinolinium
Tetraiodid (YOYO) Die Wahl des Farbstoffes richtet sich in erster Linie nach der gewählten Detektionseinheit YOYO ist beispielsweise ideal für die Fluoreszenzdetektion nach Anregung mit einem Argon- Laser, wahrend das entsprechende YOPRO-Dimer ideal zum Infrarot- Laser paßt Diese Farbstoffe zeichnen sich auch dadurch aus, daß kaum
Hintergrundfluoreszenz auftritt, da diese Farbstoffe nur im inter- kalierten Zustand fluoreszieren Das positiv geladene YOYO kann beispielsweise vom Reaktionsgefaß (9), unter Beischaltung der Fukussier- spannung, elektrokinetisch eingeführt werden
Deutlich höhere Spezifitat kann beispielsweise durch eine fluoreszenzmarkierte Gensonde erreicht werden Die Gensonde besteht aus einer zur Zielnukleinsaure komplementären Nukleotidsequenz die eine oder mehrere Fluoreszenzfarbstoffe tragt Die Wahl des Farbstoffes richtet sich in erster Linie nach der gewählten Detektionseinheit Fluorescein- isothiocyanat oder reaktive Cumarinderivate werden vorzugsweise für die Fluoreszenzdetektion nach Anregung mit einem Argon-Laser eingesetzt
Enzymkatalysierte Reaktionen wie Restriktionsenzymverdau, PCR-
Reaktion und Sanger Sequenzierung werden durchgeführt indem die erforderlichen Enzyme und benotigten Substrate zur Nukleinsäure im Mikrokanal transportiert werden
Die konzentrierte Nukleinsäure kann in einem geeigneten Puffer durch
Anlegen von Druck und/oder Spannung in wenigen Nanoliter eluiert werden und steht für weitere Analysen zur Verfügung
1 5 Die Spannung wird dazu umgepolt, so daß nun die Anode im Analysengefäß (14) (Fig. 5) liegt. Vorzugsweise wird der Mikrokanal und das Puffergefäß (11) vorher mit einem wäßrigen Puffer der oben genannten Zusammensetzung gefüllt. Als nachfolgende Analysen können PCR-Reaktion, CE-Trennungen, DNA-Sequenzierungen, Hybridisie- rungsreaktionen massenspektrometrische Analysen oder molekularbiologische Verfahren durchgeführt werden.
1.6. Innerhalb des Mikrosystems ist die Nukleinsäure elektrophoretisch analysierbar (Fig. 4). Wie bei der Elution wird das Puffergefäß (10) dabei auf anodisches Potential gebracht. In einem geeigneten Siebmedium können Nukleinsäure-Fragmente größenabhängig getrennt werden.
Die Puffergefäße (10,11) sowie der Mikrokanal (1) werden dazu mit einer polymerhaltigen Pufferlösung gefüllt. Vorzugsweise handelt es sich dabei um lineare lösliche Polymere zum Beispiel Acrylamid, Poly- vinylalkohol, Zellulose (modifiziert und unmodifiziert), Dextran, oder Agarose. Die sonstige Pufferzusammensetzung entspricht der allgemeinen Zusammensetzung.
1.7. Durch Verwendung fluoreszenzmarkierter Sonden, fluoreszenzmarkierter Terminatoren in der Sanger-Sequenzierung oder interkalieren- der Farbstoffe ist eine direkte Fluoreszenzdetektion der Nukleinsäure im Mikrosystem möglich.
Viren
2.1. Die virushaltige Probe wird auf einen solchen pH-Wert gebracht, daß das zu untersuchende Virus, oder die zu untersuchenden Viren, eine negative Überschußladung trägt. Falls erforderlich können vorher Nuk- leaseverdaus oder Virusmodifikationen durchgeführt werden. Die geeigneten Puffer sind bereits im allgemeinen Verfahren beschrieben worden Der pH- Wert des Puffers muß deutlich über dem pK-Wert des Virus liegen Auf saure Puffer wie Natriumeitrat wird daher verzichtet, ebenso finden Modifizierungsreagenzien keine Anwendung Nukleaseverdaus werden vorzugsweise durch Zugabe von RNAsen oder DNAsen durchgeführt Hervorragend geeignet ist beispielsweise die Benzonase Modifizierungsreaktionen können in Form von Anfar- bungsreaktionen mit interkalierenden Farbstoffen (vgl 1 4) oder durch Inkubation mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern durchgeführt wer- den. Die Wahl des Farbstoffes richtet sich in beiden Fallen nach der gewählten Detektionsart
Die negativ geladenen Viren werden aus dieser gepufferten Losung elektrophoretisch extrahiert Dazu wird in die Losung eine Elektrode gebracht und auf kationisches Potential gebracht Die Elektrode im
Puffergefaß (4) (Fig 1) wird auf anodisches Potential gebracht und der Mikrokanal (4) wird mit einer elektrisch leitenden Flüssigkeit gefüllt Die Zusammensetzung des Elektrolyts entspricht der allgemeinen Pufferzusammensetzung Die Aufgabe kann mittels UV oder Fluores- zenz verfolgt werden Wahrend der Injektion kann zusatzlich eine
Druckdifferenz zwischen den Puffergefäßen (3 und 4) angelegt werden
Die extrahierten Viren werden im Kanal mit Hilfe der eingebrachten
Membran immobilisiert und konzentriert (Fig 2) Die Membran ar- beitet nach dem Großenausschlußprinzip, wobei die Porengroße virus- abhangig zwischen 10 und 200 nm liegt
Die auf wenige Nanoliter konzentrierten Viren können vielfaltig modifiziert und analysiert werden (Fig 3) Das offene Kanalsystem erlaubt die Zuführung und Abführung von Reagenzien mittels Druck oder
Spannung Kombiniert mit einer geeigneten Temperaturregelung sind in dem Mikrosystem alle Derivatisierungsverfahren für Proteine und Nukleinsäuren möglich (vgl 1 4 und 3 4) Die Viren können auch auf der Membran lysiert und anschließend die Nukleinsäuren und/oder die Proteine analysiert werden (vgl 1 4-1 7 und 3 4-3.7)
Die Größenausschlußmembran muß im Fall der Viruslyse so dimensio- niert sein, daß die Zielproteine, bzw Nukleinsäuren ebenfalls retardiert werden. Es ist prinzipiell jedes Lyseprotokoll geeignet. Vorzugsweise finden denaturierende Bedingungen wie extreme pH- Werte, chaotrope Reagenzien oder Detergenzien Anwendung Beispiele sind verd Natronlauge, Guanidinium-Hydro chlorid oder Natriumdodecylsulfat (SDS) Durch Verwendung nichtionischer Detergenzien (z B NP-40) kann von behüllten Viren die Lipoproteinmembran entfernt werden
Die konzentrierten Viren können in einem geeigneten Puffer durch Anlegen von Druck und/oder Spannung in wenigen Nanoliter eluiert werden und stehen für weitere Analysen zur Verfügung
Die Spannung wird dazu umgepolt, so daß nun die Anode im Analysengefaß (14) (Fig 5) liegt Vorzugsweise wird der Mikrokanal (1) und das Puffergefaß (11) vorher mit einem wäßrigen Puffer der oben genannten Zusammensetzung gefüllt Nach Fraktionierung in ein puffergefülltes Analysengefaß (14) können mit den Viren beispielsweise Pathogenitatsassays oder CE-Trennungen durchgeführt werden Nach Fraktionierung auf ein planares Analysentarget (14) können die Viren beispielsweise direkt elektronenmikroskopisch untersucht wer- den
Innerhalb des Mikrosystems sind die Viren elektrophoretisch analysierbar Wie bei der Elution wird das Puffergefaß (10) dabei auf anodisches Potential gebracht (Fig 4)
Durch Verwendung fluoreszenzmarkierender Verfahren für Proteine oder Nukleinsäuren (vgl 1 4 und 3 4) können die Viren auch fluores- zenzspektroskopisch identifiziert werden 3. Proteine
3.1. Die proteinhaltige Probe wird auf einen pH- Wert gebracht der mindestens eine log-Stufe neben dem pK-Wert des Proteins liegt. Wenn es die Löslichkeitseigenschaften des Proteins erlauben, wird der pH- Wert unterhalb des pK- Werts des Proteins gelegt, so daß das Protein positiv geladen vorliegt. Im folgenden soll dieser Fall durchdiskutiert werden. Für negativ geladene Proteine kehren sich die Spannungsverhältnisse entsprechend um. Geeignete Puffer entsprechen den allgemeinen Bedingungen. Vorzugsweise finden alkaligepufferte Phosphat- und Ci- tratpuffer Anwendung, z.B. Natriumeitrat, 20 mmol/1, pH 2,5.
3.2. Die positiv geladenen Proteine werden aus dieser gepufferten Lösung elektrophoretisch extrahiert. Dazu wird in die Lösung eine Elektrode gebracht und auf anionisches Potential gebracht. Die Elektrode im Puffergefäß (4) (Fig. 1) wird auf kathodisches Potential gebracht und der Mikrokanal (4) wird mit dem Puffer gefüllt. Die Zusammensetzung des Elektrolyts richtet sich nach der Art der Immobilisierungstechnik und entspricht den allgemeinen Bedingungen. Wahlweise wird ein Mo- difier, vorzugsweise ein organisches Lösungsmittel, wie z.B. Methanol zwischen 5 und 30 % zugesetzt. Die Aufgabe kann mittels UV- oder Fluoreszenzdetektion - nach vorheriger Derivatisierung - im Mikro- kanal ( 1 ) verfolgt werden.
3.3. Die extrahierten Proteine werden im Kanal mit Hilfe der eingebrachten
Membran immobilisiert und konzentriert (Fig. 2). Neben den Größen- ausschlußmembran eignen sich für Proteine auch Ionenaustauscher- membranen. Für negativ geladene Proteine finden als weiche Anionen- austauscher vorzugsweise DEAE-Phasen Anwendung. Als starke Anionenaustauscher finden hauptsächlich quartäre Ammoniumphasen Verwendung. In dem hier diskutierten Fall der kationischen Proteine eignen sich als weiche Austauscher hauptsächlich Carbonsäure-Phasen und als starke Austauscher Sulfonsäurephasen. Für spezielle Proteine können die Membranen mit entsprechenden Antikörpern belegt werden und so über Affinität angereichert werden.
3.4. Die auf wenige Nanoliter konzentrierten Proteine können vielfältig modifiziert und analysiert werden (Fig. 3). Das offene Kanalsystem erlaubt die Zuführung und Abführung von Reagenzien mittels Druck oder Spannung. Die Polarität der Spannung wird wie bei der Extraktion und
Fokussierung beibehalten. Kombiniert mit einer geeigneten Temperaturregelung sind in dem Mikrosystem enzymatische Spaltungen, Komplexierungen, chemische Derivatisierungen oder Antikörperbindungen möglich.
Beispielsweise kann das Protein mit Reaktivfarbstoffen umgesetzt werden. Vorzugsweise handelt es sich um aminspezifische Farbstoffe wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC). Die Wahl des Farbstoffes richtet sich in erster Linie nach der gewählten Detektionseinheit. FITC ist beispielsweise ideal für die Fluoreszenzdetektion nach Anregung mit einem Argon-Laser.
Deutlich höhere Spezifität kann beispielsweise durch fluoreszenzmarkierten Antikörpern erreicht werden. Bei der anschließenden Trennung wird dann der Protein-Antikörper-Komplex mittels Fluoreszenz bestimmt.
3.5. Die konzentrierten Proteine können in einem geeigneten Puffer durch Anlegen von Druck und/oder Spannung in wenigen Nanolitern eluiert werden und stehen für weitere Analysen zur Verfügung.
Die Spannung wird dazu umgepolt, so daß nun die Kathode im Analysengefäß (14) (Fig. 5) liegt. Vorzugsweise wird der Mikrokanal und das Puffergefäß (11) vorher mit einem wäßrigen Puffer der oben genannten Zusammensetzung gefüllt. Als nachfolgende Analysen können CE-Trennungen, massenspektrometrische Analysen, Enzym- assays, Bindungsstudien oder immunologische Verfahren durchgeführt werden.
3.6. Innerhalb des Mikrosystems sind die Proteine elektrophoretisch analysierbar (Fig. 4).
3.7. Durch Verwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper, fluoreszierender
Enzymsubstrate, fluoreszierender Bindungspartner oder Derivatisie- rungsreagenzien können die Proteine auch fluoreszenzspektroskopisch identifiziert werden.
4. Bakterien
4.1. Die bakterienhaltige Probe wird auf einen solchen pH- Wert gebracht, daß das zu untersuchende Bakterium eine negative Überschußladung trägt. Falls erforderlich können vorher Nukleaseverdaus oder Protein- modifikationen durchgeführt werden.
Die geeigneten Puffer sind bereits im allgemeinen Verfahren beschrieben worden. Der pH- Wert des Puffers muß deutlich über dem pK-Wert des Bakterium liegen. Auf saure Puffer wie Natriumeitrat wird daher verzichtet, ebenso finden Modifizierungsreagenzien keine Anwendung.
Nukleaseverdaus werden vorzugsweise durch Zugabe von RNAsen oder DNAsen durchgeführt. Hervorragend geeignet ist beispielsweise die Benzonase. Modifizierungsreaktionen können in Form von Anfär- bungsreaktionen mit interkalierenden Farbstoffen (vgl. 1.4) oder durch Inkubation mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern durchgeführt werden. Die Wahl des Farbstoffes richtet sich in beiden Fällen nach der gewählten Detektionsart. 4.2. Die negativ geladenen Bakterien werden aus dieser gepufferten Lösung elektrophoretisch extrahiert. Dazu wird in die Lösung eine Elektrode gebracht und auf kationisches Potential gebracht. Die Elektrode im
Puffergefäß (4) (Fig. 1) wird auf anodisches Potential gebracht und der Mikrokanal (4) wird mit einer elektrisch leitenden Flüssigkeit gefüllt.
Die Zusammensetzung des Elektrolyts richtet sich nach der Art der Immobilisierungstechnik. Die Aufgabe kann mittels UV oder Fluoreszenz verfolgt werden.
4.3. Die extrahierten Bakterien werden im Kanal mit Hilfe der eingebrachten Membran immobilisiert und konzentriert (Fig. 2). Die Membran arbeitet nach dem Größenausschlußprinzip (Ultrafiltrationsmem- bran) oder dem Ionenaustauscherprinzip (Anionenaustauscher). Vorzugsweise finden Membranen für die Sterilfiltration mit einer Aus- schlußgröße von 0, 1 - 0,45 μm Verwendung. Es können aber auch die gleichen Anionenaustauscher wie für die Proteine eingesetzt werden (vgl. 3.3.)
4.4. Die auf wenige Nanoliter konzentrierten Bakterien können beispiels- weise auf der Membran lyophilisiert und anschließend die Proteine oder
Nukleinsäuren vielfältig modifiziert und analysiert werden (Fig. 3). Das offene Kanalsystem erlaubt die Zuführung und Abführung von Reagenzien mittels Druck oder Spannung. Kombiniert mit einer geeigneten Temperaturregelung sind in dem Mikrosystem alle Derivatisierungsver- fahren für Proteine und Nukleinsäuren möglich (vgl. 1.4 - 1.7 und 3.4 -
3.7).
Die Größenausschlußmembran muß im Fall der Bakterienlyse so dimensioniert sein, daß die Zielproteine, bzw. Nukleinsäuren ebenfalls retardiert werden. Es ist prinzipiell jedes Lyseprotokoll geeignet. Vor- zugsweise finden denaturierende Bedingungen wie extreme pH- Werte, chaotrope Reagenzien oder Detergenzien Anwendung. Beispiele sind verd. Natronlauge, Guanidinium-Hydrochlorid, Harnstoff oder Na- triumdodecylsulfat (SDS). 4.5. Die konzentrierten Bakterien können in einem geeigneten Puffer durch Anlegen von Druck und/oder Spannung in wenigen Nanoliter eluiert werden und stehen für weitere Analysen zur Verfügung.
Die Spannung wird dazu umgepolt, so daß nun die Anode im Analysengefäß (14) (Fig. 5) liegt. Vorzugsweise wird der Mikrokanal (1) und das Puffergefäß (11) vorher mit einem wäßrigen Puffer der oben genannten Zusammensetzung gefüllt. Nach Fraktionierung in ein puf- fergefülltes Analysengefäß (14) können mit den Bakterien beispielsweise Pathogenitätsassays oder elektrophysiologische Experimente durchgeführt werden. Nach Fraktionierung auf ein planares Analysentarget (14) können die Bakterien beispielsweise direkt licht- oder elektronenmikroskopisch untersucht werden, oder z.B. mikrobiolo- gisch auf einer Agarplatte über Plaques identifiziert werden.
4.6. Innerhalb des Mikrosystems sind die Bakterien elektrophoretisch analysierbar (Fig. 4).
4.7. Durch Verwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper oder fluoreszierender Bindungspartner können die Bakterien auch fluoreszenzspek- troskopisch identifiziert werden.
Alle gängigen Verfahren der Makromolekül-Isolierung setzen die Prozessierung des gesamten Probenvolumens durch das Extraktionsmedium voraus. Die Handhabung großvolumiger Proben verhindert aber die Miniaturisierung die ihrerseits unbedingt nötig ist um die Analysengeschwindigkeit und die Sensitivität zu steigern. Durch die Kombination von direkter elektrophoretischer Extraktion mit einer Immobilisierungsmembran im Mikromaßstab ist es erstmals möglich große Probenvolumina direkt mit einer Nanoanalysentechnik zu kombinieren.
Gegenüber den etablierten Verfahren zeichnet sich das Verfahren vor allem durch die vereinfachte Isolierung und extreme Anreicherungsraten aus. Wird die Probe elektrophoretisch oder mit Druck aus dem Mikrokanal eluiert, können anschließend weitere Nanoanalysenverfahren durchgeführt werden Nach Verdünnung steht die isolierte Probe auch für konventionelle makroskopische Analysenverfahren zur Verfügung Das Verfahren stellt dann ein sehr effizientes Probenvorbereitungsmodul für diese Techniken dar
Durch die Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren können in vielen Fallen zusätzliche Amplifikationsschritte vermieden werden Das Verfahren kann damit beispielsweise die PCR ersetzen.
Das Verfahren kann auch als Aufschlußverfahren für Viren, Bakterien und andere Zellen eingesetzt werden Beispielsweise wird Bakteriummaterial isoliert, anschließend wird das Bakterium im Mikrokanal aufgeschlossen und die freigesetzte Nukleinsäure derivatisiert und analysiert
Das Verfahren kann vorteilhaft zur direkten Nukleinsäure-Sequenzierung für Diagnostik und Forschung eingesetzt werden Im Falle menschlicher DNA ist hierbei eine Analyse auf erbliche genetische Defekte möglich, die durch Deletionen, Mutationen oder Translokationen hervorgerufen werden Als mögliche Einsatzgebiete seien hier genannt Cystische Fibröse, Down's Syndrom, Sichelzellanamie, Huntington" s Chorea, Hamophilie A und B Eine weitere Anwendung dieser Nukleinsaureanalytik liegt in der Tumordiagnostik sowie der allgemeinen Erkennung für genetische Pradispositionen für bestimmte Krankheiten Hierbei ist die Analyse von Tumorsuppressorgenen und Oncogenen von besonderem Interesse
Eine weitere Verwendung liegt in der Kombination mit Nukleinsaureamplifizierungs- verfahren (wie z B PCR)
Das Verfahren kann auch zur direkten Gensondenanalytik von medikamentenresisten- ten Keimen oder zur Subklassifizierung eingesetzt werden Als Qualitätssicherungsmethode ermöglicht die Erfindung auch die Kontrolle von gentechnologisch hergestellten Produkten, bei denen Nukleinsäurefreiheit gewährleistet sein muß.
Die Untersuchung von intakten Viren, Bakterien oder deren Nukleinsäure oder deren
Proteine kann für die Infektionsdiagnostik eingesetzt werden. Auch Nukleinsäuren oder Proteine von Pilzen oder Parasiten können für diese Zwecke analysiert werden. Als wichtigste virale Vertreter seien hier exemplarisch im Falle der Viren HIV lu. 2, HTLV, HSV, CMV, HPV, Hepatitis A, B, C, D, E, F, G , VZV, Rotaviren, EBV und Adenoviren genannt. Zu den wichtigsten bakteriellen Vertretern gehören unter anderen Chlamydien, Mycobakterien, Shigella, Campylobacter, Salmonellen, Neisserien, Staphylokokken, Streptokokken , Pneumokokken. Bei den Pilzen zählen zu den wichtigsten Pathogenen Candida, Aspergillus sowie Cryptococcus.
Ein weiteres Einsatzgebiet ist in der Sicherheitsüberwachung von biologischen Proben zu sehen. Die Bedeutung liegt hier z.B. bei der Überprüfung von Blutspenden sowie aller aus Blut hergestellter Produkte. Die Einsatzgebiete entsprechen weitgehend denen der Infektionsdiagnostik.
Dieses Verfahren erlaubt erstmals den direkten hochsensitiven Nachweis von intakten
Viren. Dabei können beliebige, auch unbekannte Viren direkt gemessen werden. Dies hat sowohl für die Infektionsdiagnostik, als auch für die Sicherheit von Produkten aus biologischen Materialien enorme Bedeutung, da mit allen anderen Verfahren nur spezielle Viren individuell nachgewiesen werden können.
Die durch elektrokinetische Probenvorbereitung erhaltenen Proteine sind aufgrund ihrer Anreicherung und Aufreinigung einer anschließenden immundiagnostischen Analytik leichter zugänglich. Hierbei haben in Humandiagnostik verschiedene Proteine wie z. B. Transferrin, Fibrinogen,ß-2 Microglobulin, hCG oder Tumormarker (AFP, CEA, CA 15-3, CA 19-9) hohe diagnostische Relevanz.
0 Beispiele
Elektrokinetische Injektion von Nukleinsäure
Zur Überprüfung der elektrokinetischen Injektion von Nukleinsäure wurde Modell-
DNA durch das Anlegen von Spannung in einen Mikrokanal injiziert und mittels UV vermessen. Das Experiment sollte zeigen, daß es möglich ist Nukleinsäure elektrokinetisch zu extrahieren.
Es wurde eine Verdünnungsreihe von pBr-DNA (Boehringer Mannheim) von 250 bis
1,25 mg/1 hergestellt und im Probengefäß vorgelegt. Nach der Injektion wurde elektrophoretisch getrennt. Die Meßbedingungen befinden sich in Tabelle 1.
Trägt man die Peakflächen gegen die DNA-Konzentration auf, so zeigt sich eine Sättigung der Peakflächenzunahme für hohe DNA-Konzentrationen. Die injizierte
DNA-Menge wird über 100 mg/1 durch den elektrischen Strom und nicht durch die DNA-Konzentration limitiert. Damit konnte gezeigt werden, daß Nukleinsäure über einen weiten Konzentrationsbereich elektrokinetisch aus einer Lösung aufkonzentriert werden kann.
Tabelle 1: Meßparameter zur elektrokinetischen Nukleinsäure-Injektion.
Figure imgf000027_0001
Wiederfindungsrate von Größenausschlußmembran
Zur Überprüfung der Retardierung von Nukleinsäure an einer Größenausschlußmembran wurde pBr-DNA elektrokinetisch in den Mikrokanal injiziert und anschließend elektrophoretisch im Kanal zur Anode mobilisiert. Zwischen dem Injektionsende des Kanals und der im Kanal vorhandenen Größenausschlußmembran befand sich ein UV-
Detektor (vgl. Fig. 4). Die pBR-DNA (250 mg/1) wurde am Detektor vorbei elektrophoriert und die Elektrophorese wurde so lange fortgesetzt, daß die DNA den Kanal ohne Membran bereits verlassen hätte. Dann wurde die Spannung umgepolt und so die retardierte DNA wieder am Detektor vorbei bewegt. Die Meßparameter befinden sich in Tabelle 2. Tabelle 2: Meßparameter zur elektrophoretischen Nukleinsäure- Wiederfindung von einer Größenausschlußmembran.
Figure imgf000028_0001
Die elektrokinetisch injizierte DNA migrierte nach 1,7 min durch den UV-Detektor. Ohne Größenausschlußmembran würde die DNA nach 7 min den Kanal wieder verlassen. Die Elektrophorese wurde aber insgesamt 10 min fortgesetzt und dann die Spannung direkt umgepolt. Die retardierte DNA in der Kapillare wanderte wieder zurück durch den UV-Detektor. Nach 12,05 min konnte ein Signal detektiert werden, das exakt der Peakfläche der injizierten DNA entsprach. Das analoge Experiment mit 3-Nitrobenzolsulfonsäure zeigte, wie erwartet, nur den Injektionspeak und damit keine Retardierung an der Größenausschlußmembran.
In einem weiteren Experiment wurden drei aufeinanderfolgende Injektionen an Nukleinsäure durchgeführt und mit identischen Bedingungen analysiert. Das Elektrophero- gramm zeigte eindeutig die Aufkonzentrierung der drei Nukleinsäure-Injektionen in einem Signal. Die Peakflächen der drei Einzelinjektionen entsprachen exakt der Peakfläche der retardierten DNA. Damit wurde gezeigt, daß Makromoleküle an der Membran im Mikrokanal elektrophoretisch immobilisiert und quantitativ remobilisiert werden können
Nukleinsäure-Extraktion
Für die Nukleinsaure-Aufkonzentrierung ist es notwendig die vorhandene Nuklein- saure-Menge aus einer bestimmten Losung möglichst quantitativ in den Mikrokanal zu überführen Wenn die gesamte Nukleinsäure injiziert ist, durfte bei einer 2 Injektion aus dem selben Probengefaß nur noch sehr wenig Nukleinsäure extrahierbar sein
Um die DNA-Menge möglichst gering zu halten wurde die DNA mit dem interkalierenden Farbstoff YOYO (Molecular Probes) angefärbt und mit laserinduzierter Fluoreszenzdetektion (LIF) detektiert Dazu wurde YOYO (0,4 mmol/1, in 76 μl TBE-Puffer) vorgelegt und mit 1-4 μl der pBr-DNA-Losung (1 mg/1) versetzt und mindestens 30 min bei RT vor der Messung inkubiert Die Meßparameter befinden sich in Tabelle 3
Tabelle 3: Meßparameter zur elektrophoretischen Nukleinsäure-Extraktion
Figure imgf000029_0001
Die Detektionsprofile sahen so aus, daß nach ca. 10 min ein deutlicher Anstieg der Fluoreszenz zu verzeichnen war, der rasch ein Plateau erreichte. Nach ca. 30 min viel die Fluoreszenz wieder ab, verbunden mit einem allmählichen Anstieg des Stroms im Kanal. Die Höhe des Plateaus korrelierte mit der Menge an DNA. Bei der zweiten Injektion war aus keiner Probe noch signifikante Fluoreszenz zu injizieren. Die Daten belegen die vollständige Extraktion der pBr-DNA bei der 1. Injektion. Aus dem Fluoreszenzverlauf schließen wir, daß die gesamte Nukleinsäure bereits nach 30 min vollständig injiziert war.
Diese Daten zeigen eindeutig, daß die gesamte Nukleinsäure eines Probenvolumens elektrokinetisch in einen Mikrokanal injiziert werden kann. In Kombination mit der Größenausschlußmembran sollte es möglich sein diese Nukleinsäure in wenigen Nanoliter aufzukonzentrieren und so nachweisbar zu machen.
Nukleinsäure-Aufkonzentrierung
Mit den Meßbedingungen von Tab. 2 wurde Nukleinsäure in den Mikrokanal mit eingebauter Membran injiziert. Dazu wurde pBr-DNA (2,5 mg/1, 50 μl) 25 min injiziert und anschließend mit dem Trennpuffer fokussiert (Fig. 2). Bei dieser niedrigen Konzentration war die DNA direkt nicht nachweisbar. Nach 10 min wurde die Spannung umgepolt und die aufkonzentrierte DNA wanderte nach 12 min als intensiver Peak zurück durch den Detektor. Praktisch die gesamte DNA der 50 μl-Probe (0, 1 mg) war in weniger als 50 nl (1 cm in der Kapillare) aufkonzentriert. Der Anreicherungsfaktor lag damit bei Faktor 1000.
Derivatisierung auf der Membran
Zur Überprüfung der Derivatisierung von Nukleinsäure an einer Größenausschlußmembran wurde pBr-DNA wie bereits beschreiben elektrokinetisch injiziert und auf der Membran immobilisiert (Tab. 2). Nach der Immobilisierung wurde die Spannung aber nicht sofort umgekehrt, sondern das zur DNA auf der anderen Seite der Mem- bran gelegene Puffergefäß wurde gegen eine Pufferlösung ersetzt, die kationischen interkalierenden Farbstoff enthielt (YOYO, 0,4 mmol/1, Molecular Probes). Die Spannung wurde für weitere 20 Minuten beibehalten, wobei der Farbstoff durch den Mikrokanal, und durch die Membran wanderte. Die DNA wurde also mit YOYO auf der Membran inkubiert. Danach wurde nochmals 10 min ohne Farbstoff elektropho- riert, um restliches YOYO wieder aus der Kapillare zu entfernen. Dann wurde die Spannung umgepolt und so die retardierte und angefärbte DNA wieder am Detektor vorbei bewegt.
Die elektrokinetisch injizierte DNA migrierte nach 2 min durch den UV-Detektor.
Zwei Minuten nach der Umpolung konnte ein Signal mit größerer Peakfläche detek- tiert werden, das der angefärbten DNA entsprach. Die mittels Dioden-Array-Detek- tion (DAD) im Mikrokanal erzeugte UV-VIS-Spektrun der injizierten DNA zeigte das typische UV-Spektrum mit 2 Absorptionsmaxima bei 200 und 260 nm. Nach der Inkubation mit YOYO auf der Membran wies die DNA zusätzlich ein Absorptionsmaximum bei 490 nm auf. Dies entspricht exakt dem Absorptionsmaximum der mit YOYO interkalierten DNA. Damit konnte bewiesen werden, daß Makromoleküle im Mikrokanal derivatisiert werden können.
Kopplung mit Elektronenmikroskopie
Als Beweis der weiteren Analyse von aufbereiteten Makromolekülen, soll die Kopplung mit der Elektronenmikroskopie (EM) dienen.
Herpes Simplex Viren (Typ 2) wurden mit YOYO (Molecular Probes) angefärbt und mit laserinduzierter Fluoreszenzdetektion (LIF) detektiert. Dazu wurde YOYO (0,4 mmol/1, in 76 μl TBE-Puffer) vorgelegt und mit 4 μl der HSV-2-Lösung (5 x 105 Viren/ml) versetzt und mindestens 30 min bei RT vor der Messung inkubiert. Die Meßparameter befinden sich in Tabelle 3.
Die wenigen injizierten, interkalierten Viren (10 - 20) wurden als einzelne Signale detektiert. Zur Identifizierung der Signale wurde die gleiche Probe unter vergleich- baren Elektrophoresebedingungen an einer Prince-CE (Lauerlabs) mit Nanofraktions- sammler (Probot, BAI-Instruments) analysiert Das Ende des Mikrokanals wurde dabei zeitgesteuert auf unterschiedliche Elektronenmikroskopietrager fraktioniert und nach Negativkontrastierung mit Uranylacetat im EM untersucht.
In den erwarteten Fraktionen konnten intakte HSV-Partikel eindeutig nachgewiesen werden Damit wurde am Beispiel von Viren erstmals gezeigt, daß Makromoleküle nach der elektrophoretischen Trennung für weitere Analysen als intakte Partikel zur Verfügung stehen
Legenden zu Abbildungen
Fig 1 Schematische Darstellung der Aufreinigungsapparatur Ein Mikrokanal (1) mit eingebauter Membran (2) verbindet 2 Puffergefaße (3,4) Über eingebrachte Elektroden können diese Puffergefaße auf unterschiedliche Spannungspotentiale gebracht werden (5) Über eine Druckregelung können auch unterschiedliche Drucke angelegt werden (6) In (3) befindet sich die zu untersuchende Probe
Fig. 2 Schematische Darstellung der Aufkonzentrierung Das zu untersuchende Makromolekül wurde elektrokinetisch in den Mikrokanal (1) mit eingebauter Membran (2) injiziert Das Probengefaß wurde bereits durch den Konzentrationspuffer (7) ersetzt. Die Makromoleküle wan- dern bis zur Membran und werden dort festgehalten
Fig 3 Schematische Darstellung der Probenmodifizierung In den Reaktions- gefaße (8,9) befinden sich die Derivatisierungsreagenzien, die entweder elektrokinetisch und/oder mit Hilfe von Druck zu den aufkonzentπer- ten Makromolekülen gebracht werden
Fig 4 Schematische Darstellung eines on-line Analysenverfahrens Das aufkonzentrierte und modifizierte Makromolekül wird elektrokinetisch im Mikrokanal (1) an einem Detektorfenster (12) vorbei mobilisiert, so daß die spektroskopischen Eigenschaften analysiert und ausgewertet werden können (13).
Fig. 5: Schematische Darstellung der Fraktionierung des aufgereinigten
Makromoleküls. Die aufkonzentrierte Probe wird in dem Probengefäß oder auf dem Analysentarget (14) aufgefangen und steht für weitergehende Analysen zur Verfügung.
Fig. 6: Schematische Darstellung der high-throughput Aufreinigungsapparatur. Eine Vielzahl von Mikrokanälen wird so angeordnet, daß sie mit dem Probenformat (z.B. Mikrotiterplatte) kompatibel sind. Die Membran (2) wird über das gesamte Format eingebracht und mit einem zweiten Mikrokanal- Array (15) verbunden. Die Vorgehensweise dieser multiplen Anordnungen entspricht Fig. 1-5.
Fig. 7: Schematische Darstellung der Anreicherungsapparatur für schnelle
Aufkonzentrierungen. Neben dem Mikrokanal (1) befindet sich ein
Flachkanal (16), der mit dem Mikrokanal (1) über den Transferkanal (17) verbunden ist. Der Flachkanal erlaubt sehr viel höhere Flußraten und damit höhere Anreicherungsfaktoren. Details im Text.
Fig. 8: Schematische Darstellung der schnellen Anreicherung aus salzhaltiger
Lösung in der Aufsicht am Beispiel von Nukleinsäuren. Die An- reicherung erfolgt durch Anlegen einer Spannung (6) an den Flachkanal
(16) (Fig. 8a). Die Spannung wird so lange beibehalten, bis alle Nukleinsäuren an der Membranoberfläche (2) immobilisiert sind (Fig. 8b). Wird nun zwischen dem Flachkanal (16) und dem Mikrokanal (1), wie angegeben, eine Spannung (6) angelegt, so wandert die aufge- reinigte und aufkonzentrierte Nukleinsäure von der großen Membran- oberfäche des Flachkanals (16) zur Membran des Mikrokanals (1) (Fig. 8c) und steht dann für die analogen Verfahren (Fig. 3 -6) zur Verfügung. Details im Text.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Isolierung und Aufkonzentrierung von Makromolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß die Makromoleküle in einem Mikrokanal auf einer Membran elektrokinetisch gesammelt und anschließend analysiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren, Viren, Proteine, Bakterien oder Pilze in einem Mikrokanal auf einer Membran elektrokinetisch gesammelt und anschließend analysiert werden.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, wobei die Probe auf der Membran derivatisiert wird.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 als Probenvorbereitung für weitere
Analysenverfahren.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 als Probenvorbereitung für MS, Gelelektrophorese, PCR, TEM, Nucleinsäuresequenzierung, Immundiagnostik und Hybridisierungen.
6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 in Form eines Chip-Moduls mit eingebetteter Membran, wobei 1 -400 Kapillaren nebeneinander angeordnet sind.
7. Vorrichtung gemäß Anspruch 2, enthaltend eine Membran aus Polyethersulfon (PES), Polyester, vliesgestütztem Acrylpolymer, Polytetrafluorethylen (PTFE), Polysulfon, Polypropylen (PP), Glasfaser, Nylon oder Polycarbonat.
8. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 in Form eines Flachkanals zur Analyse von salzhaltigen Proben.
9. Verwendung der Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 6 bis 8 zur Anreicherung und zur Analyse von Makromolekülen.
10. Verwendung der Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 6 bis 8 in der Qualitäts- kontrolle von biologischen Präparaten.
11. Verwendung der Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 6 bis 8 zur direkten Infektionsdiagnostik.
12. Verwendung der Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 6 bis 8 zur ampli- fikationsfreien Nukleinsäureanalytik.
0 0
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