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WO1998030905A1 - Moyens pour la bio-epuration d'un fluide biologique - Google Patents

Moyens pour la bio-epuration d'un fluide biologique Download PDF

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Publication number
WO1998030905A1
WO1998030905A1 PCT/FR1998/000066 FR9800066W WO9830905A1 WO 1998030905 A1 WO1998030905 A1 WO 1998030905A1 FR 9800066 W FR9800066 W FR 9800066W WO 9830905 A1 WO9830905 A1 WO 9830905A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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groups
support
pei
ligand
purification
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/000066
Other languages
English (en)
Inventor
Laurent Simard
Michel Thomas
Gérard Quash
Nicolas Moachon
Original Assignee
Hospal Industrie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hospal Industrie filed Critical Hospal Industrie
Priority to US09/142,607 priority Critical patent/US6260715B1/en
Priority to DE69840885T priority patent/DE69840885D1/de
Priority to JP53061398A priority patent/JP4224621B2/ja
Priority to EP98903063A priority patent/EP0902893B1/fr
Priority to AT98903063T priority patent/ATE433573T1/de
Priority to CA002248247A priority patent/CA2248247C/fr
Publication of WO1998030905A1 publication Critical patent/WO1998030905A1/fr

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
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    • B01D—SEPARATION
    • B01D2323/00—Details relating to membrane preparation
    • B01D2323/38—Graft polymerization

Definitions

  • the present invention relates to membranes for bio-purification of a biological fluid.
  • purification or bio-purification is meant throughout this text the process of partial or total elimination of a molecule or macromolecule endogenous or heterologous present in the biological fluid, and whose total or partial elimination is sought; this molecule or macromolecule can be in the isolated soluble state, or complexed with other substances.
  • the present invention also relates to a versatile device for the purification of a biological fluid.
  • the device consists of a functionalized support, hemocompatible in the case of use in an extracorporeal circuit for the treatment of blood.
  • the special feature of the device is that it can covalently fix any type of ligand that can be used to modify the activity or composition of a biological fluid.
  • the invention also relates to the process for obtaining and implementing the support either alone or integrated into an extemporaneous preparation kit for the support capable of carrying a specific ligand.
  • Biocompatible semi-permeable membranes have been developed for the dialysis of patients with renal impairment. These supports can take the form of either flat membranes or hollow fibers.
  • membranes based on synthetic polymers or based on modified cellulose have been made available to users by the manufacturers. The polymers used are rarely homopolymers, and no membrane is made entirely of polyacryionitrile.
  • the PAN membrane from Asahi consists of a copolymer of acrylonitrile, methyl methacrylate and acrylic acid; this membrane has an asymmetric microporous structure formed by a dense layer in contact with the blood and a spongy wall on the dialysate side.
  • the ENKA SPAN membrane is also an asymmetric microporous membrane based on acrylonitrile, sodium methallyl sulfonate and methyl methacrylate.
  • the AN69 membrane manufactured and marketed by HOSPAL (Meyzieu, France) is based on a copolymer of acrylonitrile and sodium methallyl sulfonate. This membrane is known for its biocompatibility and transfer properties.
  • the content of anionic sites (from the comonomer sodium methallyl sulfonate) of poylmere AN69 is 600 m Eq / kg. That of the membrane is around 180 Eq / kg (polymer content close to 30%).
  • polysulfone polymers also have an asymmetric microporous structure; they are basically hydrophobic and must be mixed with hydrophilic components such as polyvinylpyrrolidone in order to be able to provide dialysis membranes with sufficient diffusive properties.
  • Symmetrical hydrophilic supports whether in the form of hollow fibers or of flat membranes according to the use that one wishes to make of them, also have functional advantages as regards their biocompatibility in that they are weakly activators of the complement , non-thrombogenic and of great diffusion capacity.
  • any biocompatible anionic polymer such as acrylonitrile copolymers, can provide supports functionalizable by the methods of the invention.
  • bio-purification Two types of bio-purification are concerned in the present invention; on the one hand, it is a non-specific bio-purification of the dialysis and / or hemofiltration type commonly used during renal dialysis; on the other hand, bio-purification in which it is sought to eliminate an undesirable molecule or macromolecule from a biological fluid, and this by specific interaction of the molecule or macromolecules to be eliminated with one or more ligands covalently coupled to hydrophilic supports.
  • Devices for the treatment of blood by extracorporeal circulation are used in various medical or paramedical applications such as: treatment of renal failure by dialysis or hemofiltration, plasmapheresis and apheresis for therapeutic and non-therapeutic purposes, blood oxygenation, immuno-purification, etc.
  • the invention aims to propose a method for manufacturing a device satisfying the conditions set out above and the active element of which, before treatment, has negative surface charges.
  • the blood comes into contact with a negatively charged surface, it is the site of a biological phenomenon, called activation of the contact phase which manifests itself by the generation of active substances, kallikrein and factor Xlla, from inactive substances. , prekallikrein and factor XII.
  • Activation of the contact phase is benign in itself, but when it occurs simultaneously with certain disruptive factors (intake of hypotensive drugs of the IEC type by the patient, dilution of the blood entering the device filled with saline solution, concomitant lowering of the pH), it seems at the origin
  • Adverse reactions known as anaphylactoids which appear a few minutes after the start of treatment with various symptoms, including feeling of generalized heat, numbness of the fingers, lips or tongue, gasping, nausea, edema laryngeal. It is recalled that anaphylactoid reactions are not exclusively linked to the use of medical devices whose blood compartment has a negatively charged internal surface.
  • a microemulsion containing the ligand has been developed to promote contact between the ligand and a hydrophilic support (WO 92/07023).
  • One of the specific applications that have long been contemplated for fixing biological macromolecules to supports is the specific purification of fluids for the purpose of purifying molecules or macromolecules. This, of which a particular example is the immuno-purification of plasma proteins, is usually carried out by passing the plasma and more rarely the blood obtained, by sampling from donors, over a solid support on which is bound a ligand capable of reacting specifically and if possible with a good affinity with the molecule that one wishes to obtain.
  • the affinity of the antibodies for their epitopes must be such that the release of antigens into the circulation is minimal, while the immuno-purification in vitro to obtain purified substances must on the other hand allow the release without denaturation of said substances, at the risk to have a lower fixing efficiency.
  • the only commercial product that can be cited as an example of extracorporeal purification is a column which is composed of grafted Protein A on sepharose beads and marketed under the column Immunosorba (Excorim). Protein A, extracted from the wall of S. aureus, has an affinity for the Fc fragment of IgG, also, the Immunosorba columns are of very limited application since only IgG, but all IgG regardless of their antigenic specificity is eliminated, which is obviously not the aim sought in most cases.
  • the inventors wanted to use the advantageous physical and functional properties of existing systems for extracorporeal circulation to purify biological fluids, and in particular plasma; such a purification can represent a therapy for the elimination of molecules or macromolecules whose presence leads to certain pathologies or certain biological dysfunctions and more particularly toxic molecules and macromolecules of molecular mass greater than albumin (66400 daltons) and not purified by hemofiltration or hemodialysis techniques.
  • the object of the present invention is to provide modules for the extracorporeal purification of a biological fluid comprising a compartment for the circulation of said fluid; this compartment is at least partially delimited by a functionalized support or a wall, the surface of which comprises functionalized groups, and satisfy the following conditions: - be stable at least at a temperature between approximately 15 ° C and approximately 45 ° C;
  • - be stable to at least one type of sterilization process applicable to medical devices; and in particular gamma radiation; - be able, if necessary, to generate, in the presence of an activating substance, functional groups, in the sense that they are capable of forming covalent bonds with ligands carrying groups: v NH -CHO, -NH 2 , -COOH, -SH, -OH, -NH-C ⁇ NH 2
  • Hydrophilicity can be intrinsic or imparted by chemical modification.
  • the term “functionalized support” will mean any wall or surface comprising groups stable at ambient temperature and for a duration compatible with commercial use and capable, in the presence of an activating substance, of generating functional groups to themselves. able to react with organic groups of the -CHO, - NH2.-COOH, -SH type, for the direct or indirect coupling of a ligand, itself capable of interacting specifically with molecules or figured elements of the biological fluid that we want to purify.
  • the base of the functionalized supports may constitute any dialysis membrane in the form of a flat film or of hollow fibers; in the form of a flat film or of solid or hollow non-porous fibers; porous or not, or a combination of the above.
  • the module for the extracorporeal purification of a biological fluid can also comprise a functionalized support whose surface has charges, by the intermediary of which are linked by ionic bonds, molecules or macromolecules of a first type exhibiting, once linked free amino groups to which are attached, by covalent bond, molecules of a second type which, once linked, exhibit free carboxylic groups 1) capable of forming amide, ester and thioester bonds with NH 2 groups, OH and SH respectively; or 2) capable of being modified into hydrazines to form hydrazone bonds with aldehydes; or 3) capable of being modified in amines to form imines with aldehydes and which can be stabilized in amines by reduction; or 4) able to be modified into 1, 2 dicetone (for example cyclohexandione, glyoxal, etc.) in order to be able to form covalent bonds with
  • molecules of the first type is a polyethylenimi ⁇ e with a molecular mass of between 10,000 and 2,000,000 daltons.
  • molecules of the second type is a dicarboxylic acid anhydride of formula: CO Y. / O
  • Another example of a second type molecule is an anhydrous monocarboxylic acid, such as that of acetic acid of formula: CH 3 - CO
  • the free carboxylic groups can form amide bonds either with the ligand allowing specific bio-purification, or with a molecule of a third type which can have one or more of the following functions:
  • a di-hydrazide of formula NH 2 - NH - CO - Y - CO - NH - NH 2, where Y is preferably a group (CH 2 ) m in which m is between 2 and 6.
  • Y must be chosen in such a way that it must carry hydrophilic groups, it must in no case be a complement activator, and must be stable to at least one method of sterilization of medical devices, such as gamma rays. .
  • module according to the invention in an extra-corporeal circuit, implies the existence of intrinsic properties of said supports, which are: - minimal non-specific adsorption,
  • the modules made from said supports must allow the circulation of a biological fluid under conditions compatible with the therapeutic approach envisaged.
  • the modules of the invention will preferably comprise, as membrane, a semi-permeable membrane made from a copolymer of acrylonitrile and sodium methallyl sulfonate, of type AN69.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a functionalized biocompatible support carrying groups capable of forming covalent bonds with organic groups, in particular:
  • the terminal carboxylic group can be used directly for the coupling of a ligand, either by adding a carbodiimide, or by converting the carboxyl group into activated ester in the form of N. hydroxy succinimide. c) where appropriate, bringing the modified support into contact with steps a) and b) with a di-hydrazide of formula:
  • Y is chosen from groups which do not activate the complement and are stable in at least one type of sterilization process for medical devices such as ⁇ radiation.
  • Y is preferably a group [CH 2 ] m ⁇ in which m is between 1 and 4.
  • the method of the invention may include a variant leading to an equivalent result in which the carboxylic anhydride of step b) reacted with the PEI of step a) before the treatment of the support as proposed in step a ). ; in other words, in this variant a functionalized biocompatible support carrying groups capable of forming covalent bonds with organic groups, in particular: NH
  • NH 2 can be obtained by bringing ionic supports into contact with the reaction product between: a polyethylenimine (PEI) with a molecular mass of between 10,000 and 2,000,000 daltons, said PEI being substituted or not, with a solution of dicarboxylic acid anhydride of formula:
  • PEI polyethylenimine
  • the support having an anionic character is preferably a membrane made up of an acrylonitrile and sodium methallyl sulfonate copolymer, of type AN69 as described above.
  • the PEI preferably has a molecular mass of between 10,000 and
  • the dicarboxylic acid anhydride is preferably that of the succinic acid of formula:
  • the anhydride is used in a solution of concentration from 0.5 M to 2 M in acetonitrile.
  • This second variant is called “pre-acylation”, in order to differentiate it from the first.
  • the whole is brought into contact with the anionic support.
  • the -COOH functionalities can react with dihydrazide which is preferably ADH (adipic-dihydrazide) in which m is equal to 4.
  • the invention relates more generally to the supports capable of being obtained by the process or its variant described above, as well as to the bio-purification modules which comprise them. These supports must meet the same conditions as those listed above.
  • the methods of the invention described above can be used for the preparation of dialysis and / or hemofiltration membranes.
  • the invention relates to the membranes capable of being obtained by these methods, whether they consist of post-acylation of PEI or pre-acylation of the latter.
  • the dialysis modules comprising the membranes thus produced form part of the invention.
  • the ligands capable of being coupled to the functionalized supports can be of homogeneous or heterogeneous nature, that is to say that they can consist of a single molecular species or of a compatible mixture of several molecular species if the one seeks to purify the biological fluid of several molecules simultaneously, or of a single molecule with ligands which have a different affinity for different sites thereof; for example it may be, when the ligand is an antibody or an antibody fragment, a mixture of antibodies of different specificities.
  • Bringing a biological fluid into contact with the support thus modified by covalent coupling of said ligands makes it possible to selectively eliminate one or more molecular or macromolecular species, or figured element of the biological fluid, having an affinity with the ligand (s).
  • the ligands will be covalently attached by any known means, by the action of an activating substance compatible with extracorporeal use of the modified support.
  • any known means are described in the following documents: US patent 4,217,338; Thomas et al., Colloids and surfaces A. (1993) vol. 77; 125-139; Malmsten et al. J. Colloid and Interface Science. (1996) vol. 177; 70-78.
  • the ligands are antibodies
  • two approaches are possible for this; the first consists in coupling the antibodies by amide bond between the amino groups of the antibodies and the carboxyl groups of the supports.
  • the second consists in oxidizing the antibodies with sodium periodate, then in coupling them by formation of a hydrazone bond between aldehyde groups generated on the carbohydrate groups of the molecule and the hydrazide acids of the support functionalized by di-hydrazides; the coupling efficiency ⁇ under these conditions is maximum when the pH is between 4 and 6.
  • the antibodies can be polyclonal antibodies or preferably monoclonal antibodies, either monospecific, or as a mixture of several epitopic or molecular specificities.
  • IL-1 ⁇ IL-1 ⁇
  • TNF ⁇ IL-6
  • RhD antibodies in the treatment or prevention of hemolytic disease of the newborn
  • the coupling products between the functionalized supports of the invention with the ligands and in particular the monoclonal or polyclonal antibodies are new and also form part of the invention, as well as their use in the purification of biological fluids.
  • the coupling product In order to be effective, the coupling product must be characterized by an optimal quantity of fixed antibody which is variable for each type of antigen. As an example, approximately 2 mg / m2 can be set.
  • Antigens also represent a class of candidates interesting for the purification of biological fluids, especially in the case of autoimmune diseases for the elimination of autoantibodies.
  • Autoimmune diseases are above all marked by hyperactivity of B lymphocytes and are characterized, among other biological symptoms, by the presence of multiple autoantibodies directed against autoantigens.
  • various anti-nuclear antigen antibodies, anti-DNA antibodies, antibodies against enzymes and nucleoproteins involved in the transcription and translation processes of RNA are characterized, among other biological symptoms, by the presence of multiple autoantibodies directed against autoantigens.
  • Typical examples of autoimmune diseases are those of systemic lupus erythematosus (SLE) or rheumatoid arthritis.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • rheumatoid arthritis The great diversity of autoantibodies which can be present in several systemic diseases makes the diagnosis very difficult especially as clinically the symptoms are sometimes mixed.
  • the various therapeutic routes currently used are mainly: a) treatment with glucocorticoids which result in high doses (from 0.7 to 1 ml / kg) a frank clinical improvement with reduction in the level of the various autoantibodies, disappearance of the immun-complexes and increased serum complement rate; b) immunosuppressants, the use of which is more controversial; c) plasma exchanges or plasmapheresis; If the latter technique has proven effective for some lupus patients, it has many drawbacks: it is expensive, difficult to implement, elimination is non-selective because it not only purifies the pathogenic immune complexes, but also, essential constituents such as immunoglobulins, coagulation factors, complement molecules, and many other compounds with regulatory activity. It is therefore much more traumatic for the organism than a specific technique.
  • apheresis which is usually carried out by passing the plasma or more rarely the blood over a solid support to which is bound a ligand capable of reacting specifically and if possible with great affinity with the sites present on the target cells or on the constituents of low or high molecular mass.
  • a possible therapeutic route consists in specifically eliminating the pathogenic antibodies, in this case the anti-DNA antibodies, by this process.
  • the first data were provided by Terman et al. who had used a colloidal DNA column to purify the blood of lupus patients.
  • DNA as the ligand remains very limited due, firstly, to its instability in contact with enzymes such nucleases and esterase ⁇ plasma and, secondly, because of the potential danger related to its potentially transforming nature that its release could present in circulation, complexed with serum proteins.
  • anti-DNA antibodies can be specifically trapped not by DNA but by other compounds with which these antibodies give cross reactions. Many authors, including Lafer et al.
  • Lipoic acid (LA) or lipoic acid 6.8 dithiooctanoic (AT) is a molecule with eight carbon atoms linked to two sulfur atoms on carbons 6 and 8 to form a dithiolane heterocycle.
  • oxo acids dehydrogenases which are the multi-enzymatic complexes essential for enzymes such as pyruvate dehydrogenase (PDH) or oxoglutarate dehydrogenase to which it covalently binds the NH2 groups of lysine ( 1, 2, 21).
  • PDH pyruvate dehydrogenase
  • oxoglutarate dehydrogenase to which it covalently binds the NH2 groups of lysine ( 1, 2, 21).
  • Anti-AL antibodies react with double stranded DNA, but not with single stranded DNA (13); however, LED is characterized by the presence at a given time of the disease of anti-double-stranded DNA antibodies.
  • lipoic acid was an excellent candidate for purifying the plasma of anti-AL and anti-DNA antibodies in lupus pathology.
  • Lipoic acid is capable of being coupled to the functionalized support by amide bond with conferred amino groups, by a monohydrazide.
  • a dihydrazide or by a diamine of formula NH 2 - (CH 2 ) n- NH 2 with n included between 2 and 6, or a polyamine of formula NH 2 - (CH 2 ) x - NH - (CH 2 ) y - NH 2 with x and including 3 and 6, for example.
  • the exemplary embodiments of coupling according to the invention with lipoic acid for the treatment of LED will be given in the exemplary embodiments below.
  • the invention also relates to the coupling product between a support functionalized according to the invention with lipoic acid, as well as its use for purifying the serum of patients suffering from LED.
  • Devices comprising this coupling product are particularly effective for treating autoimmune diseases, and more particularly LED.
  • ligands for the therapy of a given pathology by selecting it from a group consisting, in addition to the antibodies and antigens described above, of peptides, glycoproteins, hormones, enzymes, cofactors thereof, substrates or inhibitors thereof, polysaccharides, lectins, toxins or antitoxins, nucleic or polynucleotide acids, haptens, hapten ligands, pigments or dyes.
  • the treatment of a given pathology may be carried out by a mixture of ligands, either simultaneously or sequentially, by the use of several coupling products.
  • the present invention relates to the use of a functionalized support as described above and resulting from the implementation of the methods of the invention in the manufacture of a multipurpose module intended for the extracorporeal purification of biological fluids and in which are purified biochemical species or cells, present in biological fluids, and the elimination of which is sought, in particular antigens, antibodies or haptens.
  • the present invention also relates to a versatile kit for preparing a coupling product according to the invention, between the functionalized support and one or more specific ligands for the purification of biological fluids, said kit comprising at least:
  • the kit of the invention consists in proposing a therapeutic solution associating a modified support capable of being obtained by a process described above, the porosity and the modification of the support being adapted to the ligand and to the nature and concentration of the molecule (s), or of the figurative elements which it is sought to eliminate in the biological fluid.
  • the device could advantageously be a dialysis cartridge, and more particularly a functionalized AN 69 cartridge as described above.
  • the activating solution will preferably be carbodiimide in water-soluble form.
  • the activating solution is, for example, Na periodate.
  • the reactions involved in the couplings are conventional reactions well known to those skilled in the art who can implement the most efficient operating conditions, both by the nature of the activator and by the physicochemical conditions of the reaction, function of the ligand chosen.
  • the kit of the invention can be advantageously used by nursing staff or qualified staff associated with them to prepare in a sterile and extemporaneous manner a cartridge carrying a specific ligand and usable in extracorporeal circulation for the purification of a biological fluid which will preferably be blood or plasma.
  • the invention relates to the use of a kit as described above in any prophylactic or therapeutic treatment of a mammal and more particularly of humans.
  • the invention finally relates to a specific bio-purification process for human or animal blood or plasma by extracorporeal circulation of a device comprising at least one module of the invention.
  • a device comprising at least one module of the invention.
  • whole blood is treated by extracorporeal circulation, by passage through a module of the invention and re-administration to the patient. Within the framework of such treatment, it is possible to ultrafiltrate a portion blood if necessary.
  • FIG. 1 shows by way of illustration the coupling of a low molecular mass molecule, glycine, or of an antibody to a support functionalized with PEI with the succinylated amino groups.
  • FIG. 2 represents a similar coupling by hydrazone bond to a molecule of low molecular weight (pyruvate) or of high molecular weight (oxidized antibody).
  • FIG. 3 shows a titer of lipoic acid antibody in the serum of MLR mice. In light gray is represented the rate in MRIJIpr mice and in hatched dark gray, the rate obtained in MRL / mp mice.
  • FIG. 4 represents the comparison of the anti-lipoic acid IgM levels in different pathologies.
  • C represents control, PBC, primary biliary cirrhosis, M, Myastenia, RA, rheumatoid arthritis, SLE, represents systemic lupus erythematosus, S, syphilis and TH thyroiditis.
  • FIG. 5 represents the decrease in anti-DNA antibodies purified after passage of a lupus serum on a support which is covalently coupled lipoic acid.
  • FIG. 6 represents the number of sites available after functionalization of I ⁇ N69-PEI with succinic anhydride.
  • the curve represents the quantity of anhydrides obtained compared to the quantity of ethanolamine introduced on I ⁇ N69 alone succinylated (represented on the curve by a circle) and I ⁇ N69-PEI succinylated.
  • the dosage was done both at the entrance (represented on the curve by a triangle), in the center (represented on the curve by a diamond) and at the exit of the module (represented on the curve by a square).
  • FIGS. 7, 8 and 9 represent the fixing of pyruvic acid 4 C on I ⁇ N69 which is not functionalized or functionalized with EDC and ADH respectively, succinic anhydride, EDC and ADH, and PEI, succinic anhydride, EDC and DHA.
  • FIG. 10 represents the methods of preparation of a treatment module and FIG. 11 the methods of treatment by extracorporeal circulation.
  • Figure 12 is a schematic representation of the process for obtaining a support consisting of an epoxy surface coupled to putrescine, capable of forming a covalent bond with lipoic acid, in the presence of an activator which is the EDC.
  • FIG. 13 represents, by way of comparison, the formation of the support by ester bond directly between the LA and the OH groups of the epoxy.
  • FIG. 14 compares the anti-AL IgM levels obtained, in other words the purification rates, on an AN 69-AL support obtained by ester bond (black dots) or by amide bond (black diamonds).
  • Figure 15 compares the purification rates obtained after successive passages on columns whose support consists of AN 69-AL.
  • FIG. 16 represents the profile obtained by electrophoresis in polyacrylamide gel 10% of the proteins eluted after several passages on the same support.
  • FIG. 17 indicates the level of substituted amines of PEI-P as a function of increasing amounts of succinic anhydride reacting with PEI.
  • FIG. 18 represents the influence of the post-succinylation of PEI-P on contact activation.
  • FIG. 19 represents the quantity of PEI-P pre-succinylated per AN69 minimodule as a function of the degree of succinylation.
  • FIG. 20 represents the quantity of pre-succinylated PEI-P per AN69 minimodule as a function of the degree of succinylation and for variable concentrations of pre-succinylated PEI-P.
  • FIG. 21 is a schematic representation of the presentation of the groups charged with succinic acid explaining the results obtained according to the pre-succinylation rate of PEI-P.
  • FIG. 22 represents the activation of the contact phase measured by the generation of kallikrein, as a function of the rate of succinylation.
  • FIG. 23 indicates the quantity of heparin which binds to the minimodules coated with pre-succinylated PEI-P as a function of the rate of pre-succinylation.
  • the PEI which was used in these experiments, is LUPASOL-P, marketed by the company BASF, and of average molecular weight 750,000 Dalton, measured by light scattering.
  • Other types of PEI can be used, in particular lupasol-WF marketed by the same company and having an average molecular mass of 25,000.
  • the carboxylic acid anhydride used is that of succinic acid.
  • the acylation is a succinylation.
  • mini-dialyzers comprising 170 AN69 hollow fibers (internal diameter: 210 ⁇ m; wall thickness: 42 ⁇ m; length: 0.18 m) and the PEI-P labeled with tritium modified or not solution in physiological saline (0.14N NaCl).
  • Two approaches were used: a) the modules were first treated with PEI-P, labeled with tritium and then succinylated; b) the modules were covered with PEI-P marked with tritium previously succinylated, totally or partially.
  • 1.2 Preparation of PEI-P at different succinylation rates:
  • succinic anhydride dissolved in acetonitrile.
  • AS succinic anhydride
  • the amount of AS added according to the degree of succinylation is as follows: 100% Succinylation: 162 ⁇ mol of AS 80% Succinylation: 54 ⁇ mol of AS 60% Succinylation: 31 ⁇ mol of AS 40% Succinylation: 18 ⁇ mol of AS
  • a biological liquid has been prepared, capable of stimulating the production of kallikreins in contact with a negatively charged membrane on the surface.
  • the biological fluid used for the test consisted of human plasma poor in platelets, diluted to 5% in physiological serum added with citrate (it is noted that the conditions of the test used are far from the conditions of use of a device for circulation extracorporeal blood: the dilution rate is very high, the liquid chosen is plasma and not blood, the plasma is supplemented with citrate, therefore acidified, whereas in dialysis, the anticoagulant used is heparin.
  • test conditions are chosen on purpose because they stimulate and amplify the activation of the contact phase).
  • J 50 ml of this liquid were circulated in open circuit in the blood compartment of the minimodule at a flow rate of 05 ml / min for 30 minutes.
  • the plasma kallikreins were assayed in samples of liquid taken at time intervals using a standard chromogenic test, from the substrate S 2302 from the company BIOGENIC.
  • FIG. 18 This figure compares the kallikrein produced, measured in units per liter, in the case of the membrane of AN69 naked, of the AN69 membrane covered with PEI-P and the AN69 membrane covered with PEI-P and then succinylated.
  • Figure 19 shows that the amount of PEI-P adsorbed on TAN69 increases with the degree of succinylation, reaching a maximum of 60%. Above 60%, the amount of PEI-P adsorbed decreases rapidly. Furthermore, the amount of PEI-P adsorbed increases both with the degree of succinylation (as indicated in FIG. 19) and with the concentration of pre-succinylated PEI-P introduced into the minimodule. The maximum adsorption is observed with a pre-succinylation of PEI-P of 60%, and this in all cases.
  • FIG. 20 indicates that the quantity of PEI-P adsorbed on the mini module reaches a plateau of 216 ⁇ g for concentrations of pre-succinylated PEI-P introduced into the minimodule greater than or equal to 60 mg / l.
  • the increase in the adsorption of pre-succinylated PEI-P on the AN69 modules can result from a conformational change resulting from a modification of the electrostatic interactions between the charged amino and carboxyl groups.
  • Figure 21 is a schematic representation of the adsorption of PEI not pre-succinylated (top diagram) and pre-succinylated at 30%, 60% and 100%, on an AN69 membrane.
  • the number of amino groups per mole of PEI-P interacting with the ionic groups (50 ⁇ ) of the membrane is important.
  • Pre-succinylation decreases the number of amino groups per mole of PEI-P inducing a change in conformation of the pre-succinylated PEI-P, which increases the amount of PEI-P adsorbed and therefore the number of reactive sites available for bio-purification specific.
  • controlling the rate of pre-succinylation makes it possible to control the amount of reactive sites that can be obtained on the AN 69 membranes thus treated.
  • Table II below shows the percentage of desorption of PEI-P after washing with increase in the salt concentration.
  • the desorption level of pre-succinylated PEI-P increases with the degree of pre-succinylation. Treatment of the minimodules with 60% pre-succinylated PEI-P is optimal for obtaining the maximum of functional sites.
  • Figure 22 indicates that I ⁇ N69 treated with PEI-P pre-succinylated between 20 ⁇ and 70% does not cause the activation of the contact phase.
  • the treatment of I ⁇ N69 is carried out with a PEI-P presuccinylated at 100% (FIG. 22)
  • the activation of the contact phase observed is equivalent to that of I ⁇ N69 not treated with PEI-P.
  • this technique allows reproducible control of the number of reactive sites present on the treated membrane, namely:
  • Example 1 Immobilization of anti IL6 Ab on AN69 PEI-PEG epoxide: We undertook experiments to determine the best method for immobilizing anti IL6 Ab on insoluble supports, for example sepharose, and once the method established for apply to I ⁇ N69. Two techniques for coupling ACs have been implemented using the IgG labeled with tritium [ 3 H]. a) coupling by amide bond on ⁇ NH 2 of lysine in the protein chain of IgG; b) a coupling by hydrazone bond on carbohydrate groups previously oxidized and which are on the Fc part of IgG according to the technique described in the following documents: US Patent No. 4,217,338; Quash et al. J. Immunol. Methods, 1978, 22, 165-174.
  • Sepharose beads and anti IL6 Ab are contacted for 2 hours at the rate of one volume of beads for one volume of AclL6 at increasing concentrations of AclL6 deposited.
  • the amount of radioactivity obtained on each sample of beads is then measured on a PACKARD MINAXI ⁇ liquid scintillation counter.
  • beads on which the anti IL6 Ab was coupled to increasing amounts either by amide bond or by hydrazone bond according to the techniques and the same ratios set out in paragraph 1,1) and Table I,
  • anti-IL6 sepharose / Ac beads are then brought into contact with the various mixtures of modified sera at the rate of one volume of beads for one volume of sera.
  • the immuno-purification of IL6 is 90-100% effective for the two coupling techniques used and for sera having a low or a high level of IL6.
  • the immuno-purification efficiency decreases by 9 °% for a serum with 3,157 pg / ml of IL6 at 54.2% for a serum with 35,030 pg / ml of IL6.
  • the anti IL6 Ab is coupled to 0.38 ⁇ g / 40 cm 2
  • the immuno-purification efficiency decreases from 57.1% for a serum with 3,157 pg / ml of IL6 to 28.5% for a serum with 35,030 pg / ml of IL6 (Table III).
  • Coupling of anti IL6 Ab by amide bond or by hydrazone bond preserves their activity with respect to IL6.
  • the amount of anti IL6 Coupled Ac must be of the order of 0.4 ⁇ g / cm 2 . This immuno-purification efficiency is the same for anti IL6 Ab coupled either by amide bond or by hydrazone bond.
  • the immuno-purification of IL6 is all the less effective as the level of IL6 present in a serum is high. This observation is true for the two types of binding, however when the anti IL6 Ab are coupled by amide binding the immunoepuration of IL6 is generally more effective than when the anti IL6 Ab are coupled by hydrazone binding.
  • the minimodules were hydrophilized and functionalized (H&F) according to the method described in WO 92/07023.
  • Minimodules comprising 170 hollow fibers of AN69 18 cm long were assembled (internal surface: 256 cm 2 ). These minimodules have undergone a treatment with PEG tetrapoxide in order to generate epoxy groups.
  • PEG tetrapoxide was coupled by hydrazone binding of anti IL6 Ac labeled with propionate 3 H, on one of the two AN69 minimodules under the same conditions as for the beads at a rate of 0.4 ⁇ g / cm 2 knowing that these 0.4 ⁇ g / cm 2 of coupled Ac theoretically represent 42% of the deposited Ac if we consider that the coupling efficiency on the AN69 fibers is similar to the coupling efficiency on the sepharose beads.
  • the level of IL6 present is then measured by an immunoenzymatic technique of the sandwich type before and after passing over these minimodules.
  • the rate of binding of anti-IL6 antibodies to the AN69 module is 0.11 ⁇ g / cm 2 .
  • AN69 H&F membranes did not fix the added complement at a rate of 0.625 UH50 or 2.5 UH.
  • AN69 H&F cartridges grafted with Ac allow to specifically eliminate the corresponding Ag and do not cause the fixation of the complement.
  • This preparation was made by treating the minimodules with PEI WF, followed by post-succinylation.
  • the succinic anhydride is then fixed by the following protocol:
  • the labeled ethanolamine is fixed as follows: a) activation of the COOH groups generated: a - 1): prepare a solution of 1 ethyl 3 (3 dimethylaminopropyl carbodiimide) (EDC) (50nM) and N. hydroxysuccinimide (NHS) (50nM) in NaH 2 P0 10nM and leave in contact for 15 minutes with the pellets. a - 2): eliminate the activation solution. b) fixation of ethanolamine: b - 1): prepare isotopic dilutions of cold ethanolamine / labeled ethanolamine
  • Figure 6 shows that the quantity of ethanolamine retained on AN 69 + succinylated PEI is homogeneous over the entire module since we find the same number of sites at the entrance, center or at the exit of the module.
  • the ADH is set as follows:
  • AN 69 + ADH is 0.1 nmol / tablet with or without activation (EDC) of the support.
  • FIG. 8 shows that the optimal quantity of pyruvic acid retained on succinylated AN 69 + ADH is 0.5 nmol / tablet with or without activation (EDC) of the support for quantities of pyruvic acid introduced greater than 150 nMole per tablet .
  • the quantity of pyruvic acid coupled to AN 69 + PEI + succinic anhydride + ADH is at least 1.1 nmol per tablet after activation of the carboxyls generated on the support (via succinic anhydride) for fixing by amide bond DHA;
  • the functionalization of the AN 69 first of all by the PEI and then by the succinic anhydride and finally by the ADH makes it possible to increase at least twice the number of sites available for the molecules of high molecular mass.
  • LA is a PM hapten of 100 kDa
  • the technique developed could be extended to other haptens containing functional COOH groups.
  • the fixing of the AL covalently on an insoluble support is done in the following way: - the functional epoxy terminal group has been substituted with putrescine directly to form an arm ending in an ⁇ NH2 on which has been grafted by bond amide lipoic acid (see Figure 1).
  • FIG. 5 shows that the immuno-purification of anti-AL IgM is clearly more effective when the AL is coupled by an amide bond since all of these anti-AL are eliminated while the AL coupled by an ester bond only causes '' a very small decrease in anti-AL IgM of the order of 8%.
  • FIG. 8 shows that six successive passages, with an elution step between each passage, on the same support of six different samples but coming from the same lupus serum gives an efficiency of purification of the anti-AL Ac identical after the first passage as after the sixth pass.
  • minidialysers comprising 170 hollow fibers made of AN69 (internal diameter: 210 ⁇ m; wall thickness: 42 ⁇ m; length: 0.18 m).
  • Goat IgG comes from Biosys (Compiègne France).
  • Mouse IgG and rabbit IgG were purified in the laboratory respectively on a protein A sepharose column from a pool of ascites liquid and DEAE cellulose from rabbit serum. 5.2 Method:
  • mice, rabbit and goat IgGs were radiolabeled N-succinidyl (2 - 3 3 H) propionate and the excess radioactivity eliminated by dialysis.
  • - specific IgG activity after dialysis mouse IgG: 1.25 10 6 cpm / mg protein rabbit IgG: 1.86 10 6 cpm / mg protein goat IgG: 0.77 10 6 cpm / mg protein
  • the amount of IgG coupled corresponds to the amount of radioactivity introduced - the amount of radioactivity released.

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Abstract

L'invention porte sur un dispositif polyvalent pour l'épuration d'un fluide biologique constitué d'un support biocompatible fonctionnalisé, sur lequel tout type de ligand peut y être fixé par liaison covalente afin d'être utilisé dans un circuit extracorporel. L'invention porte également sur le procédé de préparation dudit support et sur le kit de préparation du support couplé au ligand. L'invention porte enfin sur des membranes fonctionnalisées pour la dialyse et/ou l'hémofiltration.

Description

MOYENS POUR LA BIO-EPURATION D'UN FLUIDE BIOLOGIQUE
La présente invention porte sur des membranes pour la bioépuration d'un fluide biologique. Par épuration ou bioépuration, on entend dans l'ensemble de ce texte le processus d'élimination partielle ou totale d'une molécule ou macromolécule endogène ou hétérologue présente dans le fluide biologique, et dont l'élimination totale ou partielle est recherchée ; cette molécule ou macromolécule peut être à l'état soluble isolée, ou complexée à d'autres substances . La présente invention est également relative à un dispositif polyvalent pour l'épuration d'un fluide biologique. Le dispositif est constitué d'un support fonctionnalisé, hémocompatible dans le cas d'une utilisation dans un circuit extracorporel pour le traitement du sang. La particularité du dispositif est de pouvoir fixer de manière covalente tout type de ligand utilisable pour modifier l'activité ou la composition d'un fluide biologique.
L'invention est également relative au procédé d'obtention et à la mise en œuvre du support soit seul, soit intégré dans un kit de préparation extemporanée du support susceptible de porter un ligand spécifique.
Des membranes semi-perméables biocompatibles ont été développées pour la dialyse de patients insuffisants rénaux. Ces supports peuvent prendre la forme soit de membranes planes, soit de fibres creuses. Plusieurs membranes à base de polymères synthétiques ou à base de cellulose modifiée on été mises à la disposition des utilisateurs par les fabricants. Les polymères utilisés sont rarement des homopolymères, et aucune membrane n'est constituée uniquement de polyacryionitrile.
A titre d'exemple, la membrane PAN d'Asahi est constituée d'un copolymère d'acrylonitrile, de méthacrylate de méthyle et d'acide acrylique ; cette membrane présente une structure microporeuse asymétrique formée d'une couche dense en contact avec le sang et d'une paroi spongieuse côté dialysat. La membrane SPAN d'ENKA est également une membrane microporeuse asymétrique à base d'acrylonitrile, de méthallyl sulfonate de sodium et de méthacrylate de méthyle.
La membrane AN69 fabriquée et commercialisée par HOSPAL (Meyzieu, France) est à base d'un copolymère d'acrylonitrile et de méthallyle sulfonate de sodium. Cette membrane est connue pour ses propriétés de biocompatibilité et de transfert. La teneur en sites anioniques (provenant du comonomère méthallyle sulfonate de sodium) du poylmère AN69 est de 600 m Eq/kg. Celle de la membrane est d'environ 180 Eq/kg (teneur en polymère voisine de 30 %).
D'autres polymères, notamment des polymères de polysulfone, présentent également une structure microporeuse asymétrique ; ils sont fondamentalement hydrophobes et doivent être mélangés à des composants hydrophiles tels la polyvinylpyrrolidone pour pouvoir fournir des membranes de dialyse dotées de propriétés diffusives suffisantes.
Les supports hydrophiles symétriques, qu'ils soient sous forme de fibres creuses ou de membranes planes selon l'usage que l'on souhaite en faire, présentent en outre des avantages fonctionnels quant à leur biocompatibilité en ce qu'ils sont faiblement activateurs du complément, non thrombogènes et d'une grande capacité de diffusion.
De manière générale, tout polymère anionique biocompatible, comme les copolymères d'acrylonitrile, peut fournir des supports fonctionnalisables par les procédés de l'invention.
Deux types de bioépuration sont concernées dans la présente invention ; il s'agit, d'une part, d'une bioépuration non spécifique de type dialyse et/ou hémofiltration communément utilisée lors de la dialyse rénale ; d'autre part, la bioépuration dans laquelle on cherche à éliminer d'un fluide biologique une molécule ou macromolécule indésirable, et ce par interaction spécifique de la molécule ou des macromolécules à éliminer avec un ou des ligands couplé(s) par covalence à des supports hydrophiles.
Dialyse et hémofiltration :
Des appareils pour le traitement du sang par circulation extracorporelle sont utilisés dans diverses applications médicales ou paramédicales telles que : traitement de l'insuffisance rénale par dialyse ou hémofiltration, plasmaphèrèse et aphérèse à visée thérapeutique et non thérapeutique, oxygénation du sang, immunoépuration, etc.
Tous les matériaux utilisés dans la fabrication de ces appareils sont choisis pour être aussi biocompatibles que possible de façon que les réactions (coagulation, notamment) qui se produisent lorsque le sang entre au contact d'un matériau étranger ne se produisent pas ou à des niveaux relativement bénins.
Il est connu de traiter, dans la masse ou en surface, les matériaux destinés à être en contact avec du sang pour en améliorer la biocompatibilité. Les traitements connus interviennent soit lors de la préparation des solutions de polymères utilisées pour fabriquer telle ou telle partie d'un appareil (traitement massique), soit après que les différentes parties de l'appareil ont été assemblées et avant stérilisation de l'appareil, soit, extemporanément, juste avant l'utilisation de l'appareil. Un problème particulièrement ardu à résoudre se pose lorsqu'on cherche à améliorer la biocompatibilité de l'élément actif d'un appareil (membrane de dialyse, par exemple) en respectant les conditions suivantes :
1) le choix de la substance utilisée pour le traitement et les modalités du traitement doivent avoir pour résultat la modification d'un élément actif connu, cette modification ayant pour effet d'améliorer la biocompatibilité de l'élément actif tout en préservant toutes les qualités connues (par exemple, pour une membrane de dialyse/hémofiltration : performances des transferts diffusifs et convectifs, capacité d'adsorption de substances indésirables, etc.) ;
2) la stérilisation de l'appareil ne doit pas avoir d'influence sur le traitement ;
3) le traitement ne doit pas requérir de manipulation particulière de la part de l'utilisateur.
De façon plus spécifique, l'invention a pour but de proposer un procédé de fabrication d'un dispositif satisfaisant aux conditions énoncées ci-dessus et dont l'élément actif, avant traitement, présente des charges négatives en surface. Lorsque le sang entre en contact avec une surface négativement chargée, il est le siège d'un phénomène biologique, appelé activation de la phase contact qui se manifeste par la génération de substances actives, la kallikréine et le facteur Xlla, à partir de substances inactives, prékallicréine et facteur XII. L'activation de la phase contact est bénigne en soi, mais quand elle se produit simultanément à certains facteurs perturbateurs (prise de médicaments hypotenseurs de type IEC par le patient, dilution du sang pénétrant dans l'appareil rempli de solution saline, abaissement concomitant du pH), elle semble à l'origine de réactions indésirables, dites anaphylactoïdes qui se manifestent quelques minutes après le début du traitement par divers symptômes, parmi lesquels la sensation de chaleur généralisée, l'engourdissement des doigts, des lèvres ou de la langue, le halètement, la nausée, l'oedème laryngé. On rappelle que les réactions anaphylactoïdes ne sont pas exclusivement liées à l'utilisation d'appareils médicaux dont le compartiment sang a une surface interne chargée négativement. Ces réactions ont été observées avec des échangeurs ayant des membranes de différentes compositions chimiques, tantôt lors d'une première utilisation, tantôt après plusieurs utilisations lorsque les échangeurs, au lieu d'être jetés après un usage unique, sont réutilisés de multiples fois et sont recyclés après chaque usage. Comme exemple, d'échangeurs dont une première utilisation s'est accompagnée d'une réaction indésirable, on peut citer les dialyseurs ayant une membrane de polyméthylméthacrylate et de polyacrylonitrile. Des réactions associées à la réutilisation des dialyseurs à membrane d'acétate de cellulose et de polysulfone ont été également bien documentées (voir "Anaphylactoide réactions associated with reuse of hollow-fiber hemodialyzers and ACE inhibitors" in Kidney International, vol. 42 (1992), pp. 1232-1237). Bioépuration spécifique La fixation covalente de macromolécules sur des supports solides a fait l'objet de nombreux développements, plus particulièrement destinés à augmenter le taux de fixation spécifique et diminuer le taux de fixation non spécifique, par exemple par adsorption. A titre d'exemple, on peut citer les demandes de brevet WO 92/07023, 92/07006, et WO 92/05201 qui développent une technologie dans laquelle un support est recouvert d'un polymère hydrophile non chargé : le PEG (polyethylène glycol)-époxy, lié de façon covalente à une polyethylène imine (PEI). Le procédé décrit dans ces trois demandes de brevets est mis en oeuvre dans un milieu réactionnel non polaire ; le PEG époxy forme une liaison stable avec la PEI qui, par réaction directe en diminuant le pH du milieu réactionnel, se fixe sur le support insoluble. On obtient alors un support fonctionnalisé de type époxy ; néanmoins, ces supports présentent l'inconvénient d'être parfois trop hydrophiles par la présence de ces groupes hydroxyles et cet excès d'hydrophilie peut empêcher une protéine que l'on souhaite utiliser à titre de ligand de venir en contact avec les groupements époxy réactionnels ayant pour conséquence la diminution du taux de fixation du ligand sur le support.
Pour éliminer ce problème, une microémulsion contenant le ligand a été développée pour favoriser le contact entre le ligand et un support hydrophile (WO 92/07023). Une des applications particulières envisagées depuis longtemps d'une fixation de macromolécules biologiques sur des supports est l'épuration spécifique des fluides à des fins de purification de molécules ou macromolécules. Celle-ci, dont un exemple particulier est l'immunoepuration de protéines plasmatiques, est habituellement réalisée en passant le plasma et plus rarement le sang obtenu, par prélèvement à partir de donneurs, sur un support solide sur lequel est lié un ligand capable de réagir spécifiquement et si possible avec une bonne affinité avec la molécule que l'on souhaite obtenir.
Parmi les ligands particulièrement intéressants pour la purification, se trouve la classe des anticorps monoclonaux. Par la spécificité de leur interactions avec les antigènes, et par les affinités élevées avec les antigènes correspondants, leur utilisation est éprouvée dans l'immunoepuration spécifique in vitro dans les nombreuses applications de la chromatographie d'affinité ( Current Protocol in Immuπology, Section II, Unit 8-2 ). Néanmoins, l'immunoepuration extracorporelle ayant pour objectif l'épuration maximale de la substance dans le plasma diffère fondamentalement de l'immunoepuration in vitro ayant pour objectif l'obtention d'une substance purifiée et/ou concentrée, par de nombreux paramètres et notamment :
- la nécessaire biocompatibilité du support modifié comme évoqué plus haut, - la fixation covalente du ligand par une méthode qui lui permette de conserver son intégrité fonctionnelle.
- l'affinité des anticorps pour leurs épitopes doit être telle que le relargage des antigènes dans la circulation est minime, alors que l'immunoepuration in vitro pour l'obtention de substances purifiées doit permettre en revanche le relargage sans dénaturation desdites substances, au risque d'avoir un rendement de fixation plus faible.
Le seul produit commercial que l'on peut citer à titre d'exemple d'épuration extracorporelle est une colonne qui se compose de Protéine A greffée sur des billes de sepharose et commercialisée sous le nom de colonne Immunosorba (Excorim). La Protéine A, extraite de la paroi de S. aureus, a une affinité pour le fragment Fc des IgG, aussi, les colonnes Immunosorba sont d'une application très limitée dans la mesure où seules les IgG, mais toutes les IgG sans distinction de leur spécificité antigénique sont éliminées, ce qui n'est évidemment pas le but recherché dans la plupart des cas.
Les inventeurs ont voulu utiliser les propriétés physiques et fonctionnelles avantageuses des systèmes existants en matière de circulation extracorporelle pour épurer les fluides biologiques, et notamment le plasma ; une telle épuration peut représenter une thérapeutique pour l'élimination de molécules ou macromolécules dont la présence conduit à certaines pathologies ou certains dysfonctionnements biologiques et plus particulièrement les molécules et macromolécules toxiques de masse moléculaire supérieure à l'albumine (66400 daltons) et non épurées par les techniques d'hémofïltration ou d'hémodialyse. La présente invention a pour objet de fournir des modules pour l'épuration extracorporelle d'un fluide biologique comprenant un compartiment pour la circulation dudit fluide; ce compartiment est délimité au moins partiellement par un support fonctionnalisé ou une paroi dont la surface comprend des groupements fonctionnalisés, et satisfaire aux conditions suivantes: - être stables au moins à une température comprise entre environ 15°C et environ 45° C ;
- être hémocompatibles,
- être stable à au moins un type de procédé de stérilisation applicable aux dispositifs médicaux; et en particulier aux rayonnements gamma; - être aptes, le cas échéant, à engendrer, en présence d'une substance activatrice, des groupements fonctionnels, en ce sens qu'ils sont aptes à former des liaisons covalentes avec des ligands porteurs de groupements : v NH -CHO, -NH2, -COOH, -SH, -OH, -NH-C ^ NH2
- avoir une hydrophiiie suffisante pour éviter les fixations non spécifiques de macromolécules, mais inférieure à un seuil critique au-delà duquel le taux de fixation covalente des ligands serait faible sinon nul. Le caractère hydrophile peut être intrinsèque ou conféré par modification chimique.
Dans l'ensemble du texte, on appellera support fonctionnalisé toute paroi ou surface comportant des groupements stables à température ambiante et pendant une durée compatible avec une utilisation commerciale et aptes, en présence d'une substance activatrice, générer des groupements fonctionnels à eux-mêmes aptes à réagir avec des groupements organiques de type -CHO, - NH2.-COOH, -SH , en vue du couplage direct ou indirect d'un ligand, lui-même apte à interagir spécifiquement avec des molécules ou des éléments figurés du fluide biologique que l'on souhaite épurer. Pourront en particulier constituer la base des supports fonctionnalisés toute membrane de dialyse sous forme de film plan ou de fibres creuses ; sous forme de film plan ou de fibres pleines ou creuses non poreux; de microbilies poreuses ou non, ou d'une combinaison des précédents.
Le module pour l'épuration extracorporelle d'un fluide biologique peut également comprendre un support fonctionnalisé dont la surface présente des charges , par l'intermédiaire desquelles sont liées par des liaisons ioniques, des molécules ou macromolécules d'un premier type exhibant, une fois liées des groupements aminés libres sur lesquels sont fixés, par liaison covalente, des molécules d'un deuxième type qui, une fois liées, exhibent des groupements carboxyliques libres 1) aptes à former des liaisons amides, esters et thioesters avec des groupements NH2, OH et SH respectivement ; ou 2) aptes à être modifiés en hydrazines pour former des liaisons hydrazones avec des aldéhydes ; ou 3) aptes à être modifiés en aminés pour former des imines avec des aldéhydes et qui peuvent être stabilisées en aminés par réduction ; ou 4) aptes à être modifiés en 1 , 2 dicetone (par exemple cyclohexandione, glyoxal, etc..) pour pouvoir former des liaisons covalentes avec des
^ NH guanidines -NH-C
^^ NH2. Un exemple de molécules du premier type est une polyéthylènimiπe de masse moléculaire comprise entre 10 000 et 2 000 000 daltons.
Un exemple de molécules de deuxième type est un anhydride d'acide dicarboxylique de formule: CO Y. / O
CO dans laquelle X = [CH2]n, n étant égal à 2 ou 3, ou X = - CH = CH -. Un autre exemple de molécule de deuxième type est un anhydre d'acide monocarboxylique, comme celui de l'acide acétique de formule : CH3 — CO
^"^- O
CH3 CO ^ Pour l'application à la bioépuration spécifique, les groupements carboxyliques libres peuvent former des liaisons amides soit avec le ligand permettant la bioépuration spécifique, soit avec une molécule d'un troisième type qui peut avoir une ou plusieurs des fonctions suivantes:
- ajouter un espaceur pour diminuer l'encombrement stérique et favoriser la fixation ultérieure d'un ligand et/ou de la molécule ou éléments figurés à épurer,
- augmenter l'hydrophilie de la membrane ou du support en vue de limiter les interactions non spécifiques avec des protéines ou avec toute substance susceptible de telles interactions,
- exhiber un groupement d'une autre nature, par exemple un groupement aminé, permettant un autre type de couplage covalent avec un ligand porteur notamment de groupements - CHO, -COOH, -NH2.
Ces différentes fonctionnalités peuvent être cumulées et se retrouver dans une seule molécule. Un exemple avantageux de molécule du troisième type qui associe les trois fonctionnalités ci-dessus est une di-hydrazide de formule: NH2 - NH - CO - Y - CO - NH - NH2, ou Y est de préférence un groupement (CH2)m dans lequel m est compris entre 2 et 6.
En outre, Y doit être choisi de telle façon qu'il doit être porteur de groupements hydrophiles, il ne doit en aucun cas être activateur du complément, et doit être stables à au moins une méthode de stérilisation de dispositifs médicaux, tels les rayons gamma.
L'utilisation d'un module selon l'invention, dans un circuit extra-corporel, implique l'existence de propriétés intrinsèques desdits supports, qui sont : - une adsorption non spécifique minimale,
- une absence d'activation de la phase contact, c'est-à-dire une génération de kallicréine inférieure à 10 Unités par litre ;
- une non-toxicité. En outre, pour l'utilisation en bioépuration spécifique, ils doivent présenter une forte capacité de couplage avec les ligands spécifiques.
Les modules confectionnés à partir desdits supports doivent permettre la circulation d'un fluide biologique dans des conditions compatibles avec l'approche thérapeutique envisagée. Les modules de l'invention comprendront de préférence comme membrane, une membrane semi-perméable fabriquée à partir d'un copolymère d'acrylonitrile et de méthallyle sulfonate de sodium, de type AN69.
La présente invention porte également sur un procédé de préparation d'un support biocompatible fonctionnalisé porteur de groupements aptes à former des liaisons covalentes avec des groupements organiques, notamment :
NH -CHO, -NH2, -COOH, -SH, -OH, -NH-C
^ NH2 et comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de supports portant des groupements anioniques fixes avec une polyéthylénimine (PEI) de masse moléculaire comprise entre 10 000 et 2 000 OOO.daltons, la PEI étant substituée ou non ; b) mise en contact du support traité en a) avec une solution d'un anhydride d'acide dicarboxylique de formule : CO
X ^\O
^ CO dans laquelle X = [CH2]n, n étant égal à 2 ou 3, ou X = - CH = CH -, ou d'un anhydre d'acide monocarboxylique comme celui de l'acide acétique de formule :
CH3 — CO
^"^ O CH3 CO Le groupement carboxylique terminal peut être utilisé directement pour le couplage d'un ligand, soit en ajoutant un carbodiimide, soit en convertissant le groupement carboxyle en ester activé sous forme de N. hydroxy succinimide. c) le cas échéant, mise en contact du support modifié par les étapes a) et b) avec une di-hydrazide de formule :
NH2 - NH -CO- Y - CO - NH - NH2, en présence d'un agent de couplage activateur des groupements carboxyles tels que les carbodiimides.
Y est choisi parmi les groupements qui n'activent pas le complément et d'être stables à au moins un type de procédé de stérilisation de dispositifs médicaux comme les rayonnements γ . Y est de préférence un groupement [CH2]mι dans lequel m est compris entre 1 et 4 .
Cette première variante du procédé de l'invention est appelée dans la suite du texte "post-acylation".
Le procédé de l'invention peut comporter une variante conduisant à un résultat équivalent dans laquelle l'anhydride carboxylique de l'étape b) a réagi avec la PEI de l'étape a) avant le traitement du support tel proposé dans l'étape a). ; autrement dit, dans cette variante un support biocompatible fonctionnalisé porteur de groupements aptes à former des liaisons covalentes avec des groupements organiques, notamment : NH
- CHO, - NH2, - COOH, -SH, -OH, -NH-CT
NH2 peut être obtenu par la mise en contact de supports à caractère ionique avec le produit de la réaction entre : une polyethylenimine (PEI) de masse moléculaire comprise entre 10000 et 2.000000 daltons ladite PEI étant substituée ou non, avec une solution d'un anhydride d'acide dicarboxylique de formule :
Figure imgf000012_0001
dans laquelle X à la même signification que ci-dessus, ou d'un anhydre d'acide monocarboxylique de formule : CH3 — CO
O
CH3 CO ^ Le support ainsi modifié est alors mis en contact avec une di-hydrazide de formule:
NH2 - NH -CO-Y- CO - NH - NH2, Y ayant la même signification que ci-dessus.
Dans l'un quelconque des procédés ci-dessus, le support à caractère anionique est de préférence une membrane constituée d'un copolymère acrylonitrile et de méthallyle sulfonate de sodium, de type AN69 tel que décrit plus haut. La PEI a de préférence une masse moléculaire comprise entre 10 000 et
2 000 000 daltons.
L'anhydride d'acide dicarboxylique est de préférence celui de l'acide succinique de formule :
CO CH2
O
^ CO CH2
L'anhydride est utilisée en solution de concentration de 0,5 M à 2 M dans l'acétonitrile. Cette deuxième variante est appelée « pré-acylation », pour bien la différencier de la première.
Après le couplage soit de l'anhydride acétique, soit de l'anhydride succinique à la PEI par une liaison amide, l'ensemble est mis en contact avec le support anionique. Dans le cas du traitement avec la PEI présuccinylée, les fonctionnalités -COOH peuvent réagir avec la dihydrazide qui est de préférence l'ADH (adipic-dihydrazide) dans laquelle m est égale à 4.
L'invention porte plus généralement sur les supports susceptibles d'être obtenus par le procédé ou sa variante décrits ci-dessus, ainsi que sur les modules de bioépuration qui en comprennent. Ces supports doivent satisfaire aux mêmes conditions que celles énumérées ci-dessus.
Les procédés de l'invention décrits ci-dessus peuvent être mis en oeuvre pour la préparation de membranes de dialyse et/ou d'hémofiltration. L'invention concerne les membranes susceptibles d'être obtenues par ces procédés, qu'ils consistent en une post-acylation de la PEI ou une pré-acylation de cette dernière.
Les modules de dialyse comprenant les membranes ainsi réalisées font partie de l'invention.
Les ligands susceptibles d'être couplés aux supports fonctionnalisés peuvent être de nature homogène ou hétérogène, c'est-à-dire qu'ils peuvent être constitués d'une seule espèce moléculaire ou d'un mélange compatible de plusieurs espèces moléculaires si l'on cherche à épurer le fluide biologique de plusieurs molécules simultanément, ou d'une seule molécule avec des ligands qui ont une affinité différente pour différents sites de celle-ci ; par exemple il peut s'agir, quand le ligand est un anticorps ou un fragment d'anticorps, d'un mélange d'anticorps de spécificités différentes. La mise en contact d'un fluide biologique avec le support ainsi modifié par un couplage covalent desdits ligands permet d'éliminer sélectivement une ou plusieurs espèces moléculaires ou macromoléculaires, ou élément figuré du fluide biologique, présentant une affinité avec le ou les ligands.
Les ligands seront fixés de façon covalente par tout moyen connu, par action d'une substance activatrice compatible avec une utilisation extracorporelle du support modifié. De tels moyens sont décrits dans les documents suivants : brevet US 4 217 338 ; Thomas et al., Colloids and surfaces A. (1993) vol. 77; 125- 139 ; Malmsten et al. J. Colloid and Interface Science. (1996) vol. 177;70-78.
Les chiffres entre parenthèses correspondent à des références bibliographiques dont la liste, pour l'ensemble du texte, est donnée en fin de description.
Quand les ligands sont des anticorps, deux approches sont possibles pour ce faire ; la première consiste à coupler les anticorps par liaison amide entre les groupements aminés des anticorps et les groupements carboxyle des supports.
La deuxième consiste à oxyder les anticorps par le periodate de sodium, puis à les coupler par formation d'une liaison hydrazone entre des groupements aldéhyde engendrés sur les groupements glucidiques de la molécule et les acides hydrazides du support fonctionnalisé par les di-hydrazides ; l'efficacité de couplage^dans ces conditions est maximale quand le pH est compris entre 4 et 6.
Un exemple de chacune de ces approches est représenté dans les figures 1 et 2.
Il serait fastidieux et vain d'énumérer toutes les situations dans lesquelles une bioépuration des fluides biologiques présenterait un intérêt thérapeutique, d'autant que l'évolution constante des connaissances sur les processus métaboliques et pathologiques fournira constamment de nouveaux candidats à l'épuration ; l'homme du métier saura choisir et sélectionner le ligand ou le mélange de ligands appropriés en fonction de la décision thérapeutique qu'il aura prise ; par exemple, il pourra, le cas échéant, associer des mélanges d'anticorps de spécificités épitopiques ou antigéniques différentes dans le cas d'épuration de molécules ou de mélanges complexes ; il pourra enfin choisir d'épurer le fluide biologique par un ligand qui présente une affinité non pour la substance à épurer mais pour une autre substance complexée spécifiquement à celle que l'on souhaite épurer.
Les anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux ou de préférence des anticorps monoclonaux, soit monospécifiques, soit en mélange de plusieurs spécificités épitopiques ou moléculaires. A titre d'exemple, on pourra citer :
- les anticorps anti-cytokines pro-inflammatoires (IL-1β ; TNFα ; IL-6) dans le traitement du choc septique ou dans le traitement de phénomènes inflammatoires tels la polyarthrite rhumatoïde ; - les anticorps anti RhD dans le traitement ou la prévention de la maladie hémolytique du nouveau-né ;
- les anticorps anti-HLA, en prophylaxie de greffes d'organes .
On pourra également choisir d'épurer spécifiquement des éléments figurés du sang tels les cellules ou les plaquettes à l'aide de ligands appropriés comme les anticorps, les récepteurs, les lectines etc..
Les produits de couplage entre les supports fonctionnalisés de l'invention avec les ligands et notamment les anticorps monoclonaux ou polyclonaux sont nouveaux et font également partie de l'invention, ainsi que leur utilisation dans l'épuration de fluides biologiques. Afin d'être efficace, le produit de couplage doit être caractérisé par une quantité optimale d'anticorps fixée variable pour chaque type d'antigènes. A titre d'exempLe, on peut fixer environ 2 mg/m2.
Les antigènes représentent également une classe de candidats intéressants pour l'épuration des fluides biologiques, notamment dans le cas de maladies autoimmunes pour l'élimination des autoanticorps.
Les maladies autoimmunes représentent aujourd'hui le troisième grand processus pathologique après les maladies cardio-vasculaires et les cancers, et pour lesquelles seuls des traitements symptomatiques existent.
Les maladies autoimmunes sont avant tout marquées par une hyperactivité des lymphocytes B et se caractérisent parmi d'autres symptômes biologiques, par la présence de multiples autoanticorps dirigés contre des autoantigènes. A titre d'exemple, on peut citer des anticorps anti-antigènes nucléaires variés, des anticorps anti ADN, des anticorps contre des enzymes et des nucléoprotéines intervenant dans les processus de transcription et de traduction de l'ARN. Des exemples typiques de maladies autoimmunes sont ceux du Lupus érythemateux disséminé (LED) ou de la polyarthrite rhumatoïde. La grande diversité des autoanticorps qui peuvent être présents dans plusieurs maladies systémiques rend le diagnostic très difficile d'autant que cliniquement les symptômes sont parfois mêlés.
Si la production d'autoanticorps semble être une caractéristique chez les patients atteints de maladies autoimmunes, il est intéressant de constater que cette production augmente aussi avec l'âge chez des individus sains (8, 14, 18) sans pour autant que ces individus ne développent de pathologies autoimmunes. Par ailleurs, les autoantigènes cibles (ADN, histones, enzymes et nucléoprotéines) des autoanticorps produits chez ces mêmes personnes sont les mêmes que ceux rencontrés dans les maladies autoimmunes, et notamment dans le LED (11 ). En revanche, de nombreux travaux font état du caractère pathogène des immuncomplexes. En effet, il a été démontré que l'insuffisance rénale qui est l'une des causes ultimes de mortalité chez les malades atteints de LED est induite par les dépôts d'immun-complexes dans les reins et notamment d'immun-complexes ADN/anti ADN (9, 10). Récemment Sasaki et al. ont apporté un certain nombre d'éléments conduisant à associer la présence d'immuns-complexes ADN/antiADN à l'incidence de la glomérulonéphrite proliférative diffuse d'où l'intérêt d'éliminer, avant toute complication rénale, les antigènes et les anticorps impliqués dans la formation d'immun-complexes circulant afin de réduire leur formation chez les malades atteints.
Les différentes voies thérapeutiques actuellement utilisées sont principalement : a) le traitement par des glucocorticoïdes qui entraînent à forte dose (de 0,7 à 1 ml/kg) une amélioration clinique franche avec diminution du taux des divers autoanticorps, disparition des immun-complexes et remontée du taux de complément sérique ; b) les immunosuppresseurs, dont l'utilisation est plus controversée ; c) les échanges plasmatiques ou plasmaphérèses ; Si cette dernière technique s'est avérée efficace pour quelques patients lupiques, elle présente de nombreux inconvénients : elle est onéreuse, de mise en oeuvre délicate, l'élimination est non sélective car elle épure non seulement les immun-complexes pathogènes mais, aussi, des constituants essentiels tels que les immunoglobulines, les facteurs de la coagulation, les molécules du complément, et beaucoup d'autres composés ayant une activité régulatrice. Elle est donc beaucoup plus traumatisante pour l'organisme qu'une technique spécifique.
Enfin, le traitement est souvent suivi de phénomènes de « rebonds » où les taux de complexe immuns et d'autoanticorps augmentent dramatiquement quelques jours après l'arrêt du traitement. d) l'aphérèse qui est habituellement réalisée en passant le plasma ou plus rarement le sang sur un support solide sur lequel est lié un ligand capable de réagir spécifiquement et si possible avec une grande affinité avec ies sites présents sur les cellules cibles ou sur les constituants de faible ou haut masse moléculaire.
Dans le cas du LED, une voie thérapeutique possible consiste à éliminer spécifiquement les anticorps pathogènes en l'occurrence les anticorps anti-ADN par ce procédé. Les premières données avaient été fournies par Terman et al. qui avaient utilisé une colonne d'ADN sous forme colloïdale pour épurer le sang de patients lupiques. Cependant, l'usage de l'ADN comme ligand reste très limité en raison, d'une part, de son instabilité au contact d'enzymes telles les nucléases et éstérases^ plasmatiques et, d'autre part, en raison du danger potentiel lié à son caractère potentiellement transformant que pourrait présenter son relargage dans la circulation, complexé à des protéines sériques. Néanmoins, les anticorps anti- ADN peuvent être spécifiquement piégés non pas par l'ADN mais par d'autres composés avec lesquels ces anticorps donnent des réactions croisées. De nombreux auteurs parmi lesquels Lafer et al. puis Shoenfeld ont montré que les anticorps anti-ADN murin et humain sont capables de réagir avec des composés très différents de l'ADN telle que la cardiolipine ou d'autres molécules phospholipidiques négativement chargées ; Susuki et al. ont conçu un système d'aphérèse en continu sur gel de sulfate de dextran couplé à un système de regénération du support et mis en évidence une diminution du taux d'anticorps anti-ADN chez des patients lupiques. Cependant, l'intérêt de cette stratégie thérapeutique paraît limité par le fait que seuls les anticorps anti-ADN sont partiellement éliminés et qu'ils ne sont pas les seuls auto-anticorps à l'origine de lésions rencontrées dans le lupus.
L'acide lipoïque (AL) ou acide lipoïque 6,8 dithiooctanoïque (AT) est une molécule à huit atomes de carbone liée à deux atomes de soufre sur les carbones 6 et 8 pour former un hétérocycle dithiolane. S S
I I
Figure imgf000018_0001
Sur le plan métabolique, il constitue un cofacteur essentiel pour des oxo acides deshydrogénases que sont les complexes multi-enzymatiques essentiel pour des enzymes comme la pyruvate deshydrogénase (PDH) ou oxoglutarate deshydrogénase auxquelles il se lie de façon covalente aux groupements NH2 de la lysine (1 , 2, 21).
Sur le plan immunologique, il a été clairement montré que la partie de la PDH correspondant au site de fixation de l'acide lipoïque constitue un autoantigène susceptible d'être reconnu par des autoanticorps chez des malades atteints de cirrhose biliaire primitive (7). Récemment, des auteurs ont montré que la présence de l'acide lipoïque sur cet autoantigène est déterminante pour cette reconnaissance chez ces malades (6, 7).
Toujours dans le domaine immunologique, il a été démontré que les composés porteurs des groupements sulfhydryles, parmi lesquels figurent le 2- mercaptoéthanol et le dithiothréitol, sont capables de stimuler la production d'anticorps chez des lymphocytes en culture (3, 4, 15, 17).
Ohmori a étudié in vitro l'effet de l'AL dans le but de définir son éventuel caractère immunostimulant (16). Il apparaît évident que l'augmentation de la réponse anticorps consécutive à une stimulation antigénique en présence d'AL est dépendante de la population T. En effet, une déplétion en lymphocytes T auxiliaires annule l'action de l'AL. Par ailleurs, la stimulation obtenue est spécifique de l'antigène utilisé.
Le choix de l'acide lipoïque comme ligand dans le traitement du LED par immunoépuration a été fondé sur les observations suivantes :
1) les sérums de malades atteints de LED contiennent un taux élevé d'anticorps anti-AL de classe IgG mais surtout de classe IgM, à la différence des sujets normaux comme cela apparaît dans la figure 3.
2) Le taux d'anticorps anti-AL augmente dans le sérum de souris MRIJIpr avec l'âge ; en outre ces souris développent spontanément le LED en vieillissant.
Une étude comparative des taux d'anticorps anti-AL chez les souris MRIJIpr et des souris contrôles appelées MRL/mp en fonction de l'âge des animaux fait apparaître clairement que le titre en anticorps anti-AL augmente à partir de la douzième semaine chez la souris MRL/lpr, tandis que ce taux reste faible chez la souris contrôle MRL/mp. Les résultats sont représentés dans la figure 4.
3) Des anticorps anti-AL réagissent avec de l'ADN double brin, mais pas avec l'ADN simple brin (13) ; or, le LED est caractérisé par la présence à un moment donné de la maladie d'anticorps anti-ADN double brin.
4) L'épuration des anticorps anti-AL à partir d'un sérum de patient malade du LED diminue simultanément le taux d'anticorps anti-ADN double brin
(figure 5).
En fonction des observations et des résultats exposés ci-dessus, il apparaissait que l'acide lipoïque était un excellent candidat pour épurer le plasma en anticorps anti-AL et anti-ADN dans la pathologie lupique. L'acide lipoïque est susceptible d'être couplé au support fonctionnalisé par liaison amide avec des groupements aminés conférés, par une monohydrazide.par une dihydrazide, ou par une diamine de formule NH2 - (CH2)n- NH2 avec n compris entre 2 et 6, ou une polyamine de formule NH2 - (CH2)x - NH -(CH2)y - NH2 avec x et y compris 3 et 6, par exemple. Les exemples de réalisation de couplage selon l'invention avec l'acide lipoïque pour le traitement du LED seront donnés dans les exemples de réalisation ci-dessous.
L'invention concerne également le produit de couplage entre un support fonctionnalisé selon l'invention avec l'acide lipoïque, ainsi que son utilisation pour épurer le sérum de patients atteints de LED. Des dispositifs comprenant ce produit de couplage sont particulièrement performants pour traiter les maladies autoimmunes, et plus particulièrement le LED.
L'homme du métier saura, selon les cas, sélectionner le ligand approprié à la thérapeutique d'une pathologie donnée en le sélectionnant dans un groupe constitué, outre les anticorps et les antigènes décrits ci-dessus, de peptides, de glycoprotéines, d'hormones, des enzymes, des cofacteurs de ceux-ci, des substrats ou des inhibiteurs de ceux-ci, des polysaccharides, des lectines, des toxines ou des antitoxines, des acides nucléiques ou polynucléotidiques, des haptènes, des ligands d'haptène, des pigments ou des colorants.
Le traitement d'une pathologie donnée pourra être réalisé par un mélange de ligands, soit simultanément, soit séquentiellement, par utilisation de plusieurs produits de couplage. la présente invention porte sur l'utilisation d'un support fonctionnalisé tel que décrit ci-dessus et résultant de la mise en oeuvre des procédés de l'invention à la fabrication d'un module polyvalent destiné à l'épuration extracorporelle de fluides biologiques et dans lequel sont épurées des espèces biochimiques ou des cellules, présentes dans des fluides biologiques, et dont l'élimination est recherchée, en particulier des antigènes, des anticorps ou des haptènes. La présente invention porte également sur un kit polyvalent de préparation d'un produit de couplage selon l'invention, entre le support fonctionnalisé et un ou plusieurs ligands spécifiques pour l'épuration des fluides biologiques , ledit kit comportant au moins :
1 - un dispositif porteur d'un support susceptible d'être couplé de façon covalente à un ligand ,
2 - un récipient ou poche stérile contenant une solution activatrice de la réaction entre le support fonctionnalisé et le ligand ;
- le ligand dans une solution et une concentration appropriées ; - le cas échéant une ou des solutions de rinçage.
Le kit de l'invention dont un mode de réalisation est représenté sur la figure 10 consiste à proposer une solution thérapeutique associant un support modifié susceptible d'être obtenu par un procédé décrit ci-dessus, la porosité et la modification du support étant adaptées au ligand et à la nature et à la concentration de la ou des molécule(s), ou des éléments figurés que l'on cherche à éliminer dans le fluide biologique.
Dans le kit, le dispositif pourra avantageusement être une cartouche de dialyse, et plus particulièrement une cartouche d'AN 69 fonctionnalisée telle que décrite plus haut.
Quand le ligand du kit de l'invention est l'acide lipoïque, et que les groupements présents sur le support sont des groupements aminés, la solution activatrice sera de préférence la carbodiimide sous forme hydrosoluble.
Quand le ligand du kit de l'invention est un anticorps, la solution activatrice est par exemple le periodate de Na. Les réactions mises en jeu dans les couplages sont des réactions classiques bien connues de l'homme du métier qui pourra mettre en œuvre les conditions opératoires les plus performantes, tant par la nature de l'activateur que par les conditions physicochimiques de la réaction, en fonction du ligand choisi. Le kit de l'invention pourra être avantageusement utilisé par un personnel soignant ou un personnel qualifié associé à ceux-ci pour préparer de façon stérile et extemporanée une cartouche porteuse d'un ligand spécifique et utilisable en circulation extracorporelle pour l'épuration d'un fluide biologique qui sera de préférence le sang ou le plasma. L'invention porte sur l'utilisation d'un kit tel que décrit ci-dessus dans tout traitement prophylactique ou thérapeutique d'un mammifère et plus particulièrement des humains.
L'invention porte enfin sur un procédé de bioépuration spécifique de sang ou de plasma humain ou animal par circulation extracorporelle d'un dispositif comportant au moins un module de l'invention. Dans la représentation schématique de la figure 1 1 , du sang total est traité par circulation extracorporelle, par passage dans un module de l'invention et réadministration au patient. Dans le cadre d'un tel traitement, il y a possibilité d'ultrafiltrer une partie du sang si nécessaire.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et en se reportant aux figures 1 à 22.
La figure 1 représente à titre d'illustration le couplage d'une molécule de faible masse moléculaire, la glycine, ou d'un anticorps à un support fonctionnalisé à la PEI avec les groupements aminés succinylés.
La figure 2 représente un couplage similaire par liaison hydrazone à une molécule de faible poids moléculaire (pyruvate) ou de haut poids moléculaire (anticorps oxydé). La figure 3 présente un titre d'anticorps antiacide lipoïque dans le sérum de souris MLR . En gris clair est représenté le taux dans les souris MRIJIpr et en gris foncé hachuré, le taux obtenu chez les souris MRL/mp.
La figure 4 représente la comparaison des taux d'IgM anti-acide lipoïque dans différentes pathologies. C représente le contrôle, PBC, la cirrhose biliaire primitive, M, la Myastenie, RA, l'arthrite rhumatoïde, SLE, représente le lupus érythémateux disséminé, S, la syphilis et TH la thyroïdite.
La figure 5 représente la diminution des anticorps anti-ADN épurés après passage d'un sérum lupique sur un support laquelle est couplée de façon covalente l'acide lipoïque. La figure 6 représente le nombre de sites disponibles après fonctionnalisation de IΑN69-PEI par l'anhydride succinique. La courbe représente la quantité des anhydrides obtenues par rapport à la quantité d'éthanolamine introduit sur IΑN69 seul succinylé (représenté sur la courbe par un rond) et IΑN69-PEI succinylé. Le dosage a été fait tant à l'entrée (représenté sur la courbe par un triangle), au centre (représenté sur la courbe par un losange) et à la sortie du module (représenté sur la courbe par un carré).
Les figures 7, 8 et 9 représentent la fixation de l'acide pyruvique 4C sur IΑN69 non fonctionnalisée ou fonctionnalisée avec respectivement l'EDC et l'ADH, l'anhydride succinique, l'EDC et l'ADH, et la PEI, l'anhydride succinique, l'EDC et l'ADH.
La figure 10 représente les modalités de préparation d'un module de traitement et la figure 11 les modalités de traitement par circulation extracorporelle. La figure 12 est une représentation schématique du procédé d'obtention d'un support constitué d'une surface époxy couplée à de la putrescine, apte à former une liaison covalente avec l'acide lipoïque, en présence d'un activateur qui est l'EDC. La figure 13 représente , à titre de comparaison, la formation du support par liaison ester directement entre l'AL et les groupements OH de l'epoxy.
La figure 14 compare les taux d'IgM anti-AL obtenus, autrement dit les taux d'épuration, sur un support AN 69-AL obtenu par liaison ester (points noirs) ou par liaison amide (losanges noirs). La figure 15 compare les taux d'épuration obtenus après passages successifs sur des colonnes dont le support est constitué d'AN 69- AL.
La figure 16 représente le profil obtenu en électrophorèse en gel de polyacrylamide 10% des protéines éluées après plusieurs passages sur le même support. La figure 17 indique le taux d'aminés substituées de la PEI-P en fonction de quantités croissantes d'anhydride succinique réagissant avec la PEI.
La figure 18 représente l'influence de la post-succinylation de la PEI-P sur l'activation de contact.
La figure 19 représente la quantité de PEI-P pré-succinylée par minimodule d'AN69 en fonction du degré de succinylation.
La figure 20 représente la quantité de PEI-P pré-succinylée par minimodule d'AN69 en fonction du degré de succinylation et pour des concentrations variables de PEI-P pré-succinylée.
La figure 21 est une représentation schématique de la présentation des groupes chargés de l'acide succinique expliquant les résultats obtenus selon le taux de présuccinylation de la PEI-P.
La figure 22 représente l'activation de la phase contact mesurée par la génération de kallicréine, en fonction du taux de succinylation.
La figure 23 indique la quantité d'héparine qui se fixe sur les minimodules recouverts de PEI-P pré-succinylée en fonction du taux de pré-succinylation.
Procédé de préparation des supports fonctionnalisés pour la bioépuration spécifique et pour la dialyse et rhémonofiltration :
L'étude qui suit porte sur la préparation de membranes de type co- polymère d'acrylonitrile, traitées par post-acylation ou par pré-acylation. Elle permet de mettre en évidence les avantages de la deuxième méthode pour les applications en bioépuration non spécifiques (membranes de dialyse et/ou hémofiltration) ou spécifique (couplage d'un ou de ligands spécifiques de molécules à épurer).
Les modifications de la PEI ont été réalisées dans le but de :
- optimiser le taux de fonctionnalisation, c'est-à-dire le taux de groupements réactifs aptes à être couplés le cas échéant avec un ligand ;
- limiter la thrombogénicité observée avec les membranes polyanioniques non traitées tout en évitant les fixations non spécifiques, par exemple la fixation de l'héparine.
La PEI, qui a été utilisée dans ces expériences, est le LUPASOL-P, commercialisé par la société BASF, et de masse moléculaire moyenne 750 000 Dalton, mesurée par diffusion de la lumière. D'autres types de PEI peuvent être utilisés, notamment le lupasol-WF commercialisé par la même société et de masse moléculaire moyenne 25 000.
L'anhydride d'acide carboxylique utilisé est celui de l'acide succinique. L'acylation est dans ce cas une succinylation.
1 ° Méthode : 1.1 Modification de surface :
Toutes les expériences sont réalisées en utilisant des mini-dialyseurs comprenant 170 fibres creuses AN69 (diamètre interne : 210 μm ; épaisseur de la paroi : 42 μm ; longueur : 0,18 m) et la PEI-P marquée au tritium modifiée ou non en solution dans du sérum physiologique (NaCI 0,14N). Deux approches ont été utilisées : a) les modules ont été d'abord traités avec la PEI-P, marquée au tritium puis succinylée ; b) les modules ont été recouverts avec la PEI-P marquée au tritium préalablement succinylée, totalement ou partiellement. 1.2 Préparation de la PEI-P à différents taux de succinylation :
A 3 mg de PEIP dans 50 ml de Borate 0,05 M pH 8,6 est ajouté de l'anhydride succinique (AS) dissous dans l'acétonitrile. La quantité d'A.S. ajoutée selon le degré de succinylation est la suivante : 100 % de Succinylation : 162 μmol d'AS 80 % de Succinylation : 54 μmol d'AS 60 % de Succinylation : 31 μmol d'AS 40 % de Succinylation : 18 μmol d'AS
20 % de Succinylation : 8 μmol d'AS Après un temps de contact d'une heure sous agitation en ajustant le pH à 8,6 si nécessaire avec de la soude 0,1 M, la réaction est arrêtée par diminution du pH à 5 par ajout d'acide acétique 12 M. Le taux de substitution des aminés est vérifié à l'aide de la fluorescamine selon la méthode décrite dans "Pratique de l'analyse organique calorimétrique et fluorométrique", de J. Bartos et M. Tesez, deuxième édition, 1984, Masson, pages 84 à 85 (figure 17).
Pour revêtir les minimodules, le pH est ajusté à 8. 1.3 Evaluation de la stabilité de la membrane d'AN 69 recouverte par la
PEI :
La stabilité des modifications de surface a été évaluée en établissant une circulation d'une solution de NaCI à différentes concentrations (0,14 M, 1 , 2 et 4 M). 1.4 Evaluation biologique :
Pour évaluer si les minimodules traités conformément à l'invention activent la phase contact, on les soumet au test suivant : un liquide biologique a été préparé, propre à stimuler la production de kallicréines au contact d'une membrane chargée négativement en surface. Le liquide biologique utilisé pour l'essai était constitué de plasma humain pauvre en plaquettes, dilué à 5 % dans du sérum physiologique additionné de citrate (on note que les conditions du test utilisé sont éloignées des conditions d'utilisation d'un appareil pour circulation extracorporelle de sang : le taux de dilution est très élevé, le liquide choisi est du plasma et non du sang, le plasma est additionné de citrate, donc acidifié, alors qu'en dialyse, l'anticoagulant utilisé est de l'héparine. Ces conditions de test sont choisies à dessein car elles stimulent et amplifient l'activation de la phase contact). J 50 ml de ce liquide ont été mis en circulation en circuit ouvert dans le compartiment sang du minimodule à un débit de 05 ml/min pendant 30 minutes. Les kallicréines plasmatiques ont été dosées dans des échantillons de liquide prélevés à intervalles de temps au moyen d'un test chromogénique classique, à partir du substrat S 2302 de la société BIOGENIC.
On précise que, compte tenu de la sensibilité du test chromogénique utilisé, on considère qu'il n'y a pas d'élévation significative du taux de kallicréines si la concentration en kallicréines reste en deçà d'environ 10 unités par litre.
2° Résultats obtenus :
2.1 Modification de surface :
2.1.1 Post-succinylation :
Les modules sont d'abord recouverts de la PEI-P marquée au tritium puis succinylée. Les résultats sont indiqués dans le tableau I ci-dessous : TABLEAU I : Influence de la post-succinylation sur le relargage du PEI-P pré- adsorbé sur AN69
Figure imgf000026_0001
Ces résultats montrent que la post-succinylation entraîne 43 % de relargage de la PEI-P.
Par ailleurs, le niveau d'activation de la phase contact mesurée par le biais de la génération de kallicréines, est représentée sur la figure 18. Cette figure compare la kallicréine produite, mesurée en unité par litre, dans le cas de la membrane d'AN69 nue, de la membrane d'AN69 recouverte de PEI-P et de la membrane d'AN69 recouverte de PEI-P puis succinylée.
Cette figure montre que IΑN69 traitée avec de la PEI-P n'active pas la phase contact. En revanche, la post-succinylation désorbant partiellement la PEI- P, IΑN69 traitée avec de la PEI-P post-succinylée active la phase contact. 2.1.2 Effet de la pré-succinylation ;
Un minimodule recouvert avec la PEI-P marqué au tritium a été pré- succinylée à des degrés divers (figure 17) et la quantité de PEI-P marquée au tritium pré-succinylée adsorbée sur AN69 a été déterminée. Les résultats apparaissent sur la figure 19.
La figure 19 indique que la quantité de PEI-P adsorbée sur TAN69 augmente avec le degré de succinylation, pour atteindre un maximum de 60 %. Au-delà de 60 %, la quantité de PEI-P adsorbée diminue rapidement. Par ailleurs, la quantité de la PEI-P adsorbée augmente tant avec le degré de succinylation (comme l'indique la figure 19) que avec la concentration de PEI-P pré-succinylée introduite dans le minimodule. Le maximum d'adsorption est observé avec une pré-succinylation de la PEI-P de 60 %, et ce dans tous les cas.
La figure 20 indique que la quantité de PEI-P adsorbée sur le mini module atteint un plateau de 216 μg pour des concentrations de PEI-P pré- succinylée introduite dans le minimodule supérieures ou égales à 60 mg/l.
2.1.3 Conclusion :
L'augmentation de l'adsorption de la PEI-P pré-succinylée sur les modules d'AN69 peut résulter d'un changement conformationnel résultant d'une modification des interactions électrostatiques entre les groupes chargés aminés et carboxyles.
La figure 21 est une représentation schématique de l'adsorption de PEI non pré-succinylée (schéma du haut) et pré-succinylée à 30 %, 60 % et 100 %, sur une membrane d'AN69. Lorsque la PEI-P n'est pas pré-succinylée, le nombre de groupements aminé par mole de PEI-P interagissant avec les groupements ioniques (50^) de la membrane est importante. La pré-succinylation diminue le nombre de groupements aminé par mole de PEI-P induisant un changement de conformation de la PEI-P présuccinylée, ce qui augmente la quantité de PEI-P adsorbée et par conséquent le nombre de sites réactifs disponibles pour la bioépuration spécifique. En outre, le contrôle du taux de pré-succinylation permet de maîtriser la quantité de sites réactifs susceptibles d'être obtenus sur les membranes d'AN 69 ainsi traitées.
En revanche, dans le cas de la post-succinylation, il est visible sur le premier schéma de la figure 21 que le nombre de sites N+ réactifs est relativement faible, conduisant ainsi à un nombre de sites carboxyl réactifs après succinylation plus faible que dans le cas de la pré-succinylation.
2.2 Stabilité de la PEI marquée au tritium non succinylée et pré- succinylée après lavage des minimodules avec des concentrations salines croissantes.
Dans le cas de la post-succinylation, le couplage de l'anhydre succinique sur la PEI passe par une étape de déprotonation conduisant à un relargage de 30 à 40 % de la PEI du fait de l'affaiblissement de la liaison entre les groupes NH3+ et les groupes SO3- de la membrane (comme cela été montré plus haut dans le tableau I).
Le tableau II ci-dessous montre le pourcentage de désorption de PEI-P après lavage avec accroissement de la concentration saline.
TABLEAU II :
Figure imgf000028_0001
Le résultat montre que quand les minimodules sont traités avec 40, 60 et 110 mg/l de PEI-P pré-succinylée, puis lavés avec 20 ml de sérum physiologique, (0,14 M NaCI), il n'y a pas de désorption de la PEI-P, et ce jusqu'à une concentration saline de 1 M). En revanche, quand les minimodules sont lavés avec une solution saline ayant une molarité supérieure ou égale à 2M, une désorption partielle de la PEI-P pré-succinylée est observée dans tous les cas.
Le niveau de désorption de la PEI-P pré-succinylée augmente avec le degré de pré-succinylation. Un traitement des minimodules par de la PEI-P pré-succinylée à 60 % est optimal pour obtenir le maximum de sites fonctionnels.
2.3 Hémocompatibilité
La figure 22 indique que IΑN69 traitée avec de la PEI-P pré-succinylée entre 20~et 70 % ne provoque pas l'activation de la phase contact. En revanche, quand le traitement de IΑN69 est réalisé avec une PEI-P présuccinylée à 100 % (figure 22), l'activation de la phase contact observée est équivalente à celle de IΑN69 non traité par la PEI-P.
Un avantage supplémentaire du traitement de surface de IΑN69 avec la PEI-P pré-succinylée est la diminution de l'adsorption de l'héparine sur le support par rapport à l'adsorption observée avec IΑN69 traité avec la PEI-P non succinylée (figure 23). Ceci représente un avantage considérable lorsque ces membranes sont utilisées en hémodialyse/hémofiltration car l'héparine est souvent utilisée comme anticoagulant. 3° Conclusions
Ces expériences comparatives ont permis de définir les conditions optimales de préparation des membranes d'AN69 fonctionnalisées en particulier lorsqu'elles sont traitées avec de la PEI-P pré-acylée. Si l'anhydre d'acide carboxylique est celui de l'acide succinique, ces conditions sont les suivantes : - un degré de succinylation de 60 % ;
- un traitement en surface à une concentration de 60 mg/l de PEI- présuccinylée.
Ceci conduit à :
- une fonctionnalité maximum de 2 μM de COOH/m2 de membrane; - une très bonne stabilité dans un milieu à haute force ionique (jusqu'à 1 molaire) ;
- pas d'activation de la phase contact du sang ;
- une adsorption limitée d'héparine sur le support ce qui présente un avantage considérable lorsque ce type de membranes est utilisé en dialyse/hémofiltration.
De façon générale, cette technique permet de maîtriser de façon reproductible le nombre de sites réactifs présents sur la membrane traitée, à savoir :
- une augmentation du nombre de sites réactifs pour l'application à la bioépuration spécifique ;
- la reproductibilité du nombre de sites réactifs obtenus dans l'ensemble des applications des membranes de l'invention.
Les expériences ci-dessus mettent en outre en évidence l'avantage de la pré-succinylation par rapport à la post-succinylation ; en effet, dans cette dernière un relargage de la PEI préfixée entraîne la formation probable de « trous » dans le revêtement de la membrane AN69. L'existence de tels « trous » conduit à des effets indésirables notamment des effets d'activation de la phase contact, observés sur la membrane nue, non recouverte.
Exemple 1 : Immobilisation des Ac anti IL6 sur AN69 PEI-PEG epoxyde : Nous avons entrepris des expériences pour déterminer la meilleure méthode pour immobiliser les Ac anti IL6 sur les supports insolubles, par exemple le sepharose, et une fois la méthode établie de l'appliquer à IΑN69. Deux techniques de couplage des AC ont été mises en oeuvre en utilisant les IgG marqués au tritium [3H]. a) un couplage par liaison amide sur des εNH2 de la lysine dans la chaîne protéique des IgG ; b) un couplage par liaison hydrazone sur des groupements glucidiques préalablement oxydés et qui se trouvent sur la partie Fc de l'IgG selon la technique décrite dans les documents suivants : brevet US n° 4217338 ; Quash et al. J. Immunol. Methods, 1978, 22, 165-174.
Les billes de sepharose et les Ac anti IL6 sont mis en contact pendant 2 heures à raison d'un volume de billes pour un volume d'AclL6 à des concentrations croissantes d'AclL6 déposées.
La quantité de radioactivité obtenue sur chaque échantillon de billes est alors mesurée sur un compteur à scintillation liquide PACKARD MINAXI β.
Les résultats sont indiqués dans les tableaux I et II ci-dessous :
TABLEAU I : COUPLAGE COVALENT DE l'Ac anti IL6 SUR BILLES de SEPHAROSE
I - a : PAR LIAISON AMIDE
Figure imgf000031_0001
- b : PAR LIAISON HYDRAZONE
Figure imgf000031_0002
Les résultats du tableau I montrent que :
1) pour des faibles concentrations d'Ac anti IL6 mises en jeu, la quantité d'Ac couplé représente 20 % de la quantité d'Ac déposé et ce pour les deux techniques (tableau I).
2) le fait d'augmenter la concentration d'Ac anti IL6 déposé entraîne une augmentation de la quantité d'Ac anti IL6 couplé par les deux techniques puisqu'on passe de 0,54 μg à 13,6 μg d'Ac anti IL6 couplé pour 40 cm2 de billes lorsque l'Ac anti IL6 est couplé par liaison amide. Cette quantité est de 0,38 μg à 18 μg d'Ac anti IL6 couplé pour 40 cm2 de billes lorsque l'Ac anti IL6 est couplé par liaison hydrazone. 3) lorsque les Ac anti IL6 sont couplés par liaison hydrazone, le rendement de couplage augmente en fonction de la quantité d'Ac anti IL6 déposée, passant de 20 % à 42 % alors que pour les Ac anti IL6 couplés par liaison amide, le rendement d'Ac anti IL6 couplé reste constant (26 %) en fonction de la quantité d'Ac déposé.
Des expériences entreprises pour déterminer le degré d'adsorption des anticorps anti IL-6, oxydés ou non oxydés, sur des billes de Sepharose ont montré que cette adsorption ne dépassait pas 7 %.
Il apparaît donc que si la quantité d'Ac anti IL6 couplé augmente pour les deux techniques en fonction de la concentration d'Ac anti IL6 déposé, l'efficacité de couplage de ces Ac anti IL6 est supérieure lorsque ces Ac anti IL6 sont couplés par liaison hydrazone.
Ceci est plus marqué à des fortes concentrations d'Ac ajouté:
- 42 % pour liaison hydrazone, - 26 % pour liaison amide.
Exemple 2 : Immunoépuration de l'antigène IL6 sur AN69 PEI-PEG epoxyde :
2.1 Sur billes de sepharose avec des Ac anti IL-6 couplés par liaison amide ou liaison hydrazone : Des essais d'immunoépuration de l'IL6 ont été effectués en utilisant :
- d'une part des billes sur lesquelles l'Ac anti IL6 a été couplé à des quantités croissantes soit par liaison amide soit par liaison hydrazone selon les techniques et les mêmes rapports énoncés dans le paragraphe 1,1) et le tableau I,
- d'autre part en faisant varier le taux d'IL6 présent dans les sérums à tester. Pour cela, nous avons dilué un sérum contenant un taux très élevé d'IL6
(1 ,7 μg d'IL6 pour 1 ml de sérum) dans un mélange de sérums négatifs, testés préalablement. Finalement les sérums testés ont un taux d'IL6 final de 33 050, 22 470, 11 235 et 3 157 pg/ml.
Ces billes de sepharose/ Ac anti IL6 sont alors mises en contact avec les différents mélanges de sérums modifiés à raison d'un volume de billes pour un volume de sérums.
Le taux d'IL6 restant dans les sérums avant et après passage est mesuré par une technique immunoenzymatique de type sandwich. Les résultats figurent dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU II a : % d'IL6 immunoepure après passage sur billes
PAR LIAISON AMIDE
Figure imgf000033_0001
TABLEAU II b : % d'IL6 immunoepure après passage sur billes
PAR LIAISON HYDRAZONE
Figure imgf000033_0002
Figure imgf000034_0001
Ces résultats montrent que :
1) le support seul (billes sans Ac anti IL6) traité ou non avec l'hydrazine ne fixe pas l'IL6. 2) plus la quantité d'Ac anti IL6 couplée est importante plus l'immunoepuration de l'IL6 est efficace et ceci pour les deux techniques de couplage utilisées.
3) lorsque les Ac anti IL6 sont couplés à raison de 13,6 μg/40 cm2 (liaison amide) et 18 μg/40 cm2 (liaison hydrazone), l'immunoepuration de l'IL6 est efficace à 90-100 % pour les deux techniques de couplage utilisées et pour des sérums ayant un faible ou un fort taux d'IL6.
4) pour des quantités d'Ac anti IL6 couplés inférieures à 13,6 μg/40 cm2 (liaison amide) et 18 μg/40cm2 (liaison hydrazone) l'immunoepuration de NL6 diminue en fonction de la quantité d'Ac anti IL6 couplé et en fonction du taux d'IL6 présent dans le sérum.
En effet, lorsque l'AC ANTI IL6 est couplé par liaison amide à 2,64 μg/40 cm2, l'efficacité d'immunoépuration diminue de 98 % pour un sérum avec 3.157 pg/ml d'IL6 à 81 ,3 % pour un sérum avec 35 030 pg/ml d'IL6. De même, lorsque l'Ac anti IL6 est couplé à 0,54 μg/40 cm2, l'efficacité d'immunoépuration diminue de 86,9 % pour un sérum avec 3 157 pg/ml d'IL6 à 18,5 % pour un sérum avec 35 030 pg/ml d'IL6. (tableau II).
Lorsque l'Ac anti IL6 est couplé par liaison hydrazone à 2,72 μg/40 cm2, l'efficacité d'immunoépuration diminue de 9° % pour un sérum avec 3 157 pg/ml d'IL6 à 54,2 % pour un sérum avec 35 030 pg/ml d'IL6. De même lorsque l'Ac anti IL6 est couplé à 0,38 μg/40 cm2, l'efficacité d'immunoépuration diminue de 57,1 % pour un sérum avec 3 157 pg/ml d'IL6 à 28,5 % pour un sérum avec 35 030 pg/ml d'IL6 (tableau III). Conclusion :
Le couplage des Ac anti IL6 par liaison amide ou par liaison hydrazone préserve leur activité vis-à-vis de l'IL6.
Pour que l'immunoepuration de l'IL6 présent dans un sérum contenant jusqu'à 35 000 pg/ml soit efficace à 90-100 %, la quantité d'Ac anti IL6 couplé doit être de l'ordre de 0,4 μg/cm2. Cette efficacité d'immunoépuration est la même pour des Ac anti IL6 couplés soit par liaison amide soit par liaison hydrazone.
Pour des quantités d'Ac anti IL6 couplé inférieures à 0,4 μg/cm2, l'immunoepuration de l'IL6 est d'autant moins efficace que le taux d'IL6 présents dans un sérum est fort. Cette constatation est vraie pour les deux types de liaison, néanmoins lorsque les Ac anti IL6 sont couplés par liaison amide l'immunoepuration de l'IL6 est d'une manière générale plus efficace que lorsque les Ac anti IL6 sont couplés par liaison hydrazone.
La quantité optimale d'Ac anti IL6 couplé par cm2 pour une immunoépuration de l'IL6 totale ayant été définie sur billes, nous pouvions passer à l'immunoepuration de l'IL6 sur minimodules AN69.
2.2. Essais d'immunoépuration de l'IL6 sur minimodules AN69 :
Les minimodules ont été hydrophilisés et fonctionnalisés (H&F) selon la méthode décrite dans WO 92/07023.
1 ) Méthodes :
Des minimodules comprenant 170 fibres creuses en AN69 de 18 cm de long ont été assemblés (surface interne : 256 cm2). Ces minimodules ont subi un traitement par le PEG tétrapoxyde afin de générer des groupements époxides. Nous avons couplé par liaison hydrazone des Ac anti IL6 marqués au propionate 3H, sur un des deux minimodules AN69 dans les mêmes conditions que pour les billes à raison de 0,4 μg/cm2 sachant que ces 0,4 μg/cm2 d'Ac couplés représentent théoriquement 42 % des Ac déposés si on considère que l'efficacité de couplage sur les fibres AN69 est similaire à l'efficacité de couplage sur les billes de sepharose.
Nous avons donc mis en contact 0,95 μg d'Ac pour 1cm2 de fibre soit 243 μg d!Ac pour 256 cm2 fibres.
D'autre part, nous avons couplé des Ac de chèvres témoins toujours par liaison hydrazone sur le deuxième minimodule AN69 dans les mêmes conditions que pour le minimodule AN69 + Ac anti IL6.
Trois ml de sérum à 11 203 pg/ml d'IL6 ont été recyclés pendant deux heures sur ces minimodules (0,5 ml/mn).
Puis le taux d'IL6 présent est alors mesuré par une technique immunoenzymatique de type sandwich avant et après passage sur ces minimodules.
D'après le tableau III, il apparaît que l'immunoepuration a été efficace et spécifique puisque après passage sur IΑN69 greffé avec les Ac témoins il n'y a que 14 % d'IL6 enlevés non spécifiquement tandis que après passage sur AN69 avec les Ac anti IL6 le taux d'immunoépuration augmente jusqu'à 77,5 %.
TABLEAU III : IMMUNOEPURATION D'IL6 APRES PASSAGE SUR AN69
Figure imgf000036_0001
Dans les conditions expérimentales utilisées, le taux de fixation d'anticorps anti-IL6 sur le module d'AN69 est de 0,11 μg/cm2.
L'hypothèse la plus vraisemblable qui peut expliquer ce rendement moyen de couplage des Ac anti IL6 sur les fibres AN69 est la rareté des sites époxides à la surface des fibres et donc la rareté après traitement à l'adipic dihydrazide de groupements hydrazines disponibles pour générer une liaison hydrazone avec les aldéhydes de la partie glucidique des Ac oxydés.
Nous savons que l'immunoepuration de NL6 est efficace à 100 % pour des sérums où leurs taux d'IL6 est < à 35 000 pg/ml, à condition que la quantité d'Ac anti IL6 couplé soit d'au moins 0,4 μg/cm2. Or, nous avons à notre disposition un système (fibre AN69) qui vraisemblablement ne permet pas d'obtenir -une telle densité d'Ac couplé de façon covalente au cm2 et donc limite l'immunoepuration de l'IL6.
2.3 Contrôle de la capacité à fixer le complément :
L'efficacité d'épuration d'IL6 sérique par le minimodule AN69 hydrophilisé et fonctionnalisé H& F greffé avec des Ac anti IL6 ayant été prouvée, nous avons déterminé si ce même minimodule chimiquement modifié préservait sa propriété initiale concernant sa non réactivité envers le système du complément. Nous avons donc vérifié sa capacité à fixer ou non le complément.
Les membranes AN69 H&F n'ont pas fixé le complément ajouté à raison de 0,625 UH50 ou à 2,5 UH. Les cartouches AN69 H&F greffées avec l'Ac permettent d'éliminer spécifiquement l'Ag correspondant et n'engendrent pas la fixation du complément.
Exemple 3 : Préparation de IΑN69 PEI post-succinylée pour la bioépuration spécifique :
Cette préparation a été faite par traitement des minimodules avec de la PEI WF, suivi par une post-succinylation.
3.1 Détermination du nombre de sites disponibles sur AN 69-PEI pour la fixation de molécules de faible masse moléculaire (FPM) :
1) Après fonctionnalisation de l'AN 69-PEI par l'anhydride succinique :
Pour cette étude, nous avons utilisé un module constitué d'une membrane plane représentant une surface de 1 m2. Ce module a été traité avec de la PEI puis démonté afin de pouvoir prélever aux extrémités et au centre du module des échantillons de membrane de 4,5 cm2 à l'aide d'un emporte pièce.
Nous avons comparé le nombre de sites disponibles sur ces pastilles AN 69-PEI par rapport à des pastilles AN 69 témoins en utilisant une molécule de FPM radiomarquée : la [14C] éthanolamine.
L'anhydride succinique est ensuite fixé par le protocole suivant :
- Préparation d'une solution d'anhydride succinique à 1 M en acétonitrile ;
- Dilution de celle-ci au 1/10 dans tampon borate 50 mM pH 8,5 et laisser en contact avec les pastilles AN 69 témoin et AN 69 PEI pendant 15 minutes ; - Recommencer l'opération une deuxième fois ;
- Lavages intenses en H20.
Sur les parties ainsi obtenues, l'éthanolamine marquée est fixée de la façon suivante : a) activation des groupements COOH générés : a - 1 ) : préparer une solution d'1 ethyl 3(3 diméthylaminopropyl carbodiimide) (EDC) (50nM) et de N. hydroxysuccinimide (NHS) (50nM) dans NaH2P0 10nM et laisser en contact 15 minutes avec les pastilles. a - 2) : éliminer la solution d'activation. b) fixation d'éthanolamine : b - 1 ) : préparer des dilutions isotopiques d'éthanolamine froid/éthanolamine marquée
- 4nmol froid / 0,4 nmol marqué - 40 nmol froid / 0,4 nmol marqué
- 400 nmol froid / 0,4 nmol marqué
- 4000 nmol froid / 0,4 nmol marqué.
Chaque solution étant préparée dans 50 mM Borate pH 8 final, b - 2) : laisser en contact avec les pastilles AN69 témoin et AN69-PEI pendant deux heures sous agitation, puis laver en borate/NaCI 0,5 M et compter. La figure 6 montre que :
- la quantité optimale d'éthanolamine retenue sur AN69 + PEI + anhydride succinique est de 5,6 nmol/pastille ;
- la quantité d'éthanolamine retenue sur AN 69 + anhydride succinique est de 1 ,2nmol/pastille.
Donc la quantité d'éthanolamine retenue réellement sur AN69 + PEI succinylé est de 5,6 - 1 ,2 = 4,4 nmol / 4,5 cm2 , soit : 1nmol / cm2 ou 10 μmol/m2.
Enfin la figure 6 montre que la quantité d'éthanolamine retenue sur AN 69 + PEI succinylé est homogène sur la totalité du module puisque nous trouvons le même nombre de sites à l'entrée, au centre ou à la sortie du module.
2) après fonctionnalisation de l'AN 69-PEI succinylé par l'adipique dihydrazide (ADH)
L'ADH est fixé de la façon suivante :
Après activation des groupements COOH (voir a)), préparer une solution d'ADH à 50 mM en borate 50 mM pH 8,5 et laisser en contact avec les pastilles d'AN69 pendant 1 heure.
Laver abondamment en borate puis en H20 puis en acétate.
La fixation d'acide pyruvique 14C sur les pastilles est effectuée de la manière suivante :
Préparer des dilutions isotopiques d'acide pyruvique froid / acide pyruvique marqué dans 1 ml d'acétate 50 nM pH 5,4 : 0 nmol froid / 5 nmol marqué - 20 nmol froid / 5 nmol marqué
- 200 nmol froid / 5 nmol marqué
- 2000 nmol froid / 5 nmol marqué ;
Laisser en contact avec les pastilles pendant 2 heures puis laver en acétate, NaCI 0,5 M et compter. La figure 7 montre que la quantité d'acide pyruvique optimale retenue sur
AN 69 + ADH est de 0,1 nmol / pastille avec ou sans activation (EDC) du support. La figure 8 montre que la quantité d'acide pyruvique optimale retenue sur AN 69 succinylé + ADH est de 0,5 nmol / pastille avec ou sans activation (EDC) du support pour des quantités d'acide pyruvique introduites supérieures à 150 nMole par pastille.
La figure 9 montre que :
- la quantité d'acide pyruvique couplée sur AN 69 + PEI + anhydride succinique + ADH est d'au moins 1 ,1 nmole par pastille après activation des carboxyles générés sur le support (via l'anhydride succinique) pour la fixation par liaison amide de l'ADH ;
- lorsqu'on n'active pas les groupements carboxyles générés sur le support, la quantité d'acide pyruvique adsorbée sur AN 69 + PEI + succinylation + ADH est de 0,45 nmole par pastille.
En conclusion, la fonctionnalisation de l'AN 69 par le PEI tout d'abord et ensuite par l'anhydride succinique augmente le nombre de sites disponibles pour les molécules de faible masse moléculaire d'au moins 5 fois. Cette augmentation est du même ordre de grandeur après traitement par l'ADH.
3.2 Détermination du nombre de site disponible sur AN 69-PEI pour la fixation de molécules de haut masse moléculaire (HPM) : Pour cette étude, nous avons mis en contact deux concentrations d'Immunoglobuline (Ig) oxydées ou non oxydées (5 μg et 60 μg) avec des pastilles d'AN 69 fonctionnalisées ou non fonctionnalisées.
Figure imgf000040_0001
La fonctionnalisation de l'AN 69 tout d'abord par le PEI et ensuite par l'anhydride succinique et finalement par l'ADH permet d'augmenter d'au moins deux fois le nombre de sites disponibles pour les molécules de haut masse moléculaire.
Exemple 4 : Immunoépuration des Anticorps anti acide lipoïque (AL) sur AN69 PEI post-succinylé :
En ce qui concerne le LED, les résultats présentés sur les figures 1 , 2 et
3 nous ont incités à mettre au point des cartouches capables d'éliminer spécifiquement les Ac anti AL dans le plasma des malades atteints de LED. L'AL étant un haptène de PM de 100 kDa, la technique développée pourrait être étendue à d'autres haptènes contenant des groupements COOH fonctionnels.
La fixation de l'AL de façon covalente sur un support insoluble se fait de la manière suivante : - le groupement fonctionnel terminal époxy a été substitué avec de la putrescine directement pour former un bras se terminant par une αNH2 sur laquelle a été greffé par liaison amide l'acide lipoïque (voir figure 1).
Cette mise au point était nécessaire pour deux raisons : d'une part, elle devrait permettre la réutilisation de la cartouche après élution des Ac en milieu alcalin et, d'autre part, la liaison amide est intrinsèquement beaucoup plus stable que la liaison ester (voir figure 2) qui aurait été formée si l'AL avait été couplé directement avec des groupements OH de l'époxide hydrolysée (voir figure 5). 4.1 Etude comparative d'immunoépuration en fonction du type de liaison de l'AL :
La figure 5 montre que l'immunoepuration des IgM anti-AL est nettement plus efficace lorsque l'AL est couplé par une liaison amide puisque la totalité de ces anti-AL est éliminée alors que l'AL couplé par une liaison ester ne provoque qu'une diminution très faible des IgM anti-AL de l'ordre de 8 %.
L'efficacité d'immunoépuration des Ac anti-AL par AL couplé par liaison amide étant prouvé, l'étape suivante consistait à tester la réutilisation et donc la stabilité du support. Pour cela, nous avons, sur le même support, immunoepure six échantillons provenant du même sérum lupique.
4.2 Essais de réutilisation du minimodule AN69 H&F -AL :
La figure 8 montre que six passages successifs, avec une étape d'élution entre chaque passage, sur le même support de six échantillons différents mais provenant du même sérum lupique donne une efficacité d'épuration des Ac anti- AL identique après le premier passage comme après le sixième passage.
L'élution successive des protéines retenues après ces six passages donne le même profil sur gel de poiyacrylamide (figure 9).
Conclusion : Nous avons donc mis au point sur l'AN 69 un système d'immunoépuration des Ac anti-AL efficace, spécifique et réutilisable en circulation extracorporelle.
Exemple 5 : Couplage par covalence d'IgG purifiées sur AN69 PEI-P présuccinylée : 5.1 Matériels :
Les expériences sont réalisées sur des minidialyseurs comportant 170 fibres creuses en AN69 (diamètre interne : 210 μm ; épaisseur de la paroi : 42 μm ; longueur : 0,18 m).
Les IgG de chèvre proviennent de chez Biosys (Compiègne France). Des IgG de souris et IgG de lapin ont été purifiées au laboratoire respectivement sur colonne de protéine A sepharose à partir d'un pool de liquide d'ascite e_t sur DEAE cellulose à partir d'un sérum de lapin. 5.2 Méthode :
5.2.1 Préparation des IgG radiomarquées :
Les IgG de souris, de lapin et de chèvre ont été radiomarqués N- succinidyl(2 - 3 3H) propionate et l'excès de radioactivité éliminé par dialyse. - activité spécifique des IgG après dialyse : IgG desouris :1 ,25 106 cpm/mg protéine IgG de lapin : 1 ,86 106 cpm/mg protéine IgG de chèvre : 0,77 106 cpm/mg protéine
5.2.2 Modification des minimodules
5.2.2.1) 6 minimodules ont été déglycérinés puis traités avec une solution de PEI-P présuccinylée à 60 % ;
5.2.2.2) 3 minimodules, notés A, B, C sont ensuite activés par un carbodiimide tandis que les 3 autres appelés D, E, F sont laissés tels quels ;
5.2.2.3) 50 μg d'IgG de lapin radiomarqués sont recyclés pendant 2 heures en PBS (volume final : 3ml) sur les minimodules A et D.
50 μg d'IgG de souris radiomarqués sont recyclés pendant 2 heures en PBS (volume final : 3 ml) sur les minimodules B et E.
50 μg d'IgG de chèvre radiomarqués sont recyclés pendant 2 heures en PBS (volume final : 3 ml) sur les minimodules C et F.
5.2.2.4) Les 6 minimodules sont ensuite lavés jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de traces de radioactivité.
La quantité d'IgG couplée correspond à la quantité de radioactivité introduit - la quantité de radioactivité restituée.
5.3 Résultats : Quantité d'IgG couplée sur AN69 présuccinylé
Figure imgf000042_0001
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Claims

REVENDICATIONS
1. Module pour l'épuration extracorporelle spécifique d'un fluide biologique comprenant un compartiment pour la circulation dudit fluide, ce compartiment étant délimité au moins partiellement par un support fonctionnalisé ou une paroi dont la surface comprend des groupements fonctionnalisés, et satisfaisant aux conditions suivantes:
- être stables au moins à une température comprise entre environ 15°C et environ 45 °C ; - être stable à au moins un type de procédé de stérilisation applicable aux dispositifs médicaux; et en particulier aux rayonnements gamma;
- être aptes à engendrer, en présence d'une substance activatrice, des groupements fonctionnels, en ce sens qu'ils sont aptes à former des liaisons covalentes avec des ligands porteurs de groupements : NH
-CHO, -NH2, -COOH, -SH, -0H,-NH-C
NH2
2. Module pour l'épuration extracorporelle d'un fluide biologique comprenant au mois un compartiment pour la circulation dudit fluide, ce compartiment étant délimité au moins partiellement par un support fonctionnalisé ou une paroi dont la surface présente des charges , par l'intermédiaire desquelles sont liées par liaisons ioniques des molécules ou macromolécules d'un premier type exhibant, une fois liées, des groupements aminés libres sur lesquels sont fixées, par liaison covalente, des molécules d'un deuxième type qui, une fois liées, exhibent des groupements carboxyliques libres aptes à former directement ou indirectement des liaisons amides, esters, thioesters et dérivées de la guanidine.
3. Module selon la revendication 2, caractérisé en ce que sont fixés par liaison covalente sur les groupements carboxyliques des molécules de troisième type ayant une fonction d'espaceur pour diminuer l'encombrement stérique et favoriser la fixation ultérieure d'un ligand et/ou de la molécule ou éléments figurés à épurer.
4. Module selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que sont fixés par liaison covalente sur les groupements carboxyliques des molécules d'un quatrième type ayant pour fonction d'augmenter l'hydrophilie du support en vue de limiter les interactions non spécifiques.
5. Module selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que sont fixés par liaison covalente sur les groupements carboxyliques des molécules d'un cinquième type exhibant, une fois liées, des groupements d'une autre nature, permettant un autre type de couplage covalent avec un ligand porteur notamment de groupements - CHO ou -COOH.
6. Module selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que la membrane est une une membrane semi-perméable fabriquée à partir d'un copolymère d'acrylonitrile et de méthallyle sulfonate de sodium.
7. Module selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la molécule du premier type est une polyéthylénimine (PEI) de masse moléculaire comprise entre 10 000 et 2 000 000 daltons, la PEI étant substituée ou non .
8. Module selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que la molécule de deuxième type est un anhydride d'un acide dicarboxylique de formule:
X /CX O
CO dans laquelle X = [CHsJn, n étant égal à 2 ou 3, ou X = - CH = CH -.
9. Module selon l'une des revendications 2 à 7 caractérisé en ce que la molécule de deuxième type est un anhydride d'un acide monocarboxylique de formule:
CH3 CO O
CH3 CO
10. Module selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que une seule molécule remplit les fonctions des troisième, quatrième, et cinquième types de molécule , ladite molécule étant une di-hydrazine de formule: NH2 - NH - CO - Y - CO - NH - NH2, où Y est de préférence un groupement (CH2)m dans lequel m est compris entre 2 eL6.
1 1. Procédé de préparation d'un support biocompatible fonctionnalisée porteur de groupements aptes à former des liaisons covaientes avec des groupements organiques, notamment :
NH -CHO, -NH2, -COOH, -SH, -OH.-NH-C TMH2
comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de supports portant des groupements anioniques fixes avec de la poiyéthylènimine (PEI) de masse moléculaire comprise entre 10 000 et 2 000 000, la PEI étant substituée ou non ; b) mise en contact du support traité en a) avec une solution d'un anhydride d'acide carboxylique de formule :
Figure imgf000048_0001
CO dans laquelle X = [CH2]n, n étant égal à 2 ou 3, ou X = - CH = CH - ou de formule :
CH3 CO ^^
O CH3 CO c) le cas échéant, mise en contact du support modifié par les étapes a) et b) avec une di-hydrazide de formule :
NH2 - NH -CO- Y - CO - NH - NH2. où Y est de préférence un groupement (CH2)m dans lequel m est compris entre 2 et 6
12. Procédé de préparation d'un support biocompatible fonctionnalisé porteur de groupements susceptibles de former des liaisons covaientes avec des groupements organiques, notamment
NH - CHO, - NH2, - COOH, -0H.-NH-C
NH2 lesdits supports étant susceptibles d'être obtenus par la mise en contact de supports à caractère ionique avec le produit de la réaction entre : a) la polyethylenimine (PEI) de masse moléculaire comprise entre 10.000 et 2.000 000, substituée ou non ; b) une solution d'un anhydride d'acide carboxylique de formule :
Figure imgf000049_0001
dans laquelle X = [CH2]n, n étant compris entre 1 et 4, ou X = - CH = CH -, ou de formule : CH3 — CO
O
CH3 CO ^ le support ainsi modifié est le cas échéant mis en contact avec une dihydrazide de formule : NH2 - NH -CO- Y - CO - NH - NH2,
Y étant choisi parmi les groupements qui ont la double propriété d'être porteurs de groupements hydrophiles qui n'activent pas le complément et d'être stables aux rayonnements γ, et étant est de préférence un groupement [CHJm, dans lequel n est compris entre 2 et 6 .
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12 dans lequel le support à caractère ionique est un copolymère d'acrylonitrile et de metallyl sulfonate de Na.
14. Procédé selon la revendication 11 à 13 caractérisé en ce que l'anhydride d'acide carboxylique est l'anhydride succinique.
15. Procédé selon l'une des revendications 11 à 14 dans lequel la di- hydrazine est l'ADH (adipic di-hydrazine).
16 Support biocompatible fonctionnalisée susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 11 à 15.
17. Support selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être couplé de façon covalente à des ligands sélectionnés dans un groupe constitué d'anticorps, d'antigènes, de peptides, de protéines, ou glycoprotéines, des hormones, des enzymes, de cofacteurs de ceux-ci, des substrats-ou des inhibiteurs de ceux-ci, des polysaccharides, des lectines, des toxines ou des antitoxines, des acides nucléiques ou polynucleotides, des haptènes ou des ligands d'haptènes, des pigments ou colorants.
18. Support selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il entre dans la constitution d'une membrane notamment une membrane de dialyse sous forme de films plans ou de fibres, poreux ou non, pleines ou creuses, des microbilles poreuses ou non ou d'une combinaison de ceux-ci.
19. Support selon la revendication 16 caractérisé en ce que il s'agit d'une membrane de dialyse destiné à la dialyse rénale ou à l'hémofiltration.
20. Utilisation d'un support selon l'une des revendications 15 à 19 dans la fabrication d'un module polyvalent destiné à l'épuration extracorporelle de fluides biologiques, ledit module répondant à la définition de l'une quelconque des revendications 1 à 9.
21. Utilisation selon la revendication 20, dans laquelle sont épurés par le module : des espèces biochimiques ou des cellules, présentes dans des fluides biologiques, et dont l'élimination est recherchée.
22. Produit du couplage entre un support défini dans l'une quelconque des revendications 16 à 18 et un ligand sélectionné dans un groupe constitué d'anticorps, d'antigènes, de peptides, de protéines, ou glycoprotéines, des hormones, des enzymes, de cofacteurs de ceux-ci, des substrats ou des inhibiteurs de ceux-ci, des polysaccharides, des lectines, des toxines ou des antitoxines, des acides nucléiques ou polynucleotides, des haptènes ou des ligands d'haptènes, des pigments ou colorants.
23. Dispositif pour circulation extracorporelle de sang incorporant un support selon l'une, quelconque des revendications 16 à 19.
24. Dispositif selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un dispositif de dialyse.
25. Kit comprenant :
- un module polyvalent selon l'une, quelconque des revendications 1 à
11 ,
- un récipient ou poche stérile contenant une solution activatrice de la réaction entre le support fonctionnalisé et un ligand ;
- le cas échéant un récipient ou poche stérile contenant une solution du ligand choisi ;
- le cas échéant les solutions tampons ou de rinçages nécessaires à l'activation et/ou au couplage covalent du ligand.
26. Kit selon la revendication 25, caractérisé en ce que la solution activatrice est la carbodiomide et le ligand est l'acide lipoïque.
27. Kit selon l'une des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce que la solution activatrice est le periodate de sodium et le ligand est un anticorps.
28. Utilisation d'un kit selon l'une quelconque des revendications 25 à 27 dans l'épuration extracorporelle de fluides biologiques.
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