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WO1998035035A1 - Nouveau recepteur de chimiokine cxc murin - Google Patents

Nouveau recepteur de chimiokine cxc murin Download PDF

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Publication number
WO1998035035A1
WO1998035035A1 PCT/JP1997/000299 JP9700299W WO9835035A1 WO 1998035035 A1 WO1998035035 A1 WO 1998035035A1 JP 9700299 W JP9700299 W JP 9700299W WO 9835035 A1 WO9835035 A1 WO 9835035A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mouse
hiv
polypeptide
cells
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/000299
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tadamitsu Kishimoto
Takashi Nagasawa
Kazunobu Tachibana
Hisashi Iizasa
Nobuaki Yoshida
Toshihiro Nakajima
Osamu Yoshie
Original Assignee
Shionogi & Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shionogi & Co., Ltd. filed Critical Shionogi & Co., Ltd.
Priority to AU59643/98A priority Critical patent/AU734252B2/en
Priority to DE69739525T priority patent/DE69739525D1/de
Priority to KR10-1999-7007081A priority patent/KR100462431B1/ko
Priority to CA002279461A priority patent/CA2279461A1/en
Priority to JP53408598A priority patent/JP4116087B2/ja
Priority to US09/367,052 priority patent/US7074616B1/en
Priority to PCT/JP1997/000299 priority patent/WO1998035035A1/ja
Priority to EP97954863A priority patent/EP0960935B1/en
Priority to AT97954863T priority patent/ATE438718T1/de
Publication of WO1998035035A1 publication Critical patent/WO1998035035A1/ja
Priority to US11/437,734 priority patent/US7361737B2/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel mouse C X C chemokine receptor and a mouse chemokine receptor gene. More specifically, the present invention relates to a polypeptide encoded by the gene, an expression vector containing the gene, a transformant into which the expression vector has been introduced, and a monoclonal antibody against the polypeptide. Furthermore, the present invention relates to a method for producing the polypeptide using the transformant. Furthermore, the present invention relates to a method for screening an agonist or an agonist of a chemokine, and a method for screening an AIDS onset inhibitor or an HIV-1 infection inhibitor. Background art
  • Tissue damage caused by bacterial or viral infections, physical or chemical trauma, autoimmune diseases, allergic diseases, etc. triggers an inflammatory response with signs of redness, edema, fever, pain, etc.
  • accumulation and infiltration of peripheral blood leukocytes are observed.
  • Different types of leukocytes exude to sites of inflammation depending on the disease.
  • neutrophils in acute inflammation such as normal bacterial infections, immune complex deposition, trauma, etc., mainly monocytes in M. tuberculosis, Salmonella typhi, and delayed-type hypersensitivity, and mainly in viral infections.
  • Lymphocytes accumulate and infiltrate into the nucleus, and eosinophils and basophils are exuded with immediate allergic or parasite infection (Baggioloni, M. et al., Immunol. Today, 15, 127-133 ( 1994) Recently, a chemotactic factor of a polypeptide having four characteristic cysteine residues having a certain degree of selectivity for migrating leukocytes was discovered, which has homology to the amino acid sequence.
  • Chemokine (Chemokine; Chemoattractant and cytokine activit)
  • the four cysteine residues of the chemokine are disulfide bonded between the first and third residues and between the second and fourth residues, respectively.
  • the biological activity is characterized by the presence or absence of another amino acid between the first and second cysteine residues.
  • These subfamilies are called CXC chemokines and CC chemokines to distinguish them. (Baggioloni,. Et al., Adv. Immunol., 55, 97-179 (1994)).
  • CXC chemokines discovered so far include PBSF / SDF-1, IL-8 (Yoshimura. T. et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA 84, 9233-9237 (1987)), NAP-2 (Walz. A, et al., Biochem. Biophys. Res. Co. Oki un., 159. 969-975 (1989)), NAP-4, GRO (Richmond, A. et al., J. Cell. Biochem .. 36, 185- 198 (1988)), GRO / SCHaskill. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • CC chemokines can be obtained from MCP-l ((Yoshimura, T. et al., J. Immunol., 142, 195 6-1962 (1989), CP-2 (Chang, H. et al., Int. Immunol., 1, 388-). 397 (1989)), CP-3 (Van Damme.J. Et al., J. Exp.Med., 176, 59-65 (1992)), IP-1a (Obaku,. Et al., J. Biochem., 99). 885-894 (1986)), MIP-1 ⁇ (Lipes, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 9704-9708 (1988)).
  • CXC chemokines migrate neutrophils but not monocytes. In addition, most CC chemokines do not migrate monocytes and neutrophils. Also, For other leukocytes, eosinophils, basophils and lymphocytes, migratory activity has been reported for some CX C and CC chemokines, respectively. The migratory activity of human lymphocytes has been observed in the CC chemokines RANTES, MIP-1 ⁇ , MCP-1 and the CXC chemokine IL-8, but all of them are chemotactic factors specific to lymphocytes. Absent.
  • Mouse PBSF / SDF-1 is a CXC chemokine originally identified as a mouse B progenitor cell growth promoting factor secreted from mouse bone marrow stromal cell line PA6, and its amino acid sequence has also been reported ( Figure 1). (Nagasawa, T. et al. Pro Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2305-2309 (1994)). More recently it has strong chemotactic activity against human T-lymphocytes has been revealed (Bleul. C. et al., J.Exp.
  • IL-8RA which are specific receptors for IL-8, and IL-8RB
  • MIP-1 which are receptors for other CXC chemokines, and specific receptors for RANTES
  • CC CKR2A a specific receptor for CC CKR1 and MCP-1
  • CC CKR2B specific for MCP-1 and MCP-3
  • CC CKR3CC omb a receptor specific for MCP-3 and RANTES C. et al., J. Biol., 270. 16491-16494 (1995).
  • CCCK5 a receptor specific for MIP-1a, MIP-1 ⁇ , RANTES, has also been reported.
  • CXCR4 / fusin / HUMSTSR was identified as an SDF-1 receptor, a human CXC chemokine.
  • CC CKR5, CC CKR2B, CC CKR3 and CXCR4 / fusin / HUMSTSR may act as a receptor for HIV-1 in cooperation with CD4, a protein present on the cell membrane. Furthermore, it has been shown that each receptor's ligand inhibits HIV-1 infection through those receptors.
  • HIV-1 Two different types are involved in the transmission of HIV-1, the causative virus of AIDS, and the development of AIDS.
  • Monocytes that mainly infect monocytes, macrophages, and T lymphocytes Directed HIV-1 is involved in the propagation of the virus in humans during infection and latent infection, and T cell line-directed HIV-1, which mainly infects T lymphocytes, has a reduced T lymphocyte count and AIDS Involved in the onset.
  • T cell line-directed HIV-1 which mainly infects T lymphocytes, has a reduced T lymphocyte count and AIDS Involved in the onset.
  • Two receptors are required for the two types of HIV-1 to infect cells.
  • One is the CD4 protein, a type of cell membrane protein, which is a receptor common to the above two HIV-1 types.
  • the other is a protein called coreceptor, which has activity as a receptor for CD4 in cooperation with CD4 protein, and is a receptor specific to each of the above two HIV-1 types.
  • the major coreceptor of monocyte-directed HIV-1 is CCCKR5, a CC chemokine receptor
  • the coreceptor of T cell line-directed HIV-1 is human CXCR4 / fusin / HUMSTSR, a CXC chemokine receptor
  • CCIPR5 ligands MIP-1, MIP-1, and RANTES are used to infect monocyte-directed HIV-1 cells
  • human CXCR4 / fusin / HUMSTSR is a human PBSF / SDF-1 T cell line. It was clarified that directional HIV-1 infection was inhibited, respectively, suggesting that the above chemokine receptors could be targets for HIV-1 infection inhibitors.
  • Human CXCR4 / fusin / HUMSTSR a CXC chemokine receptor
  • Human CXCR4 / fusin / HUMSTSR a CXC chemokine receptor
  • the three-dimensional structure formed by the four extracellular domains is thought to be important for binding to ligand or HIV-1
  • HIV-1 differs in its ability to infect CD4-positive cells depending on the strain. Some strains are classified as monocyte or macrophage tropic strains (M-tropic) because they infect monocytes, and others are categorized as T cell strain tropic strains (T-tropic) because they infect T cell lines. Has been done.
  • M-tropic monocyte or macrophage tropic strains
  • T-tropic T cell strain tropic strains
  • CXCR4 seven-transmembrane G protein-coupled receptor
  • the present inventors isolated mouse CXCR4 as a receptor for mouse PBSF / SDF-1, a kind of CXC chemokine, and revealed here that the amino acid sequence of human CXCR4 is 90% identical to that of human CXCR4.
  • an object of the present invention is to provide a novel mouse CXC chemokine receptor gene, a polypeptide encoded by the gene, and a polypeptide useful for studying the therapeutic mechanism of AIDS therapeutic agents and HIV-1 infection.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems.
  • the present inventors have cloned a novel mouse chemokine receptor gene from mouse B precursor cell line DW34, whose proliferation is promoted in a mouse PBSF / SDF-1-dependent manner.
  • cells expressing mouse CXCR4 and human CD4 cells should be fused with cells expressing the env protein derived from the T cell line-oriented HIV-1 strain, and those cells should be fused with the T cell line-directed HIV-1 strain. Infection.
  • chimeric virus clones of T cell line-directed HIV-1 in which the env region or V3 region has been replaced with those of monocyte-directed HIV-1 do not infect cells expressing mouse CXCR4 and human CD4 cells.
  • the V3 loop of the -1 envelope protein was required for the mouse C XCR4-mediated entry of HIV-1.
  • the present invention has been completed based on such knowledge.
  • the gist of the present invention is:
  • All or part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 in the sequence listing At least one deletion, addition, insertion or substitution of one or more amino acid residues in the amino acid sequence, and encodes a polypeptide having a receptor activity capable of binding to mouse PBSF / SDF-1.
  • a DNA comprising the whole or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a DNA containing the DNA, having a receptor activity capable of binding to mouse PBSF / SDF-1 DNA encoding a polypeptide
  • polypeptide consisting of all or part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 in the sequence listing, or a polypeptide comprising the polypeptide, which is a receptor capable of binding to mouse PBSF / SDF-1 Active polypeptides,
  • a method of screening for an AIDS onset inhibitor or HIV-1 infection inhibitor comprising:
  • a method for screening for an AIDS onset inhibitor or an HIV-1 infection inhibitor comprising:
  • kits for detecting the onset of AIDS or HIV-1 infection comprising a cell expressing the polypeptide of any one of [6:] to [9] or the cell of [16];
  • a method for detecting the onset of AIDS or HIV-1 infection characterized in that the method comprises the steps of: BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the cDNA nucleotide sequence of mouse PBSF / SDF-1 and the amino acid sequence of mouse PBSF / SDF-1 encoded by the nucleotide sequence.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of electrophoresis by the Northern plotting method of Example 2. It is. A shows the results for mouse tissue mRNA, and B shows the results for mouse fetal mRNA.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of Example 6.
  • the horizontal axis indicates elapsed time
  • the vertical axis indicates the ratio of the fluorescence intensity ([fluorescence intensity at 340 nm] Z [fluorescence intensity at 380 nm]).
  • the cells used are CH ⁇ cells in which chemokine receptor Yuichi is not expressed.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of Example 6.
  • the horizontal axis indicates elapsed time
  • the vertical axis indicates the ratio of fluorescence intensity ([fluorescence intensity at 34 O nm] [fluorescence intensity at 380 nm]).
  • the cells used are CHO cells expressing the human chemokine receptor CC CKR 2B.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of Example 6.
  • the horizontal axis indicates elapsed time
  • the vertical axis indicates the ratio of fluorescence intensity ([fluorescence intensity at 34 O nm] [fluorescence intensity at 380 nm]).
  • the cells used were CHO cells expressing mouse chemokine (PBSFZSDF-1) receptor Yuichi (mouse CXCR4).
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of Example 6.
  • the horizontal axis represents the elapsed time
  • the vertical axis represents the ratio of the fluorescence intensity ([fluorescence intensity at 340 nm] [fluorescence intensity at 380 nm]).
  • the cells used are CHO cells expressing human chemokine receptor CXCR4 / fusinZHUMSTSR.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of Example 6.
  • the horizontal axis indicates elapsed time
  • the vertical axis indicates the ratio of fluorescence intensity ([fluorescence intensity at 34 O nm] / [fluorescence intensity at 380 nm]).
  • the cells used were CHO cells expressing mouse CXCR4.
  • FIG. 8 shows that mouse CXCR4 supports membrane fusion via the env protein of human T cell line-tropic HIV-1.
  • the target cells, NIH3T3 were infected with recombinant vaccinia virus expressing human CD4, T7 polymerase, and S-gal ⁇ -subunit. After infection, the cells were transfected with mouse CXCR4, human CXCR4, and human CCR5.
  • HeLaS3, an effector cell is from NL432 or SF162 Infected with recombinant hexinia virus expressing the native env protein and / S-gal-subunit. After the cells were fused, the cells were used for the / 3-gal assay.
  • FIG. 9 shows that mouse CXCR4 supports infection with the human T cell line-tropic HIV-1 virus.
  • SW480 (A) cells were transfected with human CD4 and chemokine receptors (mouse CXCR4, human CXCR4, human CCR5, human CCR2b), respectively, and infected with HIV-1 NL432, ⁇ , and SF162, respectively. After allowing the cell lysate to be used for 8-gal alassay.
  • FIG. 10 shows that mouse CXCR4 supports the infection of human T cell line tropic HIV-1 virus.
  • H0S cells B
  • chemokine receptors mouse CXCR4, human CXCR4, human CCR5, human CCR2b
  • FIG. 11 shows that mouse CXCR4 supports infection with the human T cell line-tropic HIV-1 virus.
  • U87MG cells C
  • human CD4 and chemokine receptors mouse CXCR4, human CXCR4, human CCR5, human CCR2b
  • the cell lysate was later used for 8-gal atsay.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing the structure of a chimeric provirus clone.
  • the env or V3 loop of SF162 was incorporated into the provirus DNA of NL432, a human T cell line-tropic HIV-1 (E: EcoRI, Ba: BamHI, St: Stu I, Nh: NheI) 0
  • FIG. 13 is a diagram showing that the V3 loop of the envelope protein gpl20 is essential for mouse CXCR4-mediated HIV-1 entry.
  • SW480 cells expressing human CD4 and the receptors shown in the figure were infected with HIV-1 NL432 strain, SF162 strain and chimeric provirus clones NL432env-162 and NL432V3-162.
  • the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it encodes a receptor (mouse CXCR4) of mouse PB SF / SDF-1 which is a novel mouse CXC chemokine receptor.
  • DNA is exemplified.
  • a polypeptide comprising the whole or a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 in the sequence listing, or a polypeptide containing the polypeptide, which has a receptor activity capable of binding to mouse PBSF / SDF-1.
  • DNA consisting of all or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a DNA containing the DNA, which has a receptor activity capable of binding to mouse PBSF / SDF-1 DNA that encodes a peptide.
  • deletion, addition, insertion or substitution of one or more amino acid residues is not particularly limited, and for example, deletion, addition, or deletion of one or several amino acid residues. Refers to insertion or substitution. Here, several means, for example, 10 or less. Furthermore, in 4), deletion, addition, insertion or substitution of bases of the DNA of the present invention is performed. The degree is one or more, but preferably one to several. Here, several means, for example, 10 or less. Also, provided that the expressed polypeptides have substantially the same function or activity, they may contain chemically or biochemically modified or unnatural or derivatized amino acid residues or bases. You may go out.
  • the DNA of the present invention is isolated by amplifying a nucleotide sequence having homology between known chemokine receptors by PCR, and screening a mouse cDNA library or the like using the amplified fragment as a probe. Can be performed.
  • the experimental methods that can be used in the present invention include general molecular biological experimental methods (eg, DNA electrophoresis, a method of recovering DNA separated by electrophoresis from a gel, ligation, host transformation, and the like). Culture of recombinant hosts, preparation of plasmid DNA, cleavage of DNA with restriction enzymes, radiolabeling of DNA, etc.) are described, for example, in Molecular Cloning 2nd edition (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)). A method known to those skilled in the art as described above is employed.
  • general molecular biological experimental methods eg, DNA electrophoresis, a method of recovering DNA separated by electrophoresis from a gel, ligation, host transformation, and the like.
  • Culture of recombinant hosts, preparation of plasmid DNA, cleavage of DNA with restriction enzymes, radiolabeling of DNA, etc. are described, for example, in Molecular Cloning 2nd edition (Man
  • Primers used in PCR include, for example, forward degeneracy of the DNA sequence encoding the amino acid sequence of the second transmembrane region based on the reported amino acid sequence conserved in the human chemokine receptor.
  • An appropriate restriction enzyme site is added to the 5 'side of the primer, and an appropriate restriction enzyme site is added to the 5' side of the degenerate primer in the reverse direction to the DNA sequence encoding the amino acid sequence in the seventh transmembrane region. Those that have been added are listed.
  • Such a primer can be synthesized using a DNA synthesizer.
  • mouse mRNA used for cloning cDNA can be purified from cells such as mouse B precursor cell line DW34 (provided by Professor Nishikawa of Kyoto University) using a commercially available kit for purifying mRNA.
  • cloning of the mouse genome DNA can also be performed using a DNA fragment derived from the mouse CXCR4 cDNA.
  • GenBank By performing a nucleic acid homology search on the EBL / DDBJ DNA sequence database, it is possible to estimate whether the obtained cDNA encodes a chemokine receptor.
  • SEQ ID NO: 1 in the sequence listing shows the nucleotide sequence of the obtained cDNA.
  • the nucleotide sequence of this open reading frame is Based on the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 17 in the sequence listing), DNASIS (Hitachi), BL ASTC Altschul, F. et al., J. Mol. Biol., against databases such as Genbank, EMBL, and DDBJ. 215, 403-410), a homology search can be performed to further examine the polypeptide encoded by the DNA of the present invention.
  • polypeptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing is a trimeric G protein-coupled receptor containing seven transmembrane domains characteristic of chemokine receptors.
  • amino acid sequence of the known CXC chemokine receptor revealed that human CXCR4 / fusin / HUMSTSR was most similar (90% homology).
  • cells expressing the DNA of the present invention had both receptor activity against chemokines (mouse PBSF / SDF-1) and activity to increase intracellular calcium concentration. It turned out that it encodes a mouse chemokine receptor, and the protein encoded by the DNA is named mouse CXCR4.
  • “Chemokine” refers to the four cysteines that have a certain degree of selectivity for migrating leukocytes, as described above, among the triggers for leukocytes to show chemotaxis to inflammatory response sites. Refers to a family of polypeptides having residues. These are related to the amino acid sequence and biological activity. The four cysteine residues of the chemokine are disulfide bonded between the first and third residues and between the second and fourth residues, respectively. Chemokine with another amino acid between the first and second cysteine residues Are distinguished as "CXC chemokine J" and a chemokine containing no other amino acid as "cc chemokine". In general, it is known that CC chemokines migrate monocytes and do not migrate neutrophils, and CXC chemokines migrate neutrophils and do not migrate monocytes.
  • Chemokine receptor refers to a cell membrane protein family that specifically binds to the above chemokines. Chemokine receptor Yuichi has amino acid sequence and structural relationships. All chemokine receptors have seven transmembrane domains characteristic of the oral dopsin family and a binding domain for the trimeric G protein. Chemokine receptors are classified into two subgroups based on their specificity for ligands. Among the above chemokines, those that specifically bind to C X C chemokines are distinguished from “C C chemokine receptors” that specifically bind to C C chemokines as C X C chemokine receptor j.
  • chemokine receptors have the effect of increasing intracellular calcium concentration when combined with their respective ligands. Recently, some chemokine receptors not only have chemokine receptor activity but also have HIV-1 receptor activity in cooperation with a molecule called CD4 on the cell membrane. It is clear that
  • the receptor activity for mouse PBSF / SDF-1 can be measured, for example, as follows.
  • the PBSF / SDF-1 peptide is a ligand for murine CXCR4, for example, or labeled with 1 2 5 I by using a Bolton hunter reagent is labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase.
  • the labeled PBSF / SDF-1 peptide is added to a suspension of cells expressing the polypeptide with receptor activity and incubated at a constant temperature. After washing, receptor activity can be measured by measuring the amount of PBSF / SDF-1 peptide bound to the cells and measuring the amount of labeling.
  • the cells used herein include, for example, mouse B progenitor cell line DW34, human fetal kidney cell line 293 cells, or Chinese hamster ovary-derived cell line CH0 engineered to express mouse CXCR4. Cells Is mentioned.
  • polypeptide of the present invention preferably has an activity of increasing the intracellular calcium concentration when bound to a ligand.
  • activity can be measured, for example, as follows.
  • the cells After washing the cells expressing the polypeptide whose activity is to be measured with a buffer, the cells are washed with an appropriate buffer (for example, HBSS (125 mM NaCl, 5 mM KC1 in 2 OmM Hepes, pH 7.4). Containing 1 mM MgCl 2 , 0.5 mM glucose and 0.1% BSA), add a fluorescent reagent that is affected by intracellular calcium ions, and incubate the cells. May be labeled. After washing the labeled cells with a buffer, the cells are suspended in an appropriate buffer, and the activity can be measured from the change in fluorescence intensity when a chemokine serving as a ligand is added.
  • an appropriate buffer for example, HBSS (125 mM NaCl, 5 mM KC1 in 2 OmM Hepes, pH 7.4). Containing 1 mM MgCl 2 , 0.5 mM glucose and 0.1% BSA
  • a fluorescent reagent that is
  • the measurement is performed under the conditions of excitation wavelengths of 340 nm and 380 nm, a fluorescence wavelength of 510 nm, and a response of 0.5 seconds. Then, the ratio of [fluorescence intensity at excitation wavelength of 330 nm] to [fluorescence intensity at excitation wavelength of 380 nm] is determined.
  • concentration of intracellular calcium ion in the cell to be measured increases due to the addition of chemodynamic, the ratio of the fluorescence intensity increases. Also, by adding different types of chemokines, the specificity of the receptor for the ligand can be confirmed.
  • mouse CXCR4 mRNA can be detected using a usual specific mRNA detection method.
  • mRNA can be detected by Northern blot analysis or in situ hybridization using antisense RNA or cDNA as a probe.
  • mRNA can also be detected by converting the mRNA to cDNA with reverse transcriptase, followed by PCR using appropriate primer combinations.
  • polypeptide of the present invention examples include the following.
  • a polypeptide encoded by the DNA of the present invention which has a receptor activity capable of binding to mouse PBSF / SDF-1.
  • a polypeptide comprising all or part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 in the sequence listing, or a polypeptide containing the polypeptide, which is capable of binding to mouse PBSF / SDF-1 A polypeptide having activity.
  • mice A polypeptide having receptor activity that can bind to PBSF / SDF-1.
  • the degree of deletion, addition, insertion or substitution of the amino acid residue of the polypeptide of the present invention is 1 or more, as long as it has a receptor activity capable of binding to mouse PBSF / SDF-1.
  • the number of mutations is not particularly limited. For example, one to several pieces are exemplified. Here, several means, for example, a number of 10 or less. It may also contain chemical or biochemical modifications, or unnatural or derivatized amino acid residues, provided that the function or activity of the polypeptide is substantially the same.
  • the polypeptide of the present invention is preferably derived from the mouse B precursor cell line DW34.
  • polypeptide of the present invention can be confirmed using a usual specific protein detection method.
  • a usual immunoprecipitation method using an antibody specific to mouse CXCR4, Western blot method, or FACS analysis.
  • Expression vector and transformant of the present invention can be obtained, for example, by incorporating the DNA of the present invention into a known vector such as pEFB0S, pCAGGStkNeo, or pMX.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the expression vector of the present invention into a desired host.
  • the host is not particularly limited, but a mammalian cell line is preferable.
  • the mammalian cell line include a mouse B precursor cell line, a human embryonic kidney cell line, a Chinese hamster ovary-derived cell line, and the like, and a hamster ovary-derived cell line is preferable.
  • a method for introducing the expression vector into a host a known method such as the calcium phosphate method, the DAE dextran method, and the electoporation method may be used.
  • a polypeptide having receptor activity capable of binding to mouse PBSF / SDF-1 can be produced.
  • the polypeptide thus produced can be easily purified by a method such as ordinary column chromatography or affinity chromatography using the antibody of the present invention.
  • the monoclonal antibodies of the present invention include those against the mouse CXCR4 polypeptide of the present invention and those against the fusion protein of the polypeptide and human CXCR4 / fusin / HUMSTSR.
  • Such a monoclonal antibody can be prepared, for example, as follows.
  • an immunogen bacteria, yeast, animals transformed with a synthetic peptide synthesized by a conventional peptide synthesizer based on a part of the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention, or with a mouse CXCR4-expressing vector
  • Mouse CXCR4 produced by cells, insect cells, etc. is used as it is or as protein obtained by purifying it using ordinary protein chemical methods.
  • mice, rats, hamsters Immunization of animals such as goats, removing cells from the spleen or lymph nodes, fusing them with myeloma cells, and using the method of Oehler and Milstein (Nature, 256, 495-497 (1975)) or a modified version of Ueda. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4386-4390 (1982), and a hybridoma is prepared.
  • Such hybridomas can produce monoclonal antibodies.
  • a monoclonal antibody of mouse CXCR4 can be obtained by the following steps.
  • the present invention also includes a monoclonal antibody against a fusion protein of mouse CXCR4 and human CXCR4 / fusin / HUMSTSR.
  • Such a monoclonal antibody can be obtained by obtaining a fusion protein of mouse CXCR4 and human CXCR4 / fusin / HUMSTSR, and using this protein or its peptide as an immunogen by the above-described method or the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains mouse PBSF / SDF-1, and is used as an AIDS onset inhibitor or an HIV-1 infection inhibitor.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally. That is, it can be orally administered as a commonly used dosage form, for example, tablets, capsules, granules, powders, etc., or intramuscularly or subcutaneously as liquids, emulsions, suspensions, ribosomes, etc. It can also be administered rectally as a suppository.
  • Such a dosage form is prepared by mixing the active ingredient of the present invention with a pharmaceutically acceptable usual carrier, excipient, binder, stabilizer, buffer, solubilizing agent, isotonic agent and the like. Can be manufactured.
  • the dose and frequency of administration vary depending on the patient's symptoms, medical history, age, body weight, dosage form, etc.For example, when administered orally to an adult, it is usually 5 to 50 Omg per day, preferably 10 to 1 It can be administered once or in several divided doses, suitably adjusted within the range of 0 mg.
  • the cell of the present invention is a cell that expresses the polypeptide of the present invention, or a cell that expresses both the polypeptide and the human CD4 protein.
  • Such cells can be obtained, for example, as follows. That is, a vector incorporating a polynucleotide encoding mouse CXCR4 is obtained. Known vectors such as pEFBOS, pCAGGS, and pMX can be used as the vector.
  • the cells of the present invention can be obtained by introducing a vector into which the above-mentioned polynucleotide is incorporated into cells for expression.
  • Cells for expression include Chinese hamster ovary-derived cell lines, CHO cells, human colon cancer cell lines, SW480 cells, human osteosarcoma cell lines, HOS cells, human glioblast cell lines, and U87MG cells. Examples of the vector introduction method include a calcium phosphate method and a method using Lipofectin (GibcoBRL) or Lipofectaraine CGibcoBRL).
  • the cells of the present invention were used as AIDS onset inhibitors, HIV-1 infection inhibitors, and agonist II antagonists of PBSFZSD F-1. Screening ⁇ AI DS onset or H It can be used to detect IV-1 infection.
  • the screening method of the present invention includes a method of screening for an AIDS onset inhibitor, an HIV-1 infection inhibitor, and an agonist / iangonist of mouse or human PBSFZSDF-1. Specifically, it is as follows.
  • a method for screening for an AIDS onset inhibitor or an HIV-1 infection inhibitor comprising:
  • a method of screening for an AIDS onset inhibitor or an HIV-1 infection inhibitor comprising:
  • human T cell line-directed HIV-1 examples include HIV-1 II IB (provided by Professor Harada of Kumamoto University) and HIV-1 NL432 (provided by Professor Adachi of Tokushima University). Donation).
  • the step of analyzing the localization of HIV-1 is more preferably performed using a monoclonal antibody against human T cell line tropism HIV-1.
  • the method of analysis using such a monoclonal antibody is not particularly limited, and examples thereof include commonly used known methods.
  • the enzymatic method described below can also be used.
  • the “cells of the present invention” used in this method include cells expressing human CD4 protein and CO-receptor (for example, SW480, U87MG, H0S, etc.), and an HIV-1 gene expression promoter.
  • An LTR having an enzyme eg, 8-galactosidase, luciferase, CAT, etc.
  • HIV-1 infects such cells a tat protein, a type of viral protein, is expressed, which activates LTR. Therefore, the amount of infection can be quantified by measuring the enzyme activity contained in the cell lysate.
  • Cells expressing the HIV-1 envelope protein include, for example, cells obtained by introducing the gene for the HIV-1 envelope protein into HeLaS3, and further include, for example, a gene for a galactosidase subunit (either ⁇ or ⁇ ). The introduced one is preferably used.
  • the “cells of the present invention” are, for example, cells obtained by introducing a human CD4 protein and a co-receptor into ⁇ 3 ⁇ 3, and further include, for example, either one of a / 3-galactosidase subunit or ⁇ . In this case, a gene into which the HIV-1 envelope protein is expressed is different from that introduced into cells expressing the HIV-1 envelope protein).
  • the amount of cell fusion can be measured by measuring the galactosidase activity contained in the cell lysate after mixing and culturing both cells.
  • the target substance may be an agonist.
  • the target substance may be an orphanist.
  • the target substance may be an antagonist.
  • An example of the antago-dist is a hematopoietic stem cell release promoter.
  • the kit for detecting the onset of AIDS or HIV-1 infection of the present invention is characterized by containing the cell of the present invention.
  • the kit of the present invention is for performing detection using the detection method of the present invention described below.
  • the method for detecting the onset of AIDS or HIV-1 infection of the present invention comprises:
  • examples of a method for analyzing the localization of HIV-1 include a method used in the AIDS onset inhibitor or HIV-1 infection inhibitor of the present invention.
  • examples of a method for measuring the fusion property between an HIV-1 infected cell and the cell include a method used in the AIDS onset inhibitor or HIV-1 infection inhibitor of the present invention.
  • the HIV-1 infected cells in (b) are blood cells of a patient suspected of being infected with HIV-1 and infected with HIV-1.
  • mouse CXCR4 of the present invention and human CXCR4 / fusin / HUMSTSR respond to mouse PBSF / SDF-1.
  • Mouse and human PBSF / SDF-1 are expected to bind to human PBSF / SDF-1 since the difference between mouse and human PBSF / SDF-1 is only one amino acid out of 71 amino acids.
  • human PBSF / SDF-1 inhibits TX cell line-directed HIV-1 infection via CXCR4 / fusin / HUMSTSR
  • antibodies to the mouse CXCR4 protein of the present invention, and cells of mouse CXCR4 and human CXCRVfusin / HUMSTSR An antibody against a chimeric protein having a T cell line-directed HIV-1 binding site obtained by substituting ectodomains for each other can be used as an HIV-1 infection inhibitor, ie, a therapeutic agent for AIDS.
  • the method for screening chimeric protein agonists and antagonists obtained by substituting the mouse CXCR4 protein and the extracellular domain of mouse CXCR4 / human CXCR4 / fusin / HUMSTSR with each other comprises the steps of Gonists can be obtained and used as inhibitors of HIV-1 infection, ie, treatments for AIDS.
  • Gonists can be obtained and used as inhibitors of HIV-1 infection, ie, treatments for AIDS.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • Example 1 (Cloning of mouse CXCR4 cDNA)
  • a forward degenerate primer C2F2-2 (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) for the DNA sequence encoding the amino acid sequence of the second transmembrane region
  • the seventh transmembrane A reverse degenerate primer C4R1 (SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) for the DNA sequence encoding the amino acid sequence of the region was synthesized using a DNA synthesizer (Cyclone Plus, Japan Millipore).
  • the mouse B precursor cell line DW34 was suspended in RPMI 1640 medium, cultured for one week, washed with Darbecco PBS (-) (Nissi), and the mRNA was purified using an mRNA purification kit (Pharmacia).
  • Single-stranded cDNA was synthesized from 200 ng of mRNA purified from mouse B precursor cell line DW34 using Ready-To-Go T-Primed First-Strand kit (Pharmacia). Using this single-stranded cDNA as a template, C2F2-2 and C4R1 as primers and Taq as a thermostable DNA polymerase, PCR reaction (0.5 minutes at 94 ° C, 0.5 minutes at 55 ° C). For 30 minutes at 72 ° C for 1 minute).
  • the resulting reaction solution was separated by low-melting point agarose gel electrophoresis, a DNA band of the desired size (about 690 bp) was cut out, and the DNA fragment was purified using a Wizard PCR Preps DNA purification system (Promega).
  • the resulting DNA fragment into P T7Blue vector was inserted with DNA Raigeshiyonki Tsu preparative (evening color).
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA was determined using a PRISM Ready Reaction sequence kit (Applied Biosystems) and a DNA sequencer (ApPlied Biosystems).
  • the obtained mouse CXCR4 cDNA sequence was This is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • a probe was prepared as follows. Based on the nucleotide sequence of the mouse CXCR4 gene, a forward DNA sequence corresponding to the second transmembrane region (SEQ ID NO: 15 in the sequence listing) and a reverse DNA sequence corresponding to the seventh transmembrane region (SEQ ID NO: 16 in the sequence listing) was synthesized as a primer and used for the next PCR.
  • the cDNA of the nucleotide sequence obtained in the section (3) of Example 1 above was used as type III, and it was subjected to Taq volimerase at 94 ° C for 1 minute, 55 at 1 minute, and 72 at 2 minutes. 30 cycles of the PCR reaction were performed.
  • the PCR reaction product was separated by agarose gel electrophoresis, a DNA band of the desired size (690 bp) was cut out, and the DNA fragment was purified using a Wizard PCR Preps DNA purification system.
  • the resulting DNA fragment 50 ng, and 3 2 P-labeled using the Prime-I t II random primer labeling kit (scan Tiger evening Gene) was used as a probe.
  • Double-stranded DNA was obtained from the cDNA obtained in Example 1 (3) above, this double-stranded DNA was converted into type II, PCR was performed using Taq polymerase, and separated by agarose gel electrophoresis. A DNA band of the desired size (about 690 bp) was cut out and a DNA fragment was purified. 50 ng of the obtained DNA fragment was labeled with 32 P using Prime-It II random primer-labeling kit (Stratagene) and used as a probe.
  • Prime-It II random primer-labeling kit (Stratagene)
  • Escherichia coli was infected with the 129 / SvJ mouse liver genomic library integrated into the phage vector-1 ⁇ , and as a primary screening, plaques were seeded on a plate, and then transferred to a nylon membrane (DuPont).
  • Pre-hybridization solution (5XSSPEC 0.9M NaCl, 0.05M sodium phosphate pH 7.7, 0.005M Na 2 EDTA), 50% formamide, 5x Den Hart's solution, 50 zg / ml salmon sperm
  • the probe obtained in section (A) above and the hybridization solution (5XSS PE, 50% formamide, IX Denhardt's solution, 10% % Dextran sulfate disodium , 50 ⁇ g / ml salmon sperm DNA, 0.1% SDS) and hybridized at 42 ° C. for 15 hours. After washing the membrane, radioactivity was detected, positive blacks producing a signal were selected, serial dilutions were performed for secondary and tertiary screening, and two single clones were selected.
  • the cloned phage DNA is digested with various restriction enzymes and separated by agarose gel electrophoresis.If the band pattern is the same, the clone is identified as the same clone, and the same hybridization is repeated to give a positive band as small as possible. As a result, we cut with restriction enzymes.
  • the selected positive DNA fragment was inserted into pBluescripts KSI I vector and the nucleotide sequence was determined by the dideoxy method.
  • the DNA sequence of the obtained mouse CXCR4 gene is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence deduced based on the nucleotide sequence of mouse CXCR4 (SEQ ID NO: 17 in the sequence listing) is predicted to be a trimeric G protein-coupled receptor containing seven transmembrane domains characteristic of chemokine receptors.
  • the amino acid sequence was compared with the sequence of a known CXC chemokine receptor (analyzed by BLAST using GenBank, EMB and DDBJ as a database).
  • human CXCR4 / fusin / HU MSTSR was the most similar (90% homology), with 89% and 86% homology with monkey CXCR4 and monkey CXCR4, respectively.
  • What is Egret IL-8RA and Egret IL-8RB The homology was 49%, 47%, and 45%, respectively.
  • Example 5 (Expression of mouse CXCR4 and human CXCR4 / fusin / HUMSTSR)
  • PCR was performed as follows using cDNA from the human monocyte cell line THP-1.
  • THP-1 cell cDNA as type I
  • the primers shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 in the sequence listing were used to amplify human CXCR4 / fusin / HUMSTSR, and the sequence listing For the amplification of CC CKR2B, 500 ng of each of the primers shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 in the sequence listing was used.
  • Taq polymerase (Takara Shuzo) was used as an enzyme for the reaction. The reaction was performed for 1 cycle at 94 ° C for 3 minutes, followed by 35 cycles for 3 minutes at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes. The reaction was performed at 2 ° C for 3 minutes. Gene fragments of human CXCR4 / fusin / HUMSTSR and CC CKR2B obtained by this reaction were each incorporated into a TA cloning site of pCRI KInvitrogen). The plasmids thus obtained were named PCRI ICXCR4 and pCRUCC CKR2 B, respectively.
  • PCRI ICXCR4 and pCRI ICC CKR2B plasmids were digested with Notl and Xbol, respectively (both from Takara Shuzo), and then incorporated into the Notl / Xbol site of pCAGGStkNeo.
  • the plasmids thus obtained were named pCAN CXCR4 and pCANCC CKR2B, respectively.
  • a single-strand cDNA of the mouse B precursor cell line DW34 represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing obtained in the section (3) of Example 1 was subjected to PCR by a type III method. Was done.
  • cDNA lOOng as type I
  • primers shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing and SEQ ID NO: 14 in the sequence listing were used.
  • ExTaq (Takara Shuzo) was used as the enzyme. The reaction was carried out for 1 cycle at 94 ° C for 3 minutes, followed by 20 cycles at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes, and further at 72 ° C.
  • the reaction was performed for 5 minutes.
  • the obtained mouse CXCR4 gene fragment was digested with Notl and Xhol (Takara Shuzo) and inserted into the Notl / Xbol site of CAGGStkNeo.
  • the plasmid thus obtained was named pCANmPBSFR.
  • the CH0 cells were cultured in a 10 cm diameter cell culture Petri dish (Iwaki Glass) at 37 ° C in the presence of 10% carbon dioxide for one day. After dissolving 30 g of each of the three chemokine receptor expression vectors (PCANmPBSFR, pCANCXCR4 and pCANCCCKR2B) obtained in (1) above in distilled water 251, 250 mM calcium chloride (Nacalai Tesque) 500 ill was added. After adding 2 x BBS solution (50 mM BES (SIGMA).
  • Fukumuhi the Yuzuru FCS - MEM (GIBC0 companies) were suspended in medium supplemented with 2 mg / ml GENETICIN (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a medium, 5 X10 3 or Z dish cells cultured in a Petri dish one diameter 10cm Dispensed to Ichi (Iwaki Glass). Culture was continued at 37 ° C in the presence of 10% carbon dioxide, and GENETICIN-resistant cells were used for measuring intracellular calcium concentration as mouse CXCR4, human hCXCR4 / fusin / HUMSTSR and CKR2B expressing CH0 cell lines.
  • CH0 cells expressing mouse CXCR4 and human chemokine receptor (CXCR4 / fusin / HU STSR and CC CKR2B) obtained in section (2) of Example 5 above were washed with Darbecco PBS (-).
  • the suspension was then suspended in HBSS buffer (containing 125 mM NaCl, 5 raM KCl. LmM MgCl 2 , 0.5 ra glucose, and 0.1% BSA in 20 mM Hepes. PH 7.4) at 5 x iO 6 / ml. It became turbid, and fura-PE3AM (Texas Fluorescence Laboratory) was added to 2.5 M, and incubated at 37 ° C for 30 minutes.
  • HBSS buffer containing 125 mM NaCl, 5 raM KCl. LmM MgCl 2 , 0.5 ra glucose, and 0.1% BSA in 20 mM Hepes. PH 7.4
  • mouse PBSF / SDF-1 has an activity of specifically increasing the intracellular calcium ion concentration against the mouse CXCR4 and human CXCR4 / fusin / HUMSTSR-expressing CHO cells of the present invention.
  • mouse CXCR4-expressing cells mouse PBSF / SDF-1 was continuously added. Desensitization in which the ratio of the fluorescence intensities did not change by the addition was observed. Desensitization was not observed with the addition of the negative control, human MCP-1.
  • NIH3T3 cells Mouse NIH3T3 cells, SW480 cells derived from human small intestinal epithelium, and U87MG derived from human glial cells were cultured in DMEM containing 10% FCS.
  • Human HeLaS3 cells were cultured in RPMI1640 containing 10% FCS.
  • HOS cells derived from human osteoblasts were cultured in Eagle MEM containing 1% non-essential amino acid (Gibco) and 10% FCS.
  • Virus The HIV-1 NL432 strain was kindly provided by Professor Adachi (Tokushima University).
  • the II IB strain was provided by Professor Harada (Kumamoto University).
  • the SF162 strain was kindly provided by Prof. J. A. Levy (Power Reformia, University of San Francisco).
  • HIV-1 chimeric virus clones NL432env-162 and N-432V3-162, were kindly provided by Isaka (Shionogi Pharmaceutical). Recombinant vaccinia virus, Va Env (NL432 env), Vac. Env 162 (SF162 env) and Vac T4 (CD4) were provided by Professor Shioda (University of Tokyo). L0-T7 (T7 polymerase) was provided by M. Kohara (Tokyo Metropolitan Clinical Laboratory).
  • NIH3T3 cells were cultured in a 24-well plate at a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / well, and the chemokine receptor gene incorporated into pBluescript was transfected using pofectamine (Gibco). Four hours after the start of the transfection, the cells were washed with PBS, added with a culture solution, cultured at 37 overnight, and used for the fusion assay. SW480 and H0S cells were cultured in 6 cm plates at a cell density of 5xl0 5 cells.
  • HOS cells which constitutively express human CD4 and LTR-Gal, were transfected with the receptor gene incorporated into pEF-BOS by the same method for 15 US.
  • Cells were 35 ° C-night culture at 3 C0 2 presence, PBS (-) after recovering with PBS containing 0.5 mM EDTA after washing, and incubated overnight at seeded with 37 ° C to 12 Uwerupureto Used for infection.
  • Cell fusion assay To quantify cell fusion, we used an improved cell fusion assay utilizing the complementation of yS-galactosidase (/ 8-gal) (Shida et al., Writing a paper).
  • Human CD4 the co-subimit, T7 RNA polymerase is introduced into NIH3T3 cells evening an target cells by recombinant vaccinia virus (24 Uwerupureto 5 XLO 4 cells / Ueru), chemokine receptors evening using Lipofectamine Transfected into one get cell.
  • vaccinia virus 24 Uwerupureto 5 XLO 4 cells / Ueru
  • chemokine receptors evening using Lipofectamine Transfected into one get cell.
  • the effector cells were suspended in Hanks' buffer (PH7.6) containing 3 mM CaCl 2 and overlaid on target cells in a 24-well plate, followed by
  • a culture solution containing the HIV-1 virus (reverse transcriptase (RT) activity was 2 ⁇ 10 ⁇ RT / m for SF162, NL432envl 62, NL432V 3-162, and 5 ⁇ 10 ⁇ RT / m L NL432 There was added 3xl0 6 RT / m L), 5% C0 2 exist under after 2 hours at 37 ° C, it was added 2. 5 ml of culture medium per Ueru. Four days after the infection, 4001 of Reporter lys is buffer (Proraega) was added per 1 ml, and the cells were frozen at -80 ° C and thawed.
  • RT reverse transcriptase
  • the thawed sample was transferred to an Eppendorf tube, centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C, and the y8-gal activity contained in the supernatant was measured using a luminescence ⁇ -gal detection kit (Clontech).
  • HeLaS3 cells effector cells expressing the env protein
  • human CD4 effector cells expressing the env protein
  • the experiment was performed using an Atssei system in which activation by fusion with a target cell (NIH3T3 cell) expressing the body occurs.
  • NIH3T3 cell target cell
  • HeLaS3 cells one of the cells, were infected with the recombinant vaccinia virus to express / S-Gal -subimit and the env protein of HIV-1, and the NIH3T3 cells, the target cells,
  • the recombinant vaccinia virus was infected to express S-Gal o) -subunit, T7 polymerase, and human CD4.
  • NIH3T3 cells After virus infection The NIH3T3 cells were further transfected with a plasmid containing human CXCR4, human CCR5, or mouse CXCR4. After the culturing, the effector cells and the evening get cells were mixed and cultured. When cell fusion occurs, ⁇ -subunit of Gal contained in the cytoplasm of the fused cell and ⁇ -subunit associate and S-Gal is activated. As shown in Fig. 8, HeLaS3 cells expressing the env protein derived from NL432, a T cell line-directed HIV-1, fuse with human CXCR4 and NIH 3T3 cells expressing human CD4, but not with human CCR5 and human CCR5. It did not fuse with CD4 expressing NIH 3T3 cells.
  • HeLaS3 cells expressing the env protein from NL432 also fused to cells expressing mouse CXCR4 and human CD4.
  • HeLaS3 cells expressing the env protein from SF162, a monocyte-directed HIV-1 fuse with human CCR5 and human CD4 expressing NIH 3T3 cells, but human or mouse CXCR4 and human CD4 expressing NIH It did not fuse with 3T3 cells.
  • Mouse cells expressing human CXCR4 and CD4 have low replication efficiency of HIV-1 including NIH3T3 cells.Thus, SW480 cells derived from human intestinal epithelial cells, H0S cells derived from osteoblasts, and U87MG cells derived from glial cells was used as target cells for virus infection. These cells were transfected with a reporter gene (lacZ) having the HIV-1 LTR as a promoter. When the virus infects cells, Tat protein, a transcriptional activator derived from HIV-1, is expressed and acts on the LTR to induce lacZ expression.
  • lacZ reporter gene
  • T cell line tropic virus strain NU32, IIIB
  • monocyte tropic virus strain SF162
  • NL432 and ⁇ were infected with both mouse CXCR4 and human CD4 expressing SW480 as well as human CXCR4 and human CD4 expressing SW480. This result was consistent with the above-mentioned result of Fusion Atsushi. However, when human CCR2b or CCR5 was expressed instead of CXCR4, those viruses were not infected.
  • mouse CXCR4 supports the entry of T cell line tropism-directed HIV-1 into target cells, and does not affect proviral DNA synthesis, integration into genomic DNA, or viral expression in human cells The thing was suggested.
  • NL432env-162 is a provirus clone in which the env region of the cell line tropic virus strain NL432 was replaced with that of SF162, which is monocyte tropic HIV-1, and NL432V3-162 was This is a provirus clone in which the V3 loop of env of NL432 was replaced with that of SF162.
  • mouse CXCR4 is a cell line-directed HIV-1 env-mediated cell It has been shown to support membrane fusion and T cell line-directed HIV-1 infection. These results suggest that mouse CXCR4 is not a species-specific barrier to HIV-1 infection.
  • Previous studies have shown that expression of human CD4 on mouse lymphocytes or non-lymphocyte cell lines, such as NIH3T3 and T cell clone 3DT, results in HIV-1 adsorption but no entry. I was One interpretation of this result is that CXCR4 is not expressed on the surface of mouse cells expressing human CD4. Indeed, stimulation with mouse PBSF / SDF-1 does not induce changes in intracellular calcium concentration in NIH3T3 cells.
  • mouse CXCR4 is expressed on thymocytes positive for both CD4 and CD8, or on thymocytes positive for either CD4 or CD8. Therefore, it is important to determine whether the 3DT cells used in the experiment express CXCR4 (to verify that the above interpretation is correct).
  • mouse CCR5 a receptor for monocyte-directed HIV-1 (mouse CCR5)
  • mouse CCR5 a receptor for monocyte-directed HIV-1
  • T-cell line directed HIV-1 have different species characteristics. This difference may be due to the high conservation of amino acid sequences among species in CXCR4 compared to other chemokine receptors, including CCR5.
  • the amino acid sequence of mouse CXCR4 is 90% identical to that of human CXCR4, whereas that of CCR5 and CXCR2 is only 82% and 71% identical in mouse and human, respectively.
  • CXCR4 ligand PBSF / SDF-1 has a unique function when compared to other chemokines such as the CCR5 ligands MIP-1, MIP- ⁇ , and RANTES. It reflects the facts. Chemokines other than PBSF / SDF-1 are thought to be involved in leukocyte migration in inflammation, whereas PB SF / SDF-1 has functions essential for biogenesis such as hematopoiesis and heart formation. have.
  • mice cell line NIH 3T3, which expressed human CD4 and chemokine receptors, supports HIV-1 entry it has lower virus particle production efficiency than human cells. Contains the cellular components required for HIV-1 replication The child is considered to be missing.
  • the generation of transgenic mice transfected with the human gene of a molecule that causes a species-specific barrier could create a model mouse for HIV-1 infection.
  • Our results demonstrated that it is not necessary to transfer the human CXCR4 gene into model mice infected with HIV-1.
  • the physiological expression of CXCR4 is more suitable for studying the onset and progression of the transition from monocyte-directed HIV-1 to T-cell line-directed HIV-1 leading to AIDS development. It provided useful information in developing animal models to simulate the entire course of the infection. Industrial applicability
  • a novel mouse CXC chemokine receptor gene a polypeptide encoded by the gene, an expression vector of the polypeptide, which is useful for studying the therapeutic mechanism of AIDS therapeutic agents and HIV-1 infection, etc.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA) Sequence features: 8, 9, 17 (Inosine)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
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Description

明 細 書 新規マウス c x cケモカインレセプター 技術分野
本発明は、 新規マウス C X Cケモカインレセプ夕一、 及びマウスケモカインレ セプター遺伝子に関する。 さらに詳しくは、 該遺伝子にコードされるポリべプチ ド、 該遺伝子を含有する発現べクタ一、 該発現べクタ一を導入した形質転換体、 前記ポリべプチドに対する単クローン抗体に関する。 さらには前記形質転換体を 用いる前記ポリペプチドの生産方法に関する。 さらには、 ケモカインのァゴニス ト又はアン夕ゴニストのスクリーニング方法、 及び A I D S発症阻害剤又は H I V - 1感染阻害剤のスクリーニング方法に関する。 背景技術
細菌またはウィルスによる感染、 物理的または化学的な外傷、 自己免疫疾患、 アレルギー疾患などが原因で組織障害が起こると、 発赤、 浮腫、 発熱、 疼痛など の兆候を伴う炎症反応が惹起され、 炎症局所に末梢血白血球の集積および浸潤が 観察される。 白血球は、 疾患によって炎症部位に浸出する種類が異なっている。 通常の細菌感染、 免疫複合体の沈着、 外傷などの急性炎症では主に好中球が、 結 核菌感染、 チフス菌感染、 および遅延型過敏症では主に単球が、 ウィルス感染で は主にリンパ球が集積および浸潤し、 そして好酸球および好塩基球は即時型ァレ ルギ一または寄生虫感染に伴って浸出する （Baggioloni, M.ら、 Immunol. Today ， 15， 127-133 (1994)。 近年、 遊走する白血球に対してある程度の選択性を有し 、 特徴的な 4つのシスティン残基を有するポリべプチドの走化因子が発見された 。 これらは、 アミノ酸配列に相同性があり、 生物活性にも関連性のあるファミ リ —であるため、 ケモカイン (Chemokine; Chemoat tract ant and cytokine activi t
- l 一 y)と命名されている（Lindley, I. J.D. ら、 Immunol. Today, 14-24(1993)) 。
ケモカインの 4つのシスティン残基は、 第 1 と第 3の残基間および第 2と第 4 の残基間でそれぞれジスルフィ ド結合している。 第 1と第 2とのシスティン残基 間に別のァミノ酸を 1つ含むか否かで生物活性に特徴が認められるので、 それぞ れのサブファミ リーを CXCケモカインおよび CCケモカインと呼んで区別して いる（Baggioloni, . ら、 Adv. Immunol., 55, 97-179(1994))。
これまでに発見された CXCケモカインは、 PBSF/SDF- 1、 IL-8(Yoshimura. T. ら、 Pro Natl. Acad. Sci.U. S. A.84,9233-9237(1987)), NAP-2(Walz. A， ら、 Biochem. Biophys. Res. Co隱 un. , 159. 969-975(1989)), NAP-4, GRO ひ（Richm ondo, A. ら、 J. Cell. Biochem.. 36, 185-198(1988)), GRO /SCHaskill. S.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.87， 77732 -7736 (1990) ) , GRO r (Haskill , S.ら、 (1990) 前出） 、 GCP-2(Proos t , P.ら、 J. Immunol..150, 1000-1010 (1993) , ENA-78(Wayz, A. ら、 J. Exp. Med., 174, 1355-1362(1991)), PF-4 (Deuel. T. F. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.74 , 2256-2258 (1977) ) 、 ヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR(Feng,Y. ら、 Science, 272.872- 877(1996))、 及び iP -10(Dewald. B. ら、 I議 unol, Lett., 32, 81-84(1992)である。
そして CCケモカインは、 MCP-l((Yoshimura， T.ら、 J. Immunol., 142, 195 6-1962(1989), CP-2(Chang, H. ら、 Int. Immunol. ,1, 388-397(1989)), CP -3 (Van Damme. J.ら、 J. Exp. Med., 176, 59-65(1992)), IP-1 a (Obaku, . ら、 J. Biochem. , 99. 885-894(1986)), MIP-1 ^ (Lipes, M. A. ら、 Proc. Natl . Acad. Sci. U.S.A., 85, 9704-9708(1988)). RANTESCSchalL T. ら、 J. I画 unol., 141, 1018-1025(1988), I-309(Miller, M. D. ら、 J. Immunol., 143， 2 907-2916(1989)) およびェォタキシン（Jose, P. ら、 J. Exp. Med. , 179, 881-88 7(1994) ) である。
ほとんどの C X Cケモカインは好中球を遊走させて単球を遊走させない。 また 、 ほとんどの CCケモカインは単球を遊走させて好中球を遊走させない。 また、 他の白血球である好酸球、 好塩基球、 リンパ球については、 それぞれ一部の CX Cおよび CCケモカインに遊走活性が報告されている。 ヒトリンパ球の遊走活性 としては、 CCケモカインの RANTES、 MIP-1 α、 MCP-1 、 そして CXCケモカイ ンである IL-8において認められているが、 いずれもリンパ球に特異的な走化因子 ではない。
マウス PBSF/SDF- 1は、 元来マウス骨髄間質細胞株 PA6 より分泌されるマウス B 前駆細胞増殖促進因子として同定された CXCケモカインであり、 そのァミノ酸 配列も報告されている (図 1) (Nagasawa, T.ら Pro Natl. Acad. Sci. U.S. A., 9 1, 2305-2309(1994)) 。 また最近ヒト Tリンパ球に対しても強い遊走活性をもつ ことが明らかとなっている (Bleul. C. ら、 J.Exp. Med., 184.1101-1110 ) 0 ケモカインのレセプターについても、 種々の研究が行われており、 IL-8に特異 的なレセプターである IL-8RA, IL-8およびその他の CXCケモカインのレセプ夕 一である IL-8RB, MIP-1 ひおよび RANTESに特異的なレセプターである CC CKR1, M CP-1に特異的なレセプターである CC CKR2A、 MCP-1 および MCP-3 に特異的な CC C KR2B, ェォタキシン、 MCP- 3、 RANTES に特異的なレセブターである CC CKR3CC omb a d i e r e . C. ら、 J. Biol., 270. 16491-16494 (1995). また MIP - 1 a, MIP-1 β, RANTESに特異的なレセプターである CC CK 5 が報告されている 。 また、 最近ヒト CXCケモカインである SDF-1 レセプターとして CXCR4/fusin/ HUMSTSR が同定された。
また、 上記のケモカインレセプターのうち CC CKR5, CC CKR2B, CC CKR3および CXCR4/fusin /HUMSTSRは細胞膜上に存在するタンパク質である CD4 と協調して HI V-1 のレセプ夕一としての作用をもつこと、 さらにそれぞれのレセプ夕一のリガ ンドによりそれらのレセプタ一を介する HIV-1 の感染が阻害されることが明らか と 7よっている。
AIDSの病因ウィルスである HIV-1 の感染と AIDSの発症には性質の異なる 2種の HIV-1 が関与している。 主に単球、 マクロファージ、 Tリンパ球に感染する単球 指向性 HIV- 1 は感染および潜伏感染期間中のヒト体内でのウィルスの増殖に関与 し、 主に Tリンパ球に感染する T細胞株指向性 H I V— 1は T リンパ球数の減少 と AIDSの発症に関与している。 上記の 2種の HIV-1 が細胞に感染するには、 2つ のレセプターが必要である。 1つは細胞膜タンパク質の一種のである CD4 タンパ ク質であり、 上記の 2種の HIV-1 で共通するレセプターである。 もう 1つは CD4 夕ンパク質と協調してレセブ夕一としての活性をもつ coreceptorと呼ばれるタン パク質であり、 上記の 2種の HIV- 1 のそれぞれに特異的なレセプターである。 最近、 単球指向性 H I V - 1の主な coreceptorは C Cケモカインレセプターで ある C C C K R 5であり、 T細胞株指向性 H I V - 1の coreceptorは C X Cケ モカインレセプターであるヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR であることが明らかとなつ た。 更に、 C C C K R 5のリガンドである M I P— 1 、 M I P— 1 、 R A N T E Sで単球指向性 H I V - 1の感染が、 ヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR のリガン ドであるヒト PBSF/SDF-1で T細胞株指向性 H I V - 1の感染がそれぞれ阻害され る事が明らかとなり、 上記のケモカインレセプターが H I V— 1感染阻害剤の標 的となりうることが示唆された。
一方、 T細胞株指向性 H I V - 1の感染にヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR のどのド メイン必要であるかは、 現在のところ同定されていない。 C X Cケモカインレセ プターであるヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR は 7回膜貫通型レセプターであり、 4つ の細胞外ドメインにより形成される立体構造がリガンドまたは H I V - 1 との結 合に重要であると考えられる。 ヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR の機能ドメインを同定 するにはレセプ夕一としての立体構造が保たれるような CXCR4/fusin/HUMSTSR 変 異体を作製する事が必要である。 ヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR の機能ドメインを同 定することは、 H I V— 1感染阻害剤の開発に極めて有用である。
また、 HIV-1 の種特異性の原因となるメカニズムを解明する事は、 ウィルスの 感染に必要な細胞内因子を明らかにするのと同様、 HIV- 1 感染のモデル動物を開 発するために重要である。 マウスは、 扱いやすく、 低コストで、 性質が詳細に明 らかとなつている優れた実験動物であるが、 HIV- 1 に感染するという報告はない マウス細胞には HIV- 1 ウィルス感染に関していくつかの障壁が存在している。 最初の障壁は、 マウス細胞へのウィルスの結合の段階に存在する。 ヒト CD4は HI V-1 に結合するが、 マウス CD4 は HIV-1 に結合しない。 しかし、 これまでの研究 から、 in vi troにおいて T 細胞株を含むマウス細胞株の細胞表面にヒト CD4を発 現させると、 HIVの細胞への吸着は起こるがェントリは起こらない事が明らかに なっている。 この結果から、 ヒト CD4を発現するマウス細胞はウィルスのェント リを支持しない事が明らかとなり、 CD4以外にも （ウィルスのェントリの時に起 こる） 膜融合に必要で、 かつヒト特異的な受容体が存在しており、 その分子はマ ウス細胞には欠如している事が示唆されていた。
HIV-1 は株により CD4陽性細胞に対する感染能力に差異が認められる。 ある株 は単球に感染するため単球或いはマクロファージ指向性株 （M-tropic) に分類さ れ、 その他の株は T 細胞株に感染するため T 細胞株指向性株 (T-tropic)に分類さ れている。
HIV-1 感染が進行するに従って、 感染初期に多く認められる単球指向性のウイ ルスは、 T細胞株指向性のウィルスに置き換わっていく。 1996年に、 7回膜貫通 型で G蛋白質結合性受容体である CXCR4/fusin がヒト CD4陽性細胞への T細胞株 指向性 HIV-1のエントリに必須であることが示された。 この結果は、 ウィルスェ ントリの受容体としての機能に関して CXCR4 に種特異性があるかどうかを検討す る事を本発明者らに促した。 発明の開示
本発明者らは、 C X Cケモカインの一種のマゥス PBSF/SDF-1の受容体としてマ ウス CXCR4を単離し、 それがヒト CXCR4とアミノ酸配列が 90%—致している事を ここに明らかにした。 本発明者らは、 ヒト CD4とマウス CXCR4をトランスフエク トした細胞を樹立し、 HIV- 1の受容体であるヒト CXCR4 がマウス細胞に存在する HIV-1 ェントリに対する障壁であるかどうかを検討した。
したがって本発明の目的は、 AIDSの治療薬及び HIV-1 の感染の作用機序等の研 究に有用な、 新規なマウス C X Cケモカインレセプター遺伝子、 該遺伝子にコ一 ドされるポリペプチド、 該遺伝子の発現べクタ一、 該発現ベクターを有する形質 転換体、 該ボリペプチドに対する単クローン抗体、 該ポリペプチドの生産方法、 さらには該ポリペプチドのァゴニスト又はアンタゴニストの、 及び HIV-1 感染阻 害剤のスクリーニング方法を提供することにある。
そこで本発明者らは前記課題を解決すベく鋭意検討を行つた結果、 マゥス PBSF /SDF- 1依存的に増殖が促進されるマウス B前駆細胞株 DW34より新規マウスケモカ インレセプター遺伝子のクロ一ニングに成功した。 さらに、 マウス CXCR4 とヒト CD4細胞を発現する細胞は T細胞株指向性 HIV- 1株由来の env 蛋白質を発現する 細胞と融合する事、 また、 それらの細胞は T 細胞株指向性 HIV-1株に感染する事 を見出した。 これらの結果は、 CXCR4がマウス細胞に存在する T細胞株指向性 H IV-1のェントリに対する種特異的な障壁ではないと結論付けられるものである。 また、 env 領域もしくは V3 領域を単球指向性 HIV- 1 のものに置換した T 細胞株 指向性 HIV-1のキメラウィルスクローンは、 マウス CXCR4 とヒト CD4細胞を発現 する細胞に感染しない事から HIV-1 のエンベロープ蛋白質の V3ループがマウス C XCR4を介する HIV- 1のェントリーに必要である事を明らかにした。 かかる知見に 基づいて、 本発明を完成させた。
即ち、 本発明の要旨は、
〔 1〕 配列表の配列番号： 1 7に記載のァミノ酸配列の全部又は一部からな るポリペプチド、 又は該ポリペプチドを含むポリペプチドであって、 マウス PBSF /SDF- 1と結合可能なレセプタ一活性を有するポリペプチドをコードする D NA、
〔 2〕 配列表の配列番号： 1 7に記載のァミノ酸配列の全部又は一部のァミ ノ酸配列において、 1以上のアミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入又は置換の少なく とも一つが生じ、 かつマウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプター活性を有するボ リベプチドをコ一ドする DNA、
〔3〕 配列表の配列番号： 1に記載の塩基配列の全部又は一部からなる DN A、 又は該 DNAを含む DNAであって、 マウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプ ター活性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA、
〔4〕 配列表の配列番号： 1に記載の塩基配列の全部又は一部の DNA、 又 は該 DNAを含む DNAであって、 1以上の塩基の欠失、 付加、 挿入又は置換の 少なくとも一つが生じ、 マウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプター活性を有する ポリべプチドをコ一ドする DNA、
〔5〕 前記 〔1〕 〜〔4〕 いずれか記載の DNAとストリンジェントな条件 下でハイブリダィズする D N Aであって、 マウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプ 夕一活性を有するポリペプチドをコードする DNA、
〔6〕 前記 〔1〕〜 〔5〕 いずれか記載の DNAによりコードされるポリべ プチドであつて、 マウス PBSF/SDF- 1と結合可能なレセプ夕一活性を有するポリぺ プチド、
〔7〕 配列表の配列番号： 1 7に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からな るポリペプチド、 又は該ポリペプチドを含むポリペプチドであって、 マウス PBSF /SDF-1と結合可能なレセプター活性を有するボリぺプチド、
〔 8〕 配列表の配列番号： 1 7に記載のァミノ酸配列の全部又は一部のァミ ノ酸配列において、 1以上のアミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入又は置換の少なく とも一つが生じ、 かつマゥス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプ夕一活性を有するポ リベプチド、
〔9〕 マウス B前駆細胞株 DW 3 4に由来する、 前記 〔6；) 〜 〔8〕 いずれか 記載のポリべプチド、
〔 1 0〕 前記 〔1〕 〜 〔5〕 いずれか記載の DN Aを含む発現ベクター、 〔1 1〕 前記 〔1 0〕 記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換 体、
〔1 2〕 宿主が哺乳類細胞株である前記 〔1 1〕 記載の形質転換体、 〔1 3〕 前記 〔 1 1〕 又は 〔 1 2〕 記載の形質転換体を、 前記 〔 1 0〕 記載の 発現べクタ一の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、 マウス PBSF/SDF -1と結合可能なレセプター活性を有するポリぺプチドの生産方法、
〔14〕 前記 〔6：) 〜 〔9〕 いずれか記載のポリペプチドに対する単クローン 抗体、
〔1 5) マウス PBSF/SDF-1を含有し、 A I D S発症阻害剤又は H I V— 1感染 阻害剤として用いられる医薬組成物、
〔1 6〕 前記 〔6：) 〜 〔9〕 いずれか記載のポリペプチド及びヒト CD 4タン パク質を発現する細胞、
〔1 7〕 （a)前記 〔6〕 ~ 〔9〕 いずれか記載のポリペプチドを発現する細 胞又は前記 〔1 6〕 記載の紬胞； ヒト T細胞株指向性 H I V- 1 ；及びスクリー ニングの対象となる物質を混合してインキュベートを行う工程、 及び
(b)該細胞における HIV-1の局在性を分析する工程、
を含んでなることを特徴とする、 A I DS発症阻害剤又は H I V- 1感染阻害剤 をスクリーニングする方法、
〔1 8〕 HIV-1の局在性を分析する工程を、 ヒト T細胞株指向性 H I V— 1に 対するモノクローナル抗体を用いて行う、 前記 〔1 7〕 記載の方法、
〔1 9〕 （a)前記 〔6：) 〜 〔9〕 いずれか記載のポリペプチドを発現する細 胞又は前記 〔1 6〕 記載の細胞； H I V— 1エンベロープタンパク質を発現する 細胞；及びスクリーニングの対象となる物質を混合してィンキュベートを行うェ 程、 及び
(b) H IV- 1エンベロープタンパク質を発現する細胞と該細胞との融合性を 測定する工程、 を含んでなることを特徴とする、 A I DS発症阻害剤又は H I V- 1感染阻害剤 をスクリーニングする方法、
〔20〕 （a)前記 〔6〕 〜 〔9〕 いずれか記載のポリべプチドを発現する細 胞又は前記 〔1 6〕 記載の細胞；マウス又はヒト PBSF/SDF-1；及びスクリーニン グの対象となる物質を混合してインキュベートを行う工程、 及び
(b)該細胞内のカルシウムイオン濃度を測定する、 及び/又は発現したポリべ プチドと該マウス又はヒト PBSF/SDF-1との結合活性を測定することを特徴とする 、 A I DS発症阻害剤若しくは H IV— 1感染阻害剤、 又は該 PBSF/SDF-1のァゴ ニスト若しくはアン夕ゴニストをスクリーニングする方法、
〔21〕 該アンタゴニストが造血幹細胞遊離促進剤である前記 〔20〕 記載の 方法、
〔22〕 前記 〔6：) 〜 〔9〕 いずれか記載のポリペプチドを発現する細胞又は 前記 〔1 6〕 記載の細胞を含む、 A I DS発症又は H I V— 1感染を検出するた めのキット、
〔23〕 （a)前記 〔6〕 〜 〔9〕 いずれか記載のポリペプチドを発現する細 胞又は前記 〔1 6〕 記載の細胞、 及び H IV— 1に感染していることが疑われる 患者の血清、 血球又は血液を混合してインキュベートを行う工程、 及び
(b)該細胞における HIV-1の局在性を分析する、 又は H I V— 1感染細胞と該 細胞との融合性を測定する工程、
を含んでなることを特徴とする、 A I DS発症又は H IV- 1感染を検出する方 法、 に関するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 マウス PBSF/SDF- 1の cDNA塩基配列、 及び該塩基配列にコードされるマ ウス PBSF/SDF-1のァミノ酸配列を示す図である。
図 2は、 実施例 2のノーザンプロッティング法による電気泳動の結果を示す図 である。 Aはマウス組織の mRNAについての結果を示し、 Bはマウス胎児の m RNAについての結果を示す。
図 3は、 実施例 6の結果を示す図である。 図中、 横軸は経過時間を示し、 縦軸 は蛍光強度の比 （ 〔 34 0 nmにおける蛍光強度〕 Z 〔 380 nmにおける蛍光 強度〕 ） を示す。 使用した細胞はケモカインレセプ夕一が発現していない CH〇 細胞である。
図 4は、 実施例 6の結果を示す図である。 図中、 横軸は経過時間を示し、 縦軸 は蛍光強度の比 （ 〔34 O nmにおける蛍光強度〕 〔 380 nmにおける蛍光 強度〕 ） を示す。 使用した細胞はヒトケモカインレセプター CC CKR 2 Bが 発現した CHO細胞である。
図 5は、 実施例 6の結果を示す図である。 図中、 横軸は経過時間を示し、 縦軸 は蛍光強度の比 （ 〔34 O nmにおける蛍光強度〕 〔 38 0 nmにおける蛍光 強度〕 ） を示す。 使用した細胞はマウスケモカイン （PBSFZSDF— 1 ) の レセプ夕一 （マウス CXCR4 ) が発現した CHO細胞である。
図 6は、 実施例 6の結果を示す図である。 図中、 横軸は経過時間を示し、 縦軸 は蛍光強度の比 （ 〔 34 0 nmにおける蛍光強度〕 〔 38 0 nmにおける蛍光 強度〕 ） を示す。 使用した細胞はヒトケモカインレセプター CXCR 4/f u s i nZHUMSTSRが発現した CHO細胞である。
図 7は、 実施例 6の結果を示す図である。 図中、 横軸は経過時間を示し、 縦軸 は蛍光強度の比 （ 〔34 O nmにおける蛍光強度〕 ノ 〔 380 nmにおける蛍光 強度〕 ） を示す。 使用した細胞はマウス CXCR4 が発現した CHO細胞である。 図 8は、 マウス CXCR4がヒト T細胞株指向性 HIV-1の env蛋白質を介する膜融 合を支持することを示す図である。 ターゲッ ト細胞である NIH3T3にはヒト CD4、 T7 polymerase、 S-galの ω- subunitを発現する組み換えワクシニアウィルスを 感染させた。 感染後、 それらの細胞にマウス CXCR4、 ヒト CXCR4、 ヒト CCR5をト ランスフヱクトした。 エフヱクタ一細胞である HeLaS3には NL 432或いは SF162 由 来の env 蛋白質と /S -galの - subuni tを発現する組み換えヮクシニアウィルスを 感染させた。 それらの細胞を細胞融合させた後に /3 - galアツセィに用いた。
図 9は、 マウス CXCR4がヒト T細胞株指向性 HIV-1ウィルスの感染を支持する ことを示す図である。 SW480(A)細胞に、 それぞれヒト CD4 とケモカイン受容体 （ マウス CXCR4 、 ヒト CXCR4 、 ヒト CCR5、 ヒト CCR2b ) をトランスフヱクトし、 HI V-1 の NL432株、 Ι ΠΒ株、 SF162 株をそれぞれ感染させた後に細胞溶解物を; 8 -g alァッセィに用いた。
図 1 0は、 マウス CXCR4がヒト T細胞株指向性 HIV-1ウィルスの感染を支持す ることを示す図である。 H0S 細胞 （B)に、 それぞれヒト CD4 とケモカイン受容体 (マウス CXCR4 、 ヒト CXCR4 、 ヒト CCR5、 ヒト CCR2b ) をトランスフヱク トし、 HIV-1 の NL432株、 I I IB株、 SF162株をそれぞれ感染させた後に細胞溶解物を -galアツセィに用いた。
図 1 1は、 マウス CXCR4がヒト T細胞株指向性 HIV-1ウィルスの感染を支持す ることを示す図である。 U87MG 細胞 （C)に、 それぞれヒト CD4 とケモカイン受容 体 （マウス CXCR4 、 ヒト CXCR4 、 ヒト CCR5、 ヒト CCR2b ) をトランスフヱク トし 、 HIV-1 の NL432 株、 Ι ΠΒ株、 SF162 株をそれぞれ感染させた後に細胞溶解物を 8 -galアツセィに用いた。
図 1 2はキメラプロウィルスクローンの構造を示す模式図である。 SF162の e nv或いは V3ループを、 ヒト T細胞株指向性 HIV-1である NL432のプロウィルス DN A に組み込んだ (E : EcoRI、 Ba : BamHI、 St : Stu I 、 Nh :NheI)0
図 1 3は、 エンベロープ蛋白 gpl20 の V3 ループが、 マウス CXCR4を介する H IV - 1エントリに必須であることを示す図である。 ヒト CD4と図中に示す受容体を 発現する SW480 細胞に、 HIV-1 の NL432 株、 SF162 株及びキメラプロウィルスク ローンである NL432env-162、 NL432V3-162 を感染させた。 発明を実施するための最良の形態 1. 本発明の DNAについて
本発明の DN Aは、 マウスの新規 CXCケモカインレセプターであるマウス PB SF/SDF- 1のレセプタ一 （マウス CXCR4 ) をコードする DN Aであれば特に限定さ れないが、 具体的には、 以下の DNAが例示される。
1 ) 配列表の配列番号： 1 7に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなるポリ ペプチド、 又は該ポリペプチドを含むポリペプチドであって、 マウス PBSF/SDF-1 と結合可能なレセブター活性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA。
2 ) 配列表の配列番号： 1 7に記載のァミノ酸配列の全部又は一部のァミノ酸配 列において、 1以上のアミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入又は置換の少なくとも一 つが生じ、 かつマゥス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプター活性を有するポリぺプ チドをコ一ドする DNA。
3) 配列表の配列番号： 1に記載の塩基配列の全部又は一部からなる DNA、 又 は該 DNAを含む DNAであって、 マウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプター活 性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA。
4) 配列表の配列番号： 1に記載の塩基配列の全部又は一部の DNA、 又は該 D NAを含む DNAであって、 1以上の塩基の欠失、 付加、 挿入又は置換の少なく とも一^ ^が生じ、 マウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプター活性を有するポリぺ プチドをコ一ドする DNA。
5) 前記 1 )〜4) いずれか記載の DN Aとストリンジヱントな条件下でハイブ リダイズする DNAであって、 マウス PBSF/SDF- 1と結合可能なレセプター活性を 有するポリべプチドをコ一ドする DNA。
また、 2) において、 「 1以上のアミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入又は置換」 とは、 特に限定されるものではなく、 例えば 1個又は数個のアミノ酸残基の欠失 、 付加、 挿入又は置換をいう。 ここで数個とは、 例えば 1 0個以下の個数をいう 。 さらに、 4) において、 本発明の DNAの塩基の欠失、 付加、 挿入又は置換の 程度は 1以上であるが、 好ましくは 1〜数個が好ましい。 ここで数個とは、 例え ば 1 0個以下の個数をいう。 また、 発現されるポリペプチドの機能又は活性が実 質的に同じ程度であるならば、 化学的または生化学的な改変、 あるいは非天然ま たは誘導体化されたァミノ酸残基や塩基を含んでいてもよい。
本発明の DNAの単離は、 既知のケモカインレセプ夕一間でホモロジ一を有す る塩基配列を PCRにより増幅し、 該増幅断片をプローブとしてマウスの c DN Aライブラリ一等をスクリ一二ングすることにより行うことができる。
なお、 本発明において用い得る実験手法は、 一般的な分子生物学的実験手法 （ DNA の電気泳動、 電気泳動により分離した DNA をゲル中から回収する方法、 ライ ゲ一シヨン、 宿主の形質転換、 組換え宿主の培養、 プラスミ ド DNA の調製、 DNA の制限酵素による切断、 DNA の放射標識など） は、 例えば Molecular Cloning 第 2版（Maniatis ら Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1989))に記載され ているような、 当業者に公知の方法が採用される。
PCRに用いるプライマ一としては、 報告されているヒトケモカインレセプ夕 —で保存されているアミノ酸配列に基づいて、 例えば、 第 2膜貫通領域のァミノ 酸配列をコードする DNA配列に対する正方向の縮重プライマーの 5' 側に適切な 制限酵素部位を付加したもの、 および第 7膜貫通領域のァミノ酸配列をコードす る DNA配列に対する逆方向の縮重プライマーの 5' 側に適切な制限酵素部位を付 加したものが挙げられる。 かかるプライマ一は DNA合成機を用いて合成すること ができる。
また、 c DNAのクローニングに用いられるマウス mRNAは、 マウス B前駆 細胞株 DW34 (京都大学の西川教授より供与） 等の細胞から、 市販の mRNA 精製用キッ トを用いて精製し得る。
また、 マウス CXCR4 の c DNA由来の DNA断片等を用いて、 マウスゲノム D N Aのクローニングを行うこともできる。
得られる cDNAの塩基配列やゲノム DNAの塩基配列を、 例えば、 GenBank/ E BL/DDBJ DNA配列データベースに対して核酸ホモロジ一検索を行うことにより 、 得られる c D N Aがケモカインレセプターをコードしているかどうかを推定す ることができる。 配列表の配列番号： 1に、 得られる c D N Aの塩基配列を示す 。 また、 配列表の配列番号： 1の第 1 2 0位〜第 1 1 9 6位の塩基配列が最長の オープンリ一ディングフレームであることから、 このオープンリ一ディングフレ ームの塩基配列に基づいて推定したアミノ酸配列 （配列表の配列番号： 1 7 ) に ついて、 Genbank、 EMBL、 DDBJなどのデータベースに対して DNASIS (日立） 、 BL ASTCAl tschul, F.ら， J. Mol. Biol. , 215, 403-410)などのプログラムを用いて、 ホモロジ一検索を行い、 本発明の D N Aにコードされるボリべプチドについてさ らに検討を加えることができる。
その結果、 配列表の配列番号： 1 7に記載されるアミノ酸配列を有するポリべ プチドは、 ケモカインレセプ夕一に特徴的な 7つの膜貫通ドメインを含む三量体 Gタンパク質結合型レセプターであると推定された。 また、 既知の C X Cケモカ インレセプターのアミノ酸配列と比較した結果、 ヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR が最 も類似している事が明らかとなった （相同率 90% ) 。
また、 本発明の D N Aを発現させた細胞は、 ケモカイン （マウス PBSF/SDF-1) に対するレセプター活性、 細胞内カルシウム濃度上昇活性のいずれをも有してい たことから、 本発明の D N Aは新規のマウスケモカインレセプ夕一をコードして いることが分かり、 該 D N Aにコードされるタンパク質をマウス CXCR4 と命名す 。
「ケモカイン」 とは、 前記のように白血球が炎症反応局所への走化性を示すた めの誘因物質のうち、 遊走する白血球に対してある程度の選択性を有し、 特徴的 な 4つのシスティン残基を有するポリべプチドのファミ リーをいう。 これらはァ ミノ酸配列および生物活性に関連性がある。 ケモカインの 4つのシスティン残基 は、 第 1 と第 3の残基間および第 2と第 4の残基間でそれぞれジスルフィ ド結合 している。 第 1 と第 2のシスティン残基間に別のァミノ酸を 1つ含むケモカイン を 「C X Cケモカイン J 、 別のアミノ酸を含まないケモカインを 「c cケモカイ ン」 、 として区別している。 一般に、 C Cケモカインは単球を遊走させて好中球 を遊走させず、 C X Cケモカインは好中球を遊走させて単球を遊走させないこと が知られている。
「ケモカインレセプ夕一」 とは上記ケモカインに特異的に結合する細胞膜夕ン パク質ファミ リーをいう。 ケモカインレセプ夕一はアミノ酸配列や構造上の関連 がある。 ケモカインレセプタ一はすべて口ドプシンファミ リーに特徴的な 7つの 膜貫通ドメインと三量体 Gタンパク質との結合ドメインを有している。 ケモカイ ンレセプ夕一はリガンドに対する特異性から 2つのサブグループに分類される。 上記ケモカインのうち C X Cケモカインに特異的に結合するものを 「C X Cケモ 力インレセプ夕一 j として C Cケモカインに特異的に結合する 「C Cケモカイン レセブター」 と区別している。 一般にケモカインレセプ夕一はそれぞれのリガン ドと結合した時に、 細胞内カルシウム濃度を上昇させる作用を有している。 また 最近、 ケモカインレセプターにはケモカインのレセプ夕一としての活性を持つだ けでなく、 細胞膜上に存在する CD4 と呼ばれる分子と協調して HIV-1 のレセプ夕 一としての活性を有するものがあることが明らかとなっている。
本明細書において、 マウス PBSF/SDF-1に対するレセプター活性は、 例えば次の ようにして測定することができる。
マウス CXCR4 のリガンドである PBSF/SDF-1ペプチドを、 例えば、 ボルトンハン ター試薬などを用いて1 2 5 Iで標識したり、 アルカリホスファターゼなどの酵素 で標識する。 標識された PBSF/SDF-1ペプチドを、 レセプター活性を有するポリべ プチドを発現する細胞の懸濁液に添加し、 一定の温度でインキュベートする。 洗 浄後、 細胞に結合した PBSF/SDF-1ペプチドの量を、 標識量を測定することにより レセプター活性を測定し得る。 ここで用いられる細胞としては、 例えば、 マウス B前駆細胞株 DW 3 4、 ヒト胎児腎細胞株 2 9 3細胞、 またはマウス CXCR4 を発 現するように操作を行ったチャイニーズハムスター卵巣由来細胞株 C H 0細胞等 が挙げられる。
また、 本発明のポリぺプチドはリガンドと結合したときに細胞内カルシゥムィ オン濃度を上昇させる活性を有するものが好ましい。 かかる活性は、 例えば次の ようにして測定することができる。
上記の活性の測定対象であるポリべプチドを発現する細胞を緩衝液で洗浄した 後、 適当な緩衝液 （例えば、 HBSS (2 OmM He p e s、 pH7. 4中に 、 1 25mM NaC l、 5mM KC 1、 1 mM MgC l 2 、 0. 5mM グルコース及び 0. 1 %BSAを含む） 等） に懸濁し、 さらに細胞内カルシウム イオンにより影響を受けるような蛍光試薬を加え、 インキュベートすることで細 胞を標識し得る。 標識した細胞を緩衝液で洗浄した後、 適当な緩衝液に懸濁し、 リガンドとなるケモカインを加えたときの蛍光強度の変化から、 活性を測定する ことができる。
例えば、 蛍光試薬として fura-PE3AM (テキサス フルォレツセンス ラボラト リ一） を用いる場合、 励起波長が 34 0 nmと 380 nm、 蛍光波長が 5 1 0 n m、 レスポンスが 0. 5秒の条件で測定する。 そして、 〔励起波長 38 0 nmで の蛍光強度〕 に対する 〔励起波長 34 0 nmでの蛍光強度〕 の比を求める。 ケモ 力ィンの添加により測定対象の細胞において細胞内カルシウムィォン濃度が上昇 した場合、 該蛍光強度の比の上昇が認められる。 また、 種類の異なるケモカイン を添加することにより、 リガンドに対するレセプ夕一の特異性を確認することも できる。
また、 マウス CXCR4の mRNAの存在の確認は、 通常の特異的な mRNAの検出法を用 いて行い得る。 例えば、 mRNAはアンチセンス RNA または cDNAをプローブとして用 いた、 ノーザンブロッ ト分析またはインサイチュハイプリダイゼ一ション法によ り検出し得る。 又は、 mRNAはまた mRNAを逆転写酵素で cDNAに変換した後、 適当な プライマーの組み合わせによる PCR法によっても検出し得る。 2 . 本発明のポリペプチドについて
本発明のポリべプチドとしては、 例えば以下のものが挙げられる。
1 ) 本発明の D N Aによりコードされるボリペプチドであって、 マウス PBSF/SDF -1と結合可能なレセプター活性を有するポリぺプチド。
2 ) 配列表の配列番号： 1 7に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなるポリ ペプチド、 又は該ポリペプチドを含むポリペプチドであって、 マウス PBSF/SDF-1 と結合可能なレセプ夕一活性を有するポリペプチド。
3 ) 配列表の配列番号： 1 7に記載のァミノ酸配列の全部又は一部のァミノ酸配 列において、 1以上のアミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入又は置換の少なくとも一 つが生じ、 かつマゥス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプタ一活性を有するポリぺプ チド。
4 ) マウス B前駆細胞株 DW 3 4に由来する、 前記 1 ) 〜3 ) いずれかのポリべ プチド。
3 ) の態様において、 本発明のポリペプチドのアミノ酸残基の欠失、 付加、 揷 入又は置換の程度は 1以上であり、 マウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプタ一活 性を有する限り、 変異の個数は特に限定されない。 例えば、 1〜数個が例示され る。 ここで数個とは、 例えば 1 0個以下の個数をいう。 また、 ポリペプチドの機 能又は活性が実質的に同じ程度であるならば、 化学的または生化学的な改変、 あ るいは非天然または誘導体化されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。
また、 本発明のポリペプチドは、 マウス B前駆細胞株 DW 3 4に由来するもの が好ましい。
また、 本発明のポリペプチドの存在の確認は、 通常の特異的なタンパク質の検 出法を用いて行い得る。 例えば、 マウス CXCR4 に特異的な抗体を用いる通常の免 疫沈降法またはウェスタンブロッ ト法、 FACSによる解析により確認し得る。
3 . 本発明の発現ベクター及び形質転換体について 本発明の発現べクタ一は、 例えば、 p E F B 0 S、 p C A G G S t k N e o , p MXなどの公知のベクターに、 本発明の D N Aを組み込むことにより得ること ができる。
また、 本発明の形質転換体は、 本発明の発現ベクターを所望の宿主に導入する ことにより得ることができる。 宿主としては特に限定されないが、 哺乳類細胞株 が好ましい。 哺乳類細胞株としては、 例えば、 マウス B前駆細胞株、 ヒト胎児腎 細胞株、 チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株等が挙げられ、 ハムスター卵巣 由来細胞株が好ましい。 発現ベクターを宿主に導入する方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法、 D E A Eデキストラン法、 エレクト口ポレーシヨン法等の 公知の方法を用いれば良い。
また、 上記の形質転換体を、 上記の発現ベクターの発現可能な条件下で培養す ることにより、 マウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプター活性を有するポリぺプ チドを生産することができる。 このようにして生産されるポリペプチドは、 通常 のカラムクロマトグラフィー又は本発明の抗体を用いたァフィ二ティークロマト グラフィ一等の方法により、 容易に精製することができる。
4 . 本発明の単クローン抗体について
本発明の単クローン抗体としては、 本発明のマウス CXCR4 ポリペプチドに対す るもの、 及び該ポリペプチドとヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR との融合タンパク質に 対するものが挙げられる。
かかる単クロ一ン抗体は、 例えば次のようにして作製することができる。 免疫原として、 本発明のポリべプチドのァミノ酸配列の一部に基づいて通常の ペプチド合成機で合成した合成ペプチドを、 又はマウス CXCR4 を発現するべクタ 一で形質転換した細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞などにより産生されたマウス CXCR4 を細胞のまま、 或いは通常のタンパク質化学的方法で精製して得られる夕 ンパク質を用いる。 かかる免疫原を用いて、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 ゥサ ギなどの動物を免疫し、 脾臓またはリンパ節から細胞を取り出し、 ミエローマ細 胞と融合させて、 oehler および Mi lsteinの方法 (Nature, 256, 495-497(1975)) またはその改良法である Uedaらの方法 (Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 79, 4386-4 390(1982))に従ってハイプリ ドーマを作製する。 かかるハイプリ ドーマは単クロ ーン抗体を産生させ得る。
より具体的には、 例えば、 以下の工程によりマウス CXCR4 の単クローン抗体を 得ることができる。
(a) マウス CXCR4 タンパク質によりマウスを免疫する工程、
(b) 免疫マウスの脾臓を摘出して脾臓細胞を分離する工程、
(c) 分離された脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを、 融合促進剤 （例えば、 ポ リエチレングリコール） の存在下で、 上記の Koehler らに記載の方法によって融 合する工程、
(d) 非融合ミエローマ細胞が成長しない選択培地で得られたハイプリ ドーマ細胞 を培養する工程、
(e) EL ISA 法および免疫電気移転法などにより所望の抗体を産生するハイプリ ド —マ細胞を選択し、 限界希釈法などによりクローニングする工程、 および
(f) 抗マウスマウス CXCR4 の単クローン抗体を回収する工程。
また、 マウス CXCR4 とヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR との融合タンパク質に対する 単クローン抗体も本発明に含まれる。
このような単クローン抗体は、 マウス CXCR4 とヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR との 融合タンパク質を得、 このタンパク質やそのペプチドを免疫原として、 上記の方 法等により得ることができる。
5 . 本発明の医薬組成物及び細胞について
本発明の医薬組成物は、 マウス P B S F / S D F— 1を含有し、 A I D S発症 阻害剤または H I V - 1感染阻害剤として用いられるものである。 本発明の医薬組成物は、 経口的又は非経口的に投与することができる。 すなわ ち、 通常用いられる投与形態、 例えば錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤等として 経口投与することができ、 あるいは液剤、 乳剤、 懸濁液剤、 リボソーム剤などと して筋肉内注射又は皮下注射することができ、 また、 坐剤として直腸投与するこ ともできる。 このような剤形は、 医薬として許容される通常の担体、 賦型剤、 結 合剤、 安定剤、 緩衝剤、 溶解補助剤、 等張剤等と本発明の有効成分を配合するこ とにより製造することができる。
投与量、 投与回数は、 患者の症状、 症歴、 年齢、 体重、 投与形態等によって異 なるが、 例えば成人に経口投与する場合、 通常、 1日当たり 5〜50 Omg、 好ま しくは 1 0〜1 0 Omgの範囲で適宜調節して、 1回又は数回に分けて投与するこ とができる。
また、 本発明の細胞は、 上記の本発明のポリペプチドを発現する細胞、 又は該 ポリべプチド及びヒト CD 4タンパク質の両者を発現する細胞である。
かかる細胞は、 例えば次のようにして得ることができる。 即ち、 マウス CXCR4 をコードするポリヌクレオチドを組み込んだベクターを得る。 ベクターとしては 、 pEFBOS、 pCAGGS、 p MX等の公知のものが使用できる。 次いで、 発現用の細胞に上記のボリヌクレオチドを組み込んだべクタ一を導入することに より、 本発明の細胞を得ることができる。 発現用の細胞としては、 チャイニーズ ハムスター卵巣由来細胞株、 CHO細胞、 ヒト結腸癌細胞株、 SW480細胞、 ヒト骨芽肉腫細胞株、 HOS細胞、 ヒトグリア芽細胞株、 U87MG細胞等が挙 げられる。 また、 ベクターの導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法や Lipofectin (GibcoBRL社） 、 Lipofectaraine CGibcoBRL社） を用いる方法が挙げ られる。
マウス CXCR4 は H I V— 1の co-receptor となることが見出されたことから、 本発明の細胞は、 A IDS発症阻害剤や HI V— 1感染阻害剤、 PBSFZSD F- 1のァゴニストゃアンタゴニストのスクリ一ニングゃ A I DS発症または H I V- 1感染の検出等に用いることができる。
6. 本発明のスクリーニング方法について
本発明のスクリーニング方法には、 A IDS発症阻害剤、 H IV - 1感染阻害 剤、 及びマウス又はヒト PBSFZSDF— 1のァゴニストゃアン夕ゴニストを スクリーニングする方法がある。 具体的には次の通りである。
1 ) (a)上記に記載の本発明の細胞； ヒト T細胞株指向性 H IV- 1 ；及びス クリ一二ングの対象となる物質を混合してィンキュベ一トを行う工程、 及び
(b) 該細胞における HIV-1の局在性を分析する工程、
を含んでなることを特徴とする、 A I DS発症阻害剤又は H I V- 1感染阻害剤 をスクリーニングする方法。
2) (a)上記に記載の本発明の細胞； H I V— 1エンベロープタンパク質を発 現する細胞；及びスクリ一ニングの対象となる物質を混合してィンキュベ一トを 行う工程、 及び
(b) H IV- 1エンベロープタンパク質を発現する細胞と該細胞との融合性を 測定する工程、
を含んでなることを特徴とする、 A I DS発症阻害剤又は H IV- 1感染阻害剤 をスクリーニングする方法。
3) (a)上記に記載の本発明の細胞；マウス又はヒト PBSF/SDF-1；及ぴスクリ 一二ングの対象となる物質を混合してィンキュペートを行う工程、 及び
(b)該細胞内のカルシウムイオン濃度を測定する、 及び/又は発現したポリべ プチドと該マウス又はヒト PBSF/SDF-1との結合活性を測定することを特徴とする 、 A I DS発症阻害剤若しくは H I V- 1感染阻害剤、 又は該 PBSF/SDF- 1のァゴ ニスト若しくはアン夕ゴニストをスクリーニングする方法。
また、 ヒト T細胞株指向性 H I V— 1としては、 例えば H I V— 1 II IB株 （ 熊本大学の原田教授より供与） や H I V - 1 NL432株 （徳島大学の足立教授よ り供与） が挙げられる。
1 ) について
HIV-1の局在性を分析する工程としては、 ヒト T細胞株指向性 H I V - 1に対 するモノクローナル抗体を用いて行うことがより好ましい。
かかるモノクローナル抗体を用いての分析方法としては特に限定されるもので はなく、 通常用いられる公知の方法が挙げられる。
また、 HIV-1の局在性を分析する方法としては、 以下に述べる酵素法も用いる ことができる。
即ち、 この方法で用いられる 「本発明の細胞」 としては、 ヒト C D 4タンパク 質と CO- receptor を発現する細胞 （例えば、 SW480 、 U87MG、 H0S 等） であって 、 H I V - 1の遺伝子発現プロモーターである L T Rの下流に酵素 （例えば；8— ガラクトシダーゼ、 ルシフェラーゼ、 C A T等） の遺伝子が導入されたものが好 ましく用いられる。 H I V— 1がかかる細胞に感染すると、 ウィルスのタンパク 質の一種である t a tタンパク質が発現し、 それが L T Rを活性化させる。 した がって、 細胞溶解物中に含まれる酵素活性を測定することにより、 感染量を定量 できる。
2 ) について
H I V - 1エンベロープタンパク質を発現する細胞としては、 例えば HeLaS3に H I V - 1エンベロープタンパク質の遺伝子を導入したものが挙げられ、 さらに 例えば —ガラクトシダーゼのサブユニッ ト （α又は ωのいずれか一方） の遺伝 子を導入したものが好適に用いられる。 また、 「本発明の細胞」 としては、 例え ば ΝΙΗ3Τ3に、 ヒト C D 4タンパク質と co-receptor を導入したものであって、 さ らに例えば /3—ガラク トシダーゼのサブュニッ ト 又は ωのいずれか一方であ つて、 H I V— 1エンベロープタンパク質を発現する細胞に導入されたものとは 異なるもの） の遺伝子を導入したものが好適に用いられる。 H I V— 1ェンベロ ープタンパク質を発現する細胞と本発明の細胞とが細胞融合した場合、 /3—ガラ ク トシダーゼのひ—サブュニットと ω—サブュニッ トが会合し、 活性型の /8—ガ ラク トシダーゼとなる。 したがって、 両細胞を混合して培養した後に、 細胞溶解 物中に含まれるガラクトシダーゼ活性を測定することにより、 細胞融合量が測定 できる。
3 ) について
( a ) 工程においてインキュベートが行われた結果、 細胞内カルシウムイオン 濃度を上昇させる活性が認められた場合、 対象物質はァゴニストの可能性がある 。 また、 細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性は認められないものの、 対象物質とレセプターとの結合が認められた場合、 対象物質はァン夕ゴ二ストの 可能性がある。 また、 マウス PBSF/SDF-1の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇さ せる活性及びノ又はレセプターとの結合活性に影響を及ぼす場合、 すなわち活性 を阻害する場合、 対象物質はアンタゴニストの可能性がある。 また、 該アンタゴ 二ストとしては、 造血幹細胞遊離促進剤が例示される。
7 . 検出キッ ト及び検出方法について
本発明の A I D S発症又は H I V - 1感染を検出するためのキッ トは、 本発明 の細胞を含むことを特徴とする。
かかるキッ トを用いることにより、 簡単に A I D S発症又は H I V - 1感染を 検出することができる。 本発明のキッ トは、 以下に示す本発明の検出方法を利用 して検出を行うためのものである。
また、 本発明の A I D S発症又は H I V— 1感染を検出する方法は、
( a ) 上記に記載の本発明の細胞、 及び H I V— 1に感染していることが疑われ る患者の血清、 血球又は血液を混合してインキュベートを行う工程、 及び
( b ) 該細胞における HIV-1の局在性を分析する、 又は H I V— 1感染細胞と該 細胞との融合性を測定する工程、 を含んでなることを特徴とするものである。 法。 ここで、 HIV-1の局在性を分析する方法としては、 本発明の A I D S発症阻害 剤又は H I V— 1感染阻害剤において用いられる方法が挙げられる。 また、 H I V— 1感染細胞と該細胞との融合性を測定する方法としては、 本発明の A I D S 発症阻害剤又は H I V - 1感染阻害剤において用いられる方法が挙げられる。 な お、 （b ) における H I V - 1感染細胞とは、 H I V— 1に感染していることが 疑われる患者の血球であって、 H I V— 1に感染しているものである。
8 . 本発明の有用性について
本発明のマウス CXCR4 とヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR は共に、 マウス PBSF/SDF - 1 に反応する。 マウスとヒ卜の PBSF/SDF-1は 7 1アミノ酸のうち 1つのァミノ酸の 差異しか認められないので、 マウス CXCR4 はヒト PBSF/SDF-1にも結合すると期待 される。 ヒト PBSF/SDF-1は CXCR4/fusin/HUMSTSR を介する T細胞株指向性 H I V — 1の感染を阻害するので、 本発明のマウス CXCR4 タンパク質に対する抗体、 お よびマウス CXCR4 とヒト CXCRVfusin/HUMSTSR との細胞外ドメインを互いに置換 して得られる T細胞株指向性 H I V - 1 との結合部位を有するキメラタンパク質 に対する抗体は、 HIV-1 の感染阻害剤、 すなわち AIDSの治療薬として用いられ得 。
また本発明により提供されるマウス CXCR4 タンパク質およびマウス CXCR4 とヒ ト CXCR4/fusin/HUMSTSR との細胞外ドメインを互いに置換したキメラ夕ンパク質 のァゴニスト、 アン夕ゴニストをスクリーニングする方法により、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストを得、 HIV- 1 の感染阻害剤、 すなわち AIDSの治療薬として用いら れ得る。 以下、 実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらの実施 例によりなんら限定されるものではない。 実施例 1 (マウス CXCR4 の cDNAのクローニング）
( 1 ) プライマーの合成
既知のケモカインレセプターのアミノ酸配列に基づいて、 第 2膜貫通領域のァ ミノ酸配列をコードする DNA配列に対する正方向の縮重プライマー C2F2-2 (配列 表の配列番号： 5 ) 、 第 7膜貫通領域のアミノ酸配列をコードする DNA 配列に対 する逆方向の縮重プライマー C4R1 (配列表の配列番号： 6 ) を、 DNA 合成機 (Cyc lone Plus,日本ミ リポア） を用いて合成した。
( 2 ) マウス B前駆細胞株 DW34からの mRNAの精製
マウス B前駆細胞株 DW34を RPMI 1640 培地に懸濁し、 一週間培養した後、 ダル べッコ PBS(-) ( ニッスィ） で洗浄し、 mRNA精製キッ ト （フアルマシア） を用いて mRNAを精製した。
( 3 ) マウス CXCR4 の cDNA断片のクローニング
マウス B前駆細胞株 DW34から精製した mRNAの 200ng について、 Ready-To-Go T- Primed First-Strand キッ ト （フアルマシア） を用いて一本鎖 cDNAを合成した。 この一本鎖 cDNAを铸型とし、 プライマーとして C2F2- 2および C4R1を、 耐熱性 DNA ポリメラーゼとして Taq を用いて、 PCR 反応（ 9 4 °〇で0 . 5分間、 5 5 °Cで 0 . 5分間、 7 2 °Cで 1分間の条件で 3 0サイクル） を行った。 得られた反応液を 、 低融点ァガロースゲル電気泳動で分離し、 目的のサイズ （約 690bp)の DNA バン ドを切り出し、 Wizard PCR Preps DNA精製システム （プロメガ） を用いて DNA 断 片を精製した。 得られた DNA 断片を PT7Blue ベクターに、 DNA ライゲーシヨンキ ッ ト （夕カラ） を用いて挿入した。 この挿入 DNA の塩基配列を、 PRISM Ready Re actionシーケンスキッ ト （Appl ied Biosystems社） および DNAシーケンサー （Ap Pl ied Biosystems社） を用いて決定した。 得られたマウス CXCR4 の cDNA配列を、 配列表の配列番号： 2に示す。 上記のようにして得られたマウス CXCR4 の cDNA配 列を基に配列表の配列番号： 7および配列表の配列番号： 8に示すプライマーを 合成し、 Marathon cDNA Ampl if icat ion キット（Clontech社） を用い、 上記のよ うにして得た而 34細胞の cDNAを铸型にして 5 ' 末端を含む cDNAク口ーンを得た。 得られたマウス CXCR4 の cDNA配列を、 配列表の配列番号： 3に示す。 実施例 2 (マウス CXCR4 の各組織における発現）
( 1 ) プローブの作製
マウス CXCR4 のマウス各組織における発現を検討するために、 まず、 以下のよ うにプローブを作製した。 マウス CXCR4 の遺伝子の塩基配列に基づいて、 第 2膜 貫通領域部分に対応する正方向の DNA配列 （配列表の配列番号： 1 5 ) および第 7膜貫通領域部分に対応する逆方向の DNA配列 （配列表の配列番号： 1 6 ) をプ ライマーとして合成し、 次の PCR に用いた。 上記実施例 1の （3 ) 項で得られた 塩基配列の cDNAを铸型とし、 Taq ボリメラーゼを用いて、 9 4 °Cで 1分間、 5 5 で 1分間、 7 2 で 2分間の条件で 3 0サイクルの PCR 反応を行った。 PCR反 応物をァガロースゲル電気泳動で分離し、 目的のサイズ（690bp) の DNA バンドを 切り出し、 Wi zard PCR Preps DNA精製システムを用いて DNA断片を精製した。 得 られた DNA断片 50ngを、 Prime-I t I I ランダムプライマーラベリングキッ ト （ス トラ夕ジーン） を用いて3 2 P標識し、 プローブとして用いた。
( 2 ) マウス組織およびマウス胎児のノーザンプロット分析
種々のマウス組織の mRNA、 及び生後 7日目、 1 1日目、 1 5日目、 1 7日目の マウス胎児の mRNAを電気泳動で分離してトランスファ一したメンブラン、 並びに 上記 （ 1 ) 項で得たプローブを用いて、 ハイブリダィゼーシヨンを行った。 メン ブランの洗浄は、 0. 05%SDS を含む 2xSSC に浸して、 室温で 1 5分間を 2回行つ た後、 さらに 0.1 %SDSを含む 0. lxSSC に浸して 50 °Cで 20分間を 2回行った。 このメンブランの放射線をォ一トラジオグラフィ一で検出した。 この結果を図 2 の A (マウス組織） 及び B (マウス胎児） に示す。 バンドの濃さから明らかなよ うに、 胸腺、 リンパ節、 脾臓に強いシグナルが得られ、 脳、 小腸、 胃、 腎臓で弱 レ、シグナルが得られた。 またマウス胎児の全てで強いシグナルが得られた。 実施例 3 (マウス CXCR4のゲノム DNAのクローニング）
(A)プローブの作製
上記実施例 1の （3)項で得られたマウス CXCR4の cDNAの塩基配列に基づいて 、 適切な正方向および逆方向のプライマーを合成し、 次の PCR に用いた。 上記実 施例 1 (3)項で得られた cDNAから二本鎖 DNAを得、 この二本鎖 DNAを 铸型とし、 Taq ポリメラ一ゼを用いて PCR反応を行い、 ァガロース電気泳動で分 離し、 目的のサイズ （約 690bp)の DNAバンドを切り出し、 DNA断片を精製した。 得られた DNA断片 50ngを、 Prime-It II ランダムプライマ一ラベリングキッ ト （ ストラタジーン） を用いて32 P標識し、 プローブとして用いた。
(B)マウスゲノムライブラリ一のクローニング
まず、 ファージベクタ一 λΡΙΧΠ に組み込んだ 129/SvJ マウス肝臓ゲノムライ ブラリーを大腸菌に感染させ、 一次スクリーニングとして、 プレートに播いてプ ラークを形成させた後、 ナイロンメンブラン （デュポン社） にトランスファーし た。 このメンブランをプレハイブリダィゼ一シヨン液 (5XSSPEC0.9M NaCl、 0.05 M リン酸ナトリゥム pH7.7、 0.005M Na2 EDTA) 、 50%ホルムァミ ド、 5 xデン ハルト液、 50 zg/mlサケ精子 DNA、 0.1 %SDS)に浸してプレハイブリダィゼーシ ヨンした後、 上記 (A) 項で得られたプローブとハイブリダィゼーシヨン液（5XSS PE、 50%ホルムアミ ド、 I Xデンハルト液、 10%デキストラン硫酸ニナトリウム 、 50〃g/mlサケ精子 DNA、 0. 1 %SDS)に浸して 42°C15時間ハイブリダィズさせた 。 メンブレンを洗浄した後、 放射活性を検出し、 シグナルを生じる陽性のブラー クを選択し、 逐次希釈して二次および三次のスクリーニングを行ない、 2 個のシ ングルクローンを選択した。
クローニングしたファージ DNA について種々の制限酵素で切断してァガロース 電気泳動で分離し、 バンドのパターンが同じものは同一クローンとし、 同様のハ イブリダイゼーシヨンを繰り返して、 できるだけ小さいサイズの陽性バンドを与 えるように、 制限酵素で切断した。 選択した陽性 DNA 断片を、 pBluescripts KSI I ベクタ一に挿入し、 ジデォキシ法により塩基配列を決定した。 得られたマウス CXCR4 遺伝子の DNA配列を、 配列表の配列番号： 4に示す。 また、 配列表の配列 番号： 3に示される塩基配列と、 配列表の配列番号： 4に示される塩基配列から 、 最長のオープンリーディングフレームを含む塩基配列を見出し、 この塩基配列 を配列表の配列番号： 1に示す。 そして、 この配列表の配列番号： 1に示される 塩基配列を、 GenBank/EMBL/DDBJ DNA配列データベースに対して核酸ホモロジー 検索を行った。 この検索の結果、 得られたクローンは、 新規のマウスケモカイン レセプターをコードする DNA であることが明らかになり、 これをマウス CXCR4 と ΐ口'^ έした。 実施例 4 (マウス CXCR4 のアミノ酸配列のホモロジ一解析）
マウス CXCR4 の塩基配列に基づいて推定したアミノ酸配列 （配列表の配列番号 ： 1 7 ) は、 ケモカインレセプターに特徴的な 7つの膜貫通ドメインを含む三量 体 Gタンパク質結合型レセプタ一であると推定された。 そのアミノ酸配列を、 既 知の C X Cケモカインレセプターの配列と比較した （データベースとして GenBan k、 EMBし、 DDBJを用い、 BLAST にて解析した） 。 その結果、 ヒト CXCR4/fusin/HU MSTSR が最も類似しており （相同率 90%) 、 サル CXCR4 、 ゥシ CXCR4 とはそれぞ れ 89%、 86%の相同率であり、 ラッ ト IL-8RB、 ゥサギ IL- 8RA、 ゥサギ IL- 8RBとは それぞれ 49%、 47%, 45%の相同率であった。 実施例 5 (マウス CXCR4 ならびにヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR の発現）
( 1 ) マウス CXCR4、 ヒト CCCKR2B およびヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR 発現べクタ 一の作製
既報のヒトケモカインレセプターである CC CKR2Bの遺伝子ならびに CXCR4/fusi n/HUMSTSR の遺伝子をクローニングするために、 ヒト単球細胞株 THP- 1 の cDNAを 用いて以下のように PCR反応を行った。 THP- 1 細胞の cDNA 500ngを铸型として用 レ、、 配列表の配列番号： 1 1および配列番号： 1 2に示すプライマーをヒト CXCR 4/fusin/HUMSTSR の増幅のために、 そして、 配列表の配列番号： 9および配列表 の配列番号： 1 0に示すプライマーを CC CKR2Bの増幅のために、 それぞれ 500ng を用いた。 反応を行うための酵素としては Taq ポリメラ一ゼ （宝酒造社） を用い た。 反応を、 9 4 °C、 3分で 1サイクル行った後、 9 4 °〇で1分間、 5 5 °Cで 2 分間、 7 2 °Cで 3分間の条件で 3 5サイクル行い、 さらに 7 2 °Cで 3分間の反応 を行った。 この反応で得られたヒト CXCR4/f us i n/HUMSTSR および CC CKR2Bの遺伝 子断片を、 それぞれ pCRI KInvi trogen社） の TAクローニング部位へ組み込んだ。 このようにして得られたプラスミ ドを、 それぞれ PCRI ICXCR4および pCRUCC CKR2 B と命名した。 次に、 得られた PCRI ICXCR4および pCRI ICC CKR2B プラスミ ドを、 それぞれ Notlおよび Xbol (ともに宝酒造社） で消化した後、 pCAGGStkNeo の Not l /Xbol 部位に組み込んだ。 このようにして得られたプラスミ ドを、 それぞれ pCAN CXCR4 および pCANCC CKR2Bと命名した。
マウス CXCR4 の遺伝子をクローニングするために、 上記実施例 1の （3 ) 項で 得られた配列表の配列番号： 3で示されるマウス B前駆細胞株 DW34の一本鎖 cDNA を铸型に PCR法を行った。 cDNA lOOngを铸型として用い、 配列表の配列番号： 1 3および配列表の配列番号： 1 4に示すプライマーを用いた。 反応を行うための 酵素としては ExTaq (宝酒造社） を用いた。 反応を、 94°Cで 3分間、 1サイク ル行った後、 94°Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 72 °Cで 2分間の条件で 20サイ クル行い、 さらに 72 °Cで 5分間の反応を行った。 得られたマウス CXCR4遺伝子 断片を Notlと Xhol (宝酒造社) で消化した後、 CAGGStkNeoの Notl/Xbol 部位に 組み込んだ。 このようにして得られたプラスミ ドを、 pCANmPBSFRと命名した。
(2) CH0細胞でのマウス CXCR4、 ヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR、 ヒト CC CKR2Bの 発現
CH0細胞を直径 10cmの細胞培養のシャーレ一 （岩城硝子社） で、 37°C、 1 0 %炭酸ガス存在下で 1日培養した。 上記 （1)項で得た 3種のケモカインレセプ ターの発現ベクター（PCANmPBSFR、 pCANCXCR4および pCANCC CKR2B) の DNAそれ ぞれ 30 gを蒸留水 25 1 に溶解した後、 250mM塩化カルシウム （ナカライテス ク社） 500 ill を添加した。 DNAおよび塩化カルシウムの混合液に 2 xBBS溶液 (50mM BES(SIGMA).280m塩化ナトリウム （ナカライテスク社） 、 および 1.5mM リ ン酸水素ニナトリウム （ナカライテスク社） ） 500 n\ を添加した後、 室温で 2 5分間静置した。 このように調製した DNA溶液を CH0細胞を培養しているシヤー レーに滴下し、 35°C、 3%炭酸ガス存在下で 20時間培養し、 細胞に DNAを導 入した。 DNA導入した細胞を、 3ml の PBS (+)で 2回洗浄した後、 10mlの 10%溶液 FCS を含む - MEM(GIBC0社） を添加し、 37°C、 5 %炭酸ガス存在下で 1日培養 した。
次いで、 讓 FCSを含むひ- MEM(GIBC0社） 培地に 2mg/ml GENETICIN (和光純薬 工業社） を添加した培地に懸濁し、 5 X103 個 Zシャーレ一で直径 10cmの細胞培 養のシャーレ一 （岩城硝子社） に分注した。 37°C、 1 0%炭酸ガス存在下で培 養を続け、 GENETICIN耐性の細胞をマウス CXCR4、 ヒ hCXCR4/fusin/HUMSTSRお よび CKR2B発現 CH0細胞株として細胞内カルシウム濃度測定用に用いた。 以下 の実施例 6に示すように、 CC CKR2Bについては、 特異的リガンドである MCP- 1 の 添加による細胞内カルシゥム濃度上昇活性があつため、 レセブタ一の発現が確認 された。 また、 マウス CXCR4 とヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR の発現については、 CC CKR2Bと同じ細胞株を用レ、て同様の形質転換および培養を行つたことから、 同様 に発現していると考えられる。 実施例 6 (マウス CXCR4 の生物活性）
上記実施例 5の （2 ) 項で得たマウス CXCR4 ならびにヒトケモカインレセプタ ― (CXCR4/fusin/HU STSR および CC CKR2B ) が発現している CH0 細胞を、 ダル べッコ PBS (-)で洗浄した後、 HBSS緩衝液 (20mM Hepes. pH 7. 4 中に、 125m Nacl ，5raM KCl. lmM MgCl2, 0. 5ra グルコース、 および 0. 1 % BSAを含む） に 5 x iO6 個/ ml で懸濁し、 さらに fura- PE3AM ( テキサス フルォレツセンス ラボラトリ 一） を 2.5 Mになるように加え、 3 7 °Cで 3 0分間インキュベートした。 HBSS 緩衝液で洗浄した後、 各 C Cケモカインレセプター発現細胞を同緩衝液に 5 X 10 6 個/ ml で懸濁した。 得られたケモカインレセプタ一発現細胞懸濁液各 500 u l に、 ケモカイン （マウス PBSF/SDF-1またはヒト MCP-1)をそれぞれ ΙΟΟηΜ になるよ うに加えたときの蛍光度の変化を、 蛍光分光光度計 (LS50B . PERKIN ELMER) を用 いて、 励起波長 340nm と 380mn,蛍光波長 510nm,レスポンス 0. 5 秒で測定した。 そ の結果を、 時間経過と 340nm と 380nm との蛍光強度の比で図 3〜図 6に示す。 マウス PBSF/SDF-1刺激では、 マウス CXCR4 及びヒ h CXCR4/fusin/HUMSTSR 発現 細胞で蛍光強度の比の上昇が認められ、 C Cケモカインレセプターである CC CKR 2B発現細胞では蛍光強度の比の上昇は認められなかった。 なお、 レセプターに対 する陽性コントロールである MCP-1 ペプチドによる刺激では、 CC CKR2B発現細胞 で蛍光強度の比の上昇が認められた。 したがって、 マウス PBSF/SDF-1は、 本発明 のマウス CXCR4 およびヒト CXCR4/fusin/HUMSTSR 発現 CHO 細胞に対して、 特異的 に細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有することがわかった。 また 図 7に示すようにマウス CXCR4 発現細胞では、 マウス PBSF/SDF- 1の連続しての添 加により蛍光強度の比が変化しない脱感作が認められた。 脱感作は陰性コントロ ールであるヒト MCP-1 の添加では認められなかった。 この結果より、 本発明のレ セプターは、 マウス PBSF/SDF-1のレセプターである事が明らかとなった。 実施例 7 材料と方法
細胞株：マウス NIH3T3細胞、 ヒト小腸上皮由来の SW480 細胞、 ヒトグリァ細 胞由来の U87MG は、 1 0 % FCSを含む DMEMで培養した。 ヒト HeLaS3 細胞は 10% FCSを含む RPMI1640 で培養した。 ヒト骨芽細胞由来の H0S細胞は 1%不必須ァミ ノ酸 （ Gibco社 ）と 10% FCS を含む Eagle MEMで培養した。 ウィルス： HIV- 1の NL432株は、 足立教授 （徳島大学） より供与された。 I I IB 株は、 原田教授 （熊本大学） より供与された。 SF162株は、 J. A . Levy教授 （力 リフォルニァ、 サンフランシスコ大学） より供与された。 HIV-1のキメラウィル スクローン、 NL432env-162 と Nし 432V3- 162は、 井阪 （塩野義製薬） より供与さ れた。 遺伝子組み換えワクシニアウィルス、 Va Env ( NL432 env) 、 Vac. Env 162 (SF162 env ) 、 Vac T4 ( CD4) は、 塩田教授 （東京大学） より供与された 。 L0-T7 (T7 polymerase ) は、 M. Kohara (都立臨床研） より供与された。 細胞へのトランスフエクション ： NIH3T3 細胞を 1ゥヱルあたり 5xl04 細胞の 細胞密度で 24ゥヱルプレートでー晚培養し、 pofectamine (Gibco 社） を用い て pBluescriptに組み込んだケモカイン受容体遺伝子をトランスフエクトした。 トランスフ クト開始後 4 時間目に細胞を PBSで洗浄し、 培養液を添加した後 37 でで一晩培養して融合アツセィに使用した。 SW480 細胞と H0S 細胞は、 5xl05 細 胞の細胞密度で 6センチメートルプレートでー晚培養した。 SW480 細胞には pEF -BOSに組み込んだ受容体遺伝子を 5^g、 CD4 を発現するベクターである T4-Ne 0 を 7.5〃 g、 LTR (EcoRV)- S- Gal-Neoを 2.5 zgのプラスミ ド混合物を改良 型リン酸カルシウム法によりトランスフヱクトした。 ヒト CD4 と LTR-Galを恒常 的に発現する H0S細胞には、 同じ方法で pEF-BOS に組み込んだ受容体遺伝子を 15 U Sトランスフエクトした。 細胞は 3 C02存在下で 35°C—晩培養し、 PBS (-) で 洗浄後に 0.5 mM EDTA を含む PBS を用いて回収した後、 12ゥヱルプレートにまい て 37°Cで一晩培養して感染アツセィに用いた。 細胞融合アツセィ ：細胞融合を定量化するために我々は、 yS-galactosidase ( /8-gal) のひ- complementationを利用した改良型細胞融合アツセィを使用した （ 志田等、 論文作成中） 。
；8-8&1のひ-31]1)1]11 と61^蛋白質は、 遺伝子組み換えワクシニアウィルスによ りエフェクター細胞である HeLaS3細胞 （ 24 ゥエルプレート、 lxlO5 細胞 /ゥ エル ） に導入した。
ヒト CD4、 の co-subimit、 T7 RNA polymerase は、 遺伝子組み換えワク シニアウィルスにより夕一ゲット細胞である NIH3T3細胞 （ 24 ゥヱルプレート 5 xlO4細胞 /ゥエル ）に導入し、 ケモカイン受容体は Lipofectamine を用いて夕一 ゲット細胞にトランスフエク卜した。 トランスフエクト後 16時間目に、 エフヱク ター細胞とターゲット細胞を 0.5 mM CaCl2を含む PBSで洗浄し、 ワクシニアウイ ルスにより引き起こされる非特異的な細胞融合を抑制するために抗ヮクシニアゥ ィルス抗体である 2D5 で処理した。 エフヱクタ一細胞を 3 mM CaCl2を含む Hanks の緩衝液 （PH7.6)に懸濁し、 24ゥエルプレート中でターゲット細胞に重層した後 、 融合を開始するために 1,300 rpmで 5分間遠心した。
遠心後に細胞を 5 C02存在下で 37 °C12時間培養した。 細胞融合が起きた場合 、 融合細胞の細胞質に拿まれる ^- galのひ- subunitと ω-subun が会合し、 ひ- c omplementationにより活性型S-gal酵素になるので、 培養液を除いた後に、 ^-g alの基質である chlorophenolred - b - D - galactopyranos ide ( Boehringer Mannhei m ) を 8 M と、 45 m 2- メルカプトエタノール、 1 mM MgCl 2 、 100 mM Hepes pH8. 0、 0. 5% NP40、 DNAse I 0. 1 mg /mlを含む溶液を 1ゥエルにつき 200 1 添加し、 37 °Cで 30分間反応後、 反応を停止するために 2 SDS を 1ゥエルにつ き 200 1添加した。 反応液中の -gal活性を定量するため波長 590nm における 吸光度を測定した。 感染アツセィ ： ヒト CD4 と受容体を発現するヒト SW480或いは H0S細胞を 12 ゥエルプレートで培養した。 各ゥエルに、 HIV- 1ウィルスを含む培養液 （revers e transcri ptase(RT) 活性は、 SF162が 2χ10β RT/ mし、 NL432envl 62、 NL432V 3-162、 Ι ΠΒが 5χ10β RT/ m L NL432が 3xl06 RT/m L ) を添加し、 5% C02存 在下、 37°Cで 2時間培養した後、 1ゥエルあたり 2. 5 mlの培養液を添加した。 感 染後 4日目に Reporter lys is buffer ( Proraega ) を 1ゥヱルあたり 400 1 添 加し、 -80 °Cで凍結後に融解した。 融解したサンプルをエツペンドルフチューブ へ移し、 4 °C、 5分間 12, 000 rpmで遠心した後、 上清に含まれる y8 -gal活性を 発光^ - gal検出キット （Clontech社） で測定した。
まず第一に、 我々は、 マウス CXCR4が HIV-1の envを介した膜融合を支持する かどうかを検討するために、 env 蛋白質を発現するエフェクター紬胞 （HeLaS3細 胞） とヒト CD4と受容体を発現するタ一ゲット細胞 （NIH3T3細胞） との融合によ り の活性化が起こるアツセィシステムを用いて実験した。 このアツセィで は、 ェフエクタ一細胞である HeLaS3細胞には遺伝子組み換えワクシニアウィルス を感染させて /S -Galの - subimi tと HIV-1 の env蛋白質を発現させ、 ターゲット 細胞である NIH3T3細胞には遺伝子組み換えワクシニアウィルスを感染させて、 S -Galの o)-subuni t、 T7 polymerase、 ヒト CD4を発現させた。 ウィルス感染後 に NIH3T3細胞には更にヒト CXCR4、 ヒト CCR5或いは、 マウス CXCR4を含むブラ スミ ドをトランスフエクトした。 一晚培養後に、 エフェクター細胞と夕一ゲット 細胞を混合して培養した。 細胞融合が起こると、 融合細胞の細胞質に含まれる - Galの α-subunitと ω-subunitが会合し、 S -Galが活性化する。 図 8に示すよう に、 T細胞株指向性 HIV-1である NL432由来の env蛋白質を発現する HeLaS3細胞 はヒト CXCR4 とヒト CD4を発現する NIH 3T3細胞とは融合するが、 ヒト CCR5とヒ ト CD4を発現する NIH 3T3細胞とは融合しなかった。
驚いた事に、 NL432 由来の env 蛋白質を発現する HeLaS3細胞はマウス CXCR4と ヒト CD4を発現する細胞にも同様に融合した。 単球指向性 HIV-1である SF162由 来の env蛋白質を発現する HeLaS3細胞はヒト CCR5 とヒト CD4を発現する NIH 3T 3細胞とは融合するが、 ヒト或いはマウス CXCR4 とヒト CD4を発現する NIH 3T3 細胞とは融合しなかった。
第二に我々は、 マウス CXCR4を発現した細胞にウィルスが感染するかを検討し た。 ヒト CXCR4と CD4を発現したマウス細胞では NIH3T3細胞も含め HIV-1 の複製 効率が低いので、 ヒト小腸上皮細胞由来の SW480細胞、 骨芽細胞由来の H0S細胞 、 グリア細胞由来の U87MG細胞の 3種のヒト紬胞株をウィルス感染のターゲット 細胞として使用した。 それらの細胞には HIV-1 の LTR をプロモータ一として持つ レポーター遺伝子 （lacZ) をトランスフエクトした。 ウィルスが細胞に感染する と、 HIV-1由来の転写活性化因子である Tat 蛋白が発現され、 LTR に作用して la cZの発現を誘導する。 それらの細胞に、 更にヒト CD4とケ乇カイン受容体をトラ ンスフヱクトした後に、 T細胞株指向性ウィルス株 （NU32、 I I IB) 或いは、 単 球指向性ウィルス株 （SF162 ) を感染させた。 図 9に示すように、 NL432 と Ι ΠΒ はマウス CXCR4 とヒト CD4 を発現する SW480 にもヒト CXCR4とヒト CD4 を発現す る SW480 にも同様に感染した。 この結果は、 上記の融合アツセィの結果と一致す るものであった。 しかし、 ヒト CCR2bや CCR5を CXCR4の代わりに発現した場合は それらのウィルスは感染しなかった。 一方 SF162 は、 ヒト CCR5 とヒト CD4 を発現する SW480 には感染したが、 マウ ス CXCR4 とヒト CD4 を発現する細胞ゃヒト CXCR4とヒト CD4 を発現する細胞には 感染しなかった。 また、 H0S 細胞や U87MG 細胞を SW480 細胞の代わりに用いても 同様の結果であった （図 1 0と図 1 1 ) 。 すなわち、 マウス CXCR4は、 T細胞株 指向性 HIV-1 のターゲッ ト細胞へのエントリーを支持する事、 そして、 ヒト細胞 におけるプロウィルスの DNAの合成、 ゲノム DNA への組み込み、 ウィルスの発現 に影響しない事が示唆された。
ところで、 ヒト CXCR4を介する HIV-1のエントリは、 env蛋白の V3ループに対 する単クローン抗体によって阻害されることが明らかとなっている。 そこで、 我 々はマウス CXCR4の機能がヒト CXCR4と同様であることを確認するために、 （T 細胞株指向性ウィルス株の） env 蛋白 （gpl20)の V3 ループがマウス CXCR4を介 する HIV-1エントリにも必要であるかを検討した。 そのために、 ヒト CD4 とケモ 力イン受容体を発現する SW480 細胞に、 NL432 と SF162 のキメラウィルスのクロ ーンである NL432env-162或いは NL432V3-162 を感染させた。 図 1 2に示すように 、 NL432env-162 はで細胞株指向性ウィルス株 NL432 の env 領域を単球指向性 H IV-1である SF162 のものに置換したプロウィルスクローンであり、 NL432V3-162 は、 NL432 の env の V3ループを SF162 のものに置換したプロウィルスクローンで ある。 NL432はマウス CXCR4とヒト CD4を発現する SW480 に感染したが、 NL432e nv-162及び NL432V3-162はそれらの細胞に感染しなかった （図 1 3 )。
—方、 NL432env-162と NL432V3-162 は、 ヒト CCR5とヒト CD4を発現する SW480 細胞には感染した （図 1 3 ) 。 これらの結果から、 NL432 の env の V3ループがマ ウス CXCR4 でもヒト CXCR4 の場合と同様にウィルスのエントリ一に必要であるこ とが明らかになった。 論
以上の研究より、 マウス CXCR4 がで 細胞株指向性 HIV-1 の env を介する細胞 膜融合と T細胞株指向性 HIV-1 の感染を支持する事が明らかとなった。 これらの 結果はマウス CXCR4が HIV- 1 の感染に対する種特異的な障壁ではないことを示唆 するものである。 これまでの研究で、 ヒト CD4を NIH3T3 や T細胞クローン 3DT などのマウスのリンパ球或いは非リンパ球細胞株に発現しても、 HIV- 1は吸着は 起こるがェントリは起こらない事が明らかとなっていた。 この結果の解釈の 1つ は、 ヒト CD4を発現させたマウス細胞表面に CXCR4 が発現していないというもの である。 実際、 マウス PBSF/SDF- 1 刺激は、 NIH3T3細胞の細胞内カルシウム濃 度の変化を誘導しない。 しかし、 マウス CXCR4は、 CD4 と CD8 が共に陽性の胸腺 細胞や、 CD4或いは CD8 のいずれかが陽性の胸腺細胞には発現している。 従って 、 実験に用いられた 3DT細胞が CXCR4 を発現しているかどうかを決定することが (上記の解釈が正しいかを検証する上で） 重要である。
最近の研究で単球指向性 HIV- 1 の受容体であるヒト CCR5のマウス相同体 （マウ ス CCR5) は HIV-1 のエントリーを支持しない事が明らかとなった。 この結果は単 球指向性 HIV-1 に対する受容体と T細胞株指向性 HIV-1 に対する受容体とで種特 異性が異なることを示唆している。 この差異は、 CCR5を含む他のケモカイン受容 体と比較して CXCR4 は種間でァミノ酸配列が高度に保存されている事が原因であ るかもしれない。 マウス CXCR4のアミノ酸配列はヒト CXCR4と 90%—致している が、 CCR5や CXCR2では、 マウスとヒトでそれぞれ 82%、 71¾ しか一致していない 。 CXCR4 の種間における高度な保存は、 CCR5のリガンドである MIP-1 ひ， MIP- β , RANTES など他のケモカインと比較すると、 CXCR4 のリガンドである PBSF/SDF- 1 はユニークな機能を持つという事実を反映している。 PBSF/SDF- 1 以外のケモカ ィンは炎症における白血球の遊走に関与していると考えられているのに対し、 PB SF/SDF-1は、 造血や心臓形成など生体発生に必須な機能を持っている。
これまでの研究と、 ヒト CD4とケモカイン受容体を発現したマウス細胞株 NIH 3T3 は HIV-1 エントリを支持するものの、 ヒトの細胞と比較してウィルス粒子の 産生効率が低いという事実から、 マウス細胞には HIV-1 の複製に必要な細胞内分 子が欠損していると考えられる。 しかし、 種特異的な障壁の原因となる分子のヒ ト遺伝子を導入したトランスジヱニックマウスを作製することによって HIV-1感 染のモデルマウスを開発できるであろう。 我々の結果は、 ヒト CXCR4遺伝子を HI V - 1 感染のモデルマウスに導入する必要はない事を明らかにした。 また CXCR4 の 生理的な発現の方が AIDS発症に至る単球指向性 HIV-1から T細胞株指向性 HIV- 1 への移行の開始や進行を研究するのに適しているので、 HIV-1感染の全過程をシ ユミレ一トするための動物モデルを開発する上で有益な情報を提供した。 産業上の利用可能性
本発明により、 A I D Sの治療薬及び H I V - 1の感染の作用機序等の研究に 有用な、 新規なマウス C X Cケモカインレセプター遺伝子、 該遺伝子にコードさ れるポリペプチド、 該ボリペプチドの発現ベクター、 該発現ベクターを導入した 形質転換体、 前記ポリペプチドに対する単クローン抗体、 さらには前記形質転換 体を用いる前記ポリペプチドの生産方法、 さらには、 前記レセプターのァゴニス ト又はアンタゴニストのスクリーニング方法、 及び H I V - 1感染阻害剤のスク リーニング方法の提供が可能となつた。
CO
Figure imgf000041_0001
謹 vj.001v一 - MetGlyTyrGlnLysし ysLeuArgSerMetThrAspし ysTyrArgLeu 65 70 75 80
CACCTGTCAGTGGCTGACCTCCTCTTTGTCATCACACTCCCCTTCTGG 407 HisLeuSerValAlaAspLeuLeuPheVal l leThrLeuProPheTrp
85 90 95
GCAGTTGATGCCATGGCTGACTGGTACTTTGGGAAATTTTTGTGTAAG 455 AlaValAspAla etAlaAspTrpTyrPheGlyLysPheLeuCysLys
100 105 110
GCTGTCCATATCATCTACACTGTCAACCTCTACAGCAGCGTTCTCATC 503 AlaValHisI lel leTyrThrValAsnLeuTyrSerSerValLeuI le
115 120 125
CTGGCCTTCATCAGCCTGGACCGGTACCTCGCCATTGTCCACGCCACC 551 LeuAlaPhel leSerLeuAspArgTyrLeuAlal leValHisAlaThr
130 135 140
AACAGTCAAAGGCCAAGGAAACTGCTGGCTGAAAAGGCAGTCTATGTG 599 AsnSerGlnArgProArgLysし euし euAlaGluし ysAlaValTyrVal 145 150 155 160
GGCGTCTGGATCCCAGCCCTCCTCCTGACTATACCTGACTTCATCTTT 647 GlyValTrpI leProAlaLeuLeuLeuThrl leProAspPhel lePhe
165 170 175
GCCGACGTCAGCCAGGGGGACATCAGTCAGGGGGATGACAGGTACATC 697 AlaAspValSerGlnGlyAspI leSerGlnGlyAspAspArgTyrl le
180 185 190
TGTGACCGCCTTTACCCCGATAGCCTGTGGATGGTGGTGTTTCAATTC 743 CysAspArgLeuTyrProAspSerLeuTrpMetValValPheGlnPhe 195 200 205 一 4 o 一 CAGCATATAATGGTGGGTCTCATCCTGCCCGGCATCGTCATCCTCTCC 791 GlnHisI leMetValGlyLeuI leLeuProGlyl leVal I leLeuSer
210 215 220
TGTTACTGCATCATCATCTCTAAGCTGTCACACTCCAAGGGCCACCAG 839 CysTyrCysI lel lel leSerLysLeuSerHisSerLysGlyHisGln 225 230 235 240
AAGCGCAAGGCCCTCAAGACGACAGTCATCCTCATCCTAGCTTTCTTT 887 LysArgし ysAlaLeuLysThrThrVal I leLeuI leLeuAlaPhePhe
245 250 255
GCCTGCTGGCTGCCATATTATGTGGGGATCAGCATCGACTCCTTCATC 935 AlaCysTrpLeuProTyrTyrValGlyl leSerl leAspSerPhel le
260 265 270
CTTTTGGGAGTCATCAAGCAAGGATGTGACTTCGAGAGCATTGTGCAC 983 LeuLeuGlyVal l leLysGlnGlyCysAspPheGluSerl leValHis
275 280 285
AAGTGGATCTCCATCACAGAGGCCCTCGCCTTCTTCCACTGTTGCCTG 1031 LysTrpI leSerl leThrGluAlaLeuAlaPhePheHisCysCysLeu
290 295 300
AACCCCATCCTCTATGCCTTCCTCGGGGCCAAGTTCAAAAGCTCTGCC 1079 AsnProI leLeuTyrAlaPheし euGlyAlaLysPheし ysSerSerAla 305 310 315 320
CAGCATGCACTCAACTCCATGAGCAGAGGCTCCAGCCTCAAGATCCTT 1127 GlnHisAlaLeuAsnSerMetSerArgGlySerSerLeuLysI leLeu
325 330 335
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配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー 直鎖状
配列の種類 他の核酸 （合成 D NA)
配列の特徴 1 3、 1 5 (イノシン）
配列：
CTSMGTTTGK CMNTNKCYGA 20 配列番号： 6
配列の長さ ： 2 6
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D NA) 配列の特徴： 8、 9、 1 7 (イノシン）
配列：
TAGAKSANNG GRTTSANRCA RCAGTG 26 配列番号： 7
配列の長さ ： 2 5
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列：
TCATCCCCCT GACTGATGTC CCCCT 25 配列番号： 8
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27 配列番号： 9
配列の長さ ： 3 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D NA)
配列：
CGCGTCGACC ACAACATGCT GTCCACATCA 30 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 3 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D NA)
配列：
CGCTCTAGAT TATAAACCAG CCGAGACTTC 30 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 2 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D NA)
配列：
CGCGTCGACC TTACCATGGA GGGGATCAG 29 配列番号： 1 2
配列の長さ ： 3 2
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D NA)
配列：
CGCGCGGCCG CTTAGCTGGA GTGAAAACTT GA 32 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D NA)
配列：
TAGCGGCCGC GTTGCCATGG AACCGAT 27 配列番号： 1 4
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D NA)
配列：
GCGTCGACTA AGGGTTAGCT GGAGTGA 27 配列番号： 1 5
配列の長さ ： 2 0 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
CTGCACCTGT CAGTGGCTGA 20 配列番号： 1 6
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
TAGATGAGGG GGATTGAGAC AACAGTG 27 配列番号： 1 7
配列の長さ ： 359
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：マウス
配列：
MetGluProIleSerValSerlleTyrThrSerAspAsnTyrSerGlu
1 5 10 15
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Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列表の配列番号： 1 7に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなるポ リペプチド、 又は該ポリペプチドを含むポリペプチドであって、 マウス PBSF/SDF -1と結合可能なレセプター活性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA。
2. 配列表の配列番号： 1 7に記載のァミノ酸配列の全部又は一部のァミノ酸 配列において、 1以上のアミノ酸残基の欠失、 付加、 挿入又は置換の少なくとも 一つが生じ、 かつマウス PBSF/SDF- 1と結合可能なレセプ夕一活性を有するポリべ プチドをコードする DNA。
3. 配列表の配列番号： 1に記載の塩基配列の全部又は一部からなる DNA、 又は該 DN Aを含む DN Aであって、 マウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプ夕一 活性を有するボリべプチドをコ一ドする DNA。
4. 配列表の配列番号： 1に記載の塩基配列の全部又は一部の DNA、 又は該 DNAを含む DNAであって、 1以上の塩基の欠失、 付加、 挿入又は置換の少な くとも一つが生じ、 マウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプター活性を有するポリ ぺプチドをコ一ドする DNA。
5. 請求項 1〜4いずれか記載の DNAとストリンジ ン卜な条件下でハイブ リダイズする DNAであって、 マウス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプ夕一活性を 有するポリべプチドをコ一ドする DNA。
6. 請求項 1〜 5レ、ずれか記載の D N Aによりコードされるポリぺプチドであ つて、 マウス PBSF/SDF- 1と結合可能なレセプター活性を有するポリべプチド。
7 . 配列表の配列番号： 1 7に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなるポ リペプチド、 又は該ボリペプチドを含むポリペプチドであって、 マウス PBSF/SDF - 1と結合可能なレセプター活性を有するポリぺプチド。
8 . 配列表の配列番号： 1 7に記載のァミノ酸配列の全部又は一部のァミノ酸 配列において、 1以上のァミノ酸残基の欠失、 付加、 揷入又は置換の少なくとも 一^ 3が生じ、 かつマゥス PBSF/SDF-1と結合可能なレセプ夕一活性を有するポリぺ プチド。
9 . マウス B前駆細胞株 DW 3 4に由来する、 請求項 6〜 8いずれか記載のポ リペプチド。
1 0 . 請求項 1〜5いずれか記載の D N Aを含む発現ベクター。
1 1 . 請求項 1 0記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
1 2 . 宿主が哺乳類細胞株である請求項 1 1記載の形質転換体。
1 3 . 請求項 1 1又は 1 2記載の形質転換体を、 請求項 1 0記載の発現べク夕 一の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、 マウス PBSF/SDF- 1と結合可 能なレセプター活性を有するポリぺプチドの生産方法。
1 4 . 請求項 6〜 9いずれか記載のポリペプチドに対する単クローン抗体。
1 5 . マウス PBSF/SDF-1を含有し、 A I D S発症阻害剤又は H I V - 1感染阻 害剤として用いられる医薬組成物。
1 6. 請求項 6〜9いずれか記載のポリペプチド及びヒト CD4タンパク質を 発現する細胞。
1 7. (a)請求項 6〜 9いずれか記載のポリペプチドを発現する細胞又は請 求項 1 6記載の細胞； ヒト T細胞株指向性 H I V- 1 ；及びスクリ一ニングの対 象となる物質を混合してインキュベートを行う工程、 及び
(b) 該細胞における HIV-1の局在性を分析する工程、
を含んでなることを特徴とする、 A I DS発症阻害剤又は H IV- 1感染阻害剤 をスクリーニングする方法。
1 8. HIV-1の局在性を分析する工程を、 ヒト T細胞株指向性 H I V - 1に対 するモノクローナル抗体を用いて行う、 請求項 1 7記載の方法。
1 9. (a)請求項 6〜 9いずれか記載のボリペプチドを発現する細胞又は請 求項 1 6記載の細胞； HI V— 1エンベロープタンパク質を発現する細胞；及び スクリーニングの対象となる物質を混合してィンキュベートを行う工程、 及び
(b) H IV- 1エンベロープタンパク質を発現する細胞と該細胞との融合性を 測定する工程、
を含んでなることを特徴とする、 A I DS発症阻害剤又は H IV- 1感染阻害剤 をスクリーニングする方法。
20. (a)請求項 6〜 9いずれか記載のポリペプチドを発現する細胞又は請 求項 1 6記載の細胞； マウス又はヒト PBSF/SDF- 1；及びスクリーニングの対象と なる物質を混合してインキュベートを行う工程、 及び (b)該細胞内のカルシウムイオン濃度を測定する、 及び 又は発現したポリべ プチドと該マウス又はヒト PBSF/SDF-1との結合活性を測定することを特徴とする 、 A IDS発症阻害剤若しくは H IV— 1感染阻害剤、 又は該 PBSF/SDF-1のァゴ ニスト若しくはアンタゴニストをスクリ一ニングする方法。
21. 該アンタゴニストが造血幹細胞遊離促進剤である請求項 20記載の方法
22. 請求項 6〜 9いずれか記載のポリぺプチドを発現する細胞又は請求項 1 6記載の細胞を含む、 A I DS発症又は H I V- 1感染を検出するためのキット
23. (a)請求項 6〜 9いずれか記載のポリペプチドを発現する細胞又は請 求項 1 6記載の細胞、 及び H I V— 1に感染していることが疑われる患者の血清 、 血球又は血液を混合してインキュベートを行う工程、 及び
(b)該紬胞における HIV- 1の局在性を分析する、 又は H IV— 1感染細胞と該 細胞との融合性を測定する工程、
を含んでなることを特徴とする、 A I DS発症又は H I V— 1感染を検出する方
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