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WO1998037913A1 - Inhibiteurs d'activation de lymphocytes - Google Patents

Inhibiteurs d'activation de lymphocytes Download PDF

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Publication number
WO1998037913A1
WO1998037913A1 PCT/JP1998/000831 JP9800831W WO9837913A1 WO 1998037913 A1 WO1998037913 A1 WO 1998037913A1 JP 9800831 W JP9800831 W JP 9800831W WO 9837913 A1 WO9837913 A1 WO 9837913A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
cells
human
cell
manufactured
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/000831
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuo Koishihara
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to AU61181/98A priority Critical patent/AU718463B2/en
Priority to CA002282631A priority patent/CA2282631A1/en
Priority to KR10-1999-7007801A priority patent/KR100370744B1/ko
Priority to EP98905703A priority patent/EP0972524A4/en
Publication of WO1998037913A1 publication Critical patent/WO1998037913A1/ja

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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a novel lymphocyte activation inhibitor.
  • infectious microorganisms such as viruses, bacteria, molds, and parasites
  • infectious microorganisms such as viruses, bacteria, molds, and parasites
  • Lymphocyte cells are mainly responsible for immunity in living organisms. Lymphocyte cells are roughly classified into T lymphocyte cells (T cells) and B lymphocyte cells (B cells) according to their functions. T cells are considered to have antigen-presenting ability and cytotoxicity, and B cells are considered to have antibody-producing ability. These two types of lymphocytes are all derived from the same blood stem cells and are released into the peripheral blood after repeated differentiation in the bone marrow or other organs or by the action of growth factors. .
  • hematopoietic stem cells differentiate into pre-T cells in the bone marrow, then migrate to the thymus, and further repeat differentiation to become mature T cells. After that, it is activated by the stimulation of the antigen, and becomes an activated T cell having a proliferative ability or cytotoxicity.
  • B cells hematopoietic stem cells in the bone marrow undergo pro-B cells and pre-B cells by stimulating site cytokines such as I-1, IL-2, IL-4, and IL-6. Differentiates into mature B cells and receives additional antigen stimulation And finally become plasma cells capable of producing antibodies. Therefore, final activation is essential for the lymphocyte to exert its function.
  • immunity is intended to protect the living body from foreign foreign substances, so a mechanism that recognizes foreign substances (non-self) and self by a sophisticated mechanism, and reacts with only non-self as an antigen It has become.
  • an autoimmune disease occurs when this mechanism breaks down for some reason and the self is recognized as an antigen.
  • a condition in which an immune response to non-self occurs excessively or in an inappropriate manner, resulting in tissue damage is called allergy.
  • lymphocyte activation Numerous experiments and studies are elucidating the pathway from lymphocyte activation to the disease caused by it, and a number of therapeutic agents for diseases involving lymphocyte activation are being developed.
  • non-steroids such as aspirin are used for rheumatoid arthritis, systemic erythematosus, and scleroderma.
  • Anti-inflammatory drugs ⁇ Steroids, immunosuppressants such as azathioprine have been used.
  • cyclosporin azathioprine, mizoribine, etc. are mainly used for kidney transplantation and bone marrow transplantation.
  • Immunosuppressants have been used.
  • antiallergic drugs antihistamine drugs, chemical mediator release inhibitors that suppress release of chemical substances that cause allergies, and the like are used.
  • non-steroid anti-inflammatory drugs such as ⁇ steroids, anti-histamine drugs, and chemical mediator release inhibitors are all active against the activation of lymphocytes, which cause this disease. Does not act at all and is merely a symptomatic treatment that suppresses inflammation, so it does not fundamentally treat this disease
  • anti-HM1.24 antibody a monoclonal ⁇ -nal antibody obtained by immunizing mice with human myeloma cells (Blood (1994)). 84, 1922-1930).
  • anti-HM1.24 antibody When anti-HM1.24 antibody was administered to mice transplanted with human myeloma cells, this antibody specifically accumulated in tumor tissues (Kosaka, Masaaki et al., Japanese Clinical (1995) 53, 627-635). It has been suggested that the anti-HM1.24 antibody can be applied to the diagnosis of tumor localization by radioisotope labeling and missile therapy such as radioimmunotherapy. However, it was not known that the anti-HM1.24 antibody was involved in suppressing the activation of lymphocytes.
  • an object of the present invention is to provide a lymphocyte activation inhibitor. It is to provide.
  • the present inventors analyzed FCM (flow cytometry) using an anti-HM1.24 antibody (Goto, T. et al. Blood (1994) 84.1922-1930).
  • FCM flow cytometry
  • anti-HM1.24 antibody Goto, T. et al. Blood (1994) 84.1922-1930.
  • the present invention provides a lymphocyte activation inhibitor comprising, as an active ingredient, an antibody that specifically binds to a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a T cell or B cell activation inhibitor comprising, as an active ingredient, an antibody that specifically binds to a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. .
  • the present invention also provides a lymphocyte activation inhibitor comprising, as an active ingredient, a monoclonal antibody that specifically binds to a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. I do.
  • the present invention also relates to activation of a lymphocyte, which comprises, as an active ingredient, an antibody having a human antibody constant region, which specifically binds to a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Provide an inhibitor.
  • the present invention also provides a lymphocyte activation inhibitor comprising an anti-HM1.24 antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a lymphocyte activation inhibitor containing a chimeric antibody or a humanized antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a lymphocyte activation inhibitor comprising, as an active ingredient, a chimeric anti-HM1.24 antibody or a humanized anti-HM1.24 antibody.
  • the present invention also provides a lymphocyte activation inhibitor comprising, as an active ingredient, an antibody that specifically binds to an epitope recognized by an anti-HM1.24 antibody.
  • the present invention also provides a preventive / therapeutic agent for a lymphocyte activation-related disease, which comprises, as an active ingredient, an antibody that specifically binds to a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. provide.
  • the present invention relates to a self-immune disease, a rejection reaction at the time of transplantation of an organ or the like, which contains, as an active ingredient, an antibody that specifically binds to a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a self-immune disease a rejection reaction at the time of transplantation of an organ or the like, which contains, as an active ingredient, an antibody that specifically binds to a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 Provide allergy prevention and treatment agents.
  • FIG. 1 shows that anti-HM1.24 antibody suppresses antibody production from B cells upon SAC stimulation.
  • FIG. 2 shows a histogram obtained by FCM analysis of PHA-stimulated T cells using an anti-HM1.24 antibody.
  • FIG. 3 shows a histogram when activated T cells were subjected to FCM analysis with an anti-HM1.24 antibody.
  • FIG. 4 shows that anti-HM1.24 antibody suppresses the T cell blastogenesis response induced by PHA.
  • the hybridoma producing the antibody used in the present invention can be basically produced as follows using a known technique. That is, use HM1.24 antigen protein or cells expressing HM1.24 antigen as sensitizing antigen This is then immunized according to a conventional immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a conventional cell fusion method, and a monoclonal antibody is produced by a normal screening method. It can be produced by screening cells.
  • a monoclonal antibody may be prepared as follows.
  • HM1.24 antigen-expressing cells which are sensitizing antigens for obtaining antibodies, include human multiple myeloma cell lines KP ⁇ 2 (Japanese Patent Laid-Open No. 7-236475) and KPC-32 (Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400) can be used.
  • the sensitizing antigen a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a peptide or polypeptide containing an epitope recognized by the anti-HM1.24 antibody can be used.
  • the cDNA encoding the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 used as the sensitizing antigen was inserted between the Xbal cleavage sites of the pUC19 vector, and the plasmid pRS38- Prepared as pUC19.
  • Escherichia coHDH5 (pRS38-pUC19) has been internationally deposited under the Budapest Agreement under the accession number FERM BP-4434 (see JP-A-7-196694).
  • a peptide or polypeptide containing an epitope recognized by the anti-HM1.24 antibody can be prepared by a genetic engineering technique.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Rodents such as mice, rats, and hamsters are used. Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method. For example, as a general method, the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal. Specifically, sensitizing antigen
  • the animals Dilute and suspend in a suitable amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, etc., and mix a normal adjuvant, such as Freund's complete adjuvant, if necessary, emulsify and suspend
  • a normal adjuvant such as Freund's complete adjuvant
  • the animals are dosed several times every 4-21 days.
  • an appropriate carrier can be used at the time of immunization with a sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells to be subjected to cell fusion include spleen cells in particular.
  • Mammalian myeloma cells as the other parent cells fused with the immune cells are already known in various cell lines, for example, P3X63Ag8.653 (J. Immnol. (1979) 123 : 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS -1 (Kohler.G. And Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 : 5 11-519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8: 405-415), SP2 / 0 (Shulman. M.
  • the cell fusion of the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein,
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter.
  • fusion promoters include
  • Polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like can be used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added to increase the fusion efficiency.
  • the ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is, for example, preferably 1 to 10 times the number of the immune cells to the myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, an RPMI 1640 culture medium, a MEM culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, and other ordinary culture mediums used for this kind of cell culture are used. It is possible, and serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the immunocyte and the myeloma cell are mixed well in the culture solution, and a PEG solution preliminarily heated to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is used.
  • a PEG solution is added at a concentration of 30 to 60% (w / v) and mixed to form a desired fused cell (hybridoma).
  • a cell fusion agent or the like that is unfavorable for the growth of the hybridoma can be removed.
  • the hybridoma is selected by culturing it in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture solution is continued for a time sufficient for cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die, usually for several days to several weeks. Next, a conventional limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of the hybridoma producing the desired antibody are performed.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture solution is continued for a time sufficient for cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die, usually for several days to several weeks.
  • a conventional limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of the hybridoma producing the desired antibody
  • a human lymphocyte is used to inject ⁇ 1.24 antigen or HM1.24 antigen in the mouth.
  • Sensitized with the expressing cells the sensitized lymphocytes are fused with a human myeloma cell, for example, U266, and a desired human antibody having a binding activity to HM1.24 antigen or HM1.24 antigen expressing cells Can also be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • a transgenic animal having all the repertoires of the human antibody gene is administered with the HM1.24 antigen or HML24 antigen-expressing cell serving as an antigen, and the desired human antibody is prepared according to the method described above.
  • WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602, WO94 / 25585, WO96 / 34096, WO96 / 33735 See International Patent Application Publication Nos. WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602, WO94 / 25585, WO96 / 34096, WO96 / 33735).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture medium, and can be stored for a long time in liquid nitrogen. is there.
  • a method of culturing the hybridoma according to an ordinary method and obtaining the culture supernatant, or administering the hybridoma to a mammal compatible therewith A method of obtaining as ascites is used.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a hybridoma producing an anti-HM1.24 antibody can be carried out by the method of Go to, T. et al. (Blood (1994) 84.1922-1930). Deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM BP-5233 on September 14, 1995 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) Injecting the anti-HM1.24 antibody-producing hybridoma into the abdominal cavity of BA LB / c mice (manufactured by Nippon Clear) to obtain ascites, purifying the anti-HM1.24 antibody from the ascites fluid, Suitable medium, for example, RPMI 1640 medium containing 10% fetal serum, 5% BM-Condimed HI (manufactured by Boehringer Mannheim), Hypri-Doma SFM medium (manufactured by GI BC0-BRL), PFHM-II Culture medium (GI BC0-BR
  • a recombinant gene obtained by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating the antibody gene into an appropriate vector, introducing this into a host, and producing it using a gene recombination technique.
  • Antibodies can be used (for example, see Carl, AK Borrebaeck, James,. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). From the hybridoma, mRNA encoding the variable (V) region of the antibody is isolated.
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), and AGPC method (Chomczynski, P. et al., Analytical Biochemistry, (1987)). Prepare total RNA using 162, 156-159), etc., and prepare mRNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Also, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • cDNA can be synthesized using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 , 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) can be used.
  • the desired recombinant vector is prepared by selecting a colony by introducing it into a bacterium or the like.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the Doxy method.
  • DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated to the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and inserted into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the C region of the antibody.
  • an antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • host cells can be transformed with the expression vector to express the antibody.
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans such as a chimeric antibody or a humanized antibody
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • Chimeric antibodies are produced by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above to the DNA encoding the human antibody C region, incorporating the DNA into an expression vector, and introducing it into a host. (See European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 96/02576). Using this known method, chimeric antibodies useful in the present invention can be obtained.
  • Escherichia coli having a plasmid containing DNA coding for the V region of the chimeric anti- ⁇ 1.24 antibody and the V region of the H chain are respectively Escherichja coli DH5 (pUC19-1.24L-g) and Escherichia col i DH5a ( P UC19-1.24H-gr 1)
  • Escherichia coli DH5 pUC19-1.24L-g
  • Escherichia col i DH5a P UC19-1.24H-gr 1
  • FERM BP-5646 and FERM BP-5644 were deposited internationally under the Budapest Treaty on August 29, 1996, at Higashi-ku, Tsukuba City, Ibaraki Pref. (See Japanese Patent Application No. 9-271536).
  • the humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal, for example, a mouse antibody, is replaced with a human body. It has been transplanted into the complementarity determining region, and its general gene recombination technique is also known (European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. W0
  • a DNA sequence designed to link (framework region; FR) is synthesized by PCR from several oligonucleotides that have been prepared so as to have overlapping portions at the ends.
  • the obtained DNA is ligated to DNA encoding the C region of the human antibody, then inserted into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 239400).
  • the human antibody FR linked via the CDR is selected so that the complementarity-determining region forms a favorable antigen-binding site. If necessary, amino acids in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • a plasmid containing DNA encoding the V chain a region (SEQ ID NO: 2) and the H chain V region r version (SEQ ID NO: 3) of a humanized anti-HM1.24 antibody is used.
  • Escherichia coli having a plasmid containing DNA encoding the H chain V region s version of the humanized anti-HM1.24 antibody (SEQ ID NO: 4) is also Escherichia coli D H5 «(pUC19- As RVHs-AHM-g 1), the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (1-1-3 Tsukuba-Higashi, Ibaraki Pref.) Was registered with FERM on September 29, 1997. It has been deposited internationally under the Budapest Treaty as BP-6127 (see Japanese Patent Application No. 9-271536).
  • the chimeric antibody and the humanized antibody use a human antibody C region, and human CA can be used as a particularly preferred human antibody constant region.
  • Chimeric antibodies consist of the variable regions of antibodies derived from mammals other than human and C regions derived from human antibodies, and humanized antibodies comprise the complementarity-determining regions of antibodies derived from mammals other than human and human antibodies. It is composed of a framework region (FR) and a C region of origin, and has a reduced antigenicity in a human body, and thus is useful as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • a preferred specific example of the humanized antibody to be used is a humanized anti-HM1.24 antibody (see Japanese Patent Application No. 9-271536).
  • Preferred specific examples of the L-chain V region of the humanized anti-HM1.24 antibody include those having an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a preferred specific example of the H chain V region of the humanized anti-HM1.24 antibody is one having an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4. Is mentioned.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • mammalian cells useful and commonly used It can be expressed by an oral motor, an antibody gene to be expressed, a DNA having a polyA signal operably linked to its 3 ′ downstream, or a vector containing the DNA.
  • a promoter overnight promoter human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer can be mentioned.
  • SV retrovirus
  • poliovirus poliovirus
  • adenovirus adenovirus
  • simian virus 40 SV
  • a promoter / enhancer derived from a mammalian cell such as a virus promoter such as 40
  • HEF1a virus promoter-1a
  • expression can be performed by operably linking a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoters include the lacz promoter and the araB promoter.
  • the lacz promoter the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FA SEB J. (1992) 6, 2422-2427), and when the araB promoter is used, the method of Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).
  • a pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bact. eriol. (1987) 169, 4379) may be used. After separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is appropriately refolded and used (see, for example, W096 / 30394).
  • the expression vector was selected as a selection marker, including the aminoglycoside trans- ferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, and Escherichia coli xanching. It can contain a guanine phosphoryltransferase (Ecogpt) gene, a dihydrofolate reductase (dhir) gene, and the like.
  • APH aminoglycoside trans- ferase
  • TK thymidine kinase
  • Edhir dihydrofolate reductase
  • any production system can be used. Production systems for producing antibodies include in vitro and in vivo production systems. In vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • animal cells include (1) mammalian cells, for example, CH0, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, (2) amphibian cells, for example, African oocyte, Alternatively, (3) insect cells such as sf9 and sf2K Tn5 are known.
  • Known plant cells include cells derived from the genus Nicotiana, for example, cells derived from Nicotiana tabacum, which may be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, Saccharomyces (Saccaromvc), for example, Saccharomyces cerevisiae (Saccaromvces cerevisiae), Yeast 4 canine, for example, Aspergillus, for example, Aspergillus 'Niger (Aspergillus niger) is known.
  • Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Yeast 4 canine for example, Aspergillus, for example, Aspergillus 'Niger (Aspergillus niger) is known.
  • E. coli Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacteria As cells, Escherichia coli (E. coli) and Bacillus subtilis are known.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in an inlet. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI 1640. iMDM can be used as a culture solution, and a serum supplement such as bovine calf serum (FCS) can be used in combination. Alternatively, antibodies may be produced in vivo by transferring the cells into which the antibody gene has been introduced into the peritoneal cavity or the like of the animal.
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. When using animals, there are production systems using mammals and insects.
  • mice As mammals, goats, bushes, sheep, mice, and mice can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). In addition, silkworms can be used as insects.o
  • tobacco When using plants, for example, tobacco can be used.
  • an antibody gene is introduced into these animals or plants, and antibodies are produced and recovered in the animals or plants.
  • an antibody gene is inserted into a gene encoding a protein that is uniquely produced in milk, such as goat casein, to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been introduced is injected into a goat embryo, and this embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic Nigga or the progeny of the goat that has received the embryo.
  • Hormones may be used in transgenic fish as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody produced by transgenic fish (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12 , 699-702).
  • silkworms insert the desired antibody gene.
  • the baculovirus thus infected is infected to a silkworm, and a desired antibody is obtained from a body fluid of the silkworm (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
  • the target antibody gene is introduced into a vector for plant expression, for example, pMON530, and this vector is introduced into a vector such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium is used to infect evening sprouts, for example, Nicotiana tabacum, to obtain the desired antibody from the leaves of this tobacco (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) is separately added to the expression vector.
  • the host may be transformed by integration and the host may be co-transformed, or the DNA encoding the H and S chains may be incorporated into a single expression vector to transform the host (International Patent Application Publication No. W0 94-11523).
  • the antibody obtained as described above can be used as a modified antibody by binding to various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” referred to in the claims of the present application also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification.
  • the antibody produced and expressed as described above can be separated from the host inside and outside the cell and from the host and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be carried out by affinity chromatography. Columns used for affinity chromatography Examples thereof include a protein A column and a protein G column. Examples of the carrier used for the Protein A column include Hyper D, P0R0S, Sepharose FF and the like.
  • the separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation.
  • the antibody used in the present invention can be obtained by appropriately selecting and combining chromatography other than the above-mentioned affinity chromatography, finography, ultrafiltration, salting out, and dialysis. Can be separated and purified.
  • the chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and the like. These chromatographs can be applied to HPLC. In addition, reverse phase HPLC can be used.
  • the concentration of the antibody obtained in 2-1 can be measured by measuring absorbance or ELISA. That is, when the absorbance is measured, the antibody used in the present invention or a sample containing the antibody is appropriately diluted with PBS (-), and the absorbance at 280 nm is measured. Calculate as 0D.
  • measurement can be performed as follows. That is, goat anti-human IgG (manufactured by BIO SOURCE) 1001 diluted to 1 g / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well plate (manufactured by Nunc). Incubate with C to immobilize the antibody.
  • the cells used in the present invention can be prepared by the following method. 3-1. Preparation of human peripheral blood lymphocyte fraction
  • Diluted blood collected from a healthy subject is diluted 1/2 with PBS (-), layered on Ficol® paque (Pharmacia) in a 50 ml centrifuge tube (BECTON DICKINSON), and centrifuged at 450 X g for 40 minutes at room temperature. After that, the mononuclear cell fraction in the boundary layer is separated. After preparation the proper density of the same fraction 10% fetal bovine serum (manufactured by Moregate) containing RPMI16 40 medium (GIBC0- manufactured BRL), 1 hour at 3 c, 5% C0 2 under conditions plastic Shah in one Les Perform the incubating operation twice to remove the cells attached to the petri dish. The remaining non-adherent cells can be used as the human peripheral blood lymphocyte fraction in the following experiments.
  • the human peripheral blood lymphocytes prepared as described above were placed in a polypropylene tube at a density of 5 ⁇ 10 6 cells / ml in the presence or absence of 1 ng / ml IL-6 and 0.01% SAC (Pansorbin). cells, Calbiochem., Ltd.) and 2 days, at 37, in a 5% C0 I Nkyube Bok child in two conditions, the B cells in peripheral dust emissions Pas sphere can and activation child.
  • Human peripheral T cells can be purified from human peripheral blood lymphocytes prepared in 3-1 using Cellect Humm T cell Kit (Biotex) according to the attached method.
  • T cells Purify the T cells purified in 3-3 above with RP containing 2% fetal bovine serum (Moregate). Suspend in MI 1640 medium and add 1 or 10 ⁇ g / ml PHA (Phytohemagglutinin, Sigma) at a cell density of 1 ⁇ 10 6 cells / 1 ml / well in a 24-well culture plate, and add the cells at 37 ° C. % C0 2 conditions, the T cells in the youngest Kozuechiri lymphocytes in the child 4 days of culture can and activation child.
  • PHA Physicalhemagglutinin
  • the reactivity between lymphocyte cells and the antibody used in the present invention can be determined by FCM (flow cytometry) analysis.
  • the cells freshly isolated cells or cells obtained by further culturing them can be used.
  • peripheral blood mononuclear cells, peripheral blood lymphocytes, peripheral blood T lymphocytes, peripheral blood B lymphocytes, and the like can be used as freshly separated cells.
  • PBS (-) PBS (-)
  • anti-HM1 diluted to 25 ⁇ g / ml with FACS buffer (PBS (-) containing 2% fetal serum and 0.1% sodium azide).
  • PBS (-) FACS buffer
  • FACS buffer After washing with FACS buffer, add 100 g of FITC-labeled goat anti-mouse antibody (GAM, Becton Dickinson) at 25 g / ml, and incubate at ice temperature for 30 minutes. After washing with FACS buffer, the cells are suspended in 600 1 of FACS buffer, and the fluorescence intensity of each cell may be measured by FACScan (manufactured by Becton Dickinson).
  • GAM FITC-labeled goat anti-mouse antibody
  • lymphocytes undergo a blastogenesis reaction in T cells, and antibody production is observed in B cells.
  • the antibody used in the present invention is added to T cells to suppress the blastogenesis reaction.
  • the antibody used is added to B cells to suppress antibody production, or the antibody used in the present invention is added to lymphocytes to evaluate changes in the expression of antigen markers on the cell surface. What to do it can.
  • the human peripheral T cells purified as described above were suspended in RPMI 1640 medium containing 2% fetal bovine serum (manufactured by Moregate), and cultured at a cell density of 1 x 10 5 cells / 200 1 / well in a 96-well culture plate.
  • the human peripheral blood lymphocytes prepared as described above were placed in a polypropylene tube at a density of 5 ⁇ 10 6 cells / ml with 0.01% SAC (Pansorbin cells, Calbiochem.) At 37 ° C for 5 days for 2 days. % C0 between Lee Nkyube Bok child in two conditions, activate B cells youngest ⁇ lymph neutrophils.
  • the IgG concentration in the main culture supernatant can be measured by a human IgG-specific ELISA. That is, 100 i1 of goat anti-human IgG (manufactured by TAG0) diluted to 1 / g / ral with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well immunoplate (manufactured by Nunc). Incubate at 4 ° C to solidify the antibody. After blocking, add 100 ⁇ l of human IgG (manufactured by CAPPEL) as an appropriately diluted culture supernatant or sample, and incubate at room temperature for 1 hour.
  • human IgG-specific ELISA 100 i1 of goat anti-human IgG (manufactured by TAG0) diluted to 1 / g / ral with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well immunoplate (manufactured by Nunc). Incubate at 4 ° C
  • the human peripheral blood lymphocytes or human peripheral T cells prepared as described above were combined with PHA or SAC and anti-HM1.24 antibody or control mouse IgG2a as described in 5-1 or 5-2. Culture together. Reaction of these cells with an antibody that recognizes a cell surface antigen marker whose expression changes before and after activation, such as the CD10, CD25, CD38, CD40, CD47, CD54, CD98, PCA-1, HM1.24 antigen, etc. Let it. This can be analyzed by FCM as described in 4 above.
  • the activated lymphocytes express the HM1.24 antigen, and the addition of anti-HM1.24 antibody suppresses the T lymphocyte blastogenesis, and furthermore, In B, suppression of antibody production by B lymphocytes was observed. These results indicate that the anti-HM1.24 antibody has an effect of suppressing the activation of lymphocytes.
  • diseases associated with lymphocyte activation include autoimmune diseases, rejection at the time of transplantation of organs and the like, and allergy.
  • autoimmune diseases include Hashimoto's thyroiditis, primary myxedema, thyrotoxicosis, pernicious anemia, autoimmune atrophic gastritis, Addison's disease, premature menopause, and insulin.
  • rejection at the time of transplantation of organs examples include rejection at the time of kidney, liver and heart transplantation, epithelial or endothelial rejection at the time of corneal transplantation, HV D at the time of bone marrow transplantation, and GVHD ( Translated by Shunichi Hirose et al., Clinical Immunology, Iraised (1994) Nankodo). Allergies are represented by type I allergies typified by atopic diseases, type II allergies seen in drug allergies, type III allergies causing various types of nephritis, dermatitis caused by cosmetics and metals, etc. (Takeo Yanagi et al., New Immunology Monographs (7) Immunity and Allergy (1981), Medical School). Therefore, the therapeutic agent of the present invention is useful as a therapeutic agent for these lymphocyte activation-related diseases.
  • the lymphocyte activation inhibitor of the present invention can be administered parenterally systemically or locally.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection can be selected, and the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the effective dose is selected in the range of 0.01 mg / kg to 100 mg / kg body weight at a time.
  • a dose of 1 to 1000 mg, preferably 5 to 50 mg can be chosen per patient.
  • the lymphocyte activation inhibitor of the present invention may contain pharmaceutically acceptable carriers and additives depending on the administration route.
  • Such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, carboxymethyl cellulose.
  • Examples include lilcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • the additives to be used are selected appropriately or in combination from the above depending on the dosage form, but are not limited thereto.
  • Anti-HM1.24 antibody-producing hybridomas were obtained according to the method of Goto, T et al. (Blood (1 994) 84. 1922-1930).
  • BALB / c mice (Nippon Clear Co., Ltd.), which were given 500 n 1 of 2,6,10,14-tetramethylpenecane (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) intraperitoneally one to three days before intraperitoneally, 5 ⁇ 10 6 hybridomas were injected intraperitoneally. From day 10 after injection of Hypri-Doma, ascites collected in the abdominal cavity of the mouse was collected with a 19-gauge indwelling needle happi-cas (made by Medikit).
  • the ascites collected was centrifuged twice at 1,000 rpm and 3000 rpm using a low-speed centrifuge RLX-131 (manufactured by Tomi Issei) to remove miscellaneous waste such as hybridomas and blood cells.
  • Purification of anti-HM1.24 antibody from mouse ascites was performed by the following method. An equal volume of PBS (-) was added to the mouse ascites, and then filtered using a hollow fiber filter media brush (MILLIPORE). The high-speed antibody purification system ConSep LC100 (MILLIPORE) and HyperD Using a Protein A column (column volume 20 mK, manufactured by NGK), PBS (-) was used as the adsorption buffer, and 0.1 M sodium citrate was used as the elution buffer, based on the attached instructions. Affinity purification was performed using a buffer (pH 4).
  • Control mouse IgG2a was purified by the following method.
  • KAPPA mouse IgG2a
  • UPC 10 ascites
  • CAPPEL ascites
  • the concentration of the purified antibody was measured by measuring the absorbance. That is, After diluting the antibody prepared with PBS (-), the absorbance at 280 nm was measured, and 1 mg / ml was calculated as 1.350D.
  • Peripheral blood collected from a healthy person is diluted 1/2 with PBS (-), layered on Ficoll paque (Pharmacia) in a 50 ml centrifuge tube (BECTON DICKINSON), and centrifuged at 450 X g for 40 minutes at room temperature. After that, the mononuclear cell fraction of the boundary layer was separated. After preparation the proper density of the same fraction 10% fetal bovine serum (manufactured by Moregate) containing RPMI16 40 medium (manufactured GIBC0), 1 hour Lee Nkyu at 37 ° C, 5% C0 2 under conditions in plastic petri dish The cells were attached to the petri dish by removing the plate twice. The remaining non-adherent cells were used in the following experiments as a fraction of human lymphocyte lymphocytes.
  • the human peripheral blood lymphocytes prepared as described above were placed in a polypropylene tube at a density of 5 ⁇ 10 6 cells / ml in the presence or absence of 1 ng / ml IL-6 and 0.01% SAC (Pansorbin). cells, Calbi ochem., Ltd.) and 2 days, at 37, in a 5% C0 I Nkyube Bok child in two conditions to activate B cells in peripheral dust emissions Pas sphere.
  • the IgG concentration in the culture supernatant was measured by a human IgG-specific ELISA. That is, goat anti-human IgG (TAG0) 100 1 diluted to 1 g / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well immunoplate (Nunc). In addition, incubation was performed at 4 ° C to solidify the antibody. After blocking, human Ig G (manufactured by CAPPEL) 1001 was added as an appropriately diluted culture supernatant or sample, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour.
  • the human peripheral T cells were purified from the human peripheral blood lymphocytes prepared in Example 2 using a Cellect Humm T cell Kit (manufactured by Biotex) according to the attached method.
  • the purified T cells are suspended in RPMI 1640 medium containing 2% fetal calf serum (manufactured by Moregate) and 0, 1, 10 ⁇ g / cell density in a 24-well culture plate at a cell density of 1 ⁇ 10 6 cells / 1 ml / we11.
  • ml of PHA Physical toheraagglutinin, manufactured by Sigma 37 converting mechanism, 5% C0 2 under the conditions, and cultured for 4 days. Some of these are cultured for 4 days After that, the cells were resuspended in RPMI 1640 medium containing 2% fetal bovine serum (manufactured by Moregate) without PHA, and cultured for 3 days.
  • the antibody was diluted to 25 ⁇ g / ml with FACS buffer (PBS (-) containing 2% fetal serum and 0.1% sodium azide). The 1.24 antibody or 100 ⁇ 1 of the control antibody was added, and the mixture was incubated at an ice temperature for 30 minutes.
  • FACS buffer PBS (-) containing 2% fetal serum and 0.1% sodium azide
  • FITC-labeled goat anti-mouse antibody (GAM, manufactured by Becton Dickinson) 1001 was added, and the mixture was incubated at ice temperature for 30 minutes.
  • FACS buffer 25 g / ml of FITC-labeled goat anti-mouse antibody (GAM, manufactured by Becton Dickinson) 1001 was added, and the mixture was incubated at ice temperature for 30 minutes.
  • the cells were suspended in 600 1 of FACS buffer, and the fluorescence intensity of each cell was measured by FACScan (manufactured by Becton Dickinson).
  • FACScan manufactured by Becton Dickinson
  • T cells 3 H- Ji Mi Jin uptake by juvenile Kahan response by PHA stimulation increases, change in addition to this Koniko down Tororumau scan IgG2a 20 g / ml There was no, adding 20 g / ml HM1.24 antibody when 3 H- Ji Mi Jin uptake inhibition was observed. Therefore, it was shown that the anti-HM1.24 antibody suppressed the activation of T cells.
  • a mouse anti-HM1.24 monoclonal antibody-producing hybridoma was prepared according to the method described in Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1992-1930.
  • mice Three days before sacrifice of the mice, 1.5 ⁇ 10 6 KPC-32 were injected into the spleen of the mice to further increase their antibody titers (Goto, T. et al., Tokushiraa J Exp. Med. (1990) 37, 89). After sacrifice of the mouse, the spleen was excised, and the spleen cell excised according to the method of Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465) and myeoma cell line SP2 / 0 were subjected to cell fusion. did.
  • the reaction was stopped with 2N sulfuric acid, and the absorbance at 492 nm was measured using an ELISA reader (manufactured by Bio-Rad).
  • Positive hybridoma culture to eliminate hybridomas that produce antibodies to human immunoglobulin
  • the supernatant was adsorbed to human serum in advance, and the reactivity to other cell lines was screened by ELISA.
  • Positive hybridomas were selected and their reactivity to various cells was determined by flow cytometry.
  • the last selected hybridoma clone was cloned twice and injected into the abdominal cavity of pristane-treated BALB / C mice to obtain ascites.
  • Monoclonal antibodies were purified from mouse ascites by precipitation with ammonium sulfate and protein A affinity chromatography kit (Amure PA, manufactured by Amersham). The purified antibody was labeled with FITC by using a Quick Tag FITC binding kit (manufactured by Boehringer Mannheim).
  • HM1.24 a hybrid clone most useful for flow cytometry analysis and having CDC activity against RPMI 8226 was selected and named HM1.24.
  • the subclass of the monoclonal antibody produced by this hybridoma was determined by ELISA using a subclass-specific anti-mouse porcupine antibody (Zymed).
  • the anti-HM1.24 antibody had a subclass of IgG2a /.
  • Hypri-Doma HM1.24 which produces anti-HM1.24 antibody, was submitted to the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (1-3 1-3 Tsukuba East, Ibaraki Prefecture) by FERM BP on September 14, 1995. -Deposited internationally as 5233 under the Busseast Convention.
  • Total RNA was prepared from the hybridoma HM1.24 prepared in Reference Example 1 by a conventional method. From this, cDNA encoding the mouse antibody V region was synthesized and amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method and the 5'-RACE method. A DNA fragment containing the gene encoding the mouse V region is obtained, and each of these DNA fragments is ligated to a plasmid pUC-based cloning vector, introduced into E. coli competent cells, and transformed into E. coli. Got a body.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the above plasmid was obtained from this transformant, the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined according to a conventional method, and the complementarity determining regions (CDRs) of the respective V regions were determined. did.
  • the V region CDR of the mouse anti-HM1.24 antibody was transplanted to the human antibody by CDR transplantation.
  • the L chain of the human antibody RE I was used as the L chain of the human antibody, and the Fm-3 of the human antibody HG3 was used for the framework region (FR) 1-3 for the human antibody H chain.
  • FR4 of human antibody JH6 was used.
  • the amino acids of FRs in the V region of the H chain were replaced so that the CDR-grafted antibody formed an appropriate antigen-binding site.
  • each gene was separately introduced into a HEF vector, and humanized.
  • a vector expressing the L chain or H chain of the anti-1.224 antibody was prepared.
  • a cell line producing a humanized anti-HM1.24 antibody was established.
  • the antigen-binding and binding-inhibitory activities of the humanized anti-human 1.24 antibody obtained by culturing this cell line on the human amniotic membrane-derived cell line WISH were examined by Cell ELISA.
  • the humanized anti-HM1.24 antibody has the same antigen-binding activity as the chimeric antibody, and the binding inhibitory activity using the biotinylated mouse anti-substituent 1.24 antibody is also significant. Alternatively, it had the same activity as the mouse antibody.
  • Escherichia coli having a plasmid containing DNA encoding the V region of the chimeric anti-HM1.24 antibody and the V region of the H chain were respectively Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L-gc) and Escherichia E. coli DH5 (pUC19-1.24H-gr1) was submitted to the Institute of Biotechnology, Industrial Science and Technology Institute (1-1-3 Tsukuba East, Ibaraki Prefecture) on August 29, 1996. They were deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM BP-5646 and FERM BP-5644, respectively.
  • Plasmid containing DNA encoding the L chain V region a version (SEQ ID NO: 2) and the H chain V region r version (SEQ ID NO: 3) of the humanized anti-HM1.24 antibody Escherichia co 11 DH5 strain (pUC19-RVLa-AHM-g) and Escheri chia coli DH5 strain (pUC19-RVHr-AHM-gr 1), respectively, are referred to as Escherichia co 11 DH5 strain (pUC19-RVHr-AHM-gr 1)
  • Escherichia co 11 DH5 strain pUC19-RVHr-AHM-gr 1
  • FERM BP-5645 and FERM BP-5643 were deposited internationally under the Budapest Treaty on 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Prefecture.
  • Escherichia coli having a plasmid containing DNA encoding the H chain V region s version (SEQ ID NO: 4) of the humanized anti-HM1.24 antibody was used for cherichia coli DH5 (pUC19-
  • the RVHs-AHM-g 7 ⁇ was submitted to the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture) on September 29, 1997 as FERM BP- It was deposited internationally as 6127 under the Budapest Treaty.
  • Total RNA was prepared from the human multiple myeloma cell line KPMM2 according to the method of Chirgwin et al. (Biochemistry, 18.5294 (1979)). That is, 2.2 ⁇ 10 8 KPMM2s were completely homogenized in 20 ml of 4 M guanidine thiosine mixture (manufactured by Nacalai Tesque). The homogenate was overlaid on a 5.3 M cesium chloride solution in a centrifuge tube, and then centrifuged at 20 ° C for 24 hours at 31, OOOrpm at 31 ° C, overnight at the Beck man SW40 port to precipitate RNA. I let it.
  • RNA precipitate is washed with 70% ethanol and dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) 3001 containing 1 mM EDTA and 0.5% SDS, and then Pronase (Boehringer) Was added to a concentration of 0.5 mg / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes. The mixture was extracted with phenol and chloroform, and the RNA was precipitated with ethanol. Next, the RNA precipitate was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) 2001 containing ImM EDTA.
  • poly (A) + RNA was purified using the Fast Track 2.0 mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) according to the instructions attached to the kit.
  • a double-stranded cDNA was synthesized using the TimeSave r cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) according to the instructions attached to the kit, followed by Directional Cloning Toolbo x ( Pharmacia) and the EcoRI adapter supplied with the kit was connected according to the kit's prescription. EcoRi Adapter Configuration The treatment with Notl and the restriction enzyme Notl was performed according to the recipe attached to the kit.
  • an adapter-added double-stranded cDNA having a size of about 500 bp or more is separated and purified using a 1.5% low-melting point agarose gel (manufactured by Sigma), and an adapter-added double-stranded cDNA of about 40 ⁇ 1 is added.
  • the adapter-added double-stranded cDNA prepared in this manner was previously treated with restriction enzymes EcoRI, Notl and alkaline phosphatase (manufactured by Takara Shuzo) to obtain pCOSl vector-1 (Japanese Patent Application No. 255196) and T4 DNA ligase (GIBC0-BRL) to construct a cDNA library.
  • the constructed cDNA library was transduced into Escherichia coli cell line DH5 (GIBC0-BR) and the total size was estimated to be about 2.5 x 10 s independent clones.
  • a panning dish coated with a mouse anti-HM1.24 antibody was prepared according to the method of B. Seed et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (1987)). That is, a mouse anti-HM1.24 antibody was added to 50 mM Tris-HCl (pH 9.5) at a concentration of 10 g / ml. 3 ml of the antibody solution thus prepared was added to a cell culture dish having a diameter of 60 mm, and the mixture was incubated at room temperature for 2 hours. After washing three times with a 0.15 M NaCl solution, PBS containing 5 fetal calf serum, 1 mM EDTA and 0.02% NaN 3 was added, and the cells were blocked, and used for the following cloning.
  • C0S-7 cells Bok preparative La Nsufu We click as described above, peeling with PBS containing 5 mM EDTA, 53 ⁇ 4; After washing once with PBS containing fetal calf serum, about 1 X 10 6 cells / ml was suspended in PBS containing 5 fetal bovine serum and 0.02% NaN 3 , added to the panning dish prepared as described above, and incubated at room temperature for about 2 hours. After washing three times gently with 5% fetal bovine serum and 0.02% containing NaN 3 PBS, cells or et plus Mi de DNA solution was bound to the panning Dish with containing 0.6% SDS and 10 mM EDTA Recovery was performed.
  • the recovered plasmid DNA was transduced again into Escherichia coli DH5 ⁇ , and the plasmid DNA was amplified as described above and recovered by the alkaline method.
  • the recovered plasmid DNA was transfected into COS-7 cells by the electroporation method, and the plasmid DNA was recovered from the cells bound in the same manner as described above. The same operation was repeated once more, and the recovered plasmid DNA was digested with restriction enzymes EcoRI and NotI. As a result, it was confirmed that an insert of about 0.9 kbp in size was concentrated.
  • E. coli transfected with a part of the recovered plasmid DNA was A 2-YT agar plate containing 50 g / ml ampicillin was inoculated, cultured for 10 minutes, and plasmid DNA was recovered from a single colony. After digestion with restriction enzymes EcoRI and Not1, clone p3.19 having an insert size of about 0.9 kbp was obtained.
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Description

明 細 書 リ ンパ球の活性化抑制剤 技術分野
本発明は、 新規な リ ンパ球活性化抑制剤に関する。 背景技術
人間の生きている環境には、 ウィルス、 細菌、 カ ビ、 寄生虫等の おびただしい種類の感染性の微生物が存在している。 そのいずれか が生体内で増殖する と病気の原因となり、 ひいては個体の死をも も たらす。 従って、 個体が健康的に生活するためには、 これら外因性 の微生物などから生体を防御する機構が必要となる。 この機構が 「 免疫」 と呼ばれる ものである。
生体において主に免疫を担当するのがリ ンパ球細胞である。 リ ン パ球細胞は、 その機能により T リ ンパ球 （T細胞） と B リ ンパ球 （ B細胞） に大別される。 T細胞は抗原提示能、 細胞障害能等を、 B 細胞は抗体産生能を有していると考えられている。 これら 2種のリ ンパ球は全て同じ血液幹細胞に由来し、 骨髄中あるいはその他の器 官で様々な分化、 または増殖因子の作用を受けて分化を繰り返した 後、 末捎血中へ放出される。
例えば、 T細胞の場合、 骨髄中で造血幹細胞が前 T細胞に分化し た後胸腺へと移行し、 さ らに分化を繰り返し成熟 T細胞になる。 そ の後抗原の刺激により活性化され、 増殖能あるいは細胞障害能等を 有する活性化 T細胞となる。 一方、 B細胞の場合、 骨髄中で造血幹 細胞が Iし- 1， I L-2, I L-4, I L-6 等のサイ トカイ ンの刺激によりプロ B 細胞、 プレ B細胞を経て成熟 B細胞に分化し、 さ らに抗原刺激を受 けて活性化され、 最終的に抗体産生能を有する形質細胞となる。 従って、 リ ンパ球がそれぞれの機能を発揮するためには最終的な 活性化が必須である。 前述の通り、 免疫は外来の異物から生体を防 御するこ とが目的であるこ とから、 巧みな機構により異物 （非自己 ) と自己を認識し、 非自己のみを抗原と して反応する仕組みになつ ている。 ところがこの機構が何らかの原因で破綻し、 自己をも抗原 と認識するようになった結果起こる疾患が自己免疫疾患である。 ま た、 非自己に対し免疫反応が過度に、 あるいは不適当な形で起こ り 、 その結果組織障害を引き起こす状態をァ レルギ一という。
一方、 他人の臓器等を移植した場合、 それを非自己と認識し排除 しょう とする反応 （拒絶反応） は、 生体の正常な機構ともいえる。 個体間には遺伝学的に違いがあるこ とが知られており、 その代表的 なものが主要組織適合遺伝子 （MHC ) と呼ばれるものである。 MHC が異なる個体からの臓器移植は、 大きな拒絶反応を引き起こす。 近 年の医療技術の進歩により、 白血病、 あるいはリ ンパ腫治療時の骨 髄移植、 末期腎疾患患者に対する腎移植、 さ らには角膜移植等、 臓 器等の移植の必要性は非常に大きなものとなっている。 それに伴い 、 拒絶反応をいかに抑制するかも大きな問題といえる。
多 く の実験や研究により、 リ ンパ球の活性化からそれに起因する 疾患に至る経路が解明されつつあり、 それに伴い、 リ ンパ球活性化 関与疾患に対する多く の治療薬が開発されている。 現在リ ンパ球活 性化に起因する自己免疫疾患のうち、 慢性関節リ ウマチや全身性ェ リ トマ ト一デス、 さ らには強皮症に対してアス ピ リ ンのような非ス テロイ ド性抗炎症薬ゃステロイ ド剤、 ァザチォプリ ンのような免疫 抑制剤が使用されている。
また、 臓器等移植時の拒絶反応を抑制する目的で、 主に腎移植や 骨髄移植の際にサイ クロスポリ ンゃァザチォプリ ン、 ミ ゾリ ビン等 の免疫抑制剤が使用されている。 さ らに、 アレルギーの治療薬と し ては抗ヒスタ ミ ン薬や、 ァレルギ一の原因となる化学物質の遊離を 抑制する化学伝達物質遊離抑制薬等が用いられている。 しかし、 こ れらのうち非ステロイ ド性抗炎症薬ゃステロイ ド剤、 抗ヒス夕 ミ ン 薬や化学伝達物質遊離抑制薬はいずれも本疾患の原因である リ ンパ 球の活性化に対しては何ら作用せず、 あく まで炎症を押さえる対症 療法に過ぎないこ とから、 本疾患を根本的に治療する ものではない
また、 現在使用されている免疫抑制剤はその性質上、 血球数減少 やシ ョ ッ ク等の重篤な副作用を有する ものも多く、 未だ十分とは言 い難い。 さ らに、 自己免疫疾患の多く は現在も治療法や治療薬が全 く無いのも現実である。
一方、 Got o, T. らは、 ヒ ト骨髄腫細胞をマウスに免疫して得られ たモノ ク π—ナル抗体 （抗 HM1. 24抗体） を報告している （B l ood ( 1 994) 84， 1922- 1930) 。 ヒ ト骨髄腫細胞を移植したマウスに抗 HM1. 24抗体を投与すると、 この抗体が腫瘍組織に特異的に集積したこ と (小阪昌明ら、 日本臨床 （1995) 53, 627-635 ) から、 抗 HM1. 24抗 体はラジオァイ ソ ト一プ標識による腫瘍局在の診断や、 ラジオィ厶 ノセラ ピ一などの ミサイル療法に応用するこ とが可能であるこ とが 示唆されている。 しかし、 抗 HM1. 24抗体がリ ンパ球の活性化抑制に 関与するこ とは知られていなかった。
発明の開示
現在用いられている リ ンパ球活性化関与疾患の治療薬には、 種々 の抗炎症剤や免疫抑制剤が挙げられるが、 上記のごと く、 未だ十分 とは言い難く、 これら疾患を治療し患者の苦痛を緩和する治療剤が 待たれている。 従って、 本発明の目的は、 リ ンパ球活性化抑制剤を 提供するこ とである。
本発明者らは、 所期の目的を達成すべく 、 抗 HM1.24抗体 （Goto, T. ら Blood (1994) 84. 1922-1930) を用いて、 FCM (フ ローサイ トメ ト リ ー） 解析、 T細胞の幼若化反応に対する作用、 B細胞の抗 体産生に対する作用、 さ らには抗 HM1.24抗体が特異的に結合する抗 原蛋白質単離の研究を重ねた結果、 抗 HM1.24抗体が認識する抗原夕 ンパク質が活性化リ ンパ球に発現しているこ と、 および抗 HM1.24抗 体がリ ンパ球の活性化を抑制することを見出 し、 本発明を完成する に至った。
すなわち、 本発明は配列番号 1 に示されるァ ミ ノ酸配列を有する 蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分と して含有する、 リ ンパ 球の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、 配列番号 1 に示されるァ ミ ノ酸配列を有する蛋白 質に特異的に結合する抗体を有効成分と して含有する、 T細胞また は B細胞の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、 配列番号 1 に示されるァ ミ ノ酸配列を有する蛋白 質に特異的に結合するモノ ク ローナル抗体を有効成分と して含有す る、 リ ンパ球の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、 配列番号 1 に示されるァ ミ ノ酸配列を有する蛋白 質に特異的に結合する、 ヒ ト抗体定常領域を有する抗体を有効成分 と して含有する、 リ ンパ球の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、 抗 HM1.24抗体を有効成分と して含有する、 リ ンパ 球の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、 キメ ラ抗体またはヒ ト型化抗体を有効成分と して 含有する、 リ ンパ球の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、 キメ ラ抗 HM1.24抗体またはヒ ト型化抗 HM1.24抗体 を有効成分と して含有する、 リ ンパ球の活性化抑制剤を提供する。 本発明はまた、 抗 HM1. 24抗体が認識するェピ ト一プと特異的に結 合する抗体を有効成分と して含有する、 リ ンパ球の活性化抑制剤を 提供する。
本発明はまた、 配列番号 1 に示されるア ミ ノ酸配列を有する蛋白 質に特異的に結合する抗体を有効成分と して含有する、 リ ンパ球活 性化関与疾患の予防 · 治療剤を提供する。
さ らに、 本発明は、 配列番号 1 に示されるア ミ ノ酸配列を有する 蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分と して含有する、 自己免 疫疾患、 臓器等移植時の拒絶反応、 ア レルギーの予防 ， 治療剤を提 供する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 抗 HM1. 24抗体が SAC 刺激による B細胞からの抗体産生を 抑制するこ とを示す図である。
図 2 は、 PHA 刺激した T細胞を抗 HM1. 24抗体で FCM 解析したとき のヒス トグラムを示す。
図 3 は、 活性化 T細胞を抗 HM1. 24抗体で FCM 解析したときのヒス トグラムを示す。
図 4 は、 抗 HM1. 24抗体が PHA 刺激による T細胞の幼若化反応を抑 制するこ とを示す図である。 発明の実施の形態
1. 抗体の作製
1 - 1. ハイプリ ドーマの作製
本発明で使用される抗体を産生するハイプリ ドーマは、 基本的に は公知技術を使用 し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 HM 1. 24抗原蛋白質や HM1. 24抗原を発現する細胞を感作抗原として使用 して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細 胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のス ク リ ーニング法により、 モノ クロ一ナルな抗体産生細胞をスク リ ー ニングする こ とによつて作製できる。
具体的には、 モノ クロ一ナル抗体を作製するには次のようにすれ ばよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原である HM1.24抗原発現細胞と しては、 ヒ 卜多発性骨髄腫細胞株である KP丽 2 (特開平 7-236475) や KPC- 32 (Goto, T. et al.， Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400 ) を用いるこ とができる。 また、 感作抗原と して配列番号 1 に示す了 ミ ノ酸配列を有する蛋白質、 あるいは抗 HM1.24抗体が認識 するェピ トープを含むペプチ ドまたはポリペプチ ドを使用するこ と ができる。
なお、 感作抗原として使用される、 配列番号 1 に示すア ミ ノ酸配 列を有する蛋白質をコ一 ドする cDNAは pUC19 ベクターの Xbal切断部 位に間に挿入されて、 プラス ミ ド pRS38-pUC19 と して調製されてい る。 このプラス ミ ド PRS38- pUC19 を含む大腸菌 （E.coli) は、 平成 5 年 （ 1993年） 10月 5 日付で工業技術院生命工学工業技術研究所 （ 茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号） に、 Escherichia coH DH5ひ ( pRS38-pUC19 ) と して、 受託番号 FERM BP-4434と してブダペス ト条 約に基づき国際寄託されている （特開平 7- 196694参照） 。 このブラ ス ミ ド PRS38- pUC19 に含まれる cDNA断片を用いて遺伝子工学的手法 により、 抗 HM1.24抗体が認識するェピ トープを含むペプチ ドまたは ポリペプチ ドを作製するこ とができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定される もので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ま しく、 一般的にはげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラ ッ ト、 ハムスター等が使用される。 感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内また は、 皮下に注射するこ とにより行われる。 具体的には、 感作抗原を
PBS (Phosphate-Buffered Saline ) や生理食塩水等で適当量に希 釈、 懸濁したものを所望により通常のアジュバン ト、 例えば、 フロ イ ン ト完全アジュバ ン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4- 21日 毎に数回投与するのが好ま しい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担 体を使用するこ とができる。
このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付さ れる。 細胞融合に付される好ま しい免疫細胞と しては、 特に脾細胞 が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物の ミ エ 口一マ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3X63Ag8.6 53 (J. Immnol. (1979) 123: 1548-1550) 、 P3X63Ag8U.1 (Curren t Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7) 、 NS -1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6: 5 11-519) 、 MPC-11 (Margulies. D. H. et al.， Cell (1976) 8: 40 5-415 ) 、 SP2/0 (Shulman. M. et al. , Nature (1978) 276： 269 -270) 、 F0 (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immunol. Methods (1980) 35： 1-21 ) 、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (19 78) 148: 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 2 77: 131-133 ) 等が適宜使用される。
前記免疫細胞と ミ エローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 たとえば、 ミ ルスティ ンらの方法 （Kohler. G. and Milstein,
C. 、 Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) 等に準じて行う こ とが できる。 より具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば
、 ポリ エチレ ングリ コ一ル （PEG ) 、 センダイウ ィ ルス （ HV J ) 等 が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスル ホキシ ド等の補助剤を添加使用するこ ともできる。
免疫細胞と ミ エロー マ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエロー マ 細胞に対して免疫細胞を 1 - 10倍とするのが好ま しい。 前記細胞融合 に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミ エロー マ細胞株の増殖に 好適な RPMI 1640培養液、 MEM 培養液、 その他、 この種の細胞培養に 用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに、 牛胎児血清 （ FCS ) 等の血清補液を併用するこ ともできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞と ミエロ ー マ細胞との所定量を前記培 養液中でよ く混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000〜 6000程度の PEG 溶液を通常、 30〜 60 % ( w/v ) の濃度で添加し、 混合するこ とによって目的とする融合細胞 （ハイ プリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すこ とによ りハイプリ ドー マ の生育に好ま しく ない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイプリ ドー マは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 (ヒポキサンチン、 ア ミ ノ プテリ ンおよびチ ミ ジンを含む培養液） で培養するこ とにより選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目 的とするハイプリ ドー マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに 十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈 法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイブリ ド一マのスク リ ー ニングおよび単一クロ一ニングが行われる。
また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリ ド— マを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球をィ ンビト口で丽 1. 24抗原または HM1. 24抗原 発現細胞で感作し、 感作リ ンパ球をヒ ト ミ エロ一マ細胞、 例えば U2 66と融合させ、 HM1. 24抗原または HM1. 24抗原発現細胞への結合活性 を有する所望のヒ ト抗体を得るこ と もできる （特公平 1 -59878 参照 ) 。 さ らに、 ヒ ト抗体遺伝子の全てのレパー ト リ ーを有する トラ ン スジェニッ ク動物に抗原となる HM1. 24抗原または HML 24抗原発現細 胞を投与し、 前述の方法に従い所望のヒ ト抗体を取得してもよい （ 国際特許出願公開番号 W0 93/12227 、 W0 92/03918 、 W0 94/02602 、 W0 94/25585 、 W0 96/34096 、 W0 96/33735 参照） 。
このようにして作製されるモノ クローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養するこ とが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存するこ とが可能である。
当該ハイプリ ドーマからモノ クローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
具体的には、 抗 HM1. 24抗体産生ハイプリ ドーマの作製は、 Go t o, T. らの方法 （B l ood ( 1994) 84. 1922- 1930) により行う こ とができ る。 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 7 年 9 月 14日に FERM BP- 5233と してブタぺス ト 条約に基づき国際寄託された抗 HM1. 24抗体産生ハイプリ ドーマを BA LB/cマウス （日本ク レア製） の腹腔内に注入して腹水を得、 この腹 水から抗 HM1. 24抗体を精製する方法や、 本ハイプリ ドーマを適当な 培地、 例えば、 10 %ゥシ胎児血清、 5 % BM- Cond i med HI ( Boehr i ng er Mannhe im 製） 含有 RPMI 1640培地、 ハイプリ ドーマ SFM 培地 （G I BC0-BRL 製） 、 PFHM- I I 培地 （G I BC0- BRL 製） 等で培養し、 その培 養上清から抗 HMl.24抗体を精製する方法で行う ことができる。
1-2. 組換え型抗体
本発明では、 モノ ク ローナル抗体と して、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからク ローニングし、 適当なベク ターに組み込んで、 これを 宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体 を用いるこ とができる （例えば、 Carl, A. K. Borrebaeck, James, . Larr ick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照） 具体的には、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマから、 抗 体の可変 （V ) 領域をコ一 ドする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジ ン超遠心法 （Chirgwin, J. M. ら、 Biochemistry (1979) 18， 5294-5299 ) 、 AGPC法 （ Chomczynsk i， P . ら、 Analytical Biochemistry, (1987) 162, 156-159) 等により 全 RNA を調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia 製） 等を使 用 して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia 製） を用いることにより mRNAを直接調製するこ とがで きる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V 領域の cDNAを合成す る。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDN A Synthesis Kit 等を用いて行う こ とができる。 また、 cDNAの合成 および増幅を行うには 5' -Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCR を用いた 5' - RACE 法 （Frohman, M. A. ら、 Pro Natl . Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002 ； Belyavsky, A. ら、 Nu cleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932 ) を使用するこ とができ る。 得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、 ベク タ一 DNA と連結する。 さ らに、 これより組換えべクタ一を作成し、 大腸 菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えべク タ一を調製す る。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 デォキシ法 によ り確認する。
目的とする抗体の V 領域をコー ドする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C 領域） をコ一 ドする DNA と連結し、 これを 発現ベクターへ組み込む。 または、 抗体の V 領域をコー ドする DNA を、 抗体 C 領域の DNA を含む発現べクタ一へ組み込んでもよい。 本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のように抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサ一、 プロモーターの制御の もとで発現するよう発現ベクターに組み込む。 次に、 この発現べク 夕一により宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させるこ とができる ο
1-3. 改変抗体
本発明では、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させるこ と等を目的 として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメ ラ （Ch imeric) 抗体、 ヒ ト型化 （Humanized ) 抗体を使用できる。 これら の改変抗体は、 既知の方法を用いて製造するこ とができる。
キメ ラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V 領域をコー ドする DN A をヒ ト抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 これを発現べクタ 一に組み込んで宿主に導入し産生させるこ とにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 96/02576 参照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメ ラ抗体を得 るこ とができる。
例えば、 キメ ラ抗丽 1.24抗体のし 鎖 V 領域および H 鎖 V 領域をコ — ドする DNA を含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichj a col i DH5ひ ( pUC19一 1.24L— g ） および Escherichia col i DH5 a ( PUC19-1.24H-gr 1 ) と して、 工業技術院生命工学工業技術研究 所 （茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 8 年 8 月 29日に、 各々 FERM BP- 5646および FERM BP- 5644と してブダペス ト条約に基づ き国際寄託されている （特願平 9-271536参照） 。
ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体とも称され、 ヒ ト 以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; com pleraentar i ty determining region ) をヒ ト 几体の相補性決定領域 へ移植したものであり、 その一般的な遺伝子組換え手法も知られて いる （欧州特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0
96/02576 参照） o
具体的には、 マウス抗体の CDR と ヒ ト抗体のフ レームワーク領域
(framework region ； FR) を連結するよう に設計した DNA 配列を、 末端部にオーバーラ ップする部分を有するように作製した数個のォ リ ゴヌ ク レオチ ドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ ト 抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 次いで発現ベクターに組み 込んで、 これを宿主に導入し産生させるこ とによ り得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 96/02576 参照） 。
CDR を介して連結される ヒ ト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成 ヒ ト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように 抗体の可変領域のフ レームワーク領域のア ミ ノ酸を置換してもよい
(Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
例えば、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体のし 鎖 V 領域 aバージョ ン （配列 番号 ： 2 ) および H 鎖 V 領域 rバージョ ン （配列番号 ： 3 ) をコー ドする DNA を含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichia coli DH5 ( pUC19-RVLa-AHM-g κ ) および Escheri chia coli DH5ひ
(pUC19-RVHr-AHM-gr 1 ) と して、 工業技術院生命工学工業技術研 究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 8 年 8 月 29日に 、 各々 FERM BP- 5645および FERM BP- 5643と してブダぺス ト条約に基 づき国際寄託されている （特願平 9- 271536参照） 。 また、 ヒ ト型化 抗 HM1.24抗体の H 鎖 V 領域 sバージ ョ ン （配列番号 ： 4 ) をコー ド する DNA を含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 Escherichia col i D H5« (pUC19- RVHs-AHM-gァ 1)と して、 工業技術院生命工学工業技術 研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 9 年 （ 1997年 ) 9 月 29日に FERM BP- 6127と してブダぺス 卜条約に基づき国際寄託 されている （特願平 9-271536参照） 。 キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体に は、 ヒ ト抗体 C 領域が使用され、 特に好ま しいヒ ト抗体定常領域と してヒ ト C ァを使用するこ とができる。
キメ ラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域と ヒ ト抗体 由来の C 領域からなり、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗 体の相補性決定領域と ヒ ト抗体由来のフ レームワーク領域 （framew ork region; FR) および C 領域からなり、 ヒ ト体内における抗原性 が低下しているため、 本発明の治療剤の有効成分と して有用である 本発明に使用される ヒ ト型化抗体の好ま しい具体例と しては、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体が挙げられる （特願平 9-271536参照） 。 ヒ ト型 化抗 HM1.24抗体の L 鎖 V 領域の好ま しい具体例と しては、 配列番号 2 に示される塩基配列でコー ドされるァ ミ ノ酸配列を有する ものが 挙げられる。 また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の H 鎖 V 領域の好ま しい 具体例と しては、 配列番号 3又は 4 に示される塩基配列でコ一ドさ れるァ ミ ノ酸配列を有する ものが挙げられる。
1-4. 発現および産生
前記のよう に構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ 、 取得することができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプ 口モーター、 発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポリ A シグナ ルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベクタ一により発 現させるこ とができる。 例えばプロモ一夕一 Zェンハンサーとして は、 ヒ トサイ ト メガロウ ィ ルス前期プロ乇一夕一/ェンハンサー （ human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer ) を 挙げるこ とができる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ 一夕一/ェ ン ノヽンサ一と して、 レ トロウイ ルス、 ポリオ一マウィ ル ス、 アデノ ウイ ルス、 シ ミ アンウィ ルス 40 (SV 40 ) 等のウィ ルス プロモータ一 Zェ ン ノヽンサーゃヒ トェロ ンゲ一ショ ンフ ァ クタ一 1 a (HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプロモーター/ェンハンサ一 を用いればよい。
例えば、 SV 40 プロモーター/ェンハンサーを使用する場合、 Mu lliganらの方法 （Nature (1979) 277, 108) 、 また、 HEF1ひプロモ 一夕一 Zェンハンサーを使用する場合、 Mizushima らの方法 （Nucl eic Acids Res. (1990) 18, 5322) に従えば容易に実施するこ とが できる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させるこ とができる。 例えばプロモー夕一と しては、 laczプロモ一 夕一、 araBプロモータ一を挙げるこ とができる。 laczプロモータ一 を使用する場合、 Wardらの方法 （Nature (1098) 341， 544- 546 ； FA SEB J. (1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモーターを使用する場合 、 Betterらの方法 （Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えばよ い。
抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のペリ ブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei, S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169， 4379 ) を使用すればよい。 ペリ ブラズ厶に産 生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フ ォ ール ド （re fold) して使用する （例えば、 W096/30394を参照） 。
複製起源としては、 SV 40 、 ポリ オ一マウ ィ ルス、 アデノ ウ ィ ル ス、 ゥシパピ口一マウ ィ ルス （BPV ) 等の由来のものを用いるこ と ができ、 さ らに、 宿主細胞系で遺伝子コ ピー数増幅のため、 発現べ クタ一は選択マ一カーと して、 ア ミ ノ グリ コシ ド トラ ンスフ ェラ一 ゼ （APH ) 遺伝子、 チ ミ ジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサン チングァニンホスホリ ボンル トラ ンスフ ェラーゼ （ Ecogp t ) 遺伝子 、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhir) 遺伝子等を含むこ とができる。 本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す るこ とができる。 抗体製造のための産生系は、 イ ンビ トロおよびィ ンビボの産生系がある。 イ ンビ トロの産生系としては、 真核細胞を 使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用い る産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば、 CH 0 、 COS 、 ミ エローマ、 BHK (baby hamster kidney ) 、 HeLa、 Ve ro、 (2) 両生類細胞、 例えば、 アフ リ カッメガエル卵母細胞、 ある いは（3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9 、 sf2K Tn5 などが知られている 。 植物細胞と しては、 ニコティ アナ (Nicotiana ) 属、 例えばニコ ティ アナ · 夕バカム (Nicotiana tabacum ) 由来の細胞が知られて おり、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例 えば、 サッカロ ミ セス （ Saccaromvc ） 属、 例えばサッカロ ミ セス • セレ ビ'シェ ( Sacc aromvces cerevisiae) 、 糸 4犬菌、 列えば、 了 スペルギルス （ Aspergillus ) 属、 例えばァスペルギルス ' 二ガー (Aspergillus niger ) などが知られている。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 (E. coli ) 、 枯草菌が知られている。
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し 、 形質転換された細胞をィ ンビ ト口で培養するこ とにより抗体が得 られる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液と して、 DMEM、 MEM 、 RPMI 1640. iMDMを使用するこ とができ、 牛眙児血清 （ FCS ) 等の血清補液を併用するこ ともできる。 また、 抗体遺伝子を 導入した細胞を動物の腹腔等へ移すこ とにより、 イ ン ビボにて抗体 を産生してもよい。
一方、 イ ンビボの産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物 、 昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物としては、 ャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用い るこ とができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applica tions, 1993 ) 。 また、 昆虫としては、 カイ コを用いるこ とができ る o
植物を使用する場合、 例えばタバコを用いるこ とができる。
これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、 動物または植物 の体内で抗体を産生させ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ カゼイ ンのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコー ドする遺 伝子の途中に挿入して融合遺伝子と して調製する。 抗体遺伝子が揷 入された融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を 雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる ト ラ ンスジェ ニッ クャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。
ト ラ ンスジエニッ クャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量 を増加させるために、 適宜ホルモンを ト ラ ンスジヱニッ クャギに使 用してもよい （Ebert, K.M. et al.， Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ) 。 また、 カイ コを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入 したバキュロウ ィ ルスをカイ コに感染させ、 このカイ コの体液より 所望の抗体を得る （Susumu, M. et al. , Nature (1985) 315, 592- 594 ) 。
さ らに、 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用べ クタ一、 例えば pMON 530に揷入し、 このべクタ一を Agrobacterium tumefaciens のようなノくクテリアに導入する。 このバクテリ アを夕 バコ、 例えば Nicotiana tabacum に感染させ、 本タバコの葉より所 望の抗体を得る （Julian, K. -C. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1 994) 24, 131-138) 。
上述のように、 イ ンビ トロまたはイ ン ビボの産生系にて抗体を産 生する場合、 抗体重鎖 （H 鎖） または軽鎖 （L 鎖） をコー ドする DN A を別々 に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させても よいし、 あるいは H 鎖およびし 鎖をコー ドする DNA を単一の発現べ クタ一に組み込んで、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願 公開番号 W0 94-11523 参照） 。
上述のよう に得られた抗体は、 ポリエチレ ングリ コール （PEG ) 等の各種分子と結合させ抗体修飾物と して使用するこ ともできる。 本願特許請求の範囲でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含 される。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的 な修飾を施すこ とによって得るこ とができる。 これらの方法はこの 分野においてすでに確立されている。
2. 抗体の分離、 精製
2-1. 抗体の分離、 精製
前記のように産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製するこ とができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製はァフィ 二ティ 一クロマ トグラフ ィ 一により行う こ とがで きる。 ァフ ィ 二ティ 一クロマ トグラフ ィ 一に用いるカラムと しては 、 例えば、 プロテイ ン A カラム、 プロテイ ン G カラムが挙げられる 。 プロテイ ン A カラ厶に用いる担体と して、 例えば、 Hyper D 、 P0 R0S 、 Sepharose F. F.等が挙げられる。
その他、 通常のタ ンパク質で使用されている分離、 精製方法を使 用すればよ く、 何ら限定されるものではない。 例えば、 上記ァフ ィ 二ティ 一クロマ ト グラフィ ー以外のクロマ トグラフ ィ ー、 フ ィ ノレ夕 一、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わせれば、 本発明 で使用される抗体を分離、 精製するこ とができる。 クロマ トグラフ ィ 一と しては、 例えば、 イオン交換クロマ トグラフ ィ ー、 疎水クロ マ ト グラフ ィ ー、 ゲルろ過等が挙げられる。 これらのクロマ ト グラ フ ィ 一は HPLCに適用するこ とができる。 また逆相 HPLCを用いるこ と ができる。
2-2. 抗体の濃度測定
2- 1 で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定または EL I SA 等に より行う こ とができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 本発明で使用される抗体または抗体を含むサンプルを PBS (-)で適当 に希釈した後、 280 nmの吸光度を測定し、 1 mg/ml を 1. 35 0D と し て算出する。 また、 EL I SA による場合は以下のように測定するこ と ができる。 すなわち、 0. 1M 重炭酸緩衝液 （pH9. 6 ) で 1 g/ml に希釈したャギ抗ヒ ト I gG ( B I O SOURCE製） 100 1 を 96穴プレー ト （Nunc製） に加え、 4 °Cでー晚イ ンキュベーシ ョ ン し、 抗体を固 層化する。
ブロ ッキングの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗体または 抗体を含むサンプル、 あるいは標品と してヒ ト I gG ( CAPPEL製） 10 0 1 を添加し、 室温にて 1 時間イ ンキュベーシ ョ ンする。 洗浄後 、 5000倍希釈したアル力 リ フ ォスフ ァ タ一ゼ標識抗ヒ ト I gG ( B I O SOURCE製） 100 fi 1 を加え、 室温にて 1 時間イ ンキュベー トする。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベーショ ンの後、 MICROPLATE REA DER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405nm での吸光度を測定し 、 目的の抗体の濃度を算出する。
3. 細胞の調製
本発明で用いる細胞は、 以下の方法で調製するこ とができる。 3-1. ヒ 卜末梢血リ ンパ球画分の調製
健常人より採取した末捎血液を PBS (-)で 1/2 希釈後、 50 ml 遠心 チューブ （BECTON DICKINSON製） 中で Ficol卜 paque (Pharmacia 製 ) に重層し 450 X g 、 室温で 40分間遠心した後、 境界層の単核球画 分を分離する。 同画分を 10% 牛胎児血清 （Moregate製） 含有 RPMI16 40培地 （GIBC0- BRL 製） で適当密度に調製後、 プラスチッ ク シャ一 レ中で 3 c、 5 %C02条件下にて 1 時間イ ンキュべ一 卜する操作を 2 度行う こ とにより、 シャーレに付着した細胞を除去する。 残った非 付着性の細胞をヒ 卜末梢血リ ンパ球画分と して以下の実験に用いる こ とができる。
3-2. SACによる ヒ 卜末梢血 B 細胞の活性化
上記の通り調製したヒ 卜末梢血リ ンパ球をポリ プロ ピレ ンチュー ブ中、 5 X 106 cells/mlの密度で 1 ng/ml IL- 6存在下、 あるいは非 存在下で 0.01 % SAC (Pansorbin cells , Calbiochem. 製） と 2 日 間、 37で、 5% C02条件下でィ ンキュベー 卜するこ とで、 末梢血リ ン パ球中の B 細胞を活性化するこ とができる。
3-3. ヒ 卜末梢 T 細胞の精製
ヒ 卜末稍 T 細胞は 3-1 で調製したヒ 卜末梢血リ ンパ球から Cellec t Humm T cell Kit (Biotex製） を用いて、 添付の方法に従い精製 する こ とができる。
3-4. PHA 刺激による ヒ 卜抹消血 T 細胞の活性化
上記 3-3 で精製した T 細胞を 2%牛胎児血清 （Moregate製） 含有 RP MI 1640培地に懸濁し 24穴培養プレー ト中 1 x 106 cell/1 ml/well の細胞密度で、 1 あるいは 10〃 g/mlの PHA (Phytohemagglutinin, Sigma 製） を添加し 37°C、 5%C02 条件下、 4 日間培養するこ とで末 梢血リ ンパ球中の T 細胞を活性化するこ とができる。
4. FCM 解析
リ ンパ球細胞と本発明で使用される抗体との反応性は、 FCM (フ ローサイ ト メ ト リ 一） 解析で行う こ とができる。 細胞と しては、 新 鮮分離細胞あるいはそれをさ らに培養した細胞を用いるこ とができ る。 例えば新鮮分離細胞と して、 末梢血単核球、 末梢血リ ンパ球、 末梢血 Tリ ンパ球、 末梢血 B リ ンパ球などを用いるこ とができる。 上記細胞を PBS (-)で洗浄した後、 FACS 緩衝液 （2 %ゥシ胎児血 清、 0.1 %アジ化ナ ト リ ウム含有 PBS (-）） で 25〃 g/ml に希釈した 抗 HM1.24抗体あるいはコ ン トロール抗体 100 / 1 を加え、 氷温下 30 分イ ンキュベー トする。 FACS 緩衝液で洗浄した後、 25 g/ml の FITC標識ャギ抗マウス抗体 （GAM, Becton Dickinson 製） 100 j 1 を加え、 氷温下 30分間イ ンキュベー トする。 FACS 緩衝液で洗浄し た後、 600 1 の FACS 緩衝液に懸濁し、 FACScan (Becton Dicki nson製） で各細胞の蛍光強度を測定すればよい。
5. 効果の確認
リ ンパ球はその活性化に伴い T細胞では幼若化反応が、 また B細 胞では抗体産生が認められる。 また、 両細胞と も活性化に伴い、 細 胞表面の種々の抗原マーカーの出現あるいは消失が観察される。 従 つて、 本発明のリ ンパ球活性化抑制剤の効果を確認するには、 本発 明で使用される抗体を T細胞に添加し幼若化反応を抑制するこ と、 また、 本発明で使用される抗体を B細胞に添加し抗体産生を抑制す るこ と、 あるいは本発明で使用される抗体をリ ンパ球に添加し細胞 表面の抗原マーカ一の発現の変化を評価するこ とにより行う こ とが できる。
5-1. T細胞の幼若化反応に対する抗 HMl.24抗体の効果
前述の通り精製したヒ 卜末梢 T 細胞を、 2%牛胎児血清 （Moregate 製） 含有 RPMI 1640培地に懸濁し 96穴培養プレー ト中 1 x 105 cells /200 1/wellの細胞密度で、 1 g/mlの PHA ( Phy tohemagglut inin , Sigma 製） 及び抗 HMl.24抗体またはコ ン ト ロ一ルマウス IgG2a 20 〃 g/mlと共に 37で、 5¾C02 条件下、 4 日間培養し、 3H- チ ミ ジン （ Amersham製） を 1 Ci/well 添加し、 4 時間後の取り込みを /S -c ounter (Pharmacia 製） で測定すればよレヽ。
5-2. B細胞の抗体産生に対する抗 HM1.24抗体の効果
前述の通り調製したヒ 卜末梢血リ ンパ球をポリ プロ ピレ ンチュー ブ中、 5 X 106 cells/mlの密度で 0.01 % SAC (Pansorbin cells , Calbiochem. 製） と 2 日間、 37°C、 5% C02条件下でイ ンキュベー 卜するこ とで、 末捎血リ ンパ球中の B 細胞を活性化する。 SAC 処理 した末梢血リ ンパ球を 10% 牛胎児血清 （Moregate製） 含有 RPMI1640 培地で懸濁し 96穴培養プレー ト （BECTON DICKINSON製） で 1 x 105 cells/200^ 1/wellの細胞密度で、 抗 HM1.24抗体またはコ ン トロー ルマウス IgC2a 20 g/mlと共に 37°C、 5%C02 条件下 6 日間培養した 後、 培養上清を回収する。
本培養上清中の IgG 濃度は、 ヒ 卜 IgG 特異的 ELISA で測定するこ とができる。 即ち、 0.1M 重炭酸緩衝液 （pH9.6 ) で 1 ； g/ralに希 釈したャギ抗ヒ ト IgG (TAG0製） 100 i 1 を 96穴ィ厶ノ プレー ト （ Nunc製） に加え、 4 °Cでー晚イ ンキュベー シ ョ ン し、 抗体を固層化 する。 ブロ ッキングの後、 適当に希釈した培養上清あるいは標品と してヒ ト IgG (CAPPEL製） 100 μ.1 を添加し、 室温にて 1 時間イ ン キュベ一シ ョ ンする。
洗浄後、 2000倍希釈したアルカ リ フ ォスフ ァ タ一ゼ標識抗ヒ ト Ig G (CAPPEL製） 100 1 を加え、 室温にて 1 時間イ ンキュベー トす る。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベー シ ョ ンの後、 MICR0PLATE
READER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405nm での吸光度を測 定すればよい。
5-3. 細胞表面抗原マーカーの解析
前述の通り調製したヒ 卜末梢血リ ンパ球、 あるいはヒ 卜末梢 T 細 胞を、 5-1 または 5- 2 の通り PHA または SAC および抗 HM1.24抗体ま たはコ ン ト ロールマウス IgG2a とと もに培養する。 これら細胞を、 活性化の前後で発現が変化する細胞表面抗原マーカ一、 たとえば CD 10， CD25, CD38, CD40, CD47, CD54, CD98, PCA- 1， HM1.24抗原等を 認識する抗体と反応させる。 これを前述 4 の通り FCM 解析すればよ い。
5-4. 効果の確認と関連疾患
後述の実施例に示されるように、 活性化リ ンパ球に HM1.24抗原が 発現しているこ と、 また抗 HM1.24抗体の添加により Tリ ンパ球の幼 若化の抑制、 さ らには B リ ンパ球の抗体産生抑制が認められた。 こ れらのこ とから、 抗 HM1.24抗体はリ ンパ球の活性化を抑制する効果 を有するこ とが示された。
一方、 リ ンパ球の活性化が関与する疾患と しては、 自己免疫疾患 、 臓器等の移植時の拒絶反応、 アレルギーが挙げられる。 具体的に は自己免疫疾患と して橋本甲状腺炎、 原発性粘液水腫、 甲状腺中毒 症、 悪性貧血、 自己免疫性萎縮性胃炎、 ア ジ ソ ン （Addison ) 病、 早発性閉経、 イ ンス リ ン依存性糖尿病、 グッ ドパスツール （Goodpa sture ) 症候群、 重症筋無力症、 男性不妊症、 尋常性天疱瘡、 類天 疱瘡、 交感性眼炎、 水晶体原性ぶどう膜炎、 多発性硬化症、 自己免 疫性溶血性貧血、 特発性血小板減少性紫斑病、 原発性胆汁性肝硬変 症、 活動性慢性肝炎、 特発性肝硬変症、 潰瘍性大腸炎、 シユ ーグレ ン症候群、 慢性関節リ ウマチ、 皮膚筋炎、 強皮症、 混合性結合組織 病、 円扳状エリ トマ ト一デス、 全身性エリ トマ ト一デス等が挙げら れる （廣瀬俊一ら監訳、 臨床免疫学イ ラ ス ト レイテッ ド（1 994 )南江 堂） 。
臓器等の移植時の拒絶反応と して、 腎、 肝、 心移植時の拒絶反応 、 角膜移植時の上皮性、 あるいは内皮性拒絶反応、 骨髄移植時の HV D 、 あるいは GVHD等が挙げられる （廣瀬俊一ら監訳、 臨床免疫学ィ ラス ト レイテツ ド（1994)南江堂） 。 アレルギーと して、 ア ト ピー疾 患に代表される I 型アレルギー、 薬物アレルギーに見られる I I型ァ レルギ一、 各種の腎炎を引き起こす I I I型ア レルギー、 化粧品や金 属による皮膚炎などに代表される I V型ア レルギーが挙げられる （畔 柳武雄ら、 新免疫学叢書（7 ) 免疫とアレルギー（1981 )医学書院） 。 従って、 本発明の治療剤は、 これら リ ンパ球活性化関与疾患の治療 剤と して有用である。
6. 投与経路および製剤
本発明のリ ンパ球活性化抑制剤は、 非経口的に全身あるいは局所 的に投与することができる。 例えば、 点滴などの静脈内注射、 筋肉 内注射、 腹腔内注射、 皮下注射を選択することができ、 患者の年齢 、 症状により適宜投与方法を選択するこ とができる。 有効投与量は 、 一回につき体重 1 Kgあたり 0. 0 1 mg から 100 mgの範囲で選ばれる 。 あるいは、 患者あたり 1 〜1000 mg 、 好ま しく は 5 〜50 mg の投 与量を選ぶことができる。 本発明のリ ンパ球活性化抑制剤は、 投与 経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであつ てもよい。
このような担体および添加物の例と して、 水、 医薬的に許容され る有機溶媒、 コラーゲン、 ポ リ ビニルアルコール、 ポ リ ビニルピロ リ ドン、 カルボキシ ビ二ルポ リ マ一、 カルボキシメ チルセルロース ナ ト リ ウム、 ポ リ ア ク リ ル酸ナ ト リ ウム、 アルギン酸ナ ト リ ウム、 水溶性デキス ト ラ ン、 カルボキシメ チルスタ ーチナ ト リ ウム、 ぺク チ ン、 メ チルセルロース、 ェチルセルロース、 キサン タ ンガム、 ァ ラ ビアゴム、 カゼイ ン、 ゼラチ ン、 寒天、 ジグ リ セ リ ン、 プロ ピレ ン グリ コール、 ポ リ エチ レ ン グリ コール、 ワセ リ ン、 ノ、°ラ フ ィ ン、 ステア リ ルアルコール、 ステア リ ン酸、 ヒ ト血清アルブ ミ ン （ HSA ) 、 マンニ トール、 ソルビ トール、 ラ ク ト一ス、 医薬添加物として 許容される界面活性剤などが挙げられる。 使用される添加物は、 剤 型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、 これ らに限定される ものではない。 実施例
次に、 本発明を実施例によりさ らに具体的に説明するが、 本発明 はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例 1. 抗 HM1.24抗体の作製
1.抗 HM1.24抗体を含むマウス腹水の調製
抗 HM1.24抗体産生ハイプリ ドーマを Goto, T らの方法 （Blood (1 994) 84. 1922-1930) に従い得た。
あらかじめ 1し 3 日前に 2， 6， 10, 14-テ トラ メチルペン夕デカ ン （ 和光純薬工業製） をそれぞれ 500 n 1 ずつ腹腔内に投与した BALB/c マウス （日本ク レア製） に、 本ハイプ リ ドーマ 5 X 106 個を腹腔内 に注入した。 ハイプリ ドーマ注入後 10日 目より、 マウスの腹腔内に 溜った腹水を 19ゲージの留置針ハッ ピーキャ ス （メディ キッ ト製） で採取した。 採取した腹水は、 低速遠心機 RLX- 131 ( ト ミ 一精ェ製 ) を用いて回転数 1000、 3000 rpmで 2 回遠心し、 ハイブリ ドーマ、 血球等の雑排物を除去した。
2.マウス腹水からの抗 HM1.24抗体の精製 上記マウス腹水からの抗 HMl.24抗体の精製は以下の方法で行つた 。 マウス腹水に等量の PBS (-)を加えた後、 中空糸フ ィ ルタ一メディ アブレ ップ （MILLIPORE 製） を用いてろ過した後、 高速抗体精製装 置 ConSep LC100 (MILLIPORE 製） および Hyper D Protein A カラム (カラム体積 20 mK 日本ガイ シ製） を用い、 付属の説明書に基づ き吸着緩衝液と して PBS (-）、 溶出緩衝液と して 0.1 M クェン酸ナ ト リ ウ厶緩衝液 （pH 4) を用いてァフ ィ 二ティ ー精製した。 溶出画分 は直ちに 1 M Tris-HCl (pH 8.0) を添加して pH7.4 付近に調整した 後、 遠心限外濃縮器 Centriprep 10 を用いて濃縮および PBS (-)への 緩衝液置換を行い、 孔径 0.22 m のメ ンブラ ンフ ィ ル夕一 MILLEX- G V (MILLIPORE 製） でろ過滅菌し、 精製抗 HM1.24抗体を得た。
3. コ ン トロールマウス I gG2a の精製
コ ン トロールマウス IgG2a の精製は以下の方法で行った。 市販の マウス IgG2a(KAPPA)(UPC 10)腹水 （CAPPEL製） を精製水および PBS( -)で溶解した。 これを孔径 0.2 / m のメ ンブラ ンフ ィ ルタ一 Acrodi sc (Gelman Sciences 製） を用いてろ過した後、 高速抗体精製装置 ConSep LC100 (MILLIPORE 製） および Hyper D Protein A カラム （ カラム体積 20 mK 日本ガイ シ製） を用い、 付属の説明書に基づき 吸着緩衝液と して PBS (-）、 溶出緩衝液と して 0.1 M クェン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （pH 4) を用いてァフィ 二ティ 一精製した。
溶出画分は直ちに 1 M Tris-HCl (pH 8.0) を添加して pH7.4 付近 に調整した後、 遠心限外濃縮器 Centriprep 10 を用いて濃縮および PBS (-)への緩衝液置換を行い、 孔径 0.22〃 m のメ ンブラ ンフ ィ ルタ 一 MILLEX- GV (MILLIPORE 製） でろ過滅菌し精製コ ン ト ロールマウ ス IgG2a を得た。
4. 抗体濃度の測定
精製抗体の濃度測定は吸光度の測定によ り行った。 すなわち、 精 製抗体を PBS (-)で希釈した後、 280 nmの吸光度を測定し、 1 mg/ml を 1.35 0D として算出した。
実施例 2. SAC 刺激ヒ 卜末稍血 B 細胞の抗体産生に対する抗 HM
1.24抗体の効果
1. ヒ 卜末捎血リ ンパ球画分の調製
健常人より採取した末梢血液を PBS (-)で 1/2 希釈後、 50 ml 遠心 チューブ （BECTON DICKINSON製） 中で Fi col卜 paque (Pharmacia 製 ) に重層し 450 X g 、 室温で 40分間遠心した後、 境界層の単核球画 分を分離した。 同画分を 10% 牛胎児血清 （Moregate製） 含有 RPMI16 40培地 （GIBC0 製） で適当密度に調製後、 プラスチッ ク シャーレ中 で 37°C、 5 %C02条件下にて 1 時間イ ンキュべ一 卜する操作を 2 度行 う こ とにより、 シャーレに付着した細胞を除去した。 残った非付着 性の細胞をヒ 卜末稍血リ ンパ球画分と して以下の実験に用いた。
2. SACによる ヒ 卜末梢血 B 細胞の活性化
上記の通り調製したヒ 卜末梢血リ ンパ球をポリ プロ ピレ ンチュー ブ中、 5 X 106 cells/mlの密度で 1 ng/ml IL- 6存在下、 あるいは非 存在下で 0.01 % SAC (Pansorbin cells , Calbi ochem. 製） と 2 日 間、 37で、 5% C02条件下でィ ンキュベー 卜するこ とで、 末梢血リ ン パ球中の B 細胞を活性化した。 SAC 処理した末梢血リ ンパ球を 10% 牛胎児血清 （Moregate製） 含有 RPMI 1640培地で懸濁し 96穴培養プレ - ト （BECTON DICKINSON製） で 1 x 105 eel ls/200 1/wel 1の細胞 密度で、 抗 HM1.24抗体またはコ ン トロールマウス IgC2a 20〃 g/mlと 共に 37°C、 5%C02 条件下 6 日間培養した後、 培養上清を回収した。
3. ヒ 卜 IgG の定量
上記培養上清中の IgG 濃度は、 ヒ 卜 IgG 特異的 ELISA で測定した 。 即ち、 0.1M 重炭酸緩衝液 （pH9.6 ) で 1 g/mlに希釈したャギ 抗ヒ ト IgG (TAG0製） 100 1 を 96穴ィ厶ノ プレー ト （Nunc製） に 加え、 4 °Cでー晚イ ンキュベーショ ンし、 抗体を固層化した。 プロ ッキングの後、 適当に希釈した培養上清あるいは標品と してヒ ト Ig G (CAPPEL製） 100 1 を添加し、 室温にて 1 時間イ ンキュべ一シ ヨ ン した。
洗浄後、 2000倍希釈したアル力 リ フ ォ スフ ァ ターゼ標識抗ヒ ト Ig G (CAPPEL製） 100 1 を加え、 室温にて 1 時間イ ンキュベー ト し た。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベーシ ョ ンの後、 MICR0PLATE READER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405nm での吸光度を測 定した。
4. 抗 HM1.24抗体の SAC 刺激ヒ 卜末梢血 B 細胞の抗体産生に対す る効果
図 1 に示すように SAC 刺激により B 細胞の IgG 産生は増強され、 こ こ にコ ン トロールマウス IgG2a 20〃g/mlを加えても変化はなかつ たが、 抗 HM1.24抗体 20 g/mlを加える と IgG 産生の完全な抑制が観 察された。 従って、 抗 HM1.24抗体は B 細胞の活性化を抑制するこ と が示された。
実施例 3. PHA 刺激ヒ 卜 T 細胞幼若化反応に対する HM1.24抗体 の効果
1. ヒ 卜末稍血 T 細胞の調製
ヒ 卜末梢 T 細胞は実施例 2で調製したヒ 卜末梢血リ ンパ球から Ce llect Humm T cell Kit (Biotex製） を用いて、 添付の方法に従い 精製した。
2. FCM 解析
精製 T細胞を 2%牛胎児血清 （Moregate製） 含有 RPMI 1640培地に懸 濁し 24穴培養プレー ト中 1 X 106 cells/1 ml /we 11の細胞密度で、 0， 1， 10〃g/mlの PHA (Phytoheraagglutinin, Sigma 製） と共に 37 て、 5%C02 条件下、 4 日間培養した。 これらの一部は 4 日間の培養 後 PHA を含まない 2%牛胎児血清 （Moregate製） 含有 RPMI 1640培地に 再懸濁し、 さ らに 3 日間培養した。 これらの細胞を PBS (-)で洗浄し た後、 FACS 緩衝液 （2 %ゥ シ胎児血清、 0.1 %アジ化ナ ト リ ウム 含有 PBS( -)) で 25〃g/mlに希釈した抗丽 1.24抗体あるいはコ ン トロ ール抗体 100〃 1 を加え、 氷温下 30分イ ンキュベー ト した。
FACS緩衝液で洗浄した後、 25 g/mlの FITC標識ャギ抗マウス抗体 (GAM, Becton Dickinson 製） 100 1 を加え、 氷温下 30分間イ ン キュペー ト した。 FACS緩衝液で洗浄した後、 600 1 の FACS緩衝液 に懸濁し、 FACScan (Becton Dickinson製） で各細胞の蛍光強度を 測定した。 その結果、 図 2に示す通り、 PHA による T細胞の活性化 に伴って、 細胞上に HM1.24抗原が発現されるこ とが明らかとなった 。 さ らに図 3に示す通り、 活性化されて一旦発現した HM1.24抗原は 、 その後の培養によつて消失しないこ とが示された。
3. 抗 HM1.24抗体の PHA 刺激ヒ 卜 T 細胞幼若化反応に対する効果 精製 細胞を 2%牛胎児血清 （Moregate製） 含有 RPMI 1640培地に懸 濁し 96穴培養プレー ト中 1 X 105 cells/200〃 1/wellの細胞密度で 、 1 g/mlの PHA (Phytohemagglutinin, Sigma 製） 及び抗 HM1.24 抗体またはコ ン トロールマウス IgG2a 20 g/mlと共に 37°C、 5%C0 2 条件下、 4 日間培養し、 3H- チ ミ ジン （Amersham製） を 1〃 Ci/w ell 添加し、 4時間後の取り込みを ^ - カウ ンター （Pharmacia 製 ) で測定した。
その結果、 図 4 に示すように、 T 細胞は PHA 刺激による幼若化反 応により 3 H- チ ミ ジン取り込みは上昇し、 こ こにコ ン トロールマウ ス IgG2a 20 g/mlを加えても変化はなかったが、 HM1.24抗体 20 g/mlを加える と 3 H- チ ミ ジン取り込みの抑制が観察された。 従って 、 抗 HM1.24抗体は T細胞の活性化を抑制するこ とが示された。
参考例 1. マゥス抗 HM1.24モノ クローナル抗体産生ハィブリ ドー マの調製
Goto, T. et al. , Blood (1994) 84， 1992-1930 に記載の方法に て、 マウス抗 HM1.24モノ クローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製 した。
ヒ ト多発性骨髄腫患者骨髄由来の形質細胞株 KPC- 32 (lxlO7 個） (Goto, T. et al. , Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400 ) を BALB/Cマウス （チヤ一ルスリバ一製） の腹腔内に 6 週間おきに 2 回注射した。
このマウスを屠殺する 3 日前にマウスの抗体産生価をさ らに上昇 させるために、 1.5 X 106 個の KPC- 32をマウスの脾臓内に注射した (Goto, T. et al. , Tokushiraa J. Exp. Med. (1990) 37, 89 ) 。 マウスを屠殺した後に脾臓を摘出し、 Groth, de St. & Schreidegg erの方法 （Cancer Research (1981) 41, 3465 ) に従い摘出した脾 臓細胞と ミエ口一マ細胞 SP2/0 を細胞融合に付した。
KPC- 32を用いた Cell ELISA (Posner, M. R. et al. , J. Immunol . Methods (1982) 48, 23 ) によりハイプリ ドーマ培養上清中の抗 体のスク リ ーニングを行った。 5 X 104 個の KPC- 32を 50 ml の PBS に懸濁し、 96穴プレー ト （U 底型、 Corning 、 Iwaki 製） に分注し 37°Cで一晚風乾した。 1%ゥシ血清アルブミ ン （BSA ) を含む PBS で プロ ッ ク した後、 ハイブリ ドーマ培養上清を加え 4 にて 2 時間イ ン キュペー ト した。 次いで、 4 °Cにて 1 時間ペルォキシダ一ゼ標識抗 マウス IgG ャギ抗体 （Zymed 製） を反応させ、 洗浄後室温にて 30分 間 0-フヱニレ ンジア ミ ン基質溶液 （Sumitomo Bakelite 製） を反応 させた。
2N硫酸で反応を停止させ、 ELISA reader (Bio-Rad 製） で 492nm における吸光度を測定した。 ヒ ト免疫グロプリ ンに対する抗体を産 生するハイプリ ドーマを除去するために、 陽性ハイプリ ドーマ培養 上清をヒ ト血清にあらかじめ吸着させ、 他の細胞株に対する反応性 を EL I SA にてスク リ ーニングした。 陽性のハイプリ ドーマを選択し 、 種々 の細胞に対する反応性をフローサイ ト メ ト リ 一で調べた。 最 後に選択されたハイプリ ドーマクロー ンを二度クロー ン化し、 これ をプリ スタ ン処理した BALB/Cマウスの腹腔に注射して、 腹水を取得 した。
モノ クロ一ナル抗体は、 硫酸ァンモニゥムによる沈澱とプロティ ン A ァフ ィ 二ティ クロマ ト グラフィ ーキッ ト （ Ampure PA 、 Amersh am製） によりマウス腹水より精製した。 精製抗体は、 Qu i ck Tag F I TC結合キッ ト （ベー リ ンガーマンハイム製） を使用するこ とにより F ITC標識した。
その結果、 30のハイブリ ドーマク α —ンが産生するモノ クローナ ル抗体が KPC- 32および RPM I 8226 と反応した。 クローニングの後、 これらのハイブリ ドーマの培養上清と他の細胞株あるいは末稍血単 核球との反応性を調べた。
このうち、 3 つのクローンが形質細胞に特異的に反応するモノ ク ローナル抗体であった。 これらの 3 つのクローンのうち、 最もフロ —サイ ト メ ト リ 一分析に有用であり、 かつ RPM I 8226 に対する CDC 活性を有するハイプリ ド一マクローンを選択し、 HM1. 24と名付けた 。 このハイプリ ドーマが産生するモノ クローナル抗体のサブクラス を、 サブクラス特異的抗マウスゥサギ抗体 （Zymed 製） を用いた EL I SA にて決定した。 抗 HM1. 24抗体は、 I gG2a / のサブク ラスを有し ていた。 抗 HM1. 24抗体を産生するハイプリ ドーマ HM1. 24は、 工業技 術院生命工学工業研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 7 年 9 月 14日に FERM BP- 5233と してブ夕ぺス ト条約に基づき国 際寄託された。
参考例 2. ヒ ト型化抗 HM1. 24抗体の作製 ヒ ト型化抗 HM 1. 24抗体を下記の方法により得た。
参考例 1 で作製されたハイプリ ドーマ HM1. 24から、 常法によ り全 RNA を調製した。 これよりマウス抗体 V 領域をコ一 ドする cDNAをポ リ メ ラ一ゼ連鎖反応 （PCR ) 法および 5' -RACE 法により、 合成、 増 幅した。 マウス V 領域をコ一 ドする遺伝子を含む DNA 断片を得、 こ れらの DNA 断片を各々 プラス ミ ド pUC 系クロ一ニングベクターに連 結し、 大腸菌コ ンビテン ト細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た 。 この形質転換体から上記プラス ミ ドを得、 プラス ミ ド中の cDNAコ ― ド領域の塩基配列を常法に従い決定し、 さ らに各々の V 領域の相 補性決定領域 （CDR ) を決定した。
キメ ラ抗 HM1. 24抗体を発現するべク 夕一を作製するため、 それぞ れマウス抗 HM1. 24抗体 L 鎖および H 鎖の V 領域をコ一 ドする cDNAを HEF ベクターに挿入した。 また、 ヒ ト型化抗 HM1. 24抗体を作製する ために、 CDR 移植法によりマウス抗 HM1. 24抗体の V 領域 CDR をヒ ト 抗体へ移植した。 ヒ ト抗体の L 鎖と してヒ ト抗体 RE I のし 鎖を用い 、 ヒ ト抗体 H 鎮と してフ レームワーク領域 （FR) 1 -3 についてはヒ ト抗体 HG3 の Fm - 3 を用い FR4 についてはヒ ト抗体 JH6 の FR4 を用 いた。 CDR を移植した抗体が適切な抗原結合部位を形成するように H 鎖 V 領域の FRのァ ミ ノ酸を置換した。
このようにして作製したヒ ト型化抗 HM 1. 24抗体の L 鎖および H 鎖 の遺伝子を哺乳類細胞で発現させるために、 HEF ベクターに、 各々 の遺伝子を別々 に導入し、 ヒ ト型化抗丽 1. 24抗体の L 鎖または H 鎖 を発現するベクターを作製した。
これら二つの発現べクタ一を CH0 細胞に同時に導入するこ とによ り、 ヒ ト型化抗 HM 1. 24抗体を産生する細胞株を樹立した。 この細胞 株を培養して得られたヒ ト型化抗丽 1. 24抗体のヒ ト羊膜由来細胞株 W I SHへの抗原結合活性および結合阻害活性を、 Ce l l EL I SAにて調べ た。 その結果、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体は、 キメ ラ抗体と同等の抗原 結合活性を有し、 さ らにビォチン化マウス抗讓1.24抗体を用いた結 合阻害活性についても、 キメ ラ抗体あるいはマウス抗体と同等の活 性を有した。
なお、 キメ ラ抗 HM1.24抗体のし 鎖 V 領域および H 鎖 V 領域をコ一 ドする DNA を含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichia col i DH5a ( pUC19- 1.24L- g c ) および Escherichia coli DH5ひ ( pUC19-1.24H-gr 1 ) と して、 工業技術院生命工学工業技術研究所 (茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 8 年 8 月 29日に、 各 々 FERM BP-5646および FERM BP- 5644としてブダペス ト条約に基づき 国際寄託された。
また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の L 鎖 V 領域 aパージョ ン （配列番 号 ： 2 ) および H 鎖 V 領域 rバージ ョ ン （配列番号 ： 3 ) をコー ド する DNAを含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichia co 11 DH5ひ (pUC19-RVLa-AHM-g ) および Escheri chia coli DH5ひ ( pUC19-RVHr-AHM-gr 1 ) として、 工業技術院生命工学工業技術研究 所 （茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 8 年 8 月 29日に、 各々 FERM BP- 5645および FERM BP- 5643と してブダペス ト条約に基づ き国際寄託された。
また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の H 鎖 V 領域 sバー ジ ョ ン （配列番 号 ： 4 ) をコー ドする DNA を含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 cherichia coli DH5ひ ( pUC19- RVHs-AHM- g 7 Πと して、 工業技術院 生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3号） に、 平成 9年 （ 1997年） 9月 29日に FERM BP- 6127と してブダぺス ト条約 に基づき国際寄託された。
参考例 3. HM1.24 抗原蛋白質 cDNA のク ロ一ニング
抗 HM1.24抗体が特異的に認識する HM1.24抗原蛋白質をコー ドする cDNAをクローニングした。
1 . cDNA ライブラ リ 一の作製
1 ) 全 RNA の調製
ヒ 卜多発性骨髄腫細胞株 KPMM2 から、 全 RNA を Chirgwinら （Bioc hemistry, 18. 5294 ( 1979) ) の方法に従って調製した。 すなわち 、 2.2 X 108 個の KPMM2 を 20 ml の 4 M グァニジンチオシァネ一 卜 (ナカライテスク製） 中で完全にホモジナイズさせた。 ホモジネ一 卜を遠心管中の 5.3 M 塩化セシウム溶液に重層し、 次にこれを Beck man SW40口一夕一中で 31， OOOrpm にて 20°Cで 24時間遠心分離するこ とにより RNA を沈殿させた。
RNA 沈殿物を 70 %エタノ ールにより洗浄し、 そして 1 mM EDTA 及 び 0.5 % SDS を含有する 10 mM Tris-HCl (pH7.4 ) 300 1 中に溶 解し、 それに Pronase ( Boehr inger製） を 0.5 mg/ml となるように 添加した後、 37°Cにて 30分間イ ンキュべ一 卜 した。 混合物をフエノ —ル及びクロ口ホルムで抽出し、 RNA をエタノ ールで沈殿させた。 次に、 RNA 沈殿物を ImM EDTAを含有する 10 mM Tris-HCl (pH7.4 ) 200 1 に溶解した。
2 ) poly(A) +RNA の調製
前記のようにして調製した全 RNA の約 500 a g を材料と して Fast Track 2.0 mRNA Isolation Kit ( Inv i trogen製） を用いてキッ 卜 添付の処方に従って poly(A) + RNA を精製した。
3 ) cDNAラィブラ リ 一の構築
上記 poly(A) + RNA 10 g を材料と して cDNA合成キッ 卜 TimeSave r cDNA Synthesis Kit (Pharmacia 製） を用いてキッ 卜添付の処方 に従って二本鎖 cDNA を合成し、 更に Directional Cloning Toolbo x (Pharmacia 製） を用いてキッ 卜付属の EcoR Iアダプタ一をキッ 卜添付の処方に従って連結した。 EcoRi アダプターのカイ ネーショ ン及び制限酵素 Notl 処理はキッ 卜添付の処方に従って行った。 更 に、 約 500 bp 以上の大きさのアダプタ一付加二本鎖 cDNA を 1.5 % 低融点ァガロースゲル （Sigma 製） を用いて分離、 精製し、 ァダ プ夕ー付加二本鎖 cDNA 約 40 〃 1 を得た。
このようにして作製したアダプター付加二本鎖 cDNA を、 あらか じめ制限酵素 EcoRI、 Notl 及びアルカ リ フ ォ スフ ァ タ一ゼ （宝酒 造製） 処理した pCOSlベクタ一 （特願平 8 - 255196) と T4 DNA リ ガ —ゼ （GIBC0- BRL 製） を用いて連結し、 cDNAライブラ リ ーを構築し た。 構築した cDNA ライブラ リ ーは、 大腸菌細胞株 DH5ひ (GIBC0- BRし 製） に形質導入され、 全体のサイズは約 2.5 X 10s個の独立し たクロー ンである と推定された。
2. 直接発現法による クローニング
1 ) COS- 7 細胞への ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン
上記の形質導入した大腸菌約 5 X 105ク ロー ンを 50 g/ml の ア ン ピシ リ ンを含む 2- YT 培地 （Molecular Cloning: A Laborator y Mannual. Sambrook ら， Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989) ) にて培養する こ とによ り cDNA の増幅を行い、 アルカ リ 法 (Molecular Cloning： A Laboratory Mannual . Sambrook ら， Co Id Spring Harbor Laboratory Press ( 1989) ) により大腸菌から プラス ミ ド DNA を回収した。 得られたプラス ミ ド DNA は Gene P ulser 装置 （Bio- Rad 製） を用いてエレ ク ト口ポレーシ ヨ ン法によ り COS- 7細胞に ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン した。
すなわち、 精製したプラス ミ ド DNA 10 g を 1 X 107細胞 Zml で PBS中に懸濁した COS- 7細胞液 0.8 ml に加え、 1500 V、 25〃FD の容量にてパルスを与えた。 室温にて 10分問の回復期間の後、 エレ ク ト ロポレーシ ョ ン処理された細胞は、 10 %牛胎児血清 （GIBC0- BR し 製） を含む DMEM培養液 （GIBC0-BRL 製） にて、 37°C、 5 %C02の条 件下で 3 日間培養した。
2 ) パンニングディ ッ シュの調製
マウス抗 HM1.24抗体をコ一ティ ングしたパンニングディ ッ シュを 、 B. Seed ら （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (198 7)) の方法に従って調製した。 すなわち、 マウス抗 HM1.24抗体を 10 g/mlになるように 50 mM Tris-HCl (pH9.5 ) に加えた。 このよ う にして調製した抗体溶液 3 mlを直径 60 mm の細胞培養皿に加え、 室温にて 2 時間イ ンキュべ一 卜 した。 0.15 M NaCl 溶液にて 3 回洗 浄した後、 5 牛胎児血清、 1 mM EDTA 、 0.02 %NaN3を含む PBS を加 え、 ブロ ッキングした後、 下記ク ローニングに用いた。
3 ) cDNA ライブラ リ ーのク ロ一ニング
前述のように ト ラ ンスフ ヱ ク 卜 した C0S-7 細胞は、 5 mM EDTA を含む PBS にて剥がし、 5¾；牛胎児血清を含む PBS で一回洗浄した後 、 約 1 X 106細胞/ mlとなるよう に 5 牛胎児血清及び 0.02% NaN3を 含む PBS に懸濁し、 上記のように調製したパンニングデイ シュに加 え、 室温にて約 2 時間イ ンキュベー ト した。 5 % 牛胎児血清及び 0.02 %NaN3を含む PBS で 3度緩やかに洗浄した後、 0.6%SDS 及び 10 mM EDTAを含む溶液を用いてパンニングディ シュに結合した細胞か らプラ ス ミ ド DNAの回収を行った。
回収したプラス ミ ド DNAを再び大腸菌 DH5 αに形質導入し、 前述 のよう にプラス ミ ド DNA を増幅後、 アルカ リ法にて回収した。 回収 したプラス ミ ド DNAを COS- 7細胞にエレク トロポレーシ ヨ ン法によ り ト ラ ンスフ エク 卜 して前述と同様に結合した細胞よりプラス ミ ド DNA の回収を行った。 同様の操作を更に 1 回繰り返し、 回収したプ ラ ス ミ ド DNA を制限酵素 EcoRI および Not Iで消化した結果、 約 0.9 kbpのサイ ズのィ ンサー トの濃縮が確認された。
さ らに、 回収したプラス ミ ド DNA の一部を形質導入した大腸菌を 50 g/ml のア ン ピシ リ ンを含む 2- YTァガープレ一 卜に接種し、 一 晚培養後、 単一のコロニーよりプラス ミ ド DNA を回収した。 制限酵 素 EcoRI および Not 1にて消化し、 イ ンサー トのサイズが約 0.9 kbp を示すク ロー ン p3.19 を得た。
本ク ロ一ンについては、 PRISM, Dye Terminater Cycle Sequenci ngキッ ト （PerkinElmer 製） を用いて、 キッ 卜添付の処方に従い反 応を行い、 ABI 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer製） にて塩基配 列の決定を行つた。 この塩基配列および対応するァ ミ ノ酸配列を配 列番号 1 に示す。 産業上の利用可能性
抗 HM1.24抗体の処理により B細胞からの抗体産生抑制、 および T 細胞の幼若化の抑制が認められた。 これらのこ とから、 抗 HM1.24抗 体はリ ンパ球の活性化を抑制する効果を有することが示される。 特許協力条約第 13規則の 2 の寄託された微生物への言及及び寄託 機関
寄託機関 名 称 ： 工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 一 3 微生物 （ 1 ) 名称 ： Escherichia col i DH5a ( RS38-pUC19)
寄託番号 ： FERM BP- 4434
寄託日 ： 1993年 10月 5 日
( 2 ) 名称 ： ハイプリ ドーマ HM1.24
寄託番号 ： FERM BP- 5233
寄託日 ： 1995年 9 月 14日
( 3 ) 名称 ： Escherichia col i DH5a ( pUC19-RVHr-AHM-g r 1)
寄託番号 ： FERM BP- 5643 寄託日 ： 1996年 8月 29日
( 4 ) 名称 ： Escherichia col i DH5 a (pUC19-l.24H-g r 1) 寄託番号 ： FERM BP- 5644
寄託日 ： 1996年 8月 29日
( 5 ) 名称 ： Escherichia col i DH5 a (pUC19-RVLa-AHN-g
K )
寄託番号 ： FERM BP-5645
寄託日 ： 1996年 8月 29日
( 6 ) 名称 ： Escherichia col i DH5 (pUC19-l.24L-g κ
)
寄託番号 ： FERM BP- 5646
寄託日 ： 1996年 8月 29日
( 7 ) 名称 ： Escherichia coli DH5a ( UC19-RVHs-AHM-g
7 1)
寄託番号 ： FERM BP-6127
寄託日 ： 1997年 9月 29日
配列表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 1013
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎮
トポロジー ： 直線状
配列の種類 ： cDNA
配列
GAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC AGA 49
Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg
5 10 GTG CCC ATG GAA GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG ATA 97 Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu leu Leu Gly He
15 20 25
GGA ATT CTG GTG CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG ATT 145 Gly l ie Leu Val Leu Leu l ie l ie Val l ie Leu Gly Val Pro Leu l ie
30 35 40
ATC TTC ACC ATC AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT CGG 193 l ie Phe Thr lie Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg
45 50 55
GCA GTG ATG GAG TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG CTG 241 Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gin Gin Glu Leu
60 65 70
ACC GAG GCC CAG AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC ACC 289 Thr Glu Ala Gin Lys Gly Phe Gin Asp Val Glu Ala Gin Ala Ala Thr 75 80 85 90 £i:/86fcvJL>d OAV
Figure imgf000041_0001
配列の長さ ： 3 7 9
配列の型 ： 核酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
配列
ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Met Gly Trp Ser Cys lie l ie Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
-15 -10 -5
GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96 Val His Ser Asp l ie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
- 1 1 5 10
AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCT AGT CAG GAT GTG 144 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val
15 20 25
AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192 Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 30 35 40 45
CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGT GTG CCA AGC AGA 240 Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr l ie Ser Ser
65 70 75
CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAG CAA CAT TAT AGT 336 Leu Gin Pro Glu Asp l ie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Ser
80 85 90 ACT CCA TTC ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu l ie Lys
95 100 105
配列番号 ： 3
配列の長さ ： 4 1 8
配列の型 ： 核酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
配列
ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
-15 -10 -5
GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
- 1 1 5 10
CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
15 20 25
ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gin Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 30 35 40 45
GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser l ie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
50 55 60
CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288 Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
80 85 90
TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
95 100 105
TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
配列番号 ： 4
配列の長さ ： 4 1 8
配列の型 ： 核酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
配列
ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
-15 -10 -5
GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
- 1 1 5 10
CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
15 20 25
ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gin Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 30 35 40 45
0Ζ\ 9ΐΐ ΟΠ
J9s ass io 丄
8ΐ^ O VOX 33131033V 31003V 33V 000 WO 000001
90 ΐ 00 ΐ 96 j人丄 dsv 9Md 1 Ai9 λιο 3JV 8iy ηθ AIQ SJV ¾1V SAQ JAJ, JAX m 3V1 OVO 1113V13V1000909 VOO VOO Vll VOO VOV 0301013V1 IVl
06 98 08
¾1V dsv nio J3S V Π91 J9S J9S ngq nio 1 ¾1V J¾ 9SS 91933093V OVO 0V9131 VOV 013 OOV 30V 013 OVO OIV 3V1030 V3V
9Z O 99
s s sっ dsv ¾iv Ι¾Λ V 人 ID s 9 s uio
882 30V 03V 331 OVV OVO VOO 33V 31V 33V 310 VOV 300 OVV 311 OVV OVO
09 99 09
J3S V JMl dsv Ai dsy ^190Jd 8Md 911 S 13 1 dJ^ O Z 10V 3V1 OOV 13V IVO 100 IVO VOO 13311111V 131 VOO OIV 001 OVO 00/86df/I3d £I6i£/86 OW

Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列番号 1 に示されるァ ミ ノ酸配列を有する蛋白質に特異的 に結合する抗体を有効成分と して含有する、 リ ンパ球の活性化抑制 剤。
2. リ ンパ球が T細胞である、 請求項 1 に記載の抑制剤。
3. リ ンパ球が B細胞である、 請求項 1 に記載の抑制剤。
4. 抗体がモノ クローナル抗体である、 請求項 1 〜 3のいずれか 1 項に記載の抑制剤。
5. 抗体がヒ ト抗体定常領域を有する、 請求項 4 に記載の抑制剤
6. 抗体がキメ ラ抗体またはヒ ト型化抗体である、 請求項 4 又は 5 に記載の抑制剤。
7. 抗体が抗 HM1.24抗体である、 請求項 4 に記載の抑制剤。
8. 抗体がキメ ラ抗 HM1.24抗体である、 請求項 6 に記載の抑制剤 o
9. 抗体がヒ ト型化抗 HM1.24抗体である、 請求項 6 に記載の抑制 剤。
10. 抗体が抗 HM1.24抗体が認識するェピ トープと特異的に結合す る、 請求項 1 に記載の抑制剤。
11. 配列番号 1 に示されるア ミ ノ酸配列を有する蛋白質に特異的 に結合する抗体を有効成分として含有する、 リ ンパ球活性化関与疾 患の予防 · 治療剤。
12. リ ンパ球活性化関与疾患が自己免疫疾患、 臓器等移植時の拒 絶反応、 またはァレルギ一である、 請求項 1 1 に記載の予防 · 治療 剤。
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