WO1998038304A1 - Nouveau polypeptide, adn le codant et utilisation de ce polypeptide - Google Patents

Description

明 細 書 新規なポリペプチド、 そのポリペプチドをコードする DNA、 およびその用途 技術分野

本発明は、 ある種のヒトストロ一マ細胞株が産生する新規なポリペプチドおよ びそのボリペプチドをコードする塩基配列を有する DNAに関する。

さらに詳細に述べると、 ある種のヒトストローマ細胞株が産生する OAF 06 5 αおよび OAF 065 i3 (以下、 併せて OAF 065という。 ） と命名され た新規なポリペプチド、 それらポリペプチドの製造方法、 それらポリペプチドを コードする DNA、 それら DNAからなるベクター、 それらべクタ一で形質転換 された宿主細胞、 それらポリペプチドの抗体、 およびそれらポリペプチドまたは 抗体を含有する薬学的組成物に関する。 . 背景技術

骨髄ストローマ細胞は、 免疫系、 造血系等の骨髄微小環境を形作り、 それらの 幹細胞の増殖分化誘導に欠かせない因子、 例えば、 I L_7、 SCF、 I L- 1 1、 M— CSF、 G— CSF、 GM— CS F、 I L一 6、 TGF- L I F 等の因子を産生、 分泌していることが知られている。 また、 骨髄ストローマ細胞 のあるものは、 骨代謝に関与することが明かとなっている （Kenneth Dorshkind, Annu. Rev. Immunol. , 8, 113-137, 1990参照） 。 しかしながら、 これまでに 単離された因子群のみでは、 ストローマ細胞の役割を完全に担うことができない。 このことは、 まだ単離されていない因子が存在することを示唆している。 発明の開示

本発明者らはこの点に注目し、 ある種のスト口一マ細胞が産生している新規な 因子 （ポリペプチド） 、 特に分泌蛋白質および膜蛋白質に着目してそれを見出す ベく、 鋭意検討を行なった。

従来、 ある特定のポリペプチドまたはそれをコードする D N Aを得ようとする 場合、 組織や細胞培養液中に目的とする生物活性を確認し、 次いでポリペプチド の単離精製を経て、 遺伝子をクローニングする方法、 あるいはその生物活性を指 標として遺伝子を発現クローニングする方法が一般的に用いられていた。

しかし、 生体内生理活性ポリペプチドは、 多様な生物活性を有している場合が 多いので、 あるひとつの活性を指標にして遺伝子をクロ一ニングした結果、 それ が既知のポリぺプチドと同一であることが後になって判明するという事例が増え ている。 また、 骨髄ストローマ細胞が産生する因子は殆どのものが微量しか産生 されず、 そのことが単離、 精製および生物活性の確認を困難なものとしている。 近年、 c D N Aの作製技術やシークェンス技術は急速に発展し、 大量の c D N Aのシークェンスを迅速に行なうことができるようになった。 そこでこれらの技 術を利用して、 様々な細胞や組織から c D N Aライブラリ一を作製し、 ランダム に c D N Aをクローニングして塩基配列を決定し、 相当するポリぺプチドを発現 させた後、 その生理機能を解析していくという方法が発展しつつある。 この方法 は、 生化学的、 遺伝子学的な解析を一切必要とせずに遺伝子をクローニングし、 その塩基配列の情報を得ることができるという特徴を有しているが、 目的とする 遺伝子の発見は偶発的要素が大きい。

本発明者らは、 これまで造血系や免疫系で働く増殖分化因子の遺伝子のクロー ニングを研究してきた。 そして、 増殖分化因子 （例えば、 各種サイト力イン等） のような分泌蛋白質やそのレセプ夕一のような膜蛋白質 （以下、 これらをまとめ て分泌蛋白質等と呼ぶ。 ） の大部分がその N末端にシグナルペプチドと呼ばれる 配列を有していることに着目して、 シグナルべプチドをコ一ドする遺伝子を効率 的かつ選択的にクローニングする方法を鋭意検討した。 その結果、 動物細胞を用 いて、 シグナルペプチドの有無を簡単に検索できる方法 （シグナルシークェンス トラップ （S S T) 法） を見出した （特願平 6-13951号参照） 。 さらに同じ概念 のもとに、 酵母を用いてさらに大量かつ簡便にシグナルペプチドをコードする遺 伝子を単離する方法 （酵母 SST法） も開発された （米国特許第 5, 536， 637号参 照） 。

本発明者らは S S T法を用いて、 骨髄ストローマ細胞が産生している新規な膜 蛋白質およびそれをコードする DNAを見出すことに成功し、 本発明を完成した。 アミノ酸配列データベースのスイスプロット （Swiss Prot Release 33) に登 録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を調査した結果、 本発明のポリ ぺプチド OAF 065は未知であつたが、 I型の膜蛋白質で細胞外領域に腫瘍壊 死因子 （Tumor necrosis factor： TNF) 受容体ファミリ一に共通する C y S リッチ領域を有することが判明した （図 1) 。 このことから、 本発明のポリぺプ チドは TNF受容体ファミリ一に属する新規の膜蛋白質であることが示された。 図面の簡単な説明

図 1は本発明ポリペプチドである OAF 065と他の TNF受容体ファミリーの アミノ酸配列を比較した図である。 図中、 hTNFRlはヒト腫瘍壊死因子受容 体 1を表わし、 hTNFR 2はヒト腫瘍壊死因子受容体 2を表わし、 hNGFR はヒト神経成長因子受容体を表わし、 hFa sはヒト Fa sを表わす。 発明の詳細な説明

本発明は、

(1) 配列番号 1または 5で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、

(2) 前記 （1) に記載したポリペプチドをコードする DNA、

(3) 配列番号 2または 6で示される塩基配列を有する D N A、

( 4 ) 配列番号 3または 7で示される塩基配列を有する D NA、

に関する。

さらに詳しく述べると、 本発明は実質的に純粋な形である配列番号 1または 5 で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 そのホモローグ、 その配列のフ ラグメントおよびそのホモローグからなるポリペプチドに関する。 本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードする D NAに関する。 より具体 的には、 配列番号 2、 3、 6または 7で示される塩基配列を有する D N A、 およ び配列番号 2、 3、 6または 7で示される塩基配列に選択的にハイブリダィズす るフラグメントを有する D N Aに関する。

実質的に純粋な形である配列番号 1または 5で示されるアミノ酸配列を有する ポリペプチドとは、 一般に生産時のポリペプチドの 9 0 %以上、 例えば 9 5、 9 8または 9 9 %が配列番号 1または 5で示されるアミノ酸配列を有するポリぺプ チドであることを意味する。

配列番号 1または 5で示されるァミノ酸配列からなるポリペプチドのホモロー グとは、 一般に少なくとも 2 0個、 好ましくは少なくとも 3 0個、 例えば 4 0、 6 0または 1 0 0個の連続したアミノ酸領域で、 少なくとも 7 0 %、 好ましくは 少なくとも 8 0または 9 0 %、 より好ましくは 9 5 %以上相同性であるものであ り、 そのようなホモローグは、 以後本発明のポリペプチドとして記載される。 さらに、 配列番号 1または 5で示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドの フラグメント、 またはそれらのホモローグのフラグメントとは、 少なくとも 1 0 アミノ酸、 好ましくは少なくとも 1 5アミノ酸、 例えば 2 0、 2 5、 3 0、 4 0、 5 0または 6 0アミノ酸部分を意味する。

配列番号 2、 3、 6または 7で示される塩基配列を有する D N Aに選択的にハ イブリダィズする D NAとは、 一般に少なくとも 2 0偭、 好ましくは少なくとも 3 0個、 例えば 4 0、 6 0または 1 0 0個の連続した塩基配列領域で、 少なくと も 7 0 %、 好ましくは少なくとも 8 0または 9 0 %、 より好ましくは 9 5 %以上 相同性であるものであり、 そのような D NAは、 以後本発明の D N Aとして記載 される。

配列番号 2、 3、 6または 7で示される塩基配列を有する D N Aのフラグメン トとは、 少なくとも 1 0塩基、 好ましくは少なくとも 1 5塩基、 例えば 2 0、 2 5、 3 0または 4 0塩基部分を意味し、 そのようなフラグメントも本発明の D N Aに含まれる。 さらに、 本発明には、 本発明の D N Aからなる複製または発現べクタ一が含ま れる。 ベクターとしては、 例えば、 o r i領域と、 必要により上記 D NAの発現 のためのプロモー夕一、 プロモ一夕一の制御因子などからなるプラスミド、 ウイ ルスまたはファージベクタ一が挙げられる。 ベクターはひとつまたはそれ以上の 選択的マーカ一遺伝子、 例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。 ベ クタ一は、 イン ' ビトロ （in vitro) において、 例えば D NAに対応する R NA の製造、 宿主細胞の形質転換に用いることができる。

さらに、 本発明には、 配列番号 2、 3、 6または 7で示される塩基配列、 また はそれらのオープンリ一ディングフレームを有する D N Aを含む本発明の D N A を複製または発現させるためのベクタ一で形質転換された宿主細胞も含まれる。 細胞としては、 例えば細菌、 酵母、 昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。 さらに、 本発明には、 本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、 本 発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含ま れる。 培養は、 本発明のポリペプチドが発現し、 宿主細胞より製造される条件下 で行なわれることが好ましい。

本発明の D NAは、 上記のようなベクタ一のアンチセンス領域に挿入すること でアンチセンス R N Aを製造することもできる。 このようなアンチセンス R N A は、 細胞中の本発明のポリぺプチドのレベルを制御することに用いることもでき る。

本発明は、 本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナ ル抗体も含む。 さらに本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリ クローナル抗体の製造方法も含む。 モノクローナル抗体は、 本発明のポリべプチ ド、 またはその断片を抗原として用い、 通常のハイプリドーマの技術により製造 することができる。 ポリクローナル抗体は、 宿主動物 （例えば、 ラットやゥサギ 等） に本発明のポリペプチドを接種し、 免疫血清を回収する通常の方法により製 造することができる。

本発明には、 本発明のポリペプチド、 その抗体と薬学的に許容される賦形剤お よび zまたは担体を含有する薬学的組成物も含まれる。

(1) の本発明のポリペプチドとしては、 配列番号 1または 5で示されたアミ ノ酸配列を有するもの以外に、 その一部が欠損したもの （例えば、 配列番号 1中、 生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド等） 、 その一部が他のァ ミノ酸と置換したもの （例えば、 物性の類似したアミノ酸に置換したもの） 、 お よびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。

よく知られているように、 ひとつのアミノ酸をコードするコドンは 1〜 6種類 (例えば、 Me tは 1種類、 Le uは 6種類） 知られている。 従って、 ポリぺプ チドのァミノ酸配列を変えることなく DNAの塩基配列を変えることができる。

(2) で特定される本発明の DN Aには、 （1) の配列番号 1または 5で示さ れるポリぺプチドをコ一ドするすべての塩基配列群が含まれる。 塩基配列を変え ることによって、 ポリペプチドの生産性が向上することがある。

(3) で特定される DNAは、 （2) で示される DNAの一態様であり、 天然 型配列を表わす。

(4) に示される DNAは、 （3) で特定される DNAに天然の非翻訳部分を 加えた配列を示す。

配列番号 3で示される塩基配列を有する DN Aの作製は、 以下の方法に従って 行なわれる。

はじめに酵母 SST法 （米国特許第 5， 536, 637号に記載） の概要について説明 する。

サッカロマイセス ·セレピシェ (Saccharomyces cerevisiae) などの酵母がシ ョ糖またはラフィノースをエネルギー源や炭素源として利用するためにはインべ ル夕一ゼを培地中に分泌しなければならない （インベル夕一ゼはラフィノースを ショ糖とメリビオースに、 ショ糖をフルクト一スとグルコースに分解する酵素で ある。 ） 。 また、 数多くの既知の哺乳類のシグナルシークェンスは酵母のィ ル夕一ゼを分泌させ得ることが知られている。 これらの知見から、 酵母のィ ルターゼの分泌を可能にする新規のシグナルシ一クエンスを哺乳類の c DNAラ ィブラリーからラフイノ一ス培地上での酵母の生育を指標にスクリ一ニングする 方法として本方法は開発された。

翻訳開始点 ATG を削除した非分泌型のインベル夕一ゼ遺伝子 SUC 2 (GENBANK accession No. V01311) を、 酵母の発現べクタ一 （発現用プロモータ 一 （ADHプロモ一夕一） およびタ一ミネ一夕一 （ADH夕一ミネ一夕一） は A AH 5プラスミド （Gammerer, Methods in Enzyraol. , 101, 192-201, 1983) 由来 で、 酵母複製起点は 2 / o r i、 酵母選択マーカーには TRP 1、 大腸菌複製 起点は C o 1 E 1 o r i、 大腸菌薬剤耐性マ一カーにはアンピシリンが使用さ れている。 ） に組み込んで酵母 S ST用べクタ一 p SUC 2を作製した。 その S UC 2遺伝子の上流に哺乳類の cDN Aを組み込んで、 酵母 SSTcDNAライ ブラリ一を調製した。 このライブラリ一を分泌型ィンベルターゼを欠損している 酵母に形質転換した。 組み込まれた哺乳類 c DNAがシグナルシークェンスをコ ードしている場合、 酵母で発現されたインベル夕一ゼに対しても分泌作用をもつ と考えられ、 その結果ラフイノ一ス培地上での生育が可能となる。 よって出現し たコロニーから酵母を培養してプラスミドを調製し、 インサート DNAの塩基配 列を決定することによって、 新規シグナルシークエンスの検索を迅速かつ容易に した。

酵母 S STcDNAライブラリーの作製は、

(1) 対象となる細胞より mRN Aを単離し、 特定の制限酵素 （酵素 I) サイト を連結したランダムプライマ一を用いて二本鎖 DN Aを合成し、

(2) 酵素 Iとは異なる特定の制限酵素 （酵素 II) サイトを含むアダプタ一を 連結して、 酵素 Iで消化した後、 適当なサイズで分画し、

(3) 酵母発現ベクター内のシグナルペプチドを削除したインベル夕ーゼ遺伝子 の上流に得られた cDN A断片を連結し、 形質転換する工程よりなる。

各工程を詳しく説明すると、 工程 （1) では、 対象となる哺乳類の臓器や細胞 株などより、 必要により適当な刺激剤で刺激した後、 公知の方法 （以下、 公知の 方法は特に記載がなければ Molecular Cloning (Sambrook, J.， Fritsch, E. F. および Maniatis, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989年に 発干 lj) または Current Protocol in Molecular Biology (F. . Ausubelら編、 John Wiley & Sons, Inc. より発干リ）に記載の方法に従って行なわれる。 ） に従 つて mRN Aの単離が行なわれる。

対象となる細胞としては、 HAS 303 (ヒト骨髄スト口一マ細胞株：東京医 科大学第一内科外山圭助教授、 相沢信助手より供与。 J. Cell. Physiol. , Η8, 245-251, 1991 および Experimental Hematol.， 22, 482-487, 1994 に記載） ま たは HUVEC (ヒトさい帯静脈血管内皮細胞： ATCC No. CRL-1730) が挙げられ る。 ランダムプライマ一を用いる二本鎖 c DNAの合成は公知の方法により行な われる。

アダプターに連結される制限酵素 （酵素 I) サイトと次の工程 （2) で用いら れる制限酵素 （酵素 II) サイトは、 互いに異なるものであれば何を用いてもよ レ^ 好ましくは、 酵素 Iとして E C OR 酵素 IIとしては Xh o Iが用いら れる。

工程 （2) では T 4 DNAポリメラ一ゼで末端を平滑化し、 酵素 IIアダプタ 一を連結した後、 酵素 Iで消化ァガロース電気泳動 （AGE) により 300〜8 00 b pの c DNAを分画する。 酵素 IIは、 前記したように酵素 Iと異なるも のなら何でもよい。

工程 （3) は、 酵母発現用プラスミドベクターに連結されたシグナルペプチド を削除したインベルタ一ゼの遺伝子の上流に （2) で得られた cDNA断片を組 み込んで大腸菌に形質転換する工程である。 ここで酵母発現用プラスミドベクタ 一としては種々のものが知られているが、 例えば大腸菌内でも機能する YE p 2 4などが用いられる。 好適には前述したプラスミド p SUC 2が用いられる。 形質転換のための宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られており、 好ましく は DH 10 Bのコンビテントセルである。 また形質転換方法は公知のいずれを用 いてもよいが、 好ましくはエレクトロボレ一シヨン法により行なわれる。 形質転 換体は常法により培養され、 酵母 S ST用の cDNAライブラリ一が得られる。 この c D NAライブラリ一は、 すべてのクロ一ンが該断片を含んでいる訳では ないし、 またすべてが未知の （新規の） シグナルペプチドをコードする遺伝子断 片とは限らない。 そこで、 次に該ライブラリーから未知のシグナルペプチドをコ 一ドする遺伝子断片をスクリーニングする必要がある。

すなわち、 c D N Aライブラリ一をインベル夕ーゼ遺伝子をもたない酵母サッ カロマイセス 'セレピシェ (Saccharomyces cerevisiae) (例えば、 Y T 4 5 5 株など） またはインベル夕一ゼ遺伝子を人為的に欠損させた株 （公知の方法に従 い作製可能） を用いることができる。 酵母の形質転換は公知の方法、 例えば酢酸 リチウム法によって行なわれる。 形質転換体を選択培地で生育後、 ラフイノース を炭素源とする培地に移し、 生育可能なコロニーを選択し、 プラスミドを回収す る。 ラフイノースを炭素源として酵母が生育したということは、 ライブラリ一中 に何らかの分泌蛋白質のシダナルぺプチドが組み込まれていたことを示している。 次に、 単離した陽性クローンについて、 塩基配列を決定し、 未知の蛋白質をコ —ドすることが明らかになった c D N Aについては、 それをプローブとして全長 クローンを単離し、 全長の塩基配列を決定することができる。 これらの操作は、 当業者にとつてすベて公知の方法で行なわれる。

配列番号 2、 3、 6または 7で示される塩基配列が、 一部、 好ましくは全てが 確定されると哺乳類に存在する本発明のポリペプチドをコードする D N Aもしく は本発明ポリペプチドのホモローグおよびサブセットをコードする D N Aを得る ことができる。 適当な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、 それを用 いて哺乳類由来の c D N Aライブラリーあるいは mR N Aから P C R法により、 あるいは適当な塩基配列の断片をプロ一ブとしてハイブリダィズさせることによ り、 他の哺乳類 c D NAライブラリーあるいは該ゲノムライブラリーから、 他の 哺乳類型の当該ポリペプチドをコードする D N Aを得ることができる。

このようにして得られた c D NAが、 S S Tで得られた c D NA断片の塩基配 列 （またはその相同配列） を含んでいるならばシグナルシークェンスをコードし ていることになるので、 該 c D NAが全長、 またはほぼ全長であることは明らか である （シグナルシークェンスは例外なく蛋白質の N末端に存在することから、 c DN Aのオープンリーディングフレームの 5 ' 末端にコードされている。 ） 。 さらに、 公知の方法に従い該 C DN Aをプローブとしてノザン （Northern) 解 析によつて全長の確認ができる。 ハイブリダィズしたバンドから得られる m R N Aのサイズと該 c DN Aのサイズを比較し、 ほぼ同じであれば該 cDNAはほぼ 全長であると考えられる。

配列番号 2、 3、 6または 7で示される塩基配列が一旦確定されると、 その後 は、 化学合成によって、 あるいは該塩基配列の断片を化学合成し、 これをプロ一 ブとしてハイブリダイズさせることにより、 本発明の D N Aを得ることができる。 さらに、 本 DNAを含有するベクター DNAを適当な宿主に導入し、 これを増殖 させることによって、 目的とする DNAを必要量得ることができる。

本発明のポリペプチドを取得する方法としては、

(1) 生体または培養細胞から精製単離する方法、

(2) ペプチド合成する方法、 または

(3) 遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、

などが挙げられるが、 工業的には （3) に記載した方法が好ましい。

遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系 （宿主一べ クタ一系） としては、 例えば、 細菌、 酵母、 昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現 系が挙げられる。

例えば、 大腸菌で発現させる場合には、 成熟蛋白部分をコードする DNAの 5' 末端に開始コドン （ATG) を付加し、 得られた DNAを、 適当なプロモ —ター （例えば、 t r pプロモータ一、 l a cプロモータ一、 APLプロモ一 夕一、 T 7プロモーター等） の下流に接続し、 大腸菌内で機能するベクター （例 えば、 pBR322、 pUC 18、 pUC 19等） に挿入して発現べクタ一を作 製する。

次に、 この発現べクタ一で形質転換した大腸菌 （例えば、 E. Coli DH1、 E. Coli JM109、 E. Coli HB 101株等） を適当な培地で培養して、 その菌 体より目的とするポリペプチドを得ることができる。 また、 バクテリアのシグナ ルペプチド （例えば、 p e 1 Bのシグナルペプチド） を利用すれば、 ペリプラス' ム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。 さらに、 他のポリぺプ チドとのフュージョン ·プロテイン （fusion protein) を生産することもできる。 また、 哺乳動物細胞で発現させる場合には、 例えば、 配列番号 3または 7で示 される塩基配列をコードする DNAを適当なベクター （例えば、 レトロウイルス ベクタ一、 パピローマウィルスベクタ一、 ワクシニアウィルスベクタ一、 SV4 0系ベクター等） 中の適当なプロモータ一 （例えば、 SV40プロモーター、 L TRプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター等） の下流に揷入して発現べ クタ一を作製する。 次に、 得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞 （例えば， サル COS— 7細胞、 チャイニーズハムスター CHO細胞、 マウス L細胞等） を 形質転換し、 形質転換体を適当な培地で培養することによって、 その細胞膜上に 目的とするポリペプチドが発現される。 さらに配列番号 3または 7で示される塩 基配列をコードする DN Aの膜貫通領域を欠いた欠失体を上記べクタ一に挿入し、 これを用いて適当な哺乳類動物細胞を形質転換することによって、 その培養液中 に目的とする可溶性ポリペプチドが分泌される。 以上のようにして得られたポリ ぺプチドは、 一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。 産業上の利用可能性

本発明のポリペプチド OAF 065は TNF受容体ファミリ一に属する一群の 蛋白質と有意な相同性を示した。 TNF受容体ファミリーに属する蛋白質は細胞 外ドメインに 6つの Cy s残基を含む繰り返し構造を 3〜6つもつ I型の膜蛋白 質で、 そのリガンドとの相互作用により、 様々な細胞の増殖、 分化、 細胞死とい つた現象に関わっていることが明らかとなっている （Craig A. Smith et. al. , Cell, 76, 959-962， 1994) 。

例えば、 神経成長因子 （NGF) 受容体 ZNGFは各種の神経系の細胞の生存 維持、 神経突起の伸長、 神経伝達物質の合成促進に必須である （Chao M.V., J. Neurobiol. , 25, 1373 - 1385， 1994) 。 F a s /F a s Lはそのアポト一シス誘 導活性を介して癌細胞の破壊や自己反応性リンパ球の除去といった生体の恒常性 維持に必須であるとともに、 A I D Sにおける C D 4陽性 T細胞の減少、 劇症肝 炎、 移植後の移植片対宿主 （GVHD) 、 各種の自己免疫疾患の発症に関与して いる （Nagata S. et. al. Science, 267, 1449 - 1456， 1995) 。 CD40/CD 40 Lは TZB細胞間相互作用を介して B細胞の活性化 （増殖および抗体産生促 進） に必須である （Banchereau J. et. al. Annu. Rev. Immunol. , 12, 881-922, 1994) 。 TNF受容体/ TNFおよびリンホトキシン （ 丁）受容体/1^丁は各 種免疫 ·造血細胞の増殖、 活性化、 分化誘導、 腫瘍細胞の細胞障害、 増殖抑制、 各種結合組織 （血管内皮細胞、 線維芽細胞、 骨芽細胞等） の増殖、 活性化、 ウイ ルス増殖抑制等の作用を有するとともに、 リンパ組織の形態あるいは器官形成に も必須しあ o (Ware C. F. et al. Curr. Topics Microbiol. Immunol. , 198， 175-218, 1995) 。

本発明のポリぺプチドも細胞外ドメインに C y sの繰り返し構造が 3力所存在 することから、 新規の TNF受容体ファミリーに属する蛋白質であり、 既知また は未知の TNFファミリ一に属するリガンドを介して作用することは明白である。 したがって、 本発明のポリペプチドおよびそれをコードする cDN Aは、 造血 · 免疫 ·神経系細胞の分化、 増殖、 成長、 生存維持または細胞死、 免疫系の機能、 腫瘍の増殖、 成長あるいは炎症、 骨代謝等に関連した一つまたはそれ以上の効果 あるいは生物活性 （以下に列挙するアツセィに関連するものを含む） を示すこと が考えられる。 本発明のポリぺプチドに関して記述される効果あるいは生物活性 は、 そのポリペプチドの投与あるいは使用により、 あるいはそのポリペプチドを コードする cDNAの投与あるいは使用 （例えば、 遺伝子治療や cDNA導入に 適したベクター） により提供される。

( 1 ) サイトカイン活性および細胞増殖ノ分化活性

本発明のポリペプチドは、 サイト力イン活性および細胞増殖 （誘導あるいは阻 害） /分化活性 （誘導あるいは阻害） を示す可能性、 あるいはある細胞集団に他 のサイトカインの産生を誘導あるいは抑制すると考えられる。 全ての既知のサイ トカインを含む、 現在発見されている多くの蛋白性因子は、 因子に依存した一つ あるいはそれ以上の細胞増殖アツセィ法で、 活性を示してきたので、 それらのァ ッセィは、 サイトカイン活性の便利な確認法として機能する。 本発明のポリぺプ チドの活性は、 多くの従来の因子依存性の細胞株の細胞増殖ァッセィのうちのい ずれかによつて証明され得る。

( 2 ) 免疫刺激 Z抑制活性

本発明のポリべプチドは、 免疫刺激活性および免疫抑制活性を示すと考えられ る。 また、 本発明のポリペプチドは、 例えば Tリンパ球および Bリンパ球あるい はどちらか一方の成長および増殖を制御 （刺激あるいは抑制） することや、 同様 に N K細胞や他の集団の細胞傷害性活性に影響を与えることによって、 様々な免 &:小全および ¾ (severe combined immunodeficiency ( S C I D) を la.む) の 治療に効果を示すと考えられる。 これらの免疫不全は遺伝性である場合もあるし、 (例えば H I Vのような） ウィルスや、 同様に細菌やカビの感染が原因で起こる 場合もある。 あるいは、 自己免疫疾患から由来する可能性もある。 より特殊な場 合に、 H I V、 干炎ウィルス （h印 atitis viruses)、 ヘルぺスウィルス （herpes viruses ) 、 マつ コノ クアリ ア ( mycobacteria ) 、 リ一ンュマニゾ' (leishmania) 、 マラリア （malaria) およびカンジダ （Candida) のような様々 なカビ感染を含むウィルス、 細菌、 カビあるいは他の感染による感染症の原因を、 本発明のポリペプチドを用いることによって治療できると考えられる。 もちろん、 この関連より、 本発明のポリペプチドは、 免疫システムが増大していることが一 般的に示唆される場所、 すなわち癌治療の箇所において効果を示すと考えられる。 本発明のポリぺプチドは、 ァレルギ一反応および喘息や他の呼吸器系疾患のよ うな状況の治療にも効果を示すと考えられる。 免疫抑制が望まれるような他の状 態 （例えば、 喘息や関連呼吸器疾患を含む。 ） にも、 本発明のポリペプチドを用 いて治療できると考えられる。

本発明のポリペプチドは、 例えば （敗血病性のショックあるいは全身性炎症反 応症候群 （S I R S ) のような） 感染、 炎症性大腸炎、 クローン病、 あるいは

( I L— 1 1により証明された効果のような） T N Fや I L一 1のようなサイト 力インの過剰産生から由来するような感染に関連した慢性あるいは急性の炎症を 抑制する可能性もある。

( 3 ) 造血細胞制御活性

本発明のポリペプチドは、 造血細胞の制御に、 またそれに応じて骨髄球様細胞 あるいはリンパ球様細胞の欠乏に対する治療にも効果を示すと考えられる。 コロ 二一形成細胞あるいは因子依存性細胞株の援助の下での極く弱い生物活性でさえ も、 造血細胞の制御に係わることを示唆する。 その生物活性とは、 次に挙げる例 の全てあるいはそのいずれかで例えられるようなものに係わるものである。 赤血 球前駆細胞のみの （成長および） 増殖を支持、 あるいは他のサイト力インとの組 み合わせ、 また、 それが示唆する有効性、 例えば様々な貧血の治療、 あるいは赤 血球前駆細胞および赤血球あるいはそのどちらかの産生を刺激する放射線療法 Z 化学療法と組み合わせての使用；顆粒球および単球 Zマクロファージのような骨 髄球の （成長および） 増殖を支持 （すなわち、 古典的な C S F活性） 、 化学療法 に伴う骨髄抑制を防ぐための化学療法との併用；巨核球の （成長および） 増殖お よびそれに続く血小板の （成長および） 増殖の支持、 それによつて血小板減少症 のような様々な血小板障害を防御および治療を可能とする血小板輸血の際あるい は相補的な一般的使用；前記造血細胞の幾つかあるいは全ての細胞へ成熟可能な 造血幹細胞の （成長および） 増殖の支持、 従って、 様々な幹細胞障害 （限定はさ れないが、 再生不良性貧血および発作性夜間血色素尿症を含む、 移植で一般的に 治療されるようなもの） に治療的効果を見い出せる、 また、 正常細胞あるいは遺 伝子療法のため遺伝的に操作された細胞をイン ·ビトロ （in vitro) あるいはェ キソ ·ビポ （ex vivo) (すなわち、 骨髄移植に伴う） どちらかで、 放射線療法 Z化学療法後の幹細胞分画の再構築を行うことも同様である。

本発明のポリペプチドは、 他の方法の中で、 以下の方法により測定することが 可能である。 ( 4 ) 組織生成/修復活性

本発明のポリペプチドは、 損傷治癒および組織修復、 また、 火傷、 切開、 およ び潰瘍の治療と同様に、 骨、 軟骨、 腱、 靭帯、 および神経組織成長あるいは再生 のいずれかに使用されると考えられる。

骨を正常に形成しない環境での軟骨および骨あるいはいずれかの成長を誘導す るような本発明のポリペプチドは、 ヒトおよび他の動物の骨折および軟骨損傷あ るいは欠損の治癒に適用される。 また、 本発明のポリペプチドを使用する製剤は、 開放骨折と同様に閉鎖骨折の整復、 また人工関節の固定の改良や、 予防的使用に も有効であると考えられる。 骨形成剤により誘導された新生骨形成は、 先天性、 外傷性、 癌切除術により誘発した頭蓋顔面の欠損の修復に貢献する。 また、 美容 形成外科分野にも有効である。

本発明のポリペプチドは、 歯根膜症の治療および他の歯の修復にも使用される と考えられる。 そのような薬品は、 骨形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖を刺 激し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 本発明のポ リペプチドは、 骨および軟骨あるいはいずれかの修復を刺激することを通して、 あるいは、 炎症あるいは炎症過程で介される組織破壊 （コラゲナ一ゼ活性や破骨 細胞の活性） の過程を阻止することにより、 骨粗鬆症および骨関節炎の治療に有 効であると考えられる。

本発明のポリペプチドに起因すると考えられる組織再生活性の別のカテゴリー は腱 Z靭帯形成である。 本発明のポリペプチドは、 腱 靭帯様組織あるいは他の 組織が正常に形成されない環境でそのような組織形成を誘導するものであるが、 ヒトおよび他の動物における腱ノ靭帯の裂傷、 奇形、 および他の腱 Z靭帯の障害 の治癒に適用できる。 腱 Z靭帯様組織を誘導するポリペプチドを使用する製剤は、 骨あるいは他の組織への腱 Z靭帯の固定の改良、 および腱/靭帯組織の欠損の修 復での使用はもちろん、 腱あるいは靭帯の損傷の防御に対する予防的使用も考え られる。 本発明の構成物により誘導された新生腱 Z靱帯様組織形成は、 先天性、 外傷、 あるいは他の起源の腱あるいは靱帯欠損の修復に貢献する。 また、 腱ある いは靭帯の貼付あるいは修復という美容形成外科でも有効である。 本発明の構成 物は、 腱/靭帯形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖を刺激し、 その前駆細胞の 分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 あるいは、 組織修復を果たすため イン ·ビボ （in vivo) への返還に備えてェキソ ·ビボ （ex vivo) で腱/靭帯細 胞あるいはその前駆細胞を誘導する。 本発明の構成物は、 腱炎、 手根トンネル症 候群 （Carpal tunnel syndrome) 、 および他の腱あるいは靭帯欠損の治療にも有 効である。 本発明の構成物には、 適当なマトリックスおよびキャリア一と同様に 当業者に良く知られている錯化 （Sequestering) 剤も含まれる。

本発明のポリペプチドは、 神経細胞の増殖、 および、 神経および脳組織の再生、 すなわち、 神経細胞あるいは神経組織に対する変性、 死、 あるいは外傷を含む機 械的および外傷的障害と同様に中枢および末梢神経系疾患および神経病の治療に 対しても、 効果を示すと考えられる。 より特異的には、 本発明のポリペプチドは、 末梢神経障害、 末梢神経症、 および局所的神経症のような末梢神経系の疾患、 お よびアルツハイマー病、 パーキンソン病、 ハンチントン病、 筋萎縮性側策症 (amyotrophic lateral) , およびシャイ—ドレ一ガ一 （Shy— Drager) 症候群のよ うな中枢神経系の疾患の治療に有効であると考えられる。 さらに本発明に応じて 治療され得る条件には、 脊髄障害、 頭部外傷、 および脳卒中等の脳血管疾患のよ うな機械的および外傷的障害を含む。 化学療法あるいは他の治療から起因する末 梢神経症も本発明のポリペプチドを用いて治療可能である。

本発明のポリペプチドは、 （例えば膝臓、 肝臓、 腸、 腎臓、 皮膚、 内皮を含め た） 臓器、 （平滑、 骨格あるいは心臓） 筋肉、 および （血管内皮を含めた） 血管 組織のような他の組織を生成する活性、 あるいはそのような組織を構成する細胞 の増殖を促進する活性を示す可能性も期待される。 望まれる効果の一部は、 正常 組織を再生させる繊維性瘢痕 (scarring) の阻害によっても担われると考えられ る。

本発明のポリペプチドは、 消化管保護あるいは再生、 および肺あるいは肝臓の 繊維化、 様々な組織の再還流損傷、 および全身性サイト力イン障害に起因する状 態に対する治療にも有効であると考えられる。 本発明のポリペプチドは、 ァクチビン Zインヒビンに関連した活性を示すと考 えられる。 ァクチビンは濾胞刺激ホルモン （F S H) の放出を刺激する活性によ つて特徴づけられるが、 インヒビンは、 濾胞刺激ホルモン （F S H) の放出を阻 害する活性によって特徵づけられる。 よって、 本発明のポリペプチドは、 単独あ るいはインヒビン aファミリ一のメンバ一とのへテロダイマーで、 哺乳類動物の 雌の受精率を減少させ、 雄の精子形成を減少させるィンヒビンの活性に基づく避 妊調節剤として有効であると考えられる。 充分量の他のィンヒビンの投与によつ て、 哺乳動物の不妊を誘導可能である。 一方、 本発明のポリペプチドは、 インヒ ビン bグループの他の蛋白質サブュニットとのホモダイマーあるいはヘテロダイ マーで、 前脳下垂体の細胞から F S Hの放出を刺激するァクチビン分子の活性に 基づいた治療的な不妊誘導として有効であると考えられる （米国特許第 4, 798, 885号を参照） 。 本発明のポリペプチドは、 牛、 羊、 および豚のような家 畜の生涯出産能力可能な期間を延ばすために、 性的に未熟な哺乳類動物における 妊娠開始を早めることに有効であると考えられる。

( 6 ) 走化性/化学運動性活性

本発明のポリペプチドは、 例えば、 単球、 好中球、 T細胞、 マスト細胞、 好酸 球、 および内皮細胞、 あるいはそのいずれかを含む、 哺乳動物の細胞に対して (例えば、 ケモカインとして働く） 走化性/化学運動性蛋白質を有すると考えら れる。 走化性 化学運動性蛋白質は、 反応の望まれる部位へ、 望まれる細胞集団 を固定化あるいは引き寄せるため使用されることが可能である。 走化性/化学運 動性蛋白質は、 局所的な感染と同様に、 創傷および他の外傷の治療に特別な優位 性を提供する。 例えば、 リンパ球、 単球、 あるいは好中球を腫瘍あるいは感染部 位へ引き寄せることは、 腫瘍あるいは感染部位に対する免疫応答を改善する結果 となると考えられる。

蛋白質やペプチドは、 もしそれが直接あるいは間接的に特殊な細胞集団に対し て指示された方向あるいは運動を刺激可能であれば、 そのような細胞集団に対す る走化性活性を保持している。 望ましくは、 その蛋白質やペプチドは、 細胞の指 示された運動を直接的に刺激する活性を保持する。 特別な蛋白質がある集団の細 胞に対し走化性活性を保持するか否かは、 どんな既知の細胞走化性のアツセィ法 にそのような蛋白質あるいはペプチドを使用しても容易に決定できる。

( 7 ) 凝血および血栓活性

本発明のポリペプチドは、 凝血あるいは血栓活性も示すと考えられる。 結果と して、 そのような蛋白質は、 様々な凝固障害 （血友病のような遺伝性障害を含 む。 ） の治療に有効であると期待される。 あるいは、 外傷、 手術または他の原因 により生じた創傷の治療における凝固および他の凝血事象を促進させることが期 待される。 本発明のポリペプチドは、 血栓の形成の溶解あるいは阻害 （血栓ある いは卒中等） 、 およびそれより生じる状態の治療および予防にも効果があると考 えられる。

( 8 ) 受容体 Zリガンド活性

本発明のポリペプチドは、 受容体、 受容体 Zリガンドあるいは受容体 Zリガン ドのインヒビ夕一あるいはァゴニストとしての活性を示す可能性もある。 そのよ うな受容体およびリガンドの例として、 サイトカイン受容体およびそのリガンド、 受容体キナーゼぉよびそのリガンド、 受容体フォスファタ一ゼぉよびそのリガン ド、 細胞間相互作用に関連した受容体 （Selectin, Integurin、 およびそのリガ ンド、 受容体キナーゼ等の細胞接着分子を含む。 ) およびそのリガンド、 および 抗原提示、 抗原認識、 および細胞性および液性免疫反応の発達に係わる受容体 Z リガンドの組み合わせが挙げられるが、 これらに制限するものではない。 受容体 およびリガンドは、 その相互作用に対する可能なぺプチドあるいは小分子のィン ヒビ夕一のスクリーニングにも有効である。 本発明のポリペプチドは、 （受容体 およびリガンドの断片を含むが、 制限されるものではない） それ自身受容体/リ ガンドの相互作用のインヒビ夕一として有効であると考えられる。 ( 9 ) その他の活性

本発明のポリペプチドは、 以下に示す付加的な活性あるいは効果の一つあるい はそれ以上を示すと考えられる：細菌、 ウィルス、 カビ、 および他の寄生虫を含 む感染性の物質を殺傷する；身長、 体重、 髪の色、 目の色、 肌あるいは他の組織 の色素沈着、 あるいは器官の大きさ （例えば、 胸部増量あるいは減量） 等、 身体 的特徴に効果を及ぼす （抑制するあるいは促進） ；食餌脂肪、 蛋白質、 あるいは 炭水化物の分解に効果を及ぼす；食欲、 性欲、 ストレス、 認識 （認識障害） 、 鬱 病、 暴力行動を含む行動特徴に効果を及ぼす；鎮痛効果あるいは他の痛みを減少 させる効果を提供する；胚性幹細胞の造血系以外の他の系統への分化および増殖 を促進する；および、 酵素の場合、 その酵素の欠失を補う、 および関連疾患の治 療。 上記活性を有する本発明のポリペプチドは、 例えば B細胞、 T細胞、 肥満細胞 の増殖または細胞死、 免疫グロブリンのクラススィッチ促進によるクラス特異的 誘導、 B細胞の抗体産生細胞への分化、 顆粒球前駆細胞の増殖または分化、 細胞 死、 単球 ·マクロファージ前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 好中球、 単球 - マクロファージ、 好酸球、 好塩基球の増殖または機能亢進、 細胞死、 巨核球前駆 細胞の増殖または細胞死、 好中球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 Bまたは T前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 赤血球の産生促進、 赤血球、 好中球、 好 酸球、 好塩基球、 単球 ·マクロファージ、 肥満細胞、 巨核球前駆細胞の増殖支持、 好中球、 単球 ·マクロファージ、 B細胞または T細胞の遊走促進、 胸腺細胞の増 殖または細胞死、 脂肪細胞の分化抑制、 ナチュラルキラー細胞の増殖または細胞 死、 造血幹細胞の増殖または細胞死、 幹細胞および各種造血前駆細胞の増殖抑制、 間葉系幹細胞からの骨芽細胞、 軟骨細胞への分化促進または増殖、 細胞死、 ある いは破骨細胞の活性化や単球から破骨細胞への分化促進による骨吸収の促進の作 用を本ポリペプチドのみで、 またリガンドーレセプ夕一間の結合を介して、 ある いは他の分子と相乗的に働くことにより有する可能性がある。 また、 本発明のポリペプチドは神経系にも作用することが予測されるので、 各 種神経伝達物質作動性神経細胞への分化ならびにそれらの生存維持または細胞死、 グリア細胞の増殖促進または細胞死、 神経突起の伸展、 神経節細胞の生存維持ま たは細胞死、 ァストロサイトの増殖または分化促進または細胞死、 末梢神経の増 殖または生存維持、 細胞死、 シュワン細胞の増殖または細胞死、 運動神経の増殖 または生存維持、 細胞死の作用もある可能性がある。

さらに、 本ポリペプチドは初期胚の発生過程において、 外胚葉誘導作用による 表皮、 脳、 背骨、 神経の器官形成、 中胚葉誘導作用による背索結合組織 （骨、 筋 肉、 腱） 、 血球細胞、 心臓、 腎臓、 生殖巣の器官形成、 あるいは内胚葉誘導作用 による消化器系臓器 （胃、 腸、 肝齓 脬臓） 、 呼吸器系 （肺、 気管） の形成に促 進的または抑制的に作用する可能性があるとともに、 生体においても上記器官の 増殖あるレゝは増殖抑制作用を有する可能性がある。

したがって、 本発明のポリペプチドはそれ自身で、 免疫系または神経系もしく は骨代謝の機能の低下または亢進に関する疾患、 または造血系細胞の発育不全ま たは異常増殖、 例えば炎症性疾患 （リウマチ、 潰瘍性大腸炎等） 、 骨髄移植後の 造血幹細胞の減少症、 ガン、 白血病に対する放射線照射または化学療法剤投与後 の白血球、 血小板、 B細胞または T細胞の減少症、 貧血、 感染症、 ガン、 白血病、 A I D S , 骨代謝異常 （骨粗鬆症等） 、 各種変性疾患 （アルツハイマー病、 多発 性硬化症等） 、 あるいは神経損傷の予防または治療薬として用いることが期待さ れる。

また本発明のポリペプチドは、 外胚葉、 中胚葉または内胚葉由来器官の分化ま たは増殖作用を有する可能性があるので、 各器官 （表皮、 骨、 筋肉、 腱、 心臓、 腎臓、 胃、 腸、 肝臓、 塍臓、 肺、 気管等） の組織修復剤として用いることも期待 される。

また、 本発明のポリペプチドのポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル抗体 を用いて、 生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、 これによつて本発明ポ リぺプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。 ポリクローナル抗体およびモノク口一ナル抗体は該ポリぺプチドあるいはその断 片を抗原として用いて常法により作製することができる。

また本発明のポリぺプチド （好ましくはその細胞外ドメインのポリぺプチド） を用いることにより、 例えばァフィ二ティーカラムを作製して、 本ポリペプチド と結合する既知または未知の蛋白質 （リガンド） の同定、 精製あるいはその遺伝 子クロ一ニングを行なうことができる。

また本発明ポリぺプチド （好ましくはその膜貫通領域または細胞内ドメインの ポリペプチド） を用いて、 例えばウェスト一ウエスタン法により、 または該 c D NA (好ましくは該ポリぺプチドの膜貫通領域または細胞内ドメインをコードす る c D NA) を用いて、 例えば酵母 2—ハイブリッド法により該ポリペプチドと 細胞質内で相互作用する下流のシグナル伝達分子の同定、 遺伝子クローニングを 行なうこともできる。

さらに本発明のポリぺプチドを用いることによって、 本ポリぺプチドレセプ夕 —ァゴニスト、 アン夕ゴニストおよび受容体一シグナル伝達分子間の阻害剤等の スクリーニングを行なうこともできる。

本発明の c D N Aは、 多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを生産 する際の重要かつ必須の铸型となるだけでなく、 遺伝病の診断や治療 （遺伝子欠 損症の治療またはアンチセンス D N A (R N A) によって、 ポリペプチドの発現 を停止させることによる治療等） に利用できる。 また、 本発明の c D NAをプロ —ブとしてジエノミック （genomic) D NAを分離できる。 同様にして、 本発明 c D NAと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、 またマウス以外の生 物における本発明ポリぺプチドと相同性の高いポリぺプチドの遺伝子を分離する ことも可能である。 [医薬品への適用]

造血系細胞の発育不全や異常増殖、 神経系機能の亢進や低下、 免疫系機能の亢 進や低下に関する疾患、 例えば炎症性疾患 （リウマチ、 潰瘍性大腸炎等） 、 骨髄 移植後の造血幹細胞の減少症、 放射線治療後または化学療法剤投与後の白血球、 血小板、 B細胞または T細胞の減少症、 貧血、 感染症、 ガン、 白血病、 A I D S、 各種変性疾患 （アルツハイマー病、 多発性硬化症等） 、 または神経損傷の予防ま たは治療、 骨代謝異常 （骨粗鬆症等） の予防または治療薬、 あるいは組織修復等 のために、 本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドに対する抗体は、 通常全身的又は局所的に、 一般的には経口または非経口の形で投与される。 好ま しくは、 経口投与、 静脈内投与および脳室内投与である。

投与量は、 年齢、 体重、 症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間等により異なる 力 通常成人一人あたり、 一回につき 1 0 0 /z gから 1 0 O m gの範囲で、 一 日一回から数回経口投与されるかまたは、 成人一人当り、 一回につき 1 0 i g から 1 0 O m gの範囲で、 一日一回から数回非経口投与される。

もちろん前記したように、 投与量は種々の条件により変動するので、 上記投与 量より少ない量で十分な場合もあるし、 また範囲を越えて必要な場合もある。 本発明化合物を投与する際には、 経口投与のための固体組成物、 液体組成物お よびその他の組成物、 非経口投与のための注射剤、 外用剤、 坐剤等として用いら れる。

経口投与のための固体組成物には、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒剤等 が含まれる。 カプセルには、 ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれる。 このような固体組成物においては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少なく とも一つの不活性な希釈剤 （例えば、 ラクト一ス、 マンニトール、 グルコース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 微結晶セルロース、 デンプン、 ポリビニルピロ リドン、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等） と混合される。 組成物は、 常法 に従って不活性な希釈剤以外の添加物、 例えば潤滑剤 （ステアリン酸マグネシゥ ム等） 、 崩壊剤 （繊維素グリコール酸カルシウム等） 、 安定化剤 （ヒト血清アル ブミン、 ラクト一ス等） 、 溶解補助剤 （アルギニン、 ァスパラギン酸等） を含有 していてもよい。

錠剤または丸剤は、 必要により白糖、 ゼラチン、 ヒドロキシプロピルセル口一 ス、 ヒドロキシプロピルメチルセル口一スフ夕レート等の胃溶性あるいは腸溶性 のフィルムで皮膜してもよいし、 また 2以上の層で皮膜してもよい。 さらにゼラ チンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。

経口投与のための液体組成物は、 薬学的に許容される乳濁剤、 溶液剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を含み、 一般に用いられる不活性な希釈剤 （例えば、 精製水、 エタノール等） を含んでいてもよい。 この様な組成物は、 不活性な希釈 剤以外に湿潤剤、 懸濁剤のような補助剤、 甘味剤、 風味剤、 芳香剤、 防腐剤を含 有していてもよい。

経口投与のためのその他の組成物としては、 ひとつまたはそれ以上の活性物質 を含み、 それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。 この組成 物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリゥムのような安定剤と等張性を与え るような安定化剤、 塩化ナトリウム、 クェン酸ナトリウムあるいはクェン酸のよ うな等張剤を含有していてもよい。 スプレー剤の製造方法は、 例えば米国特許第 2, 868, 691号および同第 3， 095, 355号明細書に詳しく記載されている。

本発明による非経口投与のための注射剤としては、 無菌の水性または非水性の 溶液剤、 懸濁剤、 乳濁剤を包含する。 水性または非水性の溶液剤、 懸濁剤として は、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合 される。 水性の希釈剤としては、 例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げら れる。 非水性の希釈剤としては、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレング リコール、 オリ一ブ油のような植物油、 エタノールのようなアルコール類、 ポリ ソルベー卜 8 0 (登録商標） 等が挙げられる。

このような組成物は、 さらに防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤 （例 えば、 ヒト血清アルブミン、 ラクトース等） 、 溶解補助剤 （例えば、 アルギニン、

'酸等） のような補助剤を含んでいてもよい。 発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 これらは本発明の範 囲を制限するものではない。

実施例

ヒト骨髄ストローマ細胞株 HAS 303 (東京医科大学第一内科外山圭助教授、 相沢信助手より供与。 J. Cell. Physiol., 148 ： 245-251 (1991)および Experimental Hematol. , 22 ： 482 - 487(1994)に記載されている。 ） より TR I ζ ο 1試薬 （TRIzol reagent (登録商標、 GIBC0BRL 社より販売） ） を用いて全 R NAを抽出し、 mR NA ' ピユリ フィ ケ一シヨ ン ' キッ ト （ mRNA Purification Kit (商品名、 Pharmacia社より販売） ） を用いて po 1 y (A) RNAを精製した。 Xho I部位を連結したランダム 9 me r (配列番号 9 ：

NNN- 3 ' ) をプライマーとして、 スーパースクリプト ·プラスミド . シス アム (Superscript Plasmid System ior cDNA synthesis and Plasmid loning (商品名、 GIBCOBRL社より販売） ） を用いて 2本鎖 cDNAの合成を行なった。 Ec oR Iアダプター （GIBCOBRL社より販売） を D N A · ライゲ一シヨン · キット · ver.2 (DNA ligation kit ver.2 (商品名、 宝酒造 （株） より販売） 以 後 DN Aの連結はすべて本キットを使用した。 ） を用いて連結した後、 Xho l で消化し、 ァガロース電気泳動で 300〜800 b pの c DNAを切り出して分 画し、 PSUC2 (米国特許 5536637号参照） の E c o R I ZN o t I部位に連 結し、 大腸菌 DH10B株にエレクト口ポレーシヨン法で形質転換して酵母 SS T用の cDNAライブラリ一を得た。

この C DNAライブラリ一のプラスミドを調製し、 酢酸リチウム法 （Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1 を参照） により酵母 YTKl 2株を形 質転換し、 トリブトファン （Tr p) を含まない酵母形質転換体の選択培地 （C MD_T r p培地） のプレート上にまき、 30°Cで 48時間インキュベートし た後、 ァクトラン · レプリカ ·プレー夕一 （Accutran Replica Plater (商品名、 Schleicher & Schuell 社より販売） ） を用いて得られたコロニー （形質転換 体） のレプリカをラフイノースを炭素源とする YPRプレートにとり、 30°C で 14日間インキュベートした。 3日目以降、 出現してきた各々のコロニーを一 つずつ再度 Y PRプレートにストリークして 30°Cで 48時間インキュベート した後、 シングルコロニ一を YPD培地に植菌し、 30°Cで 48時間インキュ ペートした後、 プラスミドを調製した。

続いて p SUC 2のクロ一ニングサイトの両端の配列の 2種類のプライマ一 (センス鎖はピオチン化プライマ一） を用いて公知の方法に従つて P C Rを行な い、 インサート C DN Aを増幅した後、 ダイナビーズ （Dynabeads, 商品名， DYNAL社より販売） を用いてピオチン化 1本鎖 DNAを精製し、 塩基配列の決定 を行なった。 塩基配列の決定は D N A · シ一ゲンシング · キッ ト （DNA Sequencing kit (Dye Terminatorし ycle sequencing Reaay Reactionノ ( 品名、 Applied Biosystems Inc. より販売） ） を用いた蛍光ダイ夕一ミネ一夕ーサイク ルシークェンス法で反応を行ない、 自動 DN Aシークェンサ一 373 (Applied Biosystems Inc.) で読み取りを行なった （以下、 塩基配列決定はすべて本方法 で行なった。 ） 。

その中の 1クローン OAF 065について得られた塩基配列および推定される アミノ酸配列についてデータベースとの相同性検索を行なった結果、 データべ一 スに登録されていない新規の DN Aであることが明らかとなった。 また推定され るァミノ酸配列を既知のシグナルシークェンスと比較することにより本発明の D N Aが機能的かつ構造的にもシグナルシークェンスを有することが確認された。 次に 3 ' RACE (Rapid Amplification of cDNA End) 法により OAF 06 5の全長 c DNAを単離した。 3 ' RACE法はマラソン · c DNA ·アンプ リフィケーション · キッ ト （Marathon cDNA Amplification Kit (商品名、 Clontech社より販売） ） を用いた。 このキットの方法に従って H A S 303の o l y (A) RNAよりアダプタ一を連結した 2本鎖 c DNAを調製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に基づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 28 me rの OAF 065特異的プライマー F 3 (配列番号 10 : 5 ' — AGAA

- 3 ' ) を作製して、 該 キッ卜に添付されたアダプタープライマーとで P CRを行なった。 その結果、 4. Ok と 1.5k bの 2種類の DNAが増幅されたため、 4. Okbの cDNAを〇 AF 065ひ、 1.5k bの c DNAを OAF 065 /3と命名した。

この 2種類の DNAをァガロース電気泳動で分画後、 pT7ブルー 2 · Τべク 夕一 （pT7 Blue- 2 T- Vector (商品名、 Novagen社より販売） ） に連結し、 大腸 菌 DH5 αに形質転換してプラスミドを調製した。 初めに 5 ' 側の塩基配列を 決定して、 両者に OAF 065特異的プライマー F 3の塩基配列が存在すること を確認した後、 OAF 065 αに関しては 5 ' 側の約 1.7k bを、 OAF065 i3に関しては全塩基配列を決定し、 それぞれ配列番号 3および 7に示す配列を 得た。 さらにオープンリーディングフレームを検索し、 アミノ酸に翻訳して配列 番号 1および 5に示す配列を得た。

OAF 065 ο;および OAF 065 /3の塩基配列を比較すると、 5 ' 側の 1 〜1290bまでの塩基配列はすべて一致していたが、 1291 b以降の塩基配列は全く 相同性が認められなかった。 また OAF 065ひおよび OAF 065 i3のアミ ノ酸配列を比較すると N末端側の 1〜415アミノ酸はすべて一致しており、 O AF 065ひの C末端側 2アミノ酸 （G 1 u A 1 a) のみが OAF 065 ]3で は 8アミノ酸 (Va l Ar gG l nAr gLeuG l yS e r L e u) に置換さ れていた。 また疎水性プロットによる解析から OAF 065 ο;および OAF 0 65 i3は I型の膜蛋白質であり、 細胞外領域と膜貫通領域はすべて共通である ことが判明した。

さらにスイスプロット （Swiss Prot Release 33) に登録されている既知のポ リペプチドのアミノ酸配列と比較した結果、 本発明のポリペプチド OAF 065 ο;と OAF 065 ;3は未知であつたが、 細胞外領域に TNF受容体ファミリ一 に共通する C y sリツチ領域を有することが判明した。 すなわち、 図 1に他の T NF受容体ファミリーであるヒト腫瘍壊死因子受容体 1 (hTNFR l) 、 ヒト 腫瘍壊死因子受容体 2 (hTNFR 2) 、 ヒト神経成長因子受容体 （hNGF R) およびヒト F a s (hF a s) とのアミノ酸配列の比較を示す通り （ァミノ 酸を 1文字記号で示す。 ） 、 本発明ポリペプチド （OAF 065) は I型の膜蛋 白質で細胞外領域に腫瘍壊死因子 （Tumor necrosis factor： TNF) 受容体フ ァミリ一に共通する C y sリツチ領域を有することが判明した。 このことから、 本発明のポリペプチド OAF 065 αおよび OAF 065 3は、 TNF受容体 ファミリ一に属する新規の膜蛋白質であることが確認された。

配 列 表

配列番号： 1

配列の長さ ： 4 1 7

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

配列

Met Ala Leu Lys Val Leu Leu Glu Gin Glu Lys Thr Phe Phe Thr Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Gly Tyr し eu Ser Cys Lys Val Thr Cys Glu Thr Gly

20 25 30

Asp Cys Arg Gin Gin Glu Phe Arg Asp Arg Ser Gly Asn Cys Val Pro

35 40 45

Cys Asn Gin Cys Gly Pro Gly Met Glu Leu Ser Lys Glu Cys Gly Phe 50 55 60

tj丄 y Tyr Gly Glu Asp Ala Gin Cys Val Thr Cys Arg Leu His Arg Phe 65 70 75 80 ys Glu Asp Trp Gly Phe Gin し ys Cys Lys Pro Cys Leu Asp Cys Ala

85 90 95 Val Val Asn Arg Phe Gin Lys Ala Asn Cys Ser Ala Thr Ser Asp Ala

100 105 110 lie Cys Gly Asp Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Lys Thr Lys Leu Val

115 120 125

Gly Phe Gin Asp Met Glu Cys Val Pro Cys Gly Asp Pro Pro Pro Pro 130 135 140

Tyr Glu Pro His Cys Ala Ser Lys Val Asn Leu Val Lys lie Ala Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ser Ser Pro Arg Asp Thr Ala Leu Ala Ala Val He Cys Ser

165 170 175

Ala Leu Ala Thr Val Leu Leu Ala Leu Leu lie Leu Cys Val lie Tyr

180 185 190

Cys Lys Arg Gin Phe Met Glu Lys Lys Pro Ser Trp Ser Leu Arg Ser

195 200 205

Gin Asp lie Gin Tyr Asn Gly Ser Glu Leu Ser Cys Leu Asp Pro Arg

210 215 220

Gin Leu His Glu Tyr Ala His Arg Ala Cys Cys Gin Cys Arg Arg Asp 225 230 235 240

Ser Val Gin Thr Cys Gly Pro Val Arg Leu Leu Pro Ser Met Cys Cys

245 250 255

Glu Glu Ala Cys Ser Pro Asn Pro Ala Thr Leu Gly Cys Gly Val His

260 265 270

Ser Ala Ala Ser Leu Gin Ala Arg Asn Ala Gly Pro Ala Gly Glu Met

275 280 285

Val Pro Thr Phe Phe Gly Ser Leu Thr Gin Ser lie Cys Gly Glu Phe

290 295 300

Ser Asp Ala Trp Pro Leu Met Gin Asn Pro Met Gly Gly Asp Asn lie 305 310 315 320

Ser Phe Cys Asp Ser Tyr Pro Glu Leu Thr Gly Glu Asp lie His Ser

325 330 335

Leu Asn Pro Glu Leu Glu Ser Ser Thr Ser Leu Asp Ser Asn Ser Ser

340 345 350

Gin Asp Leu Val Gly Gly Ala Val Pro Val Gin Ser His Ser Glu Asn

355 360 365 6600/86dT e8一

c

o o

TCAGTGCAGA CCTGCGGGCC GGTGCGCTTG CTCCCATCCA TGTGCTGTGA GGAGGCCTGC 780

AGCCCCAACC CGGCGACTCT TGGTTGTGGG GTGCATTCTG CAGCCAGTCT TCAGGCAAGA 840

AACGCAGGCC CAGCCGGGGA GATGGTGCCG ACTTTCTTCG GATCCCTCAC GCAGTCCATC 900

TGTGGCGAGT TTTCAGATGC CTGGCCTCTG ATGCAGAATC CCATGGGTGG TGACAACATC 960 TCTTTTTGTG ACTCTTATCC TGAACTCACT GGAGAAGACA TTCATTCTCT CAATCCAGAA 1020

CTTGAAAGCT CAACGTCTTT GGATTCAAAT AGCAGTCAAG ATTTGGTTGG TGGGGCTGTT 1080

CCAGTCCAGT CTCATTCTGA AAACTTTACA GCAGCTACTG ATTTATCTAG ATATAACAAC 1140

ACACTGGTAG AATCAGCATC AACTCAGGAT GCACTAACTA TGAGAAGCCA GCTAGATCAG 1200

GAGAGTGGCG CTATCATCCA CCCAGCCACT CAGACGTCCC TCCAGGTAAG GCAGCGACTG 1260 GGTTCCCTG 1269 配列番号： 3

配列の長さ： 1 7 0 4

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列

GGGAACGTAG AACTCTCCAA CAATAAATAC ATTTGATAAG AAAGATGGCT TTAAAAGTGC 60 TACTAGAACA AGAGAAAACG TTTTTCACTC TTTTAGTATT ACTAGGCTAT TTGTCATGTA 120 AAGTGACTTG TGAAACAGGA GACTGTAGAC AGCAAGAATT CAGGGATCGG TCTGGAAACT 180 GTGTTCCCTG CAACCAGTGT GGGCCAGGCA TGGAGTTGTC TAAGGAATGT GGCTTCGGCT 240 ATGGGGAGGA TGCACAGTGT GTGACGTGCC GGCTGCACAG GTTCAAGGAG GACTGGGGCT 300 TCCAGAAATG CAAGCCCTGT CTGGACTGCG CAGTGGTGAA CCGCTTTCAG AAGGCAAATT 360 GTTCAGCCAC CAGTGATGCC ATCTGCGGGG ACTGCTTGCC AGGATTTTAT AGGAAGACGA 420 AACTTGTCGG CTTTCAAGAC ATGGAGTGTG TGCCTTGTGG AGACCCTCCT CCTCCTTACG 480 AACCGCACTG TGCCAGCAAG GTCAACCTCG TGAAGATCGC GTCCACGGCC TCCAGCCCAC 540 GGGACACGGC GCTGGCTGCC GTTATCTGCA GCGCTCTGGC CACCGTCCTG CTGGCCCTGC 600 TCATCCTCTG TGTCATCTAT TGTAAGAGAC AGTTTATGGA GAAGAAACCC AGCTGGTCTC 660 TGCGGTCACA GGACATTCAG TACAACGGCT CTGAGCTGTC GTGTCTTGAC AGACCTCAGC 720 TCCACGAATA TGCCCACAGA GCCTGCTGCC AGTGCCGCCG TGACTCAGTG CAGACCTGCG 780 GGCCGGTGCG CTTGCTCCCA TCCATGTGCT GTGAGGAGGC CTGCAGCCCC AACCCGGCGA 840 CTCTTGGTTG TGGGGTGCAT TCTGCAGCCA GTCTTCAGGC AAGAAACGCA GGCCCAGCCG 900 GGGAGATGGT GCCGACTTTC TTCGGATCCC TCACGCAGTC CATCTGTGGC GAGTTTTCAG 960 ATGCCTGGCC TCTGATGCAG AATCCCATGG GTGGTGACAA CATCTCTTTT TGTGACTCTT 1020 ATCCTGAACT CACTGGAGAA GACATTCATT CTCTCAATCC AGAACTTGAA AGCTCAACGT 1080 CTTTGGATTC AAATAGCAGT CAAGATTTGG TTGGTGGGGC TGTTCCAGTC CAGTCTCATT 1140 CTGAAAACTT TACAGCAGCT ACTGATTTAT CTAGATATAA CAACACACTG GTAGAATCAG 1200 CATCAACTCA GGATGCACTA ACTATGAGAA GCCAGCTAGA TCAGGAGAGT GGCGCTATCA 1260 TCCACCCAGC CACTCAGACG TCCCTCCAGG AAGCTTAAAG AACCTGCTTC TTTCTGCAGT 1320 AGAAGCGTGT GCTGGAACCC AAAGAGTACT CCTTTGTTAG GCTTATGGAC TGAGCAGTCT 1380 GGACCTTGCA TGGCTTCTGG GGCAAAAATA AATCTGAACC AAACTGACGG CATTTGAAGC 1440 CTTTCAGCCA GTTGCTTCTG AGCCAGACCA GCTGTAAGCT GAAACCTCAA TGAATAACAA 1500 GAAAAGACTC CAGGCCGACT CATGATACTC TGCATCTTTC CTACATGAGA AGCTTCTCTG 1560 CCACAAAAGT GACTTCAAAG ACGGATGGGT TGAGCTGGCA GCCTATGAGA TTGTGGACAT 1620 ATAACAAGAA ACAGAAATGC CCTCATGCTT ATTTTCATGG TGATTGTGGT TTTACAAGAC 1680 TGAAGACCCA GAGTATACTT TTTC 1704 配列番号： 4

配列の長さ： 1 7 0 4

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA 生物名： Homo Sapiens

セルライン： HAS303

配列の特徴

特徴を表す記号： C D S

存在位置： 45. . 1295

特徴を決定した方法： P 特徴を表" 5 §己 ： sig peptide

存在位置： 45. . 119

特徴を決定した方法： S 特徵を表す記号： mat peptide

存在位置： 120. . 1295

特徴を決定した方法： S

配列

GGGAACGTAG AACTCTCCAA CAATAAATAC ATTTGATAAG AAAG ATG GCT TTA AAA 56

Met Ala Leu Lys - 25

GTG CTA CTA GAA CAA GAG AAA ACG TTT TTC ACT CTT TTA GTA TTA CTA 104 Val Leu Leu Glu Gin Glu Lys Thr Phe Phe Thr Leu Leu Val Leu Leu

- 20 -15 - 10

GGC TAT TTG TCA TGT AAA GTG ACT TGT GAA ACA GGA GAC TGT AGA CAG 152 Gly Tyr Leu Ser Cys Lys Val Thr Cys Glu Thr Gly Asp Cyc Arg Gin -5 1 5 10 CAA GAA TTC AGG GAT CGG TCT GGA AAC TGT GTT CCC TGC AAC CAG TGT 200 Gin Glu Phe Arg Asp Arg Ser Gly Asn Cys Val Pro Cys Asn Gin Cys

15 20 25

GGG CCA GGC ATG GAG TTG TCT AAG GAA TGT GGC TTC GGC TAT GGG GAG 248 Gly Pro Gly Met Glu Leu Ser Lys Glu Cys Gly Phe Gly Tyr Gly Glu

30 35 40

GAT GCA CAG TGT GTG ACG TGC CGG CTG CAC AGG TTC AAG GAG GAC TGG 296 Asp Ala Gin Cys Val Thr Cys Arg Leu His Arg Phe Lys Glu Asp Trp

45 50 55

GGC TTC CAG AAA TGC AAG CCC TGT CTG GAC TGC GCA GTG GTG AAC CGC 344 Gly Phe Gin Lys Cys Lys Pro Cys Leu Asp Cys Ala Val Val Asn Arg

60 65 70 75

TTT CAG AAG GCA AAT TGT TCA GCC ACC AGT GAT GCC ATC TGC GGG GAC 392 Phe Gin Lys Ala Asn Cys Ser Ala Thr Ser Asp Ala lie Cys Gly Asp

80 85 90

TGC TTG CCA GGA TTT TAT AGG AAG ACG AAA CTT GTC GGC TTT CAA GAC 440 Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Lys Thr Lys Leu Val Gly Phe Gin Asp

95 100 105

ATG GAG TGT GTG CCT TGT GGA GAC CCT CCT CCT CCT TAC GAA CCG CAC 488 Met Glu Cys Val Pro Cys Gly Asp Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Pro His

110 115 120

TGT GCC AGC AAG GTC AAC CTC GTG AAG ATC GCG TCC ACG GCC TCC AGC 536 Cys Ala Ser Lys Val Asn Leu Val Lys lie Ala Ser Thr Ala Ser Ser

125 130 135

CCA CGG GAC ACG GCG CTG GCT GCC GTT ATC TGC AGC GCT CTG GCC ACC 584 Pro Arg Asp Thr Ala Leu Ala Ala Val lie Cys Ser Ala Leu Ala Thr 140 145 150 155 GTC CTG CTG GCC CTG CTC ATC CTC TGT GTC ATC TAT TGT AAG AGA CAG 632 Val Leu Leu Ala Leu Leu lie Leu Cys Val lie Tyr Cys Lys Arg Gin

160 165 170

TTT ATG GAG AAG AAA CCC AGC TGG TCT CTG CGG TCA CAG GAC ATT CAG 680 Phe Met Glu Lys Lys Pro Ser Trp Ser Leu Arg Ser Gin Asp lie Gin

175 180 185

TAC AAC GGC TCT GAG CTG TCG TGT CTT GAC AGA CCT CAG CTC CAC GAA 728 Tyr Asn Gly Ser Glu Leu Ser Cys Leu Asp Rro Arg Gin Leu His Glu

190 195 200

TAT GCC CAC AGA GCC TGC TGC CAG TGC CGC CGT GAC TCA GTG CAG ACC 776 Tyr Ala His Arg Ala Cys Cys Gin Cys Arg Arg Asp Ser Val Gin Thr

205 210 215

TGC GGG CCG GTG CGC TTG CTC CCA TCC ATG TGC TGT GAG GAG GCC TGC 824 Cys Gly Pro Val Arg Leu Leu Pro Ser Met Cys Cys Glu Glu Ala Cys

220 225 230 235

AGC CCC AAC CCG GCG ACT CTT GGT TGT GGG GTG CAT TCT GCA GCC AGT 872 Ser Pro Asn Pro Ala Thr Leu Gly Cys Gly Val His Ser Ala Ala Ser

240 245 250

CTT CAG GCA AGA AAC GCA GGC CCA GCC GGG GAG ATG GTG CCG ACT TTC 920 Leu Gin Ala Arg Asn Ala Gly Pro Ala Gly Glu Met Val Pro Thr Phe

255 260 265

TTC GGA TCC CTC ACG CAG TCC ATC TGT GGC GAG TTT TCA GAT GCC TGG 968 Phe Gly Ser し eu Thr Gin Ser lie Cys Gly Glu Phe Ser Asp Ala Trp

270 275 280

CCT CTG ATG CAG AAT CCC ATG GGT GGT GAC AAC ATC TCT TTT TGT GAC 1016 Pro Leu Met Gin Asn Pro Met Gly Gly Asp Asn lie Ser Phe Cys Asp

285 290 295 9S

WLl D111II3V1 VIOVOVDOOV 0W0I3V0VV OVllIIOOIO 92

9991 11V01001V3 I11IVI130I V3I0DD0IW VOVDWVOVV 3VV1V1VDV0 OIOUVOVDl 9091 VID30VD00I ODVDIIOOOl VOOOVOVVVD II3V0I0VVV V3V33013I3 liOOVVOVOl 9½I V0VI33I1I3 IV30I3I3VI VOIVDIDVDO 300V3313V0 VVVVOWOVV IVV01VV3X3 98^1 3VVV0130VV I0ID0VD3V0 VD30V010II OOIIOVODOV 3II1D3DVV0 I1IV300DVD 9ΖΠ lOVVVDDWO 13IVVVIWV W3f)。 )丄 丄っ 丄 33V00I310V 30V0I3V001 OS 99CI VII300V110 II13013V10 V0VVVD33W 00130I0I03 0VV0V10V30 1DIII0I130

06S 98S 088

BIV ^ηΐ "ΐθ naq JBS -iqi ujo J¾ e^y o¾ S TH 9TI ^aU 90SI 133VV0VVVI 130 VV3 OVO 313 331 OOV DVO 13V 330 V33 OVO D1V D1V

9ZC OZC S9S 91

BIV ^ΐθ ^ηΐ3 "ΐθ dsy ne u¾ jes Sjy ^Vi neq ^TV dsy

9 ZI 130 300 IOV OVO DVD IVO V13 OVD OOV VOV OIV I3V VIO V30 IVO OVO

09£ S9C 09S

•it [丄 o:3s BIV jas ηχο ns -iqi usy usy 人丄 3·ΐν ^⁹S ^N31 dsy jq 80ΖΪ I3V V31 V09 V3i WD VIO 913 VOV 3VV 3VV 1VI VOV IDl VII IVO 13V Οΐ on 9εε

v Β_ΐΝ jqi aqd usy ηχο Jes S IH θζ u\ _Λ oj_d χΐ3_Λ B_IV Αχο Λ ο

09 ΐ ΐ 100 V30 VDV 丄丄丄 3VV VVO 131 1V3 101 0V3 310 VOD 丄丄 3 130 000 100

οεε ε oz£

"[ΒΛ ΓΙΘΙ dsy J8g jag usy Jas dsy neq jas J¾L a^s s η ο neq q Zl l l 110 Oil IVO VVO 10V OOV IVV V31 IVO Oil 131 OOV V3I ODV VVO 113

sie οτε sos οοε

"TO ojd usy "91 S TH dsy ηχο ^io jq丄 neq ηχο OJJ JA丄

WOT VVO VX) IVV 313 131 IVO IIV OVO VVO VOO IDV 313 VVO 133 上 VI 丄:)丄

應 86dfALC f0£8£/86 O W 配列番号： 5

配列の長さ ： 4 2 3

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

配列

Met Ala Leu Lys Val Leu Leu Glu Gin Glu Lys Thr Phe Phe Thr Leu

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Gly Tyr Leu Ser Cys Lys Val Thr Cys Glu Thr Gly

20 25 30

Asp Cys Arg Gin Gin Glu Phe Arg Asp Arg Ser Gly Asn Cys Val Pro

35 40 45

Cys Asn Gin Cys Gly Pro Gly Met Glu Leu Ser Lys Glu Cys Gly Phe 50 55 60

ijly Tyr Gly Glu Asp Ala Gin Cys Val Thr Cys Arg Leu His Arg Phe 65 70 75 80

Lys Glu Asp Trp Gly Phe bin Lys Cys Lys Pro Cys Leu Asp Cys Ala

85 90 95

Val Val Asn Arg Phe iiln Lys Ala Asn Cys Ser Ala Thr Ser Asp Ala

100 105 110 l ie Cys Gly Asp Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Lys Thr Lys Leu Val

115 120 125

Gly Phe Gin Asp Met Glu Cys Val Pro Cys Gly Asp Pro Pro Pro Pro 130 135 140

Tyr Glu Pro Hi s Cys Ala Ser Lys Val Asn Leu Val Lys l ie Ala Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ser Ser Pro Arg Asp Thr Ala Leu Ala Ala Val lie Cys Ser

165 170 175

Ala Leu Ala Thr Val Leu Leu Ala Leu Leu lie Leu Cys Val lie Tyr

180 185 190

Cys Lys Arg Gin Phe Met Glu Lys し ys Pro Ser Trp Ser Leu Arg Ser

195 200 205

υΐη Asp lie Gin Tyr Asn Gly Ser (JIU Leu Ser Cys Leu Asp Pro Arg

210 215 220

υΐη Leu His Glu Tyr Ala His Arg Ala Cys Cys Gin Cys Arg Arg Asp 225 230 235 240

Ser Val Gin Thr Cys Gly Pro Val Arg Leu Leu Pro Ser Met Cys Cys

245 250 255 blu Glu Ala Cys Ser Pro Asn Pro Ala Thr Leu Gly Cys Gly Val His

260 265 270

Ser Ala Ala Ser Leu Gin Ala Arg Asn Ala Gly Pro Ala Gly Glu Met

275 280 285

Val Pro Thr Phe Phe Gly Ser Leu Thr Gin Ser He Cys Gly irlu Phe

290 295 300

Ser Asp Ala Trp Pro Leu Met Gin Asn Pro Met Gly Gly Asp Asn lie 305 310 315 320

Ser Phe Cys Asp Ser ryr Pro Glu Leu Thr Gly Glu Asp lie His Ser

325 330 335

Leu Asn Pro Glu Leu lu Ser Ser Thr Ser Leu Asp Ser Asn Ser Ser

340 345 350

Gin Asp Leu Val Gly Gly Ala Val Pro Val Gin Ser His Ser Glu Asn

355 360 365 Phe Thr Ala Ala Thr Asp Leu Ser Arg Tyr Asn Asn Thr Leu Val Glu

370 375 380

Ser Ala Ser Thr Gin Asp Ala Leu Thr Met Arg Ser Gin Leu Asp Gin

385 390 395 400

Glu Ser Gly Ala lie lie Hi s Pro Ala Thr Gin Thr Ser Leu Gin Val

405 410 415

Arg Gin Arg Leu Gly Ser Leu

420 配列番号： 6

配列の長さ： 1 2 6 9

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列

ATGGCTTTAA AAGTGCTACT AGAACAAGAG AAAACGTTTT TCACTCTTTT AGTATTACTA 60 GGCTATTTGT CATGTAAAGT GACTTGTGAA ACAGGAGACT GTAGACAGCA AGAATTCAGG 120 GATCGGTCTG GAAACTGTGT TCCCTGCAAC CAGTGTGGGC CAGGCATGGA GTTGTCTAAG 180 GAATGTGGCT TCGGCTATGG GGAGGATGCA CAGTGTGTGA CGTGCCGGCT GCACAGGTTC 240 AAGGAGGACT GGGGCTTCCA GAAATGCAAG CCCTGTCTGG ACTGCGCAGT GGTGAACCGC 300 TTTCAGAAGG CAAATTGTTC AGCCACCAGT GATGCCATCT GCGGGGACTG CTTGCCAGGA 360 TTTTATAGGA AGACGAAACT TGTCGGCTTT CAAGACATGG AGTGTGTGCC TTGTGGAGAC 420 CCTCCTCCTC CTTACGAACC GCACTGTGCC AGCAAGGTCA ACCTCGTGAA GATCGCGTCC 480 ACGGCCTCCA GCCCACGGGA CACGGCGCTG GCTGCCGTTA TCTGCAGCGC TCTGGCCACC 540 GTCCTGCTGG CCCTGCTCAT CCTCTGTGTC ATCTATTGTA AGAGACAGTT TATGGAGAAG 600 AAACCCAGCT GGTCTCTGCG GTCACAGGAC ATTCAGTACA ACGGCTCTGA GCTGTCGTGT 660 CTTGACAGAC CTCAGCTCCA CGAATATGCC CACAGAGCCT GCTGCCAGTG CCGCCGTGAC 720 TCAGTGCAGA CCTGCGGGCC GGTGCGCTTG CTCCCATCCA TGTGCTGTGA GGAGGCCTGC 780 AGCCCCAACC CGGCGACTCT TGGTTGTGGG GTGCATTCTG CAGCCAGTCT TCAGGCAAGA 840 AACGCAGGCC CAGCCGGGGA GATGGTGCCG ACTTTCTTCG GATCCCTCAC GCAGTCCATC 900 TGTGGCGAGT TTTCAGATGC CTGGCCTCTG ATGCAGAATC CCATGGGTGG TGACAACATC 960 TCTTTTTGTG ACTCTTATCC TGAACTCACT GGAGAAGACA TTCATTCTCT CAATCCAGAA 1020 CTTGAAAGCT CAACGTCTTT GGATTCAAAT AGCAGTCAAG ATTTGGTTGG TGGGGCTGTT 1080 CCAGTCCAGT CTCATTCTGA AAACTTTACA GCAGCTACTG ATTTATCTAG ATATAACAAC 1140 ACACTGGTAG AATCAGCATC AACTCAGGAT GCACTAACTA TGAGAAGCCA GCTAGATCAG 1200 GAGAGTGGCG CTATCATCCA CCCAGCCACT CAGACGTCCC TCCAGGTAAG GCAGCGACTG 1260 GGTTCCCTG 1269 配列番号： Ί

配列の長さ： 1 4 9 6

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列

GGGAACGTAG AACTCTCCAA CAATAAATAC ATTTGATAAG AAAGATGGCT TTAAAAGTGC 60 TACTAGAACA AGAGAAAACG TTTTTCACTC TTTTAGTATT ACTAGGCTAT TTGTCATGTA 120 AAGTGACTTG TGAAACAGGA GACTGTAGAC AGCAAGAATT CAGGGATCGG TCTGGAAACT 180 GTGTTCCCTG CAACCAGTGT GGGCCAGGCA TGGAGTTGTC TAAGGAATGT GGCTTCGGCT 240 ATGGGGAGGA TGCACAGTGT GTGACGTGCC GGCTGCACAG GTTCAAGGAG GACTGGGGCT 300 TCCAGAAATG CAAGCCCTGT CTGGACTGCG CAGTGGTGAA CCGCTTTCAG AAGGCAAATT 360 GTTCAGCCAC CAGTGATGCC ATCTGCGGGG ACTGCTTGCC AGGATTTTAT AGGAAGACGA 420 AACTTGTCGG CTTTCAAGAC ATGGAGTGTG TGCCTTGTGG AGACCCTCCT CCTCCTTACG 480 AACCGCACTG TGCCAGCAAG GTCAACCTCG TGAAGATCGC GTCCACGGCC TCCAGCCCAC 540 GGGACACGGC GCTGGCTGCC GTTATCTGCA GCGCTCTGGC CACCGTCCTG CTGGCCCTGC 600 TCATCCTCTG TGTCATCTAT TGTAAGAGAC AGTTTATGGA GAAGAAACCC AGCTGGTCTC 660 TGCGGTCACA GGACATTCAG TACAACGGCT CTGAGCTGTC GTGTCTTGAC AGACCTCAGC 720 TCCACGAATA TGCCCACAGA GCCTGCTGCC AGTGCCGCCG TGACTCAGTG CAGACCTGCG 780 GGCCGGTGCG CTTGCTCCCA TCCATGTGCT GTGAGGAGGC CTGCAGCCCC AACCCGGCGA 840 CTCTTGGTTG TGGGGTGCAT TCTGCAGCCA GTCTTCAGGC AAGAAACGCA GGCCCAGCCG 900 GGGAGATGGT GCCGACTTTC TTCGGATCCC TCACGCAGTC CATCTGTGGC GAGTTTTCAG 960 ATGCCTGGCC TCTGATGCAG AATCCCATGG GTGGTGACAA CATCTCTTTT TGTGACTCTT 1020 ATCCTGAACT CACTGGAGAA GACATTCATT CTCTCAATCC AGAACTTGAA AGCTCAACGT 1080 CTTTGGATTC AAATAGCAGT CAAGATTTGG TTGGTGGGGC TGTTCCAGTC CAGTCTCATT 1140 CTGAAAACTT TACAGCAGCT ACTGATTTAT CTAGATATAA CAACACACTG GTAGAATCAG 1200 CATCAACTCA GGATGCACTA ACTATGAGAA GCCAGCTAGA TCAGGAGAGT GGCGCTATCA 1260 TCCACCCAGC CACTCAGACG TCCCTCCAGG TAAGGCAGCG ACTGGGTTCC CTGTGAACAC 1320 AGCACTGACT TACAGTAGAT CAGAACTCTG TTCCCAGCAT AAGATTTGGG GGAACCTGAT 1380 GAGTTTTTTT TTTGCATCTT TAATAATTTC TTGTATGTTG TAGAGTATGT TTTAAAATAA 1440 ATTTCAAGTA TTTTTTTTAA AAACTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1496 配列番号： 8

配列の長さ： 1 4 9 6

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

起源

生物名： Homo Sapiens

： HAS303 配列の特徴

特徴を表す記号： C D S

存在位置： 45. . 1313

特徴を決定した方法： P 特徴を表す記号： sig peptide

存在位置： 45. . 119

特徴を決定した方法： S 特徴を表す記号： mat peptide

存在位置： 120. . 1313

特徴を決定した方法： S

配列

GGGAACGTAG AACTCTCCAA CAATAAATAC ATTTGATAAG AAAG ATG GCT TTA AAA 56

Met a Leu し ys

- 25

GTG CTA CTA GAA CAA GAG AAA ACG TTT TTC ACT CTT TTA GTA TTA CTA 104 Val し eu Leu Glu Gin Glu し ys Thr Phe Phe Thr Leu Leu Val し eu Leu

- 20 -15 -10

GGC TAT TTG TCA TGT AAA GTG ACT TGT GAA ACA GGA GAC TGT AGA CAG 152 Gly Tyr Leu Ser Cys し ys Val Thr Cys Glu Thr Gly Asp Cyc Arg Gin - 5 1 5 10

CAA GAA TTC AGG GAT CGG TCT GGA AAC TGT GTT CCC TGC AAC CAG TGT 200 Gin Glu Phe Arg Asp Arg Ser Gly Asn Cys Val Pro Cys Asn Gin Cys

15 20 25 GGG CCA GGC ATG GAG TTG TCT AAG GAA TGT GGC TTC GGC TAT GGG GAG 248 Gly Pro Gly Met Glu Leu Ser Lys Glu Cys Gly Phe Gly Tyr Gly Glu

30 35 40

GAT GCA CAG TGT GTG ACG TGC CGG CTG CAC AGG TTC AAG GAG GAC TGG 296 Asp Ala Gin Cys Val Thr Cys Arg Leu His Arg Phe Lys Glu Asp Trp

45 50 55

GGC TTC CAG AAA TGC AAG CCC TGT CTG GAC TGC GCA GTG GTG AAC CGC 344 Gly Phe Gin Lys Cys Lys Pro Cys Leu Asp Cys Ala Val Val Asn Arg

60 65 70 75

TTT CAG AAG GCA AAT TGT TCA GCC ACC AGT GAT GCC ATC TGC GGG GAC 392 Phe Gin Lys Ala Asn Cys Ser Ala Thr Ser Asp Ala lie Cys Gly Asp

80 85 90

TGC TTG CCA GGA TTT TAT AGG AAG ACG AAA CTT GTC GGC TTT CAA GAC 440 Cys し eu Pro Gly Phe Tyr Arg Lys Thr Lys Leu Val Gly Phe Gin Asp

95 100 105

ATG GAG TGT GTG CCT TGT GGA GAC CCT CCT CCT CCT TAC GAA CCG CAC 488 Met Glu Cys Val Pro Cys Gly Asp Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Pro His

110 115 120

TGT GCC AGC AAG GTC AAC CTC GTG AAG ATC GCG TCC ACG GCC TCC AGC 536 Cys Ala Ser Lys Val Asn Leu Val Lys lie Ala Ser Thr Ala Ser Ser

125 130 135

CCA CGG GAC ACG GCG CTG GCT GCC GTT ATC TGC AGC GCT CTG GCC ACC 584 Pro Arg Asp Thr Ala Leu Ala Ala Val lie Cys Ser Ala Leu Ala Thr 140 145 150 155 GTC CTG CTG GCC CTG CTC ATC CTC TGT GTC ATC TAT TGT AAG AGA CAG 632 Val Leu Leu Ala Leu Leu lie Leu Cys Val lie Tyr Cys Lys Arg Gin

160 165 170 TTT ATG GAG AAG AAA CCC AGC TGG TCT CTG CGG TCA CAG GAC ATT CAG 680 Phe Met Glu Lys Lys Pro Ser Trp Ser Leu Arg Ser Gin Asp lie Gin

175 180 185

TAC AAC GGC TCT GAG CTG TCG TGT CTT GAC AGA CCT CAG CTC CAC GAA 728 Tyr Asn Gly Ser Glu Leu Ser Cys Leu Asp Rro Arg Gin Leu His Glu

190 195 200

TAT GCC CAC AGA GCC TGC TGC CAG TGC CGC CGT GAC TCA GTG CAG ACC 776 Tyr Ala His Arg Ala Cys Cys Gin Cys Arg Arg Asp Ser Val Gin Thr

205 210 215

TGC GGG CCG GTG CGC TTG CTC CCA TCC ATG TGC TGT GAG GAG GCC TGC 824 Cys Gly Pro Val Arg Leu し eu Pro Ser Met Cys Cys Glu Glu Ala Cys

220 225 230 235

AGC CCC AAC CCG GCG ACT CTT GGT TGT GGG GTG CAT TCT GCA GCC AGT 872 Ser Pro Asn Pro Ala Thr Leu Gly Cys Gly Val His Ser Ala Ala Ser

240 245 250

CTT CAG GCA AGA AAC GCA GGC CCA GCC GGG GAG ATG GTG CCG ACT TTC 920 Leu Gin Ala Arg Asn Ala Gly Pro Ala Gly Glu Met Val Pro Thr Phe

255 260 265

TTC GGA TCC CTC ACG CAG TCC ATC TGT GGC GAG TTT TCA GAT GCC TGG 968 Phe Gly Ser Leu Thr Gin Ser lie Cys Gly Glu Phe Ser Asp Ala Trp

270 275 280

CCT CTG ATG CAG AAT CCC ATG GGT GGT GAC AAC ATC TCT TTT TGT GAC 1016 Pro Leu Met Gin Asn Pro Met Gly Gly Asp Asn lie Ser Phe Cys Asp

285 290 295

TCT TAT CCT GAA CTC ACT GGA GAA GAC ATT CAT TCT CTC AAT CCA GAA 1064 Ser Tyr Pro Glu Leu Thr Gly Glu Asp lie His Ser Leu Asn Pro Glu 300 305 310 315 mm：ー 口

藤本一： ¾ω饞 Z 腿： m m 6 ^·暴 ½a

96 ΐ WW VVVVVVVVVV OZ zsn vvvvvvvvvv vwwvviov vwv 丄丄丄 XIVIOVVOII IWVIVWVX IllOIVlOVO

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配列の長さ ： 2 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列

AGAAAGATGG CTTTAAAAGT GCTACTAG

Claims

請求の範囲

1 . 実質的に純粋な形である配列番号 1または 5で示されるアミノ酸配列から なるポリペプチド、 そのホモローグ、 そのフラグメントまたはそのフラグメント のホモローグからなるポリぺプチド。

2 . 配列番号 1または 5で示されるアミノ酸配列からなる請求の範囲 1記載の ポリペプチド。

3 . 請求の範囲 1に記載されたポリペプチドをコードする D NA。

4 . 配列番号 2または 6で示される塩基配列を有する請求の範囲 3記載の D N A、 またはその配列に選択的にハイブリダィズするフラグメントからなる D N A。

5 . 配列番号 3または 7で示される塩基配列を有する請求の範囲 3記載の D N A、 またはその配列に選択的にハイブリダィズするフラグメントからなる D N A。

6 . 請求の範囲 3から 5のいずれかの項に記載の D N Aからなる複製または発 現べクタ一。

7 . 請求の範囲 6記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

8 . 請求の範囲 1または 2に記載されたポリペプチドを発現させるための条件 下で請求の範囲 7記載の宿主細胞を培養することからなる該ポリぺプチドの製造 方法。

9 . 請求の範囲 1または 2に記載されたポリべプチドのモノクローナルまたは ポリクローナル抗体。

1 0 . 請求の範囲 1または 2に記載されたポリペプチドまたは請求の範囲 9記 載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および/または担体を含有することを 特徴とする薬学的組成物。