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WO1998039034A2 - Verwendung von anti-cd44 antikörper enthaltenden präparationen zur behandlung bestimmter tumore und zur unterdrückung von immunreaktionen - Google Patents

Verwendung von anti-cd44 antikörper enthaltenden präparationen zur behandlung bestimmter tumore und zur unterdrückung von immunreaktionen Download PDF

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Publication number
WO1998039034A2
WO1998039034A2 PCT/EP1998/001089 EP9801089W WO9839034A2 WO 1998039034 A2 WO1998039034 A2 WO 1998039034A2 EP 9801089 W EP9801089 W EP 9801089W WO 9839034 A2 WO9839034 A2 WO 9839034A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibodies
preparation
scd44
vcd44
prophylactic
Prior art date
Application number
PCT/EP1998/001089
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO1998039034A3 (de
Inventor
Peter Herrlich
Helmut Ponta
Jan Simon
Johannes Weiss
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh, Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh
Priority to CA002281934A priority Critical patent/CA2281934A1/en
Priority to JP53812198A priority patent/JP2001513794A/ja
Priority to EP98912401A priority patent/EP0967996A2/de
Publication of WO1998039034A2 publication Critical patent/WO1998039034A2/de
Publication of WO1998039034A3 publication Critical patent/WO1998039034A3/de

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2884—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD44
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to the use of anti-CD44 antibodies against both the constant and the variable part of CD44 for the treatment of certain tumors and other diseases associated with the degeneration and activation of Langerhans cells (LC) and dendritic cells (DC ) are associated within a mammalian body, including humans, and for the treatment of unwanted immune reactions.
  • Another object of the present invention relates to an ex vivo culture process for the production of dendritic cells
  • Epidermal Langerhans cells belong to the family of dendritic cells (DC) of the blood, which are an essential part of the peripheral immune system (Simon, JC et al, dermatologist 43 241-249, 1992) due to their exposed position in the skin or In other peripheral organs they form the "guard posts of the immune system" (Simon, JC et al, 1992, loc cit.) They belong to the most potent immune cells of the mammal or the human organism and are the only ones with the ability to carry out primary T-cell-mediated immune reactions Examples of such immune reactions are delayed-type allergies, tianplant rejection, and immune responses against viruses or tumors (G ⁇ abbe, S et al, Immunology Today _16 1 17-121, 1995, Moll, H, The immunehenctions of epidermal Langerhans cells, Heidelberg Springer Verlag, 1995, Steinmann, RM et al, Adv Exp Med Bwl. 329 1-9-, 1993, Schuler, G et al,
  • dendritic cells produced outside the body have recently also been used as immunotherapeutics, for example in certain tumors (Grabbe, S et al, 1995, loc. Cü.)
  • those produced by the known methods reach DC only rarely the peripheral lymph nodes in which they can trigger an immune response, so that the DC produced ex vivo according to the prior art are not as effective as immunotherapeutic agents
  • the surface glycoprotein CD44 is of central importance for the migration of activated immune cells and certain tumor cells into the peripheral lymph nodes (Zahalka, MA et al, J. Immunol.
  • CD44 is a glycoprotein located on the cell surface, which was originally described as a "lymphocyte homing receptor" (Screaton, GR et al, 1992, loc. Cit.) It is intended for the adhesion of lymphocytes to certain mucous endothelial cells of veins (Peyer's patch or Peyer-Plaques or Folliculi lymphatici aggregati) or postcapillary veins of the lymph nodes (Jalkanen ST et al, Eur. J Immunol 16 1195-1202, 1986, Camp, RL et al, J. Exp. Med.
  • CD44 glycoprotein is believed to be involved in the maturation and activation of lymphocytes and / or to have an increased migratory effect on all lymphoblasts (e.g. Camp, RL et al, 1991, Joe cit, Huet, S et al, J. Immunol 143 798-801, 1989) and is said to play a role as an anchor point for other adhesion molecules (Shimizu, Y et al, J. Immolol 143 2457-2463, 1989) all these functions from CD44 ei clarified unclear
  • rat tumor cells that metastasize via the lymphatic system (BSp73 cells of a spontaneous rat pancreatic adenocarcinoma) that these cells express variants of CD44 (vCD44) and for the spreading ("trafficking") of Tumor cells are responsible These conditions could also be demonstrated on other tumor cell lines
  • vCD44 glycoprotein confers a priori non metastatic tumor metastasis, whereas the standard form of CD44 (sCD44) is not able to do so.
  • sCD44 standard form of CD44
  • BSp73AS non-metastatic variant AS
  • BSp73ASML metastatic variant ASML
  • mAbs monoclonal antibodies
  • BSp73ASML cells which metastasize in lymph nodes and lungs.
  • MAbs were produced which were directed against the membrane proteins of BSp73ASML cells (Matzku, S et al., 1989, loc. cit.)
  • One of these mAbs which only recognizes epitopes on BSp73 ASML cells, but not those on BSp73AS cells or other non-tumorogenic cells, was used to make one Search the E. coh cDNA expression library, prepared from poly (A) + RNA from BSp73ASML cells and a suitable vector system.
  • a clone (pMeta-1) was identified which contains the complete cDNA with a length of 3207 bp and which codes for an additional domain of 162 amino acids.
  • This domain is neither found in sCD44 cells nor in other non-metastatic tumor cells and contains the mAb-specific epitope coding End region
  • vCD44 represents a splice variant of sCD44 and that the expression of the vCD44 RNAs with the formation of Associated with metastases
  • the additional extracellular domain (amino acids 224 to 385 in pMeta-1) encoded by the 486 bp insertion is the metastasis-relevant portion of the surface glycoprotein vCD44 (Matzku, S et al, 1989, / oc. cit)
  • the metastatic tumor growth (rat adenocarcinoma) could be suppressed after immunization with monoclonal antibodies which recognize the aforementioned epitope or which specifically react with this extracellular region of vCD44 (Reber, S et al, Int. J Cancer 46 919-927, 1990 )
  • CD44 While the smallest CD44 isoform, the standard form sCD44, is ubiquitously expressed in a number of different tissues, including epithelial cells, certain splice variants of CD44 (vCD44) are only expressed on one Subgroup of epithelial cells exp ⁇ mierA
  • the CD44 isoforms are generated by alternative splicing in such a way that the sequences of 10 exons (vl-vlO) are completely cut out in sCD44, but can occur in different combinations in the larger variants (Screaton, GR et al , 1992, loc cit., Heider, K -H et al., J. Cell. Bwl.
  • CD44 variants differ in that different amino acid sequences are inserted at a certain point in the extracellular part of the protein. Such variants could be detected in different human tumor cells and in human tumor tissue.
  • the expression of CD44 variants was recently observed of colorectal carcinogenesis was investigated (Heider, K -H et al, 1993, loc cit.)
  • the expression of CD44 variants is absent in normal human tissue (eg colonic epithelium), and only a weak expression is detectable in the proliferating cells of the crypts later stages of tumor progression, eg in adenocarcinomas, all malignant degenerations express variants of CD44.
  • the expression of CD44 splice variants in activated lymphocytes and in non-Hodgkin lymphomas was recently shown (Koopman, G et al., J Exp.Med. YR 897-904, 1993)
  • amino acid sequence of exon v4 of human vCD44 is (one-letter code)
  • amino acid sequence of exon v5 of human vCD44 is (one-letter code)
  • amino acid sequence of exon v6 of human vCD44 is (one letter code)
  • WO 91/17248 describes the use of anti-vCD44 antibodies for the therapy and diagnosis of tumors.
  • WO 95/00851 relates to the use of antibodies directed against variant ⁇ exons of CD44 for the diagnosis and analysis of tumors.
  • WO 95/04547 describes the use of such antibodies for immunotherapeutic and immunoscintigraphic purposes, which are directed in particular against the variant exon v5.
  • WO 95/33771 describes antibodies against variant exon v6 of CD44.
  • EP-A 0 538 754 describes the use of against variant CD44 (vCD44) directed antibodies for immunosuppression are described
  • the object of the present invention was to provide means for the treatment of certain tumors and for the suppression of immune responses and the development of methods for producing such means
  • DC dendritic cells
  • an ex vivo cultivation method for the production of dendritic cells which preferably migrate into peripheral lymph nodes, is also encompassed by the present invention
  • Such a cultivation method also solves the task of providing dendritic cells with the ability to specifically migrate into the peripheral lymph nodes, adhere there to the T-cell areas and initiate a T-cell-mediated immune response. This is of great importance for the use such dendritic cells for immunotherapeutic purposes.
  • Preferred antibodies for the uses according to the invention are those which react with epitopes of the N-terminal part of the constant part of CD44 (sCD44) or the epitopes which are coded by the variants exons v4, v5, v6 or v9, recognize what antibodies against v6 are very preferred.
  • the N-terminal part of the constant part of CD44 is to be understood as the part of the protein which is caused by the constant exons 1 to 5 of the CD44 gene according to the publication by Screaton et al. (Screaton GR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12160-12164, 1992). Antibodies which bind specifically to an epitope which is coded by exon 2, 3, 4 and / or 5 are particularly preferred.
  • a preferred antibody against the N-terminal portion of the constant part of CD44 is the monoclonal antibody SFF-2, which is secreted by a hybridoma cell line, which was deposited on April 16, 1997 with the deposit number DSM ACC2305 at the DSM-Deutsche Sammlung for microorganisms and cell cultures GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany, or derivatives of this antibody.
  • One aspect of the present invention accordingly relates to the use of anti-sCD44 and / or anti-vDC44 antibodies for the preparation of a preparation for the prophylactic and therapeutic treatment of malignant diseases associated with degeneration, activation or massive proliferation of Langerhans cells (LC) and / or dendritic cells (DC) are associated.
  • LC Langerhans cells
  • DC dendritic cells
  • Langerhans cell histiocytoses, histiocytosis X, Abt-Letters-Siewe syndrome, eosinophilic granuloma Simon, J.C. et al., Dermatologist 43: 241-249, 1992).
  • Another aspect of the present invention is the use according to the invention of anti-sCD44 antibodies which recognize N-terminal epitopes of sCD44, or parts thereof, for the preparation of a preparation for prophylactic and therapeutic use.
  • treatment of malignant diseases associated with degeneration, activation or massive proliferation of Langerhans cells (LC) and / or dendritic cells (DC) is a technique for treating malignant diseases associated with degeneration, activation or massive proliferation of Langerhans cells (LC) and / or dendritic cells (DC)
  • a still further aspect of the present invention resides in the above-mentioned uses according to the invention of anti-sCD44 antibodies, the antibodies being monoclonal antibodies or fragments or derivatives thereof
  • the use of antibodies, which are directed against epitopes, which are encoded by variant exons of vCD44 or parts thereof, for the preparation of a preparation for the prophylactic and therapeutic treatment of malignant diseases associated with are associated with degeneration, activation or massive proliferation of Langerhans cells (LC) and / or dendritic cells (DC).
  • LC Langerhans cells
  • DC dendritic cells
  • the present invention comprises the use of antibodies directed against epitopes which are encoded by the variants exons v4, v5, v6 and / or v9 or parts thereof, for the preparation of a preparation for the prophylactic and therapeutic treatment of malignant diseases associated with degeneration, activation or massive proliferation of Langerhans cells (LC) and / or dendritic cells (DC)
  • LC Langerhans cells
  • DC dendritic cells
  • the invention encompasses the use of antibodies which are capable of reacting with the following amino acid sequences or parts thereof
  • monoclonal antibodies are included for the purpose according to the invention, as well as fragments and derivatives thereof
  • the invention comprises the use of the anti-ko ⁇ ers VFF-18, which is secreted by a hybridoma cell line, which was deposited on June 7, 1994 under the deposit number DSM ACC2174 at the DSM-Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany, was deposited (WO 95/33771), or derivatives of this antibody
  • An additional aspect of the present invention relates to the use of ant-sCD44 antibodies for the preparation of a preparation for the suppression or alleviation of undesirable or excessive immune reactions for the therapy or prophylaxis of diseases caused thereby or in order to positively influence related events
  • anti-sCD44 antibodies includes all those diseases and conditions of a mammalian organism which are based on an immune regulatory disorder or an undesirable or excessive immune reaction, such as allergic diseases, in particular allergies of the delayed type, rejection of skin or organ transplants, autoimmune diseases, diseases of the rheumatic type, multiple sclerosis, psoriasis or atopic dermatitis
  • anti-sCD44 antibodies described are suitable both for prophylactic measures and for therapeutic treatments
  • monoclonal anti-sCD44 antibodies according to the invention are included for the above-mentioned uses for influencing immune reactions in the sense of prophylactic and therapeutic treatments, the antibodies being monoclonal antibodies or fragments or derivatives thereof
  • the above-mentioned uses for influencing immune reactions of the anti-V6-encoded epitope, or parts thereof, directed against the V6-encoded epitope and those antibodies which are able to react with the epitope recognized by VFF-18 or parts thereof includes
  • Another aspect of the present invention relates to the production of dendritic cells and their use for triggering or initiating an immune reaction in vivo for immunotherapy, in particular adoptive immunotherapy, for example adoptive immunotherapy for tumors or viral diseases
  • DC could be produced which immigrate to peripheral lymph nodes and attach there preferentially in the T-cell areas.
  • the process is based on the invention that monocytes from the peripheral blood of healthy blood donors or of patients with malignant tumors, for example melanomas, or isolated from the bone marrow, and the cells obtained therefrom in a suitable culture medium, for example RPMI 1640, supplemented with serum, antibiotics, non-essential amino acids, a buffer, for example with an active in the range from pH 6 0 and pH 8 5 ven buffer, in particular with an organic buffer, and at least one cytokine, cultured for a few days and then isolated
  • a suitable culture medium for example RPMI 1640
  • serum for example RPMI 1640
  • a buffer for example with an active in the range from pH 6 0 and pH 8 5 ven buffer, in particular with an organic buffer, and at least one cytokine, cultured for a few days and then isolated
  • the method is characterized in that the isolated monocytes as described above are in a culture medium consisting of RPMI 1640, fetal calf serum, penicillin / streptomycin, one of an N-substituted aminosulfonic acid, for example Hepes [4- (2nd -Hydroxyethyl) -l-piperazinethanesulfonsaure] existing buffer, non-essential amino acids, L-glutamine, GM-CSF (granulocyte / macrophage colony-stimulating factor, described for example in WO86 / 03225 or by Cantrell, MA et al, Proc. Natl Acad Sei USA 82 6250-6254, 1985), cultivated for a few days and then isolated
  • RPMI 1640 fetal calf serum
  • penicillin / streptomycin one of an N-substituted aminosulfonic acid
  • an N-substituted aminosulfonic acid for example He
  • the method is characterized in that the isolated monocytes as described above are in a culture medium consisting of RPMI 1640, 10% FCS (fetal calf serum), 45 ⁇ g penicillin / streptomycin, 25 raM Hepes, 1 mM non-essential amino acids, 2 mM L-glutamine, 50 ng / ml human GM-CSF, preferably recombinant human GM-CSF, and 1000 U / ml interleukin-4 (IL-4) for 8 days and then cultured be isolated.
  • a culture medium consisting of RPMI 1640, 10% FCS (fetal calf serum), 45 ⁇ g penicillin / streptomycin, 25 raM Hepes, 1 mM non-essential amino acids, 2 mM L-glutamine, 50 ng / ml human GM-CSF, preferably recombinant human GM-CSF, and 1000 U / ml interleukin-4 (IL-
  • the culture consisted of> 90% dendritic cells which had the same CD44 isoform pattern as LC or DC, which migrated in vivo in lymph nodes.
  • the DC cultivated according to the invention bind like activated LC in the paracortical T cell from lymph nodes. This binding was preferably by using antibodies, the epitopes which are encoded by the variants exons v4, v5, v6 or v9, for example by the monoclonal antibody VFF18, or which react with antibodies against the constant part of CD44 (standard form, sCD44) Block antibodies against epitopes of the N-terminal part of the constant part of CD44 (sCD44).
  • immunotherapy in particular adoptive immunotherapy, for example adoptive immunotherapy of tumors or viral diseases, can advantageously be carried out in vitro.
  • Such an immunotherapy is therefore based on the fact that the migration behavior of the DC produced according to the invention from the blood or the bone marrow is influenced in such a way that the dendritic cells according to the invention migrate into the peripheral lymph nodes, where they initiate the desired immune reactions.
  • These cells can advantageously be used to optimize the immunogenicity of DC when used in adoptive immunotherapy for inflammatory, infectious, proliferative or hypo-proliferative diseases, for example viral or tumor diseases.
  • vCD44 glycoprotein or variant forms thereof
  • DNAs and RNAs nucleic acids
  • vCD44 antibodies directed against sCD44 or variant forms thereof (vCD44), in particular monoclonal antibodies, fragments and derivatives thereof, for the use according to the invention.
  • sCD44 or vCD44 on which the present invention is based are understood as meaning proteins or parts or epitopes thereof which are encoded by RNA, DNA or transcripts coding for sCD44 or vCD44, including those which are caused by mutations, for example by deletions, insertions, substitutions , Inversions, transitions, transversions are changed, and those which are compatible with the DNA sequences described in the prior art, for example in Tölg, C. et al., Nucleic Acids Res. 21 (5): 1225-1229, 1993, or in Srceaton, GR et al, Proc. Natl. Acad - Sei USA 89 12160-12164, 1992, hybridize under the known conventional conditions. It is immaterial whether the production and isolation of these nucleic acids takes place conventionally via cell cultures, or via DNA recombination, via synthetic or semisynthetic processes
  • sCD44 vCD44 are further to be understood in the context of the present invention, all j ene derived from animal or human glycoproteins, regardless' of their preparation or isolation by conventional cell cultures or DNA recombination, or any synthetic or semi-synthetic methods
  • antibody is understood to mean mono- or polyvalent antibody and poly- and monoclonal antibody, but also those that represent fragments thereof and derivatives thereof, including the F (ab ') 2, Fab' and Fab fragments, but also chimeric antibodies or hybrid antibodies with at least two antigen or epitope binding sites (for example quadroms, triomes), interspecies hybrid antibodies, anti-idiotypic antibodies and those thereof which have been chemically modified and are to be understood as derivatives of these antibodies and which are either known or conventional Methods of obtaining antibodies or using DNA recombination (for example diabodies), via hybridoma techniques or antibody engineering or synthetically or semi-synthetically can be prepared in a manner known per se and can bind to epitopes of sCD44 or vCD44.
  • Humanized antibodies can, for example, by CDR -grafting (EP 0239400) Framework can also be produced Regions can be modified (EP 0519596, WO 9007861) Methods such as PCR (see B EP 0368684, EP 0438310, WO 9207075) or computer modeling (see B WO 9222653) or computer modeling (see B WO 9222653) can be used today for the humanization of antibodies Kohler, G & Milstein, C, Nature 256 495-497, 1975, diverse literature known to the person skilled in the art should be pointed out
  • sCD44 and vCD44 With regard to the production of polyclonal antibodies against epitopes of sCD44 and vCD44, a number of methods are available. For this purpose, for example, different animals can be prepared in a manner known per se by injection with sCD44 or vCD44, which are of natural origin, via DNA recombination or synthetically , or fragments thereof, can be immunized and the desired polyclonal antibodies can be obtained and purified from the sera obtained thereafter by known methods. Alternatively, intact cells can also be used. Various adjuvants can be used to increase the immune response to the sCD44 or vCD44 administration.
  • the monoclonal antibodies against an epitope of sCD44 or an epitope of vCD44 preferred for the use according to the invention can be obtained by any technique which is available for the production of antibodies by culturing celiums. Examples of such known techniques are those of Kohler, G & Milstem, C, 1975, loc.
  • the antibodies can be purified by known methods, for example by immunoabsorption or immunoaffinity chromatography, by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) or combinations thereof.
  • Antibody fragments which contain the idiotype of the molecule can likewise be prepared by known methods.
  • F ( ab ') 2 fragments can be obtained by pepsin digestion of the complete poly- or monoclonal antibody.
  • Fab' fragments can be obtained, for example, by reducing the disulfide bridges of the F (ab ') 2 fragment in question and Fab fragments can be produced, for example, by treating the antibody molecules with papain and a reducing agent
  • any known method can be used for the identification and selection of antibodies, fragments or derivatives thereof which react with an epitope of sCD44 or vCD44, for example in that the antibodies in question can be detected after appropriate labeling if they are isolated or purified from sCD44 or vCD44 or Have parts of it bound or by immunoprecipitation of the sCD44 or vCD44 purified, for example, using polyacrylamide gels, or by the fact that antibodies against sCD44 or vCD44 compete with other anti-sCD44 or anti-vCD44 antibodies for binding to sCD44 or vCD44 or parts thereof
  • the invention also includes the use of hybridoma cell lines for the preparation of the preparations described in the present invention for the preparations on which the invention is based
  • preparations with such antibodies can be used in the tumor diseases and immune processes in animals and humans described in the present description, which include prevention or prophylaxis or therapeutic treatment
  • the designated antibodies or the preparations they contain are suitable for the prevention and treatment of diseases and conditions which require a temporary or permanent reduction or suppression of an immune response
  • autoimmune diseases such as diseases of the rheumatic type, multiple sclerosis, psoriasis, atopic dermatitis, or to prevent rejection of transplanted tissues or organs such as kidney, heart, lungs, bone marrow, spleen, cutis or cornea, during adverse reactions during or after transfusions, or from allergic diseases , for example, those that relate to the gastrointestinal tract and can become manifest there at the end of the day, or from terminal, proliferative and hypo-proliferative diseases and cutaneous manifestations of immunologically related diseases, such as eczematosis dermatitis, urticaria, vasculi tidal, scleroderma
  • immunologically related diseases such as eczematosis dermatitis, urticaria, vasculi tidal, scleroderma
  • a systemic mode of action is a systemic mode of action for example, desirable when different organs or organ systems are in need of treatment, such as with systemic autoimmune diseases or allergies or with transplants of foreign, larger organs or tissues or with tumors that are difficult to localize.
  • a local effect would have to be considered if only local manifestations of a neoplastic or immunological event are to be influenced, such as, for example, in the case of local tumor events, small-area transplants of cutis, and cornea, or in the case of local immunological reactions, for example the skin, for example local dermatitis.
  • the antibodies in question can be administered via any enteral or parenteral route of application known to the person skilled in the art.
  • the intravenous, intravascular, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, oral, or intrathecal route is suitable.
  • a more local administration can take place, for example, subcutaneously, intracutaneously, intracardially, intralobarically, intramedullarily, intrapulmonally or in or to the tissue to be treated (connective, bone, muscle, nerve, epithelial or bone tissue).
  • the antibody preparations can be administered one or more times, also intermittently, per day over several days, weeks or months and at different doses.
  • the injectable, physiologically compatible solutions known to the person skilled in the art can be used in sterile form to produce an antibody preparation suitable for the applications mentioned.
  • the known aqueous isotonic solutions for example saline or a corresponding plasma protein solution without gamma globulin, are available for producing a ready-to-use solution for parenteral injection or infusion.
  • the preparation can also be in the form of a lyophilisate or dry preparation, which can be reconstituted with one of the known injectable solutions immediately before use under sterile conditions, e.g. as a kit of parts.
  • the final preparation of an antibody preparation for injection, infusion or perf sion to be used according to the invention is carried out by mixing antibodies purified according to known methods in accordance with the definitions given above with one of the physiologically compatible solutions mentioned, which can optionally be supplemented with known excipients or auxiliaries (e.g. serum albumin, dextrose, sodium bisulfite, EDTA).
  • auxiliaries e.g. serum albumin, dextrose, sodium bisulfite, EDTA.
  • the amount of antibodies to be administered depends on the type and severity of the disease or disorder to be treated or the condition to be influenced and the patient concerned, whether animal or human. However, it must be assumed that the dosage to be used is 1 to 1000 mg, preferably 5-200 mg, of the antibody in question per dose unit, as is also common for other antibodies or monoclonal antibodies, between 0.01 to 20 mg / day and 0.1 to 100 mg / kg body weight / day can also be given over a long period (days, weeks, months) to achieve the desired effects achieve - depending on how intensively and for how long a prophylactic or therapeutic effect should be achieved.
  • Freshly isolated HLA-DR + LC expressed an N-terminal epitope of CD44 (referred to as "pan CD44") and an epitope which was formed jointly by CD44 exons v7 and v8 (Fig. La).
  • Epitopes encoded by exons v5 and v6 were only weakly expressed, whereas epitopes encoded by v4, v9 and v10 were not detectable (Fig. La).
  • LCs that were cultured for 48 and 72 hours carried elevated (2-fold) values for N-terminal epitopes.
  • the epitopes of v4, v5, v6 and v9 were also downregulated (Fig. La).
  • the CFD44v7 / 8 was lost during cultivation (Fig. La).
  • a CD44 vlO epitope could not be detected. It can be concluded that LC activation is accompanied by an increased synthesis of CD44 and by a change in either epitope access or epitope splicing.
  • LC belong to the family of dendritic cells (Steinman, RM, Annu. Rev. Immuno l.9: 271-296, 1991).
  • DCs from other origins express CD44 epitopes that are similar to those of LC.
  • DCs from peripheral blood were prepared by culturing in a cytokine cocktail (Sallusto, F. & Lanzavecchia, A., J. Exp. Med. 179: 1109-1118, 1994).
  • FACS analysis of CDla + (DC marker) cells revealed CD44 epitope patterns which were identical to those of cultured LC (FIG. 1b).
  • a very similar pattern of CD44 expression also emerged in cultured LC from skin of BL / 6 mice (Fig. Lc).
  • a skin explant culture (Larsen, CP et al., J. Exp. Med. 172: 1483-1493, 1990) was used in the LC actively migrated from the epidermis to the dermis.
  • Full, whole skin punch biopsies (“whole thickness punch biopsies") from human skin were cultured between 0 and 72 hours.
  • LC were examined both by light microscopy with Lag mAb against Birbeck granules (cytoplasmic organelles specific for human epidermal LC (Kashihara, M. et al., J. Invest. Dermatol.
  • the LCs in the dermis had accumulated in cord-like structures within lymphatic vessels, which was identified by electron microscopy due to their characteristic, ultrastructural features of a "single layer" of endothelial cells with emerged nuclei.
  • CD44 on LC was monitored during migration by immunohistochemical double labeling with mAb Lag (FITC, green) and CD44-specific antibodies (Cy3, red). Double staining appeared yellow. Keratinocytes stained red because they carry various CD44 epitopes (CD44v2-v ⁇ O) (Hofmann, M. et al., Cancer Res. 53: 1516-1521, 1993; Hudson, DL et al., J. Cell. Science 108 (Pt 5): 1959-1970, 1995), but not the lag epitopes.
  • split skin (“split thickness skin”) was applied to culture medium in a floating manner and the LC was allowed to migrate into the medium. The latter were collected after 48 hours of cultivation. These LC carried epitopes of the CD44 N-terminus, v5, v6 and v9, but not v7 / 8 (Fig. 2 1, m). Thus, the CD44 phenotype of LC that completely migrated from the skin exactly matches that of the in vitro activated LC or DC.
  • LC were identified in frozen sections of axillary lymph nodes that had migrated to the regional lymph accounts via lymphatic vessels.
  • Lag + cells were found in the paracortical T cell zones of the lymph nodes and the majority of expressed epitopes of exons v4, v5, v6 and v9 (FIG. 2 k) in addition to the N-terminus of CD44 (FIG. 2 i), but not the v7 / 8 epitope. It can be concluded from this that the CD44 expression pattern acquired during emigration from the epidermis remains until LC has reached the lymph nodes.
  • Anti-CD44 antibodies were used to determine the functional importance of CD44 protein expression during the early stages of LC activation, during the adhesion of LC and DC to lymph nodes and during antigen presentation by LC.
  • both anti-CD44 N-terminal antibodies and, on the one hand, hyaluronic acid (HA) binding block e.g. MEM-85, Bennett, KL et al, J. Cell. Bwl 128 687-698, 1995
  • HA hyaluronic acid
  • mice were sensitized epicutaneously with DNFB (dinitrofluorobenzene), which was stimulated with the same hapten in Ear skin on day 6 resulted in a massive DTH ("Delayed Type Hypersensitivity") reaction, which was measured via the ear swelling (FIG. 5).
  • Anti-CD44 mAbs were injected ip on days -1, 0 and +1 with regard to the hapten application (um to test for interference with the sensitization phase of DTH, which requires LC migration from the Epp dermis to the lymph nodes and hapten presentation (Austyn, JM, J. Exp.
  • N-terminal CD44 antibodies The inhibition of the extravasation phase of DTH by N-terminal CD44 antibodies is known (Camp, RL et al., 1993, loc. Cit.)
  • Fig. 1 Change in CD44 epitope expression during in vitro cultivation of epidermal LC and blood DC. (a) Freshly isolated human LC and after 48 and 72 hours of cultivation and (c) mouse
  • BL / 6 skin LC after 72 hours of cultivation were stained with mAbs against HLA-DR or Iab, 7-AAD and mAbs against CD44 epitopes.
  • the mean fluorescence intensity of HLA-DR + cells was determined using FACScan. Representative result for 6 experiments with cells from different donors. Low expression of CD44v epitopes on fLC was not demonstrated by those used during the isolation procedure
  • Fig. 2 LC migrating from the epidermis into the dermis and lymph nodes show the same CD44 expression pattern as LC / DC activated in vitro. Frozen sections of skin cultured for 12 hours were detected using FITC-conjugated MAK goat anti-mouse lag (Birbeck recognizes granules, specific cytoplasmic
  • Antibodies were added to split-thickness skin cultures and the cells which had migrated from the split skin into the medium were analyzed by FACS, (a) treatment with MEM-85 or control mAb. CD1 + , living (propidium iodide negative) LC are encircled. The fraction of these cells over the total number of cells is shown in the upper corner of each graphic as%, (b) ⁇ "
  • Fig. 4 The binding of LC or DC to paracortical lymph node areas is inhibited by antibodies against CD44.
  • Fig. 5 Antibodies to CD44v epitopes inhibit the sensitization phase of contact hypersensitivity in vivo.
  • Group 2 mice were raised as indicated both before and during the
  • Sensitization phase with the specified mAbs i.p. group 3 mice were treated equally before and during the challenge phase.
  • Group 1 mice were not treated with mAbs. * statistically significant reduction in ear swelling at p ⁇ 0.05 ("one way ANOVA", Dunnett's test)
  • Example 1 Isolation of the Langerhans cells (LC) and the dendritic cells (DC)
  • Human epidermal cell suspensions were prepared according to the method of Simon, JC, et al., Exp. Dermatol. 4: 155-161, 1995, by limited trypsinization of human skin obtained in plastic surgery.
  • Murine LC were derived from the trunk skin of female C57 / BL63 mice (Harlan-Olac, Great Britain) according to Simon, J. C, et al., J. Immunol. 146 485-491, 1991, LC were enriched to 5-20% by density gradient centrifugation on lymphophoprep (Gibco). Both fresh LC and in supplemented RPMI (Simon, JC, et al, Exp. Dermatol.
  • an anti-exon v4 monoclonal antibody an anti-exon v6 monoclonal antibody, isotype control
  • EB7 rats IgGl, Dianova, Hamburg
  • secondary anti-coherent FITC-labeled sheep -anti-mouse (Fab) 2 and sheep-anti-mouse (Fab) 2 (Dianova, Hamburg)
  • the Treatment with the secondary antibody was followed by a 10 minute incubation in 2% normal mouse or rat serum and then incubation with PE- (phykoerythrin) labeled HLA-DR specific antibody (L234, mouse IgGl, Becton Dickinson) or Ia D ( Mouse IgG2b, Pharmingen, Hamburg) or corresponding non-reactive PE-labeled control antibodies (Dianova)
  • Human DC were identified by FITC-conjugated mAb against CDla (Oct-6, mouse IgGl, Ortho, Neckargemund) 7- aminoactinomycin D (7
  • LC or DC MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) enriched with antibodies against HLA-DR or CDla were tested for their binding to lymph node frozen sections (Pope, M et al, J. Invest Dermatol. 104: 11 -17, 1995).
  • Fresh frozen slides (10 mm) from human axillary lymph nodes were blocked with RPMI, with 1% bovine serum albumin (BSA), at 7 ° C. for 1 hour.
  • LC or DC were suspended in HBSS (Gibco) / 1% BSA (2 x 10 ⁇ cells / ml) and the frozen sections were placed at room temperature for 40 minutes.
  • the slides were rinsed with HBSS and fixed in acetone at 4 ° C for 10 minutes the blocking of the antibodies were LC or DC with mAbs (each 20 mg / ml for 30 minutes at 4 ° C), which directed against the N-terminus of CD44 (SFF-2, MEM-85) with v exon-specific antibodies (v5, VFF-8, v6, VFF-18, v9, FW 1 1 24 7 36), with ICAM-1 mAb 84H10 (Immunotech Corp, Boston, USA, Makgoba, MW et al, Nature_ 331 86-88, 1988) or with control IgGl.
  • mAbs each 20 mg / ml for 30 minutes at 4 ° C
  • v exon-specific antibodies v5, VFF-8, v6, VFF-18, v9, FW 1 1 24 7 36
  • ICAM-1 mAb 84H10 Immunotech Corp, Boston, USA, Makgoba, MW e
  • the slides were then stained with anti-CD la mAb according to Simon, JVC et al, Europ J Cancer 32A 1394-1400, 1996.
  • the coding and evaluation was carried out by two independent investigators background binding of cultured LC / DC was about 1 5 cells mm 2, the positive binding was 30 cells mm 2 the data were up as%> binding compared to samples without Antiko ⁇ er 'borne the standard deviation was calculated from three slides, each with 9 random fields per slide, calculated using an optical grid (10x magnification)
  • mice 6-week-old female C57 / BL63 mice (Harlan-Olac, Great England) were given 20 ⁇ l of 0.5% 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB, Sigma, Deisenhofen) in acetone on the abdominal skin on days 0 and 1 according to Simon, JC et al , Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. IQ 206-211, 1994, applied On day 6, the mouse was applied 10 .mu.l 0.2%> DNFB on both sides of the right ear.
  • DNFB 2,4-dinitrofluorobenzene
  • mice were either only stimulated or sensitized and stimulated in the absence of mAbs mAbs (ip) was performed as follows
  • Group 2 mice received 300 mg on day 1, 100 mg each on days 0 and 1
  • Group 3 mice received 300 mg on day 5 and 100 mg each on days 6 and 7
  • Each bar (Fig 5) represents the mean values of the ear swellings pooled by 8 animals
  • This international depository accepts the microorganism designated under 1, which it received on 19 97 - 04 - 16 (date of first deposit)
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von anti-CD44 Antikörpern von sowohl des konstanten (sCD44) als auch des variablen Teils von CD44 (vCD44) für die Behandlung bestimmter Tumore und anderen Erkrankungen, die mit einer Entartung und Aktivierung von Langerhans-Zellen (LC) und dendritischen Zellen (DC) innerhalb eines Säugetierkörpers einschließlich des Menschen assoziiert sind, und zur Behandlung unerwünschter Immunreaktionen. Ein weiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein ex vivo Kulturverfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen.

Description

Verwendung von anti-CD44 Antikörper enthaltenden Präparationen zur Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdrückung von Immunreaktionen
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von antι-CD44 Antikörpern gegen sowohl den konstanten als auch den variablen Teil von CD44 für die Behandlung bestimmter Tumore und- anderen Erkrankungen, die mit einer Entartung und Aktivierung von Langerhans-Zellen (LC) und dendritischen Zellen (DC) innerhalb eines Saugetierkorpers einschließlich des Menschen assoziiert sind, und zur Behandlung unerwünschter Immunreaktionen Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein ex vivo Kulturverfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen
Epidermale Langerhans-Zellen (LC) gehören zur Familie der dendritischen Zellen (DC) des Blutes, die ein wesentlicher Bestandteil des peripheren Immunsystems sind (Simon, J C et al , Hautarzt 43 241-249, 1992) Durch ihre exponierte Lage in der Haut oder anderen peripheren Organen bilden sie die "Wachposten des Immunsystems" (Simon, J C et al , 1992, loc cit.) Sie gehören zu den potentesten Immunzellen des Saugetiers bzw des menschlichen Organismus und haben als einzige die Fähigkeit, primäre T-Zell-vermittelte Immunreaktionen einzu- leiten Beispiele für solche Immunreaktionen sind Allergien vom verzögerten Typ, Tiansplan- tationsabstoßungen, sowie gegen Viren oder Tumoren gerichtete Immunantworten (G^abbe, S et al , Immunology Today _16 1 17-121, 1995, Moll, H , The immunefünctions of epidermal Langerhans cells, Heidelberg Springer Verlag, 1995, Steinmann, R M et al , Adv Exp Med Bwl. 329 1-9-, 1993, Schuler, G et al , Adv. Exp. Med. Biol. 329 243-249, 1993)
Voraussetzung für diese Immunfünktion der LC/DC ist ihre Wanderung von der Haut oder von anderen Organen in die peripheren Lymphknoten (Romani, N et al , J. Exp. Med j_80 83-93, 1994, Kripke, M L et al., J. Immunol. 145 2833-2838, 1990, Cumberbatch, M et al , Immunology 81 395-401, 1994) Dort haften sie in distinkten anatomischen Regionen an, den soge1- nannten parakortikalen T-Zell-Arealen, wo sie Antigen-spezifische ruhende "naive" T-Lym- phozyten aktivieren Die Mechanismen, welche diese gerichtete Wanderung und Anheftung blockieren sind nicht bekannt
Wegen ihrer außergewöhnlichen Fähigkeit, Immunantworten einzuleiten, werden außerhalb des Korpers hergestellte dendritische Zellen seit kurzem auch als Immuntherapeutika, zum Beispiel bei bestimmten Tumoren, eingesetzt (Grabbe, S et al , 1995, loc. cü.) Jedoch erreichen die durch die bekannten Verfahren hergestellten DC nur selten die peripheren Lymphknoten, in denen sie eine Immunantwort auslosen können, sodaß die nach dem Stand der Technik ex vivo hergestellten DC nicht in dem gewünschten Maße als Immuntherapeutika wirksam sind Das Oberflachen Glykoprotein CD44 ist von zentraler Bedeutung für die Wanderung von aktivierten Immunzellen und bestimmten Tumorzellen in die peripheren Lymphknoten (Zahalka, M A et al , J. Immunol. L54 5345-5355, 1995, Jalkanen, S et al , J Cell Bwl 105 983-990, 1987, Seiter, S et al , J. Exp. Med. \11 443-455, 1993, Thomas, L et al , J Invest Dermatol 100 115-200, 1993, Thomas, L et al , J. Cell. Bwl 118 971-977, 1992) Ob CD44 und/oder dessen Isoformen für die Wanderung von LC und DC und ihre Anheftung an Lymphknoten sowie ihre Immunfunktion eine Rolle spielen, ist unbekannt
Die DNA- und Aminosauresequenz von der konstanten Form bzw Standardform von CD44 des Menschen und verschiedener Tiere sind beschrieben, bespielsweise in Tolg, C et al , Nucl Acids Res. 21 1225-1229, 1993, Screaton, G R et al , Proc. Natl. Acad - Sci USA 89 12160- 12164, 1992, Stamenkovic, I et al , The EMBO Journal 10 343-348, 1991, Gunthert, U et al , Ce// 65 13-24, 1991, Stamenkovic, I et al , Cell 56 1057-1062, 1991)
Bei CD44 handelt es sich um ein auf der Zelloberflache lokalisiertes Glykoprotein, welches ursprunglich als "lymphocyte homing receptor" beschrieben wurde (Screaton, G R et al, 1992, loc. cit.) Es soll bei der Adhäsion von Lymphocyten an bestimmten mucosen Endothel- zellen von Venen (Peyer's patch oder Peyer-Plaques bzw Folliculi lymphatici aggregati) bzw postkapillaren Venen der Lymphknoten beteiligt sein (Jalkanen S T et al , Eur. J Immunol 16 1195-1202,1986, Camp, R L et al , J. Exp. Med. 173 763-766,1991) Darüber hinaus wird dem CD44 Glykoprotein eine Beteiligung bei der Reifung und Aktivierung von Lymphozyten zugeschrieben bzw einen die erhöhte Migrationsfahigkeit aller Lymphoblasten (mιt-)bedιngen- den Effekt (z B Camp, R L et al , 1991, Joe cit, Huet, S et al , J. Immunol 143 798-801, 1989) und soll eine Rolle als Ankerstelle für andere Adhasionsmolekule spielen (Shimizu, Y et al , J.Immunol 143 2457-2463, 1989) Bis heute sind jedoch nicht alle diese Funktionen von CD44 eindeutig geklart
Es konnte bei Ratten-Tumorzellen, die über das lymphatische System metastasieren (BSp73- Zellen eines spontanen Ratten Pankreas-Adenokarzinoms), festgestellt werden, daß diese Zel- len Varianten von CD44 (vCD44) exprimieren und für die Verbreitung ("trafficking") von Tumorzellen verantwortlich sind An anderen Tumorzellinien konnten ebenfalls diese Verhaltnisse nachgewiesen werden
Es konnte ferner gezeigt werden, daß dieses vCD44 Glykoprotein einen a priori nicht metasta- sierenden Tumor Metastasefahigkeiten verleiht, wahrend die Standardfrom von CD44 (sCD44) dazu nicht in der Lage ist Somit kann heute davon ausgegangen werden, daß vCD44 gegenüber sCD44 ein metastasespezifisches Protein ist, welches Tumoren die Fähigkeit verleiht, über die Lymphbahnen zu metastasieren (Gunthert, U et al , 1991, loc. cit.) Die weitere Aufklarung des vCD44 Glykoproteins der Ratte bis hin zur endgültigen Chat akte- risierung der DNA- und Aminosauresequenz gelang Gunthert, U et al , 1991, loc. cit , anhand des BSp73-Rattenzellsystems, welches aus zwei morphologisch bzw phenotypisch verschiedenen syngenen Zellvarianten besteht einer nichtmetastasierenden Variante AS (BSp73AS) und einer metastasierenden Variante ASML (BSp73ASML) (Matzku, S et al , Cancer Research 49 1294-1299, 1989)
Zu diesem Zweck wurden monoklonale Antikörper (mAbs) hergestellt, die die antigene Determinante auf der metastasierenden Variante BSp73ASML erkennen
Sowohl aus dem Primartumor (subcutaner nicht-metastasierender Knoten bestehend aus BSp73AS-Zellen) als auch einer Metastase davon (BSp73ASML-Zellen, welche in Lymphknoten und Lunge metastasieren) wurden Zellinien gewonnen Es wurden mAbs hergestellt, die gegen die Membranproteine von BSp73ASML-Zellen gerichtet sind (Matzku, S et al., 1989, loc. cit.) Einer von diesen mAbs, der nur Epitope auf BSp73 ASML-, nicht jedoch solche auf BSp73AS-Zellen oder anderen nicht-tumorogenen Zellen erkennt, wurde dazu benutzt, um eine E. coh cDNA-Expressionsbibliothek, hergestellt aus poly(A)+RNA von BSp73ASML-Zellen und einem geeigneten Vektorsystem, zu durchsuchen Auf diesem Weg konnte ein Klon identifiziert werden (pMeta-1) der die vollständige cDNA mit einer Lange von 3207 bp enthält und welche für eine zusatzliche Domäne von 162 Aminosäuren codiert Diese Domäne ist weder in sCD44-Zellen noch in anderen nicht-metastasierenden Tumorzellen zu finden und enthalt die mAb spezifische Epitop-codierende Region Anhand von mRNA Prapa- rationen aus Zellen verschiedener Geweben und damit durchgeführter mRNA DNA Hybridisierungen mit unterschiedlichen von den cDNA Klonen erhaltenen DNA Proben war festzustellen, daß vCD44 eine Spleiß-Variante von sCD44 darstellt und daß die Expression der vCD44 RNAs mit der Entstehung von Metastasen einhergeht Damit steht fest, daß die durch die 486 bp lange Insertion codierte zusatzliche extrazellulare Domäne (Aminosäuren 224 bis 385 in pMeta-1) der metastasenrelevante Anteil des Oberflächenglykoproteins vCD44 ist (Matzku, S et al , 1989, /oc. cit)
Das metastatische Tumorwachstum (Adenokarzinom der Ratte) konnte nach Immunisierung mit monoklonalen Antikörpern, die das vorgenannte Epitop erkennen bzw die spezifisch mit diesen extrazellularen Bereich von vCD44 reagieren, unterdruckt werden (Reber, S et al , Int. J Cancer 46 919-927, 1990)
Die Identifizierung dieser Varianten extrazellularen Domäne in der Ratte (pMeta-1 bzw rMeta- 1) ermöglichte, auch die dazu äquivalenten menschlichen Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzen aufzuklaren Es wurde kurzlich gezeigt, daß die Expression von Vaπanten des Oberflachen-Glykoproteins CD44 notwendig und hinreichend ist, um sogenanntes spontanes metastatisches Verhalten sowohl in einer nicht-metastasierenden Pankreas-Adenokarzinom-Zellinie der Ratte als auch in einer nicht-metastasierenden Fibrosarkom-Zellinie der Ratte auszulosen (Gunthert, U et al , 1991, loc. cit.) Wahrend die kleinste CD44-Isoform, die Standardform sCD44, in einer Reihe verschiedener Gewebe, darunter Epithelzellen, ubiquitar exprimiert wird, werden bestimmte Spleißvarianten von CD44 (vCD44) nur auf einer Untergruppe von Epithelzellen expπmierA Die CD44-Isoformen werden durch alternatives Spleißen so erzeugt, daß die Sequenzen von 10 Exons (vl-vlO) in sCD44 komplett ausgeschnitten werden, jedoch bei den größeren Vari- anten in verschiedenen Kombinationen vorkommen können (Screaton, G R et al , 1992, loc cit. , Heider, K -H et al., J. Cell. Bwl. 120 227-233, 1993, Hofmann, M et al , Cancer Res 5_1 5292-5297, 1991) Die Varianten unterscheiden sich dadurch, daß an einer bestimmten Stelle des extrazellularen Teils des Proteins unterschiedliche Aminosauresequenzen inseriert sind Solche Varianten konnten in verschiedenen menschlichen Tumorzellen und in mensch - chem Tumorgewebe nachgewiesen werden So wurde kurzlich die Expression von CD44- Varianten im Verlauf der kolorektalen Karzinogenese untersucht (Heider,K -H et al , 1993, loc cit.) Die Expression von CD44- Varianten fehlt in normalem menschlichem Gewebe (z B Kolonepithel), und nur eine schwache Expression ist in den proliferierenden Zellen der Krypten nachweisbar In späteren Stadien der Tumorprogression, z B in Adenokarzinomen, exprimie- ren alle malignen Entartungen Varianten von CD44 Weiter wurde kurzlich die Expression von CD44-Spleißvari?nten in aktivierten Lymphozyten sowie in Non-Hodgkin-Lymphomen gezeigt (Koopman, G et al., J. Exp.Med. YR 897-904, 1993)
In der Publikation von Tόlg, C et al , Nucleic Acids Res 21(5) 1225-1229, 1993, wird be- schrieben, daß CD44 in verschiedenen Isoformen vorkommt Die Aminosauresequenzen von zehn verschiedenen Exons vl bis vlO der Maus, Ratte und des Menschen werden offenbart
Die Aminosäure-Sequenz von Exon v4 von human vCD44 lautet (Einbuchstaben-Code)
ISTTPRAFDHTKQNQDWTQWNPSHSNPEVLLLQTTTRMT
Die Aminosaures-Sequenz von Exon v5 von human vCD44 lautet (Einbuchstaben-Code)
DVDRNGTTAYEGNWNPEAHPPLIHHEHHEEEETPHSTST
Die Aminosäure-Sequenz von Exon v6 von human vCD44 lautet (Einbuchstaben-Code)
QATPSSTTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDSHSTTGTA Die Aminosäure-Sequenz von Exon v9 von human vCD44 lautet (Einbuchstaben-Code)
QQSNSQSFSTSHEGLEEDKDHPTTSTLTSS
Die WO 91/17248 beschreibt die Verwendung von antι-vCD44 Antikörper für die Therapie und Diagnostik von Tumoren Die WO 95/00851 betrifft die Verwendung von gegen Variante^ Exons von CD44 gerichtete Antikörper für die Diagnose und Analyse von Tumoren In der WO 95/04547 wird die Verwendung von solchen Antikörpern für immuntherapeutische und immunszintigraphische Zwecke beschrieben, die insbesondere gegen das Variante Exon v5 gerichtet sind Die WO 95/33771 beschreibt Antikörper gegen variantes Exon v6 von CD44 In der EP-A 0 538 754 wird die Verwendung von gegen variantes CD44 (vCD44) gerichtete Antikörper für die Immunsuppression beschrieben
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung von Mitteln zu Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdrückung von Immunantworten und die Entwicklung von Verfahren zur Herstellung solcher Mittel
Die Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung im Rahmen der Beschreibung und der Patentansprüche gelöst werden, indem einerseits Antikörper gegen den konstanten Teil von CD44 (Standardform, sCD44) und/oder gegen die Varianten Formen von CD44 (vCD44) verwendet werden, um maligne Erkrankungen, die mit einer Entartung und Aktivierung von Langerhans Zellen (LC) und/oder dendritischen Zellen (DC) assoziiert sind, zu therapieren und in dem andererseits Antikörper gegen den konstanten Teil von CD44 (sCD44) verwendet wer- den, um unerwünschte oder überschießende Immunreaktionen zu unterdrucken und dadurch bedingte Erkrankungen und Ereignisse zu therapieren bzw positiv zu beeinflussen
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden nach bestimmten Verfahren hergestellte dendritische Zellen (DC) dazu verwendet, in vivo Immunreaktionen auszulosen oder einzuleiten, um beispielsweise eine adoptive Immuntherapie durchzuführen
In diesem Zusammenhang wird auch ein ex vivo Kultivierverfahren zur Herstellung dendritischer Zellen, die vorzugsweise in periphere Lymphknoten einwandern, von der vorliegenden Erfindung umfaßt
Mit einem solchen Kultivierungsverfahren wird auch die Aufgabe gelost, dendritische Zellen mit der Fähigkeit auszustatten, gezielt in die peripheren Lymphknoten einzuwandern, dort in den T-Zell-Arealen zu haften und eine T-Zell-vermittelte Immunreaktion einzuleiten Dies hat große Bedeutung für die Verwendung solcher dendritischer Zellen für immuntherapeutische Zwecke. Als bevorzugte Antiköφer kommen für die genannten, erfindungsgemäßen Verwendungen solche in Betracht, die mit Epitopen des N-terminalen Anteils des konstanten Teils von CD44 (sCD44) reagieren oder die Epitope, die durch die Varianten Exons v4, v5, v6 oder v9 kodiert werden, erkennen, wovon Antiköφer gegen v6 ganz bevorzugt sind. Unter N-terminalem Anteil des konstanten Teils von CD44 sollen der Anteil des Proteins verstanden werden, der durch die konstanten Exons 1 bis 5 des CD44-Gens gemäß der Publikation von Screaton et al-. (Screaton G R et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 12160-12164, 1992) kodiert wird. Insbesondere sind Antiköφer bevorzugt, die spezifisch an ein Epitop binden, das durch Exon 2, 3, 4 und/oder 5 kodiert wird.
Beispielsweise kommen die monoklonalen Antiköφer BU-52 (The Binding Site, Birmingham, England, Cat.No. MCI 14; Messadi, D. V and Bertolami, C. N., Am J. Pathol. 142: 1041-1049. 1993; Spring, F. A. et al., In: Leucocyte typing V, white cell drfferentiation antigens, Schloss- man, S.F., Boumsell, L., Gilks, W., Harlan, J. M., Kishimoto, T., Morimoto C, Ritz, J. and Shaw, S. (Ed.), Oxford, New York, Tokyo:Oxford University Press, 1995), SFF-2 (Boehrin- ger Ingelheim Bioproducts, Cat.No. BMS113) oder MEM-85 (Boehringer Ingelheim Biopro- duets, Cat.No. BMS5033F1.01; Bazil, V. et al., Folia Biologica 35(5):289-297, 1989; Spring, F. A. et al., In: Leucocyte typing V, white cell differentiation antigens, Schlossman, S.F., Bo- umsell, L., Gilks, W., Harlan, J. M., Kishimoto, T., Morimoto C, Ritz, J. and Shaw, S. (Ed.), Oxford, New York, Tokyo:Oxford University Pr ss, 1995) in Betracht, welche Epitope des N- terminalen Anteils des konstanten Teils von CD44 erkennen.
Ein bevorzugter Antiköφer gegen den N-terminalen Anteil des konstanten Teils von CD44 (sCD44) ist der monoklonale Antiköφer SFF-2, der von einer Hybridom-Zellinie sezerniert wird, die am 16.04.1997 unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2305 bei der DSM- Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D- 38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt wurde, oder Derivate dieses Antiköφers.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft demzufolge die Verwendung von anti-sCD44 und/oder anti-vDC44 Antiköφern zur Herstellung einer Präparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von malignen Erkrankungen, die mit einer Entartung, Aktivierung oder massiven Vermehrung von Langerhans Zellen (LC) und/oder dendritischen Zellen (DC) assoziiert sind. Beispielsweise Langerhans-Zell-Histiozytosen, Histiozytose X, Abt-Let- terer-Siewe-Syndrom, eosinophiles Granulom (Simon, J.C. et al., Hautarzt 43:241-249, 1992).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in der erfindungsgemäßen Verwendung von anti-sCD44 Antiköφern, welche N-terminale Epitope von sCD44, oder Teilen davon, erkennen, zur Herstellung einer Präparation für die prophylaktische und therapeutische Be- handlung von malignen Erkrankungen, die mit einer Entartung, Aktivierung oder massiven Vermehrung von Langerhans Zellen (LC) und/oder dendritischen Zellen (DC) assoziiert sind
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung egt in den oben genannten erfindungs- gemäßen Verwendungen von antι-sCD44 Antikörpern, wobei die Antikoφer monoklonale Antikoφer oder Fragmente oder Derivate davon sind
In einem zusatzlichen Aspekt wird von der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Anti- koφern, die gegen Epitope gerichtet sind, die durch Variante Exons von vCD44 oder Teilen davon kodiert werden, zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von malignen Erkrankungen, die mit einer Entartung, Aktivierung oder massiven Vermehrung von Langerhans Zellen (LC) und/oder dendritischen Zellen (DC) assoziiert sind, umfaßt.
In einer besonderen Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Antikoφern, die gegen Epitope gerichtet sind, die durch die Varianten Exons v4, v5, v6 und/oder v9 oder Teilen davon kodiert werden, zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von malignen Erkrankungen, die mit einer Entartung, Aktivierung oder massiven Vermehrung von Langerhans Zellen (LC) und/oder dendriti- sehen Zellen (DC) assoziiert sind
Insbesondere werden von der Erfindung die genannnte Verwendung von Antikörpern umfaßt, die mit den folgenden Aminosauresequenzen oder Teilen davon zu reagieren vermögen
ISTTPRAFDHTKQNQDWTQWNPSHSNPEVLLLQTTTRMT
DVDRNGTTAYEGNWNPEAHPPLIHHEHHEEEETPHSTST QATPSSTTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDSHSTTGTA QQSNSQSFSTSHEGLEEDKDHPTTSTLTSS
In einer weiteren besonderen Ausführungsform werden für den genannten erfmdungsgemaßen Zweck monoklonale Antikoφer umfaßt, sowie Fragmente und Derivate davon
In einer ganz besonderen Ausführungsform umfaßt die Erfindung die Verwendung des Anti- koφers VFF-18, der von einer Hybridom-Zellinie sezerniert wird, die am 7 6 1994 unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2174 bei der DSM-Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt wurde (WO 95/33771), oder Derivate dieses Antikoφers Ein zusatzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von antι-sCD44 Antikoφern zur Herstellung einer Praparation für die Unterdrückung oder Linderung unerwünschter oder überschießender Immunreaktionen für die Therapie oder Prophylaxe dadurch bedingter Erkrankungen oder um damit verbundene Ereignisse positiv zu beeinflussen
Demzufolge umfaßt die Verwendung von anti-sCD44 Antikoφern alle diejenigen Erkrankungen und Zustande eines Saugetierorganismus, denen eine immunregulatorische Störung oder eine unerwünschte oder überschießende Immunreaktion zugrundeliegt, wie beispielsweise allergische Erkrankungen, insbesondere Allergien vom verzögerten Typ, Abstoßungen von Haut- oder Organtransplantaten, Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, Multiple Sklerose, Psoriasis oder atopische Dermatitis
Für diesen Zweck eignen sich die beschriebenen anti-sCD44 Antikoφer sowohl für prophylaktische Maßnahmen als auch für therapeutische Behandlungen
In einem zusatzlichen Aspekt werden erfindungsgemaß monoklonale anti-sCD44 Antikörper für die oben genannten Verwendungen zur Beeinflussung von Immunreaktionen im Sinne prophylaktischer und therapeutischer Behandlungen umfaßt, wobei die Antikoφer monoklonale Antikoφer oder Fragmente oder Derivate davon sind
In einer besonderen Ausführungsform werden für die oben genannnten Verwendungen zur Beeinflussung von Immunreaktionen der gegen den durch v6 kodierten Epitop, oder Teilen davon, gerichtete Antikoφer VFF-18 und solchen Antikoφern, die mit den von VFF-18 erkannten Epitop oder Teilen davon zu reagieren vermögen, umfaßt
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Herstellung von dendritischen Zellen und deren Verwendung zur Auslosung oder Einleitung einer Immunreaktionen in vivo für die Immuntherapie, insbesondere die adoptive Immuntherapie, beispielsweise die adoptive Immuntherapie von Tumoren oder Viruserkrankungen
Es wurde gefunden, daß im Verlauf ihrer Wanderung in die Lymphknoten LC und DC ihre Expression von CD44 Isoformen modulieren Im Einzelnen kommt es zu einer Aufregulierung von Epitopen im N-terminalen konstanten Teil von CD44 sowie von Epitopen, die durch die Varianten Exons v4, v5, v6 und v9 kodiert werden Es wurde ferner gef nden, daß die stadien- hafte Modulation von CD44-Isoformen von großer Bedeutung für die Immunfünktion der LC und der DC sind Erfindungsmäßig wurde nämlich festgestellt, daß die Aktivierung und Auswanderung von LC aus der Epidermis durch Antikoφer, insbesondere monoklonale Antikörper, gegen N-terminale Epitope im konstanten Teil von CD44 (sCD44), vollständig verhindert werden kann Ferner wurde überraschenderweise gefunden, daß die spezifische Anheftung von LC und DC in den T-Zell-Arealen der peripheren Lymphknoten durch Antikörper, welche Epitope auf Varianten Exons, beispielsweise v6 bzw CD44v6 (zum Beispiel VFF18, offenbart beispielsweise in der WO 95/33771), erkennen, vollständig inhibiert werden kann Es konnte aber auch festgestellt werden, daß gegen ein N-terminales Epitop im konstanten Teil von CD44 (sCD44) gerichtete Antikörper die Adhäsion ebenfalls blockierte, wenn auch in geringerem Ausmaß gegenüber der Reaktion von Antikörpern gegen Variante Exons
Im Mausmodell konnte bestätigt werden, daß eine systemische Gabe von Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikoφern, gegen Variante Epitope von CD44, beispielsweise CD44v6, die Fähigkeit von LC und DC hemmen, eine Allergie gegenüber einem Hapten, beispielsweise 2,4-Dinitrofluorbenzol, auszulosen Diese Antikoφer waren auch wirksam, wenn die Allergie bereits bestand Überraschenderweise wurde gefunden, daß hier neben den CD44v6-spezifischen monoklonalen Antikoφern auch Antikoφer gegen N-terminale Epitope des konstanten Teils von CD44 (sCD44) wirksam waren Insofern eröffnet sich mit der Ver- wendung von gegen sCD44 gerichteten Antikoφer sowohl eine prophylaktische als auch eine therapeutische Behandlung von Immunprozessen in vivo
In einem entwickelten Zellkulturverfahren konnten DC hergestellt werden, die in periphere Lymphknoten einwandern und dort praferentiell in den T-Zell-Arealen anheften Das Verfahren beruht erfindungsgemäß darauf, daß Monozyten aus dem peripheren Blut von gesunden Blutspendern oder von Patienten mit malignen Tumoren, beispielsweise Melanomen, oder aus dem Knochenmark, isoliert werden und die daraus gewonnenen Zellen in einem geeigneten Kulturmedium, beispielsweise RPMI 1640, supplementiert mit Serum, Antibiotika, nicht-essentiellen Aminosäuren, einem Puffer, beispielsweise mit einem im Bereich von pH 6 0 und pH 8 5 akti- ven Puffer, insbesondere mit einem organischen Puffer, und mindestens einem Cytokin, für einige Tage kultiviert und anschließend isoliert werden
In einer besonderen Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die wie oben beschriebenen isolierten Monocyten in einem Kulturmedium, bestehend aus RPMI 1640, fetales Kälberserum, Penicillin/Streptomycin, einem aus einer N-substituierten Aminosulfon- säure, beispielsweise Hepes [4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonsaure] bestehender Puffer, nicht-essentielle Aminosäuren, L-Glutamin, GM-CSF (granulocyte/macrophage colony- stimulating factor, beschrieben beispielsweise in der WO86/03225 oder von Cantrell, M A et al , Proc. Natl Acad Sei USA 82 6250-6254, 1985), für einige Tage kultiviert und anschlie- ßend isoliert werden
In einer ganz besonderen, beispielhaften Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die wie oben beschriebenen isolierten Monocyten in einem Kulturmedium, bestehend aus RPMI 1640, 10% FCS (fetales Kalberserum), 45μg Penicillin/Streptomycin, 25 raM Hepes, 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 50 ng/ml human GM-CSF, vorzugsweise rekombinanter human GM-CSF, und 1000 U/ml Interleukin-4 (IL-4) für 8 Tage kultiviert und anschließend isoliert werden.
Es konnte überraschenderweise festgestellt werden, daß nach dem erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahren die Kultur aus > 90% dendritischen Zellen bestand, welche das gleiche CD44-Isoformmuster aufwiesen wie LC oder DC, die in vivo in Lymphknoten gewandert sindT Die erfindungsgemäß kultivierten DC binden wie aktivierte LC in den parakortikalen T-Zell- von Lymphknoten. Diese Bindung ließ sich durch Antiköφer, die Epitope, die durch die Varianten Exons v4, v5, v6 oder v9 kodiert werden, beispielsweise durch den monoklonalen Antiköφer VFF18, oder die mit Antiköφer gegen den konstanten Teil von CD44 (Standardform, sCD44 reagieren, vorzugsweise mit Antiköφern gegen Epitope des N-terminalen Anteils des konstanten Teils von CD44 (sCD44), blockieren.
Aufgrund dieser ex vivo hergestellten dendritischen Zellen kann in vorteilhafter Weise eine Immuntherapie, insbesondere die adoptive Immuntherapie, beispielsweise die adoptive Immuntherapie von Tumoren oder Viruserkrankungen, in vitro durchgeführt werden. Eine derartige Immuntherapie beruht demzufolge darauf, daß das Wanderungsverhalten der aus dem Blut oder dem Knochenmark erfindungsgemäß hergestellten DC so beeinflußt wird, daß die erfin- dungsgemäßen dendritischen Zellen in die peripheren Lymphknoten einwandern, wo sie gewünschte Immunreaktionen einleiten. Mit diesen Zellen kann in vorteilhafter Weise die Immu- nogenität von DC bei einem Einsatz in der adoptiven Immuntherapie von entzündlichen, infektiösen, proliferativen oder hypeφroliferativen Erkrankungen, beispielsweise Virus- oder Tumorerkrankungen optimiert werden.
Da sowohl die DNA-als auch die Aminosäuresequenzen von sCD44 und von vCD44 bekannt sind, kann der Fachmann somit jedes beliebige Variante vCD44 Glykoprotein oder Variante Formen davon (vCD44) tierischer oder menschlicher Herkunft und die sie codierenden Nukleinsäuren (DNAs und RNAs) dazu benutzen, um beliebige gegen sCD44 oder Varianten Formen davon (vCD44) gerichtete Antiköφer, insbesondere monoklonale Antiköφer, Fragmente und Derivate davon, für die erfindungsgemäße Verwendung herzustellen und zu benutzen.
Unter den der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Begriffen sCD44 oder vCD44 sind Proteine oder Teile bzw. Epitope davon zu verstehen, die durch für sCD44 oder vCD44 codierende RNA, DNA oder Transkripte kodiert werden, einschließlich solche, die durch Mutationen, beispielsweise durch Deletionen, Insertionen, Substitutionen, Inversionen, Transitionen, Transversionen verändert sind und solche, die mit den im Stand der Technik beschriebenen DNA Sequenzen, beispielsweise in Tölg, C. et al., Nucleic Acids Res. 21(5): 1225-1229, 1993, oder in Srceaton, G R et al , Proc. Natl. Acad - Sei USA 89 12160-12164, 1992, unter den bekannten konventionellen Bedingungen hybridisieren Dabei ist unerheblich, ob die Herstellung und Isolierung dieser Nukleinsäuren konventionell über Zellkulturen, oder über DNA- Rekombination, über synthetische oder semisynthetische Verfahren erfolgt
Unter den Begriffen sCD44 und vCD44 sind ferner im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle jene vom Tier oder vom Menschen abstammenden Glykoproteine zu verstehen, unabhängig' von ihrer Herstellung oder Isolierung über konventionelle Zellkulturen oder über DNA Rekombination oder über synthetische oder semisynthetische Verfahren
Unter dem Begriff Antikoφer sind mono- oder polyvalente Antikoφer und poly- und monoklonale Antikoφer zu verstehen, aber auch solche, die Fragmente davon darstellen und Derivate davon, einschließlich der F(ab')2, Fab' und Fab Fragmente, aber auch chimare Antikoφer oder Hybridantikoφer mit mindestens zwei Antigen- bzw Epitopbindungsstellen, (beispiels- weise Quadrome, Triome), Interspecies-Hybridantikoφer, anti-idiotypische Antikörper und solche davon, die chemisch modifiziert wurden und als Derivate dieser Antikörper zu verstehen sind und die entweder über die bekannten konventionellen Verfahren der Antikorpergewinnung oder über DNA-Rekombination (beispielsweise Diabodys), via Hybridomatechniken oder An- tikoφer-Engineering oder synthetisch oder semisynthetisch nach an sich bekannter Weise her- stellbar sind und an Epitope von sCD44 oder vCD44 zu binden vermögen Humanisierte Antikoφer können beispielsweise durch CDR-grafting (EP 0239400) hergestellt werden Auch Framework-Regionen können modifiziert werden (EP 0519596, WO 9007861) Zur Humanisierung von Antiköφern können heute Methoden wie PCR (s z B EP 0368684, EP 0438310, WO 9207075) oder Computer-modelling (s z B WO 9222653) angewendet wer- den Auf die seit Kohler, G & Milstein, C , Nature 256 495-497, 1975 erschienene, dem Fachmann bekannte, vielfaltige Literatur sei hingewiesen
Hinsichtlich der Herstellung von polyklonalen Antikoφern gegen Epitope von sCD44 und vCD44 stehen eine Anzahl Verfahren zur Verfugung Es können z B für diesen Zweck in ah sich bekannter Weise verschiedene Tiere durch Injektion mit sCD44 oder vCD44, welche naturlichen Ursprungs, über DNA-Rekombination oder synthetisch hergestellt sein kann, oder Fragmenten davon, immunisiert werden und aus den danach gewonnenen Seren die gewünschten polyklonalen Antiköφer nach bekannten Methoden gewonnen und gereinigt werden Als Alternative können auch intakte Zellen benutzt werden Verschiedene Adjuvantien zur Erhöhung der Immunantwort auf die sCD44- oder vCD44-Gabe können, abhangig von dem für die Immunisierung ausgewählten Tier, ebenfalls verwendet werden - beispielsweise Freund's Adjuvant, Mineralgele wie z.B Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie z B Polyanionen, Peptide, Olemulsionen, Hemocyanine, Dinitrophenol oder Lysolecithin Die für die erfindungsgemaße Verwendung bevorzugten monoklonalen Antikoφer gegen ein Epitop von sCD44 oder ein Epitop von vCD44 können durch jede beliebige Technik erhalten werden, die für die Herstellung von Antikoφern über Kultivierung von Zelhnien zur Verfügung stehen Zu derartigen bekannten Techniken zahlen z B die von Kohler, G & Milstem, C , 1975, loc. cit., oder Taggart & Samiloff, Science 219, 1228-1230, 1983, beschriebenen Verfahren mit Hybridomazellen oder solche mit humanen B Zeil Hybridomen (Kozbor et al Immunology Today 4, 72-79, 1983) Chimäre Antikoφer gegen sCD44 oder vCD44 oder- Teilen davon können beispielsweise aus einer Maus-Antigen-Bindungsdomane und humanen konstanten Regionen zusammengesetzt sein (Morrison, et al , Proc. Natl Acad Sei. USA 81, 6851-6855, 1984, Takeda, et al , Nature 314, 452-454, 1985)
Die Antikoφer können nach bekannten Methoden gereinigt werden, beispielsweise über Im- munoabsorptions- oder Immunoaffinitatschromatographie, über HPLC (High Performance Liquid Chromatography) oder Kombinationen davon Antikoφer Fragmente, welche den Idiotyp des Moleküls enthalten, können gleichermaßen nach bekannten Verfahren hergestellt werden Beispielsweise können F(ab')2 Fragmente durch Pepsin Verdauung des vollständigen poly- oder monoklonalen Antikoφers erhalten werden Fab' Fragmente können erhalten werden, indem beispielsweise die Disulfidbrucken des betreffenden F(ab')2 Fragments reduziert werden und Fab Fragmente können hergestellt werden beispielsweise durch Behandlung der Antikorpermoleküle mit Papain und einem Reduktionsmittel
Zur Identifzierung und Selektion von Antikoφern, Fragmenten oder Derivaten davon, die mit einem Epitop von sCD44 oder vCD44 reagieren, kann jedes bekannte Verfahren verwendet werden Beispielsweise, indem die betreffenden Antikoφer nach entsprechender Markierung dedektierbar sind, wenn sie an isoliertes oder gereinigtes sCD44 oder vCD44 oder Teilen davon gebunden haben oder über Immunprazipitation des z B über Polyacrylamidgele gereinigtes sCD44 oder vCD44, oder dadurch, daß Antikoφer gegen sCD44 oder vCD44 mit anderen anti-sCD44 oder anti-vCD44 Antikoφern um das Binden an sCD44 oder vCD44 oder Teilen davon konkurrieren
Von der Erfindung mitumfaßt wird aber auch die Verwendung von Hybridomzellinien zur Herstellung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Antikoφer enthaltenen Praparationen für den der Erfindung zugrundeliegenden Zwecken
Auf weitere Einzelheiten betreffend die generelle Verwendung von monoklonalen Antikoφern zur Immunsuppression und bei Autoimmunkrankheiten, von Hybridantikoφern für therapeutische Zwecke und über DNA Rekombination hergestellte Antikoφer sei beispielsweise verwiesen auf Progress in Allergy Vol 45, "Monoclonal AntibodyTherapy", 1988 und auf die Arbeit von Seaman, W E et al , Ann. Rev. Med. 39,.231-241, 1988 Das CD44 Glykoprotein (Standardform, sCD44) einschließlich seiner Isoformen und Varianten (vCD44, vl bis vlO) sind sowohl für das Tier (z B Ratte, Maus) als auch für den Menschen hinsichtlich ihrer Stoffparameter (DNA- und Aminosauresequenzen, Lokalisation innerhalb des kompletten für CD44 codierenden Gens) und ihrer Herstellung vollständig literaturbeschrieben, sodaß es dem Fachmann anhand dieser Offenbarung ermöglicht wird, beliebige Antikoφer bzw monklonale Antikoφer oder Teile und Derivate davon im Sinne der oben angegebenen Definitionen für jedes auf diesem Proteinen lokalisierte Epitop herzustellen und sie erfindungs- gemaß zu benutzen, sodaß ihre Verwendung nicht auf bestimmte spezifische Antikörper oder die sie produzierenden Hybridzellinien beschrankt ist
Generell können Praparationen mit derartigen Antikoφern Verwendung finden bei den in der vorliegenden Beschreibung dargestellten Tumorerkrankungen und Immunprozessen bei Tier und Mensch, die die Prävention oder Prophylaxe, oder die therapeutische Behandlung umfas- sen
Aufgrund ihrer erfindungsgemaß festgestellten immunsuppressiven Wirkung sind die bezeichneten Antikoφer bzw die sie enthaltenen Praparationen zur Verhinderung und Behandlung von Krankheiten und Zustanden geeignet, die einer vorübergehenden oder dauerhaften Verrin- gerung oder Unterdrückung einer Immunantwort bedürfen
Insbesondere erstreckt sich ihr Einsatz in vivo zur Therapie und Prophylaxe unerwünschter oder überschießenden, für den betreffenden Saugetierorganismus schädlicher Immunantworten durch Verhinderung von LC und DC, an T-Zell-Areale peripherer Lymphknoten anzudocken Beispielsweise zur Verhinderung oder Behandlung von Autoimmunkrankheiten, wie z B Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, Multiple Sclerose, Psoriasis, atopische Derma- titis, oder zur Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Geweben oder Organen wie z.B Niere, Herz, Lunge, Knochenmark, Milz, Cutis oder Cornea, bei unerwünschten Reaktionen wahrend oder nach Transfusionen, von allergischen Erkrankungen, beispielsweise solchen, die den gastro-intestinalen Trakt betreffen und dort endzundlich manifest werden können, oder von endzundlichen, proliferativen und hypeφroliferativen Erkrankungen und cutanen Manifestationen immunologisch bedingter Erkrankungen, wie z B ekzematose Dermatitiden, Urtica- ria, Vasculitiden, Sclerodermie
Abhangig von der Art und Ursache der zu behandelnden Erkrankung oder Störung oder des zu beeinflussenden Zustands in einem tierischen oder menschlichen Köφer kann es wünschenswert sein, die Antikoφeφräparation systemisch, lokal oder topisch an das oder in das betreffende Gewebe oder Organ zu applizieren Eine systemische Wirkungsweise ist beispielsweise dann erwünscht, wenn unterschiedliche Organe oder Organsysteme behandlungsbedurftig sind, wie z.B. bei systemischen Autoimmunkrankheiten oder Allergien oder bei Transplantationen fremder, größerer Organe oder Gewebe oder aber bei schlecht lokalisierbaren Tumoren. Demgegenüber wäre eine lokale Wirkung in Betracht zu ziehen, wenn nur örtliche Manifestationen eines neoplastischen oder immunologischen Geschehens zu beeinflussen sind, wie beispiels- weise bei lokalen Tumorgeschehen, kleinflächigen Transplantationen von Cutis, und Cornea oder bei lokalen immunologischen Reaktionen, beispielsweise der Haut, zum Beispiel eine lokale Dermatitis. "
Die betreffenden Antiköφer können über jede dem Fachmann bekannte enterale oder parente- rale Applikationsroute verabreicht werden. Für die systemische Applikation bietet sich beispielsweise die intravenöse, intravaskuläre, intramuskuläre, intraarterielle, intraperitoneale, orale oder intrathecale Route an. Eine eher lokale Verabreichung kann beispielsweise subcutan, intracutan, intrakardial, intralobär, intramedullär, intrapulmonal oder in oder an das zu behandelnde Gewebe (Binde-, Knochen-, Muskel-, Nerven-, Epithel- oder Knochengewebe) erfol- gen. Abhängig von der zu erzielenden Dauer und Stärke der immunsuppressiven Wirkung können die Antiköφβφräparationen einmal oder mehrmals, auch intermittierend, pro Tag über mehrere Tage, Wochen oder Monate und unterschiedlichen Dosen verabfolgt werden.
Zur Herstellung einer für die genannten Applikationen geeignete Antiköφeφräparation kön- nen die dem Fachmann bekannten injizierbaren, physiologisch verträglichen Lösungen in steriler Form verwendet werden. Zur Herstellung einer gebrauchsfertigen Lösung zur parenteralen Injektion oder Infusion stehen die bekannten wässrigen isotonischen Lösungen, beispielsweise Saline oder eine entsprechende Plasmaproteinlösung ohne Gammaglobulin, zur Verfügung. Die Praparation kann aber auch in Form eines Lyophilisates bzw. Trockenpräparates vorliegen, welches mit einer der bekannten injizierbaren Lösungenunmittelbar vor dem Gebrauch unter sterilen Bedingungen rekonstituiert werden kann, z.B. als kit-of-parts. Die endgültige Herstellung einer erfindungsgemäß zuverwendenden Antiköφeφräparation für die Injektion, Infusion oder Perf sion erfolgt durch Vermischen von nach bekannten Methoden gereinigten Antikörpern gemäß oben angegebener Definitionen mit einem der genannten physiologisch verträgli- chen Lösungen, welche gegebenenfalls supplementiert sein können mit bekannten Träger- oder Hilfsstoffen (z.B. Serumalbumine, Dextrose, Natriumbisulfit, EDTA).
Die Menge der zu verabreichenden Antiköφer hängt ab von der Art und Schwere der zu behandelnden Krankheit oder Störung oder des zu beeinflussenden Zustands und des betreffen- den Patienten, gleichgültig ob Tier oder Mensch. Auszugehen ist jedoch von einer zu verwendenden Dosierung von 1 bis 1000 mg, vorzugsweise 5-200 mg des betreffenden Antikörpers pro Dosiseinheit, wie sie auch für andere Antiköφer bzw. monoklonale Antiköφer üblich ist, wobei zwischen 0.01 bis 20 mg / Tag und 0.1 bis 100 mg / kg Köφergewicht / Tag auch über längere Zeit (Tage, Wochen, Monate) gegeben werden kann, um die gewünschten Effekte zu erreichen - je nachdem, wie intensiv und über welchen Zeitraum eine prophylaktische oder therapeutische Wirkung erzielt werden soll.
Um zu untersuchen, ob Langerhans-Zellen CD44 exprimieren und ob diese Expression wäh- rend der LC Aktivierung verändert wird, wurden frisch isolierte LC aus menschlicher Epider- mis in eine Kultur übertragen. Dieses Verfahren ahmt LC Aktivierung durch Antigen nach (Schuler, G & Steinman, R.M., J. Exp. Med.161 :526-546.1986). Mit LC angereicherte epi^ dermale Zellsuspensionen wurden entweder unmittelbar nach der Isolierung aus der Haut oder nach 48 und 72 Stunden der epidermalen Gesamtzellkultur einer dreifarbigen FACS-Analyse [ "fluorescence activated cell sorting"] unterworfen. Die Zellen wurden mit monoklonalen Antiköφern (mAbs) gegen HLA-DR, um LC zu identifizieren, und mit mAbs gegen CD44 Epitope gefärbt. Frisch isolierte HLA-DR+LC(fLC) exprimierten ein N-terminales Epitop von CD44 (als "pan CD44" bezeichnet) und ein Epitop, welches gemeinsam durch CD44 Exons v7 und v8 gebildet wurde (Fig. la). Epitope, die durch Exons v5 und v6 codiert werden, wurden nur schwach exprimiert, wohingegen durch v4, v9 und vlO codierte Epitope nicht detektierbar waren (Fig. la). LC, die für 48 und 72 Stunden kultiviert wurden, trugen erhöhte Werte (2- fach) an N-terminalen Epitopen. Die Epitope von v4, v5, v6 und v9 waren ebenfalls abreguliert (Fig. la). Demgegenüber ging das CFD44v7/8 wärend der Kultivierung verloren (Fig. la). Ein CD44 vlO Epitop konnte nicht detektiert werden. Daraus ist zu schlußfolgern, daß die LC Aktivierung durch eine erhöhte Synthese von CD44 und durch eine Veränderung von entweder der Zugänglichkeit für das Epitop oder des Epitop-Splicing begleitet wird.
LC gehören zur Familie der dendritischen Zellen (Steinman, R.M., Annu. Rev. Immuno l.9 :271- 296, 1991). Um zu bestimmen, ob DC anderer Herkunft CD44 Epitope exprimieren, welche denen von LC gleichen, wurden DC aus peripherem Blut durch Kultivierung in einem Cytokin- Cocktail präpariert (Sallusto, F. & Lanzavecchia, A., J. Exp. Med. 179: 1109-1118, 1994). FACS Analyse von CDla+ (DC Marker) Zellen ließ CD44 Epitop Muster erkennen, welche identisch waren zu jenen von kultivierten LC (Fig. lb). Ein sehr ähnliches Muster der CD44 Expression entstand auch in kultivierten LC aus Haut von BL/6 Mäusen (Fig. lc).
Um festzustellen, in welchem Stadium LC eine veränderte Expression von CD44 Epitopen während der Kultivierung erfährt, wurde eine Hautexplantat-Kultur (Larsen, C.P. et al., J. Exp. Med. 172:1483-1493, 1990) verwendet, in die LC aktiv aus der Epidermis in die Dermis migriert. Vollständige, Vollhaut Stanzbiopsien ("whole thickness punch biopsies") aus Men- schenhaut wurden zwischen 0 - 72 Stunden kultiviert. In Gefrierschnitten wurden LC sowohl lichtmikroskopisch mit Lag mAb gegen Birbeck Granula (für menschliche epidermale LC spezifische zytoplasmatische Organellen (Kashihara, M. et al., J. Invest. Dermatol. 87:601-607, 1986)) als auch durch Transmissionselektron-Mikrsokopie identifiziert. In frisch isolierter Haut waren nahezu alle Lag+-Zellen in den suprabasalen Schichten der Epidermis lokalisiert, mit sehr wenig detektierbaren Lag+-Zellen in der Dermis, wohingegen nach 72-stündiger Kultur fast die Hälfte der LC die Epidermis verlassen hatten. Bereits 2 Stunden nach Beginn der Kultur begannen epidermale LC ihre Migration und es wurde nach 12 Stunden festgestellt, daß sie die Basalmembran der epidermo-dermalen Junctura penetriert hatten. Nach 24 Stunden hatten sich die LC in der Dermis in schnurähnlichen Strukturen innerhalb lymphatischer Gefäße akkumuliert, was durch ihre charakteristischen, ultrastrukturellen Merkmale eines "single layer" endothelialer Zellen mit herausgetretenen Nuclei elektronenmikroskopisch identifiziert wurde—
Durch immunohistochemische Doppelmarkierung mit mAb Lag (FITC, grün) und CD44 spezi- fischen Antiköφern (Cy3, rot), wurde die Expression von CD44 an LC während der Migration verfolgt. Doppel-Färbung erschien gelb. Keratinozyten färbten sich rot da sie verschiedene CD44 Epitope (CD44v2-vϊO) tragen (Hofmann, M. et al., Cancer Res. 53: 1516-1521, 1993; Hudson, D.L. et al., J. Cell. Science 108(Pt 5): 1959-1970, 1995), aber nicht die Lag Epitope. Die meisten intra-epidermalen LC exprimierten sowohl N-terminale Epitope als auch die durch v7/8 codierten Epitope, wohingegen nur wenige (≤5%) davon eine Färbung mit Antiköφern gegen von Exons v5, v6 oder v9 codierten Epitopen zeigten (Fig. 2a, b, c, e, g). Demgegenüber exprimierte die Mehrheit der LC, die in die Dermis migrierten (87.5 - 100%), v5, v6 und v9 Epitope (Fig. 2d, f, h). Somit findet der Wechsel in der Epitop-Präsentation offensichtlich bei der Transition von Epidermis zur Dermis statt. Um diese Beobachtungen zu bestätigen, wurde Spalthaut ("split thickness skin") auf Kulturmedium schwimmend aufgebracht und den LC wurde es ermöglicht, in das Medium zu migrieren. Letztere wurden nach Kultivierung von 48 Stunden gesammelt. Diese LC trugen Epitope des CD44 N-Terminus, v5, v6 und v9, aber nicht v7/8 (Fig. 2 1, m). Somit stimmt der CD44 Phenotyp von LC, die vollständig aus der Haut migrierten, exakt mit denen der in vitro aktivierten LC oder DC überein.
Um die LC Migration weiter zu verfolgen, wurden LC in Gefrierschnitten von axillaren Lymphknoten identifiziert, die via lymphatischen Gefäßen zu den regionalen Lymphkonten gewandert waren. In den parakorticalen T-Zell Zonen der Lymphknoten wurden Lag+ Zellen gefunden und die Mehrzahl exprimierte Epitope der Exons v4, v5, v6 und v9 (Fig. 2 k) zusätz- lieh zum N-Terminus von CD44 (Fig. 2 i), jedoch nicht das v7/8 Epitop. Es kann daraus der Schluß gezogen werden, daß das während der Emigration aus der Epidermis erworbene CD44 Expressionsmuster solang bestehen bleibt, bis LC die Lymphknoten erreicht haben.
Es wurden anti-CD44 Antiköφer verwendet, um die fünktionelle Bedeutung der CD44 Protei- nexpression während der frühen Stadien der LC Aktivierung, während der Adhesion von LC und DC an Lymphknoten und während der Antigenpräsentation durch LC festzustellen.
Betreffend die Untersuchung der CD44 Funktion während der frühen LC Aktivierung wurden sowohl anti-CD44 N-terminale Antiköφer, die einerseits die Hyaluronsäure (HA) Bindung blockieren (beispielsweise MEM-85, Bennett, K L et al , J. Cell. Bwl 128 687-698, 1995) und andererseits die HA Bindung nicht blockieren, als auch v5, v6 oder v9 spezifische mAbs zu dem Medium mit der schwimmenden Keratom-Spalthaut ("split thickness keratome skin") hinzugegeben und das Auftreten von LC im Medium über FACS gezahlt LC wurde in der Epidermis durch beide N-terminal spezifischen Antikörper zurückgehalten (60% bis 80% Inhibition), aber nicht durch die Exon spezifischen mAbs (Fig 3) Andere Antikörper, die den N- Terminus erkennen, zeigten ebenfalls Inhibition, wahrend Antikoφer gegen das v7/v8 Epitop- nicht inhibitorisch wirkten Diese Ergebnisse zeigen, daß CD44 in einem sehr frühen Stadium der LC Aktivierung involviert ist Wenn LC erst aktiviert sind und von Exons v5, v6 und v9 codierte Epitope exprimieren, können Antikoφer, welche diese Epitope erkennen, nicht mit der Auswanderung von LC aus der Epidermis interferieren
Um die Rolle von CD44 während der Adhäsion von aktivierten LC und DC an paracorticale T Zeil-Areale in Schnitten von Lymphknoten zu bestimmen, wurden zur Blockierung dieser Ad- hasion verschiedene anti-CD44 Antikoφer verwendet (Fig 4) MACS® (Mikrospharen Aktiviertes Cell Sorting)-gereinigte frische LC, für 48 Stunden kultivierte (und aktivierte) LC und DC aus Blut wurden für einen Lymphknoten-Gefrierschnitt Bindungsassay (Butcher, E C , et al , J,. Immunol. 123 1996-2003, 1979) verwendet LC oder DC wurden über Gegenfarbung mit einem geeigneten Antikoφer (beispielsweise CDla mAb bzw OKT-6, Ortho, Neckarge- mund ) identifiziert und die spezifische Adhäsion an Lymphknoten wurde mikroskopisch bestimmt Frische LC oder immature DC, welche von peripherem Blut gebildet wurden, zeigten nur eine schwache Bindung an Lympknoten-Gefherschnitten (Fig 4a) Kultivierte LC und Cytokin-aktivierte DC adharierten spezifisch und mit erhöhter Effizienz an die paracorticalen T-Zell Areale, aber nicht an die zentralen follikularen B-Zell Areale (Fig 4b, c) Prainkubation mit den CD44v6 spezifischen VFF18 mAb inhibierte signifikant das Binden von kultivierten LC (bis 66%>) und DC (bis 49%>) an den T-Zell Zonen (Fig 4d, e) Ein gegen das N-terminale Epitop im konstanten Teil von CD44 gerichteter Antikoφer (zum Beispiel MEM-85, Boehrin- ger Ingelheim Bioproducts, Cat No BMS5033F1 01, Bazil, V et al , Foha Bwlogica 35(5).289-297, 1989, Spring, F A et al , In Leucocyte typing V, white cell differentiatwn antigens, Schlossman, S.F., Boumsell, L , Gilks, W , Harlan, j M., Kishimoto, T , Moπmoto C , Ritz, j and Shaw, S (Ed ), Oxford, New York, Tokyo:Oxford University Press, 1995) inhibierte ebenfalls die Bindung, obwohl weniger effizient Andere mAbs, die gegen andere v Exon Epitope oder gegen ICAM-1 gerichtet waren, zeigten keinen Effekt Die mit VFF18 erhaltenen Daten zeigen, daß CD44 die Bindung von LC und DC an einen nicht-identifizierten Partner in der T-Zell Zone der Lymphknoten vermittelt Diese Wirkung, insbesondere von MEM-85, weist auf eine Bindungsfünktion an Hyaluronsaure hin (die vermutlich nicht auf die T-Zell Zonen beschrankt ist) oder, was wahrscheinlicher ist, an den selben Partner, auf den VFF 18 wirkt Der entscheidende Test für die LC Funktion stellt ab auf deren Rolle in vivo beim Präsentieren eines in der Haut mit T-Zellen zusammengekommenen Antigens Dazu wurden Mause epicutan mit DNFB (Dinitrofluorbenzol) sensitiviert, welches über Stimmulation ("challenge") mit dem selben Hapten in Ohrhaut am Tag 6 in einer massiven DTH ("Delayed Type Hypersensitivity") Reaktion resultiert, die über die Ohrschwellung gemessen wurde (Fig 5) Anti-CD44 mAbs wurden i p injiziert an den Tagen -1, 0 und +1 hinsichtlich der Haptenapplikation (um auf Interferenz mit der Sensibilisierungsphase von DTH zu testen, die LC Migration von der Epp dermis zu den Lympknoten und Hapten-Prasentation erfordert (Austyn, J.M., J. Exp. Med 183: 1287-1292, 1996)) und an Tagen 5, 6 und 7 (um auf Interferenz mit der Stimmulations- ("challenge")Phase zu testen, die Extravasation von Leukozyten erfordert (Camp, R L et al , J. Exp. Med. 178:497-507, 1993). Die Stimmulationsdosis des Haptens wurde an Tag 6 gegeben Während Antiköφer gegen den N-Terminus von CD44 und gegen das v6 Epitop die Ex- travasations-Phase von DTH inhibierte, inhibierten nur die v4 und v6 spezifischen Antikoφer stark die Sensitisation (Fig. 5) Daraus ist zu schlußfolgern, daß CD44 Varianten eine wesent- liehe Rolle bei der LC Funktion spielt, entweder wahrend der Migration zu den Lymphknoten oder bei der Interaktion mit T-Zellen. Die Inhibition der Extravasationsphase von DTH durch N-terminale CD44 Antiköφer ist bekannt (Camp, R L et al., 1993, loc. cit.) Das Unvermögen von N-terminal-spezifischen anti-CD44 Antikoφern, die LC Aktivierung in der Epidermis in vivo zu inhibieren (Fig. 5), es aber in vitro können (Fig 3), ist wahrscheinlich auf die Basal- membran-Barrieren zurückzuführen, die einen wirksamen Eintritt von Antiköφern in die Epidermis nach systemischer Applikation verhindern (Camp, R L et al , 1993, loc. cit )
Die Interferenz von anti-CD44v6 Antikoφern mit der LC Funktion erklärt zumindest teilsweise ihre Wirkung auf die primäre Immunantwort (Arch, R , et al , Science 257 682-685, 1992; Moll, J et al., J. Immunol. 156.2085-2094, 1995) Die gefundene Parallele des LC Verhaltens mit dem lymphatischen Ausbreiten metastasierender Tumorzellen und der Inhibition von beidem durch anti-CD44v6 Antikoφern offenbart eine gleiche Rolle von CD44 in beiden Prozessen. Demzufolge muß angenommen werden, daß die Selektion für die molekulare Funktion und die Nachahmung der molekularen Funktion von CD44 auf LC und DC wahrend der Tumoφrogession erfolgt. Legenden zu den Figuren
Fig.1 : Änderung bei der CD44 Epitop Expression während der in vitro Kultivierung von epidermalen LC und Blut DC. (a) Frisch isolierte human LC und nach 48 und 72 stündiger Kultivierung und (c) Maus
BL/6 Haut-LC nach 72 stündiger Kultivierung wurden mit mAbs gegen HLA-DR oder Iab,7-AAD und mAbs gegen CD44 Epitope gefärbt. Die mittlere Fluoresze zintensitäA von HLA-DR+ Zellen wurde über FACScan bestimmt. Repräsentatives Ergebnis für 6 Versuche mit Zellen verschiedener Spender. Niedrige Expression von CD44v Epitopen auf fLC wurde nicht durch die während des Isolationsverfahrens angewendeten
Trypsinisierung verursacht, da identische Trypsinisierung von kultivierten LC nicht signifikant deren CD44v Expression beeinflußten, (b) Korrespondierende Analyse von DC aus humanen peripheren Blut Monozyten generiert, Selektive Bestimmung von CDla positiven Zellen. Repräsentatives Ergebnis für 4 Versuche mit Zellen verschiedener Spender.
Fig.2: Von der Epidermis in die Dermis und den Lymphknoten wanderende LC zeigen das selbe CD44 Expressionsmuster wie in vitro aktivierte LC/DC. Gefrierschnitte von für 12 Stunden kultivierte Haut wurden mit FITC-konjugierten mAK Ziege-anti-Maus Lag (erkennt Birbeck Granula, spezifische zytoplasmatische
Organellen von LZ, Kashihara, M. et al., J. Invest. Dermatol.8^:601-607, 1986) mAbs gefärbt, um LC zu detektieren (grün), und mit Cy3-konjugierten Ziege-anti-Maus CD44 mAbs (rot). Doppelt-positive Zellen erschienen gelb-orange. Der Balken stellt 31 μm dar. Selbe Vergrößerung von A bis K. (a) Färbung mit Lag und anti pan CD44 Antiköφer (erkennen Standard Teil des CD44 Moleküls). Lag+ Zellen innerhalb der
Epidermis (*) und solche, die in die Dermis (**) eingewandert waren, färbten doppelt positiv für Lag und pan CD44 (gelb). Keratinozyten exprimierten pan CD44, aber nicht Lag (rot). Lag+ intra-epidermale LC exprimierten ebenfalls das durch Exons v7/v8 (b) gebildete Epitop aber auf sehr niedrigem Niveau die Epidope von CD44 Exon v5 (c), ' v6 (e) und v9 (g). Lag+ Zellen, die in die Dermis eingewandert waren, exprimierten
CD44v5 (d), v6 (f) und v9 (h). (i) Pan CD44 Färbung von Lag+ Zellen (gelb), weiche in den paracorticalen T-Zell Arealen der axillaren Lymphknoten lokalisiert sind und die Haut dränieren. T-Zellen exprimierten ebenfalls CD44 aber nicht Lag (rot), (k) Das Exon v9 Epitop wird in der Mehrzahl exprimiert (gelb) aber nicht auf allen Lag positiven Zellen(Pfeil, grün). (1, m) LC, welche aus Spalthaut ("split-thickness skin") ausgewandert waren, wurden nach HLA-DR Expression selektiert und mit den angegebenen mAbs durch FACS analysiert wie in Fig. 1. Fig.3 : Antiköφer gegen den CD44 N-Terminus verhindern LC Aktivierung und/oder Migration in vitro.
Antiköφer wurden Spalthautkulturen ("split-thickness skin cultures") hinzugefügt und die Zellen, welche aus der Spalthaut in das Medium ausgewandert waren, wurden durch FACS analysiert, (a) Behandlung mit MEM-85 oder Kontroll mAb. CD1+, lebende (Propidiumjodid-negativ) LC sind umkreist. Die Fraktion dieser Zellen über die Gesamtzellzahl wird in der oberen Ecke von jeder Graphik als % angezeigt, (b) ~"
Inhibition der LC Emigration durch verschiedene anti-CD44 Antiköφer. Die prozentuale Inhibition wurde aus 5 unabhängigen Experimenten berechnet (+/- SD, * statistisch signifikant bei p< 0.05, "one way ANOVA", Dunnett's Test, SigmaStat,
Jandel Scientific Software).
Fig. 4: Die Bindung von LC oder DC an paracorticale Lymphknoten Areale wird durch Antiköφer gegen CD44 inhibiert. Microbead-gereinigte frische LC (a), für 48 Stunden kultivierte LC (b, d) oder Cytokin- aktivierte DC (c, e) wurden auf gefrorene Schnitte von Lymphknoten (Balken = 31 μ m) plaziert. LC und DC adhärierten vorzugsweise an die paracorticalen T-Zell Areale, mit erhöhter Adhäsion über Aktivierung durch die Kultur, aber nicht an die zentralen B Zeil Follikel. Die Bindung wurde ebenfalls in Anwesenheit von Antiköφern bestimmt (d,c) (quantifiziert in d und e, * = statistisch signifikant bei p< 0.05, "one way
ANOVA", Dunnett's Test).
Fig.5: Antiköφer gegen CD44v Epitope inhibieren die Sensibilisierungsphase von Kontakt- Hypersensitivität in vivo. Die Gruppe 2 Mäuse wurden wie angegeben sowohl vor als auch während der
Sensibilisierungsphase mit den angegebenen mAbs i.p. behandelt, und die Gruppe 3 Mäuse wurden gleichermaßen vor und während der Stimmulationsphase ("challenge phase") behandelt. Mäuse der Gruppe 1 wurden nicht mit mAbs behandelt. * statistisch signifikante Reduktion der Ohrschwellung bei p< 0.05 ("one way ANOVA", Dunnett's Test)
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1 : Isolierung der Langerhans-Zellen (LC) und der dendritischen Zellen (DC)
Humane epidermale Zellsuspensionen wurden nach der Methode von Simon, J. C, et al., Exp. Dermatol. 4: 155-161, 1995, durch begrenzte Trypsinisierung von humaner Haut, die bei einer plastischen Operation gewonnen wurde. Murine LC wurden aus der Rumpfhaut weiblicher C57/BL63 Mäuse (Harlan-Olac, Great Britain) gemäß Simon, J. C, et al., J. Immunol. 146 485-491, 1991, gewonnen LC wurden durch Dichtegradientenzentrifügation auf Lym- phoprep (Gibco) auf 5 - 20% angereichert Sowohl frische LC als auch in supplementiertem RPMI (Simon, J C , et al , Exp. Dermatol. 4 155-161, 1995, Simon, J C , et al , J Immunol 146 485-491, 1991) für 48 oder 72 Stunden kultivierte LC wurden durch FACS analysiert Humane DC wurden gemäß Sallusto, F & Lanzavecchia, A , J. Exp. Med. 179 1 109-1118, 1994, gebildet und enthielten 80 - 90%> CDla+ Zellen
Beispiel 2 Immunofarbung und Flowzytometrie
Zellen wurden gemäß Weiss, J M , et al Eur. J. Immunol. 25 2858-2862, 1995, mit einem der folgenden Antikoφer gefärbt (a) human spezifisch N-terminales Epitop = pan CD44, Leu 44 (Klon L178, Maus IggGl, Becton Dickinson), Exon v4, FW 11 10 3 (Maus IgGl, ECACC Nr 93070776), Exon v5, VFF8 (Maus IgGl, Bender, Wien), Exon v6, VFF18 (Maus IgGl, Ben- der, Wien, WO 95/33771, DSM ACC2174), Exon v7/v8, VFF17 (Maus IgG2b, Bender, Wien), Exon v9, FW 11.24 7 36 (Maus IgGl, ECACC Nr 93070775) (b) Mause-spezifisch N-terminales Epitop = pan CD44, LM7 8 1 (Ratten IgGl, ATCC Nr TIB-235, Lesley, j et al , Cell. Immunol. U2 40-54, 1988, Lesley, J et al , Cell Immunol. H7 378-388, 1988, Trow- bridge, I S et al., Immunogenetics 15 299-312, 1982, Budd, R C et al , J. Immunol. 38 3120-3129, 1987), ein gegen Exon v4 gerichteter monoklonaler Antikoφer, ein gegen Exon v6 gerichteter monoklonaler Antikoφer, Isotyp Kontrolle, EB7 (Ratten IgGl, Dianova, Hamburg) Sekundare Antikoφer FITC-markierte Schaf-anti-Maus (Fab)2 und Schaf-antiMaus (Fab)2 (Dianova, Hamburg) Der Behandlung mit dem sekundären Antikoφer folgte eine lOminutige Inkubation in 2%> normalen Mause oder Ratten Serum und daraufhin eine In- kubation mit PE-(Phykoerythrin-)markiertem HLA-DR spezifischen Antikoφer (L234, Mause IgGl, Becton Dickinson) oder IaD (Mause IgG2b, Pharmingen, Hamburg) oder entsprechende nicht-reaktive PE-markierte Kontroll- Antikoφer (Dianova) Humane DC wurden durch FITC- konjugierte mAb gegen CDla (Okt-6, Mause IgGl, Ortho, Neckargemund) identifiziert 7- Aminoactinomycin D (7-ADD)(2.5mg/ml, Sigma) wurde hinzugegeben, um tote Zellen auszu- schließen Zeil Quest Software (Becton Dickinson) wurde für die Analyse von jeweils 10^ HLA-DR+, CDla+ oder Iab lebenden Zellen angewandt
Beispiel 3 Vollhaut Organkultur
4 mm dicke Haut-Stanzbiopsien, die Dermis und Epidermis enthielten, wurden in 25 mm Ge- webekultur-Einsatze mit einer 0 02 mm Anopore Membran (Nunc) in 6-Loch Gewebekulturplatten, welche mit supplementiertem DMEM/HAMS-F12 (Gibco) bis zur epidermo-dermalen Grenze aufgefüllt wurden, inkubiert Die Kultivierungen wurden zu den angegebenen Zeit- punkten beendet und Proben in N2 schock-gefroren Gewebeschnitte (5 mm) wurden präpariert (Cryocut 1800, Leica) und nach der Methode von Negoescu, A et al , J Histochem Cytochem. 42 433-437, 1994, mit einer Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung angefärbt Als erstes wurden Gefrierschnitte mit Lag mAB für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bei 4°C über Nacht mit FITC-konjugierten Ziege-anti-Maus monovalenten Antikoφern (Fab) (Dianova) Zum zweiten wurden Gefrierschnitte mit mAbs gegen CD44 Epitope für 30 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend mit Cy3 -konjugierten Ziege-anti-Mau
Figure imgf000024_0001
(Fab) inkubiert (4°C, 4 Stunden) Kreuzinterferenz der verschiedenen Farbe- schritte wurde durch entsprechende Kontrollen ausgeschlossen Für die quantitative Analyse von gesamten und CD44+/Lag+ doppelt-positiven LC wurden 5 stark vergrößerte Felder mikroskopisch ausgezahlt und die LC-Zahl mm^ bestimmt
Beispiel 4 Spalthaut Organkultur
2 x 2 cm Spalthaut, welche Epidermis plus papillare Dermis enthielt, wurde über Dermatome (Aesculap, Tuttlingen) gemäß Pope, M et al , J. Invest. Dermatol. 104 11-17, 1995, präpariert und auf supplementiertes RPMI in 6-Loch Platten (Greiner, Nurtingen ) gegeben Nach 3 Tagen wurden die Zellen, die in das Kulturmedium gewandert waren, gesammelt Die Keratino- zyten wurden durch Dermatom Manipulation in eine Suspension gezwungen Die Anfarbung mit ^ITC-konjugierten mAbs gegen CDla und FACS wurden wie oben beschrieben durchgeführt Alle aus einem Loch erhaltenen Zellen (5 - 6 x 10^) wurden analysiert Der Prozentsatz an CDla+ Zellen wurde anhand der Cell Qest® Software (Becton Dickinson, Heidelberg) berechnet Der Prozentsatz an emigrierenden LC aus unbehandelten Proben wurde als 0% Inhibi- tion definiert
Beispiel 5 Lymphkoten Adhasions Assay
Nach Simon, j C et al, Exp. Dermatol. 4.155-161, 1995, mit Antikoφern gegen HLA-DR oder CDla angereicherte LC oder DC MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) wurden auf ihre Bindung an Lymphknoten-Gefrierschnitten getestet (Pope, M et al , J. Invest Dermatol. 104: 11-17, 1995). Frische, auf Objektträger aufgelegte Gefrierschnitte (10 mm) von humanen axillaren Lymphknoten wurden mit RPMI, mit 1% Rinderserumalbumin (BSA), bei 7°C für 1 Stunde geblockt. LC oder DC wurden in HBSS (Gibco)/ 1% BSA suspendiert (2 x 10^ Zellen/ml) und die Gefrierschnitte bei Raumtemperatur für 40 Minuten aufgelegt Die Objektträger wurden mit HBSS gespült und in Aceton bei 4°C für 10 Minuten fixiert Für die Blockierung der Antikoφer wurden LC oder DC mit mAbs (jeweils 20 mg/ml für 30 Minuten bei 4°C) prainkubiert, welche gegen den N-Terminus von CD44 (SFF-2, MEM-85) gerichtet waren, mit v Exon spezifischen Antikoφern (v5, VFF-8, v6, VFF-18, v9, FW 1 1 24 7 36), mit ICAM-1 mAb 84H10 (Immunotech Corp , Boston, USA, Makgoba, M W et al , Nature_ 331 86-88, 1988) oder mit Kontroll IgGl Die Objektträger wurden anschließend gemäß Simon, J V C et al , Europ J Cancer 32A 1394-1400, 1996, mit anti-CD la mAb gefärbt Die Codierung und Evaluierung erfolgte durch zwei unabhängige Untersucher Die Hintergrund- Bindung von kultivierten LC/DC war ungefähr 1 5 Zellen mm2, die Positiv-Bindung war 30 Zellen mm2 Die Daten wurden als %> Bindung im Vergleich zu Proben ohne Antikoφer auf-' getragen Die Standartabweichung wurde anhand von drei Objektträgern, jeder mit 9 Zufallsfeldern pro Objektrager, durch Verwendung eines optischen Gitternetzes (Vergrößerung 10 x), berechnet
Beispiel 6 Kontakt Hypersensitivitat
6 Wochen alte weiblichen C57/BL63 Mausen (Harlan-Olac, Great Britain) wurden auf die abdominale Haut 20 μl 0.5% 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB, Sigma, Deisenhofen) in Aceton am Tag 0 und 1 gemäß Simon, J C et al, Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. IQ 206- 211, 1994, aufgetragen Am Tag 6 wurde den Mausen 10 μl 0.2%> DNFB beidseitig auf das rechte Ohr aufgetragen Die Ohrdicke wurde mit einem Ingenieur Mikrometer (Mitutoyo Coφ , Takatsu-Ku, Kawasaki-Shi, 213 Kanagawa-Ken, Japan) vor und zum Zeitpunkt 24 Stunden nach der Stimmulation gemessen (Simon, J C et al, Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 10.206-211, 1994) Die Gruppe 1 Mause wurden entweder nur stimmuliert oder sensibilisiert und stimmuliert in Abwesenheit von mAbs Die Injektion der mAbs (i p ) wurde wie folgt durchgeführt Gruppe 2 Mause erhielten 300 mg am Tag 1, jeweils 100 mg an den Tagen 0 und 1 Gruppe 3 Mause erhielten 300 mg am Tag 5 und jeweils 100 mg an den Tagen 6 und 7 Jeder Balken (Fig 5) repräsentiert die von 8 Tieren gepoolten mittleren Werte der Ohrschwellungen
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Ingelheim International GmbH
(B) STRASSE: Rheinstrasse
(C) ORT: Ingelheim (E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 55216
(G) TELEFON: ++49-(0)6132-77-2770 (H) TELEFAX: ++49-(0)6132-77-4377
(A) NAME: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
(B) STRASSE: Weberstr. 5
(C) ORT: Karlsruhe
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 76133
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verwendung von anti-CD44 Antikoeφern enthaltenden Praeparationen zur Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdru eckung von Immunreaktionen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1 :
Ile Ser Thr Thr Pro Arg Ala Phe Asp His Thr Lys Gin Asn Gin Asp 1 5 10 15
Trp Thr Gin Trp Asn Pro Ser His Ser Asn Pro Glu Val Leu Leu Leu 20 25 30 Gin Thr Thr Thr Arg Met Thr 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 2
(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LANGE 39 Aminosäuren _ (B) ART Aminosäure
(C) STRANGFORM Einzelstrang (D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO 2
Asp Val Asp Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro 1 5 10 15
Glu Ala His Pro Pro Leu I le His His Glu His His Glu Glu Glu Glu 20 25 30
Thr Pro His Ser Thr Ser Thr 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 3
(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LANGE 42 Aminosäuren
(B) ART Aminosäure
(C) STRANGFORM Einzelstrang (D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO 3 Gin Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu 1 5 10 15
Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Arg 20 25 30
Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala 35 40
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 4 (i) SEQUENZKENNZEICHEN (A) LANGE 30 Aminosäuren
(B) ART Aminosäure
(C) STRANGFORM. Einzelstrang (D) TOPOLOGEE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO 4 Gin Gin Ser Asn Ser Gin Ser Phe Ser Thr Ser His Glu Gly Leu Glu 1 5 10 15
Glu Asp Lys Asp His Pro Thr Thr Ser Thr Leu Thr Ser Ser 20 25 30
BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
F R DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Boehringer Ingelheim International GmbH Postfach 200
55216 Ingelheim am Rhein EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER
SFF- 2
DSM ACC2305
II WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I bezeichneten Mikroorganismus wurde
(X ) eine wissenschaftliche Beschreibung
( ) eine vorgeschlagene taxonomischc Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen)
III EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter 1 bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 19 97 - 04 - 16 (Datum der Ersthinterlegung)' eingegangen ist
IV EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Vntrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)
V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschπft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten
Anschrift Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig CtJas *
Datum. 1997 - 04 - 25
1 Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Boehringer Ingelheim International GmbH Postfach 200
55216 Ingelheim am Rhein LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen
INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. HINTERLEGER II KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name: Boehringer Ingelheim Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE International GmbH zugeteilte EINGANGSNUMMER
Anschrift. Post fach 200 DSM ACC2305
55216 Ingelheim am Rhein Datum der Hinterlegung oder Weiterieitung1 1997 - 04 - 16
III. LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 19 97 - 04 - 16 ! geprüft worden Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
(X)' lebensfähig
( )' nicht mehr lebensfähig
IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST*
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name- DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschπft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten
Anschrift: Mascheroder Weg Ib D-38124 Braunschweig 0
Figure imgf000030_0001
Datum 1997 - 04 - 25
Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterieitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkeitsprüfung
Zutreffendes ankreuzen.
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.
Formblatt DSMZ-BP9 (einzige Seite) 0196* BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Boehringer Ingelheim Int. GmbH
Postfach 200
55216 Ingelheim am Rhein
EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER
VFF-18
DSM ACC2174
II WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung
( ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen)
III EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1994 - 0 6 — 07 (Datum der Ersthinterlegung) eingegangen ist
IV EINGANG DES ANTRAG S AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)
V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrif (en) der zur Vertretung der internationalen MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Hinterlegungsstelle befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten
Anschrift Mascheroder Weg lb
D-38124 Braunschweig 3 Datum 1994-06-17
1 Falls Regel 6 4 Buchstabe d zutnfft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSM-BP/4 (einzige Seite) 12/93 BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Boehringer Ingelheim Int. GmbH
Postfach 200
55216 Ingelheim am Rhein
LEBENSFÄHIG KEITSBESCHEINIG UNG ausgestellt gemäß Regel 10 2 von der unten angegebenen
INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I HINTERLEGER II KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
ame Boehringer Ingelheim Int. GmbH Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER
Anschrift POΞtfaCh 200 DSM ACC2174
55216 Ingelheim am Rhein
Datum der Hinterlegung oder Weiterieitun
1994-06-07
III LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 1994 — 06 — 07 geprüft worden Zu diesem Zeitpunkt war d"'r Mikroorganismus
(X)3 lebensfähig
( ) nicht mehr lebensfähig
IV BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST4
V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschnft(en) der zur Vertretung der internationalen MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Hinterlegungsstelle befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten
Anschrift Mascheroder Weg lb
D -38124 Braunschweig
Figure imgf000032_0001
Angabe des Datums der Ersthinterlegung Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterieitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterieitung
In den in Regel 10 2 Buchstabe a Ziffer ii und in vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfahigkeitsprufung
Zutreffendes ankreuzen
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren
Formblatt DSM-BP/9 (einzige Seite) 12/93

Claims

Patentansprüche
Verwendung von anti-sCD44 und/oder antι-vCD44 Antikoφern zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von malignen Erkrankun- gen, die mit einer Entartung, Aktivierung oder massiven Vermehrung von Langerhans Zellen (LC) und/oder dendritischen Zellen (DC) assoziiert sind
Verwendung von anti-sCD44 und/oder anti-vCD44 Antikoφem zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung gemäß Anspruch 1, da- durch gekennzeichnet, daß die malignen Erkrankungen Langerhans-Zell-Histiozytosen, Hi- stiozytose X, Abt-Letterer-Siewe-Syndrom oder eosinophiles Granulom sind
Verwendung von anti-sCD44 Antikoφem zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekenn- zeichnet, daß die Antikoφer N-terminale Epitope von sCD44, oder Teilen davon, erkennen
Verwendung von anti-vCD44 Antikoφem zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn- zeichnet, daß die Antikoφer von durch Variante Exons von vCD44 kodierte Epitope, oder
Teilen davon, erkennen
Verwendung von anti-vCD44 Antikoφem zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper von durch die Varianten Exons v4, v5, v6 und/oder v9 kodierten Epitope, oder Teilen davon, erkennen
Verwendung von anti-vCD44 Antikörpern zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikoφer mit den folgenden Aminosauresequenzen oder Teilen davon zu reagieren vermögen
ISTTPRAFDHTKQNQDWTQWNPSHSNPEVLLLQTTTRMT DVDRNGTTAYEGNWNPEAHPPLIHHEHHEEEETPHSTST QATPSSTTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDSHSTTGTA
QQSNSQSFSTSHEGLEEDKDHPTTSTLTSS
Verwendung von anti-vCD44 Antikoφem zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Antiköφer aus dem gegen durch v6 kodiertes Epitop, oder Teilen davon, gerichteten Antiköφer VFF-18 und solchen Antiköφern, die mit dem von VFF-18 erkannten. Epitop oder Teilen davon zu reagieren vermögen, besteht.
8. Verwendung von anti-sCD44 Antiköφem zur Herstellung einer Praparation zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Erkrankungen und Zuständen eines Säugetierorganismus, denen eine immunregulatorische Störung oder eine unerwünschte odeT überschießende Immunreaktion zugrundeliegt.
9. Verwendung von anti-sCD44 Antiköφem zur Herstellung einer Praparation gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die immunregulatorische Störung oder die unerwünschte oder überschießende Immunreaktion allergische Erkrankungen, Allergien vom verzögerten Typ, Abstoßungen von Haut- oder Organtransplantaten, Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, Multiple Sklerose, Psoriasis oder atopische Dermatitis sind.
10. Verwendung von anti-sCD44 Antiköφem zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung gemäß Ansprüchen 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer N-terminale Epitope von sCD44, oder Teilen davon, erken- nen.
1 1. Verwendung von anti-sCD44 und/oder anti-vCD44 Antiköφem zur Herstellung einer Praparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung gemäß Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer monoklonale Antiköφer oder Fragmente oder Derivate davon sind.
12. Verwendung des gegen das durch v6 kodierte Epitop, oder Teilen davon, gerichteten Anti- köφers VFF-18 und solchen Antiköφem, die mit den von VFF-18 erkannten Epitop oder Teilen davon zu reagieren vermögen, zur prophylaktischen und therapeutischen Behand- lung von Erkrankungen und Zuständen eines Säugetierorganismus gemäß einem der Ansprüche 8 und 9.
13. Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß isolierte Monocyten in einem Kulturmedium, bestehend aus RPMI 1640, fetales Kälberserum, Peni- cillin/Streptomycin, einem aus einer N-substituierten Aminosulfonsäure bestehenden Puffer, nicht-essentielle Aminosäuren, L-Glutamin, GM-CSF und einem Interleukin, für einige Tage kultiviert und anschließend isoliert werden.
14. Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet., daß die isolierten Monocyten in einem Kulturmedium, bestehend aus RPMI 1640, 10% FCS, 45μ Penicillin/Streptomycin, 25 mM Hepes, 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 50 ng/ml human GM-CSF und 1000 U/ml ILA für 8 Tage kultiviert und anschließend isoliert werden.
PCT/EP1998/001089 1997-03-04 1998-02-26 Verwendung von anti-cd44 antikörper enthaltenden präparationen zur behandlung bestimmter tumore und zur unterdrückung von immunreaktionen WO1998039034A2 (de)

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