WO1999066061A1 - Phage de transfert d'acide nucleique - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to the field of genetic engineering, and in particular, to a technique for transporting a foreign substance such as a nucleic acid from outside to inside using a virus particle.
- Gene transfer technology that artificially introduces foreign genes into cells is not only a basic technology for analyzing various life phenomena, but also opens the way to meaningful applications for human beings, such as gene therapy and the creation of useful animals. This is an important technology. Gene transfer technology is roughly divided into two methods. One is a biological method using a virus in which a foreign gene has been introduced, and the other is a physical method in which a foreign gene is physically introduced into cells.
- the method using a virus is based on the principle that cells are infected with a recombinant virus incorporating the gene of interest and the virus genome is integrated into the cell's genome.
- ADA recombinant virus incorporating the gene of interest and the virus genome is integrated into the cell's genome.
- This method uses the biological characteristics of the virus as it is, various problems have been pointed out, such as the pathogenicity of the virus.
- modified vectors are currently being developed in which regions related to viral pathogenicity and replication have been removed from the genome.
- a virus vector that can be used for non-dividing cells such as nerve cells
- Adenovirus is known as a material for such a substance.
- adenovirus has its own cytotoxicity and antigenicity problems.
- the production of vectors requires culture animal cells, which is disadvantageous in terms of production.
- a physical method of introducing a non-viral vector is used in parallel with a method using a virus.
- a method has been established in which a chemical substance such as calcium phosphate, DEAE-dextran, polycation, or ribosome is combined with a non-viral vector and introduced into cells.
- a chemical substance such as calcium phosphate, DEAE-dextran, polycation, or ribosome
- the efficiency of introducing genes into cells is low by physical methods.
- the probability that the foreign gene on the non-viral vector introduced into the cell reaches the cell nucleus is low, and there are many issues to be overcome for application to gene therapy and the like.
- the behavior of genes common to these gene transfer technologies is briefly summarized.
- NLS nuclear localization signal
- a gene having an NLS introduced into a cell efficiently reaches the nucleus and is expressed. Moreover, long-chain DNA can be packaged inside the phage.
- NLS is not involved in the process of adsorbing to cells outside and being taken up inside. Therefore, in this prior art, a gene provided with NLS was introduced into cells by microinduction to introduce the gene into the cells.
- Lactoferrin (Nature, 1995 Feb, 373: 6516, 721-4), Herpesvirus V P22 protein (Cell 88, 223-233, 1997), or fiber Blast cell growth factor 2 (Bioes says, 1995 Jan, 17: 1, 39-44) and the like are known.
- any of the proteins only a limited size of substance could be transferred by the known method.
- the variable region of an anti-DNA antibody which is an autoantibody, penetrates cells and reaches the nucleus.
- a peptide linking CDR2 and CDR3 which are hypervariable regions in the variable region, transfers haptens and polynucleotides to the nucleus to function effectively ( Proc.
- An object of the present invention is to provide a novel system capable of reaching a substance with high efficiency from outside a cell to a nucleus inside the cell. More specifically, the use of phage enables packaging of long-chain DNA, and is easy to manufacture, improving efficiency in the entire process from incorporation into cells to reaching the nucleus. It is an object of the present invention to provide a novel technology that can be expected.
- the present inventors have paid attention to the fact that HIV TAT has a cell translocation activity as well as a nuclear translocation activity similar to NLS.
- the above problem was solved by modifying the phage head with a bifunctional protein represented by TAT. That is, the present invention provides the following techniques.
- [5] A protein that has both nuclear translocation activity and cell adsorption activity
- the phage or its head according to [1] which is a fusion protein with the phage head protein.
- a fusion protein of a protein having both nuclear translocation activity and cell adsorption activity and a protein forming a phage head is a protein having both nuclear translocation activity and cell adsorption activity and a protein forming a phage head.
- the fusion protein of [7], wherein the protein having both nuclear translocation activity and cell adsorption activity comprises the sequence of SEQ ID NO: 1.
- Human phage D protein is the protein that forms the phage head
- a kit for use in cell transformation comprising: (a) the bacterial host of [13] or [14]; and (b) a phage derived from a head protein contained in a fusion protein expressed by the bacterial host.
- the phage cannot express the head protein in the bacterium
- a pharmaceutical composition comprising the phage or the head thereof according to [1] and a component required for treatment packaged.
- Kiyapushido of bacteriophage such as Hisashi phage, it can be packaged size of the material corresponding to the file temporary own genome (3 Bok 38X 10 6 dalton).
- long-chain DNA packaged in the capsid is protected from DNase attack even after introduction into the cell. Also, since the gene can be recovered as a phage, the risk of damage to the gene during the purification process is reduced.
- the input phage is a very desirable material as a carrier of DNA.
- the present inventors have clarified that, by modifying the surface of the phage head with a protein having both a nuclear transport activity and a cell adsorption activity, it is possible to improve the efficiency of the entire process of transporting substances from the outside of the cell to the nucleus. Thus, the present invention has been completed.
- the basic operation constituting the present invention is also disclosed in an earlier application filed by the present applicant W098 / 6828.
- the NLS used for the modified protein of the head in the earlier application W098 / 6828 can be converted into a protein that has both nuclear translocation activity and cell adsorption activity.
- the present invention can be implemented. If the process is specifically described, it can be roughly explained as follows.
- the fusion protein constituting the head of human phage which incorporates a protein having both a nuclear translocation activity and a cell adsorption activity, which is a novel feature of the present invention, is expressed in Escherichia coli by a suitable expression vector.
- a mutant lambda phage (hereinafter, simply referred to as “D-amba phage”) having no ability to form a head is lysogenized in E. coli as a host.
- the head expressed as a recombinant protein based on the expression vector is reconstructed as the head of D-amber phage.
- the phage according to the present invention can be obtained in a packaged form of this genome.
- the series of operations is also described in detail in an earlier patent application W098 / 6828 or the like by the present applicant.
- D amber phage is advanced based on ADaml5.
- a material for D-amber phage for example, lysogenic Escherichia coli BHB2690 (ADaml5 b2 red3 i hall 434clts Sam7), which is distributed as ATCC 35132, can be used.
- ADaml5 b2 red3 i hall 434clts Sam7 which is distributed as ATCC 35132.
- the phage thus obtained expresses a protein having both a nuclear translocation activity and a cell adsorption activity on the surface of the head, and the capsid contains a gene to be transferred into the nucleus of the target cell.
- the phage of the present invention When the phage of the present invention is brought into contact with a cell, the phage is first taken up by the cell by its cell-adsorbing activity, and then starts to be transferred to the nucleus based on its nuclear transport activity.
- the phage head is approximately 55 nm, similar to the SV40 virion (50 nm), which is thought to deliver MA into the nucleus through the nuclear pore.
- the present invention substances can be efficiently transferred from outside the cell to the nucleus without being combined with other preparations, and application to in vivo is easy. like this As is clear from the mechanism, the phage according to the present invention achieves targeting to cells and packaging of the substance to be transferred only at the head. Therefore, the structure of the tail part, which is naturally responsible for attachment to the host, is not essential in the present invention.
- the structure of the tail part which is naturally responsible for attachment to the host, is not essential in the present invention.
- a foreign substance is packaged at the phage head to which a bifunctional protein having both nuclear translocation activity and cell adsorption activity (hereinafter, may be simply abbreviated as a bifunctional protein) is added.
- the present invention relates to a technique of introducing a phage into a desired cell in which a foreign substance is desired to function, and transferring the foreign substance together with phage particles to a nucleus of a target cell.
- the protein having both the nuclear transport activity and the cell adsorption activity used in the present invention is not particularly limited as long as it is a protein that assists the adsorption to a target cell and transport to the nucleus in the cell.
- HIV ⁇ is a desirable bifunctional protein.
- the bifunctional proteins include a variable region of an anti-DNA antibody, an antennae of Drosophila, lactoferrin, herpesvirus VP22 protein, a poliovirus VP1 protein, a poliovirus VP2 protein, and a poliovirus. Mention may also be made of VP3 protein, adeno-associated virus Cap protein, and fibroblast growth factor 2.
- TAT it is known that the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an active domain supporting the above two functions (Eric bes et al J. Biol. Chem. 272, 16010-16017 (1997)) ).
- a region necessary for the expression of the two functions namely, nuclear translocation activity and cell adsorption activity, or a region containing this essential region as a partial peptide is referred to as a translocation activation domain. Therefore, when TAT is used as the bifunctional protein in the present invention, it is desirable to design so as to include at least the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
- proteins ie, variable regions of anti-DNA antibodies, lactoferrin (Nature, 1995 Feb, 373: 6516, 721-4), herpes virus VP22 protein (Cell 88, 223-233, 1997), poliovirus VP1 protein Poliovirus VP 2 protein VP3 protein, poliovirus VP3 protein, adeno-associated virus Cap protein, or fibroblast growth factor 2 (Bioessays, 1995 Jan, 17: 1, 39-44) also have domains with translocation activity. If the phage is specified and the phage is modified using only that portion, it can be applied to the present invention. For example, Antenabedia is a protein involved in the differentiation of Drosophila.
- a protein containing at least this sequence can be used as the bifunctional protein of the present invention.
- an amino acid sequence VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA
- a protein containing this amino acid sequence can also be applied as a bifunctional protein in the present invention.
- the phage used in the present invention is not particularly limited as long as a foreign substance can be packaged on its head, and phage, M13 phage and the like can be used. Furthermore, PI phage, P22 phage, Tl phage, T2 phage, T3 phage ⁇ T4 phage, T5 phage s T6 phage ⁇ T7 phage, P2 phage, P4 phage, Mu phage, Pm2 phage ⁇ N4 phage, SPol phage, PBSlphage , Or PBS2 phage can also be used as the carrier in the present invention.
- a desirable embodiment of the phage preparation method in the present invention is application of a gene recombination technique. That is, DNA encoding a protein having both nuclear translocation activity and cell adsorption activity is linked to a gene encoding a phage head protein and integrated into a vector, and expressed as a fusion protein in a bacterial host. Mutated phage that cannot express a partial protein are grown in the host to form a phage head. I can do it. In this system, any gene can be easily packaged by incorporating the gene to be packaged into the phage gene. By using phage, the gene to be integrated is recovered as phage particles. Phage particles can be recovered from E. coli by centrifugation. Phage recovery does not require a harsh purification step, so it is less likely to damage the gene.
- kits for packaging a foreign gene into a phage by combining the bacterial host and a phage vector having a cloning site for inserting an arbitrary gene may be provided.
- the phage head protein used here is not particularly limited. For example, if the phage is a phage, a gpD protein and a gpE protein may be mentioned, and if the phage is M13, , Gene 3 protein.
- the vector (expressing the fusion protein constituting the phage head) used in this embodiment is not particularly limited, and various vectors can be used.
- the bacterial host is not particularly limited as long as the phage to be used can grow.
- various Escherichia coli strains capable of growing the phage can be mentioned.
- the binding between the DNA encoding the amino acid sequence of a protein having both nuclear translocation activity and cell adsorption activity and the gene encoding the phage head protein is not only when directly linked, but also in the middle. This includes cases where nucleotides are interposed.
- a method of chemically binding the bifunctional protein to a phage head protein can also be employed.
- the chemical bond between the bifunctional protein and the protein on the phage head in the present invention is not only when the sequence is directly linked to the protein, but also when a cross-linking agent or a peptide is interposed therebetween. This also includes the case where such is sandwiched.
- a phage is packaged with a foreign substance and then introduced into cells.
- the packaging method include the method of Ishiura et al. (Gene, 82, 28 289 (1989)) and the method of Sternberg et al. (Publicly published 59-500042).
- foreign substances include genes, gene fragments, ribozymes, antisense genes, and other substances desired to function in the nucleus.
- when performing gene therapy it is effective to use a normal gene or the like corresponding to a defective gene, and when analyzing the function of a specific gene, use an antisense gene or the like for the gene. It is effective.
- transgenic animals it is effective to introduce genes related to the traits to be given o
- a long-chain nucleic acid such as a gene including an upstream region.
- packaging of a large gene of, for example, 50 kb is possible.
- the whole genome sequence derived from animal viruses or multiple genes that support a series of functions can be integrated.
- the present invention can be applied to a large DNA such as a dystrophin cDNA (13.8 kb), since the packaging of only one cosmid vector is possible.
- the use of phage is the only reason that such long-chain DNA can be aggregated to a size that can be efficiently transported to the nucleus.
- transfer to cells in a living body can be achieved without any physical means. That is, the transfer can be achieved by bringing the phage of the present invention into contact with the transfer destination cell.
- the contact between the phage and the cell means that the cell is incubated with the phage for a certain period of time without adding any artificial and physical treatment for transferring a substance to the cell.
- no transfer function to cells can be expected, which is in contrast to using physical methods such as microinjection. Based on this feature, the phage according to the invention
- a new approach was to send the genome of a virus, such as an adenovirus with a cell-killing activity (total length of the genome is about 36 kb), directly to cancer cells by the phage of the present invention and express it in the cancer cells.
- the present invention can be applied to an approach in which a plurality of lymphokines having a function of activating an immune function are expressed in the same cell.
- a gene encoding an lymphokine such as inulin leukin 2, inulin leukin 6, or granulocyte colony stimulating factor is operably linked to the gene.
- Is packaged in the phage of the present invention When the obtained phage is brought into contact with lymphocytes or the like and returned to the living body (ex vivo), a plurality of lymphokine-producing cells that enhance the immune function can be induced in the body.
- the adenovirus in the aspect of packaging the adenovirus, can be delivered to the inside of the target cell while masking the antigenicity of the adenovirus.
- the gene is transported to the nucleus of the cell to which the gene has been adsorbed, leading to expression with high efficiency.
- In vivo application methods include direct injection into a target organ, blood flow restriction as needed after administration to a blood vessel supplying blood to the target organ, and phage according to the present invention for a certain period of time inside the organ.
- a method of maintaining a high concentration in blood vessels can be adopted.
- phage in vivo administration of the present invention it is general to prepare such that the 10110 14 PFU / m 1 about a phage concentration. Concentrations significantly below this range are likely to result in inadequate phage potency, whereas concentrations above this range generally tend to cause problems such as phage precipitation. However, this numerical range should not be construed as limiting, for example, a target cell / phage combination with a very high infection efficiency, or the introduction of a very small amount of phage should be sufficient. In the case where it can be waited, it may be possible to endure practical use even at a lower concentration.
- the phage concentration and the administered liquid volume are comprehensively determined in consideration of these conditions. For example, for direct administration to human organs, it is generally said that the injection limit is about 100 ml even for large organs such as the liver.
- the phage according to the present invention can be supplied commercially as a pharmaceutical composition intended for in vivo administration.
- the pharmaceutical composition according to the present invention can be obtained by adding the phage of the present invention at a required concentration to an appropriate buffer solution that is acceptable to a living body.
- the available dispersion medium in the case of liquid SM (10mM Tris-HCl (pH7.4 ), 10mM MgS0 4, 0.1M NaCl, 0.01% gelatin) are also 3XD Me dium and LB if the freezing It is common to use + 15% glycerol (Hendrix, R., Lambd all, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983).
- the pharmaceutical composition of the present invention can be distributed in the form of a solution or in a frozen state, but is desirably distributed at a low temperature (for example, 4 ° C.).
- the pharmaceutical composition may additionally contain components such as glycerol, serum albumin, gelatin, or butretcin.
- the combination of the target cell and the bifunctional protein is an important factor because the phage is modified with a protein exhibiting not only a nuclear transport activity but also a cell adsorption activity. That is, the cell adsorption activity of the bifunctional protein used for phage modification in the present invention must be at least directed to the target cell.
- HIV TAT is a preferred bifunctional protein.
- a site to which the phage of the present invention is applied not only a specific organ, but also a lesion such as a tumor or an atherosclerotic lesion can be selected.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of an HIV-TAT-gpD fusion protein.
- FIG. 2 shows the construction process of a TAT peptide-displaying phage incorporating a marker gene.
- FIG. 3 is a schematic diagram showing a series of operations for transfusion.
- FIG. 4 is a micrograph (48 hours after transfection) of HeLa cells treated with the phage according to the present invention. Above is a phase contrast micrograph (bright field), and below is a fluorescence micrograph of the same specimen.
- FIG. 5 is a photomicrograph (48 hours after transfection) of HeLa cells (control) treated with wild-type phage. Above is a phase contrast micrograph (bright field), and below is a fluorescence micrograph of the same specimen.
- FIG. 6 shows the results of transfection of the phage according to the present invention incorporating the luciferase gene. The vertical axis shows the luciferase activity (RLU / ⁇ g protein / sec), and the horizontal axis shows the phage contacted with the cells.
- FIG. 7 shows the effect of serum on the expression of luciferase gene introduced into cells by the TAT human phage particles of the present invention.
- the vertical axis shows luciferase activity (RLU / ⁇ g protein / sec), and the horizontal axis shows the presence or absence of serum at the time of phage contact.
- FIG. 8 shows the effect of contact time on the expression of the luciferase gene introduced into cells by the TAT human phage particles of the present invention.
- the vertical axis shows luciferase activity (RI / gprotein / sec), and the horizontal axis shows the contact time between cells and each phage.
- Example 1 Construction of a TAT peptide-gpD fusion protein expression vector Using the wild-type human phage gene as type I, the cDNA of gpD protein, one of the proteins constituting the ⁇ phage head, was cloned by PCR. One eng. Specifically, a vector called "pTrcHisA-gpDj was constructed according to the method disclosed in the earlier patent application W098 / 6828 by the present applicant. After confirming the DNA sequence by the cycle sequence method, the vector was transformed into E. coli.
- a fusion protein of TAT peptide and gpD was expressed in E. coli.
- TAT peptide As the TAT peptide, LGISYGMKRRQRRRPPQ (Eric yorks et al J. Biol. Chem. 272), which corresponds to the amino acid sequence at positions 43-60, which is known to pass through the cell membrane and reach the nucleus with the peptide alone. , 16010-16017 (1997)) (FIG. 1, and SEQ ID NO: Do).
- an oligo DNA corresponding to this sequence was synthesized, and introduced into the NcoI site of the above “pTrcHisA-gpD” to introduce pTrc-TAT.
- the vector was introduced into E. coli T0P10, and the fusion protein of NLS and gpD protein was increased in E. coli. Expression of the protein was detected by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) .As a result, a strong band was observed at the position of the molecular weight of the target protein 6 hours after induction with IPTG of ImM. was detected.
- Example 2 Construction of TAT peptide-displayed ⁇ phage incorporating marker gene E. coli T0P10 (human D1180-CMV-EGFP) was constructed according to the scheme shown in FIG.
- the phage of each plaque was reinfected with Escherichia coli C600 (supE) (manufactured by Stratagene) and TOP10 (supO) (manufactured by In vitrogen). And This is based on the principle that C600 (supE) complements Dajnl5, but TOPlO (supO) cannot complement it and therefore cannot be packaged in cells.
- D1180 with 80% genome size was constructed from Daml5-gtll.
- the input Daml5-gtll was digested with EcoRI and Sacl to prepare Left Arm 19600bp and Right Arm 13110bp. Both were ligated with EcoRI-SacI linker-5, -MTTCGGCGGCCGCGAGCT-3, / 5'-CGCGGCC GCCG-3 'to construct D1180 with a total length of 38010 bp.
- CMV-EGFP-SV40polyA (1600 bp) a unit that expresses genes in animal cells, was prepared by the PCR method.
- 5′-GGGCGTGAATTCTAGTTATTAATAGTAA-3 ′ (SEQ ID NO: 2, 5 and the 7th to 12th sequence has an EcoRI site) and 5, -GGGCGGMTTCCGCTTACAATTTACGCCTTAAG-3, (SEQ ID NO: 3, (The EcoiU site is present in the 5th to 12th sequence.)
- the pEGFP-Nl (Clontech) was used as a primer. PCR is ⁇ of 35ng, lx T hermoPol buffer (New England Biolabs , Inc., lOmM KC1, 2mM MgS0 4 3 10mM (NH 4) 2 S 0 4, 20mM Tris-HCl (pH8.8), 0. 13 ⁇ 4Triton X- 100), Primer, 500nM d
- gpD is not expressed in the supO host
- gpE is usually expressed in phage head proteins (gpD and gpE Only two types) form the head.
- This gpE-only phage is extremely sensitive to EDTA.
- d which is encoded on the phage and is a repressor of the phage, is temperature-sensitive, and the treatment at 42 ° C. for 15 minutes releases the repressor, and the phage can be lysed.
- HIV-TAT-gpD fusion protein 1.0 X 10 8 1.0 X 10 8
- Escherichia coli TOP 10 (AD1180-CMV-EGFP) transfected with plasmid pTrc-TAT-gpD in LB medium containing 10 mM Mg Cultured in 2 ° C, logarithmic growth phase (2 x l0 8 cel ls / ml) Entered ones with earthenware pots preparative shaking for 15 minutes at 42 ° C to induce the production of phage. Then, the expression of the fusion protein at 0.5 mM IPTG and induction, shaken for 2 hours 30 minutes at 38 ° C, E.
- SM buffer 0.1M NaCl, 8mM MgS0 4
- the suspension was suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5).
- the concentrated bacteria were lysed by adding a form at 37 ° C and stirring.
- the mixture was centrifuged at 8000 rpm for 30 minutes to remove insolubles, and the supernatant was centrifuged at 23000 rpm for 60 minutes to precipitate a phage and suspended in SM buffer.
- the collected phage particles were purified using a cesium chloride density gradient centrifugation method.
- the suspension was suspended in an SM buffer to prepare a TAT peptide-presenting phage lx lOnpFU / ml.
- HeLa cells (MEM medium containing 10% fetal serum / GIBC0-BRL), C0S-7 cells (DMEM medium containing 10% fetal serum / GIBCO-BRL), and NIH3T3 cells (10% neonatal) DMEM / GIBC0-BRL, Inc.) was cultured and spread to a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / chamber (Falcon Culture Slide 4101) (50% confluency). The next day, lx lOnpFU / ml of the TAT peptide display phage was added at 10 d / chajnber, M0I was set to 10,000, and the cells were cultured for 48 hours. EGFP gene expression was detected by fluorescence microscopy.
- FIG. 4 shows a micrograph of the cells treated with the phage according to the present invention
- FIG. 5 shows the case where the wild-type phage prepared as a control was given.
- Gene-expressing cells accounted for about 10% of the cells contacted with the phage according to the present invention (FIG. 4). Almost the same results were obtained for COS-7 and NIH3T3 cells. The medium was changed by contact for 5 hours in the presence and absence of serum, respectively, and culture was performed for 48 hours, but no difference was observed in expression efficiency.
- D1180-CMV-luc was constructed by inserting the luciferase gene in place of EGFP whose expression was confirmed in Example 3. Specifically, the Hind III and Xbal sites of pGL3-Basic (Promega) were cut, and the cDNA gene fragment of firefly reciprocalase was extracted. Smoothed. When pCMV-? (manufactured by Clontech) was cut with Notl and smoothed, this fragment was introduced by ligating to construct pCMV_luc.
- pCMV-luc is digested with SaII and EcoRI, the gene expression unit of CMV-luc-SV40polyA is taken out, blunted, and ligated to pCR Blunt (manufactured by In vitrogen) to construct pCR-CMV-luc.
- pCR-CMV-luc was cut with EcoRI and introduced into the EcoRI site of human D1180 to construct input D1180-CMV-luc. Further, this phage was lysogenized into E. coli T0P10 to construct T0P10 (AD1180-CMV-luc).
- the foreign gene integrated into the phage is about 210 Obp, which is about 82.7% genome size in the whole genome.
- T0P10 human D1180-CMV-luc
- SV40 large T antigen NLS-displaying phage WO 098/06828
- E. coli LE392 supE, supF
- COS-7 cells were cultured in DMEM (manufactured by GIBCO-BRL) containing 10% fetal serum and seeded at a concentration of 2 x 10 4 cells / well (Corning 24 well Culture plate 25820) (50% confluency). ).
- the expression of the luciferase gene was detected using a luciferase assay system (manufactured by Pitka Gene Co., Ltd.) and a luminometer (AutoLumat LB953 Berthold)
- the activity was determined by relative light unit ( ⁇ ) g protein
- the experiment was performed in triplicate and the results are shown in Fig. 6.
- TAT peptide display Luciferase gene expression was observed only in ⁇ phage, whereas SV40 large ⁇ antigen NLS display No luciferase activity was observed in human phage and wild-type I phage.
- the present invention provides a phage capable of packaging macromolecules, yet adsorbing itself to cells and further translocating to the nucleus through cell membranes.
- the phage can be simultaneously provided with a cell adsorption activity and a nuclear transport function.
- the phage provided by the present invention can transfer foreign substances into cells without physical assistance, thereby enabling safe administration in vivo.
- the phage according to the present invention has a more desirable characteristic for in vivo application, since the phage in the presence of serum provides a more efficient substance transfer to cells and, in the case of a gene, its expression. be able to. This is in contrast to the known chemical broach, which can hardly transfer substances to cells in the presence of serum.
- the phage according to the invention enable a certain level of gene transfer and expression in as little as 0.5 hours at 37 ° C. This indicates that gene therapy can be performed efficiently in a short time.
- the phage according to the present invention can be efficiently produced by a method easy for those skilled in the art such as genetic recombination, and has high industrial utility. Also, in the present invention employing a bifunctional protein, only one type of protein is introduced, so that the structural change of the phage itself is small and a high titer is realized. Furthermore, in a desirable embodiment of the present invention, since a gene packaged as a foreign substance is steadily expressed in a target cell, it can be expected to open a new avenue in terms of certainty and safety in gene therapy.
- the present invention since large molecules can be packaged, It becomes possible to reach the nucleus as long-chain DNA including the upstream region of the offspring.
- the present invention is expected to be effectively used in various fields such as elucidation of life phenomena and gene therapy.
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Description
明細書 核酸導入ファージ 技術分野
本発明は遺伝子工学の分野、 特にウィルス粒子を使って核酸のような外来物を 細胞の外から中へ輸送するための技術に関する。 背景技術
細胞に外来遺伝子を人為的に導入する遺伝子導入技術は、 様々な生命現象を解 析するための基礎技術としてのみならず、 遺伝子治療や有用動物の作出など人類 にとって有意義な応用への道を切り開く重要な技術であるといえる。 遺伝子導入 技術には、 大きく分けて 2つの方法が用いられている。 1つは、 外来遺伝子を導 入したウィルスを用いる生物学的方法であり、 もう 1つは、 外来遺伝子を物理的 に細胞内へ導入する物理的方法である。
ウィルスを用いる方法は、 目的の遺伝子を組み込んだ組み換えゥィルスを細胞 に感染させ、 ウィルスゲノムごと細胞のゲノムに組み込ませるという原理に基づ いており、 現在、 レッシュ 'ナイハン症候群やアデノシンデァミナ一ゼ （ADA) 欠 損症などに対する遺伝子治療の基盤技術として最も注目されている方法である。 しかし、 この方法は、 ウィルスの生物学的特性をそのまま用いているため、 ゥ ィルスの病原性など様々な問題が指摘されてきた。 レトロウィルスにおいては、 現在、 ウィルスの病原性や複製に関する領域をゲノムから除去した改変べクタ一 が開発されている。 しかし改変ベクターとはいえ、 たとえば細胞内の相同組み換 えによって再び感染性を獲得する危険性がある。 またレトロウィルスの生活環を 利用している以上、 分裂している細胞にしか適用することができないという制約 がある。 神経細胞のような分裂していない細胞にも利用できるウィルスベクタ一
の材料として、 アデノウイルスが知られている。 しかしアデノウイルスにはべク 夕一自身の細胞毒性や抗原性の問題がある。 またべクタ一の調製に培養動物細胞 が必要なことから、 製造面においても不利である。
そこで、 ウィルスを用いる方法と並行して、 非ウィルスベクタ一を導入する物 理的方法が用いられている。 この物理的方法では、 これまでリン酸カルシウム、 D EAE-デキストラン、 ポリカチオン、 リボソームなどの化学物質と非ウィルスべク 夕一とを組み合わせて細胞内に導入する方法が確立されている。 しかし物理的方 法では、 一般に遺伝子の細胞への導入効率が低いとされている。 加えて、 細胞内 に導入された非ウィルスベクタ一上の外来遺伝子が細胞核内へ到達する確率も低 いという問題点があり、遺伝子治療などへの応用に向けて克服すべき課題が多レ 。 ここで、 これらの遺伝子導入技術に共通する遺伝子の挙動を簡単にまとめる。 遺伝子を細胞の中で働かせるには、 おおまかにいって、 人為的に構成した遺伝子 (細胞の外にある） が標的細胞の表面にたどり着きその中に取り込まれる工程、 そして細胞内に入った遺伝子が核にたどり着く工程、 最後に核内で転写され発現 にいたる過程（構造遺伝子の場合)、 が必要になる。あるいは転写制御系に作用す る塩基配列を導入するのであれば、 転写が行われる場にその配列を効率よく機能 させる必要がある。 先に述べたレトロウイルスを利用した方法は、 これらのすべ てのステップが比較的効率よく進む。 他方、 物理的な方法では、 全ての工程で高 い効率を達成しにくいという特徴がある。 これらの過程を効率化することを目的 として、 様々な試みが報告されている。
まず、 細胞内部に導入した遺伝子を核に移行させる過程を改善する方法として 、 核移行シグナル （Nuclei Localization Signal ;NLSとも呼ばれる） の応用が提 案された。 NLSは、核内に輸送されるシグナルの役割を果たす特定のアミノ酸配列 である (G. Garcia-Bustosetal .BiochemBiophysActa, 1071 , 83-101( 1991 ) ) o本来核 に移行しないタンパク質に NLSを付加すると、核内への移行活性が付与されるとい う報告がある (R. E.Lanfordetal .Cell , 46, 575 - 582( 1986 )、 Y. Yonedaetal · ExpCel
lRes， 170,439-452(1987)、 D.Chelskyetal.MolCellBiol, 9, 2487-2492(1989))。 こ の知見に基づき、 NLSを用いて、物理的方法により導入された遺伝子の核内への到 達率を高める研究が進められている。すなわち、 DNAをできるだけ核膜孔に近いサ ィズまで凝集させ、 この凝集物に NLSを付与し、 DNAを積極的に核に移行させる手 法が研究されている。 DNAを小さく凝集させるために、 たとえばポリいリジン （J oseC.PERALESetal.E.J.B.266,255-266(1994)), カチォニックリポソ一ム (J.Zab neretal. J. B.C.270, 18997-19007(1995)) の他、 HMG- 1やヒストンなどのタンパク 質などを用いる研究が行われてきた。
しかしながら、 このような合成化学的アプローチによる方法では、 DNAとの複合 体の溶解性や均一性に問題があったり、 また、塩濃度により DNAの凝集の度合いが 変化するという問題があつた。また DNAを物理的に小さくする技術には限界が有る ため、 導入できる遺伝子の大きさを制限する要因となっていた。 更に、 これら非 ウィルスベクターを利用する方法では、 一般に使用時にプラスミ ドとのコンプレ ックス形成を行う必要が有るので、 利用者がそのまま使える商品形態（ready to use)を採用できない。 これは商業的な供給を考えると大きな障害になる。 また大 腸菌等で増幅したプラスミ ドゃコスミ ドを回収するには、 アルカリ法、 ホットフ ェノール法、 臭化工チジゥム /塩化セシウム超遠心法、 あるいはカラム法といつ た過酷な精製ステップが必要となる。 そのため、 回収された遺伝子が損傷を受け る心配が有った。
この他、 HIVの TATを細胞への物質輸送に応用する技術が報告されている（W094/ 04686)。 この先行技術では、 TATの移送活性を持つセグメントに、 タンパク質や 2 本鎖核酸を結合して細胞への輸送を試みている。ただし 2本鎖 DNAの輸送は、その 発現を目的とするものではなく、 単に転写調節領域の競合的な阻害を目的とする ものである。すなわち、 TATの輸送夕ンパク質としての機能を物質輸送に利用した 報告が有るが、 細胞内における発現を可能とする遺伝子の輸送技術には未だに応 用されていない。
TATの特定領域 LGISYGRKKRRQRRRPPQが細胞への物質輸送に必須の部分であるこ とは公知である（Eric vives et al J. Biol . Chem.272， 16010- 16017( 1997) )。しか し、 遺伝子の移送から発現にいたる過程に、 この領域がどのように関与するのか については未知である。
ところで、 アデノウイルスや SV40ウィルスなど動物に感染するウィルスでは、 キヤプシドタンパク質に NLSが存在しており、 感染の初期において DNAを積極的に 核内へ移行させる働きをしていることが示唆されている （Urs . F . GreberandHarum iKasamatsu. TrendsinCellBiologyvol6, 189-195( 1996) ) o また、 直径 50nmの SV40 粒子が、 核内に粒子のまま進入することも示唆されている （K.HumMeleretal .JVi ol，6，87- 93( 1970 ) )。 さらに、 MS- 2ファージでは、外来の物質をキヤプシドで包む 輸送系が報告されている （特表平 7- 508168)。 しかしウィルスを NLSと組み合わせ て長鎖 DNAの移送をも可能とする技術についての開示はない。
以上のような問題点を解消するため、本出願人は先に NLSを頭部に付与したファ —ジと、 このファージを用いた核への物質移送技術を完成し特許出願している（W 098/6828 ) 0 この技術によれば、 細胞内へ導入された NLSを持つ遺伝子は、 効率よ く核にたどり着き発現する。しかもファージ内部には長鎖 DNAのパッケージングが 可能である。 しかし、 NLSは細胞外において細胞に吸着し、 内部に取り込まれる過 程には関与しない。 したがつてこの先行技術においては、 NLSを与えた遺伝子を細 胞内にマイクロインジヱクシヨンによって導入することで細胞内部へ遺伝子を導 入していた。
一方、細胞表面に遺伝子が吸着し内部に取り込まれる過程を効率化するために、 細胞表面のレセプ夕一に対するリガンドを利用する方法がある。 具体的には、 入 ファージの尾部 （自然の状態では大腸菌表面に吸着する部分） を標的細胞のレセ プ夕一に対応するリガンドで修飾して細胞への吸着効率を向上させる方法が公知 である (W096/21007)。 この方法では、 遺伝子が細胞に取り込まれる過程は効率化 できるが、 その後に続く核への移送効率については改善できない。 同様の試みと
して、尾部を細胞接着性ぺプチドである RGDで修飾したファージが報告されている ( IS Dunn, Biochimie78， 856-861 ; 1996 )。この報告によれば、十分な発現効率は得 られていない。 そこで、 人ファージの頭部をリガンドで修飾するとともに、 尾部 に NLSを与える方法も知られている （W098/5344)。 この方法は、 えファージを頭部 と尾部の 2個所で組み換える必要が有るので製造が困難である。また原理的には、 核移行まで含めた複数の過程の効率化を説明できるが、 現実には期待どおりの効 果を得るにはいくつかの問題点が残る。 すなわち、 人ファ一ジの尾部にある NLS が、 頭部内部にパッケージングされている核に移行させるべき遺伝子に対して十 分に機能できるとは考えにくいのである。
更にアンテナべディァ（antennapedia)と呼ばれる昆虫由来のタンパク質を利用 して、 物質輸送を試みた報告が有る。 アンテナべディアをべクタ一として、 これ に夕ンパク質や DNAを結合させ、細胞外から核への物質移送が可能であることを示 している。 アンテナべディアと他の物質との結合については、 化学的な結合や遺 伝子工学的な手法などが利用可能であるとされている。 しかし、 この報告（Trend s Cel l Biol. Vol .8， 84-87， 1998. Feb. )に基づく物質移送方法では、 移送すべき 物質の大きさが著しく制限される。 たとえば DNAであれば、 55塩基、 タンパク質で あれば 100アミノ酸残基を限界としており、これでは必要な物質を移送するには不 十分である。 アンテナべディアと同様のベクターとして利用できるタンパク質に は、 ラクトフエリン（Nature, 1995 Feb, 373 : 6516, 721-4), ヘルぺスウィルス V P22タンパク質（Cell 88, 223-233， 1997)、 あるいは繊維芽細胞成長因子 2 (Bioes says, 1995 Jan, 17: 1， 39- 44)などが知られている。 しかしいずれのタンパク質 においても、 公知の方法においては限られた大きさの物質の移送しか行うことが できなかった。また、 自己抗体である抗 DNA抗体の可変領域が細胞を透過して核に 至ることは公知である。 そして特定のクローンにおいてではある 、 可変領域の 中で超可変領域である CDR2と CDR3とを連結したぺプチドが、 ハプテンやポリヌク レオチドを核に移送し有効に機能させることが明らかにされている（Proc . Natl . A
cad. Sci . USA， Vol . 95，pp5601- 5606, May， 1998)。この試みにおいては、今までにな く大きな物質の移送が確認されている。 しかしこの方法においても、 lOkbpを越え る大きさの DNAの運搬はコンプレックスの形成に支障をきたす恐れが有るために 依然として困難と考えられる。 そのうえプラスミ ドを使用直前に混合しなければ ならず、また DNAとのコンプレックス形成のための至適条件が限られており濃度の 上昇などに伴って沈殿を生じる可能性がある、 といった非ウィルスベクタ一に共 通の問題点を残していると思われる。 発明の開示
本発明の課題は、 細胞の外から細胞内にある核まで高い効率で物質を到達させ ることができる新規なシステムの提供である。 より具体的には、 ファージを利用 することにより長鎖 DNAであってもパッケージングが可能であり、しかも製造が容 易で細胞への取り込みから核への到達にいたる全過程において、 効率の改善が期 待できる新規な技術の提供が本発明の課題である。
本発明者らは、 HIVの TATが、 NLSと同様の核移行活性とともに細胞吸着活性を併 せ持つことに着目した。 そして TATに代表される 2機能性のタンパク質でファージ の頭部を修飾することにより、 前記課題を解決した。 すなわち本発明は、 以下の ような技術を提供する。
[ 1 ] 頭部の構成成分として、 核移行活性と細胞吸着活性とを併せ持つタンパク 質を含むファージまたはその頭部。
[ 2 ] 核移行活性と細胞吸着活性とを併せ持つタンパク質が、 HIVの TAT、 または その転移活性ドメインである、 [ 1 ] のファージまたはその頭部。
[ 3 ] 転移活性ドメインが配列番号： 1に示すアミノ酸配列を含むぺプチドであ る [ 2 ] のファージまたはその頭部。
[ 4 ] ファージが λファージである、 [ 1 ] のファージまたはその頭部。
[ 5 ] 核移行活性と細胞吸着活性とを併せ持つタンパク質が、 このタンパク質と
ファ一ジ頭部夕ンパク質との融合夕ンパク質である、 [ 1 ]のファ一ジまたはその 頭部。
[6] ファージ頭部タンパク質が、 人ファージ Dタンパク質である [5] のファ —ジまたはその頭部。
[ 7 ] 核移行活性と細胞吸着活性とを併せ持つタンパク質とファージ頭部を形成 するタンパク質との融合タンパク質。
[8]核移行活性と細胞吸着活性とを併せ持つタンパク質が、 配列番号： 1の配 列を含む、 [7] の融合タンパク質。
[9] ファージがえファージである、 [7]の融合タンパク質。
[10] ファージ頭部を形成するタンパク質が、 人ファージ Dタンパク質である
[7]の融合タンパク質。
[11] [7] ~ [10]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする DNA o
[12] [11] の DNAを含むベクタ一。
[13] [12] のベクターを保持する細菌宿主。
[14]大腸菌である [13] の細菌宿主。
[15] (a) [13]または [14]の細菌宿主と、 （b)該細菌宿主が発現する 融合タンパク質に含まれる頭部タンパク質が由来するファージとを含む、 細胞の 形質転換に用いるキット ；ただし、 前記ファージは頭部タンパク質を前記細菌中 で発現できない
[16] ファージが Iファ一ジである [15] のキット。
[17]細菌宿主が発現する融合タンパク質に含まれる頭部タンパク質が、 入フ ァージ Dタンパク質である、 [16] のキット。
[18] (a)核に移行させるべき物質を [1]のファ一ジの頭部にパヅケ一ジン グする工程と、 （b)該ファージまたはその頭部を所望の細胞に接触させる工程と を含む、核に移行させるべき物質を細胞外から所望の細胞の核に移行させる方法。
[19]核に移行させるべき物質が遺伝子である、 [ 18] の方法。
[20]更に付加的に、 （ c )細胞において前記ファージの頭部にパッケージング された'遺伝子を発現させる工程を含む [19] の方法。
[21] ファージが人ファージである、 [18] の方法。
[22] 細胞が哺乳動物細胞である [ 18] の方法。
[23] [ 1]に記載のファージまたはその頭部に、治療に必要な成分をパッケ一 ジングした医薬組成物。
[24] 治療に必要な成分が発現可能な状態で組み込まれた遺伝子であり、 かつ 前記細胞吸着活性は前記遺伝子を発現させるべき細胞に対する吸着活性である [ 23] の医薬組成物。
久ファージのようなバクテリオファージのキヤプシド内には、 ファ一ジ自身の ゲノム （3卜 38X 106 dalton)に相当する大きさの物質をパッケージングすること ができる。 一方、 長鎖 DNAを核へ移行させるためには、 DNAを核膜孔 40nmに近いサ ィズにまでコンパクトに凝集させる必要がある。ファージの頭部に長鎖 D N Aをイン ビトロ （in vitro) でパッケージングすれば、 長鎖 DNAはファージの大きさ （55η m) に収まる。 そのうえ、 キヤプシドの中にパッケージングされた長鎖 DNAは、 細 胞内部に導入後も DNA分解酵素 （DNase) の攻撃から保護される。 またファージと して遺伝子を回収できることから、 精製工程を通じて遺伝子が損傷する危険が小 さくなる。このように入ファージは DNAのキヤリァ一としてたいへん望ましい材料 である。 本発明らは、 このえファージの頭部表面を核移行活性とともに細胞吸着 活性を併せ持つタンパク質で修飾することにより、 細胞外から核にいたる物質移 送の全行程について効率の改善が実現できることを明らかにし、 本発明を完成し た。
本発明を構成する基本的な操作は、本出願人による先の出願 W098/6828にも開示 されている。すなわち、先の出願 W098/6828において頭部の修飾タンパク質に利用 した NLSを、核移行活性とともに細胞吸着活性を併せ持つタンパク質とすることで
、 本発明を実施することができる。 その工程を具体的に述べれば、 およそ以下の ように説明できる。
本発明の新規な特徴である核移行活性とともに細胞吸着活性を併せ持つタンパ ク質を組み込んだ人ファージの頭部を構成する融合タンパク質は、 適当な発現べ クタ一によつて大腸菌で発現される。 このときホストとなる大腸菌に、 頭部の形 成能の無い変異 λファージ （以下、 単に 「Dアンバ一ファージ」 と称する） を溶原 化させておく。発現べクタ一を基に組み換えタンパク質として発現された頭部は、 Dアンバーファージの頭部として再構成される。 Dアンバーファージのゲノムに移 送すべき遺伝子を、 標的細胞内において発現可能な形で組み込んでおけば、 この ゲノムをパッケージングした形で本発明によるファージを得ることができる。 一 連の操作については、本出願人による先の特許出願 W098/6828等でも詳細に記載さ れている。
この先行技術においては、 Dアンバーファージの構築を ADaml5に基づいて進め ている。この他に Dアンバーファ一ジの材料としては、例えば ATCC 35132として分 譲されている溶原化大腸菌 BHB2690( ADaml5 b2 red3 i廳 434c lts Sam7)を利用す ることもできる。この大腸菌が保有する Dアンバ一ファージを回収し、 人 Daml5の、 Left Arm 17050bp、 および Middle fragment 1510bpに相当する遺伝子を得ること が可能である。
こうして得られたファージは、 頭部の表面に核移行活性とともに細胞吸着活性 を併せ持つタンパク質を発現しており、 しかもキヤプシド内部には標的細胞の核 内へ移送すべき遺伝子を抱えた状態にある。 本発明のファージを細胞に接触させ ると、 ファージはまず細胞吸着活性によって細胞に取り込まれ、 続いて核移行活 性に基づく核への移送がはじまる。 ファ一ジの頭部はおよそ 55nmで、 核膜孔を通 つて核内に MAを送達していると考えられている SV40ウィルス粒子（50nm)に類似 している。 本発明によれば、 他の製剤と組み合わせること無く、 細胞外から核ま での物質の移送が効率良く行われ、 インビボへの適用も容易である。 このような
機序から明らかなように、 本発明によるファージは頭部のみで細胞への夕ーゲテ イングと移送すべき物質のパッケージングを実現している。 したがって、 自然の 状態で'宿主への付着を担っている尾部の部分の構造は、 本発明においては必須で はない。 以下に、 本発明のより具体的な実施の形態を述べる。
本発明は、核移行活性と細胞吸着活性を併せ持つ 2機能性の夕ンパク質（以下、 単に 2機能性タンパク質と省略することもある）が付加したファージ頭部で外来物 をパッケージングし、該ファ一ジを、外来物を機能させたい所望の細胞に導入し、 ファージ粒子ごと外来物を標的細胞の核へ移行させる技術に関する。
本発明に用いられる核移行活性と細胞吸着活性を併せ持つタンパク質としては、 標的細胞への吸着とその細胞内における核への移送を助けるタンパク質であれば 特に限定されない。 たとえば λファージ粒子を核へ移行させる場合、 HIVの ΤΑΤは 望ましい 2機能性タンパク質である。 この他に前記 2機能性タンパク質としては、 抗 DNA抗体の可変領域、 ドウロソフィラ由来のアンテナぺディァ、 ラクトフエリン 、 ヘルぺスウィルス VP22プロテイン、 ポリオ一マウィルス VP1プロテイン、 ポリオ —マウィルス VP 2プロテイン、 ポリオ一マウィルス VP 3プロテイン、 アデノ随伴 ゥィルス Capプロティン、および繊維芽細胞成長因子 2などを挙げることもできる 。 TATの場合は、 配列番号： 1に示した配列が前記 2つの機能を支える活性ドメイ ンであることが公知である（Eric vives et al J. Biol . Chem.272 , 16010-16017( 1 997) )。本発明において、 前記 2つの機能、 すなわち核移行活性と細胞吸着活性の 発現に必要な領域、 あるいはこの必須領域を部分べプチドとして含む領域を転移 活性ドメインと呼ぶ。 したがって、 本発明における 2機能性タンパク質として TA Tを用いるときには、少なくとも配列番号： 1に示すような配列を含むように設計 するのが望ましい。
その他のタンパク質、 すなわち抗 DNA抗体の可変領域、 ラクトフエリン（Nature, 1995 Feb, 373 : 6516, 721-4)、 ヘルぺスウィルス VP22タンパク質（Cell 88， 223 -233， 1997)、ポリオ一マウィルス VP1プロティン、ポリオ一マウィルス VP 2プロテ
イン、 ポリオ一マウィルス VP 3プロテイン、 アデノ随伴ウィルス Capプロテイン、 あるいは繊維芽細胞成長因子 2 ( Bioessays, 1995 Jan, 17: 1 , 39- 44)等について も、 転移活性（translocation activity)を持つドメインを特定し、 その部分のみ を使ってファージを修飾すれば本発明に応用することができる。 たとえば、 アン テナべディァはドウロソフィラ（Drosophila)の分化に関与するタンパク質である c このタンパク質においては、 ホメォドメインの 43- 58位（ヘリヅクス 3に対応）の アミノ酸配列（RQIKIWFQNRRMKWKK)に相当するペプチド （配列番号： 4 ) が、 転移 活性を持つ領域として同定されている。 したがって、 少なくともこの配列を含む タンパク質は、 本発明の 2機能性タンパク質として利用することができる。 また 抗 DNA抗体の可変領域においては、超可変領域 CDR2+CDR3に相当するアミノ酸配列（ VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA)が物質移送活性を支えていると報告している。 このアミノ酸配列を含むタンパク質も本発明における 2機能性タンパク質として 応用できる。
また、 本発明に用いられるファージとしては、 その頭部に外来物をパッケージ ングすることが可能であれば、 特に制限はなく、 えファージ、 M13ファージなどを 用いることが可能である。 更に、 PI phage, P22 phage, Tl phage, T2 phage, T 3 phage^ T4 phage、 T5 phage s T6 phageヽ T7 phage、 P2 phage、 P4 phage、 Mu phage, Pm2 phageヽ N4 phage、 SPOl phage、 PBSl phage, あるいは PBS2 phage等 も、 本発明におけるキヤリア一として利用することができる。
核移行活性と細胞吸着活性を併せ持つタンパク質を頭部の構成成分としたファ ージを調製する方法としては、 種々の方法を挙げることができる。 本発明におけ るファージの調製方法として望ましい態様は、遺伝子組み換え技術の応用である。 すなわち、 該核移行活性と細胞吸着活性を併せ持つタンパク質をコ一ドする DNA とファージ頭部タンパク質をコードする遺伝子を結合させてベクタ一に組み込み、 細菌宿主内で融合タンパク質として発現させ、 さらに該頭部タンパク質を発現で きない変異ファージを該宿主中で増殖させてファージ頭部を形成させる方法を挙
げられる。 このシステムでは、 パッケージングしたい遺伝子をファージの遺伝子 に組み込むことで任意の遺伝子を容易にパッケージングすることができる。 ファ 一ジを利用したことにより、 組み込むベき遺伝子はファージ粒子として回収され ることになる。 ファージ粒子は、 遠心分離によって大腸菌から回収することがで きる。 ファージの回収には過酷な精製ステップが求められないので、 遺伝子を傷 つける可能性が小さい。
更に本発明においては、 前記細菌宿主と、 任意の遺伝子を挿入するためのクロ —ニングサイ トを備えたファージベクターとを組み合わせて、 外来遺伝子をファ —ジにパッケージングするためのキットとすることができる。 ここで用いられる ファージ頭部タンパク質としては、 特に制限はなく、 たとえば、 ファ一ジがえフ ァ一ジであれば、 gpDタンパク質及び gpEタンパク質が挙げられ、 またファ一ジが M 13であれば、 gene 3 proteinが挙げられる。
他方この態様に用いられるベクター （ファージ頭部を構成する融合タンパク質 を発現する） としては、 特に制限はなく、 種々のべクタ一が用いられる。 また、 細菌宿主としては、 用いるファージが増殖可能であれば特に限定されないが、 た とえば、 λファージを用いる場合には、 該ファ一ジが増殖可能な種々の大腸菌株 が挙げられる。 なお、 核移行活性と細胞吸着活性を併せ持つタンパク質のァミノ 酸配列をコ一ドする DNAと、ファージ頭部タンパク質をコードする遺伝子との結合 には、 直結している場合のみならず、 間にスぺ一サ一ヌクレオチドが挟まれてい る場合も含まれる。
本発明においては、 遺伝子工学的な手法の他、 前記 2機能性タンパク質をファ ージ頭部のタンパク質に化学的に結合させる方法も採用することができる。 本発 明における 2機能性タンパク質とファージ頭部のタンパク質との化学的な結合に は、 該配列とタンパク質とが直結している場合のみならず、 間に架橋剤やスぺ一 サ一ぺプチドなどが挟まれている場合も含まれる。
本発明におけるファ一ジは外来物をパッケージングした上で、 細胞に導入され
るが、 このパッケージングの方法としては、 石浦らの方法 （Gene，82, 28卜 289( 19 89 ) ) ゃスターンベルグ （Sternberg) らの方法 （公表昭 59- 500042) などが挙げら れる。 また外来物としては、 遺伝子、 遺伝子断片、 リボザィム、 アンチセンス遺 伝子、 その他核で機能させたい所望の物質が挙げられる。 たとえば、 遺伝子治療 を行う場合には、 欠陥遺伝子に対応する正常な遺伝子などを用いることが有効で あり、 また、 特定の遺伝子の機能を解析する場合には、 該遺伝子に対するアンチ センス遺伝子などを用いることが有効である。 さらに、 トランスジヱニック動物 を作出する場合には、 与えたい形質に関与する遺伝子を導入することが有効であ る o
なお、 本発明によれば、 上流域も含めた形の遺伝子など、 長鎖の核酸をパッケ 一ジングすることが可能である。ファージをキヤリァに用いた本発明においては、 たとえば 50kbに及ぶ大きな遺伝子のパッケ一ジングが可能である。 具体的には、 動物ウィルス由来の全ゲノム配列や、 あるいは一連の機能を支える複数の遺伝子 をまとめて組み込むこともできる。 また、 コスミ ドベクタ一のパッケージングも 可能なことから、ジストロフィンの cDNA( 13.8kb )等の大きな DNAへも本発明を応用 することができる。このような長鎖 DNAを核へ効率的に移送可能な大きさに凝集さ せることができるのは、 ファージを利用しているからに他ならない。
本発明に基づいて外来物をパッケージングしたファージをインビボに投与した 場合、 なんら物理的な手法の助けを借りること無く生体内において細胞への移送 が達成される。 すなわち、 移送先である細胞に本発明のファージを接触させるこ とにより、 移送が達成され得る。 ここでファージと細胞との接触とは、 細胞への 物質移送を目的とする人為的で物理的な処理を加えること無く、 細胞を一定の時 間ファージとともにィンキュベー卜することを意味する。 NLSのみで修飾したとき には細胞への移送機能が期待できず、 マイクロインジヱクション法等の物理的な 手法を利用したのと対照的である。 この特徴に基づいて、 本発明によるファージ
(またはその頭部） は、 インビボゃェクスビボへの適用を目的とする医薬組成物
への応用が可能である。 たとえば、 細胞殺傷活性を持つアデノウイルス （ゲノム 全長は約 36kb) のようなウィルスのゲノムをそのまま本発明のファ一ジによって がん細胞に送り込み、 がん細胞内で発現させるといつた新たな取り組みが可能と なる。 また、 免疫機能を活性化する働きを持った複数のリンホカインを同じ細胞 で発現させるといったアプローチへも本発明を応用することができる。 たとえば 適当なプロモ一夕一の下流に、 イン夕一ロイキン 2、 イン夕一ロイキン 6、 ある いは顆粒球コロニー刺激因子等のリンホカインをコ一ドする遺伝子を作動可能な 形で連結し、 これを本発明のファージにパッケージングしたものを調製する。 得 られるファージをリンパ球等に接触させて生体内に戻せば（ェクスビボ）、免疫機 能を増強する複数のリンホカイン産生細胞を体内に誘導できることになる。
ヒ卜の場合には、 ファージに対する抗体を持つケースは少ないと想定されるの で、 投与されたファージはすぐに排除されること無く体内にとどまり、 標的細胞 に吸着し取り込まれる。 この特徴により、 前記アデノウイルスをパッケージング する態様では、 アデノウイルスの抗原性をマスクした状態で標的細胞内部に送り 届けることができることになる。 本発明のファージに遺伝子をパッケ一ジングし たときには、 その遺伝子が吸着した細胞の核へと移送され、 高い効率で発現に導 かれる。インビボへの適用方法については、標的となる臓器に直接注入する方法、 標的臓器に血液を供給する血管に投与後に必要に応じて血流を制限して本発明に よるファージを一定時間臓器内部の血管で高濃度に維持する方法等を採用するこ とができる。
本発明のファージをインビボ投与する場合、 ファージ濃度として 1011014PFU/m 1程度となるように調製するのが一般的である。この範囲を大きく下回る濃度では ファージのカ価が不十分となる可能性が大きく、 逆にこの範囲を超える濃度では 一般的にファージの沈殿等の問題を生じ易くなる。 しかしこの数値範囲は限定的 に解釈すべきではなく、 たとえば極めて感染効率に優れた標的細胞/ファージの 組み合わせであったり、 あるいはごくわずかなファージの導入で十分な効果を期
待できるケースでは、 更に低濃度であっても実用に耐える場合もありえる。 より 具体的には、 用いるファージと標的細胞との間で感染効率が変化することも予想 されるため、 予備的な実験に基づいて予想される MOI(multiplicity of infectio n)から、 もっとも効果的な濃度を設定するようにする。 また投与方法によって適 用可能な液量も制限されることから、 これらの諸条件を考慮して総合的にファー ジ濃度と投与液量を決定する。 たとえばヒトの臓器への直接投与では、 肝臓のよ うな大きな臓器であっても一般的には 100ml程度が注入の限界といわれている。 本発明によるファージは、 ィンビボ投与を目的とした医薬組成物として商業的 に供給することができる。 本発明に基づく医薬組成物は、 生体にとって許容性の 適当な緩衝液に本発明のファ一ジを必要濃度で添加することにより得ることがで きる。 利用可能な分散媒としては、 液状の場合には SM(10mM Tris-HCl (pH7.4) , 10mM MgS04 , 0.1M NaCl, 0.01% gelatin)が、 また凍結させるのであれば 3XD Me diumや LB+15%グリセロールなどを用いるのが一般的である （Hendrix,R. , Lambd all, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983)。 本発明の医薬組成物は、 溶液状、 あるいは凍結状態で流通させることができるが、 望ましくは低温 （たとえば 4 °C ) で流通させる。 この医薬組成物には、 ファージを安定化するために、 グリセ口 —ル、 血清アルブミン、 ゼラチン、 あるいはブトレツシン等の成分を補助的に含 んでいても良い。 またインビボでの投与操作を助けることを目的として、 蛍光色 素や各種造影剤を混合しておくことも可能である。 X線造影剤や MRI造影剤を添加 しておけば、 臓器への注入状況を視覚的に捉えることができるので便利である。 外来物をパッケージングしたファージが導入される細胞（標的細胞） としては、 特に制限はなく、 目的に応じて様々な細胞が用いられる。 ただし本発明において は、 核移行活性のみならず細胞に対して吸着活性を示すタンパク質でファージを 修飾することから、 標的細胞と前記 2機能性タンパク質の組み合わせが重要な要 素となる。 すなわち、 本発明においてファージの修飾に用いられる 2機能性タン パク質の細胞吸着活性は、 少なくとも標的細胞に向けられていることが必須条件
となる。 ヒ トの細胞を標的とするとき、 HIVの TATは好適な 2機能性タンパク質で ある。 また本発明のファージを適用する部位には、 特定の臓器のみならず、 腫瘍 や動脈硬化巣等の病巣を選択することも可能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 HIV- TAT- gpD融合夕ンパク質の構造を示す模式図。
図 2は、 マーカ一遺伝子を組み込んだ TATぺプチド提示えファージの構築過程。 図 3は、 トランスフヱクシヨンのための一連の操作を示す模式図。
図 4は、 本発明によるファージで処理した HeLa細胞の顕微鏡写真 （導入後 48時 間）。 上が位相差顕微鏡写真 （明視野)、 下が同じ標本の蛍光顕微鏡写真。
図 5は、 野生型ファージで処理した HeLa細胞 （コントロール） の顕微鏡写真 （ 導入後 48時間）。 上が位相差顕微鏡写真 （明視野)、 下が同じ標本の蛍光顕微鏡写 図 6は、 ルシフェラ一ゼ遺伝子を組み込んだ本発明によるファージのトランス フエクシヨンの結果。縦軸はルシフェラ一ゼ活性（RLU/〃g protein/sec)を、横軸 は細胞に接触させたファージを示す。
図 7は、本発明の TAT人ファ一ジ粒子によって細胞に導入したルシフヱラーゼ遺 伝子の発現における血清の影響。 縦軸はルシフヱラ一ゼ活性（RLU/〃g protein/s ec)を、 横軸はファージ接触時の血清の有無を示す。
図 8は、本発明の TAT人ファージ粒子によつて細胞に導入したルシフエラーゼ遺 伝子の発現における接触時間の影響。 縦軸はルシフェラ一ゼ活性 (R I/ gprotei n/sec )を、 横軸は細胞と各ファージとの接触時間を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に限定 されるものではない。
[実施例 1 ] TATぺプチド -gpD融合蛋白発現ベクターの構築 野生型の人ファージ遺伝子を錡型として、 PCR法により、 λファージ頭部を構成 するタンパク質め 1つである gpDタンパク質の cDNAをクロ一エングした。具体的に は、 本出願人による先の特許出願 W098/6828に開示された方法に従い、 「pTrcHisA -gpDj と称するベクターを構築した。サイクルシークェンス法により、 DNA配列を 確認した後、 該ベクターを大腸菌 T0P10 (Seth G.N. Grant et al . PNAS 87, 4645- 4649( 1990) ) に導入し、 大腸菌内で gpDタンパク質を高発現させた。該タンパク質 の発現を SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法（SDS- PAGE) により検出した。 こ の結果、 ImMの IPTGで誘導後 6時間目に該タンパク質の分子量である 11.6kdaの位置 に強いバンドが検出された。
次に、 TATぺプチドと gpDの融合タンパク質を大腸菌内で発現させた。 TATぺプチ ドとしては、 そのペプチドだけで細胞膜を通過し、 核内まで到達することが知ら れている 43- 60番目のアミノ酸配列に相当する LGISYGMKRRQRRRPPQ(Eric vives e t al J. Biol .Chem.272，16010-16017( 1997) )を用いた （図 1、 および配列番号： Do そして、 この配列に対応するオリゴ DNAを合成し、 上記の 「pTrcHisA-gpD」 の Nco I部位に導入し pTrc- TAT- gpDを構築した。 サイクルシークェンス法により、 プラスミ ドが正確に構築されていることを確認した後、 該ベクタ一を大腸菌 T0P1 0に導入し、 大腸菌内で NLSと gpDタンパク質との融合タンパク質を高発現させた。 該タンパク質の発現を SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法（SDS-PAGE)により 検出した。 この結果、 ImMの IPTGで誘導後 6時間目に目的のタンパク質の分子量の 位置に強いバンドが検出された。
[実施例 2 ] マーカー遺伝子を組み込んだ TATぺプチド提示 λファージの構築 大腸菌 T0P10 (人 D1180- CMV-EGFP) を、 図 2に示すスキームにしたがって構築し た。
まず、 人 gtllの D遺伝子にアンバー変異を導入した。 具体的には、 え gtll (Str atagene社製） を Kpnl切断し得られた Right Arm 25410bpと； lDaml5 (京都大学、 井
ロ八郎氏より供与） を Kpnl切断して得られる Left Arm 17050bp, および Middle f ragment 1510bpの三者を連結させ、 Gigapackl l l gold packagin extract (Strat agene社製） にてパッケージングし、 大腸菌 Y1088に感染させプラークを形成させ た。 各プラークのファージを大腸菌 C600(supE) (stratagene社製） と TOP10(supO ) ( In vitrogen社製） に再感染させ、 前者でファージが構築でき、 後者でできな かったものをえ Daml5- gtllとした。 これは、 C600(supE)は、 Dajnl5を相補するが、 TOPlO(supO)では、相補できないため、菌体内でパッケージングできない原理に基 づいている。
次に、 え Daml5- gtllより 80%ゲノムサイズのえ D1180を構築した。 具体的には、 入 Daml5- gtllを EcoRIと Saclで切断し、 Left Arm 19600bpと Right Arm 13110bpを 調製した。 両者を EcoRI-SacIリンカ一 5，-MTTCGGCGGCCGCGAGCT - 3， / 5' -CGCGGCC GCCG- 3'で連結し、全長 38010bpのえ D1180を構築した。動物細胞で遺伝子発現する ュニットである CMV- EGFP-SV40polyA ( 1600bp) は、 PCR法によって調製した。具体 的には、 5' -GGGCGTGAATTCTAGTTATTAATAGTAA-3' (配列番号： 2、 5，側の 7 〜12番 目の配列に EcoRI部位が存在する） と 5，- GGGCGGMTTCCGCTTACAATTTACGCCTTAAG - 3， (配列番号： 3、 5'側の？〜 12番目の配列に EcoiU部位が存在する） をプライマ一 として、 pEGFP-Nl (Clontech社製）を錡型として用いた。 PCRは、 35ngの錶型、 l x T hermoPol buffer (New England Biolabs社、 lOmM KC1、 2mM MgS04 3 10mM(NH4 ) 2 S 04， 20mM Tris-HCl(pH8.8) , 0. 1¾Triton X-100)、 のプライマ一、 500nM d
NTP、 2U Vent DM polymerase (New England Biolabs社製) を用い全量を 50 l とし、 94°Cで 5分の熱変性の後、 「94°Cで 30秒の熱変性、 50°Cで 1分のァニ一リング 、 72°Cで 2分の伸長反応」のサイクルを 25サイクルを行った。 こうして増幅された DNA断片を、 EcoRIで切断して AD1180の EcoRIサイ トに導入し、 入 D1180- CMV-EGFP を構築した。 さらに本ファージを大腸菌 T0P10に溶原化させ T0P10 (人 D1180- CMV- EGFP) を構築した。本ファージは、 Dアンバー変異を有するため、 supOの本宿主に おいては gpDが発現せず、 通常 gpE (えファ一ジ頭部タンパク質には、 gpDと gpEの
2種類がある）のみで頭部が形成される。 この gpE単独ファージは、 EDTAに対して 極めて感受性が高い。 また、 該ファージ上にコードされ該ファージのリブレッサ 一である dは、 温度感受性となっており、 42°C15分の処理で、 リブレッサーが解 除され、 ファージが溶菌可能となる。 一方、 この大腸菌に、 TAT-D融合タンパク質 を発現させ、 熱誘発により出現したファージに該融合タンパク質が組み込まれれ ば、 EDTA抵抗性を示すものと考えられる。 そこで、 4mlのスケールでファージを調 製し、 lOmM EDTAで処理後、 大腸菌 LE392に感染させ、 その力価を測定した。 その 結果、 実施例 1で用いた TAT- Dの場合、 EDTA抵抗性が確認された。構造が安定化し ていることが示唆された （表 1)。
【表 1】
頭部のタンパク質を組み換えた人ファージのカ価 力価 （PFU/ml )
発現タンパク質 (大腸菌 LE392を用いて解析）
EDTA (-) EDTA ( + )
4.0 109 1.0 X 103
gpD 8.6 X 108 6.8 X 108
HIV-TAT-gpD融合タンパク質 1.0 X 108 1.0 X 108
[実施例 3 ] TATぺプチド提示えファージのトランスフエクシヨン
( l )TATぺプチド提示えファージ粒子の調製
トランスフエクシヨンのための一連の操作は図 3に示した。 プラスミ ド pTrc-TA T - gpDを導入した大腸菌 TOP 10 ( AD1180-CMV-EGFP) を 10mM Mgを含む LB培地中で 3
2°Cにて培養し、 対数増殖期 （2 x l08cel ls/ml) に入ったものを 42°Cで 15分間振と うしてファージの生成を誘発した。 次いで、 0.5mM IPTGにて融合蛋白の発現を誘 導し、 38°Cで 2時間 30分振とう後、 5000rpmで 10分間遠心して沈殿した大腸菌を、 S M緩衝液 (0.1M NaCl, 8mM MgS04 5 50mM Tris-HCl(pH7.5 )) に懸濁した。 濃縮し た菌を、 37°Cクロ口ホルムを加えて攪拌し溶菌させた。 さらに、 DNAseを加えた後 、 8000rpmで 30分間遠心して不溶物を除き、上清を 23000rpmで 60分間遠心してファ —ジを沈殿させ、 SM緩衝液に懸濁した。 回収したファージ粒子を塩化セシウムの 密度勾配遠心法を用いて精製した。 SM緩衝液にて懸濁し、 TATぺプチド提示えファ —ジ l x lOnpFU/mlを調製した。
(2) トランスフヱクシヨンおよび遺伝子発現の検出
HeLa細胞（10%ゥシ胎児血清含有 MEM培地 /GIBC0-BRL社製)、 C0S-7細胞（10%ゥシ 胎児血清含有 DMEM培地/ GIBCO- BRL社製)、 および NIH3T3細胞 （10%新生子ゥシ血清 含有 DMEM/GIBC0- BRL社製）を培養し、 1 x 105cells/chamber(Falcon Culture Slid e 4101 )の濃度にまいた （50%コンフルエンシー）。 翌日 TATペプチド提示えファ一 ジ l x lOnpFU/mlを 10 d/chajnber添加し、 M0I=10000とし、 48時間培養した。 EGFP の遺伝子発現の検出は、 蛍光顕微鏡にておこなった。 本発明によるファ一ジで処 理した細胞の顕微鏡写真を図 4に、コントロールとして用意した野生型ファージを 与えたものは図 5に示した。本発明によるファージを接触させた細胞のうち、遺伝 子発現細胞は約 10%であった （図 4)。 COS- 7、 並びに NIH3T3細胞においてもほぼ同 様の結果を得た。 血清存在下、 非存在下、 それぞれ 5時間接触により培地交換し、 48時間培養したが、 発現効率に差は認められなかった。
[実施例 4 ] ルシフエラーゼ遺伝子への応用
( 1 )ルシフェラ一ゼ遺伝子を挿入した； ID1180- CMV- lucの構築
実施例 3で発現を確認した EGFPに換えて、ルシフェラーゼ遺伝子を挿入したえ D 1180- CMV- lucを構築した。 具体的には、 pGL3- Basic (Promega社製) の Hind I I I と Xbalサイ トを切断し、 ホタルつレシフヱラ一ゼの cDNA遺伝子断片をとりだし平
滑化した。 pCMV- ? (Clontech社製） を Notl で切断し平滑化したところに、 この断 片をライゲ一シヨンにより導入し、 pCMV_lucを構築した。 続いて、 pCMV-lucを Sa IIと EcoRIにより切断し、 CMV- luc-SV40polyAの遺伝子発現ュニッ トをとりだし、 平滑化し、 pCR Blunt ( In vitrogen社製） にライゲーシヨンし pCR- CMV-luc を構 築した。 pCR- CMV-lucを EcoRIにより切断して人 D1180の EcoRIサイ 卜に導入し、 入 D 1180- CMV- lucを構築した。 さらに本ファージを大腸菌 T0P10に溶原化させ T0P10 ( AD1180-CMV-luc) を構築した。 ここでファージに組み込んだ外来遺伝子は約 210 Obpであり、 ゲノム全体では約 82.7%ゲノムサイズとなっている。
また比較を目的として、 同じ発現ュニヅトを含む T0P10 (人 D1180- CMV- luc)を公 知の SV40ラージ T抗原 NLS提示えファージ （国際公開 W098/06828) に組み合わせた もの、 ならびに大腸菌 LE392(supE，supF)に感染させて野生型ファージに組み合わ せたものも調製しておいた。
(2)ルシフヱラ一ゼ遺伝子の発現
COS- 7細胞を 10% ゥシ胎児血清を含む DMEM (GIBCO- BRL社製）で培養し、 2 x l04c ells/well (Corning 24well Culture plate 25820)の濃度でまいた (50%コンフル エンシー）。 その翌日、 TATペプチド提示えファージ、 SV40ラージ T抗原 NLS提示久 ファ一ジ、 および野性型えファージ l x l01(1PFU/mlをそれぞれ 10〃l/well添加し （ M01=10000)、 48時間培養した。 ルシフェラ一ゼの遺伝子発現の検出は、 lucifera se assay system (ピツカジーン社製） およびルミノメ一夕一（AutoLumat LB953 Berthold社） を用いて測定した。 活性は relative light unit (腳） g protei n/secとして表わした。実験は 3連で行い、結果を図 6に示した。 TATペプチド提示 λファージでのみ、 ルシフェラ一ゼの遺伝子発現がみられた。 これに対して SV40 ラージ Τ抗原 NLS提示人ファージ、 並びに野性型 Iファージでは、 全くルシフェラ ーゼ活性が確認できなかった。
また、血清存在下/非存在下でそれぞれのファージと 5時間接触後、培地交換に よりファージを除いてから 48時間培養したところ、 血清存在下でファージを接触
させた方で、 やや高い発現が得られた （図 7)。 更に、 接触時間についても検討し た。 すなわち 37°Cで 0.5時間および 5時間、 COS- 7細胞とファージを 10% ゥシ胎児 血清存在下で接触させたところ、 0.5時間という短い接触時間においても遺伝子発 現を得られることを確認した （図 8)。 産業上の利用の可倉 生
本発明は、 巨大分子をパッケージングでき、 しかも自身が細胞に吸着し、 更に 細胞膜を通過して核へ移行し得るファ一ジを提供する。 本発明では、 ファージに 対して細胞吸着活性と核移行の機能を同時に与えられる。 本発明によって提供さ れるファージは物理的な助け無しに細胞内部へ外来物質を移送しうることから、 インビボでの安全な投与を可能とする。 本発明によるファージは血清存在下の方 がむしろ効率良く細胞への物質移送、 ならびに遺伝子の場合にはその発現をもた らすことから、 インビボへの適用に際し、 より望ましい特徴を備えているという ことができる。 血清存在下ではほとんど細胞への物質移送が不可能な、 公知の化 学的なアブローチと比べると対照的な特徴である。 加えて本発明によるファージ は、わずか 37°C0.5時間という短い時間で一定の水準の遺伝子の移送と発現を可能 としている。 このことは、 遺伝子治療を短時間で効率良く進めうる可能性を示し ている。
しかも本発明によるファ一ジは遺伝子組み換えのような当業者にとって容易な 手法で効率よく製造することができ、 産業上の有用性も高い。 また 2機能性タン パク質を採用した本発明においては、 1種類のタンパク質を導入するのみなので、 ファージ自身の構造的な変化が少なく、 高力価を実現している。 更に、 本発明の 望ましい態様においては、 外来物としてパッケージングした遺伝子が標的細胞内 で着実に発現することから、 遺伝子治療に確実性と安全性の面で新しい道を開く ものと期待できる。
本発明では巨大分子をパッケージングできることから、 たとえば所望の外来遺伝
子をその上流域も含んだ長鎖 DNAとして、核へ到達させることが可能となる。本発 明は、 生命現象の解明や遺伝子治療など様々な分野において有効利用が期待され る。
Claims
1. 頭部の構成成分として、 核移行活性と細胞吸着活性とを併せ持- 質を含むファージまたはその頭部。
2. 核移行活性と細胞吸着活性とを併せ持つタンパク質が、 HIVの TAT、 または その転移活性ドメインである、 請求項 1のファージまたはその頭部。
3. 転移活性ドメインが配列番号： iに示すァミノ酸配列を含むぺプチドであ る請求項 2のファージまたはその頭部。
4. ファージがえファージである、 請求項 1のファ一ジまたはその頭部。
5. 核移行活性と細胞吸着活性とを併せ持つタンパク質が、 このタンパク質と ファージ頭部タンパク質との融合タンパク質である、 請求項 1のファージまたは その頭部。
6. ファ一ジ頭部タンパク質が、 人ファージ Dタンパク質である請求項 5のフ ァ一ジまたはその頭部。
7. 核移行活性と細胞吸着活性とを併せ持つタンパク質とファージ頭部を形成 するタンパク質との融合タンパク質。
8. 核移行活性と細胞吸着活性とを併せ持つタンパク質が、 配列番号： 1の配 列を含む、 請求項 7の融合タンパク質。
9. ファージが λファ一ジである、 請求項 7の融合タンパク質。
10. ファ一ジ頭部を形成するタンパク質が、 えファージ Dタンパク質である 請求項 7の融合タンパク質。
11. 請求項？〜 10のいずれかに記載の融合タンパク質をコ一ドする DNA。
12. 請求項 11の DNAを含むベクター。
13. 請求項 12のべクタ一を保持する細菌宿主。
14. 大腸菌である請求項 13の細菌宿主。
15. (a)請求項 13または 14の細菌宿主と、 （ b )該細菌宿主が発現する
融合タンパク質に含まれる頭部タンパク質が由来するファージとを含む、 細胞の 形質転換に用いるキッ ト ；ただし、 前記ファージは頭部タンパク質を前記細菌中 で発現できない
16. ファ一ジがえファージである請求項 15のキッ ト。
17. 細菌宿主が発現する融合タンパク質に含まれる頭部タンパク質が、 人フ ァ一ジ Dタンパク質である、 請求項 16のキット。
18. (a) 核に移行させるべき物質を請求項 1のファージの頭部にパッケ一 ジングする工程と、 （b)該ファージまたはその頭部を所望の細胞に接触させるェ 程とを含む、 核に移行させるべき物質を細胞外から所望の細胞の核に移行させる 方法。
19. 核に移行させるべき物質が遺伝子である、 請求項 18の方法。
20. 更に付加的に、 （c)細胞において前記ファージの頭部にパッケージング された遺伝子を発現させる工程を含む請求項 19の方法
21. ファ一ジが人ファージである、 請求項 18の方法。
22. 細胞が哺乳動物細胞である請求項 18の方法。
23. 請求項 1に記載のファージまたはその頭部に、 治療に必要な成分をパッ ケージングした医薬組成物。
24. 治療に必要な成分が発現可能な状態で組み込まれた遺伝子であり、 かつ 前記細胞吸着活性は前記遺伝子を発現させるべき細胞に対する吸着活性である請 求項 23の医薬組成物。
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