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WO1999001160A1 - Saccharid-konjugate, diese enthaltende pharmazeutische mittel, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Saccharid-konjugate, diese enthaltende pharmazeutische mittel, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung Download PDF

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Publication number
WO1999001160A1
WO1999001160A1 PCT/EP1998/003142 EP9803142W WO9901160A1 WO 1999001160 A1 WO1999001160 A1 WO 1999001160A1 EP 9803142 W EP9803142 W EP 9803142W WO 9901160 A1 WO9901160 A1 WO 9901160A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mmol
title compound
conjugate
amide
coor
Prior art date
Application number
PCT/EP1998/003142
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Mareski
Johannes Platzek
Bernd Radüchel
Dietmar Berndorff
Hanns-Joachim Weinmann
Original Assignee
Schering Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Aktiengesellschaft filed Critical Schering Aktiengesellschaft
Priority to AU82109/98A priority Critical patent/AU8210998A/en
Publication of WO1999001160A1 publication Critical patent/WO1999001160A1/de

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/12—Macromolecular compounds
    • A61K49/124—Macromolecular compounds dendrimers, dendrons, hyperbranched compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/146—Peptides, e.g. proteins the peptide being a polyamino acid, e.g. poly-lysine

Definitions

  • the invention relates to the subject matter characterized in the claims, that is to say conjugates consisting of an amino group-containing polymer, metal ion (s) containing signaling group (s) and mono- or oligosaccharides and optionally cations of inorganic and / or organic bases, amino acids or amino acid amides, pharmaceutical compositions containing these compounds, their use in diagnostics and methods for producing these compounds and compositions.
  • conjugates consisting of an amino group-containing polymer, metal ion (s) containing signaling group (s) and mono- or oligosaccharides and optionally cations of inorganic and / or organic bases, amino acids or amino acid amides, pharmaceutical compositions containing these compounds, their use in diagnostics and methods for producing these compounds and compositions.
  • Lymph node metastases are found in approx. 50-70% of patients with malignant tumors (Elke, M. lymph node diseases. In: W. Frommhold, H.- S. Stender and P. Thurn (eds.), Radiological diagnostics in clinic and practice, 7th edition, Vol. IV, pp. 475-512, Stuttgart-New York: Georg Thieme Verlag, 1984).
  • the involvement of lymph nodes in a malignant disease has a significant influence on the therapeutic measures to be initiated. The earliest and most accurate diagnosis of lymph node involvement is therefore of the utmost importance for the patient.
  • Contrast-assisted lymphography has so far provided only unsatisfactory results in medical practice.
  • X-ray examinations with iodized oils e.g. with iodinated fatty acid esters of poppy oil, show good storage capacities in the lymph nodes and a useful contrast effect on the one hand, but on the other hand they are due to their known side effects (Keinert, K., Köhler, K., and Platzbecker, H. , Complications and contraindications In: M. Lüning, M. Wiljasalo, and H. Weissleder (eds.), Lymphography for malignant tumors, pp. 40-50. Stuttgart: Georg Thieme Verlag, 1976) neither general nor problem-free.
  • Water-soluble iodinated X-ray contrast media such as lotrolan (Isovist®) have only a limited area of application for the representation of the lymphatic system.
  • Isovist® Water-soluble iodinated X-ray contrast media
  • the highly water-soluble, low-molecular substances then diffuse from the lymphatic vessels into the interstitium. This disadvantage cannot either can be compensated for by the sensitive method of computer tomography.
  • radioactive 99m Tc tracers are used for indirect lymph node dissection.
  • the disadvantages also apply here that only the lymph channels supplying the injection site are shown.
  • Superparamagnetic iron oxide particles are also suitable as lymphographics for nuclear magnetic resonance imaging, e.g. AMI-227
  • lymphographics (Hanka, L. et al., Radiology 1996, 198. 365-370) show such an animal specificity (rat vs. guinea pig and rabbit) that their further development had to be stopped.
  • conjugates according to the invention consisting of an amino group-containing polymer, metal ion (s) containing signaling group (s) and mono- or oligosaccharides as well as optionally cations of inorganic and / or organic bases, amino acids or amino acid amides, surprisingly become excellent Production of NMR diagnostics, particularly suitable for lymphography.
  • LD50 high tolerance
  • low elimination time more than 98% of them are usually excreted from the body within 14 days
  • their high relaxivity allows them to be applied in low doses, they often make it possible even a morphological differentiation of the lymph node tissue, they show no deviating animal specificities.
  • Z represents a mono- or oligosaccharide reduced by one hydroxyl group.
  • polymer which contains k amino groups, of which (n + m) are each reduced by one hydrogen atom
  • polymer is a dendrimer (eg WO 96/01655, EP 0271180), polylysine (eg EP 0331616), polypeptide, polyalkylamine , Poly [N- (2-aminoethyl)] methacrylamide (eg US-5,364,613) or polysaccharide (eg EP 0535668).
  • the sum (n + m) of the signaling groups (K) and of the mono- or polysaccharides (Z) bound by L, each reduced by one hydroxyl group is preferably equal to the number k of the amino groups contained in the polymer, ie.
  • the polymers preferably contain 12, 24, 32, 36, 40, 48, 64 or 80 amino groups, of which, for example, 3, 4, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 16, 18, 19, 21, 47 signaling groups K and, for example, 9, 8, 18, 17, 16, 13, 1-1, 10, 20, 6, 29, 27, 33 are bound to mono- or polysaccharides Z which are bonded via L and each reduced by one hydroxyl group. If the amino groups are understaffed, the sum (n + m) is preferably> k - 4.
  • the signaling group K is a chelate complex consisting of a radical of the general formula II, III, IV, V or VI.
  • R1 independently of one another is a hydrogen atom or a metal ion equivalent of the elements with a number of 20-32, 37-39, 42-44, 49 or 57-83,
  • R2 represents a hydrogen atom, a straight-chain or branched C1-C7 alkyl radical, a phenyl or benzyl radical,
  • U is a -CHR 3 -CONR 3 -M 1 or -CH 2 -CH (OH) -M 2 group with R 3 independently of one another in the meaning of R2 or the group -CH2- (CH2) 0 - COOH and M 1 and M 2 each represent a phenylene radical or a straight-chain, branched, saturated or unsaturated C1-C20-
  • the metal ion of the signaling group must be paramagnetic.
  • Suitable ions are, for example, chromium (III), iron (II), cobalt (II), nickel ( ll), copper (ll), praseodymium (III), neodymium (III), samarium (III) and ytterbium (III) ions. Because of their strong magnetic moment, gadolinium (III), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III), erbium (III), iron (III) and manganese (II) are particularly preferred. -ions.
  • the metal ion must be radioactive for the use of the compounds according to the invention in nuclear medicine.
  • radioisotopes of the elements copper, cobalt, gallium, germanium, yttrium, strontium, technetium, indium, ytterbium, gadolinium, samarium, iridium, rhenium and bismuth are suitable; technetium, gallium, indium and rhenium are preferred.
  • the metal ion is preferably derived from an element of a higher atomic number in order to achieve sufficient absorption of the X-rays. It has been found that diagnostic agents which contain a physiologically compatible complex salt with metal ions of elements of atomic numbers 25 and 26 and 57-83 are suitable for this purpose.
  • Manganese (II) -, iron (II) -, iron (III) -, praseodymium (III) -, neodymium (III) - 7 samarium (III) -, gadolinium (III) -, ytterbium (III) - are preferred or bismuth (III) ions, especially dysprosium (III) ions.
  • Acidic hydrogen atoms which may be present in R "1 that is to say those which have not been substituted by the central ion, can, if appropriate, be wholly or partly replaced by cations of inorganic and / or organic bases or amino acids or amino acid amides.
  • Suitable inorganic cations are, for example, lithium ion, potassium ion, calcium ion and in particular sodium ion.
  • Suitable cations of organic bases include those of primary, secondary or tertiary amines, such as, for example, ethanolamine, diethanolamine, morpholine, glucamine, N, N-dimethylglucamine and in particular N-methylglucamine.
  • Suitable cations of amino acids are, for example, those of lysine, arginine and omithin and the amides of otherwise acidic or neutral amino acids.
  • the compounds according to the invention which have a molecular weight of 5,000-200,000 D, preferably 15,000-60,000 D, have the desired properties described at the outset. They contain the large number of metal ions required for their use which are stably bound in the complex.
  • saccharide-polymer complexes according to the invention are outstandingly suitable for the interstitial and especially for the i.v. Lymphography.
  • the contrast media according to the invention can be formulated as solutions isoosmolar to the blood and thereby reduce the osmotic load on the body, which is reflected in a reduced toxicity of the substance (higher toxic threshold).
  • Lower doses and higher toxic thresholds lead to a significant increase in the safety of contrast medium applications in modern imaging processes.
  • Another advantage of the present invention is that complexes with hydrophilic or lipophilic, macrocyclic or open-chain, low molecular weight or high molecular weight ligands have now become accessible. This enables the tolerance and pharmacokinetics of these polymer complexes to be controlled by chemical substitution.
  • Preferred substituents for R 2 are the hydrogen atom, the methyl, isopropyl, phenyl and benzyl group.
  • Examples of preferred groups standing for V are the CH2C6H4, CH2-O-C6H4, (CH2) 4, (CH2) 6 and (CH2) ⁇ o group, the C6H4 group being bonded to T ⁇ .
  • Preferred substituents for R 3 are the hydrogen atom, the methyl, CH 2 COOH and (CH 2 ) 2COOH group.
  • ⁇ indicates the linkage to the rest-CH (OH) - and ß the linkage to Tl.
  • the groups are preferred:
  • the group is particularly preferred:
  • Groups Z for the monosaccharides are the hexoses, pentoses and N-acetyl-neuraminic acid, each reduced by one hydroxyl group, which are each in the pyranose or furanose form, and their derivatives.
  • Preferred are hexoses which are in the pyranose form, such as, for example, D-galactose, D-mannose, D-glucose, L-fucose, galactose-6-sulfate, mannose-6-sulfate, D-glucosamine. 6-sulfate, D-glucosamine-3,4,6-trisulfate and N-acetyl-glucosamine.
  • Examples of preferred monosaccharides are N-acetyl-2-amino-2-deoxy-D-glucose, -D-galactose and D-mannose, 6-deoxy-L-galactose and N-acetyl-neuraminic acid.
  • Z stands for oligosaccharides, these can be linear or branched from the monosaccharides mentioned above, and the linkage can be terminal or within the chain.
  • Examples of oligosaccharides are: sialyl-Lewis x (see, for example, H. Ohmoto et al, J. Med. Chem. 1996, 29, 1339); Deoxy-sialyl-Lewis x (see, for example, W.
  • N, N ', N ", N” -Tetraacetylchitotetraose; Maltotriose; Digalacturonic acid; Trigalacturonic acid (Carbohydrates International AB, Sweden).
  • the polymer is preferably bound (via the linker L) to the mono- or polysaccharides via the C-2 position, particularly preferably via the C-1 position of the sugars.
  • the groups M 3 are, for example
  • M 3 preferably stands for a direct bond and for the groups
  • K ' is a radical of the general formula II '. III ', IV, V or VI *
  • R1 independently of one another for a hydrogen atom, an acid protecting group or a metal ion equivalent of the elements of atomic numbers 20-29,
  • R 2 , V, o, p, T and U have the meaning given above, with n 'mono- or oligosaccharides of the general formula VIII
  • n ' 1-3 n
  • R 4 meaning a straight-chain or branched C-
  • M 3 has the meaning given for M 3 , but the carboxy groups which may be present in M 3 are optionally protected, and X represents NH, CO, O and S, or
  • R 1 ' stands for an acid protecting group or if the caboxy groups contained in U, M 3 ' and Z 'are protected, lower alkyl, aryl and aralkyl groups come, for example the methyl, ethyl, propyl, butyl, phenyl -, Benzyl, diphenylmethyl, triphenylmethyl, bis (p-nitrophenyl) methyl group, and trialkylsilyl groups in question.
  • the protective groups are split off by the processes known to the person skilled in the art (see, for example, E. Wünsch, Methods of Org. Chemistry, Houben-Weyl, Vol XV / 1st 4th Edition 1974, p. 315), for example by hydrolysis, hydrogenolysis, alkaline saponification of the esters with alkali in aqueous-alcoholic solution at temperatures from 0 ° C to 50 ° C, acid saponification with mineral acids or in the case of tert-butyl esters with the help of trifluoroacetic acid.
  • Suitable hydroxyl protective groups are the benzyl, 4-methoxybenzyl, 4-nitrobenzyl, trityl, diphenylmethyl, trimethylsilyl, dimethyl-t-butyl-silyl, diphenyl-t-butysilyl group.
  • the methyl group is also suitable as a protective group for the 1-OH group of the mono- and / or oligosaccharides.
  • the hydroxy groups can also e.g. as THP ether, alkyl ether, ⁇ -alkoxyethyl ether, MEM and MOM ether or as ester with aromatic or aliphatic carboxylic acids, such as e.g. Acetic acid and chloroacetic acid, benzoic acid, levulinic acid or 2-chloroacetoxymethyl (or ethyl) benzoic acid (GIT horrz. Lab. 1996, 46) are available.
  • the hydroxy groups can also be in the form of ketals with e.g. Acetone, acetaldehyde, cyclohexanone or benzaldehyde must be protected.
  • the hydroxyl groups can also be protected by intramolecular esterification to give the corresponding lactones.
  • the hydroxyl protecting groups can be prepared according to the literature methods known to the skilled person, e.g. by hydrogenolysis, reductive cleavage with lithium / ammonia, acid treatment of the ethers and ketals or alkali treatment of the esters (see, for example, "Protective Groups in Organic Synthesis", T.W. Greene, John Wiley and Sons 1981).
  • the amine protecting groups are the benzyloxycarbonyl, tertiary butoxycarbonyl, trifluoroacetyl, fluorenylmethoxycarbonyl, benzyl, formyl, 4-methoxybenzyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, phthaloyl, 1, 2- Oxazoline, tosyl, dithiasuccinoyl, allyloxycabonyl, sulfate, pent-4-encarbonyl, 2-chloroacetoxymethyl (or ethyl) benzoyl, tetrachlorophthaloyl, alkyloxycarbonyl groups [Th. W. Greene, P.G.M.
  • reaction indicated under a) is carried out according to the methods familiar to the person skilled in the art, as described, for example, in P. Erbacher et al, Bioconjugate Chem. 1995, 6, 401; G. Molema et al, J. Med. Chem. 1991, 34, 1137; JL Montero et al, Bull. Soc. Chim. France, 1994, 131.854; P. Midoux et al, Nucleic Acids Research 1993, 21, 871; Andersson, M. et al., Bioconjugate Chem. 1993, 4, 246; R. Roy et al, Tetrahedron Letters 1995, 36 4377; UK Saha et al, J. Chem. Soc. Chem.
  • Examples include thethylamine, di-isopropyl-N-ethylamine (Hünig base), N-methylmorpholine, tributylamine, tetramethylethylenediamine, pyridine, lutedine, 2,4,6-trimethylpyridine, 4-dimethylaminopyridine, N-methylimidazole, tetramethylguanidine, DBU, Lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, barium hydroxide, carbonate, and hydrogen carbonate.
  • the reaction can also be carried out in the manner known to those skilled in the art
  • Buffer solutions preferably at pH 8 to 11, particularly preferably at pH 8.5 to 9.
  • the pH value is preferably maintained using a pH state. If T 2 'stands for a CHO group, coupling is carried out by reductive amination with the aid of a reducing agent according to methods known to the person skilled in the art (J.-P. Sabri et al, Tetrahedron Letters 1994, 35, 1181; MD Bomann et al, J Org. Chem. 1995, 60, 5995; S. Bhattacharyya et al, J. Chem. Soz. Pekin Trans. I 1994, 1; OS Artyushin et al., Ser. Khim 1991, 9.
  • reducing agents are sodium borohydride, sodium cyanoborohydride, lithium borohydride, calcium borohydride, pyridine-BH3, lithium aluminum hydride and zinc borohydride. Catalytic hydrogenation on, for example, palladium or nickel catalyst is also suitable.
  • in-situ activation can also be carried out using the coupling reagents known to the person skilled in the art, such as DCCI, EEDQ, Staab reagent, BOP, PyBOP, TBTU, TDBTU, HBTU (see, for example, Fournic-Zaluski et al , J. Med. Chem. 1996, 39, 2596; Houben-Weyl, Volume XV / 2, Part II, 1974; YM An gell et al, Tetrahedron Letters 1994, 35, 5981; LA Carpino et at, J. Chem. Soc. Commun. 1994, 201; HO.
  • reaction of the polymer saccharide conjugate of the general formula IX with the complexes or complexing agents K * of the general formula II "to VII" and II'a indicated under b) is also carried out in a manner known per se, for example as described in US Pat. No. 5,135,737, H. Takalo et al, Bioconjugate Chem. 1994, 5, 278; EP 0430863; EP 0331616; WO 96/01655; EP 0271 180; U.S. 5,364,613; WO 95/17451 and WO 96/02669. It is in solvents such as water, methylene chloride, acetonitrile, chloroform, DMS0, pyridine, ethano!
  • Examples include triethylamine, di-isopropyl-N-ethylamine (Hünig base), N-methylmorpholine, tributylamine, tetramethylethylenediamine, pyridine, lutedine, 2,4,6-trimethylpyridine, 4-dimethylaminopyridine, N-methylimidazole, tetramethylguanidine, DBU, lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, barium hydroxide, carbonate, bicarbonate.
  • the reaction can also take place in the buffer solutions known to the person skilled in the art, preferably at pH 8 to 11, particularly preferably at pH 8.5 to 9.
  • the pH value is preferably maintained using a pH state.
  • T 2 ' is a CHO group
  • a coupling is carried out by reductive amination with the aid of a reducing agent according to methods known to the person skilled in the art (J.-P. Sabri et al, Tetrahedron Letters 1994, 35, 1181; MD Bomann et al, 7 Org. Chem. 1995, 60, 5995; S. Bhattacharyya et al, J. Chem. Soz. Pekin Trans. I 1994, 1; OS Artyushin et al., Ser. Khim 1991, 9. 2154; RF Borch et al , JACS 1971, 93 2897).
  • reducing agents used are sodium borohydride, sodium cyanoborohydride, lithium borohydride, calcium borohydride, pyridine-BH3, lithium aluminum hydride and zinc borohydride. Catalytic hydrogenation is also suitable.
  • the reactions indicated under a) and b) are preferably carried out with an excess of the activated saccharide of the formula VIII or the activated complex or complexing agent K * , preferably with a 1.5 to 3 times excess.
  • the occupancy ratio of the amino groups contained in the polymer is controlled by the ratio n ': m'.
  • the neutralization is carried out with the aid of inorganic bases (for example hydroxides, carbonates or bicarbonates) of, for example, sodium, potassium, lithium, magnesium or calcium and / or organic bases such as, inter alia, primary, secondary and tertiary amines, such as, for example, ethanolamine, morpholine, glucamine, N-methyl- and N, N-dimethylglucamine, as well as basic amino acids, such as lysine, arginine and omithin, or amides of originally neutral or acidic amino acids, such as hippuric acid, glycine acetamide.
  • inorganic bases for example hydroxides, carbonates or bicarbonates
  • inorganic bases for example hydroxides, carbonates or bicarbonates
  • organic bases such as, inter alia, primary, secondary and tertiary amines, such as, for example, ethanolamine, morpholine, glucamine, N-methyl- and N, N-dimethylglucamine, as
  • the acidic complex salts in aqueous solution or suspension can be added with as much of the desired base that the neutral point is reached.
  • the solution obtained can then be evaporated to dryness in vacuo.
  • water-miscible solvents such as lower alcohols (methanol, ethanol, isopropanol and others), lower ketones (acetone and others), polar ethers (tetrahydrofuran, dioxane, 1, 2- Dimethoxyethane and others) to precipitate and to obtain crystals that are easy to isolate and easy to clean. It has proven to be particularly advantageous to add the desired base already during the complex formation of the reaction mixture and thereby to save one process step.
  • acidic complex compounds contain several free acidic groups, it is often expedient to prepare neutral mixed salts which contain both inorganic and organic cations as counterions.
  • the order of base addition can also be reversed.
  • the polysaccharide conjugates thus obtained are purified, if necessary after adjusting the pH by adding an acid or base to pH 6 to 8, preferably about 7, preferably by ultrafiltration with membranes of suitable pore size (for example Amicon-®XM30, Amicon® -YM10, Amicon®-YM3) or gel filtration on e.g. suitable Sephadex® gels.
  • suitable pore size for example Amicon-®XM30, Amicon® -YM10, Amicon®-YM3
  • suitable Sephadex® gels for example Amicon-®XM30, Amicon® -YM10, Amicon®-YM3
  • an anion exchanger for example IRA 67 (OH ⁇ form)
  • a cation exchanger for example IRC 50 (H + form) for the separation of ionic components.
  • the polymers of the general formula X can be used in the form of the free amines or in the form of their salts, for example as hydrochlorides, hydrobromides or hydrosulfates. They are known from the literature (for example polylysine: EP 0331 616; dendrimers: WO 96/01655, EP 0271 180, EP 0430863, polypeptide, polyallylamine, poly [N- (2-aminoethyl)] methacrylamide: US Pat. No. 5,364,613; polysaccharide : VD Nadkami et al, Carbohydrate Research 1996, 290, 87, EA Yates et al, Carbohydrate Research 1996, 294, 15, DJ. Tyrrell et al, TiPS 1995, 16, 198, JP Patent 06080705-A).
  • the complexes or complexing agents K * used are known from the literature or can be obtained analogously to methods known from the literature:
  • EP 0430863 EP 255471, US-5,277,895, EP 0232751,
  • the mono- and oligosaccharides of the general formula VIII required as starting materials are likewise known from the literature or can be obtained analogously to methods known from the literature (see also experimental part): see, for example, EP 0 128097; AJ Jonas et al. Biochem. J. 1990, 268, 41; JP patent 04211099; DH Buss et al, J. Chem. Soc. C. 1968, 1457; CM. Hilditch et al, J. Appl. Phycol. 1991, 3, 345; M. Monsigny et al, Biol.
  • compositions according to the invention are likewise prepared in a manner known per se by suspending or dissolving the complex compounds according to the invention - if appropriate with addition of the additives customary in galenicals - in an aqueous medium and then optionally sterilizing the suspension or solution.
  • suitable additives are, for example, physiologically harmless buffers (such as, for example, tromethamine), additions of complexing agents or weak complexes (such as, for example, diethylenetriaminepentaacetic acid or the corresponding calcium polysaccharide-polymer complexes) or - if necessary - electrolytes such as, for example, sodium fluoride or - if necessary - antioxidants such as ascorbic acid.
  • suspensions or solutions of the agents according to the invention in water or physiological saline are desired for enteral administration or other purposes, they are mixed with one or more adjuvants common in galenics [e.g. Methyl cellulose, lactose, mannitol] and / the surfactant (s) [e.g. Lecithins, Tween®, Myrj®] and / or flavoring (s) for flavor correction [e.g. essential oils] mixed.
  • galenics e.g. Methyl cellulose, lactose, mannitol
  • surfactant e.g. Lecithins, Tween®, Myrj®
  • flavor correction e.g. essential oils
  • the invention therefore also relates to processes for the preparation of the complex compounds and their salts.
  • the final security is cleaning the isolated complex salt.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention preferably contain 1 ⁇ mol - 1.3 mol / l of the complex salt and are generally dosed in amounts of 0.0001–5 mmol / kg. They are intended for enteral and parenteral administration.
  • the complex compounds according to the invention are used.
  • the agents according to the invention meet the diverse requirements for their suitability as contrast agents for magnetic resonance imaging. After oral or parenteral application, they are ideally suited to improve the meaningfulness of the image obtained with the aid of an MRI scanner by increasing the signal intensity. They also show the high effectiveness that is necessary to burden the body with the smallest possible amount of foreign substances and the good tolerance that is necessary to maintain the non-invasive character of the examinations.
  • the agents according to the invention make it possible to produce highly concentrated solutions, so that the volume of the circulatory system can be kept within reasonable limits and to compensate for the dilution with the body fluid, i.e. NMR diagnostics must be 100 to 1000 times more water soluble than for them NMR spectroscopy.
  • the agents according to the invention not only have a high stability in vitro, but also a surprisingly high stability in vivo, so that the release or exchange of the ions which are not covalently bound in the complexes - in themselves toxic - within the time which the new contrast agents are completely excreted again, is extremely slow.
  • the agents according to the invention for use as NMR diagnostic agents in amounts of 0.0001-5 mmol / kg, preferably 0.005-0.5 mmol / kg, dosed. Details of the application are, for example, in H.-J. Weinmann et al., Am J. of Roentgenology 142, 619 (1984).
  • organ-specific NMR diagnostics can be used, for example, to detect tumors and heart attacks.
  • the agents according to the invention are also suitable as radio diagnostic agents. Details of their application and dosage are e.g. in "Radiotracers for Medical Applications", CRC-Press, Boca Raton, Florida.
  • positron emission tomography which is positron-emitting isotopes such as 43 Sc, 44 Sc,
  • the compounds according to the invention are surprisingly also suitable for differentiating malignant and benign tumors in areas without a blood-brain barrier. They are also characterized by the fact that they are completely eliminated from the body and are therefore well tolerated.
  • the substances according to the invention accumulate in malignant tumors (no diffusion into healthy tissues, but high permeability of tumor vessels), they can also support the radiation therapy of malignant tumors. This differs from the corresponding diagnostics only in the amount and type of isotope used.
  • the aim is to destroy tumor cells by high-energy short-wave radiation with the shortest possible range. Interactions of the metals contained in the complexes (such as iron or gadolinium) with ionizing radiation (eg X-rays) or with neutron beams are used for this purpose. This effect significantly increases the local radiation dose at the location where the metal complex is located (eg in tumors).
  • the metal complex conjugates according to the invention are therefore also suitable as radiosensitive lising substance in radiation therapy of malignant tumors (Mössbauer effects or neutron capture therapy can also be used).
  • Suitable ⁇ -emitting ions are, for example, 4 6sc, 47 Sc, 48 Sc, 72 Ga, 73 Ga and 90 ⁇ .
  • Suitable ⁇ -emitting ions with short half-lives are, for example, 21 1 Bi, 212 Bi, 213 Bi and 214 Bi, with 212 Bi being preferred.
  • a suitable photon and electron-emitting ion is 1 58Gd, which can be obtained from 57Qd by neutron capture.
  • the therapeutic agents according to the invention When the therapeutic agents according to the invention are applied in vivo, they can be administered together with a suitable carrier such as serum or physiological saline and together with another protein such as human serum albumin.
  • a suitable carrier such as serum or physiological saline and together with another protein such as human serum albumin.
  • the dosage depends on the type of cellular disorder, the metal ion used and the type of imaging method.
  • the therapeutic agents according to the invention are administered parenterally, preferably IV.
  • radiotherapeutics are e.g. in R.W. Kozak et al. TIBTEC, October 1986, 262.
  • the agents according to the invention are outstandingly suitable as X-ray contrast agents, in particular for computed tomography (CT), whereby it should be emphasized that they show no signs of the anaphylaxis-like reactions known from the iodine-containing contrast agents in biochemical-pharmacological examinations. They are particularly valuable for digital subtraction techniques due to their favorable absorption properties in areas with higher tube voltages.
  • CT computed tomography
  • the agents according to the invention for use as X-ray contrast agents are dosed in amounts of 0.1-5 mmol / kg, preferably 0.25-1 mmol / kg, in analogy to megiumin diatrizoate.
  • Gd-DTPA Gadolinium complex of [bis- (2-aminoethyl) amine-N, N, N ', N ", N" - pentaacetic acid] monosodium salt
  • the mixture is stirred for a further 15 minutes at room temperature and then the pH of the reaction solution is adjusted to 11.5 by adding 32% sodium hydroxide solution. After a reaction time of 12 hours at room temperature, make up to a total volume of 800 ml with distilled water.
  • the aqueous product solution thus obtained is cut three times using a YM3 ultrafiltration membrane [cut off 3000 D; AMICON ®] ultrafiltered against distilled water. The remaining residue is made up to a volume of 500 ml with deionized water and the aqueous product solution is freeze-dried. Yield: 10.26 g (84.6%; based on the polyamine used) as an amorphous powder Water content: 7.44%
  • the ninhydrin reaction and the TNBS method which can generally be used for the quantitative and qualitative determination of free amino functions, are negative, ie there are no free amino functions in the polymer.
  • the percentage of sulfur in the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 40% ⁇ -D-Ga lactose (equivalent to 33 galactose residues per molecule).
  • the colorimetric phenol-sulfuric acid determination Dubois et al., Anal. Chem.
  • the ninhydrin reaction on the title compound is negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 40% D-mannose (corresponding to 33 mannose residues per molecule).
  • Example 2a 0.85 g (0.020 mmol; corresponding to 0.94 mmol of DTPA) of the title compound from Example 2a) are described in analogy as for Example 1 c), with 10 ml of an aqueous gadolinium chloride solution which has a total content of 0.25 g (0 , 96 mmol) of gadolinium chloride, complexed. After working up and freeze-drying, 918 mg (98.5% of theory) of the title compound are obtained as an amorphous powder.
  • the molar elemental ratios of gadolinium to sulfur thus result in an average degree of loading of the polymer of 60.3% Gd-DPTA and 39.7% D-mannose (corresponding to 47 Gd-DTPA units and 33-D-mannose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of the quantitative ninhydrin reactions.
  • and T2 relaxivities of the title compound were determined both in water and in plasma:
  • the measurements were carried out at 40 ° C, a magnetic field strength of 0.47 Tesla, the T1 sequence: 180 ° - Tl - 90 ° [inversion recovery] and the T2 sequence: 90 ° - TE - 180 ° [CPMG].
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, i. H. the polymeric product no longer contains any free amino functions.
  • the percentage sulfur of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 40% D-glucose (corresponding to 33 glucose residues per molecule).
  • Example 3a 1.0 g (0.023 mmol; corresponding to 1.10 mmol of DTPA) of the title compound from Example 3a) are described in analogy as for Example 1c), with 10 ml of an aqueous gadolinium chloride solution which has a total content of 0.298 g (1.12 mmol ) Has gadolinium chloride solution complexed. After working up and freeze-drying, 1.06 g (99.2% of theory) of the title compound is obtained as an amorphous powder. Water content: 5.47%
  • the pH of the reaction solution is adjusted to 11.5 by adding 1 molar sodium hydroxide solution.
  • the reaction solution is stirred for 12 hours at room temperature and made up to a total volume of 800 ml by adding distilled water.
  • the aqueous product solution thus obtained is ultrafiltered three times using a YM3 ultrafiltration membrane (AMICON®) against distilled water. The remaining residue is made up to a volume of 500 ml with deionized water and the aqueous product solution is freeze-dried.
  • the ninhydrin reaction title compound is negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 54.2% D-galactose (corresponding to 13 galactose residues per molecule).
  • Example 1c 1.0 g (0.077 mmol; corresponding to 0.85 mmol of DTPA) of the title compound from Example 4b) are described in analogy as for Example 1c) with 10 ml of an aqueous gadolinium chloride solution which has a total content of 0.232 g (0.88 mmol) Contains gadolinium chloride, complexed. After working up and freeze-drying, 978.4 mg (98.4% of theory) of the title compound are obtained as an amorphous powder.
  • the molar element ratio of gadolinium to sulfur thus results in an average degree of loading of the polymer of 46.4% Gd-DPTA and 53.6% D-galactose (corresponding to 11 Gd-DTPA units and 13-D-galactose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of a ninhydrin reaction.
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, ie the polymeric product does not contain any free amino functions.
  • a degree of loading results from the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound of the polymer with 53.8% D-mannose (corresponding to 20 ⁇ -D-mannose units per molecule).
  • Example 1c) 1.0 g (0.077 mmol; corresponding to 0.85 mmol of DTPA) of the title compound from Example 5a) are described in analogy as for Example 1c) with 10 ml of an aqueous gadolinium chloride solution which has a total content of 0.232 g (0.88 mmol) Contains gadolinium chloride, complexed. After working up and freeze-drying, 952.2 mg (96.4% of theory) of the title compound are obtained as an amorphous powder. Water content: 7.89%
  • the molar element ratio of gadolinium to sulfur results in an average degree of loading of the polymer of 45% Gd-DPTA and 55% D-mannose (corresponding to 11 Gd-DTPA units and 13-D-mannose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of a ninhydrin reaction.
  • T and T relaxivities of the title compound were determined both in water and in plasma:
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions. From the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound, the degree of loading of the polymer is 54.1% N-acetyl-glucose units (corresponding to 13 N-acetyl-glucosamine residues per molecule).
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, ie the polymeric product does not contain any free amino functions. From the percentage sulfur The elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 54.9% D-glucose (corresponding to 13 glucose residues per molecule).
  • Example 7a 1.0 g (0.077 mmol; corresponding to 0.85 mmol of DTPA) of the title compound from Example 7a) are complexed in an analogy as described for Example 1c) with 232 mg (0.88 mmol) of an aqueous gadiolium chloride solution (10 ml). After working up and freeze-drying, 952.2 mg (96.4% of theory) of the title compound are obtained as an amorphous powder. Water content: 7 39%
  • the molar element ratio of gadolinium to sulfur results in an average degree of loading of the polymer of 45% Gd-DPTA and 55% D-glucose (corresponding to 11 Gd-DTPA units and 13-D-glucose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of a ninhydrin reaction.
  • a total of 9.38 g (23.3 mmol) of DTPA monoanhydride monoethyl ester is then added in portions, the pH of the reaction solution being kept constant at 9.5 by adding 1 molar sodium hydroxide solution. After a reaction time of 20 minutes at room temperature, the pH of the reaction solution is adjusted to 1 1.5 by adding 1 molar sodium hydroxide solution. The reaction solution is stirred for 12 hours at room temperature and made up to a total volume of 800 ml by adding distilled water. The aqueous product solution thus obtained is ultrafiltered three times using a YM3 ultrafiltration membrane (AMICON ®) against distilled water.
  • AMICON ® YM3 ultrafiltration membrane
  • the degree of DTPA loading of the polymer is 45.1% (corresponding to 16 DTPA units per molecule).
  • an average of 20 free amino functions per molecule are present in the polymer.
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • the percentage of sulfur in the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 59% N-acetyl-D-glucosamine (corresponding to 20 glucose residues per molecule).
  • the ninhydrin color reaction test for the presence of free amino functions in the title compound is negative, i. H. the polymeric product therefore no longer contains any free amino functions.
  • the percentage sulfur of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 56.2% D-glucose (corresponding to 20 glucose residues per molecule).
  • the molar element ratios of gadolinium to sulfur result in an average degree of loading of the polymer of 44% Gd-DPTA and 56% ß-D-glucose (corresponding to 16 Gd-DTPA units and 20 ß-D-glucose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of a ninhydrin reaction.
  • the aqueous product solution is extracted twice with 60 ml of diethyl ether each time.
  • the aqueous product solution is brought to a pH of 3.0 by adding 10% hydrochloric acid and made up to a total volume of 800 ml with water and ultrafiltered three times using a YM 3 ultrafiltration membrane (AMICON®) against distilled water.
  • the remaining residue is made up to a volume of 500 ml with deionized water and freeze-dried. Yield: 2.80 g (81.6% of theory) as an amorphous and colorless powder. Water content: 7.78%.
  • the molar element ratio of sulfur to gadolinium (1, 21) thus results in an average degree of loading of the polymer of 45.2% Gd-Gly-Me-DOTA and 54.8% ⁇ -D-mannose (corresponding to 1 1 Gd-Gly -Me-DOTA units and 13- ⁇ -D-mannose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of a ninhydrin reaction.
  • the title compound shows a negative ninhydrin reaction.
  • An average degree of loading of the polymer with 13 D-glucose residues per molecule results from the percentage sulfur value of the elemental analysis.
  • the title compound shows a negative ninhydrin reaction.
  • An average degree of loading of the polymer with 13 D-galactose residues per molecule results from the percentage sulfur value of the elemental analysis.
  • the title compound shows a negative ninhydrin reaction.
  • the percentage sulfur value of the elemental analysis gives an average degree of contamination of the polymer with tetraacetyl-glucosamine residues per molecule.
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, ie there are no free amino functions in the polymer.
  • the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 60% D-galactose (corresponding to 29 galactose residues per molecule).
  • the molar element ratios of gadolinium to sulfur thus result in an average degree of loading of the polymer of 40% Gd-DPTA and 60% D-galactose (corresponding to 19 Gd-DTPA units and 29-D-galactose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of ninhydrin reactions.
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 60% D-mannose (corresponding to 29 mannose residues per molecule).
  • Example 15a 0.85 g (0.029 mmol; corresponding to 0.56 mmol of DTPA) of the title compound from Example 15a) are described in analogy as described for Example 14c) with 0.15 g (0.58 mmol) of gadolinium chloride, dissolved in 10 ml of distilled water , complexed. After working up and freeze-drying, 854 mg (97.5% of theory) of the title compound are obtained as an amorphous powder. Water content: 6.14%
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • the percentage sulfur of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 60% D-glucose (corresponding to 29 glucose residues per molecule).
  • the molar element ratio of gadolinium to sulfur thus results in an average degree of loading of the polymer of 40% Gd-DPTA and 60% D-glucose (corresponding to 19 Gd-DTPA units and 29-D-glucose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of the ninhydrin reactions.
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, ie the polymeric product does not contain any free amino functions.
  • the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 60% L-fucose (corresponding to 29 ⁇ -L-fucose residues per molecule).
  • Example 17a 1.2 g (0.042 mmol; corresponding to 0.81 mmol of DTPA) of the title compound from Example 17a) are described in analogy to that described for Example 14c) with 0.21 g (0.83 mmol) of an aqueous gadolinium chloride solution, dissolved in 10 ml distilled water, complexed. After working up and freeze-drying, 1.25 g (98.5% of theory) of the title compound is obtained as an amorphous powder. Water content: 4.39%
  • the molar element ratio of gadolinium to sulfur thus results in an average degree of loading of the polymer of 40% Gd-DPTA and 60% ⁇ -L-fucose (corresponding to 19 Gd-DTPA units and 29 ⁇ -L-fucose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of ninhydrin reactions.
  • a solution of 5.0 g (0.97 mmol, corresponding to 23.3 mmol of free amine functions) 24-star burst dendrimer polyamine (representation according to: Tomalia DA et al.; Macromolecules 1986, 19, 2466; Tomalia DA et al .; Macromolecules 1987, 20, 1164) is dissolved in 400 ml of distilled water and adjusted to a pH of 9.5 with 1 molar sodium hydroxide solution. A total of 11.2 g (27.9 mmol) of DTPA monoanhydride monoethyl ester are then added in portions, the pH of the reaction solution being kept constant at 9.5 by adding 1 molar sodium hydroxide solution.
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, ie the polymeric product does not contain any free amino functions. From the percentage sulfur The elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 59% D-galactose (corresponding to 14 gaiactose residues per molecule).
  • Example 18b 1.0 g (0.07 mmol; corresponding to 0.7 mmol of DTPA) of the title compound from Example 18b) are dissolved in analogy as described for Example 14c) with 0.18 g (0.72 mmol) of an aqueous gadolinium chloride solution 10 ml of distilled water, complexed. After working up and freeze-drying, 1.05 g (97.3% of theory) of the title compound is obtained as an amorphous powder. Water content: 5.67%
  • the molar element ratio of gadolinium to sulfur thus results in an average degree of loading of the polymer of 41% Gd-DPTA and 59% D-galactose (corresponding to 10 Gd-DTPA units and 14-D-galactose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of the ninhydrin reaction.
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • the percentage sulfur of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 59% D-mannose (corresponding to 14 mannose residues per molecule).
  • Example 19a 1.1 g (0.077 mmol; corresponding to 0.77 mmol of DTPA) of the title compound from Example 19a) are described in analogy to that described for Example 14c) with 194.2 mg (0.79 mmol) of gadolinium chloride, dissolved in 10 ml of distilled water , complexed. After working up and freeze-drying, 1.14 g (98.6% of theory) of the title compound is obtained as an amorphous powder. Water content: 4.72%
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 59% D-glucose (corresponding to 14 glucose residues per molecule).
  • the molar element ratios of gadolinium to sulfur thus result in an average degree of loading of the polymer of 41% Gd-DPTA and 59% D-glucose (corresponding to 10 Gd-DTPA units and 14-D-glucose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of ninhydrin reactions.
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, ie the polymeric product does not contain any free amino functions.
  • the percentage of sulfur in the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 59% L-fucose (corresponding to 14 fucose residues per molecule).
  • 24-Starburst dendrimer (Gd-DTPA amide) 0 - [1- (4-thioureidophenyl) - ⁇ - L-fucopyranosyl] -
  • the molar element ratios of gadolinium to sulfur thus result in an average degree of loading of the polymer of 41% Gd-DPTA and 59% D-glucose (corresponding to 10 Gd-DTPA units and 14-D-glucose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of a ninhydrin reaction.
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 59% N-acetyi-D-glucosamine (corresponding to 14 N-acetyl-D-glucosamine residues per molecule).
  • the molar element ratios of gadolinium to sulfur thus result in an average degree of loading of the polymer of 41% Gd-DPTA and 59% N-acetyl-D-glucosamine (corresponding to 10 Gd-DTPA units and 14 N-acetyl-D-glucosamine residues per Molecule).
  • No free amino functions can be detected in the title compound by means of a ninhydrin reaction.
  • the aqueous product solution is extracted twice with 60 ml of diethyl ether each time.
  • the aqueous product solution is brought to pH 3.0 by adding 10% hydrochloric acid and made up to a total volume of 800 ml with water and three times using a YM3 ultrafiltrate.
  • tion membrane AMICON ® ultrafiltered against distilled water. The remaining residue is made up to a volume of 500 ml with deionized water and freeze-dried.
  • the title compound shows a negative quantitative ninhydrin reaction.
  • An average degree of loading of the polymer with 20 D-glucose residues per molecule results from the percentage sulfur value of the elemental analysis.
  • the title compound shows a negative ninhydrin reaction.
  • An average degree of loading of the polymer with 20 D-galactose residues per molecule results from the percentage sulfur value of the elemental analysis.
  • the aqueous product solution is extracted twice with 60 ml of diethyl ether each time.
  • the aqueous product solution is brought to pH 3.0 by adding 10% hydrochloric acid and made up to a total volume of 800 ml with water and ultrafiltered three times using a YM3 ultrafiltration membrane (AMICON®) against distilled water.
  • the remaining residue is made up to a volume of 500 ml with deionized water and freeze-dried.
  • the molar element ratio of sulfur to gadolinium thus results in an average degree of loading of the polymer of 43.8% Gd-Gly-Me-DOTA and 56.2% D-mannose (corresponding to 21 Gd-Gly-Me-DOTA units and 27 - D-Mannosc3 ⁇ -est per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of a ninhydrin reaction.
  • Example 26b In an analogous manner as described for Example 26b), the reaction of 3.5 g (0.19 mmol; corresponding to 5.13 mmol of free amine functions) of the title compound from Example 26a) with 3.3 g (6.3 mmol) 3- (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio- ⁇ -D-glucopyranosyl) propionic acid N-hydroxysuccinimide ester 5.57 g (93% of theory) of the title compound as colorless oil.
  • Example 26b In an analogous manner as described for Example 26b), the reaction of 3.5 g (0.19 mmol; corresponding to 5.13 mmol of free amine functions) of the title compound from Example 26a) with 3.3 g (6.3 mmol) 3- (2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio- ⁇ -D-gaiactopyranosyl) propionic acid N-hydroxysuccinimide ester 5.23 g (90.2% of theory) of the title compound as colorless oil.
  • the title compound shows a negative ninhydrin reaction.
  • An average degree of loading of the polymer with 27 D-galactose residues per molecule results from the percentage sulfur value of the elemental analysis.
  • ninhydrin reaction as well as the TNBS method of the title compound are negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • ninhydrin reaction as well as the TNBS method of the title compound are negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • reaction solution thus obtained of the N-hydroxysuccinimide ester of the title compound from Example 31 h) is then added dropwise at 22.degree. C. with a solution of 2.61 g (0.55 mmol, corresponding to 13.23 mmol of free amine functions, 24 cascade polyamine) 15 ml of absolute dimethyl sulfoxide are added and the mixture is stirred for a further 12 hours at room temperature, and the reaction solution is added dropwise in 1.5 l of acetone at 22 ° C., the title compound precipitating as a colorless precipitate, the precipitate is filtered off with suction, dissolved in 200 ml of distilled water and Ultrafilter three times through a YM3 ultrafiltration membrane (AMICON ®), the remaining residue is dissolved in 300 ml of distilled water, filtered and freeze-dried.
  • AMICON ® YM3 ultrafiltration membrane
  • the ninhydrin reaction as well as in the TNBS method of the title compound are negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • a degree of loading of the polymer with 58.3% D-galactopyranose results from the molar sulfur value of the elemental analysis of the title compound
  • Gd-Gly-DOTA corresponding to 10 Gd-Gly-Me-DOTA complexes per molecule.
  • the ninhydrin reaction as well as in the TNBS method of the title compound are negative, ie the polymeric product does not contain any free amino functions.
  • the percentage sulfur content of the elemental analysis of the titite compound gives a degree of loading of the polymer with 56.8% D-mannopyranose (corresponding to 14 mannose residues per molecule) and 41.2% (corresponding to 10 Gd-Gly-Me-DOTA complexes per molecule).
  • the ninhydrin reaction as well as in the TNBS method of the title compound are negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions. From the percentage sulfur value of the elemental analysis of the titite compound, a degree of loading of the polymer results with 57.9% D-glucopyranose (corresponding to 14 glucose residues per molecule) and 42.1% (corresponding to 10 Gd-Gly-Me-DOTA complexes per molecule).
  • the ninhydrin reaction as well as in the TNBS method of the title compound are negative, i. H. the polymeric product contains no free amino functions.
  • the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 54.1% ⁇ -L-fucose (corresponding to 13 ⁇ -L-fucose residues per molecule) and 40.6% (corresponding to 10 Gd-Gly-Me-DOTA Complexes per molecule).
  • the ninhydrin reaction as well as the TNBS method are negative, ie the polymeric product contains no free amino functions.
  • the ninhydrin reaction as well as the TNBS method are negative, ie the polymeric product contains no free amino functions. From the molar Sulfur value of the elemental analysis of the title compound results in a degree of loading of the polymer with 58.8% D-mannopyranose (corresponding to 14 mannose residues per molecule) and 41.2% Gd-Gly-DOTA (corresponding to 10 Gd-Gly-Me-DOTA complexes per molecule) .
  • the reaction is carried out analogously to that described in Example 1b), by reacting 4.0 g (0.45 mmol, corresponding to 6.3 mmol of free amine functions) of the title compound from Example 31a) with 15.86 g (31.5 mmol) ) of the title compound from Example 38a) to form 6.04 g (84.2% of theory, based on the polyamine used) of the above-mentioned title compound as a colorless lyophilisate.
  • a solution of 5.0 g (4.07 mmol; corresponding to 48.8 mmol of free amino functions) 12-part cascade polyamine (preparation according to: Schmitt-Willich et al.; EP 0271180) is dissolved in 400 ml of distilled water and with 1 molar sodium hydroxide solution a pH of 9.5 is set.
  • a total of 14.7 g (36.5 mmol) of DTPA-ivlcnoa ⁇ hydrid-mono-ethyl ester is then added, the pH of the reaction solution being constant at 9.5 by adding 1 molar sodium hydroxide solution is held.
  • the mixture is stirred for a further 15 minutes at room temperature and then the pH of the reaction solution is adjusted to 11.5 by adding 32% sodium hydroxide solution. After a reaction time of 12 hours at room temperature, make up to a total volume of 800 ml with distilled water.
  • the aqueous product solution thus obtained is ultrafiltered three times using YM3 ultrafiltration membrane (AMICON®) against distilled water. The remaining residue is made up to a volume of 500 ml with deionized water and the aqueous product solution is freeze-dried. Yield: 11.2 g (89.3% of theory; based on the polyamine used) as an amorphous powder Water content: 9.41%
  • the ninhydrin reaction as well as the TNBS determination of the title compound are negative, ie there are no free amino functions in the polymer.
  • the percentage sulfur value of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 67.4% sialyl -Le x units (corresponding to 8 sialyl -Le x residues per molecule).
  • Example 40 1 mg of the title compound from Example 39c) are dissolved in 2 ml of sodium citrate buffer (pH 5.3) and a solution of 11 l of indium chloride, which has an initial activity of 20.1 MBq, is added at room temperature. , After a stirring time of 15 minutes at room temperature, the reaction solution is adjusted to pH 7.2 with 1 molar sodium hydroxide solution and then sterile filtered. The solution prepared in this way can be used directly for the corresponding radiodiagnostic purposes.
  • sodium citrate buffer pH 5.3
  • 11 l of indium chloride which has an initial activity of 20.1 MBq
  • Both the ninhydrin reaction and the TNBS determination of the title compound are negative, ie there are no longer any free amino functions in the polymer.
  • the percentage sulfur content of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 67.3% D-mannose (corresponding to 8 mannose residues per molecule).
  • the colorimetric phenol-sulfuric acid determination to determine the mean pyranose loading level of the conjugate provides a loading level of 8 ⁇ -D-mannose residues per molecule and is therefore identical to the loading level (8 D-mannose residues per molecule), which by the percentage sulfur value of the elementary analysis was determined.
  • Example 40a In an analogous manner to that described for the synthesis of the titite compound from Example 39d), the title compound from Example 40a) is complexed with 1 1 ' ' indium chloride (as a solution with a specific initial activity of 19.83 MBq). After sterile filtration, a preparation is obtained which can be used directly for the corresponding radio diagnostic purposes.
  • the aqueous product solution thus obtained is made up to a total volume of 300 ml by adding water and ultrafiltered three times by means of a YM3 ultrafiltration membrane (AMICON®) against distilled water.
  • the remaining residue is made up to a volume of 300 ml with deionized water and a pH of 10.0 is set by adding 15% sodium hydroxide solution.
  • the basic product solution is ultrafiltered again twice and the remaining residue, after filling up with distilled water to a total volume of 500 ml, freeze-dried.
  • 1.42 g (82.8% of theory) of the title compound are obtained as amorphous lyophilisate in the form of the free polyamine.
  • Water content 5.37%
  • Elemental analysis (calculated on anhydrous substance): calc .: C 51, 94 H 7.83 N 17.92 S 3.77 Na 4.32 found: C 51, 89 H 7.80 N 18.01 S 3.69 Na 4.28
  • the title compound is free of fluoride ions.
  • the title compound shows a negative ninhydrin reaction.
  • An average degree of loading of the polymer with 13 D-galactose residues per molecule results from the percentage sulfur value of the elemental analysis.
  • the average degree of loading of the polymer of the above-mentioned title compound was determined from the molar element ratios of sulfur to gadolinium to 11 Gd-Gly-Me-DOTA units and 13 ⁇ -D-glucopyranosyl residues, which was very good with the loading levels of the title compound determined on the precursors correlated.
  • the ninhydrin reaction as well as the TNBS determination of the title compound are negative, i. H. there are no longer any free amino functions in the polymer.
  • the percentage sulfur of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer of 55.2% D-galactose (corresponding to 13 galactose residues per molecule), while the percentage of ytterbium results in a degree of loading of the polymer with ytterbium DTPA of 44.8% ( corresponding to 11 Yb-DTPA units per molecule).
  • the colorimetric determination of phenol-sulfuric acid [Dubois et al., Anal. Chem. 1956, 28, 3, 350; Koch et al., Cereal Chem.
  • the molar elemental ratio of dysprosium to sulfur thus results in an average degree of loading of the polymer of 46.2% Gd-DPTA and 53.8% D-mannose (corresponding to 11 Dy-DTPA units and 13 D-mannose residues per molecule) .
  • the qualitative ninhydrin reaction as well as the TNBS determination of the title compound are negative, i. H. there are no longer any free amino functions in the polymer.
  • the coiorimetric phenol-sulfuric acid determination, as well as the quantitative carbohydrate determination method according to Nelson and Somogyi for determining the average pyranose loading level of the polyamine gives a loading level of 32.68 D-mannose residues per molecule and is therefore identical to the loading level, which is caused by the percentage element ratios was determined.
  • the ninhydrin reaction as well as the TNBS determination of the title compound are negative, i. H. there are no longer any free amino functions in the polymer.
  • the percentage sulfur of the elemental analysis of the title compound gives a degree of loading of the polymer with 53.8% N-acetylglucosamine (corresponding to 13 N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine residues per molecule), while the percentage of manganese indicates a degree of loading of the polymer with manganese - DTPA of 46.0% results (corresponding to 11 Mn-DTPA units per molecule).
  • the molar element ratios of europium to sulfur thus result in an average degree of loading of the polymer of 45% Eu-DTPA units and 55% ß-D-glucose residues (corresponding to 11 DTPA units and 13 ß-D-glucose units per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of a ninhydrin reaction.
  • the qualitative ninhydrin reaction as well as the TNBS determination of the title compound are negative, i. H. there are no longer any free amino functions in the polymer.
  • the colorimetric phenol-sulfuric acid determination, as well as the quantitative carbohydrate determination method according to Nelson and Somogyi for determining the mean pyranose loading level of the conjugate results in an average loading level of 13 D-glucose residues per molecule and is therefore identical to the loading level, which is determined by the percentage element ratios was determined.
  • N N'-dicyclohexylcarbodiimide
  • the temperature is preactivated for 60 minutes.
  • a solution of 1.39 g (0.5 mmol) of the 24-mer polyamine based on the N, N, N ', N', N ", N is added to the N-hydroxysuccinimide ester solution thus prepared "-Hexakis [2nd (trilysylamino) ethyl] trimesic acid triamide and 7.28 g (72 mmol) triethylamine in 10 ml water and stirred overnight at room temperature.
  • N, N'-dicyclohexylcarbodiimide are added and the mixture is preactivated for 60 minutes.
  • a solution of 1 39 g (0.5 mmol) of the 24mer-polyamine based on N, N, N, N ', N ", N" -Hexakis [ 2. (trilysyl-amino) -ethyl] -trimesic acid triamide and 7.28 g (72 mmol) of triethylamine in 10 ml of water and stir overnight at room temperature.
  • N, N'-dicyclohexylcarbodiimide After cooling to room temperature, 14.86 g (72 mmol) of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide are added and the mixture is preactivated for 60 minutes. A solution of i, 39 g (0.5 mmol) of the 24-mer polyamine based on the N, N, N ', N', N ", N” - is added to the N-hydroxysuccinimide ester solution thus prepared. Hexakis [2. (trilysylamino) ethyl] trimesic acid triamide and 7.28 g (72 mmol) triethylamine in 10 ml water and stirred overnight at room temperature.
  • 1,2-dichloroethane is added at -10 ° C to 50 ml of trifluoroacetic acid and stirred for 2 hours at this temperature. Then one hour at 0 ° C
  • N-hydroxysuccinimide ester solution To the thus prepared N-hydroxysuccinimide ester solution was added a solution of 1, 386 g (0.5 mmol) of the 24mer-polyamine based on N, N, N, N, N ", N” -Hexakis [ 2. (trilysylamino) ethyl] trimesic acid triamids and 7.28 g (72 mmol) triethylamine in 10 ml water and stirred overnight at room temperature.
  • the suspension obtained is filtered and then sufficient acetone is added until precipitation is complete, the precipitate is filtered off with suction, dried, taken up in water, filtered off from the insoluble dicyclohexylurea and the filtrate is desalted via an AMICON® YM-3 ultrafiltration membrane (cut off 3000 Da) and then low molecular components cleaned. The retentate is then freeze-dried.
  • N, N'-dicyclohexylcarbodiimide are added and the mixture is preactivated for 60 minutes.
  • the suspension obtained in this way is filtered and then sufficient acetone is added until precipitation is complete, the precipitate is filtered off with suction, dried, taken up in water, filtered off from the insoluble dicyclohexylurea and the filtrate is desalted via an AMICON® YM-3 ultrafiltration membrane (cut off 3000 Da) and cleaned of low molecular components. The retentate is then freeze-dried.
  • the solvent is removed in vacuo and the remaining residue is mixed with dichloromethane (250 ml) and 1N hydrochloric acid (100 ml). After the organic product phase has been separated off, it is washed twice with 75 ml of water each time and dried over sodium sulfate. The desiccant is filtered off and the solvent is removed in vacuo. Crystallization from diethyl ether / pentane (1:10) yields 13.86 g (92.4% of theory) of the title compound as a colorless and crystalline solid.
  • the aqueous product solution is washed twice with Weil extracted 60 ml of diethyl ether and then brought to pH 3.0 by adding 10% hydrochloric acid. It is made up to a total volume of 800 ml with water and ultrafiltered three times using a YM3 ultrafiltration membrane (AMICON ®) against distilled water. The remaining residue is made up to a volume of 500 ml with deionized water and freeze-dried.
  • AMICON ® YM3 ultrafiltration membrane
  • the molar element ratio of sulfur to gadolinium thus results in an average degree of loading of the polymer of 45.2% Gd-Gly-Me-DOTA and 54.8% lactose (corresponding to 11 Gd-Gly-Me-DOTA units and 13-D - Lactose residues per molecule). No free amino functions can be detected in the title compound by means of a ninhydrin reaction.
  • the aqueous product solution is extracted twice with 60 ml of diethyl ether and then brought to pH 3.0 by adding 10% hydrochloric acid. It gets on with water
  • the total volume of 800 ml was filled up and ultrafiltered three times using a YM3 ultrafiltration membrane (AMICON ®) against distilled water.
  • the remaining residue is made up to a volume of 500 ml with deionized water and freeze-dried. Water content: 9.30%
  • the aqueous product solution is extracted twice with 60 ml of diethyl ether each and then brought to pH 3.0 by adding 10% hydrochloric acid, made up to a total volume of 800 ml with water and ultrafiltered three times using a YM3 ultrafiltration membrane (AMICON ®) against distilled water . After another ultrafiltration, the remaining residue is made up to a volume of 500 ml with deionized water and freeze-dried. It is then taken up in 300 ml of water and the pH of the resulting product solution is adjusted to 7.2 by adding 1 molar sodium hydroxide solution. Yield - 2.80 g (81.3% of theory) as an amorphous and colorless powder.
  • the ninhydrin reaction of the title compound is negative, i. H. free amino functions are no longer detectable in the polymer.
  • the molar elemental ratios of sulfur to gadolinium thus result in an average degree of loading of the polymer of 45.2% Gd-DTPA and 54.8% D-mannose (corresponding to 11 Gd-DTPA units and 13-D-mannose residues per molecule ). No free amino functions can be detected in the title compound by ninhydrin reaction.
  • Example 56d In an analogous manner as described for Example 56d), the complexation of 2.0 g (0.180 mmol; corresponding to 1.97 mmol of DTPA) of the title compound from Example 57b) with 525 mg (2.00 mmol) of gadolinium chloride, dissolved in 10 ml of distilled water to form the above title compound. Yield: 2.14 g (98.4% of theory) of the title compound as a colorless and amorphous powder. Water content: 7.22%

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Abstract

Konjugate bestehend aus einem aminogruppen-enthaltenden Polymeren, Metallion(en) enthaltenden signalgebenden Gruppe(n) und Mono- oder Oligosacchariden sowie gegebenenfalls Kationen anorganischer und/oder organischer Basen, Aminosäuren oder Aminosäureamide sind wertvolle Verbindungen für die Diagnostik und Therapie.

Description

Saccharid-Konjugate, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand, das heißt Konjugate bestehend aus einem aminogruppen-enthaltenden Polymeren, Metallion(en) enthaltenden signalgebenden Gruppe(n) und Mono- oder Oligosacchariden sowie gegebenenfalls Kationen anorganischer und/oder organischer Basen, Aminosäuren oder Aminosäureamide, diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel, ihre Verwendung in der Diagnostik sowie Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und Mittel.
Lymphknotenmetastasen werden in ca. 50-70 % der Patienten mit malignen Tumoren gefunden (Elke, M. Lymphknotenerkrankungen. In: W. Frommhold, H.- S. Stender and P. Thurn (eds.), Radiologische Diagnostik in Klinik und Praxis, 7th edition, Vol. IV, pp. 475-512, Stuttgart-New York: Georg Thieme Verlag, 1984). Die Beteiligung von Lymphknoten an einer malignen Erkrankung hat bedeutenden Einfluß auf die einzuleitenden Therapiemaßnahmen. Die möglichst frühe und möglichst genaue Diagnose eines Lymphknotenbefalls ist daher für den Patienten von größter Bedeutung.
Die kontrastmittelunterstützte Lymphographie hat in der medizinischen Praxis jedoch bisher nur unbefriedigende Ergebnisse geliefert. Röntgenuntersuchun- gen mit iodierten Ölen, z.B. mit iodierten Fettsäureestern des Mohnöls, zeigen einerseits zwar gute Speicherfähigkeiten in den Lymphknoten und eine brauchbare Kontrastwirkung, sind aber andererseits aufgrund ihrer bekannten Nebenwirkungen (Keinert, K., Köhler, K., and Platzbecker, H., Komplikationen und Kontraindikationen. In: M. Lüning, M. Wiljasalo, and H. Weissleder (eds.), Lymphographie bei malignen Tumoren, pp. 40-50. Stuttgart: Georg Thieme Verlag, 1976) weder allgemein noch problemlos anwendbar. Sie können, insbesondere bei zu schneller Applikation, im Hinblick auf die leichte Verletzlichkeit der Lymphgefäße Läsionen begünstigen. Eine Reihe von Nachteilen sind im Öl- charakter dieser Kontrastmittel begründet. Da die Suspendierung des Öls erst im Blut erfolgt, ist die Größe der öltröpfchen nicht im voraus bestimmbar. Fallen die öltröpfchen zu groß aus, sind häufig Mikroembolien, z.B. in der Lunge, unvermeidbar. Da die Aufnahme der großen Öltröpfchen aus dem interstitiellen Raum in die Lymphkapillaren kaum möglich ist, gelingt eine Darstellung der Lymphgefäße und Lymphknoten, beispielsweise nach subkutaner oder intra- parenchymatöser Injektion, nur in Ausnahmefällen.
Der letztgenannte Nachteil ist nur durch endoiymphatische Applikation zu überwinden, wobei jedoch eine ebenfalls nicht komplikationslose vorherige Farbstoffmarkierung und operative Freilegung der Lymphgefäße unter Lokalanästhesie in Kauf genommen werden muß. Ein weiterer Nachteil ist darin zu sehen, daß die Kontrastmittel auf Basis iodierter Öle nach erfolgter Applikation nur sehr langsam wieder ausgeschieden werden. In Abhängikeit von der Zube- reitungsform beträgt die Ausscheidungszeit Wochen bis Monate.
Durch Emulgieren der iodierten Öle hat man versucht, die aufgezeigten Nachteile zu überwinden. Dadurch wurde erreicht, die Viskosität und Tröpfchengröße zu verringern. Auf diese Weise konnte die Kapillarpassage verbessert und bei Stabilität der Emulsion das Embolisationsrisiko gesenkt werden. Diese Teilerfolge konnten jedoch nur durch andere Nachteile erkauft werden. Beispielsweise genannt seien in diesem Zusammenhang die effektive Reduktion des lodgehalts pro ml Kontrastmittel und damit verbunden unausbleiblicher Kon- trastveriust, größere Lokaltoxizität am Lymphknoten, hepatotoxische Effekte und histologisch nachweisbare Fremdkörperreaktion, die durch beigefügte Emulgatoren verstärkt werden.
Alle Kontrastmittel auf Basis iodierter Öle sind wenig stabil und aufgrund der dargestellten Nebenwirkungen nur begrenzt anwendbar. Auch die in der EP 0 022 056 als Lymphographika vorgeschlagenen Derivate der triiodierten 5- Aminoisophthalsäure haben in der medizinischen Praxis die in sie gesetzten Erwartungen nicht erfüllt, weil sie nach Applikation wieder aus dem Lymphgefäßsystem hinausdiffundieren. Aufgrund ihrer mangelhaften Speicherfähigkeit in den Lymphknoten sind diese wässrigen Zubereitungsformen bestenfalls be- grenzt für die periphere Lymphographie geeignet.
Wasserlösliche iodierte Röntgenkontrastmittel wie lotrolan (Isovist®) haben für die Darstellung des lymphatischen Systems nur einen eingeschränkten Anwendungsbereich. Mittels Infusion in den interstitiellen Raum (intrakutan, subkutan bzw. intramuskulär) werden ebenfalls nur die im Einzugsbereich der Infusionsstelle befindlichen Lymphgefäße bzw. -knoten kontrastreich dargestellt. Die hochwasserlöslichen, niedermolekularen Substanzen diffundieren anschließend aus den Lymphgefäßen in das Interstitium. Dieser Nachteil kann auch nicht durch die empfindliche Methode der Computertomographie kompensiert werden.
In der Nuklearmedizin werden radioaktive 99mTc-Tracer für die indirekte Lymph- knoten-Darsteilung eingesetzt. Neben der limitierten räumlichen Auflösung gelten auch hier die Nachteile, daß nur die die Injektionsstelle versorgenden Lymphbahnen dargestellt werden.
Als Lymphographika für die Kernresonanztomographie sind auch superpara- magnetische Eisenoxidpartikel, z.B. AMI-227, vorgeschlagen worden
(Guimaraes, R., Clement, O., Bittoun, J., Carnot, f., and Frija, G. MR lympho- graphy with superparamagnetic iron nanoparticles in rats: pathologic basis for contrast enhancement. Am. J. Roentgenol., 162. 201-207, 1994). Die bisher am Tier gewonnenen Untersuchungsergebnisse weisen jedoch auf e;ne unbe'riedi- gende Bildgebung trotz hoher Dosierung der Partikel hin.
Verschiedene als Lymphographika vorgeschlagene Verbindungen (Hanka, L. et al., Radiology 1996, 198. 365-370) zeigen eine derartige Tierspezifität (Ratte vs. Meerschweinchen und Kaninchen), daß ihre Weiterentwicklung eingestellt wer- den mußte.
Es bestand daher weiterhin die Aufgabe, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die sich nach parenteraler Applikation im Lymphgewebe anreichern und die oben genannten Nachteile nicht besitzen, z.B. gegenüber den bekannten Strukturen einen günstigeren Sicherheitsabstand zwischen diagnostischer und letaler Dosis ("margin of safety") aufweisen. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Konjugate bestehend aus ei- nem aminogruppen-enthaltenden Polymeren, Metallion(en) enthaltenden signalgebenden Gruppe(n) und Mono- oder Oligosaccharide sowie gegebenenfalls Kationen anorganischer und/oder organischer Basen, Aminosäuren oder Aminosäureamide sich überraschenderweise hervorragend zur Herstellung von NMR-Diagnostika, insbesondere für die Lymphographie eignen.
So weisen sie überraschenderweise folgende Vorteile auf:
eine für eine gute Bildgebung ausreichende Anreicherung im Lymph- System, eine hohe Verträglichkeit (LD50), eine geringe Ausscheidungszeit (sie werden in der Regel innerhalb von 14 Tagen zu mehr als 98 % aus dem Körper ausgeschieden), - ihre hohe Relaxivität erlaubt es, sie in geringer Dosierung zu applizieren, sie ermöglichen oft sogar eine morphologische Differenzierung des Lymphknotengewebes, sie zeigen keine abweichenden Tierspezifitäten.
Die erfindungsgemäßen Konjugate lassen sich durch die allgemeine Formel I beschreiben:
P (K)m (L-Z)n (I),
worin
P für ein k Aminogruppen - von denen (n + m) jeweils um ein Wasserstoff- atom vermindert sind - enthaltendes Polymer, wobei (n + m) < k sein soll, n und m jeweils für die ganzen Zahlen 1 - 149, k für die Zahlen 12 bis 150,
K für eine Metallion(en) enthaltende signalgebende Gruppe,
L für einen Linker und
Z für ein um eine Hydroxylgruppe vermindertes Mono- oder Oligosaccharid stehen.
Das für P stehende, k Aminogruppen enthaltende, von denen (n + m) jeweils um ein Wasserstoffatom vermindert sind, Polymer ist ein Dendrimer (z.B. WO 96/01655, EP 0271180), Polylysin (z.B. EP 0331616), Polypeptid, Poly- alkylamin, Poly[N-(2-aminoethyl)]methacrylamid (z.B. US-5,364,613) oder Poly- saccharid (z.B. EP 0535668). Bevorzugt ist die Summe (n + m) der signalgebenden Gruppen (K) und der über L gebundenen jeweils um eine Hydroxylgruppe verminderten Mono- oder Polysaccharide (Z) gleich der Anzahl k der im Polymeren enthaltenen Aminogruppen, d.h .es liegt eine vollständige Besetzung der in P enthaltenen Aminogruppen vor. Die Polymere enthalten bevorzugt 12, 24, 32, 36, 40, 48, 64 oder 80 Aminogruppen, von denen z.B. 3, 4, 6, 7, 8, 11 , 13, 14, 16, 18, 19, 21 , 47 an signalgebende Gruppen K und z.B. 9, 8, 18, 17, 16, 13, 1-1 , 10, 20, 6, 29, 27, 33 an über L gebundene jeweils um eine Hydroxylgruppe verminderte Mono- oder Polysaccharide Z gebunden sind. Bei einer Unterbesetzung der Aminogruppen ist die Summe (n + m) bevorzugt > k - 4.
Die signalgebende Gruppe K ist ein Chelatkomplex bestehend aus einem Rest der allgemeinen Formel II, III, IV, V oder VI.
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000007_0003
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
worin
R1 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquivalent der Elemente der Odnungszahlen 20-32, 37 - 39, 42 - 44, 49 oder 57 - 83,
R2 ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten C1-C7- Alkylrest, einen Phenyl- oder Benzylrest,
V eine -CH2-(CH2)0-(O) gruppe
Figure imgf000008_0003
mit
o in der Bedeutung der Zahlen 0 - 10, p und I jeweils in der Bedeutung der Ziffern 0 oder 1 , mit der Maßgabe, daß p nur dann für die Ziffer 1 steht, wenn I die Ziffer 1 bedeutet, T1 eine -NHCS- oder -CO-gruppe,
U eine -CHR3-CONR3-M1-oder -CH2-CH(OH)-M2-gruppe mit R3 unabhängig voneinander in der Bedeutung von R2 oder der Gruppe -CH2-(CH2)0- COOH und M1 und M2 jeweils in der Bedeutung eines Phenylenrestes oder einer geradkettigen, verzweigten, gesättigten oder ungesättigten C1-C20-
Alkylenkette, die gegebenenfalls substituiert ist durch 1-5 (CH2)0-COOH, 1-5OR2-reste oder 1-8 Sauerstoffatome, 1-2-NH-, 1-2-C(=NH)-, 1-5- CONR3", 1-5-NR3CO-, 1-2 Phenylen- oder 1-2 Phenylenoxygruppen enthält, bedeuten, mit der Maßgabe, daß mindestens zwei der Rest R1 für Metallionenäquivalente der Elemente der oben genannten Ordnungszahlen stehen.
Ist die erfindungsgemäße Verbindung zur Anwendung in der NMR-Diagnostik bestimmt, so muß das Metallion der signalgebenden Gruppe paramagnetisch sein. Dies sind insbesondere die zwei- und dreiwertigen loreπ der Elemente der Ordnungszahlen 21 - 29, 42, 44 und 58 - 70. Geeignete Ionen sind beispielsweise das Chrom(lll)-, Eisen(ll)-, Kobalt(ll)-, Nickel(ll)-, Kupfer(ll)-, Praseo- dym(lll)-, Neodym(lll)-, Samarium(lll)- und Ytterbium(lll)-ion. Wegen ihres starken magnetischen Moments sind besonders bevorzugt Gadolini- um(lll)-, Terbium(lll)-, Dysprosium(lll)-, Holmium(lll)-, Erbium(lll)-, Eisen(lll)- und Mangan(ll)-ionen.
Für die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in der Nuklearmedizin muß das Metallion radioaktiv sein. Geeignet sind zum Beispiel Radio- isotope der Elemente Kupfer, Kobalt, Gallium, Germanium, Yttrium, Strontium, Technetium, Indium, Ytterbium, Gadolinium, Samarium, Iridium, Rhenium und Bismut; bevorzugt sind Technetium, Gallium, Indium und Rhenium.
Ist die erfindungsgemäße Verbindung zur Anwendung in der Röntgen-Diagno- stik bestimmt, so leitet sich das Metallion vorzugsweise von einem Element höherer Ordnungszahl ab, um eine ausreichende Absorption der Röntgenstrahlen zu erzielen. Es wurde gefunden, daß zu diesem Zweck diagnostische Mittel, die ein physiologisch verträgliches Komplexsalz mit Metallionen von Elementen der Ordnungszahlen 25 und 26 sowie 57 - 83 enthalten, geeignet sind.
Bevorzugt sind Mangan(ll)-, Eisen (II)-, Eisen(lll)-, Praseodym(lll)-, Neo- dym(lll)-7Samarium(lll)-, Gadolinium(lll)-, Ytterbium(lll)- oder Bismut(lll)-ionen, insbesondere Dysprosium(lll)-ionen. In R"1 gegebenenfalls vorhandene acide Wasserstoffatome, das heißt diejenigen, die nicht durch das Zentralion substituiert worden sind, können gegebenenfalls ganz oder teilweise durch Kationen anorganischer und/oder organi- scher Basen oder Aminosäuren oder Aminosäureamide ersetzt sein.
Geeignete anorganische Kationen sind beispielsweise das Lithiumion, das Kaliumion, das Calciumion und insbesondere das Natriumion. Geeignete Kationen organischer Basen sind unter anderem solche von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie zum Beispiel Ethanolamin, Diethanolamin, Morpho- lin, Glucamin, N,N-Dimethylglucamin und insbesondere N-Methylglucamin. Geeignete Kationen von Aminosäuren sind beispielsweise die des Lysins, des Ar- ginins und des Omithins sowie die Amide ansonsten saurer oder neutraler Aminosäuren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die ein Molekulargewicht von 5.000 - 200.000 D, vorzugsweise 15.000 - 60.000 D, besitzen, weisen die eingangs geschilderten gewünschten Eigenschaften auf. Sie enthalten die für ihre Verwendung benötigte große Anzahl von Metallionen im Komplex stabil gebunden.
Sie reichern sich im Lymphsystem an, erlauben Aussagen über die Perfusioπ von Geweben, geben die Möglichkeit, das Blutvolumen in Geweben zu bestimmen und die Relaxationszeiten bzw. Densitäten des Blutes selektiv zu verkürzen. Solche physiologischen Informationen sind nicht durch den Einsatz von extrazellulären Kontrastmitteln, wie z.B. Gd-DTPA [Magnevist®], zu erhalten. Aus diesen Gesichtspunkten ergeben sich auch die Einsatzgebiete bei den modernen bildgebenden Verfahren Kernspintomographie und Computertomographie: spezifischere Diagnose von metastasierenden, insbesondere malignen Tumoren und frühe Therapiekontrolle bei zytostatischer, aπtiphlogistischer oder vasodilatativer Therapie.
Die erfindungsgemäßen Saccharid-Polymer-Komplexe eignen sich hervorragend für die interstitielle und besonders für die i.v. Lymphographie.
Als weitere Vorteile gegenüber extrazellulären Kontrastmitteln, wie z.B. Gd- DTPA [Magnevist®], muß die höhere Effektivität als Kontrastmittel für die Kernspintomographie (höhere Relaxivität) hervorgehoben werden, was zu einer deutlichen Reduktion der diagnostisch notwendigen Dosis führt. Gleichzeitig _ _
können die erfindungsgemäßen Kontrastmittel als Lösungen isoosmolar zum Blut formuliert werden und verringern dadurch die osmotische Belastung des Körpers, was sich in einer verringerten Toxizität der Substanz (höhere toxische Schwelle) niederschlägt. Geringere Dosen und höhere toxische Schwelle führen zu einer signifikanten Erhöhung der Sicherheit von Kontrastmittelanwendungen bei modernen bildgebenden Verfahren.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß nunmehr Komplexe mit hydrophilen oder lipophilen, makrocyclischen oder offenkettigen, nie- dermolekularen oder hochmolekularen Liganden zugänglich geworden sind. Dadurch ist die Möglichkeit gegeben, Verträglichkeit und Pharmakokinetik dieser Polymer-Komplexe durch chemische Substitution zu steuern.
Bevorzugte Substituenten für R2 sind das Wasserstoffatom, die Methyl-, Isc- propyl-, Phenyl- und Benzylgruppe. Als für V stehende bevorzugte Gruppen seien beispielhaft genannt die CH2C6H4-, CH2-O-C6H4-, (CH2)4-, (CH2)6- und (CH2)ι o-Gruppe, wobei die C6H4-gruppe an T^ gebunden ist.
Bevorzugte Substituenten für R3 sind das Wasserstoffatom, die Methyl-, CH2COOH- und (CH2)2COOH-Gruppe.
Als Gruppen M1 seien beispielhaft genannt
α-(CH2)i-i o-ß, α-CH(CH3)-ß,
α-CH[CH2CH(CH3)2]-ß, -CH-(C6H5)-ß
Figure imgf000011_0001
α -CH2-CH2-0- Vθ-CH2-ß,
Figure imgf000011_0003
Figure imgf000011_0002
α-CH2-CH2-O-CH2-ß, α-(CH2)2-3-(OCH2CH2)l -5-0-(CH2)2-3-ß, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-ß) α-CH
Figure imgf000012_0001
wobei α die Verknüpfungsstelle an den Rest-CONR3 und ß die Verknüpfungsstelle an T1 angibt.
Bevorzugt sind die Gruppen:
Figure imgf000012_0002
CH2COOH
α CH-CH2- ß, α-CH2-CH2-O-CH2-ß, α-(CH2)i-2-CO-N-CH2-ß,
CH2COOH
α-CH2-CH2-CO-NH(CH2)6-ß- α-(CH2)5-ß,
Als Gruppen M2 seien beispielhaft genannt:
α — (CH2)1.10-ß, α α -CH; -ß,
Figure imgf000012_0003
Figure imgf000012_0004
SO3H α- CH2-O 0-CH2-ß, α - ß, α -CH.-NHCO^CH^.^-ß,
wobei α die Verknüpfungsstelle an den Rest-CH(OH)- und ß die Verknüpfungsstelle an Tl angibt. Bevorzugt sind die Gruppen:
α -CH2-ß,
CH2COOH
α
Figure imgf000013_0001
α -CH2-NHCO-(CH2), ,-ß
α— CH — 0 ß -α— CH2-NHCO-CH2-O-CH2 — ß. a (CH2)g— ß
Besonders bevorzugt ist die Gruppe:
Figure imgf000013_0002
Als Gruppen Z seien für die Monosaccharide die jeweils um eine Hydroxylgruppe verminderten Hexosen, Pentosen und N-Acetyl-neuraminsäure, die jeweils in der Pyranose- oder Furanose-Form vorliegen, sowie deren Derivate genannt. Bevorzugt sind Hexosen, die in der Pyranose-Form vorliegen, wie z.B. D-Ga- lactose, D-Mannose, D-Glucose, L-Fucose, Galactose-6-sulfat, Mannose-6-sul- fat, D-Glucosamin-6-sulfat, D-Glucosamin-3,4,6-trisulfat und N-Acetyl- glucosamin. Als bevorzugte Monosaccharide seien beispielhaft die N-Acetyl-2- amino-2-deoxy-D-glucose, -D-Galactose und D-Mannose, die 6-Deoxy-L-Ga- lactose sowie N-Acetyl-neuraminsäure aufgeführt. Steht Z für Oligosaccharide, so können diese linear oder verzweigt aus den oben genannten Monosacchari- den aufgebaut sein, wobei die Verknüpfung terminal oder innerhalb der Kette erfolgt sein kann. Als Oligosaccharide seien beispielhaft genannt: Sialyl-Lewisx (s. z.B. H. Ohmoto et al, J. Med. Chem. 1996, 29, 1339); Desoxy-Sialyl-Lewisx (s. z.B. W. Stahl et al, Angew. Chemie 1994, 1ß6_, 2186); Sialyl-Lex (s. z.B. W. Stahl, J.~prak. Chemie 1995, 332, 441); Gentiobiose (Fluka Chemie AG,
Schweiz); Lactose; Maltose; Lactulose (Fluka Chemie AG, Schweiz); LactNAc; α N,N,,N"-Triacetyichitotriose; Gal(1 —+ 4)Gal, N,N'-Diacetylchitobiose;
N,N',N",N",-Tetraacetylchitotetraose; Maltotriose; Digalacturonsäure; Trigalactu- ronsäure (Carbohydrates International AB, Schweden).
Bevorzugt erfolgt die Bindung des Polymeren (über den Linker L) an die Mono- oder Polysaccharide über die C-2-Position, besonders bevorzugt über die C-1- Position der Zucker.
Der Linker L, über den die jeweils um eine Hydroxylgruppe verminderten Mono- oder Oligosacchaide an P gebunden sind, wird durch die Gruppe T2-M3-X beschrieben, wobei M3 für eine direkte Bindung steht oder die für M^ angegebene Bedeutung hat, T2 für eine -NHCS-, -C(=NH)-, -CH2- oder CO-gruppe steht und an P bindet, X für NH, CO, O und S steht und an Z bindet. Als M3 seien beispielsweise die Gruppen
τ-(CH2)l-l5 - δ,
γ-(CH2CH2O) .5-CH2-δ
Figure imgf000014_0001
γ -(CH2)1 Ϊ ,
Figure imgf000014_0002
γ-CH2-(C=NH)-δ, γ-C (=NH)-NH-(CH2)3-δ,
γ-NHCO-(CH2)2-δ, γ-CH2CH2-O-CH2CH2-δ, γ-CH2CH2-S-CH2CH2-δ,
γ -OCH2- δ, γ -NH-CH(CH2— < % ) ■
genannt, wobei γ die Verknüpfungsstelle an X und δ die Verknüpfungsstelle an T2 angibt. Bevorzugt steht M3 für eine direkte Bindung und für die Gruppen
Figure imgf000015_0001
Y — (CH2CH20)M- CH^CH^-δ,
J— (CH2)2-CONH-(CH2)6-δ,
CH(OH)CH,OH I — CH-CH(OH)-CH(OH)-δ, γ-(CH2)2-CO-(CH2)3-δ
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate der allgemeinen Formel I erfolgt in an sich bekannter Weise, daß
a) ein Polymer-Komplex(bildner)-Konjugat der allgemeinen Formel VII
P(K')m (VII), worin K' für einen Rest der allgemeinen Formel II'. III', IV, V oder VI*
R O
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000015_0003
(ii )-
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
(V)
Figure imgf000016_0003
(VI')
worin
R1' unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine Säureschutzgruppe oder ein Metallionenäquivalent der Elemente der Ordnungszahlen 20-29,
39, 42, 44 oder 57-83 steht und
R2, V, o, p, T und U die oben genannte Bedeutung haben, mit n' Mono- oder Oligosacchariden der allgemeinen Formel VIII
L*-Z' (VIII), _ _
L*-Z' (VIII),
worin n' = 1 - 3 n,
Z' die für Z genannte Bedeutung hat, wobei jedoch die in Z gegebenenfalls enthaltenen Carboxy-, Amino- und Hydroxygruppen gegebenenfalls geschützt sind, L* für eine Gruppe T2'-M3'-X mit T2' in der Bedeutung von -NCS, -C(=NH)OCH3,- CHO, einer -CO-Fg-gruppe wobei
Figure imgf000017_0001
-O-CO-R4 mit R4 in der Bedeutung einer geradkettigen oder verzweigten C-|-C7-Alkylkette,
M3' die für M3 angegebene Bedeutung hat, wobei jedoch die in M3 gegebenenfalls enthaltenen Carboxygruppen gegebenenfalls geschützt sind, und X für NH, CO, O und S steht, oder
b) ein Polymersaccharid-Konjugat der allgemeinen Formel IX
P(L'-Z,)n (IX),
worin
L' die für L genannte Bedeutung hat, wobei jedoch die in L gegebenenfalls enthaltenen Carboxygruppen gegebenenfalls geschützt sind und P, Z und n die oben genannte Bedeutung haben, mit m' Komplexen oder Komplexbildnern K*, wobei m' = 1 - 3 m ist und K* für Verbindungen der allgemeinen Formeln Fg— OC^ / — \ / — ^-COOR1 N N N R^OC-7 l ^-COOR1'
COOR1'
(II"),
RrOOC / — \ r Λ COOR1'
N N N
ROOC COOR1'
C=O
Fg
I"),
Figure imgf000018_0001
(IV),
Figure imgf000018_0002
(V)
Figure imgf000019_0001
(VI")
Figure imgf000019_0002
worin
R1'' R2, V, U und Fg die oben genannte Bedeutung haben, und T1 ' für -NCS, -CO-Fg, -C(=NH)OCH3 oder -CHO steht oder
c) ein Polymer der allgemeinen Formel X
P-(H)k (X),
worin P und k die oben angegebenen Bedeutungen haben, in einer Eintopfreaktion mit n' Mono- oder Oligosacchariden der allgemeinen Formel VIII
L*-Z' (VIII), worin
L* und Z' die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit m' Komplexen oder Komplexbildnern K*. wobei K* für Verbindungen der allgemeinen Formeln
Fg— OC ^ / — \ / — \ r COOR1' N N N RrOOC ^ l ^ COOR1
COOR1
(H"),
Figure imgf000020_0001
i
Fg (III"),
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
(VI")
Figure imgf000021_0002
worin m', R1', R2, V, T"1', und Fg die oben genannte Bedeutung haben, umgesetzt wird, wobei die gegebenenfalls notwendige Metallioneneinführung vor oder nach der gegebenenfalls notwendigen Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt, mit der Maßgabe, daß, falls R1' für Schutzgruppen steht, diese vor der Metallioneneinführung abzuspalten sind.
Falls Rl' für eine Säureschutzgruppe steht bzw. falls die in U, M3' und Z' enthaltenen Caboxygruppen geschützt sind, kommen niedere Alkyl-, Aryl- und Aralkylgruppen, beispielsweise die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Phenyl-, Ben- zyl-, Diphenylmethyl-, Triphenylmethyl-, bis-(p-Nitrophenyl)-methylgruppe, sowie Trialkylsilylgruppen in Frage.
Die gegebenenfalls gewünschte Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Verfahren (s. z.B. E.Wünsch, Methoden der Org. Chemie, Houben-Weyl, Bd XV/1. 4. Auflage 1974, S. 315), beispielsweise durch Hydrolyse, Hydrogenolyse, alkalische Verseifung der Ester mit Alkali in wäßrig-alkoholischer Lösung bei Temperaturen von 0 °C bis 50 °C, saure Verseifung mit Mineralsäuren oder im Fall von tert.-Butylestem mit Hilfe von Tri- fluoressigsäure. Als Hydroxyschutzgruppen kommen z.B. die Benzyl-, 4-Methoxybenzyi-, 4-Ni- trobenzyl-, Trityl-, Diphenylmethyl-, Trimethylsiiyl-, Dimethyl-t-butyl-silyl-, Di- phenyl-t-butysilylgruppe in Frage. Als Schutzgruppe für die 1-OH-Gruppe der Mono- und/oder Oligosaccharide ist auch die Methylgruppe geeignet.
Die Hydroxygruppen können auch z.B. als THP-Ether, Alkylether, α-AI- koxyethylether, MEM- und MOM-Ether oder als Ester mit aromatischen oder ali- phatischen Carbonsäuren, wie z.B. Essigsäure und Chloressigsäure, Benzoe- säure.Levulinsäure oder 2-Chloracetoxymethyl (bzw. ethyl)benzoesäure (GIT Fachz. Lab. 1996, 46) vorliegen. Im Falle von Polyolen können die Hydroxygruppen auch in Form von Ketalen mit z.B. Aceton, Acetaldehyd, Cyclohexanon oder Benzaldehyd geschützt sein.
Bei gleichzeitigem Vorliegen von Carbcxylgruppen können 'rydroxygπ DDen auch durch intramolekulare Veresterung zu den entsprechenden Lactonen geschützt vorliegen.
Die Hydroxyschutzgruppen können nach den dem Fachmann bekannten Literaturmethoden, z.B. durch Hydrogenolyse, reduktive Spaltung mit Lithi- um/Ammoniak, Säurebehandlung der Ether und Ketale oder Alkalibehandlung der Ester freigesetzt werden (siehe z.B. "Protective Groups in Organic Synthe- sis", T.W. Greene, John Wiley and Sons 1981).
Als Aminschutzgruppen seien die dem Fachmann geläufigen Benzyloxycar- bonyl-, tertiär-Butoxycarbonyi-, Trifluoracetyl-, Fluorenylmethoxycarbonyl-, Benzyl-, Formyl-, 4-Methoxybenzyl-, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl-, Phthaloyl-, 1 ,2- Oxazolin-, Tosyl-, Dithiasuccinoyl-, Allyloxycabonyl-, Sulfat-, Pent-4-encarbonyl-, 2-Chloracetoxymethyl (bzw.-ethyl) benzoyl-, Tetrachlorphthaloyl-, Alkyloxycar- bonyl-gruppen [Th. W. Greene, P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Syntheses, 2nd ed, John Wiley and Sons (1991), S. 309 - 385, E. Meinjohanns et al, J. Chem. Soc. Pekin Trans 1 , 1995, 405; U. Ellensik et al, Carbohydrate Research 280, 1996, 251 ; R. Madsen et al, J. Org. Chem. 60, 1995, 7920, R.R. Schmidt, Tetrahedron Letters 1995, 5343].
Die unter a) angegebene Umsetzung erfolgt nach den dem Fachmann geläufigen Methoden wie sie z.B. in P. Erbacher et al, Bioconjugate Chem. 1995, 6, 401 ; G. Molema et al, J. Med. Chem. 1991 , 34, 1137; J.L Montero et al, Bull. Soc. Chim. France, 1994, 131. 854; P. Midoux et al, Nucleic Acids Research 1993, 21, 871 ; M. Andersson et al, Bioconjugate Chem. 1993, 4, 246; R. Roy et al, Tetrahedron Letters 1995, 36 4377; U.K. Saha et al, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1995, 2571 ; C.R. McBroom et al, Methods Enzymol. 1972, 28, 212 be- schrieben werden. Sie wird in Lösungsmitteln wie z.B. Wasser, Methylenchlorid, Acetonit l, Chloroform, DMSO, Pyridin, Ethanol/Wasser, Ethanol/Acetonitril, Di- oxan, DMF, THF, niedere Alkohole, Tetramethylharnstoff, N-Methylpyrrolidon, Polyethylengiykole, 12-Dimethoxyethan, Dimethylacetamid, 1 ,2-Dichlorethan oder - falls möglich - deren Mischungen mit Wasser bei Temperaturen von -10 ° C bis 100 °C, bevorzugt 0 bis 50 °C, besonders bevorzugt bei Raumtemperatur innerhalb von 5 Minuten bis 72 Stunden, bevorzugt 1 bis 24 Stunden, besonders bevorzugt 1 bis 14 Stunden, gegebenenfalls unter Zusatz einer organischen oder anorganischen Base, wie z.B. aromatischen oder aliphatischen Aminen, Alkali- oder Erdalkali-hydroxiden, -carbonaten oder -hydrogencarbona- ten und quartären Ammoniumhydroxiden durchgeführt. Beispielhaft genannt seien Thethylamin, Di-isopropyl-N-ethylamin (Hünig-Base), N-Methylmorpholin, Tributylamin, Tetramethylethylendiamin, Pyridin, Lutedin, 2,4,6-Trimethylpyridin, 4-Dimethylaminopyridin, N-Methylimidazol, Tetramethylguanidin, DBU, Lithium-, Natrium-, Kalium, Calcium, Magnesium-, Barium-hydroxid, -carbonat, -hydro- gencarbonat. Die Umsetzung kann auch in den dem Fachmann bekannten
Pufferlösungen, vorzugsweise bei pH 8 bis 11 , besonders bevorzugt bei pH 8,5 bis 9 erfolgen. Die pH-Wert-Einhaltung erfolgt bevorzugt unter Verwendung eines pH-Staten. Steht T2' für eine CHO-Gruppe so wird eine Kupplung durch reduktive Aminierung unter Zuhilfenahme eines Reduktionsmittels nach dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt (J.-P. Sabri et al, Tetrahedron Letters 1994, 35, 1181 ; M.D. Bomann et al, J. Org. Chem. 1995, 60, 5995; S. Bhattacharyya et al, J. Chem. Soz. Pekin Trans. I 1994, 1 ; O.S. Artyushin et al., Ser. Khim 1991 , 9. 2154; R.F. Borch et al, JACS 1971 , 93 2897). Als Reduktionsmittel dienen z.B. Natriumborhydrid, Nat umcyanoborhydrid, Lithiumbor- hydrid, Calciumborhydrid, Pyridin-BH3, Lithiumaluminiumhydrid und Zinkborhydrid. Auch eine katalytische Hydrierung an z.B. Palladium oder Nickelkatalysator ist geeignet.
Steht Fg für eine OH-Gruppe, so kann auch eine in-situ Aktivierung mit den dem Fachmann bekannten Kupplungs-Reagenzien wie z.B. DCCI, EEDQ, Staab- Reagenz, BOP, PyBOP, TBTU, TDBTU, HBTU (s. z.B. Fournic-Zaluski et al, J. Med. Chem. 1996, 39, 2596; Houben-Weyl, Band XV/2, Teil II, 1974; Y.M. An- gell et al, Tetrahedron Letters 1994, 35, 5981 ; L.A. Carpino et at, J. Chem. Soc. Commun. 1994, 201 ; H-O. Kim et al, Tetrahedron Letters 1995, 36, 6013; D. Papaioannou et al, Tetrahedron Letters, 1995, 36, 5187, G. Stemple et al, Bioorg. Med. Letters 1996, 6, 55; durchgeführt werden.
Die unter b) angegebene Reaktion des Polymersaccharid-Konjugats der allgemeinen Formel IX mit den Komplexen oder Komplexbildnern K* der allgemeinen Formel II" bis VII" und ll'a erfolgt ebenfalls in an sich bekannter Weise wie z.B. beschrieben in US-5,135,737, H. Takalo et al, Bioconjugate Chem. 1994, 5, 278; EP 0430863; EP 0331616; WO 96/01655; EP 0271 180; US-5,364,613; WO 95/17451 und WO 96/02669. Sie wird in Lösungsmitteln wie z.B. Wasser, Methylenchlorid, Acetonitril, Chloroform, DMS0, Pyridin, Ethano!/Wasser, Ethaπol/Acetonitril, Dioxan, DMF, THF, niedere Alkohole, Tetramethylharnstoff, N-Methylpyrrolidon, Polyethylenglykole, 12-Dimethoxyethan, Dimethylacetamid, 1 ,2-Dichlorethan oder - falls möglich - deren Mischungen mit Wasser bei Temperaturen von -10 °C bis 100 °C, bevorzugt 0 bis 50 °C, besonders bevorzugt bei Raumtemperaturen innerhalb von 5 Minuten bis 72 Stunden, bevorzugt 1 bis 24 Stunden, besonders bevorzugt 1 bis 14 Stunden, gegebenenfalls unter Zusatz einer organischen oder anorganischen Base, wie z.B. aromatischen oder aliphatischen Aminen, Alkali- oder Erdalkali-hydroxiden, -carbonaten oder - hdrogencarbonaten und quartären Ammoniumhydroxiden durchgeführt. Beispielhaft genannt seien Triethylamin, Di-isopropyl-N-ethylamin (Hünig-Base), N- Methylmorpholin, Tributylamin, Tetramethylethylendiamin, Pyridin, Lutedin, 2,4,6-Trimethylpyridin, 4-Dimethylaminopyridin, N-Methylimidazol, Tetramethyl- guanidin, DBU, Lithium-, Natrium-, Kalium, Caicium-, Magnesium-, Barium-hy- droxid, -carbonat, -hydrogencarbonat. Die Umsetzung kann auch in den dem Fachmann bekannten Pufferlösungen, vorzugsweise bei pH 8 bis 11 , besonders bevorzugt bei pH 8,5 bis 9 erfolgen. Die pH-Wert-Einhaltung erfolgt bevorzugt unter Verwendung eines pH-Staten. Steht T2' für eine CHO-Gruppe so wird eine Kupplung durch reduktive Aminierung unter Zuhilfenahme eines Reduktionsmittels nach dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt (J.-P. Sabri et al, Tetrahedron Letters 1994, 35, 1181 ; M.D. Bomann et al, 7. Org. Chem. 1995, 60, 5995; S. Bhattacharyya et al, J. Chem. Soz. Pekin Trans. I 1994, 1 ; O.S. Artyushin et al., Ser. Khim 1991 , 9. 2154; R.F. Borch et al, JACS 1971 , 93 2897). Als Reduktionsmittel dienen z.B. Natriumborhydrid, Natriumcyanobor- hydrid, Lithiumborhydrid, Calciumborhydrid, Pyridin-BH3, Lithiumaluminiumhydrid und Zinkborhydrid. Auch eine katalytische Hydrierung ist geeignet. Die unter a) und b) angegebenen Reaktionen erfolgen vorzugsweise mit einem Überschuß des aktivierten Saccharids der Formel VIII bzw. des aktivierten Komplexes bzw. Kompiexbildners K*, vorzugsweise mit einem 1 ,5- bis 3facheπ Überschuß.
Die unter c) angegebene Eintropfreaktion erfolgt unter den unter a) und b) angeführten Reaktionsbedingungen, indem man ein Polymer der allgemeinen Formel X mit einem Gemisch aus m' = 1 - 3 m K* und n' = 1 - 3 n L* - Z' umsetzt. Das Besetzungsverhältnis der im Polymer enthaltenen Aminogruppen wird durch das Verhältnis n' : m' gesteuert.
Die nach den oben angegebenen Umsetzungen a) - c) notwendige bzw. bereits in K' oder K* erfolgte Metallioneneinführung geschieht in der Weise, wie sie z.B. in der Deutschen Offenlegungsschhft 34 01 052 offenbart worden ist, indem man das Metalloxid oder ein Metallsalz (beispielsweise das Nitrat, Acetat, Car- bonat, Chlorid oder Sulfat) des Elements der Ordnungszahlen 20 - 32, 37 -39, 42 - 44, 49, 57 - 83 in Wasser und/oder einem niederen Alkohol (wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol) löst oder suspendiert und mit der Lösung oder Sus- pension der äquivalenten Menge des komplexbildenden Liganden umsetzt und anschließend, falls gewünscht, vorhandene acide Wasserstoffatome der Säuregruppen durch Kationen von anorganischen und/oder organischen Basen, Aminosäuren oder Aminosäureamiden substituiert.
Die Neutralisation erfolgt dabei mit Hilfe anorganischer Basen (z.B. Hydroxiden, Carbonaten oder Bicarbonaten) von z.B. Natrium, Kalium, Lithium, Magnesium oder Caicium und/oder organischer Basen wie unter anderem primärer, sekundärer und tertiärer Amine, wie z.B. Ethanolamin, Morpholin, Glucamin, N-Me- thyl- und N,N-Dimethylglucamin, sowie basischer Aminosäuren, wie z.B. Lysin, Arginin und Omithin oder von Amiden ursprünglich neutraler oder saurer Aminosäuren, wie z.B. Hippursäure, Glycinacetamid. Zur Herstellung der Komplexverbindungen kann man beispielsweise den sauren Komplexsalzen in wäßriger Lösung oder Suspension so viel der gewünschten Basen zusetzen, daß der Neutralpunkt erreicht wird. Die erhaltene Lösung kann anschließend im Vakuum zur Trockne eingeengt werden. Häufig ist es von Vorteil, die gebildeten Neutralsalze durch Zugabe von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie z.B. niederen Alkoholen (Methanol, Ethanol, Isopropanol und andere), niederen Ketonen (Aceton und andere), polaren Ethern (Tetrahydrofuran, Dioxan, 1 ,2-Dimethoxyethan und andere) auszufällen und so leicht zu isolierende und gut zu reinigende Kristallisate zu erhalten. Als besoπ- ders vorteilhaft hat es sich erwiesen, die gewünschte Base bereits während der Komplexbildung der Reaktionsmischung zuzusetzen und dadurch einen Verfahrensschritt einzusparen.
Enthalten die sauren Komplexverbindungen mehrere freie acide Gruppen, so ist es oft zweckmäßig, neutrale Mischsalze herzustellen, die sowohl anorganische als auch organische Kationen als Gegenionen enthalten.
Dies kann beispielsweise geschehen, indem man den komplexbildenden Liganden in wäßriger Suspension oder Lösung mit dem Oxid oder Salz des das Zentralion liefernden Elements und der Hälfte der zur Neutralisation benötigten Menge einer organischen Base umsetzt, das gebildete Komplexsalz isoliert, es gewünschtenfalls reinigt und dann zur vollständigen Neutralisation mit der benötigten Menge anorganischer Base versetzt. Die Reihenfolge der Basenzugabe kann auch umgekehrt werden.
Die Reinigung der so erhaltenen Polysaccharid-Konjugate erfolgt, gegebenenfalls nach Einstellung des pH-Wertes durch Zusatz einer Säure oder Base auf pH 6 bis 8, bevorzugt ca. 7, vorzugsweise durch Ultrafiltration mit Membranen geeigneter Porengröße (z.B. Amicon-®XM30, Amicon®-YM10, Amicon®-YM3) oder Gelfiltration an z.B. geeigneten Sephadex®-Gelen.
Im Falle von neutralen Verbindungen ist es häufig von Vorteil, die polymeren Komplexe über einen Anionenaustauscher, beispielsweise IRA 67 (OH~-Form) und gegebenenfalls zusätzlich über einen Kationenaustauscher, beispielsweise IRC 50 (H+-Form) zur Abtrennung ionischer Komponenten zu geben.
Die Herstellung der als Ausgangssubstanzen benötigten Polymer-kom- plex(bildner)-Konjugate der allgemeinen Formel VII
P(K')m (VII)
und der Polymersaccharid-Konjugate der allgemeinen Formel IX
P(L' - Z)n (IX)
erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man ein Polymer der allgemeinen Formel X
P-(H)k (X)
mit m' Komplexen oder Komplexbildnern K* der allgemeinen Formeln II" - VI" und ll'a bzw. mit N' aktivierten Mono- oder Oligosacchaiden der allgemeinen Formel VIII
L* - Σ (VIII)
unter den oben unter a) und b) angegebenen Reaktionsbedingungeπ umsetzt.
Die Polymere der allgemeinen Formel X können in Form der freien Amine oder in Form ihrer Salze, z.B. als Hydrochloride, Hydrobromide oder Hydrosulfate eingesetzt werden. Sie sind literaturbekannt (z.B. Polylysin: EP 0331 616; Den- drimere: WO 96/01655, EP 0271 180, EP 0430863, Polypeptid, Polyallylamin, Poly[N-(2-aminoethyl)] methacrylamid: US-5, 364,613; Polysaccharid: V.D. Nadkami et al, Carbohydrate Research 1996, 290, 87, E.A. Yates et al, Carbo- hydrate Research 1996, 294, 15, DJ. Tyrrell et al, TiPS 1995, 16, 198, JP- Patentschrift 06080705-A). Die verwendeten Komplexe bzw. Komplexbildner K* sind literaturbekanπt oder analog literaturbekannten Methoden erhältlich:
II" und ll'a: s.z.B. EP 263 059,
III": s. z.B. DE 19507822, DE 19580858, DE19507819
IV: s. z.B. WO 91/14459
V: s. z.B. US-5,053,503, WO 96/02669, WO 96/01655,
EP 0430863, EP 255471 , US-5,277,895, EP 0232751 ,
US-4,885,363
VI": s. z.B. US-4,923,985
Die als Edukte benötigten Mono- und Oligosaccharide der allgemeinen Formel VIII sind ebenfalls literaturbekannt oder analog literaturbekanπteπ Methoden erhältlich (s. auch experimentellen Teil): s. z.B. EP 0 128097; A.J. Jonas et al. Biochem. J. 1990, 268, 41 ; JP- Patentschrift 04211099; D.H. Buss et al, J. Chem. Soc. C. 1968, 1457; CM. Hilditch et al, J. Appl. Phycol. 1991 , 3, 345; M. Monsigny et al, Biol. Cell 1984, 51, 187; E.P. Dubois et al, Bioorganic and Me- dicinal Chemistry Letters 1996, 6, 1387; C.R. McBroom et al, Methods Enzymol. 1972, 28, 212, M. Ponpipom et al, J. Med. Chem. 1981 , 24, 1388; J. Haensler et al, Bioconjugate Chem. 1993, 4,, 85; Y. Miura et al, Carbohydrate Research 1996, 289, 193; R. Roy et al. Tetrahedron Letters 1995, 36, 4377; W. Stahl et al, Angew. Chemie 1994, 106, 2186; U. Sprengard et al, Angew. Chemie 1996, 108. 359; A. Toepfer et al, Tetrahedron Letters 1995, 36, 9161 ; U. Sprengard et al, Angew. Chemie 1995, 107, 1104; D. Zanini et al, Tetrahedron Letters 1995, 3.6, 7383; R. Roy et al, J. Chem. Commun. 1996, 201 ; W. Spevak et al, J. Med. Chem. 1996, 39, 1018; E.A.L Biessen et al, J. Med. Chem. 1995, 38, 1846; K. Yamada et al, Tetrahedron Letters 1995, 36, 9496; Lemieux et al, JACS 1975, 97, 4076; S. Koto et al, Bull. Chem. Soc. Jap. 1976, 49, 2639; P.W. Austin et al, J. Chem. Soz. C 1965, 1419; H. Paulsen, Angew. Chem. 1990, 102, 851 ; R.R. Schmidt et al, Angew. Chem. 1986, 98, 213; H. Kunz, Angew. Chem. 1987, 99, 297; J. Banoub, Chem. Review 1992, 92, 1167; H. Paulsen, Angew. Chem. 1982, 94, 184, R.R. Schmidt et al, Liebigs Ann. Chem. 1983, 1249; H.A. van Doren et al, Carbohydrate Research 1989, 194, 71 , F.D. Tropper et al, J. Car- bohydr. Chem. 1992, H, 751 ; T. Sugawara et al, Carbohydrate Research 1992, 230. 117, Y.C. Lee et al, Biochemistry 1976, 15, 3956; Blomberg et al, J. Car- bohydr. Chem. 1992, 11, 751.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel erfolgt ebenfalls in an sich bekannter Weise, indem man die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen - gegebenenfalls unter Zugabe der in der Galenik üblichen Zusätze - in wäßrigem Medium suspendiert oder löst und anschließend die Suspension oder Lösung gegebenenfalls sterilisiert. Geeignete Zusätze sind beispiels- weise physiologisch unbedenkliche Puffer (wie z.B. Tromethamin), Zusätze von Komplexbildnern oder schwachen Komplexen (wie zum Beispiel Diethylentria- minpentaessigsäure oder die korrespondierenden Ca-Polysaccharid-Polymer- Komplexe) oder - falls erforderlich - Elektrolyte wie zum Beispiel Nätπumciiiorid oder - falls erforderlich - Antioxidantien wie zum Beispiel Ascorbinsäure.
Sind für die enterale Verabreichung oder andere Zwecke Suspensionen oder Lösungen der erfindungsgemäßen Mittel in Wasser oder physiologischer Salzlösung erwünscht, werden sie mit einem oder mehreren in der Galenik üblichen Hilfsstoff(en) [z.B. Methylcellulose, Lactose, Mannit] und/der Tensid(en) [z.B. Lecithine, Tween®, Myrj®] und/oder Aromastoff(en) zur Geschmackskorrektur [z.B. ätherischen Ölen] gemischt.
Prinzipiell ist es auch möglich, die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel auch ohne Isolierung der Komplexsalze herzustellen. In jedem Fall muß beson- dere Sorgfalt darauf verwendet werden, die Chelatbildung so vorzunehmen, daß die erfindungsgemäßen Salze und Salzlösungen praktisch frei sind von nicht komplexierten toxisch wirkenden Metallionen.
Dies kann beispielsweise mit Hilfe von Farbindikatoren wie Xylenolorange durch Kontrolltitrationen während des Herstellungsprozesses gewährleistet werden. Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung der Komplexverbindungen und ihrer Salze. Als letzte Sicherheit bleibt eine Reinigung des isolierten Komplexsalzes. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel enthalten vorzugsweise 1 μMol - 1 ,3 Mol/I des Komplexsalzes und werden in der Regel in Mengen von 0,0001 - 5 mMol/kg dosiert. Sie sind zur enteralen und parenteralen Applikation bestimmt. Die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen kommen zur Anwen- düng.
für die NMR- und Röntgen-Diagnostik in Form ihrer Komplexe mit den Ionen der Elemente mit den Ordnungszahlen 21 - 29, 39 42, 44 und 57 - 83;
2. für die Radiodiagnostik und Radiotherapie in Form ihrer Komplexe mit den Radioisotopen der Elemente mit den Ordnungszahlen 27, 29, 31 , 32, 37 - 39, 43, 49, 62, 64, 70, 7δ und 77.
Die erfindungsgemäßen Mittel erfüllen die vielfältigen Voraussetzungen für die Eignung als Kontrastmittel für die Kernspintomographie. So sind sie hervorragend dazu geeignet, nach oraler oder parenteraler Applikation durch Erhöhung der Signalintensität das mit Hilfe des Kernspintomographen erhaltene Bild in seiner Aussagekraft zu verbessern. Ferner zeigen sie die hohe Wirksamkeit, die notwendig ist, um den Körper mit möglichst geringen Mengen an Fremdstoffen zu belasten, und die gute Verträglichkeit, die notwendig ist, um den nichtinvasi- ven Charakter der Untersuchungen aufrechtzuerhalten.
Die gute Wasserlöslichkeit und geringe Osmolalität der erfindungsgemäßen Mittel erlaubt es, hochkonzentrierte Lösungen herzustellen, damit die Volumenbelastung des Kreislaufs in vertretbaren Grenzen zu halten und die Verdünnung durch die Körperflüssigkeit auszugleichen, das heißt NMR-Diagnostika müssen 100- bis 1000fach besser wasserlöslich sein als für die NMR-Spektroskopie. Weiterhin weisen die erfindungsgemäßen Mittel nicht nur eine hohe Stabilität in- vitro auf, sondern auch eine überraschend hohe Stabilität in-vivo, so daß eine Freigabe oder ein Austausch der in den Komplexen nicht kovalent gebundenen - an sich giftigen - Ionen innerhalb der Zeit, in der die neuen Kontrastmittel vollständig wieder ausgeschieden werden, nur äußerst langsam erfolgt.
Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Mittel für die Anwendung als NMR-Diagnostika in Mengen von 0,0001 - 5 mMol/kg, vorzugsweise 0,005 - 0,5 mMol/kg, dosiert. Details der Anwendung werden zum Beispiel in H.-J. Weinmann et al., Am J. of Roentgenology 142. 619 (1984) diskutiert.
Besonders niedrige Dosierungen (unter 1 mg/kg Körpergewicht) von organ- spezifischen NMR-Diagnostika sind zum Beispiel zum Nachweis von Tumoren und von Herzinfarkt einsetzbar.
Die erfindungsgemäßen Mittel sind aufgrund ihrer günstigen radioaktiven Eigenschaften und der guten Stabilität der in ihnen enthaltenen Komplexverbin- düngen auch als Radiodiagnostika geeignet. Details ihrer Anwendung und Dosierung werden z.B. in "Radiotracers for Medical Applications", CRC-Press, Boca Raton, Florida, beschrieben.
Eine weitere bildgebende Methode mit Radioisotopen ist die Positronen-Emissi- ons-Tomographie, die positronenemittierende Isotope wie z.B. 43Sc, 44Sc,
£>2Fe, 55co und 68Qa verwendet (Heiss, W.D.; Phelps, M.E.; Positron Emission Tomography of Brain, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1983).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind überraschenderweise auch zur Differenzierung von malignen und benignen Tumoren in Bereichen ohne Blut- Hirn-Schranke geeignet. Sie zeichnen sich auch dadurch aus, daß sie vollständig aus dem Körper eliminiert werden und somit gut verträglich sind.
Da sich die erfindungsgemäßen Substanzen in malignen Tumoren anreichern (keine Diffusion in gesunde Gewebe, aber hohe Durchlässigkeit von Tumorgefäßen), können sie auch die Strahlentherapie von malignen Tumoren unterstützen. Diese unterscheidet sich von der entsprechenden Diagnostik nur durch die Menge und Art des verwendeten Isotops. Ziel ist dabei die Zerstörung von Tumorzellen durch energiereiche kurzwellige Strahlung mit einer möglichst ge- ringen Reichweite. Hierzu werden Wechselwirkungen der in den Komplexen enthaltenen Metalle (wie z.B. Eisen oder Gadolinium) mit ionisierenden Strahlungen (z.B. Röntgenstrahlen) oder mit Neutronenstahlen ausgenutzt. Durch diesen Effekt wird die lokale Strahlendosis am Ort, wo sich der Metallkomplex befindet (z.B. in Tumoren) signifikant erhöht. Um die gleiche Strahlendosis im malignen Gewebe zu erzeugen, kann bei Anwendung solcher Metallkomplexe die Strahlenbelastung für gesunde Gewebe erheblich reduziert und damit belastende Nebenwirkungen für die Patienten vermieden werden. Die erfindungsgemäßen Metallkomplex-Konjugate eignen sich deshalb auch als radiosensibi- lisierende Substanz bei Strahlentherapie von malignen Tumoren (weiterhin lassen sich Mössbauer-Effekte oder die Neutroneneinfangtherapie ausnutzen). Geeignete ß-emittierende Ionen sind zum Beispiel 46sc, 47Sc, 48Sc, 72Ga, 73Ga und 90γ. Geeignete geringe Halbwertzeiten aufweisende α-emittierende Ionen sind zum Beispiel 21 1 Bi, 212Bi, 213Bi und 214Bi, wobei 212Bi bevorzugt ist. ein geeignetes Photonen- und Elektroπen-emittierendes Ion ist 158Gd, das aus 57Qd durch Neutroneneinfang erhalten werden kann.
Bei der in-vivo-Applikation der erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel kön- nen diese zusammen mit einem geeigneten Träger wie zum Beispiel Serum oder physiologischer Kochsalzlösung und zusammen mit einem anderen Protein wie zum Beispiel Human Serum Albumin verabreicht werden. Die Dosierung ist dabei abhängig von der Art der zellulären Störung, derr, benutzten Metallion und der Art der bildgebenden Methode.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel werden parenteral, vorzugsweise i.V., appliziert.
Details der Anwendung von Radiotherapeutika werden z.B. in R.W. Kozak et al. TIBTEC, Oktober 1986, 262, diskutiert.
Die erfindungsgemäßen Mittel sind hervorragend als Röntgenkontrastmittel geeignet, insbesondere für die Computertomographie (CT), wobei besonders hervorzuheben ist, daß sich mit ihnen keine Anzeichen der von den jodhaltigen Kontrastmitteln bekannten anaphylaxieartigen Reaktionen in biochemisch- pharmakologischen Untersuchungen erkennen lassen. Besonders wertvoll sind sie wegen der günstigen Absorptionseigenschaften in Bereichen höherer Röhrenspannungen für digitale Substraktionstechniken.
Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Mittel für die Anwendung als Röntgenkontrastmittel in Analogie zu Megiumin-Diatrizoat in Mengen von 0,1 - 5 mMol/kg, vorzugsweise 0,25 - 1 mMol/kg dosiert.
Details der Anwendung von Röntgenkontrastmitteln werden zum Beispiel in Barke, Röntgenkontrastmittel, G. Thieme, Leipzig (1970) und P. Thurn, E. Bücheier "Einführung in die Röntgendiagnostik", G. Thieme, Stuttgart, New York (1977) diskutiert. Insgesamt ist es gelungen, neue Polymer-Metallkomplexe zu synthetisieren, die neue Möglichkeiten in der diagnostischen und therapeutischen Medizin erschließen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des Erfindungsgegenstandes:
Die in den nachfolgenden Beispielen verwendeten, dem Fachmann bekannten und geläufigen Abkürzungen, bestimmter, häufig wiederkehrender Verbin- dungsnamen, sind im Folgenden namentlich und/oder durch Strukturformeln einmalig erläutert;
wobei = jeweils die Position, in den nachfolgend beschriebenen, Molekülen an- gibt, über welche die Bindung an das Polymer P erfolgt.
1) DTPA : [Bis-(2-aminoethyl)-amin-N,N,N',N",N"- pentaessigsäure ]
Figure imgf000033_0001
2) Gd-DTPA: Gadoliniumkomplex von [Bis-(2-aminoethyl)-amin-N,N,N',N" ,N"- pentaessigsäure ] mono-Natriumsalz
Figure imgf000034_0001
3) DTPA-Monoanhydrid-monoethylester:
Figure imgf000034_0002
4) DTPA-tetra-tert.-butylester ( zentrale Carboxymethylfunktion ): 3,9-Bis-(tert.-butoxycarbonylmethyl)-6-Carboxymethyl-3,6,9- triazaundecansäure-di-tert.-butylester
Figure imgf000034_0003
5) DTPA-tetra-tert.-butylester ( terminale Carboxymethylfunktion ):
6,9-Bis-(tert.-butoxycarbonylmethyl)-3-carboxymethyl-3,6,9-triaza- undecansäure-3,9-di-tert.-butylester
Figure imgf000035_0001
6) Gly-Me-DOTA-tri-tert.-butylester :
10-[1 -(Carboxymethylcarbamoyl)-ethyl]-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan- 1 ,4,7-triessigsäure-tri-tert-butylester, Natriumbromid:
Figure imgf000035_0002
7) Gd-Gly-Me-DOTA :
Gadoliniumkomplex von 10-[1 -(Carboxymethylcarbamoyl)-ethyl]-1 ,4,7, 10- tetraaza-cyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure
Figure imgf000036_0001
8) Sialyl-Lewisx = [ sLe* ] :
(α-Neu5Ac-(2-3)-ß-D-Gal-(1-4)-[α-L-Fuc-(1-3)]-ß-GlcNAc)
Die in den jeweiligen Synthesen eingesetzten Polyamine sind im Folgenden einmalig benannt und die entsprechenden Literaturstelleπ zu deren Synthese einmalig angeführt:
a) 12er-Kaskadenpolyamin (12mer-Polyamin):
12er-Polyamin auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)- ethyl]-trimesinsäureamids-Cores mit N,N'-Dibenzyloxycarbonyl-L-lysin
Synthesebeschreibung auf analoge Weise wie in DE 19525924 A1 in Beispiel 1d) beschrieben für die Darstellung des 24er-Kaskadenpolyamins, nur unter Verwendung von N,N'-Dibenzyloxycarbonyl-L-lysin anstelle eines vollständig Benzyloxycarbonyl geschützten "Tri-Lysins" .
b) 24er-Kaskadenpolyamin (24mer-Polyamin) :
24er-Polyamin auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)- ethyl]-trimesinsäureamids Synthesebeschreibung in : DE 19525924 A1 ; EP 0430 863 A1 ; WO 97/ 02051 ; DE 195 18 222 A1
c) 36er-Kaskadenpolyamin (36mer-Polyamin):
36er-Polyamin auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)- ethyl]-thmesinsäureamids-cores mit sechs 1-(Carboxymethoxyacetyl)-4,7,10- tris(N,N'-dibenzyloxycarbonyl-lysyl)-1 ,4,10-tetraazacyclododecan
Synthesebeschreibung in : EP 0430 863 A1 ; WO 97/ 02051
d) 48er-Kaskadenpolyamin (48mer-Polyamin):
48er-Polyamin auf der Basis des mit 1-(Carboxymethoxyacetyl)-4,7,10- tris(N,N'-dibenzyloxycarbonyl-lysyl)-1 ,4,7,10-tetraazacyclododecan- Hexamincores mit 1 ,4,7,10-tetraazacyclododecan-tetrakis- (N,N'- dibenzyloxycarbonyl-lysyl)
Synthesebeschreibung in : EP 0271180
f) 24er-Starburst-Dendrimer:
Tomalia D. A. et al.; Polym. J. (Tokyo ) 1985, IZ, 117; Tomalia D. A. et al.; Macromolecules 1986, 19, 2466; Tomalia D. A. ,et al.; Macromolecules 1987, 20, 1164 ; Tomalia D.A. et al. , J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 1601 ; Tomalia D. A. et al.; J. Org. Chem. 1987,52, 5305.
e) 48er- Starburst-Dendrimer:
Tomalia D. A. et al.; Polym. J. (Tokyo ) 1985, 17, 117; Tomalia D. A. et al.; Macromolecules 1986, Ü 2466; Tomalia D. A. et al.; Macromolecules 1987, 20, 1164 . Beispiel 1
13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)47 -[1 -(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]33-Konjugat
a) Polyamid aus 13 kD-poly-L-Lysin und DTPA
Eine Lösung von 5,0 g (0,38 mmol; entsprechend 30,4 mmol an freien Amino- funktionen) poly-L-Lysinhydrobromid (13 kD, Kaufware Sigma) wird in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 14,7 g (36,5 mmol) DTPA-Mono- anhydrid-mono-ethylester (Darstellung wie in EP 0263051 A1 , EP 0450742 A1 und EP 0413405 A1 beschrieben) hinzu, wobei der pH-Werf der Reaktions- lösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32 %iger Natronlauge auf 11 ,5 eingestellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran [ cut off 3000 D; AMICON ® ] gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet. Ausbeute: 10,26 g (84,6 %; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver Wassergehalt: 7,44 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,61 H 5,68 N 13,14 Na 13,48 gef.: C 42,55 H 5,72 N 13,20 Na 13,61
Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration bei einer Komplexie- rungstemperatur von 22°C mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungs- grad des Polymers von 58,7 % (entsprechend 47 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion [vgl. hierzu: Chem. Rev., 60, 39 (1960); Tetrahydron, 34, 1285 (1978), 47, 8791 (1991)] als auch der quantitativen Aminogruppenbestimmung mit der TNBS-Methode (vgl. hierzu : Fields, R., J. Biochem. 1971 , 124, 581-590 und weiterführende Lit: Chem. Rev., 60, 39 (1960); Tetrahedron, 34, 1285 (1978); 47, 8791 (1991)] liegen im Mittel pro Polymermolekül 33 freie Aminofunktionen vor.
b) 13-kD-poly-L-Lysin-(DTPA-Amid)47 - [1 -(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]33-Konjugat
1 ,5 g (0,047 mmol; entsprechend 1 ,54 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 1 a) werden in 80 ml entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit 1 molarer Salzsäure auf 9,5 eingestellt Anschließend wird portionsweise mit insgesamt 2,07 g (6,63 mmol) p-lso- thiocyanatophenyl-ß-D-galactopyranose (Darstellung gemäß: M. Ponpipom et al., J. Med. Chem. 24 1388; 1981. Zur allgemeinen Bildung von Isothiocyana- ten aus den entsprechenden Anilinvorstufen von diversen Hexapyranosen vgl. z.B.: D. H. Buss, I.J. Goldstein; J. Chem. Soc. , 1968, 1457-1461 , McBroom C. R. ,Samanen C. H. and Goldstein I.J. , Methods Enzymol. 1972, 28, 212-219 ) versetzt, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung mittels 0,1 molarer Natronlauge bei 9,5 konstant gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei 22°C wird filtriert und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 250 ml aufgefüllt. Dreimalige Ultrafiltration der Reaktionslösung über eine YM3- Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gefolgt von Gefriertrocknung des verbleibenden Rückstands liefert 1 ,84 g (92,6 % d. Theorie) eines amorphen und farblosen Feststoffs. Wassergehalt: 6,78 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,34 H 5,54 N 11 ,02 S 2,49 Na 10,18 gef.: C 44,27 H 5,70 N 19,97 S 2,53 Na 10,24
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode , welche zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von freien Aminofunktionen allgemein eingesetzt werden können, verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 40 % ß-D-Ga- lactose (entsprechend 33 Galactoseresten pro Molekül). Die colorimetrische Pheπol-Schwefelsäure-Bestimmung (Dubois et al., Anal. Chem. 1956, 28, 3, 350) zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Polyamins liefert als Ergebnis einen mittleren statistischen Beladungsgrad von 32,68 % an D-Galactoseresten pro Molekül und ist somit als identisch anzusehen mit dem Beladungsgrad , welcher allein durch die prozentualen Elementverhältnisse ermittelt wurde ( hier gefunden : 33 D-Galactosereste pro Molekül).
c) 13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)47 -[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]33-Konjugat
1 ,27 g (0,0411 mmol; entsprechend 1 ,56 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 1 b) werden in 40 ml Natriumeitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 0,42 g (1 ,59 mmol) Gadoliniumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations- membran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Ausbeute: 1 ,44 g (97,2 % d. Th.) als amorphes Pulver Wassergehalt: 3,89 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 41 ,00 H 5,45 N 10,11 S 2,31 Gd 16,53 Na 2,42 gef.: C 39,87 H 5,74 N 9,98 S 2,28 Gd 16,58 Na 2,42
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 58.9 % Gd-DPTA und 41 ,1 % D-Galactose (entsprechend 47 Gd-DTPA-Einheiten und 33 ß-D-Galactose- resten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar. Beispiel 2
13 kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA)47-[1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyi] 33-Konjugat
a) 13-kD-poly-L-Lysin-(DTPA-Amid)47 -[1 -(4-Thioureidophenyl)- -D- mannopyranosyi]33-Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1 b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 0,75 g (0,023 mmol; entsprechend 0,77 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 1 a) mit 1 ,2 g (3,8 mmol) p-lsothiocyaπatophenyl-α- D-mannopyranose [Darstellung gemäß: Monsigny, M. et al., Biol. Cell. 51 , (1984), 187] nach Aufarbeitung 1 ,29 g (92,4 % d τn ) eines amorpher, und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 4,86 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,34 H 5,54 N 1 1 ,02 S 2,49 Na 10, 18 gef.: C 44,40 H 5,57 N 10,96 S 2,58 Na 10,20
Die Durchführung der Ninhydrinreaktion an der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 40 % D-Mannose (entsprechend 33 Man- noseresten pro Molekül).
b) 13 kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)47-[1 -(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] 33 -Konjugat
0,85 g (0,020 mmol; entsprechend 0,94 mmol an DTPA) der Titelverbiπdung aus Beispiel 2a) werden in Analogie wie für Beispiel 1 c) beschrieben, mit 10 ml einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung , die einen Gesamtgehalt von 0,25 g (0,96 mmol) an Gadoliniumchlorid aufweist, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 918 mg (98,5 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 6,14 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 40,39 H 5,05 N 10,04 S 2,27 Gd 15,86 Na 2,32 gef.: C 40,42 H 5,11 N 10,01 S 2,36 Gd 15,92 Na 2,28
Aus den molaren Elementarverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 60.3 % Gd-DPTA und 39.7 % D-Mannose (entsprechend 47 Gd-DTPA-Einheiten und 33-D-Mannose- reste pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der quantitativen Ninhy- drinreaktionen keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Die T-| und T2-Relaxivitäten der Titelverbinduπg wurden sowohl in Wasser, als auch im Plasma bestimmt:
Die Messungen erfolgten bei 40°C, einer Magnetfeldstärke von 0.47 Tesla der T1 -Sequenz : 180° - Tl - 90° [ Inversion Recovery ] sowie der T2-Sequenz : 90° - TE - 180° [ CPMG ].
Alle Relaxivitätsbestimmungen erfolgten auf einem Minispec PC 20 und als Referenzprobe diente in allen Fällen eine Lösung von Gd-DTPA der Konzentration 1 mmol/L .
R1 (Wasser) = 14.4 ± 0.0 (LJmmol-s) R1 (Plasma) = 17.4 ± 0.2 (LJmmol-s) R2 (Wasser) = 16.4 ± 0.2 (LJmmol-s) R2 (Plasma) = 21.4 ± 1.9 (L/mmol-s)
Beispiel 3
13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)47 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D-glucopy- ranosyl]33-Konjugat
a) 13-kD-poly-L-Lysin-(DTPA-Amid)47 -[1 -(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl]33- Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 0,9 g (0,028 mmol; entsprechend 0,92 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 1a) mit 1 ,44 g (4,56 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-ß- D-glucopyranose [Darstellung in Analogie zu: M. Ponpipom et al., J. Med. Chem. 24, 1388; 1981 und Monsigny et al., Bio. Cell, 51, 187, 1984] nach Aufarbeitung 1 ,08 g (90,6 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 3,75 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,34 H 5,54 N 11 ,02 S 2,49 Na 10,18 gef.: C 44,40 H 5,51 N 11 ,03 S 2,55 Na 10,20
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen mehr. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 40 % D-Glucose (entsprechend 33 Glucoseresten pro Molekül).
b) 13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)47 -[1 -(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl]33-Konjugat
1 ,0 g (0,023 mmol; entsprechend 1 ,10 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 3a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben, mit 10 ml einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung, die einen Gesamtgehalt von 0,298 g (1 ,12 mmol) Gadoliniumchloridlösung aufweist, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1 ,06 g (99,2 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 5,47 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 40,39 H 5,05 N 10,04 S 2,27 Gd 15,86 Na 2,32 gef.: C 40,44 H 5,12 N 10,09 S 2,31 Gd 15,90 Na 2,31
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 59.7 % Gd-DPTA und 40.3 % D-Glucose (entsprechend 47 Gd-DTPA-Einheiten und 33-D-Glucosereste pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar. Beispiel 4
24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)1 1 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]i3-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)1 1 - Konjugat
Bei Raumtemperatur werden 5,0 g (1 ,06 mmol; entsprechend 25,44 mmol an freien Aminfunktionen) 24er-Kaskadenamin [als HBr-Salz ] in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der resultierenden Lösung beträgt 1 ,6. Durch tropfenweises Versetzen dieser Lösung mit 1 molarer Natronlauge wird ein pH- Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 12,3 g (30,53 mmol) DTPA-Monoanhydrid-monoethylestεr ^Darstellung wie in Europäische Patent- anmeldung Nr. 0263051 A1 , Europäische Patentanmeldung Nr. 0450742 A1 und Europäische Patentanmeldung Nr. 0413405 A1 beschrieben ) portionsweise hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten bei Raumtemperatur wird der pH-Wert der Reaktionslösung, durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf 11 ,5 eingestellt. Die Reaktionslösung wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafιltrationsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rück- stand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 5,50 g (86,4 bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver Wassergehalt: 9,33 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,20 H 5,66 N 13,88 Na 12,86 gef.: C 43,01 H 5,70 N 14,03 Na 12,84
Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 45,8 % (entsprechend 11 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion liegen im Mittel pro Polymermoiekül 13 freie Aminofunktionen vor.
b) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)1 1 -[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]-|3-Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1 b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0,12 mmol; entsprechend 1 ,65 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel- Verbindung aus Beispiel 4a) mit 2,3 g (7,26 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-ß-D- galactopyranose nach Aufarbeitung 1 ,33 g (93,2 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 7,41 %
Elemεntaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,46 H 5,38 N 10,67 S 3,49 Na 8,47 gef.: C 45,32 H 5,28 N 10,71 S 3,44 Na 8,51
Die Ninhydrinreaktion Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Pro- dukt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 54,2 % D-Galactose (entsprechend 13 Galactoseresten pro Molekül).
c) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)11 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]-| 3-Konjugat
1 ,0 g (0,077 mmol; entsprechend 0,85 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 4b) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit 10 ml einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung , die einen Gesamtgehalt von 0,232 g (0,88 mmol) Gadoliniumchlorid enthält, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 978,4 mg (98,4 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 4,36 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,04 H 4,97 N 9,87 S 3,23 Gd 13,40 Na 1 ,96 gef.: C 42,12 H 5,03 N 9,81 S 3,26 Gd 13,54 Na 1 ,93
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 46.4 % Gd-DPTA und 53.6 % D- Galactose (entsprechend 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-D-Galactose- resten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 5
24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)1 1 - [1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl]-|3 -Koπjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)1 1 - [1-(4-Thioureidophenyl)-α D-mannopyranosyl] ι3-Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1 b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0,12 mmol; entsprechend 1 ,65 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel- Verbindung aus Beispiel 4a) mit 2,3 g (7,26 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-α-D- mannopyranose nach Aufarbeitung 1 ,31 g (91 ,8 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 4,89 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,46 H 5,38 N 10,67 S 3,49 Na 8,47 gef.: C 45,27 H 5,40 N 10,58 S 3,40 Na 8,60
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 53,8 % D-Mannose (entsprechend 20 α-D-Mannoseeinheiten pro Molekül).
b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)1 1 -[1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] 33 -Konjugat
1 ,0 g (0,077 mmol; entsprechend 0,85 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 5a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit 10 ml einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung ,die einen Gesamtgehalt von 0,232 g (0,88 mmol) Gadoliniumchlorid enthält, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 952,2 mg (96,4 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 7,89 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,04 H 4,97 N 9,87 S 3,23 Gd 13,40 Na 1 ,96 gef.: C 41 ,98 H 5,02 N 10,01 S 3,27 Gd 13,42 Na 1 ,91
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45 % Gd-DPTA und 55 % D- Mannose (entsprechend 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Die T und T -Relaxivitäten der Titelverbindung wurden sowohl in Wasser ,als auch im Plasma bestimmt:
Die Messungen erfolgten bei 40°C, einer Magnetfeldstärke von 0.47 Tesla und der T1 -Sequenz : 180° - Tl - 90° [ Inversion Recovery ] sowie der T2-Sequenz : 90° - TE - 180° [ CPMG ]. Alle Relaxivitätsbestimmungen erfolgten auf einem Minispec PC 20 . Als Referenzprobe diente in allen Fällen eine Lösung von Gd-DTPA der Konzentration 1 mmol/L .
R-, (Wasser) = 15.4 ± 0.0 (L/mmol-s) R., (Plasma) = 17.7 ± 1.1 (IJmmol-s) R2 (Wasser) = 17.6 ± 0.2 (LJmmol-s) R2 (Plasma) = 19.3 + 1 .2 (LJmmol-s)
Beispiel 6
24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)1 -, -[1 -(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl-ß- D-glucosaminopyranosyl] ^-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)1 1 - [1 -(4-Thioureidopheπyl)-N-acetyl- ß-D-glucosaminopyranosyl] -\ 3-Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1 b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,3 g (0, 156 mmol; entsprechend 2,03 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 4a) mit 3, 15 g (8,92 mmol) 2-[Acetylamino-2- deoxy]-1 -[4-(isothiocyanatophenyl) ]-ß-D-glucosaminopyranose [Darstellung in Analogie zu: M. Ponpipom et al., J. Med. Chem. 24, 1388; 1981 und Monsigny et al., Biol. Cell, 51, 187, 1984] nach Aufarbeitung 1 ,74 g (89,6 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 3,94 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,97 H 5,56 N 1 1 ,66 S 3,34 Na 8, 10 gef.: C 46,03 H 5,60 N 1 1 ,62 S 3,30 Na 8,07
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel- wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers von 54, 1 % N-Acetyl-glucoseeinheiten (entsprechend 13 N- Acetyl-glucosaminresten pro Molekül).
b) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)ι 1 -[1 -(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl-ß- D-glucosaminopyranosyl] 13-Konjugat
1 ,5 g (0, 120 mmol; entsprechend 1 ,32 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 6a) werden in Analogie wie für Beispiel 1 c) beschrieben mit 10ml einer wässrigen Gadoliπiumchloridlösung komplexiert, die einen Gesamtgehalt von 0,356g (1 ,35 mmol) Gadoliniumchlorid enthält . Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1 ,57 g (97,3 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 4,91 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,65 H 5,16 N 10,82 S 3,10 Gd 12,85 Na 1 ,88 gef.: C 42,71 H 5,20 N 10,86 S 3,14 Gd 12,91 Na 1 ,85
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 46 % Gd-DTPA und 54 % N- Acetyl-D-Glucosamin , d.h. es liegen im Mittel 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-
N-Acetyl-D-GIucosamineinheiten pro Molekül vc In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofurktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 7
24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)11 -[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyrj-13- Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)ι 1 -[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl]-|3- Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,2 g (0,144 mmol; entsprechend 1 ,872 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 4a) mit 2,61 g (8,24 mmol) p-lsothiocyanatophenyl- ß-D-glucopyranose nach Aufarbeitung 1 ,49 g (87,1 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 8,37 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,46 H 5,38 N 10,67 S 3,49 Na 8,47 gef: C 45,52 H 5,44 N 10,73 S 3,55 Na 8,60
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel- wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 54,9 % D-Glucose (entsprechend 13 Glucoseresten pro Molekül).
b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)1 1 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl]-i3- Konjugat
1 ,0 g (0,077 mmol; entsprechend 0,85 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 7a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit 232 mg (0,88 mmol) einer wässrigen Gadoiiniumchloridlösung ( 10 ml ) komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 952,2 mg (96,4 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 7 39 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,04 H 4,97 N 9,87 S 3,23 Gd 13,40 Na 1 ,96 gef: C 41 ,98 H 5,02 N 10,01 S 3,27 Gd 13,42 Na 1 ,91
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45 % Gd-DPTA und 55 % D- Glucose (entsprechend 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-D-Glucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 8
36er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)16 -[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]2o-Konjugat
a) 36er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)16 - Konjugat
Bei Raumtemperatur werden 4,0 g (0,54 mmol; entsprechend 19,41 mmol an freien Aminfunktionen) 36er-Kaskadenamin [ eingesetzt als Hydrobromid; Darstellung gemäß: Schmitt-Willich et al., Schering AG, Europäische Patentanmeldung Nr. 0430 863 A1 ; WO 97/ 02051 ; Deutsche Patentanmeldung Nr. 195 18 222 A1] in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der resultierenden Lösung beträgt 1 ,8. Durch tropfenweises Versetzen dieser Lösung mit 1 molarer Natronlauge wird ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 9,38 g (23,3 mmol) DTPA-Monoanhydrid-monoethylester portionsweise hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten bei Raumtemperatur wird der pH-Wert der Reaktionslösung, durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf 1 1 ,5 eingestellt. Die Reaktionslösung wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässri- ge Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,50 g (86.4 % d. Th. : bezogen auf eingesetztes Polyamin) 3ιs amorphes Pulver
Wassergehalt: 9,33 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,23 H 5,63 N 13,88 Na 12,46 gef : C 43,40 H 5,68 N 13,92 Na 12,30
Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 45, 1 % (entsprechend 16 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach Ninhydrinreaktion der Titelverbindung liegen im Mittel im Polymer 20 freie Aminofunktionen pro Molekül vor.
b) 36er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid) 6 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]2o-Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1 b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,5 g (0,12 mmol; entsprechend 2,54 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 8a) mit 3,55 g (1 1 ,2 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-cc-D- mannopyranose nach Aufarbeitung 1 ,87 g (86,3 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 4,93 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,52 H 5,35 N 10,62 S 3,55 Na 8,14 gef: C 45,60 H 5,41 N 10,58 S 3,49 Na 8,22
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59 % N-Acetyl-D-Glucosamin (entsprechend 20 Glucose- resten pro Molekül).
c) 36er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)16 -[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]2o-Konjugat
1 ,5 g (0,10 mmol; entsprechend 1.32 mmol an DTPA) der Titeiverbindung aus Beispiel 8b) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit einer Lösung von 358,5 mg (1 ,36 mmol) Gadoliniumchlorid in 10 ml Wasser komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1 ,57 g (97,3 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 7,71 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,22 H 4,96 N 9,85 S 3,29 Gd 12,91 Na 1,89 gef: C 42,30 H 5,02 N 9,78 S 3,31 Gd 13,01 Na 1 ,78
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 44 % Gd-DPTA und 56 % D-Mannose (entsprechend 16 Gd-DTPA-Einheiten und 20 D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar. Beispiel 9
36er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)16 -[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D-glucopy- ranosyl]2o- Konjugat
a) 36er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)16 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl]2o- Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 2,5 g (0,20 mmol; entsprechend 4,0 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 8a) mit 5,58 g (17,6 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-ß-D- glucooyranose nach Aufarbeitung 3,26 g (90,2 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 8,44 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,52 H 5,35 N 10,62 S 3,55 Na 8,14 gef: C 45,61 H 5,42 N 10,57 S 3,49 Na 8,13
Der Ninhydrinfarbreaktionstest auf das Vorhandensein von freien Aminofunktionen in der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält somit keine freien Aminofunktionen mehr. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 56,2 % D-Glucose (entsprechend 20 Glucoseresten pro Molekül).
b) 36er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)16 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl] g- Konjugat
3,0 g (0,166 mmol; entsprechend 2,65 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 9a) werden in Analogie wie für Beispiel 1 c) beschrieben mit einer Lösung von 717 mg (2.72 mmol) Gadoliniumchlorid in 15 ml Wasser komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 3,18 g (98,4 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 6,43 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,22 H 4,96 N 9,85 S 3,29 Gd 12,91 Na 1 ,89 gef : C 42,24 H 4,93 N 10,01 S 3,27 Gd 12,99 Na 1 ,91
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 44 % Gd-DPTA und 56 % ß-D- Glucose (entsprechend 16 Gd-DTPA-Einheiten und 20 ß-D-Glucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 10
24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)-] -] - ( α'D- annopyranosyl-1 - thio-3-propionsäure-Amid ) 3-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)1 1
20,0 g (26,8 mmol) Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester (Titelverbindung aus Bei- spiel 31f) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren mit 3,7 g (32,16 mmol) N-Hydroxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur portionsweise mit insgesamt 6,6 g (32,16 mmol) Dicyclo- hexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0°C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 8,8 g (1 ,86 mmol; entsprechend 44,8 mmol an freien Aminofunktionen) 24er-Kaskadenpolyamin und 4,5 g (44,8 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der verbleibende Rückstand mit 250 ml Dichlormethan versetzt. Nach dem Abfϊltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organische Phase nacheinander mit 5 %iger Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Na- triumsulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 14,03 g (84,3 % d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nachfolgenden Syntheseschritte eingesetzt wird. Nach quantitativer Ninhydrinreak- tion der oben genannten Titelverbindung liegen im Mittel 13 freie Aminfunktionen pro Molekül vor.
Elementaranalyse: ber.: C 63,06 H 9,68 N 15,65 gef: C 63,20 H 10,02 N 15,71
b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid) -
[3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-α-D-mannopyranosyl-3-propion-Amid]13- Konjugat
Eine gerührte Lösung von 3,5 g (0,39 mmol; entsprechend 5,1 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 10a) in 100 ml absolutem Dichiormethan ,wird bei Raumtemperatur mit 617 mg (6,1 rr.mol) Triethylamir: versetzt. Anschließend wird mit einer Lösung von 2,97 g (5,61 mmol) 3-(2, 3,4,6- Tetra-O-acetyl-1-thio-α-D-mannopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimid- ester (Darstellung in Analogie zu : J. Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4, 85, (1993); Chipowsky, S., and Lee,Y.C (1973) , Synthesis of 1-Thio-aldosides; Carbohydrate Research 31, 339-346 ) in 60 ml Dichiormethan, bei Raumtempe- ratur tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit Dichiormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Va- kuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 5,0 g (89,7 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Elementaranalyse: ber.: C 57,67 H 8,03 N 9,73 S 2,90 gef: C 57,53 H 7,92 N 9,79 S 2,87
Somit ergibt sich aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der oben genannten Titelverbindung ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 55 % D-Mannose-tetraacetatresten (entsprechend 13 D-Mannoseeinheiten pro Molekül). c) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA -Amid)1 1 -
(-α-D- Mannopyranosyl-1-thio-3-propion-Amid)i3-Konjugat
4,5 g (0,312 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 10b) werden in 100 ml ab- solutem Dichiormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32 %igen wässrigen Ammoniaklösung versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösunc wird zweimal rr.it jeweils 60 mi Diethylether extrahiert. Die wässrige Produktlösung wird durch Versetzen mit 10 %iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM 3- Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet. Ausbeute: 2,80 g (81 ,6 % d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver Wassergehalt: 7,78 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 49,42 H 7,09 N 12,67 S 3,77 gef : C 49,18 H 7.13 N 12,81 S 3,69
Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung, in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein Beladungsgrad mit Gly Me-DOTA des Polymers von 44,8 % (entsprechend 1 1 Gly-Me DOTA-Einheiten pro Molekül). Nach Ninhydrinreaktion liegen im Polymer keine freien Aminofunktionen vor.
d) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)ι 1 - ( α-D- Mannopyranosyl- 1-thio-3-propionsäure-Amid )13-Konjugat
2,5 g (0,22 mmol; entsprechend 2,48 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 10c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe mit 10 %iger wässrigen Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Abschließend gibt man bei Raumtemperatur 670 mg (2,55 mmol) Gadoliniumchlorid gelöst in 10 ml Wasser hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C Bei Raumtemperatur wird die Reak- tionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3-Ultrafiltra- tionsmembran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Man erhält 2,7 g (97,3 % d.Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 9,37 %.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,77 H 6,05 N 19,96 S 3,26 Gd 13,54 gef : C 42,69 H 6,18 N 11 ,04 S 3.33 Gd 13,67
Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium (1 ,21 ) ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45,2 % Gd-Gly- Me-DOTA und 54,8 % α-D-Mannose (entsprechend 1 1 Gd-Gly-Me-DOTA-Ein- heiten und 13-α-D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 11
24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)^ - ( ß-D-Glucopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid ) 3-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)1 -
[3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)- ß-D-glucopyranosyl-3-propion-Amid]13- Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 10b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,0 g (0,33 mmol; entsprechend 4,3 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 10a) mit 2,76 g (5,2 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-ß-D-glucopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester, 4,0 g (85,3 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Elementaranalyse: ber.: C 57,67 H 8,03 N 9.73 S 2,90 gef: C 57,39 H 8.14 N 9,87 S 2.96
Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 13 D-Glucoseresten pro Molekül.
b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)1 1 - ( ß-D-Glucopyranosyl-1-thio- 3- propionsäure-Amid )13-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 10c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 3,5 g (0,24 mmcl) de Titelverbindung aus Beispiel 1 1 a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 2,2 g (83,6 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 4,73 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 49,42 H 7,09 N 12,67 S 3,77 gef: C 50,01 H 7.14 N 12,62 S 3,81
c) 24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)^ - ( ß-D-Glucopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid )13-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 10d) beschrieben, führt die Komplexierung von 2,0 g (0,176 mmol; entsprechend 1 ,94 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 11 b) mit 520 mg (1 ,98 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung. Ausbeute: 2,75 g (98,1 % d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver Wassergehalt: 9,36 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,77 H 6,05 N 10,96 S 3,26 Gd 13,54 gef : C 42,73 H 6,14 N 1 1 ,06 S 3,30 Gd 13,61 Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 13 D-Glucopyranosylreste
Beispiel 12
24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)^ - ( ß-D-Galactopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid ) ^-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)1 -
[3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)- ß-D-galactopyranosyl-3-propion-Amid] 3- Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 10b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,5 g (0,165 mmol; entsprechend 2,14 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 10a) mit 1 ,36 g (2,57 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O- acetyl-1-thio-ß-D-galactopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester 2,0 g (87,2 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.
Elementaranalyse: ber.: C 57,67 H 8,03 N 9,73 S 2,90 gef: C 57,78 H 8,14 N 9,80 S 2,97
Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 13 D-Galactoseresten pro Molekül.
b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)1 1 - ( ß-D-Galactopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid )1 -Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 10c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 1 ,8 g (0,12 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 12a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 1 ,15 g (87,2 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 4,22 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 49,42 H 7,09 N 12,67 S 3,77 gef: C 49,66 H 7.13 N 12,54 S 3,70
c) 24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)^ - ( ß-D-Galactopyranosyl- 1-thio-3-propionsäure-Amid )13-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 10d) beschrieben, führt die Komplexierung von 1 ,0 g (0,088 mmol; entsprechend 1 ,94 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 12b) mit 262 mg (1 ,0 mmol) Gadoliniumchlorid , gelöst in 10 ml Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung. Ausbeute: 1 ,08 g (96,4 % d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver Wassergenalt: 9,32 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,77 H 6,05 N 10,96 S 3,26 Gd 13,54 gef: C 42,56 H 6,12 N 10,93 S 3,24 Gd 13,51
Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung: 11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 13 D-Galactopyranosylreste
Beispiel 13
24er-Kaskadenamin-(Gd- dy-Me-DOTA-Amid)^ - (N-Acetyl- ß-D-glucosamino- pyranosyl-1-thio-3-propionsäure-Amid )13-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)1 1 -
[3-(N-Acetyl-3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio)- ß-D-glucosaminopyranosyl-3- propion-Amid]i3-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 10b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 2,0 g (0,22 mmol; entsprechend 2,86 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 10a) mit 1 ,74 g (3,43 mmol) 4-[(Acetylamino-4-deoxy)]- 3-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-ß-D-glucosaminopyranosyl)-propionsäure-N-hy- droxysuccinimidester 2,6 g (83,5 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Elementaranalyse: ber.: C 57,77 H 8,04 N 11 ,02 S 2,90 gef: C 57,68 H 8,12 N 11 ,13 S 2,87
Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Belastungsgrad des Polymers mit Tetraacetyl-glucosaminresten pro Molekül.
b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)1 1 - (N-Acetyl- ß-D- glucosaminopyranosyl-1-thio-3-propionsäure-Amid ) 3-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 10c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 2,5 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 13a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 1 ,74 g (88,3 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 10,02 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 49,84 H 7,10 N 13,65 S 3,60 gef: C 50,02 H 7,18 N 13,72 S 3,67
c) 24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)1 -, - (N-Acetyl- ß-D- glucosaminopyranosyl-1-thio-3-propionsäure-Amid )13-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 10d) beschrieben, führt die Komplexierung von 1,5 g (0,13 mmol; entsprechend 1 ,42 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 13b) mit 380 mg (1 ,45 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung. Ausbeute: 1 ,69 g (98,0 % d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver Wassergehalt: 7,44 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,48 H 5,95 N 11 ,91 S 3,14 Gd 13,02 gef: C 43,55 H 6,04 N 11 ,88 S 3,18 Gd 12,98 Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung: 11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 13 N-Acetyl-D-glucosaminopyranosylreste
Beispiel 14
48er- Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)19 -[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]2g-Konjugat
a) 48er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)i9 - Konjugat
5,0 g (0,47 mmoi; entsprechend 22,6 mmol an freien Aminfunktionen^ 48er- Starburst-Kaskadenamin (Tomalia D. A. ,et al.; Polym. J. (Tokyo ) 1935, 17, 117; Tomalia D. A. et al.; Macromolecules 1986, 19, 2466; Tomalia D. A. ,et al.; Macromolecules 1987, 20, 1164 ) werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 10,9 g (27,12 mmol) DTPA-Monoanhydrid-mo- no-ethylester portionsweise hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32%iger Natronlauge auf 11 ,5 eingestellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet. Ausbeute: 8,06 g (88,3 %; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver Wassergehalt: 7,32 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,18 H 6,50 N 17,59 Na 8,99 gef : C 45,26 H 6,61 N 17,32 Na 9,04 Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung, in Gegenwart von Xyienolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 40,1 % (entsprechend 19 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion [Lit.: Chem. Rev., 60, 39 (1960); Tetrahedron, 34, 1285 (1978); 4Z, 8791 (1991)] liegen im Mittel im Polyamin 29 freie Aminofunktionen pro Molekül vor.
b) 48er- Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)19 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl] g-Konjugat
1 ,0 g (0,051 mmol; entsprechend 1 ,5 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 14a) werden in 80 ml entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit 1 molarer Salzsäure auf 9,5 eingestellt. Anschließend wird portionsweise mit insgesamt 1 ,55 g (4,9 mmol) p-lso- thiocyanatophenyl-ß-D-galactopyranose versetzt, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung mittels 0,1 molarer Natronlauge bei 9,5 konstant gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei 22°C wird filtriert und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 250 ml aufgefüllt. Dreimalige Ultra- filtration der Reaktionslösung über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gefolgt von Gefriertrocknung des verbleibenden Rückstands liefert 1 ,34 g (92 % d. Theorie) eines amorphen und farblosen Feststoffs. Wassergehalt: 4,9 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,62 H 6,06 N 13,39 S 3,26 Na 6,12 gef: C 46,71 H 6.13 N 13,28 S 3,20 Na 6,21
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer lie- gen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 60 % D-Galactose (entsprechend 29 Galactoseresten pro Molekül). c) 48er- Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)19 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D-galactopyranosyl]29-Konjugat
1 ,0 g (6,035 m mol; entsprechend 0,66 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 14b) werden in 40 ml Natriumeitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 0,18 g (0,7 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations- membran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Ausbeute: 1 ,0 g (95 % d. Th.) als amorphes Pulver Wassergehalt: 5,23 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,06 H 5,67 N 12,66 S 13,08 Gd 9,89 Na 1 ,45 gef : C 44,20 H 5,71 N 12,59 S 13,11 Gd 10,01 Na 1 ,47
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 40 % Gd-DPTA und 60 % D-Galactose (entsprechend 19 Gd-DTPA-Einheiten und 29-D-Galactoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktionen keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 15
48er- Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)19-[1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] 2g -Konjugat
a) 48er- Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)19-[1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] 9 -Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 0,75 g (0,038 mmol; entsprechend 1 ,12 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 14a) mit 1 ,2 g (3,8 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-α- D-mannopyranose [Darstellung gemäß: Monsigny, M. et al., Biol. Cell, 5_1, 187 (1984)] nach Aufarbeitung 0,94 g (89,2 % d. Th.) eines amorphen und farblosen
Feststoffes.
Wassergehalt: 5,03 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,62 H 6,06 N 13,39 S 3,26 Na 6,12 gef: C 46,70 H 6,01 N 13,42 S 3,24 Na 6,09
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 60 % D-Mannose (entsprechend 29 Mannoseresten pro Molekül).
b) 48er- Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)ι9-[1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] 29 -Konjugat
0,85 g (0,029 mmol; entsprechend 0,56 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 15a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 0,15 g (0,58 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 854 mg (97,5 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 6,14 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,06 H 5,76 N 12,66 S 3,08 Gd 9,89 Na 1 ,45 gef: C 44,10 H 5,66 N 12,71 S 3,12 Gd 9,94 Na 1 ,38
Aus den molaren Eiementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 40 % Gd-DPTA und 60 % D-Mannose (entsprechend 19 Gd-DTPA-Einheiten und 29-D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktionen keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar. Beispiel 16
48er- Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)19-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl] 9- Konjugat
a) 48er- Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid) 9-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl]2g- Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0,051 mmol; entsprechend 1 ,5 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 14a) mit 1 ,44 g (4,56 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-ß- D-glucopyranose [Kaufware: Sigma oder Darstellung in Analogie zu: Monsigny et al., Biol. Cell., 51, 187 (1984)] nach Aufarbeitung 1 ,36 mg (34 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 5,08 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,62 H 6,06 N 13,39 S 3,26 Na 6,12 gef: C 46„55 H 6,12 N 13,29 S 3,24 Na 6,01
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 60 % D-Glucose (entsprechend 29 Glucoseresten pro Molekül).
b) 48er- Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid) 9-[1-(4-Thioureidophenyl)-ß -D-glucopyranosyl]29- Konjugat
1 ,0 g (0,034 mmol; entsprechend 0,646 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 16a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 0,17 g (0,66 mmol), gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, einer Gadolinium- chloridlösung komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 998 mg (97,2 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 3,94 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,06 H 5,67 N 12,66 S 3,08 Gd 9,89 Na 1 ,45 gef: C 44,12 H 5,67 N 12,74 S 3,00 Gd 10,01 Na 1 ,38
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 40 % Gd-DPTA und 60 % D-Glucose (entsprechend 19 Gd-DTPA-Einheiten und 29-D-Glucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktionen keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 17
48er- Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)19-[1-(4-Thioureidophenyl)- u. -L- fucopyranosyl]29-Konjugat
a) 48er- Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid) 9-[1-(4-Thioureidophenyl)- α - L- fucopyranosyl]29-Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0,051 mmol; entsprechend 1 ,48 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 14a) mit 1 ,65 g (5,57 mmol) p-lsothiocyanatophenyl- α-L-Fucopyranose [Darstellung gemäß: Tamio et al., Jpn. Kokai Tokio Koho, Jp 4211099 und Hilditch et al., J. Appl. Phycol. 3 (4), 345, (1991)] nach Aufarbei- tung 1 ,36 g (94 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 7,24 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 47,39 H 6,16 N 13,62 S 3,31 Na 6,22 gef: C 47,42 H 6,08 N 13,57 S 2,98 Na 6,30
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 60 % L-Fucose (entsprechend 29 α-L-Fucoseresten pro Molekül). b) 48er- Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)19-[1-(4-Thioureidophenyl)- α -L- fucopyranosyl]29-Konjugat
1 ,2 g (0,042 mmol; entsprechend 0,81 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 17a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 0,21 g (0,83 mmol) einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1 ,25 g (98,5 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 4,39 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,72 H 5,81 N 12,89 S 3,12 Gd 10,04 Na 1 ,47 gef: C 44.81 H 5,79 N i 2."S S 3, 16 Gd 10,09 Na 1 ,40
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 40 % Gd-DPTA und 60 % α-L-Fucose (entsprechend 19 Gd-DTPA-Einheiten und 29 α-L-Fucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktionen keine frei- en Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 18
24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]-| -Konjugat
a) 24er- Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid) o - Konjugat
Eine Lösung von 5,0 g (0,97 mmol, entsprechend 23,3 mmol an freien Aminfunktionen) 24er-Starburst-Dendrimer-Polyamin (Darstellung gemäß: Tomalia D. A. et al. ; Macromolecules 1986, 19, 2466 ; Tomalia D. A. et al.; Macromolecules 1987, 20, 1164 ) wird in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 11 ,2 g (27,9 mmol) DTPA-Monoanhydrid-mono-ethylester portionsweise hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH- Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32 %iger Natronlauge auf 11 ,5 eingestellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wurde dreimal mittels einer YMB-Ultrafiltra- tionsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet. Ausbeute: 4,6 g (92 % d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver Wassergehalt: 8,37 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,72 H 6,58 N 17,29 Na 9,38 gef : C 44,64 H 6,51 N 17.36 Na 9,42
Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 41 ,6 % (entsprechend 10 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion liegen im Mittel im Polymer 14 freie Aminofunktionen pro Molekül vor.
b) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]1 -Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0,10 mmol; entsprechend 1 ,43 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 18a) mit 1 ,60 g (5,03 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-ß- D-galactopyranose nach Aufarbeitung 1 ,32 g (93,3 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 7,31 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,25 H 6.13 N 13,31 S 3.16 Na 6,47 gef: C 46,32 H 6.19 N 13,28 S 3,09 Na 6,51
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel- wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59 % D-Galactose (entsprechend 14 Gaiactoseresten pro Molekül).
c) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]-| -Konjugat
1 ,0 g (0,07 mmol; entsprechend 0,7 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 18b) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 0,18 g (0,72 mmol) einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1 ,05 g (97,3 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 5,67 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,59 H 5,77 N 12,53 S 2,98 Gd 10,42 Na 1 ,52 gef: C 43,61 H 5,81 N 12,49 S 2,94 Gd 10,48 Na 1 ,47
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 41 % Gd-DPTA und 59 % D-Galactose (entsprechend 10 Gd-DTPA-Einheiten und 14-D-Galactoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 19
24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] -| -Konjugat
a) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)-α D-mannopyranosyl] -|4 -Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 0,95 g (0,096 mmol; entsprechend 1 ,344 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 18a) mit 1 ,29 g (94,6 mmol) p-lsothiocyanato- phenyl-α-D-mannopyranose nach Aufarbeitung 1 ,29 g (94,6 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 6,88 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,25 H 6.13 N 13,31 S 3,16 Na 6,41 gef: C 46,09 H 6,07 N 13,33 S 3,24 Na 6,51
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59 % D-Mannose (entsprechend 14 Mannoseresten pro Molekül).
b) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] -| -Konjugat
1 ,1 g (0,077 mmol; entsprechend 0,77 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 19a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 194,2 mg (0,79 mmol) Gadoliniumchlorid , gelöst in 10 ml destilliertem Wasser , komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1 ,14 g (98,6 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 4,72 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,55 H 5,77 N 12,53 S 2,98 Gd 10,42 Na 1 ,52 gef: C 43,61 H 5,82 N 12,48 S 3,04 Gd 10,38 Na 1 ,49
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 41 % Gd-DPTA und 59 % D-Mannose (entsprechend 10 Gd-DTPA-Einheiten und 14-D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar. Beispiel 20
24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl]1 - Konjugat
a) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl]14- Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,2 g (0,12 mmol; entsprechend 1 ,21 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 18a) mit 1 ,92 g (6,03 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-ß- D-glucopyranose nach Aufarbeitung 1 ,59 g (93,6 % d Th ) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 5,97 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,25 H 6,13 N 13,31 S 3.16 Na 6,27 gef: C 46,20 H 6,21 N 13,32 S 3,08 Na 6,37
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59 % D-Glucose (entsprechend 14 Glucoseresten pro Mole- kül).
b) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl] 4- Konjugat
1 ,40 g (0,089 mmol; entsprechend 0,89 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 20a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 219 mg (0,90 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, kom- plexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1 ,32 g (98,7 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 7,33 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,55 H 5,77 N 12,53 S 2,98 Gd 10,42 Na 1 ,52 gef: C 43,62 H 5,80 N 12,49 S 2,96 Gd 10,47 Na 1 ,58
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 41 % Gd-DPTA und 59 % D-Glucose (entsprechend 10 Gd-DTPA-Einheiten und 14-D-Glucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktionen keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 21
24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- α -L- fucopyranosyl]1 -Konjugat
a) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid) 0-[1-(4-Thioureidophenyl)- α -L- fucopyranosyl]14-Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0,10 mmol; entsprechend 1 ,4 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 18a) mit 1 ,50 g (5,03 mmol) p-lsothiocyanatophenyl- α -L-fucopyranose nach Aufarbeitung 1 ,3 g (94,2 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 6,08 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 47,00 H 6,23 N 13,53 S 3,21 Na 6,58 gef: C 46,94 H 6,19 N 13,55 S 3,25 Na 6,60
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel- wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59 % L-Fucose (entsprechend 14 Fucoseresten pro Molekül). b) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid) 0-[1-(4-Thioureidophenyl)- α - L- fucopyranosyl]-|4-Konjugat
1 ,1 g (0,078 mmol; entsprechend 0,78 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 21a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 197 mg (0,79 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1 ,14 g (98,6 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 6,97 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,20 H 5,86 N 12,72 S 3,02 Gd 10,58 Na 1 ,55 gef : C 44,28 H 5,88 N 12,69 S 2,99 Gd 10,62 Na 1 ,51
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 41 % Gd-DPTA und 59 % D-Glucose (entsprechend 10 Gd-DTPA-Einheiten und 14-D-Glucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 22
24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)-N- acetyl-ß-D-glucosaminopyranosyl] 14-Konjugat
a) 24er-Starburst-Dendrimer-( DTPA-Amid)1o-[1-(4-Thioureidophenyl)-N- acetyl-ß-D-glucosaminopyranosyl] 4-Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0,10 mmol; entsprechend 1 ,4 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 18a) mit 2,50 g (7,04 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-ß- D-glucopyranose nach Aufarbeitung 1 ,4 g (95 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 8,06 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,73 H 6.18 N 14,12 S 3,04 Na 6,22 gef: C 46,69 H 6,21 N 14,20 S 3,00 Na 6,24
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59 % N-Acetyi-D-Glucosamin (entsprechend 14 N-Acetyl-D- Glucosaminresten pro Molekül).
b) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)-N- acetyl-ß-D-glucosaminopyranosyl] 14-Konjugat
1 ,6 g (0,10 mmol; entsprechend 1 ,08 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 22a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 278 mg (1 ,10 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1 ,54 g (98,7 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 5,51 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,10 H 5,83 N 13,33 S 2,87 Gd 10,04 Na 1 ,47 gef: C 44,19 H 5,91 N 13,41 S 2,80 Gd 10,08 Na 1 ,44
Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 41 % Gd-DPTA und 59 % N-Acetyl-D-Glucosamin (entsprechend 10 Gd-DTPA-Einheiten und 14 N-Acetyl- D-Glucosaminresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrin- reaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 23
36er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)16 - ( α-D- mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid )20-Konjugat
a) 36er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid) 1 20,0 g (26,8 mmol) Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester (Titelverbindung aus Beispiel 31f) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren mit 3,7 g (32,16 mmol) N-Hydroxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur portionsweise mit insgesamt 6,6 g (32,16 mmol) Dicyclo- hexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0°C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 8,8 g (1 ,18 mmol; entsprechend 42,8 mmol an freien Aminofunktionen) 36er-Kaskadenpolyamin und 4,3 g (44,8 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der verbleibende Rückstand mit 250 ml Dichiormethan versetzt. Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organisierte Phase nacheinander mit 5 %iger Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Natriumsulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 12,5 g (86,2 % d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nachfolgenden Syntheseschritte eingesetzt wird. Nach quantitativer Ninhydrinreaktion der oben genannten Titelverbindung liegen im Mittel 20 freie Aminfunktionen pro Molekül vor.
Elementaranalyse: ber.: C 67,65 H 10,32 N 8,72 gef: C 67,50 H 10,41 N 8,91
b) 36er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)16 -
[3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-α-D- mannopyranosyl-3-propion- Amid]20-Konjugat
Eingerührte Lösung von 3,5 g (0,28 mmol; entsprechend 5,6 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 23a) in 100 ml absolutem Dichiormethan wird bei Raumtemperatur mit 708 mg (7,0 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wird mit einer Lösung von 3,6 g (6,8 mmol) 3-(2, 3,4,6- Tetra-O-acetyl-1-thio-α-D-mannopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimid- ester (Darstellung in Analogie zu : J. Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4, 85, (1993); Chipowsky, S., and Lee.Y.C (1973) , "Synthesis of 1-Thio-aldosides"; Carbohydrate Research 31, 339-346 ) in 60 ml Dichiormethan tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit Dichiormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 5,25 g (90,4 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Elementaranalyse: ber.: C 59,99 H 8,38 N 5.19 S 3 09 gef: C 60,41 H 8,52 N 5.08 S 3,00
Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 55,5 % D-Mannose- tetraacetat (entsprechend 20 D-Mannoseresten pro Molekül).
c) 36er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid) 6 - ( α-D- mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid )2Q-Konjugat
5,0 g (0,24 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 23b) werden in 100 ml absolutem Dichiormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver- bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32 %igen wässrigen Ammoniaklösung versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert. Die wässrige Produktlösung wird durch Versetzen mit 10 %iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltra- tionsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 2,69 g (94,1 % d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver Wassergehalt: 7,78 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 47,03 H 6,62 N 9,06 S 5,19 gef: C 46,98 H 6,73 N 9.10 S 5,24
d) 36er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)16 - ( α-D- mannopyranosyl- 1 -thio-3-propionsäure-Amid J2o-Konjugat
2,0 g (0, 16 mmol; entsprechend 2,6 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 23c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung wird durch tropfenweiser Zugabe mit 10 %iger wässrigen Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Abschließend gibt man bei Raumtemperatur 709 mg (2,7 mmol) Gadoliniumchlorid hinzu, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C. Bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3- Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefrier- getrocknet. Man erhält 2,31 g (97,5 % d.Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 6,7 %.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 39,24 H 5,11 N 7,56 S 4,33 Gd 16,98 gef: C 39,42 H 5,21 N 7,52 S 4,39 Gd 17,02
Aus den molaren Elemeπtverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 44 % Gd-Gly-Me-DOTA und 56 % D-Mannose (entsprechend 16 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 20-D- Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar. Beispiel 24
36er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)16 - ( ß-D-glucopyranosyl-1-thio- 3-propionsäure-Amid )2o-Konjugat
a) 36er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester- Amid)16 - [-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl- 1-thio ) -ß-D-glucopyranosyl-3-propionsäure- Amid)]2o-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 23b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,5 g (0,28 mmol; entsprechend 5,6 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 23a) m>t 3,6 g (6,8 mmol) 3-(2.3,4,6-Tetra-O-acetyι-l - thio-ß-D-glucopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (Darstellung in Analogie zu: J. Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4, 85, (1993); Chipowsky, S., and Lee, Y.C (1973), Synthesis of 1-Thio-aldosides; Carbohydrate Research 31 , 339 - 346) 5,4 g (93 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.
Elementaranalyse: ber.: C 59,99 H 8,38 N 5.19 S 3,09 gef: C 60,32 H 8,30 N 5,09 S 3.18
Die Titelverbindung zeigt eine negative quantitative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 20 D-Glucoseresten pro Molekül.
b) 36er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)i6 - ( ß-D-glucopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid )2o-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 23c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 5 g (0,24 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 24b) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 2,6 g (88,6 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 6,03 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 47,03 H 6,62 N 9,06 S 5.19 gef: C 47,12 H 6,71 N 9,02 S 5,30
c) 36er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid) 6 - ( ß-D-glucopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid ) o-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 23d) beschrieben, führt die Komplexierung von 2,0 g (0,16 mmol; entsprechend 2,6 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 24b) mit 709 mg (2,7 mmol) Gadoliniumchlorid , gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbirdung. Ausbeute: 2,35 g (98 % d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver Wassergehalt: 5,2 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber: C 39,24 H 5,11 N 7,56 S 4,33 Gd 16,98 gef: C 39,61 H 5,20 N 7,49 S 4.41 Gd 16,94
Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
16 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten (Polymerbeladungsgrad von 44,4 %) und 20 D-Glucopyranosylreste (Polymerbeladungsgrad von 55,6 %) Die Polymerbeladungsgrade wurden aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ermittelt.
Beispiel 25
36er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)16 - ( ß-D-galactopyranosyl-1 - thio-3-propionsäure-Amid )2o-Konjugat
a) 36er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester- Amid)16 - [ 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1 -thio)-ß-D-galactopyranosyl -3-propion- säure-Amid ) ]2o-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 23b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,5 g (0,28 mmol; entsprechend 5,6 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel- verbindung aus Beispiel 23a) mit 3,6 g (6,8 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-ß-D-galactopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester [Darstellung in Analogie zu: J. Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4, 85, (1993); Chipowsky, S., and Lee, Y.C (1973), "Synthesis of 1-Thio-aldosides; Carbohydrate Research 31 , 339 - 346] 5,1 g (87,8 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.
Elementaranalyse: ber.: C 59,99 H 8,38 N 5.19 S 3,09 gef: C 60,03 H 8,46 N 5.24 S 3.14
Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 20 D-Galactoseresten pro Molekül.
b) 36er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)16 - ( ß-D-galactopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid )2o-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 23c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 5,0 g (0,24 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 25b) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 2,64 g (90,2 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 8,3 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 47,03 H 6,62 N 9,06 S 5.19 gef: C 47,12 H 6,71 N 9,00 S 5,07
c) 36er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)16 - ( ß-D-galactopyranosyl- 1 -thio-3-propionsäure-Amid )2o-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 23d) beschrieben, führt die Komplexierung von 2,5 g (0,2 mmol; entsprechend 3,2 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 24b) mit 867 mg (3,3 mmol) Gadoliniumchlorid , gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung. Ausbeute: 2,88 g (97,3 % Th.) als farbloses und amorphes Pulver Wassergehalt: 9,3 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 39,24 H 5,11 N 7,56 S 4,33 Gd 16,98 gef: C 39,21 H 5,04 N 7,63 S 4,41 Gd 17,07
Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung: 16 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten (Polymerbeladungsgrad von 43,8 %) und 20 D-Galactopyranosylreste (Polymerbeladungsgrad von 56,2 %) Die Polymerbeladungsgrade wurden aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ermittelt.
Beispiel 26
48er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)2i - ( α-D-mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid )27-Konjugat
a) 48er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester-Amid)2i
20,0 g (26,8 mmol) Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester (Titelverbindung aus Beispiel 31f) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren mit 3,7 g (32,16 mmol) N-Hydroxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur portionsweise mit insgesamt 6,6 g (32,16 mmol) Dicyclo- hexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0°C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 6,0 g (0,92 mmol; entsprechend 4,4 mmol an freien Aminofunktionen) 48er-Kaskadenpolyamin und 4,5 g (46,8 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der verbleibende Rückstand mit 250 ml Dichiormethan versetzt. Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organisierte Phase nacheinander mit 5 %iger Salzsäure, gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Natriumsulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 13,75 g (83,2 % d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nachfolgenden Syntheseschritte eingesetzt wird. Nach quantitativer Ninhydrinreaktion der oben genannten Titeiverbindung liegen im Mittel 27 freie Aminfunktionen pro Molekül vor.
Elementaranalyse: ber.: C 63,35 H 9,61 N 16,36 gef: C 63,18 H 9,70 N 16,44
b) 48er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester-Amid)21 -
[3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-α-D-mannopyranosyl-3-propion-Amid]2 - Konjugat
Eine gerührte Lösung von 3,5 g (0,19 mmol; entsprechend 5,13 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 26a) in 100 ml absolutem Dichiormethan wird bei Raumtemperatur mit 657 mg (6,5 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wird mit einer Lösung von 3,3 g (6,3 mmol) 3-(2, 3,4.6- Tetra-O-acetyl-1-thio-α-D-mannopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimid- ester in 60 ml Dichiormethan tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit Dichiormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zwei- mal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 5,07 g (92,6 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die quantitative Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Elementaranalyse: ber.: C 58,65 H 7,98 N 10,21 S 3,00 gef: C 58,90 H 8,08 N 10,14 S 2.96
Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 56,2 % D-Mannose- tetraacetat (entsprechend 27 D-Mannoseresten pro Molekül). c) 48er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)21 - ( α-D-mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid )27-Konjugat
5,0 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 26b) werden in 100 ml absolutem Dichiormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver- bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32 %igen wässrigen Ammoniaklösung versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert. Die wässrige Produktlösung wird durch Versetzen mit 10 %iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltra- tionsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der ver- bleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 3,47 g (90,6 % d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver Wassergehalt: 9,11 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 51 ,08 H 7,12 N 13,32 S 3,92 gef: C 50,97 H 7,21 N 13,30 S 3,86
d) 48er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)2ι - ( α-D-mannopyranosyl- 1 -thio-3-propionsäure-Amid )27-Konjugat
3,0 g (0,136 mmol; entsprechend 285 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 26c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe mit 10 %iger wässrigen Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Abschließend gibt man bei Raumtemperatur 787 mg (3,0 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C Bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3- Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefrier- getrocknet. Man erhält 3,31 g (96,3 % d.Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 4,9 %.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44.54 H 5,96 N 11 ,62 S 3,42 Gd 13,04 gef: C 44,59 H 6,04 N 11 ,55 S 3,41 Gd 13,10
Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 43,8 % Gd-Gly-Me-DOTA und 56,2 % D-Mannose (entsprechend 21 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 27- D-Mannosc3<-esten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 27
48er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)21 - (ß-D-glucopyranosyl-1-thio-3- propionsäure-Amid )2 -Konjugat
a) 48er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester-Amid)21 - [3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)- ß-D-glucopyranosyl-3-propion-
Amid]27-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 26b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,5 g (0,19 mmol; entsprechend 5,13 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel- Verbindung aus Beispiel 26a) mit 3,3 g (6,3 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-ß-D-glucopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester 5,57 g (93 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.
Elementaranalyse: ber.: C 58,65 H 7,98 N 10,21 S 3.00 gef : C 58,68 H 8,10 N 10,20 S 3.07 Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Belastungsgrad des Polymers mit 27 D-Glucoseresten pro Molekül.
b) 48er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)21 - (ß-D-glucopyranosyl-1-thio-3- propionsäure-Amid )27-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 26c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 5 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 27a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 2,23 g (84,7 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 7,44 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 51 ,08 H 7.12 N 13,32 S 3,92 gef: C 51 ,11 H 7.10 N 13,26 S 4.01
c) 48er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)2 - (ß-D-glucopyranosyl- 1 -thio-3-propionsäure-Amid )27-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 26d) beschrieben, führt die Komplexierung von 3,0 g (0,136 mmol; entsprechend 2,85 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titel- Verbindung aus Beispiel 27b) mit 787 mg (3,0 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung. Ausbeute: 3,36 g (98 % d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver Wassergehalt: 4,41 %
Elementaranaiyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,54 H 5,96 N 11 ,62 S 3,42 Gd 13,04 gef: C 44,39 H 5,88 N 11 ,74 S 3,40 Gd 13,00
Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung: 21 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten (Polymerbeladungsgrad von 43,8 %) und 27 D-Glucopyranosylreste (Polymerbeladungsgrad von 56,2 %) Die Polymerbeladungsgrade wurden aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ermittelt. Beispiel 28
48er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)21 - (ß-D-galactopyranosyl-1-thio- 3-propionsäure-Amid )27-Konjugat
a) 48er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester-Amid)21 - [3-(2,3,4,6- Tetra-O-acetyl-1-thio)- ß-D-galactopyranosyl-3-propion-Amid]27-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 26b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,5 g (0,19 mmol; entsprechend 5,13 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 26a) mit 3,3 g (6,3 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-ß-D-gaiactopyranosyl)-propιonsäure-N-hydroxysuccinimidester 5,23 g (90,2 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.
Elementaranalyse: ber.: C 58,65 H 7,98 N 10,21 S 3,00 gef: C 58,66 H 8,00 N 10,31 S 3,11
Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 27 D-Galactoseresten pro Molekül.
b) 48er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)21 - (ß-D-galactopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid )27-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 26c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 5,0 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 28a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 3,48 g (91 ,4 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 6,79 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 51 ,08 H 7,12 N 13,32 S 3,92 gef: C 51 ,12 H 7,19 N 13,27 S 3,99 c) 48er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)21 - (ß-D-galactopyranosyl- 1 -thio-3-propionsäure-Amid )27-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 26d) beschrieben, führt die Komplexierung von 3,0 g (0,136 mmol; entsprechend 2,85 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 28b) mit 787 mg (3,3 mmol) Gadoliniumchlorid , gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung. Ausbeute: 3,32 g (96,9 % Th.) als farbloses und amorphes Pulver Wassergehalt: 8,70 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,54 H 5,96 N 11 ,62 S 3,42 Gd 13,04 gef: C 44,50 H 5,94 N 11.58 S 3,37 Gd 12,98
Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
21 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten (Polymerbeladungsgrad von 43,6 %) und 27 D-Galactopyranosylreste (Polymerbeladungsgrad von 56,4 %) Die Polymerbeladungsgrade wurden aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ermittelt.
Beispiel 29
48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)19- (O-ß-D-Galactopyranosyl-(1→4)- D-glucono-1 ,5-lacton-Amid ) g -Konjugat
a) 48er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)-|g- (O-ß-D-Galactopyranosyl- (1→4)-D-glucono-1 ,5-lacton-Amid ) g -Konjugat
Zu einer gerührten Lösung von 4,0 g (0,20 mmol ; entsprechend 6,0 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 14a) werden bei Raumtemperatur in 40 ml absolutem Dimethylsulfoxid suspendiert. An- schließend wird eine Lösung von 13,3 g (37,2 mmol, entsprechend 6,26 g Lacton pro vorliegender Aminofunktion) O-ß-D-Galactopyranosyl-(1-4)-D- glucono-1 ,5-lacton (Darstellung gemäß (a) Williams, T.J.; Plessas, N.R., Goldstein, I.J. Carbohydr. Res. 1978, 67, Cl. (b) Kobayashi, K.; Sumitomo, H.; Ina, Y. Poiym. J. 1985, 17, 567, (c) Hiromi Kitano, Katsuko Sohda, and Ayako Kosaka, Bioconjugate Chem. 1995, , 131-134) in 40 ml absolutem Dimethyisulfoxid bei 22°C tropfenweise addiert. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 14 Stunden bei 40°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei Raumtemperatur mit 500 ml absolutem Methanol versetzt und der entstehende farblose Niederschlag mittels einer G4-Fritte abgesaugt und gut mit insgesamt 250 ml absolutem Methanol nachgewaschen. Der so erhaltene Feststoff wird nun in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und über eine Ultrafiltrationsmembran (YM-3, Amicon, Ausschlußgrenze 3 kD) insgesamt dreimal ultrafiltriert. Der verbleibende Rück- stand wird vollständig in destilliertem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,42 g (92,7 % d. Th.) als farbloses Lyophilisat Wassergehalt: 8,34 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,23 H 6,31 N 11 ,66 Na 5,96 gef: C 44,41 H 6,28 N 11 ,60 Na 6,03
Nach Elementaranaiyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 39,4 % (entsprechend 19 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach Ninhydrinreaktion sind in der oben genannten Titelverbindung keine Aminofunktionen mehr nachweisbar.
b) 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)19- (O-ß-D-Galactopyranosyl- (1→4)-D-glucono-1 ,5-lacton-Amid ) g -Konjugat
4,0 g (0,136 mmol; entsprechend 2,6 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 29a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit 691 mg (2,65 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 4,14 g (98,7 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 6,94 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 41 ,84 H 5,96 N 11 ,03 Gd 9,64 Na 1 ,41 gef: C 41 ,90 H 6,03 N 10,97 Gd 9,61 Na 1 ,39
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen.
Beispiel 30
24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10- (O-ß-D-Galactopyranosyl- (1→ )-D-glucono-1 ,5-lacton-Amid ) 4 -Konjugat
a) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)10- (O-ß-D-Galactopyranosyl- (1→4)-D-glucono-1 ,5-lacton-Amid )1 -Konjugat
Zu einer gerührten Lösung von 4,0 g (0,4 mmol), entsprechend 5,7 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 18a) werden bei Raumtemperatur in 40 ml absolutem Dimethylsulfoxid suspendiert. Anschließend wird eine Lösung von 12,66 g (35,4 mmol, entsprechend 6,2 g Lacton pro vorliegende Aminofunktion) O-ß-D-Galactopyranosyl-(1-4)-D- glucono-1 ,5-lacton in 40 ml absolutem Dimethylsulfoxid bei 22°C tropfenweise addiert. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 14 Stunden bei 40°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei Raumtemperatur mit 500 ml absolutem Methanol versetzt und der entstehende farblose Niederschlag mittels einer G4- Fritte abgesaugt und gut mit insgesamt 200 ml absolutem Methanoi nachgewaschen. Der so erhaltene Feststoff wird nun in 350 ml destilliertem Wasser gelöst und über eine Ultrafiltrationsmembran (YM-3, Amicon, Ausschlußgrenze 3 kD) insgesamt dreimal ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird vollständig in destilliertem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,6 g (96,0 % d. Th.) als farbloses Lyophilisat Wassergehalt: 10,2 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,95 H 6,37 N 11 ,63 Na 6,31 gef: C 44,06 H 6,22 N 11 ,59 Na 6,40 Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 41 ,5 % (entsprechend 10 DTPA-Einheiten pro Molekül).
Nach Ninhydrinreaktion als auch TNBS-Methode sind in der oben genannten Titelverbindung keine Aminofunktionen mehr nachweisbar.
b) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)10- (O-ß-D-Galactopyranosyl- (1→4)-D-glucono-1 ,5-lacton-Amid )14 -Konjugat
5,0 g (0,343 mmol; entsprechend 10,34 mmol an DTPA der Titelverbindung aus Beispiel 30a) werden in Analogie wie für Beispiel 1 c) beschrieben mit 272 g (10,45 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 5,17 g (97,6 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 8,11 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 41 ,44 H 6,00 N 10,97 Gd 10,18 Na 1 ,49 gef: C 41 ,51 H 5,96 N 11 ,03 Gd 10,24 Na 1 ,46
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen.
Beispiel 31
24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]14-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)10 -Konjugat
Eine gerührte Suspension von 5,0 g (7,95 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31 h) in 15 ml absolutem Dimethylsulfoxid wird bei 70°C mit 0,68 g (15,9 mmol) Lithiumchlorid versetzt. Nach 30 Minuten bei 70°C wird die nun klare Reaktionslösung portionsweise mit insgesamt 1 ,83 g (15,9 mmol) N-Hydroxy- succinimid versetzt und das Reaktionsgemisch noch 1 Stunde bei dieser Temperatur gehalten. Nach dem Abkühlen auf 0°C wird mit 4,52 g (23,85 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und die Reaktionslösung noch 1 weitere Stun- de bei 0°C, gefolgt von 12 Stunden bei 22°C, gerührt. Die so erhaltene Reaktionslösung des N-Hydroxysuccinimidesters der Titelverbindung aus Beispiel 31 h) wird nun bei 22°C tropfenweise mit einer Lösung von 2,61 g (0,55 mmol, entsprechend 13,23 mmol an freien Aminfunktionen, 24er Kaskadenpolyamin, gelöst in 15 ml absolutem Dimethylsulfoxid versetzt und weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung bei 22°C in 1 ,5 I Aceton eingetropft, wobei die Titelverbindung als farbloser Niederschlag ausfällt. Der Niederschlag wird abgesaugt, in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) dreimal ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird in 300 ml destilliertem Wasser gelost, filtriert und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 4,0 g (82,0 % bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes und farbloses Pulver.
Wassergehalt: 7,38 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,10 H 6,07 N 14,97 Gd 17,69 gef: C 43,18 H 5,99 N 15,03 Gd 17,74
Nach Elementaranalyse ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 41 ,5 % Gd-Gly-Me-DOTA (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten pro Molekül). Die Bestimmung der im Polymer verbliebenen freien Aminofunktionen mittels Ninhydrin und TNBS-Methode liefert als Mittelwert 58, 1 % an freien Aminogrup- pen, d. h. im Polymermolekül liegen 14 freie Aminofunktionen vor.
b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D-galactopyranosyl]ι4-Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1 d) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0, 1 12 mmol; entsprechend 1 ,57 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 31a) mit 2,5 g (7,87 mmol; entsprechend 5 Molequivalente bezogen auf eingesetztes Polyamin) p-lsothiocyanatophenyl-ß- D-galactopyranose nach Aufarbeitung 1 ,33 g (93,2 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 7,41 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,32 H 5,66 N 11 ,50 S 3,78 Gd 11 ,84 gef: C 45,40 H 5,72 N 11 ,61 S 3,42 Gd 11 ,88
Die Ninhydrinreaktion als auch in TNBS-Methode der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem molaren Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 58,3 % D-Galactopyranose
(entsprechend 14 Galactoseresten pro Molekül) sowie 41 ,7 % Gd-Gly-DOTA (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA Komplexe pro Molekül).
c) N-(2-Brompropionyl)-glycinbenzylester
Zu 100 g (296,4 mmol) Glycinbenzylester p-Toluolsulfonsäuresalz und 89,98 g (889,2 mmol) Triethylamin in 500 ml Methyienchiorid tropft man bei 0°C 60,97 g (355,7 mmol) α-Brompropionylchiorid zu. Dabei hält man die Temperatur zwischen 0°C - 5°C. Man gibt 1000 ml 5 %ige aqu. Salzsäure zu und trennt die or- ganische Phase ab. Die organische Phase wird noch einmal mit 500 ml 5 %iger aqu. Salzsäure extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Di-isopropylether umkristallisiert. Ausbeute: 69,39 g (78 % d. Th.)
Elementaranalyse: ber.: C 48,02 H 4,70 N 4,67 Br 26,62 gef: C 47,91 H 4,82 N 4,51 Br 26,47 d) 1-[1-Benzyloxycarbonylmethylcarbamoyl)-ethyl]-1 , 4,7,10-tetraazacyclodo- decan
Zu 86,14 g (500 mmol) 1 ,4,7,10-Tetraazacyclododecan gelöst in 1000 ml Chloroform gibt man 50 g (166,6 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31 c) und rührt 24 Stunden bei Raumtemperatur. Man extrahiert 3 mal mit 600 ml Wasser, trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum zur Trockne ein.
Ausbeute: 53,48 g (82 % d. Th.) eines leicht gelb gefärbten Öls Wassergehalt: 1 ,5 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 61 ,36 H 8,50 N 17,89 gef : C 62,03 H 8,75 N 17,36
e) 10-[1 -Benzyloxycarbonylmethylcarbamoyl)-ethyl]-1 ,4,7, 10-tetraazacyclodo- decan-1 ,4,7-triessigsäure-tri-tert-butylester, Natriumbromid
Zu 50 g (127,7 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31 d) und 54,14 g (510,8 mmol) Natriumcarbonat in 500 ml Acetonitril gibt man 82,20 g (421 ,4 mmol) Bromessigsäure-tert.-butylester und rührt 12 Stunden bei 60°C Man kühlt auf 0°C und filtriert von den Salzen ab. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Methylenchlo- rid/Methanol= 20:1). Ausbeute: 90,83 g (85 % d. Th.) eines farblosen Feststoffes
Elementaranalyse: ber.: C 54,54 H 7,59 N 8,37 Na 2,75 Br 9,55 gef : C 54,37 H 7,71 N 8,21 Na 2,83 Br 9,69 f) 10-[1 -Carboxymethylcarbamoyl)-ethyl]-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan- 1 ,4,7-triessigsäure-tri-tert-butylester, Natriumbromid
90 g (107,5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31 e) löst man in 1000 ml Isopropanol und gibt 5 g Palladiumkatatlysator (10 % Pd/C) zu. Man hydriert über Nacht bei Raumtemperatur. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Dioxan umkristallisiert. Ausbeute: 77,06 g (96 % d. Th.) eines kristallinen Feststoffes
Elementaranalyse: ber.: C 49,86 H 7,69 N 9.38 Na 3,08 Br 10,70 gef : C 49,73 H 7,79 N 9,21 Na 3,19 Br 10,83
g) 10-[1 -Carboxymethylcarbamoyl)-ethyl]-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan- 1 ,4,7-triessigsäure
77 g (103,1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31f) werden in 500 ml Trifluoressigsäure gelöst und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man dampft zur Trockne ein, nimmt den Rückstand in 300 ml Wasser auf und gibt die Lösung auf eine Säule, gefüllt mit Reillex® 425 PVP. Man eluiert mit Wasser. Die produkthaltigen Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingedampft, der Rückstand wird aus Methanol/Aceton umkristallisiert. Ausbeute: 44,04 g (84 % d. Th.) eines farblosen, hygroskopischen Feststoffes Wassergehalt: 6,5 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 47,99 H 6,99 N 14,73 gef: C 47,83 H 7,12 N 14,55
h) Gadolinium-Komplex der 10-[1 -Carboxymethylcarbamoyl)-ethyl]-1 ,4,7, 10- tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure
Zu 40 g (84,12 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31g) , gelöst in 400 ml Wasser, gibt man 15,27 g (42,06 mmol) Gadoliniumoxid und erwärmt 3 h auf 90°C Man dampft zur Trockne ein (Vakuum) und kristallisiert den Rückstand aus 90 % aqu. Ethanol um. Die Kristalle werden abgesaugt, einmal mit Ethanol, dann mit Aceton und zum Schluß mit Dimethylether gewaschen und im Vakuumofen bei 130°C getrocknet (24 Stunden). Ausbeute: 50,53 g (93 % d. Th.) eines farblosen kristallinen Pulvers Wassergehalt: 2,5 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 36,24 H 4,80 N 11 ,12 Gd 24,97 gef: C 36,35 H 4,95 N 10,98 Gd 24,80
Beispiel 32
24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)10-[1-(4-Thicureidophenyl)- α - D-mannopyranosyl] 14 -Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- α -D-mannopyranosyl] 14 -Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0,11 mmol; entsprechend 1 ,57 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 31g) mit 2,5 g (7,87 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-α- D-mannopyranose nach Aufarbeitung 1 ,38 g (94,7 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 5,76 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,32 H 5,66 N 11 ,50 S 3,38 Gd 11 ,84 gef: C 45,42 H 5,72 N 11 ,47 S 3,41 Gd 11 ,81
Die Ninhydrinreaktion als auch in TNBS-Methode der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefeiwert der Elementaranalyse der Titeiverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 56,8 % D-Mannopyranose (entsprechend 14 Mannoseresten pro Molekül) sowie 41 ,2 % (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA Komplexen pro Molekül). Beispiel 33
24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- glucopyranosyl]1 - Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)10-[1 -(4-Thioureidophenyl)- ß-D-glucopyranosyl]14- Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,2 g (0,13 mmol; entsprechend 1 ,89 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 31g) mit 2,34 g (7,87 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-ß- D-glucopyranose nach Aufarbeitung 1 ,53 g (88,9 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wasseroehalt: 6,44 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,05 H 5,85 N 11 ,68 S 7,44 Gd 12,03 gef: C 45,96 H 5,90 N 11 ,71 S 3,40 Gd 12,10
Die Ninhydrinreaktion als auch in TNBS-Methode der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titeiverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 57,9 % D-Glucopyranose (entsprechend 14 Glucoseresten pro Molekül) und 42,1 % (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA Komplexen pro Molekül).
Beispiel 34
24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- α -L- fucopyranosyl]ι4-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)10-[1-(4-Thioureidophenyl)- α -L- fucopyranosyl]14-Konjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1 b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0,1 12 mmol; entsprechend 1 ,57 mmol an freien Aminfunktionen) der Ti- telverbindung aus Beispiel 31a) mit 2,34 g (7,87 mmol) p-lsothiocyanatophenyl- α-L-fucopyranose nach Aufarbeitung 1 ,37 g (93,7 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 4,92 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,05 H 5,85 N 11 ,68 S 7,44 Gd 12,03 gef: C 45,96 H 5,90 N 11 ,71 S 3,40 Gd 12,10
Die Ninhydrinreaktion als auch in TNBS-Methode der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elemeπtaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 54,1 % α-L-Fucose (entsprechend 13 α-L-Fucoseresten pro Molekül) sowie 40,6 % (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA Komplexen pro Molekül).
Beispiel 35
a) 1-[4-Nitrophenyl]-tetraethylenglycol
863,2 (5 mol) Tetraethylenglycoi werden in 2,5 I wasserfreiem Toluol gelöst und bei Raumtemperatur nacheinander mit 159,4 g (2,5 mol) 88 %igem Kalium- hydroxydpulver und 7,5 g Tetrabutyiammoniumhydrogensulfat versetzt. Bei 0°C wird dann unter starkem Rühren eine Lösung von 53 ml (500 mmol) 4-Fluor- nitrobenzol in 500 ml wasserfreiem Toluol tropfenweise addiert . Nach beendeter Zugabe wird nach 4 Stunden bei 0°C und 12 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt. Zur Aufarbeitung wird das Reaktionsgemisch in 2000 ml Eiswasser eingerührt und anschließend wird die Toluolphase abgetrennt und die wässrige Phase erschöpfend mit Toluol extrahiert. Nach dem Waschen der vereinigten organischen Phasen mit Wasser wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der verbleibende, leicht gelblich gefärbte, ölige Rückstand wird säulenchromatographisch gerei- nigt (Eluent: Essigester/ Hexan= 3:1). Man erhält 135,8 g (86,1 % d. Th.) eines leicht gelblich gefärbten Öls. Elementaranalyse: ber.: C 53,33 H 6,71 N 4,44 gef: C 53,27 H 6,68 N 4,50
b) 2,3,4,6-Tetraacetyl-ß-D-galactopyranosyl-1-O-[(4-Nitrophenyl)- tetraethylenglycol]
10 g ß-D-Galactosepentaacetat (Kaufware Aldrich) wird in 40 ml absolutem 1 ,2- Dichlorethan gelöst und mit einer Lösung von 8,0 g (25,6 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 35a) in 15 ml 1 ,2-Dichlorethan versetzt. Anschließend werden 3,9 ml (33,3 mmol) Zinntetrachlorid bei Raumtemperatur langsam zugetropft und die so erhaltene Reaktionslösung wird noch 12 h bei Raumtemperatur nachgerührt. Zur Aufarbeitung wird mit Wasser versetzt, die organische Phase abgetrennt und die verbleibende wässrige Phase erschöpfend mit Dichiormethan extrahiert. Nach dem Trocknen der organischen Phasen über Natriumsulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der verbleibende ölige Rückstand wird mittels Säulenchromatographie aufgereinigt (Eluent: Dichlormethanol/Methanol= 20:1). Man erhält 14,6 g (88,2 % d. Th.) eines farblosen Öls.
Elementaranaiyse: ber.: C 52,09 H 6,09 N 2,17 gef: C 52,13 H 6,11 N 2,21
c) ß-D-Galactopyranosyl-1-O-[(4-Nitrophenyl)-tetraethylenglycol]
33,93 g (52,56 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 35b) werden in 680 ml absolutem Methanol gelöst und mit 0,8 g Natriummethanolat versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch portionsweise Zugabe von IRA-120 (H+)-Kationenaustauscher neutralisiert, vom Austauscher abgesaugt und das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Die so erhaltene Titelverbindung (23,3 g, 95,5 % d. Th.) wird ohne weitere Reinigung direkt für den nachfolgenden Reduktionsschritt eingesetzt. Elementaranalyse: ber.: C 50,31 H 6,54 N 2,93 gef: C 50,48 H 6,74 N 3,07
d) ß-D-Galactopyranosyl-1-O-[(4-aminophenyl)-tetraethylengiycol]
Die Reduktion von 14,61 g (30,6 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 35c) erfolgt nach den in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen (vgl. hierzu: Taylor, J.K. et al., J. Chem. Soc, Chem. Commun.; 1993, 1410; Goldstein I.J., Methods in Enzymologie, Vol. XXVII, Part B., 212-219, 1972) unter Verwendung von Wasserstoff (1 atm.) als Reduktionsmittel, Palladium (10 %) auf Bariumsulfat als Katalysator und wasserfreiem Methanol als Lösungsmittel. Nach Aufarbeitung erhält man 13,15 g (96 % d. Th.) der Titciver- bindung als farbloses Öl.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 53,04 H 6,57 S 6,74 gef: C 53,13 H 6,60 S 6,84
f) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)10 -[1-O-(4-Thioureido- tetraethylenglycolyl-pheny)- ß-D-galactopyranosyl]14-Konjugat
Auf analoge Weise wie in Beispiel 1 b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 4,0 g (0,448 mmol der Titelverbindung aus Beispiel 31a) entsprechend 6,28 mmol an freien Aminfunktionen) mit 14,93 g (31 ,4 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 35e) nach Aufarbeitung 6,01 g (86,3 % d. Th. bezogen auf eingesetztes Polyamin) als farbloses Lyophilisat.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 47,36 H 6,28 N 8,56 S 2,89 Gd 10,11 gef: C 47,41 H 6,31 N 8,49 S 2,93 Gd 10,18
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem molaren Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 58,3 % D-Galactopyranose (entsprechend 14 Galactoseresten pro Molekül) sowie 41 ,7 % Gd-Gly-DOTA (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA Komplexe pro Molekül).
Beispiel 36
24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)10 -[1-O-(4-Thioureido- tetraethylenglycolyl-pheny)-α -D-mannopyranosyl]1 -Konjugat
a) α-D-Mannopyrannosyl-1-O-[(4-isothiocyanatophenyl)-tetraethylenglycol]
Auf analogem Wege, wie in den Beispielen 35b) - 35e) für die Synthese der Titelverbindung aus Beispiel 35e) beschrieben, führt die Umsetzung von 15 g α- D-Manno≤epentaacetat (38,4 mmol, Kaufware Sigma) zur Bildung von 13,22 g (72,4 % d. Th.; über 4 Syntheseschritte) der oben genannten Titelverbindung als farbloses Öl.
Eiementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 53,04 H 6,57 S 6,74 gef: C 53,14 H 6,60 S 6,68
b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)10 - [1-O-(4-Thioureido- tetraethylenglycolyl-pheny)-α -D-mannopyranosyl]-| -Konjugat
Durch eine analoge Reaktionsführung, wie in Beispiel 1b) beschrieben, führt die Umsetzung von 5,0 g (0,56 mmol, entsprechend 7,85 mmol an freien Aminofunktionen, der Titelverbindung aus Beispiel 31a) mit 18,66 g (39,25 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 36a) zur Bildung von 7,5 g (86,3 % d. Th.) bezogen auf eingesetztes Polyamin der oben genannten Titelverbindung als farbloses Lyophilisat.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 47,36 H 6,28 N 8,56 S 2,89 Gd 10,11 gef: C 47,31 H 6,36 N 8,49 S 2,94 Gd 10,22
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem molaren Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 58,8 % D-Mannopyranose (entsprechend 14 Mannoseresten pro Molekül) sowie 41 ,2 % Gd-Gly-DOTA (entsprechend 10 Gd-Gly- Me-DOTA Komplexe pro Molekül).
Beispiel 37
24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)10 - [1-O-(4-Thioureido- tetraethylenglycolyl-pheny)- N-Acetyl-ß-D-glucosaminopyranosyl]14-Konjugat
a) 1-O-[4-lsothiocyanatophenyl]-tetraetylenglycolyl-N-acetyl-ß-D- glucosaminopyranose
Auf analogem Wege wie in den Beispielen 35b-35e) beschrieben, führt die Umsetzung von 10 g (25,68 mmol) N-Acetyl-ß-D-glucosaminpentaacetat zur Bildung von 9,85 g (74,3 % d. Th. über 4 Syntheseschritte) der oben genannten Titelverbindung als farbloses Öl.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 53,48 H 6,63 N 2,71 S 6,21 gef: C 53,60 H 6,59 N ,274 S 6,28
b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)10 - [1-O-(4-Thioureido- tetraethylenglycolyl-pheny)- N-Acetyl-ß-D-glucosaminopyranosyl]14- Konjugat
Durch analoge Reaktionsdurchführung wie in Beispiel 1b) beschrieben, führt die Umsetzung von 4,0 g (0,45 mmol, entsprechend 6,3 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 31a) mit 16,2 g (31 ,5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 37a) zur Bildung von 6,15 g (85 % d. Th., bezogen auf eingesetztes Polyamin) der oben genannten Titelverbindung als farbloses Lyo- philisat
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 47,75 H 6,32 N 9,47 S 2,78 Gd 9,75 gef: C 47,84 H 6,38 N 9,59 S 2,86 Gd 9,80 Beispiel 38
24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)10 - [1-O-(4-Thioureido- tetraethylenglycolyl-pheny)- ß-D-glucopyranosyl]14-Konjugat
a) 1-O-[4-lsothiocyanatophenyl]-tetraetylenglycolyl-ß-D-glucopyranose
Auf analogem Wege wie in den Beispielen 35b-35e) beschrieben, führt die Umsetzung von 8,52 g (25,68 mmol) ß-D-glucopyranosyltetraacetat (Darstellung gemäß: Rosemann S., et al., Biochemistry, Vol. 8, No. 4, 1969, 1351-1359; Pri- har, Behrmann, Biochemistry 1973, 12, 997-1000) zur Bildung von 9,92 g (76,8 % d. Th. über 4 Syntheseschritte) der oben genannten Titelverbindung als farb- loses Öl (zur analogen Synthese vgl. Lit Monsigny, M., et al., Biol. Cell., 51, 187 (1984)) .
Elementaranaiyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 50,09 H 5,80 N 2,78 S 6,37 gef: C 50,14 H 5,86 N 2,86 S 6,40
b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)10 - [1 -O-(4-Thioureido- tetraethylenglycolyl-pheny)- ß-D-glucopyranosyl]ι4-Konjugat
Die analoge Reaktionsdurchführung wie in Beispiel 1 b) beschrieben, führt durch Umsetzung von 4,0 g (0,45 mmol, entsprechend 6,3 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 31a) mit 15,86 g (31 ,5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 38a) zur Bildung von 6,04 g (84,2 % d. Th., bezo- gen auf eingesetztes Polyamin) der oben genannten Titelverbindung als farbloses Lyophilisat.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,19 H 5,95 N 9,58 S 2,82 Gd 9,87 gef : C 46,28 H 5,91 N 9,63 S 2,76 Gd 9,80 Beispiei 39
12er-Kaskadenpolyamin-(111 ln-DTPA-Amid)4-[ß-1 -O-(6-Thioureidohexyl)- sialyl-Lex]s-Konjugat
a) 12er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid) -Konjugat
Eine Lösung von 5,0 g (4,07 mmol; entsprechend 48,8 mmol an freien Aminofunktionen) 12er Kaskadenpolyamin (Darstellung gemäß : Schmitt-Willich et al. ; EP 0271180 ) wird in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge ein pH-Wert von 9,5 eingestellt Anschließend gibt man insgesamt 14,7 g (36,5 mmol) DTPA-ivlcnoaπhydrid-mono-ethyiester hinzu, wobei der pH- Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32 %iger Natronlauge auf 11 ,5 eingestellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Was- ser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet. Ausbeute: 11 ,2 g (89,3 % d. Th. ; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver Wassergehalt: 9,41 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,99 H 5,78 N 14,98 Na 11 ,92 gef: C 44,08 H 5,82 N 14,90 Na 11 ,87
Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 32,94 % (entsprechend 4 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion als auch der quantitativen Aminogruppenbestimmung mit der TNBS-Methode (vgl. hierzu Fields, R., J. Biochem. 1971. 124. 581-590) liegen im statistischen Mittel pro Polymermolekül 13 freie Aminofunktionen vor.
b) ß-1 -O-[6-lsothiocyanatohexyl]-sialyl-Lex-glycosid
150 mg (0,146 mmol) ß-1-O-[6-Aminohexyl]-sialyl-Lex-glycosid (Darstellung gemäß: Kunz, H. et al., Angew. Chem. 1994, 106, Nr. 20 ; Kretzschmar et al. , Tetrahedron, Vol.51. No. 47. 13015-13030 , 1995 ) werden in 20 ml 80 %igem, wässrigem Ethanol gelöst und bei 0°C mit 0,028 ml (0,365 mmol) Thiophosgen durch Zugabe über eine Mikrospritze versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 22°C wird das Ethanol im Vakuum abgezogen und der erhaltenen wässrigen Rückstand des rohen Isothiocyanats direkt tür die nachfolgende Reaktion eingesetzt, wobei der Gehalt an oben genannter Titelverbindung der so erhaltenen wässrigen Rohproduktlösung mit 0,138 mmol (entspricht einem 95 %igen Umsatz) angenommen wird. Dünnschichtchromatographie (Ethylacetat/Methanol/Wasser/Eisessig= 5:3:3:0,5; Rf= 0,72) zeigt eine einheitliche Umsetzung zur oben genannten Titelverbindung an.
Elementaranalyse (Schwefelbestimmung ; bezogen auf wasserfreie Substanz ): ber.: S 3,00 gef: S 2,92
c) 12er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)4-[ß-1-O-(6-Thioureidohexyl)- sialyl-Lex]8-Konjugat
Die Umsetzung von 26,6 mg (0,00842 mmol; entsprechend 0,0673 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 39a) mit der gesamten wässrigen Lösung des Rohprodukts aus Beispiel 39b) (0,138 mmol) liefert nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung 88,7 mg (90,6 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 8,74 % Elementaranalyse
(Natrium- und Schwefelbestimmung; bezogen auf wasserfreie Substanz ) : ber.: S 2,20 Na 3,16 gef: S 2.17 Na 3,24
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung er- gibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 67,4 % sialyl -Lex -Einheiten (entsprechend 8 sialyl -Lex-Resten pro Molekül).
Aus der quantitativen Sialinsäurebestimmung mittels TBA (Thiobarbitursäure) durch literaturbekannte Vorgehensweise [vgl. Lit.. Aminoff, D (1961 ) , "Methods for the quantitative estimation of N-acetylneuraminic acid and their application to hydrolysates of sialomucoids" , J. Biochem. , 81 384-392; Uschida, Y. and Su- gimori, T. (1977); "Distribution of neuraminidase in Arthrobacter and its purifica- tion by affinity chromatography", J. Biochem. (Tokio), 82, 1425-1433 ] wird der Beladunsgrad der oben genannten Titelverbindung mit 69,2 % an Tetrasaccha- rid (entsprechend 8 sialyl -Lex-Resten pro Molekül) ermittelt. Nach erneuter colorimetrischer Titration der Titelverbindung mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung, in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator konnte der DTPA- Beladungsgrad des Polymers von 32,9 % (entsprechend 4 DTPA-Einheiten pro Molekül) bestätigt werden.
d) 12er-Kaskadenpolyamin-( 1 ln-DTPA-Amid)4- [ß-1-O-(6-Thioureidohexyl)- sialyl-Lex]8-Konjugat
1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 39c) werden in 2 ml Natriumeitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 11 1 Indiumchlorid, welche eine Anfangsaktivität von 20,1 MBq besitzt , versetzt. . Nach einer Rührzeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und anschließend sterilfiltriert Die so hergestellte Lösung ist direkt für die entsprechenden radiodiagnostischen Zwecke einzusetzen . Beispiel 40
12er-Kaskadenpolyamin-(11 11n-DTPA-Amid)4- [1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] Q -Konjugat
a) 12er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)4-[1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] 3 -Konjugat
Auf analoge Weise wie für die Synthese der Titelverbindung aus Beispiel 1 b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 0,5 g (0,16 mmol; entsprechend 1 ,3 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 39a) mit 2,07 g (6,63 mmol) p-lsothio- cyanatophenyl-α-D-mannopyranose nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung 794 mg (88,7 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses und amorphes Pulver mit einem Wassergehalt von 8.31 %.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,61 H 5,35 N 10,27 S 4,59 Na 6,58 gef: C 46,57 H 5,41 N 10,30 S 4,63 Na 6,52
Sowohl die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Aus dem prozentualen Schwefeiwert der Eiementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 67,3 % D-Mannose (entsprechend 8 Mannoseresten pro Molekül). Die colorimetrische Phenol- Schwefelsäure-Bestimmung zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungs- grades des Konjugats liefert als Ergebnis einen Beladungsgrad von 8 α-D- Mannoseresten pro Molekül und ist somit identisch mit dem Beladungsgrad ( 8 D- Mannoseresten pro Molekül), welcher durch den prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ermittelt wurde. Mit dem so ermittelten Beladungsgrad der Titelverbindung aus Beispiel 39a) von 32,94 % ergibt sich somit eine statistische, mittlere Gesamtbeladung des Polymers von 4-DTPA- und 8-α-D-Man- noseresten pro Molekül. b) 12er-Kaskadenpolyamin-(1111n-DTPA-Amid)4- [1 -(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] -Konjugat
In analoger Weise wie für die Synthese der Titeiverbindung aus Beispiel 39d) beschrieben, wird die Titelverbindung aus Beispiel 40a) mit 1 1 ''-Indiumchlorid (als Lösung mit einer spezifischen Anfangsaktivität von 19,83 MBq ) komplexiert. Nach Sterilfiltration erhält man ein Präparat, welches direkt für die entsprechenden radiodiagnostischen Zwecke eingesetzt werden kann .
Beispiel 41
24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)^ - [( ß-D-galactopyranosyl)-1- thio-2-imino -2-amidin]-|3-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA -Amid)^ - Konjugat
2,0 g (0,22 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 10a) werden in 60 ml absolutem Dichiormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen., anschließend in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und die wässrige Produktlösung zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird durch Versetzen mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 300 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultra- filtriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 300 ml aufgefüllt und durch Versetzen mit 15 %iger Natronlauge ein pH-Wert von 10,0 eingestellt. Die basische Produktlösung wird erneut zweimal ultrafiltriert und der verbleibende Rückstand nach dem Auffüllen mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml , gefriergetrocknet. Man erhält 1 ,42 g (82,8 % d. Th) der Titelverbindung als amorphes Lyophilisat in der Form des freien Polyamins. Wassergehalt: 5,37 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 51 ,94 H 7,83 N 17,92 S 3,77 Na 4.32 gef: C 51 ,89 H 7,80 N 18,01 S 3,69 Na 4.28
Nach Elementaranalyse ist die Titelverbindung frei von Fluoridionen.
Nach quantitativer Ninhydrinreaktion liegen im Mittel 13 freie Aminofunktionen in der Titelverbindung vor. Nach colorimetrischer Titration der Titelverbindung mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung bei 60°C, in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein Beiadungsgrad des Polymers mit Gly-Me-DOTA von 46,3 % (entsprechend 11 Gly-Me-DOTA-Einheiten) pro Molekül.
b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)1 1 - [( ß-D-galactopyraπosyl)- 1 -thio-2-imino -2-amidin]-| 3-Konjugat
Auf analoge Weise, wie in der Literatur für die Umsetzungen mit Proteinen beschrieben, (vgl. hierzu: Lee , Y. C. et al., Methods of Enzymologie, Vol. 83. 1982, 278 ) liefert die Umsetzung von 1 ,0 g (0,128 mmol; entsprechend 1 ,66 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 41a) mit 11 ,4 g (42,8 mmol) 2-lmino-2-methoxyethyl-1-thio-ß-D-galactopyranose ( IME-thio- galactosid) 1 ,06 g (76,3 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Lyophilisat [ Zur Synthese und den Reaktionsbedingungen analoger Kuppiungsreaktionen von IME-thiopyranosiden an Proteine vgl.: Y.C. Lee, CP. Stowell, M.J. Krantz, Biochemistry 1976, 5, 3956; R. Roger, D.G. Neilson, Chem. Rev. 1961 , 61, 179; L. Wofsy, S.J. Singer, Biochemistry 1963, 2, 104; M.J. Hunter, M.L Ludwig, this series, Vol. 25. 585; J.E. Zull, J. Chung, J. Biol. Chem. 1975, 250. 1668; CP. Stowell, Doctoral Dissertation, The Johns Hopkins University, Balti- more, Maryland, 1978 ] .
Elementaranalyse: ber.: C 57,67 H 8,03 N 9,73 S 2,90 gef: C 57,78 H 8,14 N 9,80 S 2.97
Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 13 D-Galactoseresten pro Molekül. c) 24er-Kaskadenamiπ-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)^ - [( ß-D-galactopyra- nosyl)-1-thio-2-imino -2-amidin] 3-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 23d) beschrieben, führt die Komplexierung von 900 mg (0,082 mmol; entsprechend 0,90 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 41 b) mit 241 mg (0,92 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung. Ausbeute: 990 mg (96,0 % d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver Wassergehalt: 9,32 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Suostaπz)- ber.: C 42,19 H 6,06 N 12,58 S 3,31 Gd 13,75 gef: C 42,23 H 6,10 N 12,57 S 3,28 Gd 13,80
Der mittlere Beladungsgrad des Polymers der oben genannten Titelverbindung wurde aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium zu 11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 13 ß-D-Glucopyranosylresten bestimmt, was mit den auf den Vorstufen bestimmten Beladungsgraden der Titelverbindung sehr gut korreliert.
Beispiel 42
24er-Kaskadenamin-(Yb-DTPA-Amid)11 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D-galacto- pyranosyl]-|3-Konjugat
1 ,0 g (0,077 mmol; entsprechend 0,85 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 4b) werden in 40 ml Natriumeitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 243 mg (0,87 mmol) Ytterbiumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations- membran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Ausbeute: 969 mg (96,2 % d. Th.) als amorphes Pulver Wassergehalt: 4,93 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 41 ,48 H 4,91 N 9,74 S 3.19 Yb 14,54 Na 1 ,93 gef: C 41 ,52 H 4,96 N 9,80 S 3,22 Yb 14,60 Na 1 ,88
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers von 55,2 % D-Galactose (entsprechend 13 Galactoseresten pro Molekül) während aus dem prozentualen Ytterbium Wert ein Beladungsgrad des Polymers mit Ytterbium-DTPA von 44,8 % resultiert (entsprechend 11 Yb-DTPA-Einheiten pro Molekül). Die colorimetri- sche Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung [Dubois et al., Anal. Chem. 1956, 28, 3, 350; Koch et al., Cereal Chem. 1951 , 28, 424] als auch die quantitative Kohlenhydratbestimmungsmethode nach Nelson und Somogyi [Cheronis et al., Mikrochim. Acta, 6, 769 (1957); Somogyi, J. Biol. Chem. 195, 19 (1952); Nelson, J. Biol. Chem., 153, 375 (1944); vgl. auch Hodge et al., Meth. Carbohydrate Chem., Vol. 1 ,; Whistler and Wolfrom, eds. p. 388, Academic Press, New York, 1962; So and Goldstein, J. Biol. Chem. 242, 1617 (1967)] zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Polyamins liefert als Ergebnis einen Beladungsgrad von 32,68 D-Galactoseresten pro Molekül und ist somit identisch mit dem Beladungsgrad, welcher durch die prozentualen Elementverhältnisse ermittelt wurde.
Beispiel 43
24er-Kaskadenamin-(Dy-DTPA-Amid)1 r[1 -(4-Thioureidophenyl)-α D-mannopyranosyl] 13 -Konjugat
1 ,4 g (0,108 mmol; entsprechend 1 ,18 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 5a) werden in 40 ml Natriumeitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 325 mg (1 ,21 mmol) Dysprosiumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiitrations- membran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Ausbeute: 1 ,35 g (97,0 % d. Th.) als amorphes Pulver Wassergehalt: 6,74 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 41 ,86 H 4,95 N 9,83 S 3,21 Dy 13,78 Na 1 ,95 gef: C 41 ,84 H 4,99 N 9,78 S 3,25 Dy 13,81 Na 1 ,89
Aus den molaren Elementarverhältnissen von Dysprosium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 46,2 % Gd-DPTA und 53,8 % D-Mannose (entsprechend 11 Dy-DTPA-Einheiten und 13 D-Mannose- resten pro Molekül).
Die qualitative Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Die coiorimetrische Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung, als auch die quantitative Kohlenhydratbestimmungsmethode nach Nelson und Somogyi zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Polyamins liefert als Ergebnis einen Beladungsgrad von 32,68 D-Mannoseresten pro Molekül und ist somit identisch mit dem Beladungsgrad, welcher durch die prozentualen Elementverhältnisse ermittelt wurde.
Beispiel 44
24er-Kaskadenamin-(Mn-DTPA-Amid)1 1 -[1 -(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl-ß-D- glucosaminopyranosyl]-|3-Konjugat
1 ,0 g (0,077 mmol; entsprechend 0,85 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 4b) werden in 40 ml Natriumeitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raum- temperatur mit 100 mg (0,87 mmol) Mangan-ll-carbonat versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Ausbeute: 911 mg (98,3 % d. Th.) als amorphes Pulver Wassergehalt: 7,46 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,09 H 5,33 N 10,59 S 3,46 Mn 5,02 Na 4,20 gef: C 45,11 H 5,38 N 10,61 S 3,42 Mn 5,10 Na 4,13
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 53,8 % N-Acetylglucosamin (entsprechend 13 N-Acetyl-ß-D-Glucosaminresten pro Molekül), während aus dem prozentualen Mangan Wert ein Beladungsgrad des Polymers mit Mangan- DTPA von 46,0 % resultiert (entsprechend 11 Mn-DTPA-Einheiten pro Molekül). Die colorimetrische Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung, als auch die σuantitative Kohlenhydratbestimmungsmethode nach Nelson und Somogyi zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Polyamins, liefert als Ergebnis einen Beladungsgrad von 13 N-Acetyl-ß-D-glucosaminresten pro Molekül und ist somit identisch mit dem Beladungsgrad, welcher durch die prozentualen Elementverhältnisse ermittelt wurde.
Beispiel 45
24er-Kaskadenamin-(Eu-DTPA-Amid)1 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D-gluco- pyranosyl]-|3- Konjugat
1 ,4 g (0,108 mmol; entsprechend 1 ,18 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 7b) werden in 40 ml Natriumeitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 312 mg (1 ,21 mmol) Europiumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations- membran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Ausbeute: 1.30 g (97,6 % d. Th.) als amorphes Pulver Wassergehalt: 8,34 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,23 H 4,99 N 9,92 S 3,24 Eu 13,00 Na 1 ,97 gef: C 42,24 H 5,03 N 9,89 S 3,19 Eu 13,07 Na 1 ,93 - -
Aus den molaren Elementverhältnissen von Europium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45 % Eu-DTPA-Einheiten und 55 % ß-D-Glucoseresten (entsprechend 11 DTPA-Einheiten und 13 ß-D- Glucoseeinheiten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Die qualitative Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Die colorimetrische Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung, als auch die quantitative Kohlenhydratbestimmungsmethode nach Nelson und Somogyi zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Konjugats liefert als Ergebnis einen mittleren Beladungsgrad von 13 D-Glucoseresten pro Molekül und ist somit identisch mit dem Beladungsgrad, welcher durch die prozentualen Elementverhältnisse ermittelt wurde.
Beispiel 46
Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkompiex der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-ß-D- glucopyranosid (m = 13, n = 11)
a) 1-Tert.butoxycarbonylmethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-ß-D-glucopyranosid
Zu einer gerührten Lösung von 661mg ( 5,0 mmol) Glycolsäure-tert.butylester in 25ml absolutem 1 ,2-Dichlorethan gibt man bei Raumtemperatur nacheinander feinst gepulvertes Molsieb 4 O (5.0 g ) und Silbersilicat ( 5.0g ). Anschließend wird bei 0° C tropfenweise mit einer Lösung von 3,02 g ( 5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl -α-D-glucopyranosylbromid, gelöst in 40 ml absolutem 1 ,2-Dichlorethan, versetzt. Die so erhaltene Reaktionslösung wird an- schließend für 3 Stunden bei -10°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei 0° C mit 250 ml 1 ,2-Dichlorethan versetzt und die Reaktionslösung über Celite abgesaugt. Das Filtrat wird nacheinander mit je 200 ml wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung sowie 220 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat ge- trocknet und filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Eluent : Toluol: Essigsäureethylester = 10:1 ).
Man erhält 488,7 mg ( 15, 3 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung , als farbloses Öl.
Elementaranalyse: ber.: C 73.37 H 7.08 gef: C 73.21 H 7.24
b) 1-Carboxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-beπzyl-ß-D-glucopyranosid
Zu 30 g (45.81 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 46 a) gelöst in 300 ml 1 ,2-Dichlorethan gibt man bei -10 °C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stunden bei dieser Temperatur. Anschließend wird eine Stunde bei 0 °C nachgerührt. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1). Ausbeute: 3,02 g ( 11.4 % d. Th.) eines glasigen Feststoffs.
Elementaranalyse: ber.: C 72.22 H 6.40 gef. C 72.09 H 6.61
c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)- 1 ,4,7,10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-
Carboxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-ß-D-glucopyranosid (m = 13, n = 1 1)
12,28 g (19.5 mmol) des in Beispiel 31 h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7,10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7- triessigsäure, 2,0 g Natriumbromid (19.5 mmol), 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxy- succinimid und 9,88 g (16.5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 46b) werden in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50 °C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtem- peratur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxysuccinimid- ester-Lösung gibt man eine Lösung von 1 ,39 g (0,5 mmol) des 24mer-Polya- mins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis [2.(trilysyl-amino)-ethyl]-tri- mesinsäuretriamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Suspension wird filtriert und anschließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend gefriergetrocknet. Ausbeute: 8.13 g (95 % d. Th.) H2θ-Gehalt (Karl-Fischer): 7,8 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 54,19 H 5.98 N 9.00 Gd 11.95 gef: C 54.06 H 6.10 N 8.87 Gd 11.81
Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 13 : 11 berechnen.
d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-
1 ,4, 7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-Carboxy- methyl-ß-D-glucopyranosid (m = 13, n = 1 1)
8,0 g (0,467 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 46c) werden in einer Mi- schung aus 50 ml. Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10 % Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 S .unden bei Raumtemperatur. Es wird vom Katalysator abfiitriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute: 6.08 g (99 % d. Th.) glasiger Feststoff. H2θ-Gehalt (Karl-Fischer): 11 % Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42.39 H 5.76 N 1 1.72 Gd 15.55 gef : C 42.21 H 5.89 N 1 1.61 Gd 15.42
Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 13 : 1 1 berechnen.
Beispiel 47
Thioharnstoff-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N,,N",N"-Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex auf der Basis der 4-lsothiocyanatobenzyl - DOTA und 1-Carboxymethyl- α-D-mannopyranosid (m = 10, n = 14)
a) Thioharnstoff-Konjugat des 24mer-Polyamins auf der Basis des
N,N,N',N,,N",N"-Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]-trimesinsäuretriamids mit 1-Carboxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-α- D-mannopyranosid (m = 10, n = 14).
Zu 1 ,39 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl)-trimesinsäuretriamids gelöst in 50 ml. Wasser gibt man 5,46 g (54 mmol) Triethylamin. Zu dieser Lösung tropft man bei 10 °C eine Mischung aus 4,1 1 g (7.5 mmol) 4-lsothiocyanatobenzyl-DOTA ( US- 4,923,985 ; Gansow O. A. et al. , J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. 1992, 1 173- 1 178 ) und 3,28 g (10,5 mmol) p-lsothiocyanatophenyl- α-D-mannopyranose, gelöst in 75 ml Wasser/50 ml Ethanol (Zutropfzeit: 2 Stunden). Man rührt 12 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend gibt man 3,54 g (10.6 mmol) Gadoliniumacetat hinzu und stellt mit 10 %iger Salzsäure auf pH 4,5. Man rührt 5 Stunden bei 80 °C, läßt auf Raumtemperatur kommen und stellt mit 5 %iger wässriger NaOH auf pH 7.5. Die Lösung wird über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend gefriergetrocknet. Ausbeute: 6,76 g (94 % d. Th. ) glasiger Feststoff. H2θ-Gehalt (Karl-Fischer) : 9.8 % Λ Λ n
-116-
Elementaranalyse: (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46.01 H 4.91 N 10.61 Gd 10.93 S 5.35 Na 1.60 gef: C 45.87 H 4.99 N 10.50 Gd 10.82 S 5.21 Na 1.42
Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 10 : 14 berechnen.
Beispiel 48
Thioharnstoff-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex auf der Basis der 4-lsothiocyanatobenzyi - DTPA und 1-Carboxymethyl- ß-D-galactopyranosid (m - 8. n = 16)
a) Thioharnstoff-Konjugat des 24mer-Polyamins auf der Basis des
N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2-(trilysyl-amino)ethyl]-trimesinsäuretriamids mit 4-lsothiocyanatobenzyl - DTPA (π = 8, n = 16)
Zu 1 ,39 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N" - Hexakis[2-(trilysyl-amino)ethyl]-trimesinsäuretriamids gelöst in 50 ml Wasser gibt man 5,46 g (54 mmol) Triethylamin. Zu dieser Lösung tropft man bei 10 °C eine Mischung aus 3,22 g (6,0 mmol) 4-lsothiocyanotobenzyl-DTPA ( WO 91/14459 ; Gansow, O. A. et al. , Bioconjugate Chem. 1992, 3, 108-117 ) und 3,75 g (12,0 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-ß-D-galactopyranose , gelöst in 75 ml Wasser/50 ml Ethanol (Zutropfzeit: 2 Stunden). Man rührt 12 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend gibt man 2,04 g (6,1 mmol) Gadoliniumacetat zu und stellt mit 10 %iger Salzsäure auf pH 4,5. Man rührt 3 Stunden bei 60 °C Man läßt auf Raumtemperatur kommen und stellt mit 5 %iger NaOH auf pH 7.5. Die Lösung wird über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Re- tentat wird anschließend gefriergetrocknet. Ausbeute: 6,55 g (96 % d. Th. ) glasiger Feststoff. H2θ-Gehalt (Karl-Fischer) : 10 %
Elementaranalyse: (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45.15 H 4.66 N 9.54 Gd 9.22 S 5.64 Na 2.70 gef: C 45.03 H 4.81 N 9.44 Gd 9.10 S 5.48 Na 2.51 Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 8 : 16 berechnen.
Beispiel 49
Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7,10- tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl- α-D- mannopyranosid (m = 13, n = 11)
a) l-Tert.butoxycarbonylmethyl^.SAδ-tetra-O-benzyl- α-D-mannopyranosid
Zu einer gerührten Lösung von 661mg ( 5,0 mmol) Glycolsäure-tert.butylester in 25ml absolutem 1 ,2-Dichlorethan gibt man bei Raumtemperatur nacheinander feinst gepulvertes Molsieb 4 A (5.0 g ) und Silbersilicat ( 5.0g ). Anschließend wird bei 0° C tropfenweise mit einer Lösung von 3,02 g ( 5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl -α-D-mannopyranosyl bromid , gelöst in 40 ml absolutem 1 ,2-Dichlorethan, versetzt. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 3 Stunden bei -10°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei 0° C mit 250 ml 1 ,2-Dichlorethan versetzt und die Reaktionslösung über Celite abgesaugt. Das Filtrat wird nacheinander mit je 200 ml wässriger Natriumhydro- gencarbonatlösung sowie 220 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Eluent : Toluol: Essigsäureethylester = 10:1 ). Man erhält 472,7 mg ( 14.8 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung , als farbloses Öl. Elementaranalyse: ber.: C 73,37 H 7,08 gef: C 73,25 H 7.19 - -
b) 1- Carboxycarbonylmethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl- α-D-mannopyranosid
Zu 28 g (42,76 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 49 a) gelöst in 300 ml 1 ,2-Dichlorethan gibt man bei - 10 °C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stunden bei dieser Temperatur. Anschließend eine Stunde bei 0 °C Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1 ). Ausbeute: 2,58 g ( 10,4 % d. Th.) eines glasigen Feststoffs.
Elementaranalyse: ber.: C 72.22 H 6.40 gef : C 72.10 H 6.58
c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amiπo)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-2,3, 4,6-tetra-O-benzyl α-D-mannopyranosid (m = 13, n = 1 1 )
10,39 g (16.5 mmol) des in Beispiel 31 h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10- (4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7,10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7- triessigsäure, 1 ,7 g Natriumbromid (16.5 mmol), 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxy- succinimid und 1 1 ,67 g (19.5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 49b) werden in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50 °C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxysuccinimid- esterlösung gibt man eine Lösung von 1 ,39 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N,,N',N",N"-Hexakis[2.(trilysyl-amino)-ethyl]-trimesin- säuretriamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Suspension wird filtriert und anschließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend gefriergetrocknet. Ausbeute: 8.1 g (95 % d. Th.) _ _
H2θ-Gehalt (Karl-Fischer: 9,7 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 56.78 H 6.09 N 8.21 Gd 10.14 gef: C 56.64 H 6.18 N 8.14 Gd 10.01
Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 11 : 13 berechnen.
d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl- α-D- mannopyranosid (m = 13, n = 11)
7,0 g (0,41 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 49c) werden in einer Mischung aus 50 ml. Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10 % Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtemperatur und einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5.03 g (99 % d. Th.) glasiger Feststoff. H2θ-Gehalt (Karl-Fischer): 9,8 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42.94 H 5.86 N 11.33 Gd 13.99 gef: C 42.86 H 5.97 N 11.24 Gd 13.74
Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 11 : 13 berechnen.
Beispiel 50
Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem
Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7,10- tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-ß-D- galactopyranosid (m = 6, n = 18) a) 1-Tert.butoxycarbonylmethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-ß-D-galactopyranosid
Zu einer gerührten Lösung von 661mg ( 5,0 mmol) Glycolsäure-tert.butylester in 25ml absolutem 1 ,2-Dichlorethan gibt man bei Raumtemperatur nacheinander feinst gepulvertes Molsieb 4 Ä (5.0 g ) und Silbersilicat (5.0 g). Anschließend wird bei 0° C tropfenweise mit einer Lösung von 3,02 g ( 5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl -α-D-galactopyranosyl-bromid , gelöst in 40 ml absolutem 1 ,2-Dichlorethan, versetzt . Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 3 Stunden bei -10°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei 0° C mit 250 ml 1 ,2-Dichlorethan versetzt und die Reaktionslösung über Celite abgesaugt. Das Filtrat wird nacheinander mit je 200 ml wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung sowie 220 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Eluent : Toluol: Es- sigsäureethylester = 10:1 ).
Man erhält 456,7 mg ( 14, 3 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung, als farbloses Öl. Elementaranalyse: ber.: C 73,37 H 7,08 gef: C 73,18 H 7.19
b) 1 -Carboxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-ß-D-galactopyranosid
Zu 29 g (44,29 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 50 a) gelöst in 300 ml 1 ,2-Dichlorethan gibt man bei -10 °C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stunden bei dieser Temperatur. Anschließend eine Stunde bei 0 °C Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1.
Ausbeute: 3,79 g ( 14,7 % d. Th.) eines glasigen Feststoffs.
Elementaranalyse: ber.: C 72.22 H 6.40 gef: C 72.10 H 6.51 c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-ß-D-
2,3,4,6-tetra-O-benzyl-galactopyranosid (m = 6, n = 18)
5,67 g (9 mmol) des in Beispiel 31 h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10-(4- Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7,10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-tri- essigsaure, 0,93 g Natriumbromid (9 mmol), 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxysucci- nimid und 16,16 g (27 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 50b) werden in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50 °C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxysuccinimidester-Lö- sung gibt man eine Lösung von i ,39 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2.(trilysyl-amino)-ethyl]-trimesinsäuretriamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Suspension wird filtriert und anschließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend gefriergetrocknet. Ausbeute: 8.03 g (95 % d. Th.) H2θ-Gehalt (Karl-Fischer): 9,0 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 63,34 H 6.39 N 6.22 Gd 5.58 gef: C 63.18 H 6.47 N 6.13 Gd 5.47
Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 6 : 18 berechnen.
d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem
Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1 -Carboxymethyi-ß-D- galactopyranosid (m = 6, n = 18) 7,0 g (0,414 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 50c werden in einer Mischung aus 75 ml. Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10 % Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtemperatur bei einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute: 4.27 g (99 % d. Th.) glasiger Feststoff. H2O-Gehalt (Karl-Fischer): 10,3 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44.67 H 6.19 N 10.09 Gd 9.07 gef: C 44.53 H 6.28 N 9.91 Gd 8.94
Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 6 : 18 berechnen.
Beispiel 51
Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10- tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl- α-L- fucopyranosid (m = 10, n = 14)
a) 1 -Tert.butoxycarbonylmethyl-2,3,4-tri-O-benzyl- α-L-fucopyranosid
Zu einer gerührten Lösung von 661mg ( 5,0 mmol) Glycolsäure-tert.butylester in 25ml absolutem 1 ,2-Dichlorethan gibt man bei Raumtemperatur nacheinander feinst gepulvertes Molsieb 4 A (5.0 g ) und Silbersilicat ( 5.0g ). Anschließend wird bei 0° C tropfenweise mit einer Lösung von 2.49 g ( 5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl -α-D-fucopyranosyl bromid , gelöst in 40 ml absolutem 1 ,2-Dichlorethan, versetzt. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 3 Stunden bei -10°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei 0° C mit 250 ml 1 ,2- Dichlorethan versetzt und die Reaktionslösung über Celite abgesaugt. Das Filtrat wird nacheinander mit je 200 ml wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung sowie 220 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Eluent : Toluol: Essigsäure- ethylester = 10:1 ).
Man erhält 407,5 mg (15, 3 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung, als farbloses Öl.
Eiementaranalyse: ber.: C 72.24 H 7,35 gef : C 72,10 H 7.45
b) (1-Carboxymethyl)-2,3,4-tri-(O-benzyl)- α-L-fucopyranosid
Zu 24 g (43.74 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 51 a) gelöst in 300 ml
1 ,2-Dichlorethan gibt man bei -10 °C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stun- den bei dieser Temperatur. Anschließend eine Stunde bei 0 °C Man dampft im
Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel
(Laufmittel: n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1 ).
Ausbeute: 3,36 g (16,2 % d. Th.) eines glasigen Feststoffs.
Elementaranalyse: ber.: C 70.71 H 6.55 gef: C 70.58 H 6.71
c) Amid-Konjugat des 24er-Poiyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem
Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-2,3,4- tri-O-benzyl- α-L-fucopyranosid (m = 10, n = 14)
9,45 g (15 mmol) des in Beispiel 31 h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10-(4- Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure, 1 ,54 g Natriumbromid (15 mmol), 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxy- succinimid und 10,34 g (21 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 51 b) werden in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50 °C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtempera- tur werden 14,86 g (72 mmol) N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxysuccinimidester- Lösung gibt man eine Lösung von 1 ,386 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N,,N,,N",N"-Hexakis[2.(trilysyl-amino)-ethyl]-trimesinsäure- triamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Suspension wird filtriert und anschließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, von unlöslichem Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend gefriergetrocknet. Ausbeute: 7.3 g (94 % d. Th.) H2O-Gehalt (Karl-Fischer: 8.6 %)
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 56.06 H 6.20 N 8.57 Gd 10.12 gef : C 55.91 H 6.32 N 8.49 Gd 9.97
Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 10 : 14 berechnen.
d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem
Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl- α-L- fucopyranosid (m = 10, n = 14)
7,0 g (0,41 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 51 c) werden in einer Mischung aus 75 ml. Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10 % Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtemperatur und einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 5.24 g (99 % d. Th.) glasiger Feststoff. H2θ-Gehalt (Karl-Fischer): 1 1 ,1 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44.06 H 6.03 N 1 1.33 Gd 13.38 gef : C 43.95 H 6.17 N 1 1.24 Gd 13.29 Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 10 : 14 berechnen.
Beispiel 52
Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-ß-D- galactopyranosid (m = 10, n = 14)
a) 6-Tertbutoxycarbonylhexyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-ß-D-galactopyranosid
Zu einer gerührten Lösung von 3,54g ( 5,0 mmol) 1-Tertbutoxycarbonylhexan- 6-ol in 25ml absolutem 1 ,2-Dichlorethan gibt man bei Raumtemperatur nacheinander feinst gepulvertes Molsieb 4 Ä (5.0 g ) und Silbersilicat ( 5.0g ). Anschließend wird bei 0° C tropfenweise mit einer Lösung von 3,02 g ( 5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl -α-D-galactopyranosylbromid, gelöst in 40 ml absolutem 1 ,2-Dichlorethan, versetzt. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 3 Stunden bei -10°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei 0° C mit 250 ml 1 ,2-Dichlorethan versetzt und die Reaktionslösung über Celite abgesaugt. Das Filtrat wird nacheinander mit je 200 ml wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung sowie 220 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Eluent : Toluol: Essigsäureethylester = 10:1 ).
Man erhält 449,6 mg ( 12,7 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung , als farbloses Öl.
Elementaranalyse: ber.: C 76,27 H 7.96 gef: C 76,41 H 7.80
b) 6-Carboxyhexyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-ß-D-galactopyranosid
Zu 32,4 g (45.81 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 52a) gelöst in 300 ml 1 ,2-Dichlorethan gibt man bei -10 °C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stun- den bei dieser Temperatur. Anschließend eine Stunde bei 0 °C nachgerührt. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1). Ausbeute: 3,52 g ( 11.8 % d. Th.) eines glasigen Feststoffs.
Elementaranalyse: ber.: C 75,43 H 7,41 gef. C 75,56 H 7,32
c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-2, 3,4,6- tetra-O-benzyl-ß-D-galactccyranosid (m = 10, n = 14)
9,45 g (15 mmol) des in Beispiel 31 h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10-(4- Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7,10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure, 1 ,54 g Nartriumbromid (15 mmol) und 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxy- succinimid und 14.88 g (21 mmol) 6-Carboxyhexyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-ß-D- galactopyranosid werden in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50 °C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexyl- carbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxysuccinimidester-Lösung gibt man eine Lösung von 1 ,386 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamin auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2- (triiysyl-amino)-ethyl]-trimesinsäuretriamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Suspension wird filtriert und anschließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Reteπtat wird anschließend gefriergetrocknet.
Ausbeute: 8,55 g (96 % d. Th.) H2O-Gehalt (Karl-Fischer): 9,2 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 59.30 H 6.52 N 7.47 Gd 8.83 gef: C 59.15 H 6.69 N 7.38 Gd 8.74 Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 10 : 14 berechnen.
d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-ß-D- galactopyranosid (m = 10, n = 14)
8,0 g (0,449 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 52c) werden in einer Mischung aus 75 ml. Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10 % Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtemperatur und einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. Es wird vom Katalysator abfiltπert und das Fiitrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5.67 g (99 % d. Tr.) glasiger Feststoff. H2θ-Gehalt (Karl-Fischer): 10,5 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45.85 H 6.44 N 10.43 Gd 12.33 gef: C 45.74 H 6.55 N 10.39 Gd 12.23
Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : π = 10 : 14 berechnen.
Beispiel 53
Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-α-D- mannopyranosid (m = 7, n = 17)
a) 6-Tertbutoxycarbonyl-hex-1-ol-2,3,4,6-tetra-O-benzyl- α-D-mannopyranosid Auf analoge Weise wie für die Titelverbindung aus Beispiel 52a) beschrieben, führt die Umsetzung von 3,54 g ( 5,0 mmol ) 1-Tertbutoxycarbonylhexan-6-ol mit 3,02 g ( 5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl -α-D-mannopyranosyl bromid in absolutem 1 ,2-Dichlorethan bei Raumtemperatur zur Bildung von 368,5 mg (11 ,9 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.
Elementaranalyse: ber.: C 76,27 H 7.96 gef: C 76,38 H 7.89
b) 1-Carboxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl -α-D-mannopyranosid
Zu 30 g (45.81 mmol) der itelverbindung aus Beispiel 53a) gelöst in 300 ml 1 ,2-Dichlorethan gibt man bei -10 °C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stunden bei dieser Temperatur. Anschließend wird eine Stunde bei 0 °C nachgerührt. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1 ). Ausbeute: 3,86 g ( 14,6 % d. Th.) eines glasigen Feststoffs.
Elementaranalyse: ber.: C 75,43 H 7,41 gef. C 75,40 H 7,54
c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1 -methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-2, 3,4,6- tetra-O-benzyl- α-D-mannopyranosid (m = 7, n = 17 )
6,61 g (10,5 mmol) des in Beispiel 31 h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10- (4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7,10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7- triessigsäure, 1 ,08 g Nartriumbromid (10,5 mmol), 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxy- succinimid und 16,70 g (25,5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 53b) werden in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50 °C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten, voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxy- succinimidester-Lösung gibt man eine Lösung von 1 ,386 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamin auf der Basis des N,N,N,,N',N",N"-Hexakis[2-(triIysyl-amino)- ethyl]-trimesinsäuretriamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die so erhaltene Suspension wird filtriert und anschließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend ge- friergetrocknet.
Ausbeute: 8,49 g (95 % d. Th.) H2θ-Gehalt (Karl-Fischer): 7,6 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 63.28 H 6.76 N 6.27 Gd 6.16 gef: C 63.17 H 6.83 N 6.15 Gd 6.09
Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 7 : 17 berechnen.
d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1 ,4,7,10- tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-α-D- mannopyranosid (m = 7, n = 17)
8,0 g (0,447 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 53c) werden in einer Mischung aus 75 ml Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10 % Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtempe- ratur und einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,21 g (99 % d. Th.) glasiger Feststoff. H2O-Gehalt (Karl-Fischer): 12 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 47.63 H 6.78 N 9.54 Gd 9.37 gef : C 47.52 H 6.88 N 9.48 Gd 9.28 Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 7 : 17 berechnen.
Beispiel 54
24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)^ - ( N-Glutaroyl-2-aminoethyl- 1-thio-ß-D-lactose- Amid )13-Konjugat
a) N-Glutaroyl-2-aminoethyl-1 -thio-ß-D-lactose -2,3,6,2",3",4",6"-heptaacetat
Zu einer gerührten Lösung von 12,0 g (15 mmol) (2-Aminoethyl)-1 -thio- ß-D- lactose-heptaacetat (zur Synthese vgl.: Yoshiaki Miura, Tsutomu Arai, Tatsuya Ya agata, Carbohydrate Reserarch 289 (1996) 193 - 199) in 200 m! absolutem Tetrahydrofuran gibt man bei 22 °C insgesamt 2,05 g (18 mmol) Giutsrsäure- anhydrid portionsweise hinzu und läßt die Reaktionslösung nach 12 Stunden bei Raumtemperatur nachrühren.
Zur Aufbereitung wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und der verbleibende Rückstand mit Dichiormethan (250 ml) sowie 1 N Salzsäure (100 ml) versetzt. Nach dem Abtrennen der organischen Produktphase wird diese noch zweimal mit jeweils 75 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Es wird vom Trockenmittel abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum ab- gezogen. Kristallisation aus Diethylether/Pentan (1 : 10) liefert 13,86 g (92,4 % d.Th.) der Titelverbindung als farblosen und kristallinen Feststoff.
Elementaranalyse: ber.: C 49,01 H 5,73 N 1 ,73 S 3,96 gef : C 49,10 H 5,89 N 1 ,83 S 3,92
b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid) 1 - [ N- Glutaroyl-(2-aminoethyl-1 -thio-ß-D-lactose-2,3,6,2",3",4",6"-hepta- acetyl)-Amid-]-|3-Konjugat
14 mg (18,96 mmol) der Verbindung aus Beispiel 54 a) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und bei 0 °C mit 2,56 g (22,2 mmol) N-Hydroxysuccinimid gefolgt von 4,55 g (22,2 mmol) Dicyclo- hexylcarbodimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 0 °C und 3 Stunden bei 22 °C filtriert man vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff ab und tropft die so erhaltene klare Aktivesterlösung der oben genannten Titelver- bindung bei 0 °C langsam zu einer gerührten Lösung von 4,0 g (0,446 mmol; entsprechend 5,8 mmol an freier Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 10a). Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und mit Dichiormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 7,7 g (92,6 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d.h. im Po- lymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 53,4 % Lactoseheptaacetat-Einheiten (entsprechend 13 Lactoseester pro Molekül).
Elementaranalyse: ber.: C 57,35 H 7,74 N 8,41 gef: C 57,41 H 7,78 N 8,37
c) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid) 1 - ( N-Glutaroyl-2-aminoethyl-1- thio-ß-D-lactose- Amid ) 3-Konjugat
5,87 g (0,312 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 54 b) werden in 100 ml absolutem Dichiormethan gelöst und anschließend bei 0 °C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32 %igen wässrigen Ammoniaklösung versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit je- weils 60 ml Diethylether extrahiert und anschließend durch Versetzen mit 10 %iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht. Es wird mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmem- bran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Elementaranalyse: ber.: C 47,58 H 6,61 N 8.27 S 3.62 gef: C 47,61 H 6,58 N 8,32 S 3,68
Wassergehalt: 6,43 %
Ausbeute: 3,29 (89,6 % d. Th) als amorphes und farbloses Pulver.
Für die oben genannte Titelverbindung wurde ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45,4 % Gly-Me-DOTA und 54,6 % Lactose (entsprechend 11 Gly- Me-DOTA-Einheiten und 13-D-Lactoseresten pro Molekül) ermittelt . In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
d) 24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)^ - ( N-Glutaroy-2- aminoethyl-1- thio-ß-D-lactose- Amid )-|3-Konjugat
2,53 g (0,22 mmol; entsprechend 2,42 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 54 c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe mit 10 %iger wässriger Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Abschließend gibt man bei Raumtemperatur 670 mg (2,55 mmol) Gadoliniumchlorid hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60 °C Bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Man erhält 2,7 g (98,6 % d.Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 6,12 %. Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 41 ,47 H 5,51 N 7,21 S 3,16 Gd 13,10 gef: C 41 ,54 H 5,60 N 7,16 S 3,09 Gd 13,18
Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45,2 % Gd-Gly-Me-DOTA und 54,8 % Lactose (entsprechend 11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 13-D- Lactoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 55
24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)^ - ( N-Glutaroyl-2-amiroe hyl-1- O-ß-D-lactose- Amid ) 3-Konjugat
a) N-Glutaroyl-2-aminoethyl-1-O-ß-D-lactose -2,3,6,2",3",4",6"-heptaacetat
In analoger Weise wie für Beispiel 54a) beschrieben, liefert die Umsetzung von 14,0 g (21 ,6 mmol) (2-Amino-ethyl)-ß-latosidheptaacetat (Yoshiaki Miura, Tsu- tomu Arai, Tatsuya Yamagata, Carbohydrate Reserarch 289 (1996) 193 - 199) in 250 ml wasserfreiem THF mit 2,96 g (26 mmol) Glutarsäureanhydrid nach Aufarbeitung 14,9 g (87,0 % d. Th.) der Titelverbindung als farblosen Feststoff.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 50,00 H 5,85 N 1 ,77 gef: C 49,89 H 5,92 N 1 ,80
b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)11 - [ N-Gluta- royl-(2-aminoethyl-1-O-ß-D-lactose-2,3,6,2",3",4",6"-heptaacetyl)- Amid-]i3-Konjugat
14,4 g (18,16 mmol) der Verbindung aus Beispiel 55a) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und bei 0 °C mit 2,51 g (21 ,8 mmol) N-Hydroxysuccinimid gefolgt von 4,46 (28,8 mmol) Dihydro- hexylcarbodimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 0 °C und 3 Stunden bei 22 °C filtriert man vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff ab und tropft die so erhaltene klare Aktivesterlösung der oben genannten Titelverbindung bei 0 °C langsam zu einer gerührten Lösung von 3,9 g (0,435 mmol; entsprechend 5,65 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 10a). Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und mit Dichiormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat- lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 7,48 g (90,4 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d.h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwe- feiwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 54,5 % Lactoseheptaacetat-Einheiten (entsprechend 13 Lactoseresten pro Molekül. )
Eiementaranalyse: ber.: C 56,72 H 7,65 N 8,31 gef: C 56,82 H 7,69 N 8,41
c) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)1 - ( N-Glutaroyl-2-aminoethyl- 1 -O-ß-D-lactose- Amid )1 3-Konjugat
5,93 g (0,312 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 55b) werden in 100 ml absolutem Dichiormethan gelöst und bei 0 °C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der so erhaltene, ölige Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32 %igen wässrigen Ammoniaklösung versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert und anschließend durch Versetzen mit 10 %iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht. Es wird mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiitra- tionsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet. Wassergehalt: 9,30 %
Ausbeute: 3,23 g (91 ,7 %d. Th) als amorphes und farbloses Pulver.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 48,46 H 6,73 N 7,33 gef: C 48,52 H 6,59 N 7,40
d) 24er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me- DOTA-Amid)^ - ( N-Glutaroyl-2-amino- e* yl-1-O-ß-D-lactose- Amid )13-Konjugat
2,48 g (0,22 mmol; entsprechend 2,42 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbindung aus Beispiel 55c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe mit 10 %iger wässriger Salzsäure auf 5,0 eingestellt Anschließend gibt man bei Raumtemperatur 670 mg (2,55 mmol) Gadoliniumchlorid , gelöst in 10 ml destilliertem Wasser , hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60 °C Bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Man erhält 2,75 g (96,1 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 4,19 %.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 42,13 H 5,50 N 7,33 Gd 13,31 gef: C 42,20 H 5,60 N 7,26 Gd 13,28
Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45,7 % Gd-Gly-Me-DOTA und 54,3 % Lactose (entsprechend 11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 13-D- Lactoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der quantitativen Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar. „ „„
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Beispiel 56
24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)1 1-(α-D-mannopyranose-1-thio- 3-propi- on-Amid)^3-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-tetra-t.-butylester-Amid)1 1
20,0 g (32,37 mmol) 3,9-Bis(t-butoxycarbonylmethyl)-3,6,9-triazaundecandi- carbonsäure-di-t-butylester (Darstellung wie in den europäischen Patentanmeldungen: EP 0430863; EP 0331616 und EP 0271180 beschrieben) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren mit 4,47 g (38,84 mmol) N-Hydroxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur pcrti- onsweise mit insgesamt 7,97 g (38,84 mmol) Dicyciohexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0°C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 9,0 g (1 ,9 mmol; entsprechend 44,8 mmol an freien Aminofunktio- nen) 24er-Kaskadenpolyamin und 4,6 g (45,8 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der verbleibende Rückstand mit 250 ml Dichiormethan versetzt. Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organische Phase nacheinander mit 5 %iger Salzsäure, gesättigte Natrium- hydrogencarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem
Trocknen der organischen Produktphase über Natriumsulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 14,0 g (79,2 % d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nachfolgenden Syntheseschritte einge- setzt wird. Nach quantitativer Ninhydrinreaktion der oben genannten Titelverbindung liegen im Mittel 13 freie Aminfunktionen pro Molekül vor.
Elementaranalyse: ber.: C 58,84 H 9,01 N 11 ,66 gef: C 57,79 H 9,24 N 11 ,80 b) 24er-Kaskadenamin-(DTPA- tetra-tert.butylester -Amid)1 r[(3-(2,3,4, 6-Tetra-O-acetyl)-1-thio-α-D-mannopyranosyl- 3-propion-Amid) 3- Konjugat
Einge gerührte Lösung von 3,5 g (0,27 mmol; entsprechend 3,5 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 56a) in 100 ml absolutem Dichiormethan wird bei Raumtemperatur mit 617 mg (6,1 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wird mit einer Lösung von 2,97 g (5,61 mmol) 3-(2, 3,4,6- Tetra-O-acetyl-1-thio-α-D-mannopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimid- ester ( Lee,Y.C et al., Biochemi., Vol. 15, No. 18, 1976, 3956-3963; Krohn, K.A. et al., J. Nucl. Med., Vol. 26, 10, 1985, 1157-1167) in 60 ml Dichiormethan tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit Dichiormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 3,55 g (92,6 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Elementaranalyse: ber.: C 55,10 H 7,73 N 7,37 S 2,81 gef: C 55,20 H 7,78 N 7.31 S 2,79
Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 55 % D-Mannose- tetraacetat (entsprechend 13 D-Mannoseresten pro Molekül).
c) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)1 -(α-D-mannopyranose-1-thio- 3- propion-Amid)13-Konjugat
4,5 g (0,30 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 56b) werden in 100 ml abso- lutem Dichiormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32 %igen wässrigen Ammoniaklösung versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert Die und anschließend durch Versetzen mit 10 %iger Salzsäure auf pH 3.0 gebracht, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Nach erneuter Ultrafϊltra- tion wird der verbleibende Rückstand mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet. Anschließend wird in 300 ml Wasser aufgenommen und der pH-Wert der resultierenden Produktlösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf 7,2 eingestellt. Ausbeute- 2.80 g (81 ,3 % d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver.
Wassergehalt 6,39 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,20 H 5,65 N 9,82 Na 9,09 S 3,75 gef: C 43,22 H 5,71 N 9,79 Na 9,12 S 3,70
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
d) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)1 ^-(α-D-mannopyranose-1-thio-3- propion-Amid)-|3-Konjugat
2,5 g (0,22 mmol; entsprechend 2,47 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 56c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird durch tropfenweiser Zugabe mit 10 %iger wässrigen Salzsäure auf 5,2 eingestellt. Abschließend gibt man bei Raumtemperatur eine Lösung von 670 mg (2,55 mmol) Gadoliniumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei Raumtemperatur. Die Reaktionslösung wird durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3- Ultrafiitrationsmembran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Man erhält 2,6 g (98,3 % d.Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 8,11 %.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 39,73 H 5,20 N 9,03 S 3,45 Gd 14,30 gef: C 39,81 H 5,20 N 9,07 S 3,49 Gd 14,28
Aus den molaren Elementarverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45,2 % Gd-DTPA und 54,8 % D-Mannose (entsprechend 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-D-Mannose- resten pro Molekül). In der Titelverbindung sind durch Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 57
24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid) r( ß-D-galactopyranose-1-thio- 3-propi- on-Amid)-|3-Konjugat
a) 24er-Kaskadenamin-(DTPA- tetra-tert.butylester -Amid)-] r[(3-(2,3,4,6- Tetra-O-acetyl)-1-thio- ß-D-galactopyranosyl- 3-propion-Amid)i3-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 56b) beschrieben, führt die Umsetzung von 3,0 g (0,32 mmol; entsprechend 4,2 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 56a) mit 2,76 g (5,2 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-ß-D-galactopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (Darstellung gemäß: Lee.Y.C et al., Biochemi., Vol. 15, No. 18, 1976, 3956-3963; Krohn, K.A. et al., J. Nucl. Med., Vol. 26, 10, 1985, 1157-1167) zur Bildung von 4,15 g (87,6 % d. Th. ) der oben genannten Titelverbindung als farbloses Öl.
Elementaranalyse: ber.: C 55,10 H 7,73 N 7,37 S 2,81 gef: C 55,14 H 7,80 N 7,31 S 2,88 Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranaiyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 13 D-Galactoseresten pro Molekül.
b) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid) 1-( ß-D-galactopyranose-1-thio- 3- propion-Amid)i3-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 56c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 3,5 g (0,23 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 56b) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 2,26 g (88,6 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 5,74 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,20 H 5,65 N 9,82 Na 9,09 S 3,75 gef: C 43,22 H 5,68 N 9,77 Na 9,12 S 3,70
c) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)1 1-( ß-D-galactopyranose-1-thio- 3-propion-Amid)-|3-Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 56d) beschrieben, führt die Komplexierung von 2,0 g (0,180 mmol; entsprechend 1 ,97 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 57b) mit 525 mg (2,00 mmol) Gadoliniumchlorid , gelöst in 10 ml destilliertem Wasser , zur Bildung der oben genannten Titelverbindung. Ausbeute: 2,14 g (98,4 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses und amorphes Pulver Wassergehalt: 7,22 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 39,73 H 5,20 N 9,03 Na 2,09 S 3,45 Gd 14,30 gef: C 39,84 H 5,22 N 9,10 Na 2.12 S 3,40 Gd 14,27
Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
11 Gd-DTPA-Einheiten und 13 D-Galactopyranosylresten Beispiel 58
5 24er-Kaskadenpolyamιπ-( 1 1 1 lndιum-DTPA-Amιd)8-[ß-ι,1 -Deoxy-1-thιoureιdo)-
Figure imgf000143_0001
a) 24er-Kaskadenpolyamιn -(DTPA-tetra-t butylester-Amιd)8-Konjugat
10 12,35 g (20 00 mmol) 6 9-Bιs(t-butoxycarbonylmethyl)-3-carboxymethyl-3 6 9- tnazaundecandicarbonsaure-di-t-butylester werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelost und unter Ruhren mit 2 9 g (24 mmol) N- Hydroxysuccinimid versetzt Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0 °C abgekühlt und bei dieser Temperatur portionsweise mit insgesamt 49 g
15 (24 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0 °C und 2 5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert Das so erhaltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Losung von 9 0 g (1 ,9 mmol entsprechend 45 8 mmol an freien Aminofunktionen) 24er-Kaskadenpoiyamιn und 4,6 g
20 (45,8 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der verbleibende Ruckstand mit 250 ml Dichiormethan versetzt Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organische Phase nacheinander mit 5 % Salzsaure gesattigte Natriumhydrogencarbonatlösung zweimal mit
25 Wasser gewaschen Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Natriumsulfat wird filtriert und das Losungsmittel im Vakuum abgezogen Man erhalt 12,38 g (94 6 % d Th , bezogen auf eingesalztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Ols welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nachfolgenden Syntheseschritte eingesetzt wird Nach quantitativer Ninhydπnreak-
30 tion der oben genannten Titelverbindung liegen im Mittel 16 freie Aminfunktionen pro Molekül vor
b) 24er-KaskadenDθlyamιn-( DTPA-Amιd)8-Konjugat
J3
4 5 g (0 58 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 58a) werden in 100 ml absolutem Dichiormethan gelost Anschließend wird Dei 0 °C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenwe'se versetzt Nach eιπer Reaktionszeit vor 12 Stun- Λ n
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den bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 200 ml destillierten Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jewels 60 ml Diethylether extrahiert. Anschließend wird die wässrige Produktlösung durch Versetzen mit 10 %iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YMA-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Anschließend wird in 300 ml Wasser aufgenommen und der pH-Wert der resultierenden Produktlösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf 7,2 eingestellt. Nach erneuter Ultrafiltration wird der verbleibende Rückstand mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet. Ausbeute: 3,16 g (84,3 % d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver. Wassergehalt: 7,33 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,70 H 6,0 N 14,92 Na 11 ,36 gef: C 44,77 H 6,6 N 14,90 Na 11 ,31
c) 1-Deoxy-1-isothiocyanato-sialyl-Lex-
270 mg (0,293 mmol) 1-Deoxy-1-amino-sialyl-Lex (Darstellung gemäß: Kunz, H. ; et al., Angew. Chem. 1994, 1JJJ Nr. 20 ;Kunz, H. ; et al., Angew. Chem. 1996, 108, Nr. 3, 359-362; Kunz, H. ; et al., Angew. Chem. 1995, 107, Nr. 9 ; Kretzschmar et al. , Tetrahedron, Vol.51 , No. 47. 13015-13030 , 1995 ) werden in 40 ml 80 %igem, wässrigem Ethanol gelöst und bei 0°C mit 0,056 ml (0,73 mmol) Thiophosgen durch Zugabe über eine Mikrospritze versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 22°C wird das Ethanol im Vakuum abgezogen und der erhaltene wässrige Rückstand des rohen Isothiocyanats direkt für die nachfolgende Reaktion eingesetzt, wobei der Gehalt an oben genannter Titelverbindung der so erhaltenen wässrigen Rohproduktlösung mit 0,276 mmol (entspricht einem 95 %igen Umsatz) angenommen wird , welche in einem Gesamtvolumen von 7.6 ml wässriger Lösung enthalten sind. Dünnschichtchromatographie (Ethylacetat/MethanolΛΛ/asser/Eisessig = 5:3:3:0,5 ; Rf= 0,54 ) der Reaktionslösung zeigt vollständige und einheitliche Umsetzung zur oben genannten Titelverbindung an. Schwefelbestimmung (bezogen auf wasserfreie Probe): ber.: S 3,31 gef: S 3,24
d) 24er-Kaskadenpolyamin-( DTPA-Amid)8-[ß-(1 -Deoxy-1 -thioureido)- sialyl-Lex]16-Konjugat
Die Umsetzung von 54.5 mg (0,00842 mmol; entsprechend 0,134 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 58b) mit der gesamten wässrigen Lösung des Rohprodukts der Titelverbindung aus Beispiel 58c, entsprechend 0,276 mmol), liefert nach Aufarbeitung unc Gefriertrocknung :64,7 mg ( 89 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 10.01 %
Elementaranalyse (Natrium- und Schwefelbestimmung ; bezogen auf wasserfreie Probe): ber.: S 2,34 Na 3,35 gef: S 2,36 Na 3,29
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d.h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung er- gibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 67,4 % sialyl-Lex (entsprechend 8 sialyl-Lex -Resten pro Molekül). Aus der quantitativen Schwefelsäurebestimmung mittels TBA (Thiobarbitursäure) durch literaturbekannte Vorgehensweise (vgl. Beispiel 39) wird der Beladungsgrad der oben genannten Titelverbindung mit 67,2 % an Tetrasaccharid (entsprechend 16 sialyl- Lex Resten pro Molekül) ermittelt. Nach erneuter colorimetrischer Titration der Titelverbindung mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung, in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator konnte der DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 32,8 % (entpsrechend 8 DTPA Einheiten pro Molekül) bestätigt werden. Λ Λ Λ
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e) 24er-Kaskadenpolyamin-( 111lndium-DTPA-Amid)8-[ß-(1-Deoxy-1- thioureido)-sialyl-Lex]16-Konjugat
1mg der Titelverbindung aus Beispiel 58 d) werden in 2 ml Natriumeitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 111 Indiumchlorid (Anfangsaktivität: 17,2 MBq ) versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und sterilfiltriert.
Die so hergestellte Lösung ist direkt für die entsprechenden radiodiagnostischen Zwecke einzusetzen
Beispiel 59
24er-Kaskadenpolyamin-( 157 Gadolinium-DTPA-Amid)8-[ß-1-O-(6- Thioureidohexyl)-sialyl-Lex]i6-Konjugat
a) 24er-Kaskadenpolyamin -( DTPA-Amid)8-Konjugat
5,0 g (1.80 mmol; entsprechend 43.2 mmol an freien Aminofunktionen) 24er- Kaskadenpolyamin werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 8.0 g ( 20.0 mmol) DTPA-Monoanhydrid-mono-ethyiester hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32 %iger Natronlauge auf 11 ,5 eingestellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrations- membran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleiben- de Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet. Ausbeute: 10.63 g ( 91.2 % d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver Wassergehalt: 7.88 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,70 H 6,04 N 14,92 Na 11 ,36 gef: C 44,81 H 6.10 N 14,90 Na 11 ,32
Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 33,47 % (entsprechend 8 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion als auch der quantitativen Aminogruppenbestimmung mit der TNBS-Methode liegen im statistischen Mittel pro Polymermolekül 16 freie Aminofunktionen vor.
b) ß-1-O-(6-lsothiocyanato-hexyl)-sialyl-Lex
250 mg (0,243 mmol) ß-1-O-[6-Aminohexyl]-sialyl-Lex (Darstellung gemäß: Kunz, H. ; et al., Angew. Chem. 1994, 106. Nr. 20 ; Kretzschmar et al. , Tetrahedron, Vol.51. No. 47. 13015-13030 , 1995 ) werden in 30 ml 80 %igem, wässrigem Ethanol gelöst und bei 0°C mit 0,046 ml (0,60 mmol) Thiophosgen durch Zugabe über eine Mikrospritze versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 22°C wird das Ethanol im Vakuum abgezogen und der erhaltenen wässrigen Rückstand des rohen Isothiocyanats direkt für die nachfolgende Reaktion eingesetzt, wobei der Gehalt an oben genannter Titelverbindung der so erhaltenen wässrigen Rohproduktlösung mit 0,23 mmol (entspricht einem 95 %igen Umsatz) angenommen wird , welche in einem Gesamtvolumen von 5.6 ml wässriger Lösung enthalten sind.
Dünnschichtchromatographie (Ethylacetat/Methanol Λ/asser/Eisessig = 5:3:3:0,5 ; Rf= 0,72 ) der Reaktionslösung zeigt vollständige und einheitliche Umsetzung zur oben genannten Titelverbindung an.
Elementaranalyse (Schwefelbestimmung; bezogen auf eine wasserfreie Probe): ber.: S 3,00 gef: S 2,90 c) 24er-Kaskadenpolyamin-( DTPA-Amid)8-[ß-1 -O-(6-Thioureidohexyl)- sialyl-Lex]-|6-Konjugat
Die Umsetzung von 50.0 mg (0,00770 mmol; entsprechend 0,123 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 59a) mit der gesamten wässrigen Lösung des Rohprodukts der Titelverbindung aus Beispiel 59b) (0,23 mmol) liefert nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung 167,7 mg (92,4 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 9.04 %
Elementaranaiyse (Natrium- und Schwefelbestimmung ; bezogen auf wasserfreie Probe): ber.: S 2.18 Na 6.95 gef: S 2,29 Na 7.03
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 67,0 % sialyl -Lex -Einheiten (entsprechend 16 sialyl -Lex-Resten pro Molekül).
Aus der quantitativen Sialinsäurebestimmung mittels TBA (Thiobarbitursäure) durch literaturbekannte Vorgehensweise [vgl. Lit.: Aminoff, D. , (1961) , "Methods for the quantitative estimation of N-acetylneuraminic acid and their application to hydrolysates of sialomucoids" , J. Biochem. , 81, 384-392; Uschi- da, Y. and Sugimori, T. (1977), "Distribution of neuraminidase in Arthrobacter and its purification by affinity chromatography", J. Biochem. (Tokio), 82, 1425- 1433 ] wird der Beladunsgrad der oben genannten Titelverbindung mit 68.1 % an Tetrasaccharid (entsprechend 16 sialyl -Lex-Resten pro Molekül ermittelt. Nach erneuter colorimetrischer Titration der Titelverbindung mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung, in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator , konnte der DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 32,1 % (entsprechend 8 DTPA Einheiten pro Molekül) bestätigt werden. d) 24er-Kaskadenpolyamin-(157Gadolinium-DTPA-Amid)8-[sialyl-Lex-1 - (6-hexyl-thiohamstoff )] 16 - Konjugat
1mg der Titelverbindung aus Beispiel 59c) werden in 2 ml Natriumeitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 157Gadolinium- chlorid (Anfangsaktivität: 16,2 MBq ) versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und sterilfiltriert. Die so hergestellte Lösung ist direkt für die entsprechenden radiodiagnostischen Zwecke einzusetzen
Beispiel 60
24er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid )- ( N-G!utaroyl-3-aminoethyl-ß- 1-thiolactosid-amid )-|3-Konjugat
a) 24er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-tetra-t.-butylester-Amid ) ( N-glutaroyl- 3- aminoethyl-ß-1- thioiactosid-amid )13-Konjugat
Auf analoge Weise wie in Beispiel 54b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 5,40 g (0,58 mmol, 7,54 mmol an freien Amin) der Titelverbindung aus Beispiel 56a) , welche zuvor in 25 ml absolutem N,N-Dimethylformamid gelöst und die so enthaltene Lösung auf 0°C gekühlt wurde , mit einer Lösung von 12,16 g (13,92 mmol) N-Glutaroyl-3-aminoethyl-ß-1-thiolactosylheptaacetat-glutarsäure- N-hydroxysuccinimidester [ ( zur Darstellung vgl. Beispiel 54b) ] in 75 ml absolutem N,N-Dimethylformamid zur Bildung der gewünschten Titeiverbindung . Dazu wird nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und mit Dichiormethan auf ein Gesamtvo- lumen von 500 ml aufgefüllt. Zur Aufarbeitung wird die organische Phase nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 10,0 g (90,1 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrin- reaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d.h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich e iinn Beladungsgrad des Polymers mit 52,9 % Lactoseheptaacetateinheiten (e Ben sprechend 13 Lactoseresten pro Molekül ).
b) 24er-Kaskadenpolyamin-(DTPA- Amid )ι ( N-glutaroyl-3-aminoethyl-ß- 1- thiolactosid-amid ) 3-Konjugat
6,1 g (0,312 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 60a) werden in 100 ml ab- solutem Dichiormethan gelöst und anschließend bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der so erhaltene, ölige Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32 % igen wässrigen Ammoniaklösung versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert und an- schließend durch Versetzen mit 10 %iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht. Es wird mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet. Ausbeute: 3,95 g (88,7 % d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver Wassergehalt: 4,88 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,44 H 5,85 N 8,90 S 2,91 Na 7,06 gef: C 44,49 H 5,92 N 8,79 S 2,87 Na 6,98
c) 24er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid )-π- ( N-glutaroyl-3-aminoethyl- ß-1 -thiolactosid-amid )1 3-Konjugat
3, 15 g (0,22 mmol; entsprechend 2,42 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 60b) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe mit 10 %iger wässrigen Salzsäure auf 4,0 eingestellt. Anschließend gibt man bei Raumtemperatur 670 mg (2,55 mmol) Gadoliniumchlorid ,, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser , hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C. Bei Raumtemperatur wird die Reak- tionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3-Ultrafiltra- tionsmembran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Man erhält 3,3 g (98,4 % d.Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 7,39 %.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 41 ,71 H 5,28 N 8,35 Na 1 ,66 S 2,73 Gd 11 ,33 gef: C 41 ,81 H 5,34 N 8,29 Na 1 ,62 5 2,69 00 11 ,40
Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 46 % DTPA und 54 % Lactose (entsprechend 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-Lactoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 61
48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)18 - (α-D-mannopyranosyl-1-thiopro- pionsäureamid )3Q -Konjugat
a) 48er-Kaskadenpolyamin-[DTPA-tetra-t.-butylester-Amid (terminal) ]18 - Konjugat
16,55 g (26,8 mmol) DTPA-tetra-tert.butylester (Darstellung : Deutsche Patentanmeldung Nr. 195 080 58 A ) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolu- tem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren mit 3,7 g (32,16 mmol) N-Hy- droxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0 °C abgekühlt und bei dieser Temperatur portionsweise mit insgesamt 6,6 g (32,16 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0 °C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so erhaltene Fiitrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 6,5 g (0,99 mmol; entsprechend 47,8 mmol an freien Aminofunktionen) 48er-Kaskadenpolyamin und 4,8 g (50,0 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der verbleibende Rückstand mit 250 ml Dichiormethan versetzt. Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organische Phase nacheinander mit 5 %iger Salzsäure, gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Natriumsulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 14,5 g (85,2 % d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nachfolgenden Syntheseschritte eingesetzt wird. Nach quantitativer Ninhydrinreaktion der oben genannten Titelverbindung liegen im Mittel 30 freie Aminfunktionen pro Molekül vor.
Elementaranalyse: ber.: C 59,87 H 9,20 N 8,88 gef : C 59,80 H 9,28 N 8,90
b) 48er-Kaskadenpolyamin-[DTPA-tetra-t.-butylester-Amid (terminal) ]18 - [3-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl)-1 -thiopropionsäure- amid ]3g -Konjugat
Eine gerührte Lösung von 3,26 g (0,19 mmol; entsprechend 5,7 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 61 a) in 100 ml absolutem Dichiormethan wird bei Raumtemperatur mit 657 mg (6,5 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wird mit einer Lösung von 3,3 g (6,3 mmol) 3-(2, 3,4,6- Tetra-O-acetyl-1 -thio-α-D-mannopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimid- ester in 60 ml Dichiormethan tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit Dichiormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zwei- mal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel beim Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 5,07 g (90,3 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Elementaranalyse: ber.: C 53,52 H 7,48 N 7,22 S 3,16 gef: C 53,90 H 7,52 N 7,18 S 3,21
Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 62,83 % α-D-Manno- se-tetraacetateinheiten (entsprechend 30 α-D-Mannoseresten pro Molekül).
c) 48er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)18 - (α-D-mannopyranosyl-1-thio- 3-propionsäure-amid )3C -Konjugat
5,17 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 61 b) werden in 100 ml absolutem Dichiormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver- bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32 %igen wässrigen Ammoniaklösung versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert. Die wässrige Produktlösung wird durch Versetzen mit 10 %iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltra- tionsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der ver- bleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 3,47 g (91 ,6 % d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver. Wassergehalt: 7,34 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,91 H 6,09 N 9,82 S 4,29 Na 7,39 gef: C 43,89 H 6,12 N 9,84 S 4,34 Na 7,42 d) 48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)18 - (α-D-mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-amid )30 -Konjugat
3,04 g (0,136 mmol; entsprechend 2.45 mmol an DTPA der Titelverbindung aus Beispiel 61c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung durch tropfenweise Zugabe mit 10 %iger wässrigen Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Anschließend gibt man bei Raumtemperatur 655,8 mg (2,5 mmol) Gadoliniumchlorid , in Form von 10 ml einer wässrigen Lösung , hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C Bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3- Ultrafiltraticnsmembran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefrier- getrocknet.
Man erhält 3,21 g (98,6 % d.Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 7.30 %.
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 41 ,00 H 5,68 N 9,17 S 4.01 Gd 11 ,80 Na 1 ,72 gef: C 41.09 H 5,71 N 9.10 S 4,08 Gd 11 ,74 Na 1 ,74
Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 37,8 % Gd-DTPA und 62,2 % α- D-Mannose (entsprechend 18 Gd-DTPA-Einheiten und 30 α-D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.
Beispiel 62
48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)18 - [3-(1-thio- ß-D-glucopyranosyl) propionsäure-amid ]30 -Konjugat a) 48er-Kaskadenpolyamin-[DTPA-tetra-t.-butylester-Amid (terminal) ]18 und [3-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-ß-D-glucopyranosyl)-propionat ]30- Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 61 b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,26 g (0,19 mmol; entsprechend 5,70 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 61a) mit 3,3 g (6,3 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl- 1-thio-ß-D-glucopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester 5,45 g (94.3 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.
Elementaranalyse: ber.: C 53,52 H 7,48 N 7,22 S 3,16 gef: C 53,88 H 7,46 N 7,20 S 3.20
Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 30 ß-D-Glucoseresten pro Molekül.
b) 48er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)18 - [3-(1-thio- ß-D-glucopyra- nosyl) - propionsäure-amid ]30 -Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 61 c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 5,17 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 62a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 3,35 g (88,0 % d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 7,44 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 43,91 H 6,09 N 9,82 S 4,29 gef: C 43,94 H 6.11 N 9,77 S 4,30
c) 48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)18 - [3-(1-thio- ß-D- glucopyranosyl) -propionsäure-amid ]30 -Konjugat
Auf analoge Weise wie für Beispiel 61 d) beschrieben, führt die Komplexierung von 3,04 g (0, 136 mmol; entsprechend 2,45 mmol an DTPA) der Titelverbin- dung aus Beispiel 62b) mit 556 mg (2,5 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser , zur Bildung der oben genannten Titelverbindung. Ausbeute: 3,21 g (98,4 % d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver Wassergehalt: 5,03 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 41 ,00 H 5,68 N 9,17 S 4,01 Gd 11 ,80 Na 1 ,72 gef: C 40,96 H 5,75 N 9,20 S 3,97 Gd 11 ,78 Na 1 ,69
Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung: 18 Gd-DTPA-Einheiten (Polymerbeladungsgrad von 43,8 %) und 30 D-Glucopyranosylreste (Polymerbeladungsgrad von 56,2 %)
Die Polymerbeladungsgrade wurden aus den molaren Elementve^hältnisεe-, von Schwefel zu Gadolinium ermittelt.
Beispiel 63
13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)47 - [1-(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl-ß- D-glucosaminopyranosyl] 33-Koπjugat
a) 13 kD-poly-L-Lysin - (DTPA-Amid)47 -[1-(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl-ß- D-glucosaminopyranosyl] 33-Konjugat
1 ,5 g (0,047 mmol; entsprechend 1 ,54 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 1a) werden in 80 ml entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit 1 molarer Salzsäure auf 9,5 eingestellt. Anschließend wird portionsweise mit insgesamt 2,35 g (6,63 mmol) p-lso- thiocyanatophenyl-N-acetyl-ß-D-glucosaminopyranose (Darstellung gemäß: Jonas Adam J, Jobe Helgi, Biochem. J. (1990), 268(1). 41-5) versetzt, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung mittels 0,1 molarer Natronlauge bei 9,5 konstant gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei 22°C wird filtriert und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 250 ml aufgefüllt. Dreimalige Ultrafiltration der Reaktionslösung über eine YM3-Ultrafiltrations- membran (AMICON ®) gefolgt von Gefriertrocknung des verbleibenden Rückstands liefert 1 ,93 g (93,8 % d. Theorie) eines amorphen und farblosen Feststoffs. Wassergehalt: 7,43 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,78 H 5,60 N 11 ,74 S 2,42 Na 9,87 gef: C 44,82 H 5,63 N 11 ,70 S 2,37 Na 9,79
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode , welche zur quantitativen als auch zur qualitativen Bestimmung von freien Aminofunktionen allgemein eingesetzt werden können, verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 41 ,6 % N-Acetylglucosamin (entsprechend 26 N-Acetylglucosaminresten pro Molekül). Die colorimetrische Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Konjugats liefert als Ergebnis einen mittleren statistischen Beladungsgrad on 41.1 % N-Acetylglucosamin pro Molekül und ist somit als identisch anzusehen mit dem Beladungsgrad (33 N- Acetyl-glucosamineinheiten pro Molekül), welcher aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ermittelt wurde.
b) 13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)47 - [1 -(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl- ß-D-glucosaminopyranosyl] 33-Konjugat
1 ,03 g (0,023 mmol; entsprechend 1 ,50 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 63a) werden in Analogie wie in Beispiel 1c) beschrieben, mit 0,40 g (1 ,51 mmol) Gadoliniumchlorid , gelöst in 10 ml destilliertem Wasser , komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1 ,48 g (99,4 % d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver. Wassergehalt: 0,31 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 40,90 H 5,11 N 10,72 S 2,21 Gd 15,41 Na 2,25 gef: C 40,87 H 5,03 N 10,68 S 2,27 Gd 15,48 Na 2,30
Aus den molaren Elementarverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 60 % Gd-DPTA und 40 % N-Acetyl-glucosamin (entsprechend 47 Gd-DTPA-Einheiten und 33 -N-Acetyl-ß- . _„
-l oo-
D-glucosaminresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar. Die T-| und T2-Relaxivitäten der Titelverbindung wurden jeweils in Wasser ,als auch im Plasma bestimmt . Die Messungen erfolgten bei 40°C, einer Magnetfeldstärke von 0.47 Tesla , und der T1 -Sequenz : 180° - Tl - 90° [ Inversion Recovery ] sowie der T2-Sequenz : 90° - TE - 180° [ CPMG ]. Alle Relaxivitätsbestimmungen erfolgten auf einem Minispec PC 20 . Als Referenzprobe diente in allen Fällen eine Lösung von Gd-DTPA der Konzentration 1 mmol/L .
R-, (Wasser) = 13.8 ± 0.2 (L/mmol-s)
R1 (Plasma) = 16.1 ± 0.3 (L/mmol-s) R2 (Wasser) = 15.8 + 0.2 (L/mmol-s)
R2 (Plasma) = 18.0 ± 0.1 (L/mmol-s)
Beispiel 64
24er-Kaskadenpolyamin- {10-[7-(4-lsothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1 ,4,7-tris(carboxymethyl)-1 ,4,7, 10- tetraazacyclododecan-Gadoiinium-Komplex }-j2 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D- galactopyranosyl]1 -Konjugat
a) 24er-Kaskadenpolyamin- {10-[7-(4-Thioureidophenyl)-2-hydroxy-5-oxo- 7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1 ,4,7-tris(carboxymethyl)-1 ,4,7,10- tetraazacyclododecan-Gadolinium-Komplex}ι2 -Konjugat
Bei Raumtemperatur werden 5,0 g (1 ,06 mmol; entsprechend 25,44 mmol an freien Aminfunktionen) 24er-Kaskadenpolyamin in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wird durch tropfenweises Versetzen dieser Lösung mit 1 molarer Natronlauge wird ein pH-Wert von 9,5 ein- gestellt. Anschließend gibt man insgesamt 15,77 g (20,0 mmol) des 4-lso- thiocyanatophenyl- DO3A-ß-hydroxy-Gadolinium -Komplexes (Darstellung gemäß: Deutsche Patentanmeldung Nr. 44 24 923 A1) portionsweise hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Die Reaktionslösung wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 10,2 g (78,6 % bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver Wassergehalt: 6,94 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 45,38 H 5,77 N 12,58 S 3,05 Gd 14,35 gef: C 45,42 H 5,81 N 13,02 S 2,98 Gd 14,90
Aus dem Gehalt, welcher durch Elementaranalyse für Gadolinium und Schwefel ermittelt wurde, ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit Gadolinium Komplexen von 39.7 % (entsprechend 12 Gd-DO3A-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion liegen im Mittel pro Polymermolekül noch 12 freie Aminofunktionen vor.
b) 24er-Kaskadenpolyamin- {10-[7-(4-lsothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo- 7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1 ,4,7-tris(carboxymethyl)-1 ,4,7, 10- tetraazacyclododecan-Gadolinium-Komplex }-] 2 - [1-(4-Thioureidophenyl)- ß-D-galactopyranosyl]-|2- onjugat
In analoger Weise wie für Beispiel 1 b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 2,0 g (0.16 mmol; entsprechend 1 ,90 mmol an freien Aminfunktionen) der Tϊtel- Verbindung aus Beispiel 64a) mit 2,65 g (8,36 mmol) p-lsothiocyanatophenyl-ß- D-galactopyranose nach Aufarbeitung 2,34 g (89,3 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 4,97 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 46,40 H 5,55 N 11 ,03 S 4,70 Gd 1 1 ,52 gef: C 46,91 H 5,60 N 11 ,00 S 4,68 Gd 11 ,49 _ _
Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d.h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert als auch dem Gadoliniumgehalt der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beiadungsgrad des Polymers von 51.2 % ß-D-Galactose (entsprechend 12 ß-D-Galactoseresten pro Molekül) sowie ein Komplexbeladungsgrad des Polymers von 48,8. % (entsprechend 12 Gadoliniumkomplexen pro Molekül).
Beispiel 65
48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)18 -[1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] 30 -Konjugat
a) 48er-Kaskadenpolyamin-(DTPA- Amid )18
Eine Lösung von 5,0 g (1.7 mmol; entsprechend 81.7 mmol an freien Aminofunktionen) 48er-Kaskadenpolyamin wird in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 16,5 g (41 ,0 mmol) DTPA-Monoanhydrid-mono-ethylester hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32 %iger Natronlauge auf 11 ,5 einge- stellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrations- membran (AMICON ®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml auf- gefüllt und die wässrige Produktiösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 15,63 g (81.4 %; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes
Pulver
Wassergehalt: 6,94 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 40,82 H 5,26 N 12,64 Na 14.65 gef: C 40,91 H 5,30 N 12,59 Na 14,58 Nach Eiementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 38,2 % (entsprechend 18 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion als auch der quantitativen Aminogruppenbestimmung mit der TNBS-Methode liegen im Mittel pro Polymermolekül 30 freie Aminofunktionen vor.
b) 48er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)18 - [1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] 30 -Konjugat
3.0 g (0,134 mmol; entsprechend 4.03 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 65a) werden in 150 ml entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit 1 molarer Salzsäure auf 9,5 einge- stellt. Anschließend wird portionsweise mit insgesamt 5.4 g (17.33 mmol) p- Isothiocyanatophenyl-α-D-mannopyranose versetzt, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung mittels 0,1 molarer Natronlauge bei 9,5 konstant gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei 22°C wird filtriert und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 250 ml aufgefüllt. Dreimalige Ultrafil- tration der Reaktionslösung über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ® ) gefolgt von Gefriertrocknung des verbleibenden Rückstands liefert 2.45 g (87,9 % d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffs. Wassergehalt: 7.48 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 44,65 H 5.18 N 8,88 S 4,62 Na 8,39 gef: C 44,70 H 5,23 N 8,81 S 4,57 Na 8,44
Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefeiwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 61.9 % α-D-Mannose (entsprechend 30 α-Mannoseresten pro Molekül). Die colorimetrische Phenol- Schwefelsäure-Bestimmung zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungs- grades des Polyamins liefert als Ergebnis einen Beladungsgrad von 62.3 % α- D-Mannose ,d.h. es liegen 30 α-D- Mannosereste pro Molekül vor. Der so ermittelte Beladungsgrad der Titelverbindung ist identisch mit dem Beladungsgrad, welcher durch die prozentualen Elementverhältnisse ermittelt wurde. c) 48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)18 -[1-(4-Thioureidophenyl)-α - D-mannopyranosyl] 30 -Konjugat
2.0 g (0,096 mmol; entsprechend 1 ,73 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 64b) werden in 60 ml Natriumeitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 465 mg (1 ,76 mmol) Gadoliniumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations- membran (AMICON ®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Ausbeute: 2,1 g (98,2 % d. Th.) als amorphes Pulver Wassergehalt: 4.55 %
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz): ber.: C 41.65 H 4.83 N 8.28 S 4.31 Gd 12.68 Na 1.85 gef: C 41.72 H 4.88 N 8.24 S 4.30 Gd 12.71 Na 1.79
Aus den molaren Elementarverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 36,5 % Gd-DPTA und 63,1 % α-D-Mannose (entsprechend 18 Gd-DTPA-Einheiten und 30-α-D-Man- noseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Claims

Patentansprüche
1. Konjugate bestehend aus einem aminogruppen-enthaltenden Polymeren, Metallion(en) enthaltenden signalgebenden Gruppe(n) und Mono- oder Oligosacchariden sowie gegebenenfalls Kationen anorganischer und/oder organischer Basen, Aminosäuren oder Aminosäureamide.
2. Konjugate gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie gemäß der allgemeinen Formel I aufgebaut sind
P (K)m (L-Z)n (I),
worin P für ein k Aminogruppen - von denen (n+m) jeweils um ein Wasserstoffatom vermindert sind - enthaltendes Polymer, wobei (n + m) < k sein soll, n und m jeweils für die ganzen Zahlen 1 bis 149, k für die Zahlen 12 bis 150,
K für eine Metallion(en) enthaltende signalgebende Gruppe, L für einen Linker und
Z für ein um eine Hydroxylgruppe vermindertes Mono- oder Oligosaccharid stehen.
3. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn- zeichnet, daß die Summe (n + m) der signalgebenden Gruppen (K) und der über L gebundenen jeweils um eine Hydroxylgruppe verminderten Mono- oder Polysaccharide (Z) gleich der Anzahl k der im Polymeren enthaltenden Aminogruppen ist.
4. Konjugate gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß k für die Zahlen 12, 24,32, 36, 40, 48, 64 oder 80 steht.
5. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß P für ein k Aminogruppen, von denen (n + m) jeweils um ein Wasserstoffatom vermindert sind, enthaltendes Dendrimer, Polylysin, Poly- peptid, Polyallylamin, Poly[N-(2-aminoethyl)]methacrylamid oder Polysaccha- rid steht. - lOZ-
6. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie als signalgebende Gruppe K einen Chelatkomplex bestehend aus einem Rest der allgemeinen Formel II, III, IV, V oder VI enthalten.
OC^ / — \ / — \ ^COOR1
N N N R^OC-7 I ^-COOR1
COOR1
(ll),
R1OOC^ , \ / — \ ^COOR1
N N N
R^OC- I ^COOR1
R C=O
(ill),
Figure imgf000164_0001
Figure imgf000164_0002
(V),
Figure imgf000165_0001
worin
Rl unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquivalent der Elemente der Ordnungszahlen 20-32, 37 - 39, 42 - 44, 49 oder 57- 83,
R2 ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten C-|-C7-Alkyl- rest, einen Phenyl- oder Benzylrest,
V eine -CH2-(CH2)0-(0)p gruppe mit
Figure imgf000165_0002
o in der Bedeutung der Zahlen 0 bis 10, p und I jeweils in der Bedeutung der Ziffern 0 oder 1 , mit der Maßgabe, daß p nur dann für die Ziffer 1 steht wenn I die Ziffer 1 bedeutet,
T-! eine -NHCS- oder -CO-gruppe,
U eine -CHR3-C0NR -M1- oder -CH2-CH(OH)-M2- gruppe mit R3 unabhängig voneinander in der Bedeutung von R2 oder der Gruppe -CH2-(CH2)o- COOH und Ml und M2 jeweils in der Bedeutung eines Phenylenrestes oder einer geradkettigen, verzweigten, gesättigten oder ungesättigten C1-C20-
Alkylenkette, die gegebenenfalls substituiert ist durch 1-5 (CH2)o-COOH, 1- 5 OR2 -reste oder 1-8 Sauerstoffatome, 1-2-NH-, 1-2-C(=NH)-, 1-5-CONR3- , 1-5-NR3CO-, 1-2 Phenylen- oder 1-2 Phenylenoxygruppen enthält, bedeuten, mit der Maßgabe, daß mindestens zwei der Reste R1 für Metall- ionenäquivalente der Elemente der oben genannten Ordnungszahlen stehen.
7. Konjugate gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß M1 für eine Gruppe
CH2COOH
α CH2 ß, α (CH2)2 ß, α α — CH-CH2- ß, α-CH2-CH2-0-CH2-ß,
Figure imgf000166_0001
α - (CH2)l-2-CO-N-CH2-ß,
CH2COOH
α - CH2-CH2-CO-NH(CH2)6-ß, α-(CH2)s-ß,
steht, wobei α die Verknüpfungsstelle an den Rest-CONR3 und ß die Verknüpfungssteile an T-! angibt.
8. Konjugate gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß M2 für eine Gruppe
CH2COOH
α — -CH2 ß. α — CH2-N CO-(CH2)0. CH (/ V-ß, α CH2-NHCO-(,CH2)2 3-ß
— CH,-NHCO-CH,-0-CH, — ß , α (CH, r— ß
Figure imgf000166_0002
steht, wobei α die Verknüpfungsstelle an den Rest-CH(OH)-und ß die Verknüpfungsstelle an T"ϊ angibt.
9. Konjugate gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie als Mono- saccharide Hexosen, Pentosen oder N-Acetyl-neuraminosäure, die jeweils in der Pyranose- oder Furanose-Form vorliegen, oder deren Derivate enthalten.
10. Konjugate gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie als Mono- saccharide Hexosen, die in der Pyranose-Form vorliegen, oder deren Derivate enthalten. -
11. Konjugate gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Monosaccharide als 2-Amino-2-deoxy-, N-Acetyl-2-amino-2-deoxy-, 6-Deoxy-, 2- Deoxy-, 5-Carboxy- oder 1-Amino-1-deoxy-Derivate vorliegen.
12. Konjugate gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie Oligosaccharide aufgebaut aus den Monosacchariden gemäß Anspruch 9 enthalten.
13. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Z für ein am C-1-Atom um eine Hydroxylgruppe vermindertes Mono- oder Oligosaccharid steht.
14. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn- zeichnet, daß Z für ein am C-2-Atom um eine Hydroxylgruppe vermindertes
Mono- oder Oligosaccharid steht.
15. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß L für eine Gruppe T -M -X steht, wobei M3 für eine direkte Bindung steht oder die für M^ angegebene Bedeutung hat, T2 für eine -
NHCS-, -C(=NH)-, -CH2- oder CO-gruppe steht und an P bindet, X für NH, CO, O und S steht und an Z bindet.
16. Konjugate gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß M3 für eine direkte Bindung oder für die Gruppen
δ
Figure imgf000167_0001
Y-(CH2CH2O)^- CH2-(CH2)0. δ,
Y— (CH2)2-CONH-(CH2)6-δ,
CH(OH)CH2OH
— CH-CH(OH)-CH(OH)-δ,
γ - (CH2)2-CO-(CH2)3-δ
steht, wobei γ die Verknüpfungsstelle an X und δ die Verknüpfungsstelle an T2 angibt.
17. Verfahren zur Herstellung von Konjugaten der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1 , P (K)m (L-Z)n (I),
worin P für ein k Aminogruppen - von denen (n+m) jeweils um ein Wasserstoffatom vermindert sind - enthaltendes Polymer, wobei (n + m) < k sein soll, n und m jeweils für die ganzen Zahlen 1 bis 149, k für die Zahlen 12 bis 150, K als eine magnetische(s) Metallion(en) enthaltende signalgebende Gruppe für einen Chelatkomplex bestehend aus einem Rest der allgemeinen Formel II,
III, IV, V oder VI
OC ^ / \ / \ ^ COOR1
N N N
R1OOC ^ l ^ COOR1
COOR1
(II).
ROOC - \ / \ ^ COOR
N N N
R OOC COOR
R' C=O
(HD,
ROOC -\ -Λ /" COOR1 N N N
R OOC l ^ COOR1
COOR1 (IV),
Figure imgf000169_0001
(V),
R
V-T'
R1OOC-HC / CH-COOR
N N
N N R1OOC-HC7 CH-COOR1
R^ R^ (VI),
worin R1 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquiva- lent der Elemente der Ordnungszahlen 20-32, 37 - 39, 42 - 44, 49 oder 57-
83, R2 ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten C-|-C7-Alkyl- rest, einen Phenyl- oder Benzylrest,
V eine -CH2-(CH2)0-(0)p gruppe mit
Figure imgf000169_0002
o in der Bedeutung der Zahlen 0 bis 10, p und I jeweils in der Bedeutung der Ziffern 0 oder 1 , mit der Maßgabe, daß p nur dann für die Ziffer 1 steht, wenn I die Ziffer 1 bedeutet, T1 eine -NHCS- oder -CO-gruppe, U eine -CHR -CONR3-M1- oder -CH2-CH(OH)-M2- gruppe mit R3 unabhängig voneinander in der Bedeutung von R2 oder der Gruppe -CH2-(CH2)0-COOH und M^ und M2 jeweils in der Bedeutung eines Phenylenrestes oder einer geradkettigen, verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Cι-C20-Alkylen- kette, die gegebenenfalls substituiert ist durch 1-5 (CH2)0-COOH, 1-5 OR2 - reste oder 1-8 Sauerstoffatome, 1-2-NH-, 1-2-C(=NH)-, 1-5-CONR3-, 1-5- NR3CO-, 1-2 Phenylen- oder 1-2 Phenylenoxygruppen enthält, bedeuten, mit der Maßgabe, daß mindestens zwei der Reste R^ für Metallionenäquivalente der Elemente der oben genannten Ordnungszahlen stehen, L für einen Linker und
Z für ein um eine Hydroxylgruppe vermindertes Mono- oder Oligosaccharid stehen, dadurch gekennzeichnet, daß a) ein Polymer-komplex(bildner)-Konjugat der allgemeinen Formel VII
P(K')m (VII). worin K' für einen Rest der allgemeinen Formel II', III', IV, V oder VI'
oc-\ /-^ r- Γ∞ORV
N N N RrOOC -^ L^ ^r COOR1'
COOR1'
(ll')-
R1 OOOC ^ / \ / \ ^ COOR1
N N N
RrOOC - 1 ^ COOR1'
R2^ C=O
(lll'),
rCnOnODR
COOR1'
Figure imgf000170_0001
(IV)
Figure imgf000171_0001
(V)
Figure imgf000171_0002
(VI')
worin
R1' unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine Säureschutzgruppe oder ein Metallionenäquivalent der Elemente der Ordnungszahlen 20-29, 39, 42, 44 oder 57-83 steht und R2, V, o, p, T und U die oben genannte Bedeutung haben, mit n' Mono- oder Oligosacchariden der allgemeinen Formel VIII
L*-Z* (VIII),
worin n' = 1 - 3 n,
Z' die für Z genannte Bedeutung hat, wobei jedoch die in Z gegebenenfalls enthaltenen Carboxy-, Amino- und Hydroxygruppen gegebenenfalls geschützt sind, L* für eine Gruppe T2'-M3'-X mit
T2' in der Bedeutung von -NCS, -C(=NH)OCH3,- CHO, einer -CO-Fg-gruppe wobei
Figure imgf000172_0001
-O-CO-R^ mit R^ in der Bedeutung einer geradkettigen oder verzweigten
C-ι-C-7-Alkylkette, M3' die für M3 angegebene Bedeutung hat, wobei jedoch die in M3 gegebenenfalls enthaltenen Carboxygruppen gegebenenfalls geschützt sind, und X für NH, CO, O und S steht, oder
b) ein Polymersaccharid-Konjugat der allgemeinen Formel IX
P(L'-Z')n (IX),
worin U die für L genannte Bedeutung hat, wobei jedoch die in L gegebenenfalls enthaltenen Carboxygruppen gegebenenfalls geschützt sind und P, Z' und n die oben genannte Bedeutung haben, mit m' Komplexen oder Komplexbildnern K*, wobei m' = 1 - 3 m ist und K* für Verbindungen der allgemeinen Formeln
Fg— OC - /- /— , ^- COOR N N N
R OOC -y l^ ^- COOR1' C00R (II"), RrOOC /— \ /—\ r∞0R
N N N
RrOOC COOR1
R2^t 0 i
Fg (III"),
Figure imgf000173_0001
Figure imgf000173_0002
Figure imgf000173_0003
(VI")
Figure imgf000174_0001
worin Rl'. R2, V, U und Fg die oben genannte Bedeutung haben, und T1 ' für -NCS, -CO-Fg, -C(=NH)OCH3 oder -CHO steht oder
c) ein Polymer der allgemeinen Formel X
P-(H)k (X)ι
worin P und k die oben angegebenen Bedeutungen haben, in einer Eintopfreaktion mit n' Mono- oder Oligosacchariden der allgemeinen Formel VIII
L*-Z' (VIII),
worin n", L* und Z die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit m' Komplexen oder Komplexbildnern K*, wobei K* für Verbindungen der allgemeinen Formeln
Fg— OC -χ /- — Λ /- COOR1' N N N
RrOOC - L^ ^- COOR1'
COOR (|r)ι
RrOOC -\ \ / \ - COOR
N N N
RrOOC -^ 1 ^ COOR1'
R2^ C=O i
Fg (Hl").
Figure imgf000175_0001
(IV),
Figure imgf000175_0002
Figure imgf000175_0003
(VI")
Figure imgf000175_0004
worin m', Rl', R2, V, τ ', U und Fg die oben genannte Bedeutung haben, umgesetzt wird, wobei die gegebenenfalls notwendige Metallioneneinführung vor oder nach der gegebenenfalls notwendigen Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt, mit der Maßgabe, daß falls R1' für Schutzgruppen steht, diese vor der Metallioneneinführung abzuspalten sind.
18. Pharmazeutisches Mittel enthaltend mindestens ein Konjugat nach Anspruch 1 , gegebenenfalls mit den in der Galenik üblichen Zusätzen.
19. Diagnostisches Mittel enthaltend mindstens ein Konjugat nach Anspruch 1 , gegebenenfalls mit den in der Galenik üblichen Zusätzen für die NMR-Bild- gebung.
20. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es für die NMR-Lymphographie verwendet wird.
21. Diagnostisches Mittel enthaltend mindestens ein Konjugat nach Anspruch 1 , gegebenenfalls mit den in der Galenik üblichen Zusätzen für die Röntgen- Diagnostik.
22. Diagnostisches Mittel enthaltend mindestens ein Konjugat nach Anspruch 1 , gegebenenfalls mit den in der Galenik üblichen Zusätzen für die Radio-Diagnostik und Radio-Therapie.
23. Verwendung von mindestens einem physiologisch verträglichen Konjugat gemäß Anspruch 1 für die Herstellung von diagnostischen Mitteln für die NMR-Diagnostik.
24. Verwendung von mindestens einem physiologisch verträglichen Konjugat gemäß Anspruch 1 für die Herstellung von diagnostischen Mitteln für die NMR-Lymphographie.
25.Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Mittel nach Anspruch _..
-175-
18, dadurch gekennzeichnet, daß man das in Wasser oder physiologischer Salzlösung gelöste oder suspendierte Konjugat, gegebenenfalls mit den in der Galenik üblichen Zusätzen, in eine für die enterale oder parenterale Applikation geeignete Form bringt.
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