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WO1999001575A1 - Methode de semi-quantification d'alleles - Google Patents

Methode de semi-quantification d'alleles Download PDF

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Publication number
WO1999001575A1
WO1999001575A1 PCT/FR1998/001413 FR9801413W WO9901575A1 WO 1999001575 A1 WO1999001575 A1 WO 1999001575A1 FR 9801413 W FR9801413 W FR 9801413W WO 9901575 A1 WO9901575 A1 WO 9901575A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
allele
dna
pcr
alleles
fragments
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/001413
Other languages
English (en)
Inventor
Marie-Christine Chartier-Harlin
Jean-Charles Lambert
Philippe Amouyel
Original Assignee
Institut Pasteur De Lille
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur De Lille, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Institut Pasteur De Lille
Priority to AU84456/98A priority Critical patent/AU8445698A/en
Publication of WO1999001575A1 publication Critical patent/WO1999001575A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the subject of the present invention is a method of semi-quantifying alleles.
  • Hybridization by Northern Blot, by "dot and slot” hybridization, or the protection test by S1 are techniques which make it possible to estimate the total quantity of a particular species of mRNA in a preparation.
  • the authors of the present invention have developed a method for the relative quantification of a first allele, called alele 1, with respect to a second allele, called allele 2, comprising the steps consisting in: a) subjecting the DNA to a amplification by PCR in the presence of primers allowing the specific amplification of at least one polymorphic sequence of the alleles; b) subjecting the amplified DNA to the action of at least one restriction enzyme, allowing the differentiation of the alleles; c) separating the DNA fragments; d) evaluating the quantity of fragments obtained using a marker emitting a detectable signal; e) determine the initial percentage in the various alleles, by the following formula:
  • N 0 is the initial number of DNA molecules
  • A is the proportionality coefficient making it possible to correct the difference in size between the different restriction fragments and is equal to the ratio of the lengths of restriction fragments characteristic of each allele, and ⁇ 'is determined
  • V is the volume of the sample obtained by PCR subjected to step c) and S is the measured signal emitted by the marker;
  • ⁇ 7J ⁇ V + S m lake in which S is the measured signal emitted by the marker, V is the volume of the sample obtained by PCR subjected to step c) and S max is the maximum signal which can be measured; provided that the amplification coefficient Ei of the DNA containing allele 1 is identical to the amplification coefficient E 2 of DNA containing allele 2.
  • Said DNA amplified according to step a) can be a genomic DNA or a cDNA comprising the allelic sequences of interest, this cDNA can be obtained from mRNA by the usual RT-PCR technique.
  • the alleles are differentiated according to steps b) and c) described above, which demonstrate the restriction polymorphisms (RFLP).
  • the separation of the DNA fragments according to step c) can be carried out in particular by gel electrophoresis, preferably by electrophoresis on polyacrylamide gel.
  • PCR is an exponential process in which, at the end of each cycle, the quantity of amplified DNA is directly linked to the quantity of DNA molecules initially present, it is however not excluded that, in practice, the ratio between two similar amplified targets is not preserved at the end of the amplification process.
  • the quantity of PCR products increases exponentially according to the following equation:
  • N N 0 (1 + E) n
  • N is the number of PCR products
  • n is the number of amplification cycles
  • E is the amplification coefficient, which is representative of the efficiency of the PCR for each amplified population.
  • the percentage of allele 1 PCR products compared to all PCR products can be expressed by the following formula:
  • the final percentage in allele 1 is then equal to the initial percentage in allele 2.
  • the coefficients Ei and E 2 can be calculated, in practice, by kinetic experiments, using in particular dilutions of genomic DNA from homozygous individuals making it possible to obtain initial percentages of known alleles.
  • the PCR reaction is then stopped after a variable number of cycles, preferably from 25 and up to 35 cycles.
  • the PCR products are then subjected to digestion with restriction enzymes allowing the differentiation of the alleles and the fragments obtained are separated, preferably by gel electrophoresis.
  • a marker emitting a quantifiable signal makes it possible to detect the fragments.
  • the initial percentage of allele 1 can then be expressed by the following formula:
  • N ⁇ allèl ⁇ 1 + ' S * 0allblock 2 allows the verification of the above equality, which validates the kinetic conditions.
  • the value of the coefficient ⁇ can be expressed as a function of the volume V, as being the derivative of the function f such that
  • the relationship between the dilution of the PCR sample and the measured signal is studied.
  • the measured signal values make it possible to obtain a curve representative of the function f as defined above.
  • This method makes it possible to estimate the constant K 'and the value Smax and thus to calculate the coefficients ⁇ ' a n è
  • the values of the measured signal make it possible to obtain a curve representative of the function g, which follows from the function f as follows: SV
  • This method gives directly the value of the coefficients ⁇ ' a ii è i e 1 and ⁇ ' a ⁇ i è i e2 and makes it possible to evaluate by linear regression the validity of the equation describing the phenomenon of saturation.
  • the method according to the invention is particularly suitable for normalizing the phenomenon of saturation.
  • the marker used can in particular be a DNA coloring agent such as a DNA intercalating agent, or a DNA complexing agent, a fluorescent agent, a radioactive agent or a luminescent agent, in particular a agent chemiluminescent, which can be detected on autoradiographic films.
  • the preferred marker is silver nitrate or ethidium bromide.
  • FIG. 1A represents a digital gel of the digested PCR products corresponding to the alleles ⁇ 3 and ⁇ 4 of the APOE gene after staining with silver. This example corresponds to the initial ratio in ⁇ 4 allele of 27.3%.
  • FIG. 1B represents the quantification by densitometry of the quantity of restriction fragments.
  • a linearity zone 25-30 amplification cycles
  • the values corresponding to the 72 bp fragment base pairs
  • Figure 1C shows a linear domain between the optical density corresponding to the 72 bp and 91 bp fragments, which was established by including PCR amplification.
  • the ratio calculated in ⁇ 4 allele was 27.6%.
  • FIG. 2 represents an example of a semi-quantification experiment and of the different mathematical treatments developed to interpret the experimental measurements. This example corresponds to an initial ratio in ⁇ 4 allele of 20%.
  • FIG. 2A represents a digitized gel of digested PCR products corresponding to the alleles ⁇ 3 and ⁇ 4 after staining with silver.
  • FIG. 2B represents the relationship between the intensity of the colorings of two restriction fragments (72 bp O, 91 bp O) and the volume of the PCR products applied to the gel.
  • the curve was performed using the method of least squares for the optical density values corresponding to the 72 bp (O) and 91 bp (O) fragments.
  • K ' 1.781 ⁇ l.
  • Figure 2C represents the relationship between the inverse of the coloring intensity of the two restriction fragments (72 bp O, 91 bp O) and the inverse of the volume of PCR products.
  • the linear regressions were performed for an optical density value corresponding to the fragments of 72 bp and 91 bp.
  • the final percentage in ⁇ 4 allele calculated from this data was 20.53%.
  • the apolipoprotein E gene is involved in the development of Alzheimer's disease.
  • the variability of the locus changes the risk of developing the disease. But, although there is evidence that the specific effects of isoforms can influence the development of the disease, the fact that these effects are not seen on all carriers of a specific isoform prompted the authors of the present invention to seek additional variabilities for this locus.
  • differences in the level of expression of the different alleles could explain the differences observed between individuals sharing the same genotype on this locus. It was therefore necessary to quantify the level of expression of the alleles by RT-PCR followed by an RFLP analysis, this technique being the only way to prove the specific differences between the alleles.
  • EXAMPLE 1 Verification of the conditions of the semi-quantitative method: kinetics
  • PCR conditions for the validation of the semi-quantitative method Dilutions of genomic DNA from individuals homozygous ⁇ 3 and ⁇ 4 were used to obtain a known initial percentage of ⁇ 4 allele (ranging from 10 to 70%).
  • the PCR sample contained 20 ng of genomic DNA.
  • the genomic DNA was amplified by PCR in a DNA thermocycler (Equibio Thermojet Eurogentec) with the primer F4 5'- ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTA-3 'and the primer F6
  • the ⁇ 3, ⁇ 2 and ⁇ 4 alleles can be characterized by restriction fragments of 91 bp, 83 bp and 72 bp respectively.
  • the initial percentage of ⁇ 2 allele in the ⁇ 2 / ⁇ 3 population can be calculated as
  • PCR conditions The genomic DNA (20 ng to 100 ng) was amplified by PCR according to the conditions described in example 1.
  • the PCR reaction was performed up to 30 cycles.
  • the digested PCR samples were deposited on the gel at a rate of 4 ⁇ l to 0.1 ⁇ l.
  • method 1 corresponds to the adjustment of curves by the use of the method of least squares (FIG. 2B), this method allows the estimation of the constant K 'and the maximum optical density DO max and thus makes it possible to calculate the coefficients ⁇ '.
  • method 2 consists in processing the measured data according to the
  • Method 1 mainly emphasizes the importance of the points corresponding to a high quantity of PCR products, while method 2 emphasizes more particularly the low dilutions.
  • Method 2 emphasizes more particularly the low dilutions.
  • the final ratio calculated corresponds to the initial ratio in allele ⁇ 4 whatever the percentage studied (table 2).
  • method 2 gave better approximations than method 1.
  • the narrowness of the bands allows more efficient quantification for low dilutions than for large quantities of PCR products. Consequently, it seems that method 2 is more suited to the treatment of these results.
  • different concentrations of genomic DNA (20 ng, 50 ng and 100 ng) were used to verify that the conditions of application of the semi-quantitative method were verified for different concentrations of genomic DNA. The quality of the quantification method was not changed by the initial concentration of genomic DNA (Table 2).
  • (a) method 1 corresponds to the adjustment of the curve using the method of least squares and makes it possible to calculate the values K 'and DO max

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Abstract

Cette invention concerne une méthode de quantification relative d'un premier allèle, appelé allèle 1, par rapport à un second allèle, appelé allèle 2, comprenant notamment les étapes: a) d'amplification de l'ADN par PCR; b) de digestion de l'ADN amplifié par au moins une enzyme de restriction, permettant la différenciation des allèles; c) de séparation des fragments d'ADN; d) d'évaluation de la quantité de fragments obtenus au moyen d'un marqueur émettant un signal détectable; e) de détermination du pourcentage initial en les différents allèles, par la formule (I).

Description

Méthode de semi-quantification d' allèles
La présente invention a pour objet une méthode de semi- quantification d'allèles.
Plusieurs méthodes de quantification d'ARNm existent.
L'hybridation par Northern Blot, par hybridation "dot et slot", ou l'essai de protection par la S1 sont des techniques qui permettent d'estimer la quantité totale d'une espèce particulière d'ARNm dans une préparation.
Cependant, des techniques nécessitent de grandes quantités d'ARNm, pour être valables, ce qui représente un inconvénient majeur. En particulier, cet inconvénient devient critique lorsque la préparation d'ARNm provient d'un tissu prélevé par autopsie, l'intégrité de l'échantillon étant compromise. De plus, ces méthodes ne fournissent aucune information quant au niveau d'expression des différents allèles d'un locus.
D'autres méthodes tirent profit de la sensibilité de la RT-PCR pour augmenter la concentration en ARNm spécifique et sont largement utilisées pour mesurer la quantité d'ARNm dans une préparation.
Ainsi, des techniques ont été élaborées à partir de la RT-PCR pour étudier la différence de niveau d'expression des allèles d'un gène spécifique, en utilisant la combinaison de l'amplification par PCR spécifique de l'allèle et la quantification par PCR (Horiskoshi et al, 1994, Leuk. Res., 18, 693-702) ou encore en utilisant l'électrophorèse sur un séquenceur automatique d'ADN avec des amorces marquées fluorescentes (Jensen et al., 1996, Hum. Mut., 8, 126-133).
Cependant, ces méthodes peuvent être difficiles à mettre en œuvre et nécessitent des équipements importants.
Les auteurs de la présente invention ont mis au point une méthode de quantification relative d'un premier allele, appelé alièle 1 , par rapport à un second allele, appelé allele 2, comprenant les étapes consistant à: a) soumettre l'ADN à une amplification par PCR en présence d'amorces permettant l'amplification spécifique d'au moins une séquence polymorphe des allèles ; b) soumettre l'ADN amplifié à l'action d'au moins une enzyme de restriction, permettant la différenciation des allèles ; c) séparer les fragments d'ADN ; d) évaluer la quantité de fragments obtenus au moyen d'un marqueur émettant un signal détectable ; e) déterminer le pourcentage initial en les différents allèles, par la formule suivante :
N o allele 1 Aα' allèle 1
N0 allèle 1 + N0 allèle 2 Aα' allèle 1 + Ct'allèle 2
dans laquelle N0 est le nombre initial de molécules d'ADN, A est le coefficient de proportionnalité permettant de corriger la différence de taille entre les différents fragments de restriction et est égal au rapport des longueurs de fragments de restriction caractéristiques de chaque allèle, et α' est déterminé
soit par la formule suivante
. S„ α = 'max
K' dans laquelle Smax est le signal maximum qui peut être mesuré, et K' est une constante,
Smax et K' étant déterminés par la fonction f suivante :
S = f(V) = 7-^!!≥ τ. V (K'+V)
dans laquelle V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et S est le signal mesuré émis par le marqueur;
• soit par la fonction g suivante :
1 1 1
^7J =^V + Sm„ dans laquelle S est le signal mesuré émis par le marqueur, V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et Smax est le signal maximum qui peut être mesuré ; sous réserve que le coefficient d'amplification Ei de l'ADN contenant l'allèle 1 soit identique au coefficient d'amplification E2 de l'ADN contenant l'allèle 2.
Cette nouvelle méthode de semi-quantification d'allèles est valable indépendamment de l'efficacité de la PCR, des variations courantes de signal d'une expérience à l'autre, et prend en considération l'éventuel phénomène de saturation du signal.
Elle est en outre particulièrement simple. Il suffit, en effet, soit de reporter la valeur S du signal émis en fonction du volume V de l'échantillon, la courbe représentative de la fonction f telle que S = f(V) pouvant être tracée en utilisant la méthode des moindres carrés, et de déterminer Smaχ et K' à partir de cette courbe ; soit de reporter la valeur 1/S en fonction de l'inverse du volume de l'échantillon, à savoir 1/V, la courbe représentative de la fonction g telle que — = gl — I pouvant être tracée par régression linéaire, la pente de la droite obtenue étant égale à l'inverse de α'.
Ledit ADN amplifié selon l'étape a) peut être un ADN génomique ou un ADNc comprenant les séquences alleliques d'intérêt, cet ADNc pouvant être obtenu à partir d'ARNm par la technique usuelle de RT-PCR. Les allèles sont différenciés selon les étapes b) et c) décrites ci-dessus, qui mettent en évidence les polymorphismes de restriction (RFLP).
La séparation des fragments d'ADN selon l'étape c) peut être réalisée notamment par électrophorèse sur gel, préférentiel lement par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
La méthode conformément à l'invention telle que écrite précédemment n'est applicable que si la condition E^E∑ est vérifiée.
En effet, si, théoriquement, la PCR est un processus exponentiel dans lequel, à la fin de chaque cycle, la quantité d'ADN amplifié est directement liée à la quantité de molécules d'ADN initialement présentes, il n'est cependant pas exclu que, dans la pratique, le rapport entre deux cibles similaires amplifiées ne soit pas conservé à la fin du processus d'amplification. La quantité de produits PCR augmente de manière exponentielle selon l'équation suivante :
N = N0(1 + E)n
dans laquelle N est le nombre de produits de PCR,
No est le nombre initial de molécules d'ADN, n est le nombre de cycles d'amplification ; et
E est le coefficient d'amplification, qui est représentatif de l'efficacité de la PCR pour chaque population amplifiée.
No, le nombre initial de molécules d'ADN, est donc estimé à partir de N, nombre de produits PCR, cette relation dépendant du coefficient E.
Pour comparer les valeurs N0 de deux matrices différentes, à savoir l'ADN, qu'il soit ADN genomique ou ADN complémentaire, correspondant à un allèle 1 et à un allèle 2, à partir des valeurs N, il est donc nécessaire d'évaluer en premier lieu la variation du coefficient E pour une matrice (allèle 1 ) par rapport à l'autre (allèle 2).
Le pourcentage des produits PCR de l'allèle 1 comparés à tous les produits PCR peut s'exprimer par la formule suivante :
N0allèlel (1 + Eallèlel)n ^allèle-! OallόleU ' + ^allèlell + ^0allèle2 V ' + ^allèle∑ Naiièle1 + allèle2
soit, si Ei≈E∑
oallèlel ^allèlel oallèlβl + θallèle2 allèlel + ^allόle2
Le pourcentage final en allèle 1 est alors égal au pourcentage initial en allèle 2.
Les coefficients Ei et E2 peuvent être calculés, dans la pratique, par des expériences de cinétique, utilisant notamment des dilutions d'ADN genomique d'individus homozygotes permettant d'obtenir des pourcentages initiaux en allèles connus. La réaction de PCR est alors stoppée au bout d'un nombre variable de cycles, de préférence à partir de 25 et jusqu'à 35 cycles. Les produits de PCR sont ensuite soumis à une digestion par des enzymes de restriction permettant la différenciation des allèles et les fragments obtenus sont séparés, de préférence par électrophorèse sur gel. Un marqueur émettant un signal quantifiable permet de détecter les fragments.
En première approximation, le signal S émis par le marqueur est directement proportionnel au nombre N de molécules amplifiées, selon la relation S=αN, où α est le coefficient de proportionnalité. Sachant que N et n sont liés par la relation : log N = niog (1 + E) + N0 alors il suffit de reporter, pour chaque allèle, le logarithme de la valeur du signal S émis par le marqueur en fonction du nombre de cycles de PCR, la courbe correspondante pouvant être obtenue par régression linéaire.
Ceci permet la détermination et la comparaison des coefficients d'amplification E des deux allèles.
La validité de cette détermination est confirmée en représentant les valeurs Saιièiei en fonction de Saιièiβ2-
La pente de la droite obtenue par régression linéaire est appelée p et est telle que Saiièiβ 2 = pSaiiôiβ 1- En reprenant la formule
θallèlβ-1 allèlel θallèle-1 +
Figure imgf000007_0002
N, allèlel +
Figure imgf000007_0001
avec S = αN
on obtient
^allèle-l θallèle-1 α1 θallèle1 + N0a||èle2 ^ allèlel £>alléle2 α1 α2
Le signal dépend en outre de la longueur des fragments d'ADN marqué, ce qui s'exprime selon la relation : αanèιθ 2 = Aαanè|θι, A étant le coefficient de proportionnalité permettant de corriger la différence de taille entre les fragments de restriction et est égal au rapport entre les longueurs des fragments.
Le pourcentage initial en allèle 1 peut alors être exprimé par la formule suivante :
Figure imgf000008_0001
soit
N Oallèlei
N0allèle1 +N0allè|β2 A + p
N Le rapport 0a"èlθ1 étant connu, la détermination de p
Nθallèlβ1 + 'S* 0allèle2 permet la vérification de l'égalité ci-dessus, ce qui valide les conditions de cinétique.
L'égalité entre les coefficients d'amplification Ei et E2 étant vérifiée, la méthode de l'invention telle que décrite précédemment peut s'appliquer.
Cette méthode a été mise au point afin de rendre compte de la variation observée du coefficient α, due notamment à un phénomène de saturation du signal. Elle s'applique donc à tout traitement d'un signal émis par un marqueur, que celui-ci soit soumis ou non à un phénomène de saturation. Conformément à l'invention, le phénomène de saturation est décrit par analogie avec l'interaction ligand-récepteur ou enzyme-substrat et peut être exprimé comme équivalent de l'équation de Michaelis-Menten, selon les formules suivantes :
S ^ ^N ou S = S^V
K + N ° K'+V dans lesquelles Smax est le signal maximum émis par le marqueur qui peut être mesuré, V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à la séparation des fragments,
K et K' sont des constantes, avec K'= — , où C est la
concentration finale en chaque produit de PCR correspondant aux allèles.
La valeur du coefficient α peut être exprimée en fonction du volume V, comme étant la dérivée de la fonction f telle que
s = f(v) = |^
soit
SmavK' α'= f'(V) = 'max'
(K'+V)2
avec α'= Cα.
Lorsque les valeurs de V tendent vers zéro
α'= |jmf(V) = %≈- v→O K
Conformément à l'invention, on étudie la relation entre la dilution de l'échantillon de PCR et le signal mesuré. Les valeurs du signal mesurées permettent d'obtenir une courbe représentative de la fonction f telle que définie précédemment. Cette méthode permet d'estimer la constante K' et la valeur Smax et ainsi de calculer les coefficients α'anè|θ 1 et α'aιièie 2. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, les valeurs du signal mesurées permettent d'obtenir une courbe représentative de la fonction g, qui découle de la fonction f comme suit : S V
S ≈ ^7- = f( )
5 d'où, comme α' = -rϋr~ K
Figure imgf000010_0001
Cette méthode donne directement la valeur des coefficients α'aiièie 1 et α'aιièie2 et permet d'évaluer par régression linéaire la validité de l'équation décrivant le phénomène de saturation.
La méthode de semi-quantification d'allèles selon l'invention présente plusieurs avantages :
Elle permet notamment de tenir compte du phénomène de saturation. L'introduction des constantes K et K' permet en outre de normaliser le signal, quelles que soient les variations inéluctables d'un gel à l'autre dues à la technique utilisée.
Enfin, comme la méthode vise l'évaluation d'un rapport d'ADN pour chaque allèle, l'efficacité de la PCR n'a aucune incidence sur les résultats finaux.
Cette méthode peut être appliquée aux produits de RT-PCR. Une bande spécifique d'un allèle pouvant être utilisée comme contrôle interne comparé à un autre allèle, cette application supprime la difficulté technique majeure de la RT-PCR d'avoir des données comparatives. En outre, cette méthode nécessite de faibles quantités de matériel biologique, ce qui est un avantage important lorsqu'on analyse des ARNm. La méthode conformément à l'invention est particulièrement adaptée pour normaliser le phénomène de saturation. Le marqueur utilisé peut être notamment un agent de coloration de l'ADN tel qu'un agent intercalant de l'ADN, ou un agent de complexation avec l'ADN, un agent fluorescent, un agent radioactif ou un agent luminescent, en particulier un agent chimioluminescent, pouvant être détectés sur films autoradiographiques. Le marqueur utilisé de préférence est le nitrate d'argent ou le bromure d'éthidium.
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans la limiter.
LEGENDE DES FIGURES
La figure 1 représente un exemple d'expérience cinétique. La figure 1A représente un gel digitalisé des produits de PCR digérés correspondant aux allèles ε3 et ε4 du gène APOE après coloration par l'argent. Cet exemple correspond au rapport initial en allèle ε4 de 27,3 %.
La figure 1 B représente la quantification par densitométrie de la quantité de fragments de restriction. Une zone de linéarité (25-30 cycles d'amplification) a été établie entre le logarithme de l'intensité de coloration de deux fragments de restriction (72 pb, 91 pb) et le nombre de cycles de PCR. Les valeurs correspondant au fragment de 72 pb (paires de base) ont été obtenues par multiplication de l'intensité correspondant au fragment de 72 pb mesuré sur le gel multiplié par le coefficient A égal à 91/72. La figure 1 C représente un domaine linéaire entre la densité optique correspondant aux fragments de 72 pb et 91 pb, qui a été établi en incluant l'amplification par PCR. Le rapport calculé en allèle ε4 était de 27,6 %. La figure 2 représente un exemple d'expérience de semi- quantification et des traitements mathématiques différents développés pour interpréter les mesures expérimentales. Cet exemple correspond à un rapport initial en allèle ε4 de 20 %.
La figure 2A représenté un gel digitalisé de produits de PCR digéré correspondant aux allèles ε3 etε4 après coloration par l'argent.
La figure 2B représente la relation entre l'intensité des colorations de deux fragments de restriction (72 pb O, 91 pb O) et le volume des produits de PCR appliqués sur le gel. La courbe a été réalisée en utilisant la méthode des moindres carrés pour les valeurs de densité optique correspondant aux fragments de 72 pb (O) et 91 pb (O). Pour le fragment de 72 pb (allèle ε4), Smax = 2,881 et K" = 6,448 μl. Pour le fragment de 91 pb (allèle ε3), les valeurs calculées sont Smax = 4,327 et K'= 1 ,781 μl. Le pourcentage final en allèle ε4 calculé à partir de ces données est de 18,87 %. La figure 2C représente la relation entre l'inverse de l'intensité de coloration des deux fragments de restriction (72 pb O, 91 pb O) et l'inverse du volume des produits de PCR. Les régressions linéaires ont été réalisées pour une valeur de densité optique correspondant aux fragments de 72 pb et 91 pb. L'équation obtenue pour l'allèle ε4 (valeur de densité optique correspondant au fragment de 72 pb) était y= 1 ,702x + 0,615 (^=0,995) et y= 0,348x + 0,281 (^=0,999) pour l'allèle ε3 (valeur correspondant au fragment de 71 pb). Le pourcentage final en allèle ε4 calculé à partir de ces données était de 20,53 %.
EXEMPLES
Semi-quantification des produits de PCR correspondant aux allèles APOE par coloration à l'argent.
Le gène de l'apolipoprotéine E est impliqué dans le développement de la maladie d'Alzheimer. La variabilité du locus modifie le risque de développer la maladie. Mais, bien qu'il soit prouvé que les effets spécifiques des isoformes pouvaient influencer le développement de la maladie, le fait que ces effets ne soient pas vus sur tous les porteurs d'un isoforme déterminé a incité les auteurs de la présente invention à rechercher les variabilités supplémentaires concernant ce locus. Dans le cadre de cette étude, il a été suggéré que des différences dans le niveau d'expression des différents allèles pouvaient expliquer les différences observées entre les individus partageant le même génotype sur ce locus. Il a donc été nécessaire de quantifier le niveau d'expression des allèles par RT-PCR suivi par une analyse RFLP, cette technique étant le seul moyen de prouver les différences spécifiques entre les allèles. EXEMPLE 1 : Vérification des conditions de la méthode semi- quantitative : cinétique
a) Conditions de PCR pour la validation de la méthode semi- quantitative Des dilutions d'ADN genomique à partir d'individus homozygotes ε3 et ε4 ont été utilisées pour obtenir un pourcentage initial connu en allèle ε4 (allant de 10 à 70 %). L'échantillon de PCR contenait 20 ng d'ADN genomique. L'ADN genomique a été amplifié par PCR dans un thermocycleur d'ADN (Equibio Thermojet Eurogentec) avec l'amorce F4 5'- ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTA-3' et l'amorce F6
5TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3'. (Hixon et al., 1991 , J. Lipid Res., 31 , 545-548). Brièvement, la PCR a été effectuée selon les conditions de RT- PCR dans un volume total de 25 μl, contenant 2,5 unités d'ADN polymérase Taq, 2 μM de chaque amorce, 0,2 mM de chaque dNTP, 4 mM de DTT, 0, 1 mM de MgCI2, 0,04 % de Triton X-100, 15 % (V/V) de glycérol, 1X de tampon RT-PCR (Gibco/BRL), 0,5 μl de tampon de conservation de la transcriptase inverse M-MLV (Gibco/BRL). La réaction a été stoppée dans de la glace après 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32 et 35 cycles (1 minute à 94°C, 1 minute à 58°C et 1 minute à 72°C pour chaque cycle).
b) Electrophorèse
Après digestion par ajout de 12 unités d'endonucléase Cfo I (Promega), les fragments d'ADN ont été résolus dans un gel de polyacrylamide à 8 %, pendant quatre heures à 12 V/cm. 1 à 2 μl d'échantillons digérés ont été chargés sur le gel.
c) Coloration par l'arαent Le gel a été fixé pendant 90 minutes dans 10 % (VA/) d'éthanol, 0,5 % (VA ) d'acide acétique. Après deux lavages avec de l'eau désionisee, le gel a été placé dans une solution de nitrate d'argent (1 mg/ml) pendant 25 minutes. Puis, le gel a été lavé deux fois avec de l'eau désionisee. Les fragments polymorphes d'ADN ont été colorés pendant 30 minutes dans du formaldéhyde à 0,037 % (VA ), et de l'hydroxyde de sodium (15 mg/ml). Finalement, la réaction a été stoppée avec une solution de carbonate de sodium (15 mg/ml). Le développeur et les solutions de nitrate d'argent ont été préparés extemporanément. Le gel a été digitalisé sur un scanner couleur haute résolution Sharp JX-325 et l'intensité des fragments a été mesurée en utilisant le logiciel Image Master (Pharmacia) en soustrayant le bruit de fonds.
d) Méthode de calculs mathématique et statistique
Les ajustements de courbe utilisant la méthode des moindres carrés ont été réalisés par calcul matriciel avec le logicel Matlab. La régression linéaire a été effectuée avec le logiciel SAS 6.04 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).
e) Validation des conditions par des expériences cinétiques Les coefficients E ont été calculés par cinétique (figure 1A), la quantité d'allèle ε4 allant de 10 à 50 %, en utilisant la formule :
log N = n log (1 + E) + N0
Jusqu'à trente cycles, l'amplification exponentielle a été vérifiée (figure 1 B, tableau 1 ). Les coefficients E sont hétérogènes parmi les échantillons de PCR mais homogènes entre les allèles ε3 et ε4 dans un échantillon de PCR (tableau 1 ). Cependant, si on estime le pourcentage initial d'ε4 à partir des coefficients E (tableau 1 ) on fait une erreur de 14 % à 74 % après trente cycles d'amplification. Pour limiter les variations de point à point due à l'approximation expérimentale, une régression linéaire a été réalisée à partir de la formule DOaιièiβ 2 = pDOanèιθ ι, DO étant la densité optique mesurée. N A
L'équation 0a"éleι = - — permet de calculer le
Nûεillèlel +N0a||è|θ2 A + P pourcentage initial en allèle ε4 dans les populations ε2/ε4 et ε3/ε4.
Dans le cas du gène APOE, les allèles ε3, ε2 et ε4 peuvent être caractérisés par des fragments de restriction respectivement de 91 pb, 83 pb et 72 pb.
Le coefficient de proportionnalité A peut donc être calculé comme étant A= 91/72 pour les allèles ε3/ε4, A étant 83/72 pour les individus ε2/ε4 et
A étant 91/83 pour les individus ε2/ε3. Pour ce dernier génotype, puisque les deux allèles ε2 et ε3 donnent une longueur de fragment de restriction de 91 pb alors on a la relation A DOaiièie 1 + DOanèiθ2 = DO 91 pb.
Le pourcentage initial en allèle ε2 dans la population ε2/ε3 peut être calculé comme étant
Noβllèlel + 0aHèle2 P
Par cette méthode de calcul du pourcentage de l'allèle ε4, une erreur de 0,01 % à 11 ,5 % dans la zone de linéarité (tableau 1 ) a été trouvée. Par cette approche, il a ainsi été démontré que les coefficients E étaient similaires quel que soit l'allèle étudié dans le même échantillon de PCR: l'efficacité n'est pas une limite pour conserver le pourcentage initial en ε4. Le rapport initial étant conservé, toutes les conditions nécessaires pour l'expérience de semi-quantification sont vérifiées.
EXEMPLE 2 : Méthode semi-quantitative prenant en compte un phénomène de saturation
a) Conditions de PCR L'ADN genomique (20 ng à 100 ng) a été amplifié par PCR selon les conditions décrites dans l'exemple 1.
La réaction de PCR a été effectuée jusqu'à 30 cycles.
b) Electrophorèse
Les échantillons de PCR digérés ont été déposés sur le gel à raison de 4 μl à 0,1 μl.
c) Coloration par l'argent La coloration par l'argent a été réalisée selon le protocole décrit à l'exemple 1.
d) Validation de la méthode de semi-quantification
La relation entre la dilution d'un échantillon PCR et la densité optique mesurée sur le gel pour des rapports initiaux différents en allèle ε4 a été étudiée. La densité optique résultant du traitement des gels a été reportée selon deux méthodes : i) la méthode 1 correspond à l'ajustement de courbes par l'utilisation de la méthode des moindres carrés (figure 2B), cette méthode permet l'estimation de la constante K' et de la densité optique maximale DOmax et permet ainsi de calculer les coefficients α'. ii) la méthode 2 consiste à traiter les données mesurées selon la
1 ( λ 1 1 1 courbe g représentative de la fonction — — • = d — = — - x— + - — (figure 2C).
DO VJ α' v S
Cette méthode donne directement les valeurs des coefficients α' et permet d'évaluer par régression linéaire la validité de l'équation décrivant le phénomène de saturation.
La méthode 1 accentue principalement l'importance des points correspondants à une quantité élevée de produits PCR, tandis que la méthode 2 insiste plus particulièrement sur les faibles dilutions. L'intérêt majeur de
'utilisation de ces deux méthodes est de vérifier que la formule S = nw est
K'+V capable de décrire le phénomène de saturation quels que soient les points utilisés.
Pour ces deux méthodes, les courbes obtenues par régression peuvent suivre la distribution des points (figures 2B et C). Ceci a été confirmé par la régression linéaire obtenue à partir de la méthode 2 et pour laquelle les coefficients de régression linéaire ont toujours été trouvés très proches de 1 (figure 2C).
Indépendamment du traitement mathématique, le rapport final calculé correspond au rapport initial en allèle ε4 quel que soit le pourcentage étudié (tableau 2). Pourtant, la méthode 2 a donné de meilleures approximations que la méthode 1. En effet, l'étroitesse des bandes permet une quantification plus efficace pour des dilutions faibles que pour de fortes quantités de produits de PCR. Par conséquent, il semble que la méthode 2 soit plus adaptée au traitement de ces résultats. En outre, différentes concentrations d'ADN genomique (20 ng, 50 ng et 100 ng) ont été utilisées pour vérifier que les conditions d'application de la méthode semi-quantitative étaient vérifiées pour des concentrations différentes d'ADN genomique. La qualité de la méthode de quantification n'a pas été modifiée par la concentration initiale en ADN genomique (tableau 2).
Tableau 1
Comparaison des paramètres de PCR en fonction du pourcentage initial en allèle ε4
Figure imgf000018_0001
(a) le pourcentage final estimé a été calculé à partir des valeurs des coefficients E dans la zone de linéarité d'amplification
(b) le pourcentage final calculé a été calculé à partir de la formule 8 dans la zone de linéarité de l'amplification Tableau 2
Comparaison entre le rapport final calculé et estimé en allèle ε4 en fonction de la quantité d'ADN genomique dans l'échantillon de PCR et le rapport initial ε4 connu
Figure imgf000019_0001
Les expériences ont été réalisées en triplicata pour 20 ng et en duplicata pour
50 et 100 ng.
(a) la méthode 1 correspond à l'ajustement de la courbe en utilisant la méthode des moindres carrés et permet de calculer les valeurs K' et DOmax
(b) la méthode 2 consiste dans le calcul direct des coefficients α' .

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de quantification relative d'un premier allèle, appelé allèle 1 , par rapport à un second allèle, appelé allèle 2, comprenant les étapes consistant à : a) soumettre l'ADN à une amplification par PCR en présence d'amorces permettant l'amplification spécifique d'au moins une séquence polymorphe des allèles ; b) soumettre l'ADN amplifié à l'action d'au moins une enzyme de restriction, permettant la différenciation des allèles ; c) séparer les fragments d'ADN ; d) évaluer la quantité de fragments obtenus au moyen d'un marqueur émettant un signal détectable ; e) déterminer le pourcentage initial en les différents allèles, par la formule suivante:
No ';allèle 1 Aα' allèle 1
NOaiièle 1 + NOgiièie 2 Aα'a||èle 1 + CC'allèle 2
dans laquelle No est le nombre initial de molécules d'ADN,
A est le coefficient de proportionnalité permettant de corriger la différence de taille entre les différents fragments de restriction et est égal au rapport des longueurs de fragments de restriction caractéristiques de chaque allèle, et α' est déterminé
• soit par la formule suivante :
. S„ α- max
K'
dans laquelle Smax est le signal maximum qui peut être mesuré, et K' est une constante,
Smax et K' étant déterminés par la fonction f suivante :
S = f( ) = 7^≈ .V ' (K'+V) dans laquelle V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et S est le signal mesuré émis par le marqueur;
» soit par la fonction g suivante
Figure imgf000021_0001
dans laquelle S est le signal mesuré émis par le marqueur, V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et Smax est le signal maximum qui peut être mesuré ;
sous réserve que le coefficient d'amplification E1 de l'ADN contenant l'allèle 1 soit identique au coefficient d'amplification E2 de l'ADN contenant l'allèle 2.
2. Méthode selon la revendication 1 dans laquelle Smax et K" sont déterminés à l'aide de la courbe représentative de la fonction f telle que S = f(V) tracée en utilisant la méthode des moindres carrés.
3. Méthode selon la revendication 1 , dans laquelle α' est déterminé à l'aide de la droite représentative de la fonction g telle que :
tracée par régression linéaire.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit ADN amplifié selon l'étape a) est un ADN genomique ou un ADNc comprenant les séquences alleliques d'intérêt.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le signal est soumis à un phénomène de saturation.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le marqueur utilisé est un agent de coloration, un agent fluorescent, un agent luminescent ou un agent radioactif.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le marqueur utilisé est du nitrate d'argent.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les fragments d'ADN sont séparés selon l'étape c) par électrophorèse sur gel.
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