WO1999003980A1

WO1999003980A1 - Cellules de stroma derivees d'agm

Info

Publication number: WO1999003980A1
Application number: PCT/JP1998/003209
Authority: WO
Inventors: Tatsutoshi Nakahata
Original assignee: Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1998-07-16
Publication date: 1999-01-28
Also published as: AU8243798A

Description

明細書

A GM領域由来ストロ一マ細胞技術分野本発明は、 A GM領域から分離、株化された細胞株、この細胞株を用いて造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持する方法、この方法によって増殖した造血幹細胞または造血前駆細胞を用いた移植片ならびに遺伝子治療用組成物、及ぴ移植方法ならびに遺伝子治療法に関する。背景技術生体内を流れる成熟血液細胞は、短期間の寿命（ヒトでは赤血球で約 1 2 0日、血小板で約 7日）しかなく、成熟血液細胞は造血前駆細胞から毎日分化することによって、末梢血の成熟血液細胞の恒常性を保っている。末梢血に供給される成熟血液細胞の数は、ヒトの場合赤血球で 2 0 0 0億個 Z日、好中球で 7 0 0億個日にもなる。これらの各分化系列の前駆細胞は、さらに未分化な造血幹細胞から分化しながら増殖することで恒常的に末梢血液細胞が枯渴しないようなシステムができている。

このような血液細胞の分化系については、マウスを用いた実験系においてその性質が明らかにされてきた。

末梢血を流れる成熟血液細胞が、一個の造血幹細胞に由来することが明らかにされたのは、 Tillと McCullochの研究による（Till, J. E. , Rad. Res. 14 : 213-22 2， 1961)。放射線を照射して骨髄の造血系を破壊したマウスに他のマウス由来の骨髄細胞を移植したところ、脾臓に血液細胞からなるコロニーの形成（CFU- S； spl een colony- forming- unit)が確認された。このコロニーの数は移植する骨髄細胞の数に比例すること、さらに一個の細胞に由来するコロニーの中に多くの血球系の細胞の存在が確認されることから、多くの血液細胞種に分化できる多分化能を持つ造血幹細胞（多能性幹細胞）が骨髄中に存在することが明らかにされたのである。その後、造血細胞の性質を解析する手段として放射線照射マウスを用いた移植実験系、さらには、 in vitro (インビトロ）のコロニー形成法（Bradley, T. R. , J. Exp. Med.， 44： 287 - 299， 1966)が開発され、造血幹細胞および、造血前駆細胞の分化に関する知見が蓄積されてきた。

放射線照射マウスを用いた移植実験系は、最も直接的に造血幹細胞の性質を解祈する手法である。放射線照射し造血系に障害を与えたマウス（レシピエント）に、他のマウス（ドナ一）から分離した骨髄細胞を移植すると、レシピエントマウス中にドナー由来の造血系を再構築することができる。造血細胞に発現される各種分化抗原（Spangrude, G. J. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 87 : 7433-7437， 1 990； Visser, J. M. W. , 「Flowcytometry in hematologyj， Academic Press, p9_2 9, 1992)を利用して、あるいは、造血細胞の大きさ（ Jones, R. J. , Nature, 347 ： 188-189， 1990)を利用して、あるいは、細胞の性質、状態によって染色性の異なる蛍光物質等（Rhl23， Hoechst 33342) (Wolf, N. S.， Exp. Hematol. , 21 : 614 - 622， 1993)を用いて、骨髄細胞を分画し、上記の移植実験を行うことで、骨髄細胞中の造血幹細胞を同定する試みがなされてきた。これまでの知見から、造血幹細胞は一個の細胞を移植しただけでも、リンパ球系の細胞にも骨髄球系の細胞にも分化することができ、かつ、長期にわたり移植先個体の中で造血系を構築することができることも明らかにされている（Osawa, M. , Science, 273： 242-245, 1 996)。一個の細胞が長期にわたり移植先の個体で造血系を再構築できるということから、造血幹細胞が移植先個体の中で増殖しているものと考えられている。

放射線照射マウスの移植実験系では、前述の CFU - Sとして検出される造血幹細胞よりもさらに未分化な造血幹細胞を検出することに成功している（Osawa Μ·， Sci ence, 273： 242-245, 1996)。移植実験系で確認される長期の再構築能を有する造血幹細胞と、 CFU-Sを形成する造血幹細胞の間で分化段階のヒエラルキーが存在し、この 2つの分化段階が可逆的に相互に分化状態が変化できる状況にあるのか、あるいは、造血幹細胞の CFU-Sを形成するレベルへの分化は不可逆的であり、もはや長期骨髄再構築能を持つことはできないのかは、現在のところ不明である。また、このようにマウスの実験系で確実に区別できる造血幹細胞のなかでの差異は、ヒトの臨床においてどの程度意味があるのか判らない。つまり、ヒトの造血幹細胞の中にもこのような質的な差が認められたとしても、臨床の場ではマウスの CFU - Sに相当するヒト造血幹細胞を利用できるだけで十分なことも考えられる。

一方、近年、種々のサイトカインが取得され、 in vitroで形成されるコロニー形態から、血液細胞の性質を解析できるようになった（0gawa， M.， Blood, 81 : 2 844-2853, 1993)。造血前駆細胞は多くのサイト力インが存在しても、単一の分化系列の成熟血液細胞にしか分化することはできないが、移植マウスで長期の造血系を構築できる造血幹細胞は、多くの細胞分化系列に分化することが可能である。これらの結果から、造血幹細胞から末梢血を流れる成熟血液細胞までの分化は、以下のように解釈されている。造血幹細胞は、各種分化系列に分化可能な多分化能を有しており、かつ、この多分化能の性質（分化多能性）を保持したまま自己複製することが可能である。造血幹細胞は、自己複製するとともに一部は分化し、各種サイト力インの作用を受け、次第に分化できる細胞系列が狭まり、限られた細胞種へしか分化できなレ、造血前駆細胞へと分化増殖し、最終的に成熟血液細胞になる。

以上のように、造血幹細胞に関する一連の研究は、マウスによってなされてきたが、これは前述の通り移植の実験系によって長期にわたり造血細胞が出現することを確認できることによる。ヒトでも同様の造血細胞の分化様式が存在すると考えられているが、ヒトではヒト同士の移植の実験系を樹立することは不可能であり、マウスと同レベルの造血幹細胞の同定は難しい。

ヒトで実現できない移植実験系を、免疫寛容な実験動物を用いて実現しようという試みもある。免疫系が構築されていないヒッジ胎児（Civin, C. I. , Blood, 88 : 4102-4109, 1996)、あるいは、免疫不全マウス（Human Hematopoiesi s in SCI D mice, Springer-Verlag, 1995)に、ヒト造血細胞を移植し、移植動物の体内でのヒト血液細胞の生着状況を観察することで造血幹細胞を同定する試みもなされているが、これらの実験を行うのは容易ではないし、これらの実験結果の解釈も種を越えた移植であることから多くの因子を考慮に入れなければならず、慎重に行わなければならない。

ヒト造血幹細胞を評価するため、 in vitroの評価系が種々作られている（Moore, M. A. S.， Blood, 78 : 1-19, 1991)。そのなかで広く用いられているのは、 in vit roのコロニー形成能について調べることである。造血幹細胞を種々の血液細胞が出現できるように種々のサイトカインを添加した培地にて培養すると、分化方向の決定された造血前駆細胞は、小数あるいは、単一な分化系列の細胞しか含まないコロニーを形成するが、多分化能を持つ造血幹細胞は、複数の分化系列の血液細胞を含むコロニーを形成することができる。特に、赤血球を含む混合コロニー (CFU-Emix)を形成することが、ヒトでは造血幹細胞の指標とされている。これらの評価系を用いて明らかにされてきたヒト造血幹細胞は、 CD34抗原及び C- KIT (c -kit遺伝子産物）を発現している。また、これらの造血幹細胞は、骨髄、胎児肝臓、胎児骨髄、臍帯血、抗癌剤あるいはサイトカインの投与を受けた末梢血液中に存在が確認されている。

試験管内で造血細胞を長期間維持することが可能になったのは、 Dexterによつて骨髄の血液細胞以外の線維芽細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞などのストローマ細胞（間質細胞とも称する）と、骨髄の血液細胞を試験管内で共培養する系を確立してからである（Dexter, T. M. , J. Cell. Physiol. , 91 : 335-344, 1977) ₀ この培養系では、造血細胞が増殖し、培地中に浮遊してくる様子を 6ヶ月以上に亘つて観察することができる。このことから、骨髄スト口 —マ細胞が造血幹細胞、造血前駆細胞に好ましい培養環境を提供することで、造血幹細胞、造血前駆細胞が長期にわたり、生存維持されているものと考えられる。この Dexter培養系には、非常に多くの細胞種が存在しており、どの細胞種が造血幹細胞の維持に関っているかは明らかでないが、骨髄中に造血幹細胞の維持に関与する細胞群が存在するとも考えられる。したがって、骨髄より造血幹細胞の増殖、維持を支持する細胞を単離してくることも可能かと考えられた。この点を明らかにするため、骨髄細胞から造血系の細胞ではない骨髄間質細胞であるストロ —マ細胞を種々株化し、その造血幹細胞、造血前駆細胞の増殖支持について解析されている。 (Deryugina E. I.， Critical Reviews in Immunology, 13 : 115 - 150, 1993) o しかし、造血幹細胞の増殖維持を可能にする細胞株は取得されていない。また、国際特許出願 (TO96/02662, Torok- Storb等）には、造血前駆細胞を維持増殖させるストロ一マ細胞株について開示されているが、これらの骨髄細胞を不死化した細胞株に造血幹細胞を増殖させる活性は見出せない。また、米国特許 5 5 9 9 7 0 3号（Davis等）には、ブタ脳微細血管系の血管内皮細胞を用いた造血幹細胞増殖系について開示されているが、この培養系には少なくとも一種類のサイト力インを添加する必要があり、かつ、サイト力インを添加しないで血管内皮細胞のみを用いた場合の造血幹細胞の増殖については記載がない。このようなサイト力イン添加による培養系では、その細胞自体の能力が正確に評価されているとは考えがたい。

一方、造血組織について発生の段階から検討すると、先ず、卵黄嚢で赤血球を中心とした造血が生じる。しかし、卵黄嚢における造血は一過性のものであり、この領域に存在する造血細胞は他の器官に移行することなくこの場で消滅して行くものと考えられている。その後の主要な造血器官は、肝臓、骨髄へと移行して行き、肝臓以降の造血細胞が、成体で血液細胞の恒常性を維持するために増殖分化している造血幹細胞になるものと考えられる（Zon， L. I. , Blood, 86： 2876-28 91, 1995)。肝臓での造血を担う造血幹細胞は、肝臓での造血に先立ち A GM (Ao rta - Gonad-Mesonephros)領域で発生するものと考えられる (Tavian, M. Blood, 87 : 66-72 1996； Sanchez, M-J.， Immunity, 5 : 513-525, 1996)。ここで A GM領域とは、哺乳類胚の発生初期の大動脈（Aorta) 、生殖腺原基（Gonad) 、中腎原基 (Mesonephros)の存在する領域をいう。ヒトでは胎生 2 0日から 5 0日前後、マウスでは胎生 9日から 1 2日前後に見られる場合が多い。つまり成人型の造血幹細胞は A G Mで発生した後、肝臓、骨髄へと移行し自己複製するとともに分化し、全身を循環する末梢血液細胞を供給するものと考えられている。

上記の A GMで成体型の造血幹細胞が出現することを支持する知見が、近年得られてきている（Sanchez, M-J. , Immunity, 5 : 513-525, 19%) 。注目すべきは A GMの器官培養を行うと、この領域で造血幹細胞が増殖していると推測されることであり (Medvinsky, A.， Cell, 86： 897 - 906， 1996 ; Sanchez, M-J. , Immunity, 5 : 513-525, 1996) 、この領域が造血幹細胞の発生部位であるとともに、この領域で造血幹細胞がその数を増すと想定される。すなわち、この領域に存在する細胞が造血幹細胞の分化を調節し、かつ、その増殖を支持していると考えられる。しかしながら、これらの結果は、器官培養系あるいは組織を直接分離してきた標品について評価しているだけで、これらの種々の細胞種が存在した組織の中から、造血幹細胞、造血前駆細胞の増殖を制御する細胞は特定されていなかった。

ところで、多能性幹細胞の障害で起こる疾患である再生不良性貧血や先天性免疫不全症では、治療の一つとして骨髄移植が行われている。患者に骨髄を移植することによって、血球系細胞の生産能を高めることができる。また、白血病に対する全身 X線療法や大量化学療法は有効な治療法であるが、これらの治療によつて骨髄細胞が破壊されてしまうので、これらの治療と組み合わせて骨髄移植が行われている。しかしながら、骨髄移植には、ドナーと患者の組織適合抗原が合致する確率が極めて低いことや、強力な免疫抑制が必要となること等の問題がある。また、移植に用いる骨髄の採取は、全身麻酔下で腸骨櫛で骨髄穿刺することによつて行われるため、ドナーにとっても苦痛や危険が伴う。

これに対し、臍帯血は、骨髄細胞に比べて移植後の移植片対宿主病（G V H D ) の頻度が低く、免疫抑制の必要性も低いため、幹細胞の供給源として注目されている。しかしながら、臍帯血から得られる造血幹細胞が、量的に成人の移植が可能なだけあるかどうかは現在確かめられていない。臍帯血中に存在する幹細胞を増殖させることができれは、一人の臍帯血を複数のレシピエントに有効に利用することができ、臍帯血の提供者自身が将来白血病化しても自己の臍帯血を使えるようになる。

また、近年、先天性の遺伝子疾患患者に対し、欠失あるいは、変異遺伝子を相補する遺伝子治療の試みがなされている（大橋十也、実験医学、 1 2 : 3 3 3、 1 9 9 4 ) 。遺伝子治療では、卵子や精子のような生殖細胞に遺伝子を導入することは禁止されており、遺伝子を担う細胞として患者体内に永続的に存在する造血幹細胞を用いることが、疾患の根本的な治療になると考えられている。これらの遺伝子治療は、まだ試験的なレベルにあり、治療法として確立するためには幾つかの障害が残されている（Mulligan, R. C. , Science, 260 : 926， 1993)。最も重要な課題は、造血幹細胞に効率良く遺伝子を導入することである。この点を改善するためには、幹細胞を分化させずに細胞周期を回転させること、さらに、遺伝子導入に用いるウィルスベクターを高効率で産生させること、高効率で感染できるべクタ一系を開発することに集約することができる。発明の開示本発明は、上記観点からなされたものであり、骨髄移植や臍帯血移植に代わる血液細胞移植に用いることのできる造血幹細胞又は造血前駆細胞、あるいは遺伝子治療に用いることができる造血幹細胞又は造血前駆細胞を得る手段を提供することを主な目的とするものであり、具体的には、造血幹細胞及ぴ造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得るストロ一マ細胞株、このストローマ細胞株を用いて造血幹細胞及び造血前駆細胞の増殖または生存を支持する方法、及びこれらのスト口一マ細胞株及び方法を応用した新規な技術を提供することを課題とする。本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、造血幹細胞及び造血前駆細胞を効率良く増殖させる支持細胞の源として A G M領域が好適であり、この A GM領域から分離し、株化したスト口一マ細胞株が、造血幹細胞及び造血前駆細胞を増殖させることができることを見出した。また、得られたスト口一マ細胞株の用途について検討を行った結果、本発明のストローマ細胞株とともに培養された造血幹細胞または造血前駆細胞は、血液細胞移植や遺伝子治療の材料として好適に用いることができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、哺乳動物胎児の A GM領域から分離、株化され、かつ、造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る細胞株である。また本発明は、少なくとも一部が多分化能を維持したまま造血幹細胞または造血前駆細胞を増殖させ得る前記細胞株、および、少なくとも一部が細胞周期の回転を伴うように造血幹細胞を生存させ得る前記細胞株を提供する。

本発明はまた、発癌遺伝子またはアポブト一シス関連遺伝子が導入され、該遺伝子によって自己の増殖または生存が調節される前記細胞株、および、細胞刺激因子をコードする遺伝子が導入された前記細胞株を提供する。

さらに本発明は、前記細胞株とともに培養されて増殖した又は生存が維持された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む移植片、および、前記細胞株とともに培養されて増殖し又は生存が維持され、かつ、外来遺伝子が導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む遺伝子治療用組成物を提供する。

本発明はまた、哺乳動物胎児の A GM領域から分離、株化され、かつ、造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る細胞株とともに、少なくとも造血幹細胞もしくは造血前駆細胞を含む細胞群またはその分画物を培養することを特徴とする、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する方法を提供する。前記細胞群としては、臍帯血、胎児肝臓、骨髄、胎児骨髄、または末梢血由来の細胞群が挙げられる。

また本発明は、哺乳動物胎児の A GM領域から分離、株化され、かつ、造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る細胞株とともに培養されて増殖した又は生存が維持された造血幹細胞または造血前駆細胞を移植することを特徴とする造血幹細胞または造血前駆細胞の移植方法を提供する。

さらに本発明は、哺乳動物胎児の A G M領域から分離、株化され、かつ、造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る細胞株とともに培養されて増殖した又は生存が維持された造血幹細胞または造血前駆細胞に外来遺伝子を導入し、該遺伝子導入細胞を移植することを特徴とする遺伝子治療法を提供する。

本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。

A G M (Aorta- Gonad- Mesonephros)領域とは、胎児の大動脈、生殖腺原器、中腎原器のことを指す。 A GM領域は、胎児期での成人型の造血幹細胞が出現する解剖学的に特定された領域である。

スト口一マ細胞とは、造血細胞群の生存、分化、増殖を支持する造血細胞以外の造血組織に存在する細胞群ならぴにこれを構成する細胞をさす。これらの細胞には、線維芽細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、などの細胞種が認められる。

造血幹細胞とは、血球の全ての分化系列に分化し得る多分化能を有する細胞であり、かつ、その多分化能を維持したまま自己複製することができる細胞である _c 現在のヒトの幹細胞の評価系では、 in vitroのアツセィ系で赤血球を含むコロニ一 (CFU-Emix) を形成し得る細胞として識別される。

造血前駆細胞とは、単一の血液細胞分化系列あるいは、全てではない複数の分化系列に分化できる細胞を称し、これらの細胞は単一あるいは複数の分化系列の細胞への分化が可能である。 AGM領域由来ストロ一マ細胞株とは、 AGM領域から分離 ·株化された単一なストローマ細胞をいう。

尚、本明細書において、 AGM領域由来スト口一マ細胞株を、単に「ストローマ細胞株」または「本発明の細胞株」ということがある。以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のストローマ細胞株は、哺乳動物胎児の AGM領域から分離、株化され、かつ、造血幹細胞おょぴ造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る細胞株である。

本発明の細胞株を分離、株化する方法を、以下に例示する。

マウスの雌雄を S P F (specific pathogen- free)の環境のもとで飼育し、雌を雄と一晩、同じケージにいれ、翌朝、膣栓の存在が確認された雌マウスを新しいケージに移して飼育する。膣栓の確認された日を、懐胎 0. 5日とし、懐胎 8〜 13日、好ましくは 10. 5日目のマウスから胎児を摘出する。胎児から AGM 領域を分離する方法は、 Godin等（Godin, I. , Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A., 92:7 73-777, 1997)、 Medvinsky等（Medvinsky, A. L. , Blood, 87 : 557- 565， 1996)に記載されている。すなわち、胎児が浸る程度にリン酸緩衝生理食塩水を入れた培養皿に胎児を入れ、実体顕微鏡下で、 AGM領域を他の領域を含まないように切除し、新たな培養皿に移す。

上記のようにして得られた AGM領域に、培地、例えば 10% FCS (ゥシ胎児血清）を含む MEM培地を一滴加え、 37°C、 5% CO 2, 湿度 100%の条件下でー晚培養する。 AGM領域の細胞が、培養皿に付着したところで、さらに、培地を添加して培養を継続し、 AGM領域組織片の周辺にストローマ細胞を出現させる。さらに 1週間程度培養を継続した後、接着細胞をトリプシン処理によって剥がし、培地で洗浄し、培養皿に播種する。翌日、培養皿に付着しなかった細胞を培地とともに除去し、新たに新鮮な培地を添加する。トリプシン処理後の培養開始から 2 週間後に、内在する造血細胞を除去するため 900rad程度の _γ線を照射する。その 2週間後、培養系をトリプシン処理して細胞を懸濁し、 10〜20， 000細胞ウエル、好ましくは 50〜100細胞/ゥヱルとなるように 24ゥヱル培養皿に播種する。その際、播種する細胞数を少くし、直接限界希釈法によるクロ一ニングを行おうとすると、細胞は増殖しないので、一つのゥエルに播種する細胞数を多くし、少ない細胞数からの増殖に耐えられるように細胞を馴化した後、限界希釈法によるクローニングを行うことが好ましい。続いて、 3週間程度培養を継続した後、限界希釈法により、 0 . 0 5〜1細胞ノウエル、好ましくは 0 . 3細胞 Zゥルとなるように 9 6ゥエル培養皿に細胞を播種し、一個の細胞のみが播種されているゥエルから増殖してくる細胞を拡大培養する。

上記のようにして得られた細胞の中から、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖、生存を支持することのできる細胞を選択することによって、本発明のスト口 —マ細胞株が得られる。このような細胞の選択は、候補株と造血幹細胞または造血前駆細胞とを共培養した後、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖の程度を評価することによって行うことができる。造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖の程度は、共培養開始時と共培養後の細胞をそれぞれサイトカイン存在下で培養し、血液細胞のコロニー数を比較することによって行われる。

尚、上記においては、マウスの A GM領域からスト口一マ細胞株を樹立する方法を具体的に説明したが、ストロ一マ細胞株の樹立に用いる A GM領域はマウス由来に限られるものではなく、他の哺乳動物、例えば、ブタ、ヒッジ、ヒト等の A GM領域でもよい。 A GM領域での造血幹細胞の出現は、ヒト（Tavian, M. , Blood, 87 : 67-72， 1996) 、マウス（Sanchez, M-J.， Immunity, 5： 513-525, 199 6) ともに確認されており、哺乳類の発生過程で共通の機構が存在すると考えられる。後述の実施例 1に示すように、マウスの A GM領域由来のスト口一マ細胞株を用いてヒト臍帯血由来の造血幹細胞を増殖させることができることから、マウス以外の、ヒトその他の哺乳動物の A GM領域から、実施例で得られたスト口一マ細胞株と同等のストローマ細胞を分離し、同等な利用が可能であることが強く支持される。

上記のようにして、 A GM領域から単一なストローマ細胞を分離し、株化することができる。このストローマ細胞株は、造血幹細胞及び造血前駆細胞の増殖、生存を支持することができる。すなわち、ストローマ細胞株と、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞またはこれらの少なくともいずれかを含む造血細胞群とを共培養すると、造血幹細胞は細胞周期を回転し、一部は幹細胞のまま自己複製し、一部は造血前駆細胞へと分化しながら増殖し、造血幹細胞はこの培養系で維持される。また、上記共培養によって、造血前駆細胞は、単一あるいは複数の分化系列の細胞に分化しながら増殖する。

本発明のストローマ細胞株に、発癌遺伝子またはアポブト一シス関連遺伝子を導入し、得られる遺伝子導入株を用いて造血幹細胞および造血前駆細胞とともに培養すると、ストロ一マ細胞株の増殖または生存を調節することが可能となる。ストローマ細胞株の生育を調節できれば、ストロ一マ細胞株を効率良く増やすことができ、かつ、その寿命を延長させることも可能と考えられる。一般に発癌遺伝子は、増殖に関して有利に作用すると考えられ、これらの遺伝子を導入することで AGM由来ストロ一マ細胞の増殖速度を調節したり、寿命を延長することができる（Roecklein, B. A. , Blood, 85 : 997—1005, 1995； Whitehead, R. H. , Proc. Nat l. Acad. Sci. U. S. A. 90 ; 587—591， 1993)。

逆に、ストロ一マ細胞株を用いた共培養系で増幅した造血細胞を体内に移植する場合等には、ストローマ細胞株は体内で悪影響を及ぼす可能性があり、体内に持ち込むことは避けることが好ましい。ストロ一マ細胞株の生存を調節できれば、造血細胞の培養後にストロ一マ細胞株のみを死に至らしめ、除去することも可能と考えられる。そこで、細胞死を誘導するような遺伝子を、外部からの刺激で発現の調節ができるような形にしておき、スト口一マ細胞株に導入しその増殖、生存を人為的に調節可能とするような系を作ることもできる。

発癌遺伝子としては、ヒトパピ口一マウィルス遺伝子（Halbert, C. L. , J. Vir ol.， 65 : 473， 1991； Ryan, M. J. , Kidney Int 45 : 48， 1994) )、 SV40遺伝子（Chou，

J. Y.， Proc. Natl. Acad. , Sci. USA, 75 : 1854-1858, 1978； Chou, J. Y. , J.

Cell Biol. , 89 : 216-222, 1981)が、ァポプトーシス関連遺伝子としては、デス領域を持つ受容体遺伝子、例えば、 Fas ( Itoh, N. , Cell, 66 : 233-243， 1991) , TNFreceptor type II (Loetscher, H.， Cell 61 (2) : 351-359 ， 1990) , Death r eceptor 3 ( Kitoson, J.， Nature, 384 : 372-375， 1996) , Death receptor 4 ( P an, G.， Science, 276 : 111-113， 1997) , や、上記受容体の信号伝達系に属するタンパク質分解酵素である ICE (IL- 1 β converting enzyme) (Cerretti, D. P. , Sc ience 256 : 97- 100, 1992)，さらには、 Caspase Family ( Patel, T， FASEB. J. , 10 : 587-597, 1996)、例えば CPP32 (Fernandes- Alnemri, T, J. Biol. Chem.， 269 : 30761-30764, 1994)などが挙げられる。また、これらの遺伝子の発現を人為的に制御するには、テトラサイクリンを用いた発現誘導系（Manfred, G.， Proc. Nat 1. Acad.， Sci. USA, 89 : 5547-5551， 1992)が利用できる。これらの遺伝子をストローマ細胞株に導入するには、宿主にストローマ細胞株を用いる以外は、通常動物細胞への遺伝子導入に用いられる方法、例えば、モロニ一マウス白血病ウィルス等のレトロウイルスベクタ一、アデノウイルスベクタ一、アデノ随伴ウィルス

(AAV) ベクタ一（Kotin, R. M. Hum Gene Ther 5： 793， 1994) 、単純ヘルぺスゥィルスべクタ一等のウィルス由来の動物細胞用べクタ一を用いる方法、リン酸カルシゥム共沈法、 DEAE -デキストラン法、エレクト口ポレーシヨン法、リボソーム法、リポフエクシヨン法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。アポブト一シス関連遺伝子を導入する際に、該遺伝子に加えて薬剤耐性遺伝子等のマ一カー遺伝子を用いると、目的遺伝子が導入されたストローマ細胞株の選択が容易となる。

本発明の造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する方法は、上記ストローマ細胞株の持つ性質を利用したものであり、ストローマ細胞株とともに、少なくとも造血幹細胞もしくは造血前駆細胞を含む細胞群またはその分画物を培養することかちなる。ここで細胞群とは、造血幹細胞または造血前駆細胞のいずれか一方が単離されたものであってもよく、これらの両方であってもよレ、。また、造血幹細胞または造血前駆細胞の少なくとも一方を含み、さらに他の造血細胞を含んでいてもよい。また、分画物とは造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞群から分画された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む分画をいう。以下、このような細胞群またはその分画物を、単に造血幹細胞および造血前駆細胞ということがある。

本発明の方法における造血幹細胞および造血前駆細胞の採取源としては、ヒト及びマウス等の哺乳動物の胎児肝臓、骨髄、胎児骨髄、末梢血、サイトカインぉよぴ Zまたは抗癌剤の投与によって幹細胞を動員した末梢血、及び臍帯血等が挙げられ、造血幹細胞を含む組織であればいずれであってもよい。ストロ一マ細胞株と造血幹細胞または造血前駆細胞を培養するにあたっては、いわゆる培養用のシャーレ、フラスコを用いた培養法が可能であるが、培地組成、 pHなどを機械的に制御し、高密度での培養が可能なバイオリアクタ一によって、その培養系を改善することもできる（Schwartz, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 88： 6760, 1991； Roller, M. R.， Bio/Technology, 11 : 358， 1993； Roller, M. R. , Bloo d, 82： 378， 1993； Palsson, B. 0.， Bio/Technology, 11 : 368， 1993)。

培養に用いる培地としては、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖、生存が害されない限り特に制限されないが、例えば SF - 02培地（三光純薬）、 Opti-MEM培地 (GIBC0 BRL) 、 MEM培地（GIBC0 BRL) 、 IMDM培地（GIBC0 BRL) 、 PRMI1640培地 (GIBC0 BRL) 、が好ましいものとして挙げられる。培養温度は、通常 2 5〜3 9 °C、好ましくは 3 3〜3 9 °Cである。また、培地に添加する物質としては、ゥシ胎児血清、ヒト血清、ゥマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフエリン、エタノールァミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチォグリセロール、 2— メルカプトエタノール、ゥシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリェチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、各種増殖因子、好ましくは EGF (上皮増殖因子）、 PDGF (血小板由来増殖因子）、 bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子）、 O ₂は、通常、 4〜6 %であり、 5 %が好ましい。

上述したように、本発明のスト口一マ細胞株は、造血幹細胞及び造血前駆細胞の増殖、生存の支持に利用できるが、細胞刺激因子を共培養系に添加することによって、より有効に増殖、生存を支持することができる。このような細胞刺激因子は、スト口一マ細胞株が造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖、生存を支持するのを妨げないものであれば、特に制限されないが、具体的には、 SCF (幹細胞成長因子（stem cell factor) ) 、 IL- 3 (インタ一ロイキン— 3 )、 GM-CSF (顆粒球マクロファ一 1 · コロニー刺激因子 ^granulocyte/macrophage colony-stimulating factor) ) 、 IL- 6 (インタ一ロイキン— 6 ) 、 TP0 (トロンボポェチン）、 G-CSF (顆粒球コロニー刺激因子 ^granulocyte colony-stimulating factor) ^ TGF- β (トランスフォーミング成長因子— /3 ) 、 MIP-1 a (Davateli s, G.， J. Exp. Me d. 167 : 1939-1944, 1988)等のサイト力インに代表される増殖刺激因子、 EP0 (ェリスロポェチン）のような造血ホルモン、 Wnt (Thimoth, A. W. , Blood, 89： 3624 -3635， 1997)遺伝子産物のような分化増殖調節因子、あるいは Notch/Delta (Moore K. A. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 94 : 4011-4016， 1997)系の遺伝子産物のような発生調節因子等が挙げられる。

また、上記のような細胞刺激因子をコ一ドする遺伝子をストローマ細胞株に、該細胞内で前記遺伝子が発現できるような形で導入し、得られる遺伝子導入株を用いることによつても、前記培養系を改善することができる。

さらに、スト口一マ細胞株を培養して得られる培養上清に、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖、生存の支持に寄与する活性がみられる場合には、その培養上清のみを造血幹細胞または造血前駆細胞の培養に付することも可能である。さらに、ストローマ細胞と造血幹細胞または造血前駆細胞を、細胞は透過させない力これらの造血細胞の増殖、生存の支持に関与する因子は透過させることができるような多孔質の膜で分離して培養することも可能である。その際、造血細胞の生存増殖に有利になるように、前述したような種々の細胞刺激因子を培養系に添加することも可能である（Verfaillie, C. M.， Blood, 84： 1442-1449, 1994)。上記で述べた細胞刺激因子、細胞刺激因子をコードする遺伝子、発癌遺伝子、アポプト一シス関連遺伝子の取得、ならびに細胞への添加、細胞への遺伝子の導入方法、細胞の培養方法は、当業者に周知の方法により行われる。（Robin Calla rd et al, The Cytokine Facts Book, Academic Press Inc. , 1994；村松正実、遺伝子工学ハンドプック、羊土社、 1991 ; 黒木登志夫、細胞工学ハンドブック、羊土社 1992 ; 黒木登志夫、培養細胞実験法、羊土社 1995を参照されたい。）上記のようにして、本発明の細胞株とともに培養されて増殖した造血幹細胞または造血前駆細胞は、従来の骨髄移植や臍帯血移植に代わる血液細胞移植用の移植片として用いることができる。造血幹細胞の移植は、移植片が半永久的に生着させられることから、従来の血液細胞移植治療を改善することができる。従来、骨髄移植には、大量の骨髄の採取が必要であつたが、本発明によれば、少量の骨髄採取で済ますことができる。例えば、自己免疫疾患等の骨髄移植によってその改善の見られる疾患に対しては、自己あるいは非自己の幹細胞を増殖させるに際し、本発明による幹細胞増殖技術を利用することができる。

本発明の方法による造血幹細胞の移植は、白血病に対する全身 X線療法や高度化学療法を行う際に、これらの治療と組み合わせる他、種々の疾患に用いることができる。例えば、固形癌患者の化学療法、放射線療法等の骨髄抑制が副作用として生じる治療を実施する際に、施術前に骨髄を採取しておき、造血幹細胞、造血前駆細胞を試験管内で増幅し、施術後に患者に戻すことで、副作用による造血系の障害から早期に回復させることができ、より強力な化学療法を行えるようになり、化学療法の治療効果を改善する事ができる。また、本発明を利用して、患者あるいは他人の造血幹細胞ならびに造血前駆細胞を各種血液細胞に分化させ、それらを患者の体内に移入することにより、各種血液細胞の低形成により不全な状況を呈している患者の改善を図ることができる。また、再生不良性貧血などの貧血を呈する骨髄低形成に起因する造血不全症を改善することができる。その他、本発明の方法による造血幹細胞の移植が有効な疾患としては、慢性肉芽腫症、重複免疫不全症候群、無ガンマグロブリン血症、 Wiskott-Aldrich症候群、後天性免疫不全症候群（AIDS) 等の免疫不全症候群、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、 Gaucher病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌または腫瘍等が挙げられる。

本発明の移植片を用いた造血幹細胞の移植は、用いる細胞以外は、従来行われている骨髄移植や臍帯血移植と同様に行えばよい。

上記のような造血幹細胞移植に用いられる可能性のある造血幹細胞の由来は、骨髄に限られず、前述したような胎児肝臓、胎児骨髄、末梢血、サイトカインぉよびノまたは抗癌剤の投与によって幹細胞を動員した末梢血、及び臍帯血等を用いることができる。本発明の移植片は、本発明の方法によって増殖した造血幹細胞及び造血前駆細胞の他に、緩衝液等を含む組成物としてもよい。

また、本発明の細胞株とともに培養されて増殖した造血幹細胞または造血前駆細胞は、 ex vivoの遺伝子治療に用いることができる。遺伝子治療には、 D N Aを患者に直接投与する in vivo法と、標的細胞に D N Aを導入し、遺伝子導入細胞を患者に移植する ex vivo法がある。 ex vivo法において標的細胞に骨髄細胞を用いる場合には、大量の骨髄の採取が必要であつたが、本発明によれば、少量の骨髄採取で済ますことができる。また、造血幹細胞が自己複製し、長期的に造血細胞を供給できる性質は、遺伝子治療の好適な標的と考えられているが、従来、その細胞周期を回転させることができず、遺伝子の導入が困難であった。本発明のスト口一マ細胞株と造血幹細胞または造血前駆細胞とを共培養することにより、これらの細胞の細胞周期を回転させることが可能となり、遺伝子導入を容易に行うことができる。

本発明を利用した遺伝子治療は、ストロ一マ細胞とともに培養されて増殖した造血幹細胞または造血前駆細胞に外来遺伝子（治療用遺伝子）を導入し、得られる遺伝子導入細胞を用いて行われる。本発明の遺伝子治療用組成物を用いた遺伝子治療は、ストロ一マ細胞と共培養して増幅した造血幹細胞または造血前駆細胞を標的細胞として用いる以外は、従来行われている遺伝子治療と同様に行えばよい。導入される外来遺伝子は、疾患によって適宜選択される。血液細胞を標的細胞とする遺伝子治療の対象となる疾患としては、慢性肉芽腫症、重複免疫不全症候群、無ガンマグロブリン血症、 Wiskott-Aldrich症候群、後天性免疫不全症候群

(AIDS) 等の免疫不全症候群、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、 Gaucher病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌または腫瘍等が挙げられる。

標的細胞に用いる造血幹細胞の由来は骨髄に限られず、胎児肝臓、胎児骨髄、末梢血、サイトカインおよび Zまたは抗癌剤の投与によって幹細胞を動員した末梢血、及び臍帯血等を用いることができる。

造血幹細胞または造血前駆細胞に治療用遺伝子を導入するには、通常動物細胞の遺伝子導入に用いられる方法、例えば、モロニ一マウス白血病ウィルス等のレトロウィルスベクタ一、アデノウイルスベクタ一、アデノ随伴ウィルス（MV) ベクタ一、単純へルぺスウィルスベクタ一等のウィルス由来の動物細胞用ベクターを用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、 DEAE -デキストラン法、エレクトロボレ —シヨン法、リボソーム法、リポフエクシヨン法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。これらの中では、標的細胞の染色体 D N Aに組み込まれて恒久的に遺伝子の発現が期待できるという点から、レトロウィルスベクタ一またはアデノ随伴ウィルスベクターが好ましい。

例えば、アデノ随伴ウィルス（AAV) ベクタ一は、次のようにして作製することができる。まず、野生型アデノ随伴ウィルス D N Aの両端の I T R (inverted t erminal repeat) の間に治療用遺伝子を挿入したベクタ一プラスミドと、ウィルスタンパク質を補うためのへルパープラスミドを 2 9 3細胞にトランスフエクシヨンする。続いてヘルパーウィルスのアデノウイルスを感染させると、 MVベクタ一を含むウィルス粒子が産生される。あるいは、アデノウイルスの代わりに、へルパ一機能を担うアデノウィルス遺伝子を発現するプラスミドをトランスフエクシヨンしてもよい。次に、得られるウィルス粒子を造血幹細胞または造血前駆細胞に感染させる。ベクター D N A中において、目的遺伝子の上流には、適当なプ口モータ—及びェンハンサ—を挿入し、これらによって遺伝子の発現を調節することが好ましい。さらに、治療用遺伝子に加えて薬剤耐性遺伝子等のマーカ一遺伝子を用いると、治療用遺伝子が導入された細胞の選択が容易となる。治療用遺伝子は、センス遺伝子であってもアンチセンス遺伝子であってもよい。

レトロウィルスベクターを用いる場合は、造血幹細胞は細胞周期では G 0期にあるものが大半であり、レトロウイルスが感染できないため、造血幹細胞に IL-1、 IL- 3、 IL- 6及ぴ SCFを作用させて細胞周期に入らせてから、ウィルスを感染させる必要がある（Nolta, J.， Exp. Hematol, 20： 1065-1071 1992) 。本発明の細胞株は、造血幹細胞の細胞周期を回転させることができるため、効率の良いウィルス感染が可能である。また、ウィルス感染に際し、骨髄支持細胞を共存させると感染効率が高まるとの報告もあり（Moore, K. A. , A. B. Blood, 79 : 1393 - 1399, 1992) 、アポブト一シス関連遺伝子が導入されたストローマ細胞株と造血幹細胞が共存したままウィルスを感染させた後、アポブト一シス関連遺伝子を発現させてストロ一マ細胞株を死滅させる方法が考えられる。

本発明の遺伝子治療用組成物は、本発明の方法によつて増殖した造血幹細胞及び造血前駆細胞の他に、緩衝液、新規の活性物質等を含む組成物としてもよい。図面の簡単な説明図 1は、マウス A GM由来スト口一マ細胞株と CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞との共培養開始から 4週間後のコロニーアツセィの結果を示す図である。図 2は、マウス A GM由来スト口一マ細胞株と CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞との共培養開始から 3週間後のコロニーアツセィの結果を示す図である。図 3は、マウス A GM由来スト口一マ細胞株と CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞との共培養開始から 6週間後のコロニーアツセィの結果を示す図である。図 4は、マウス A GM由来ストロ一マ細胞株とマウス骨髄由来 C- KIT⁺Sca- 1+Li n_造血幹細胞との共培養開始から 1 0日後のコロニーアツセィの結果を示す図である。

図 5は、マウス骨髄由来造血幹細胞を移植したマウス末梢血の骨髄球系細胞及びリンパ球系細胞におけるドナー細胞の割合を示す図。〇は、造血幹細胞を AGM- S3と共培養したものを、 ▲は、造血幹細胞を AGM-S3と共培養を移植していないものを示す。

図 6は、マウス胎児由来造血幹細胞を移植したマウス末梢血の骨髄球系細胞及びリンパ球系細胞におけるドナ一細胞の割合を示す図。〇は、造血幹細胞を AGM - S3と共培養したものを、 ▲は、造血幹細胞を AGM-S3と共培養を移植していないものを示す。発明を実施するための最良の形態以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。実施例 1 造血幹細胞おょぴ造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る

A GM由来ストローマ細胞株の樹立く 1 > A GM由来ストローマ細胞株の樹立

( 1 ) マウス胎児の A GM領域の分離

C3H/HeNSLcマウス（日本エスエルシ一株式会社より購入）の雌雄を S P F (spe cific pathogen-free)の環境のもとで飼育した。 1ないし 2匹の雌を 1匹の雄と一晩、同じケージにいれ、翌朝、膣拴の存在が確認された雌マウスを新しいケ一ジに移して飼育した。膣拴の確認された日を、懐胎 0 . 5日とした。懐胎 1 0 . 5日目のマウスを頸椎脱臼により死に至らしめた後、胎児を摘出した。 A G Mの分離は、 Godin等（Godin, I.， Proc. Natl. Aacd. Sci. U. S. A. , 92 : 773-777, 1995)、 Medvinsky等（Medvinsky, A. L.， Blood, 87 : 557- 565， 1996)の方法に準拠して実施した。胎児が浸る程度に P B S (—）（リン酸緩衝生理食塩水）（日水製薬製）を入れた培養皿に胎児を入れ、実体顕微鏡下で、 A GM領域を他の領域を含まないように慎重に切除し、新たな 2 4ゥ-ルの培養皿（Nunc #143982) に移した。

( 2 ) A G M由来細胞株の樹立

2 4ゥエルの培養皿（Nunc #143982) に移した A G M領域に、 10°/。 FCS (Hyclo ne社）を含む MEM培地（Sigma社）を一滴加え、ー晚、培養器中で培養した。実施例中の培養は、ことわりのない限り、 10% FCS (Hyclone社）を含む MEM培地（Sig ma社）、 37°C、 5 % C O 2 , 湿度 100%の条件下で行った。一晩の培養で、 A GM 領域の細胞が、培養皿に付着したところで、さらに、 2 ml の 10°/。 FCSを含む MEM培地を添加した。その後、培養を継続することにより、 AGM領域組織片の周辺には次第にストローマ細胞が出現した。さらに 1週間培養を継続した後、接着細胞をトリプシン処理（0. 05% トリプシン， 0. 53mM EDTA (Gibco BRL社）を含む PBS中、 37。C、 3〜5分）によって剥がした後、培地で 2回洗浄し、 6ゥヱル培養皿（Nunc #15 2795) に播種した。翌日、培養皿に付着しなかった細胞を培地とともに除去し、新たに新鮮な培地を添加した。 6ゥエル培養皿に移してから 2週間後に、内在する造血細胞を除去するため 900 Radの γ線を照射した。この培養系から限界希釈法で直接細胞のクローニングを行ったが、細胞の増殖は認められず、クローニングすることはできなかった。そこで、一つのゥエルに播種する細胞数を増やし、少ない細胞からの増殖に耐えられるように細胞を馴化してから限界希釈法によるクローニングを実施することとした。

すなわち、上記と同様にして、 A GMを摘出して培養を行い、 γ線を照射してから 2週間になる培養系をトリプシン処理（0. 05% トリプシン， 0. 53m EDTAを含む PBS中、 37°C、 3〜5分）して細胞を懸濁し、 5 0〜 1 0 0細胞/ゥヱルとなるように 24-ゥエル培養皿に播種した。 3週間培養を継続した後、限界希釈法により、 0 . 3細胞 Zゥエルとなるように 9 6ゥエル培養皿（Nunc #167008) に細胞を播種し、一個の細胞のみが播種されているゥエルから増殖してきた細胞を拡大培養した。その結果、線維芽細胞様の細胞と、敷石状の細胞が得られ、クローニングに成功した。

ヒト臍帯血由来 CD34陽性細胞分画を、線維芽細胞様の細胞と二週間共培養し、培養系中のコロニー形成細胞の有無について検討したところ、線維芽細胞様の細胞との共培養系中にはコロニー形成細胞が認められなかった。そこで、敷石状の形態を示す細胞 7クローンについて同様の検討を行い、ヒト造血幹細胞の増殖支持活性を有するクローンが 3つ得られた。これらを AGM-sl、 AGM - s2及び AGM - s3と命名した。さらにこの 3クローンを用いて造血細胞の支持能について検討した。

< 2〉A GM由来ストロ一マ細胞株の造血幹細胞に対する支持能の評価

上記のようにして樹立された A G M由来ストロ一マ細胞株の造血幹細胞に対する支持能について、ヒト CD34陽性幹細胞を用いて検討した。

( 1 ) ヒト臍帯血 CD34陽性幹細胞の取得

ヒト臍帯血は東京大学医科学研究所のガイドラインに沿って、正常分娩時に採取した。 Sui等の方法（Sui， X. , Pro Natl, Acad. Sci. U. S. A.， 92 : 2859-2863, 1 995)にしたがって、以下に示すようにして CD34陽性幹細胞の分画を行った。ヒト臍帯血に 1 0分の 1量のシリカ（IBL)を添加し、 1 0分毎によく混和しながら 3 7 °Cで 3 0分間放置した。その後、シリカ添加臍帯血を Ficol l/Hypaque (Pharma cia Biotech) 比重遠心に供し、単核細胞を分離した。次に、この単核細胞を、抗 CD34抗体を被覆した磁性体ビーズ（Dynabeads M - 450 CD34) と細胞を反応させて、 CD34を発現している細胞をビーズに結合させた後、磁場を利用して CD34陽性細胞を分離した後、前記抗体とは別の CD34抗体（DETACHaBEAD CD34； Dynal社， Oslo) を用いて、 CD34陽性細胞分画を溶出した。この細胞集団をヒト臍帯血造血幹細胞集団として使用した。この細胞集団は、 CD34抗体による FACS (fluorescence acti vated cell sorting)分析 (Or tho Diagnostics Systems社製セノレソ一タ一を使用) で、 85から 95%の CD34陽性細胞を含むことを確認した。

( 2 ) ヒト造血幹細胞に対する支持能の評価

( i ) ヒト造血幹細胞と A G M由来細胞との共培養

上記く 1〉で樹立された 3種の A GM由来スト口一マ細胞株（AGM- sl、 AGM-s2、 AGM-s3) 、あるいはマウス骨髄由来スト口一マ細胞株である MS- 5 (Itoh， Κ·， Exp. Hematol. , 17： 145-153, 1989)を、 10% FCSを含む MEM培地を用いて 2 4ゥエルの培養皿の底一面を覆うまで増殖させた。 MS- 5は、新潟大学理学部生物学科森和博教授より供与され、 10% FCSを含む MEM培地にて維持したものを用いた。

上記のようにして増殖させたストローマ細胞 AGM- sl、 AGM- s2、 AGM- s3を各 5 x 1 0³/ゥエル、あるいは、マウス骨髄由来ストローマ細胞株である MS- 5を 1 X 10⁴/ゥエル、 2 4ゥエルの培養皿に播種し、 10%FCSを含む MEM培地にて 2日間培養し、細胞が培養皿の底一面を覆うまで増殖させた。このストローマ細胞上に、（1 ) で精製した CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞 1500個又は 500個を重層し、 1 mlの 1 0% FCSを含む MEM培地にて共培養した。共培養開始後、 1週間後に同様の培地 1 m 1をさらに添加した。 2週間後より、培地の半量を新鮮な同培地と交換し、培養を継続した。共培養開始後の各時点において、トリプシン処理（0. 05% トリプシン， 0. 53mM EDTAを含む PBS中、 37°C、 3〜5分）し、ストローマ細胞とヒト血液細胞を同時に培養皿より剥がし、以下に示すように造血幹細胞及び造血前駆細胞の増殖状況を評価した。

(ii) コロニーアツセィによる造血幹細胞及び造血前駆細胞の増殖状況の評価上記共培養系にて培養した細胞は、適宜希釈して 1 mlメチルセルロース培養系に付し、 3連で解析を行った。メチルセルロース培養系は、 α -培地（Flow Labo ratories社）に 0. 9%メチルセルロース（信越化学）、 3 0 %ゥシ胎児血清（HyClo ne社）、 1 %結晶化脱イオンゥシ血清アルブミン分画 V (Sigma社）、 0. 05mM 2-メルカプトエタノール（Eastman社）、 lOOng/ml ヒト SCF (幹細胞成長因子（stem cell factor) ) 、 20ng/ml ヒト IL— 3 (インターロイキン一 3 )、 2units/ml EP0 (エリスロポェチン）、 100ng/ml ヒト IL- 6 (インタ一ロイキン一 6 ) 、 lOng/ml ヒト G- C SF (顆粒球コロニ一刺激因子、 granulocyte colony-stimulating factor)を添カロし、培養皿（Falcon社製、 #1008) にて実施した。上記で用いた各種造血因子は、いずれもリコンビナント体であり、純粋なものである。

2週間の培養で出現してくるコロニーについて、顕微鏡下で観察し、出現してきた細胞の性質について解析した。具体的には、出現した CFU-G (granulocyte co lony-forming unit) ^ CFU-M macrophage co丄 ony - forming unit) _s CFU-GM (granul ocyte-macrophage colony-forming unit) _N BFU-E (erythroid burst forming uni t)、 CFU - GEMM (granulocyte- erythrocyte megakaryocyte - macrophage colony- for ming unit)の数を計測し、ストロ一マ細胞との共培養開始時のヒト CD34陽性細胞をメチルセルロース培養系に付したときに出現したコロニー数で割った値を増殖倍率とした。

( i ) において、共培養に 1500個の CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞を用いたときに、共培養開始から 4週間後にコロニーアツセィを行った結果を図 1に示す。 1500個の CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞を A GM由来ストローマ細胞と共培養した後のコロニー形成数を計数した。培養開始時の 1500個の CD34陽'性細胞に含まれていた各コロニー形成細胞数を 1として、共培養後の各コロニー形成数を表示した。すなわち、共培養による各コロニーの増殖倍率が示されている。

また、共培養に 500個の CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞を用いたときに、共培養開始から 3週間後及び 6週間後にコロニーアツセィを行った結果を、それぞれ図 2、 3に示す。コロニ一形成数の表示は図 1と同様であり、培養開始時の 50 0個の CD34陽性細胞に含まれていた各コロニー形成細胞数を 1として共培養後のコロニー形成数を表示した。

なお、図 1力ら図 3 ίこおレヽて、 CFU—Giま granulocyte colony-forming unit, CF U - Mは macrophage colony-forming unit、 CFU - GMは granulocyte-macrophage colo ny-forming unit、 BFU-Eは erythroid burst forming unit、 CFU - GEM は granuloc yte-erythrocyte- megakaryocyte- macrophage colony-forming unitの略称である。これらの結果で特徴的なのは、好中球、赤血球、マクロファ一ジ、巨核球への分化が可能な CFU- GEMMが、 AGM- sl、 AGM_s3細胞との共培養系において著明に増幅していることである。 CFU-GEMMは造血系の非常に未分化な細胞であり、上記の結果は、マウス A G M由来のストローマ細胞株との共培養により、ヒト造血系の未分化な細胞を分化させずに増幅させていることを示している。これまでに骨髄から樹立したストロ一マ細胞株ではこのようにヒト CFU - GE匪を増幅させることはできない（Nishi, N. , Exp. Hematol. 24： 1312-1321, 1996) 。本実施例においても、図 2、図 3に示されるように、マウス骨髄から樹立されたストローマ細胞である MS- 5では共培養後 CFU-GEMMはほとんど観察されなかった。したがって、このヒト造血幹細胞を支持する活性は、 A GM由来のストロ一マ細胞株に特徴的であると考えられる。さらに、 AGM-s2細胞では CFU- GEMMの増加は確認されなかった。つまり、 A G M 由来のストローマ細胞株で同じような形態をした細胞の中でも、ヒト造血支持能のある細胞は限られていると考えられる。前述の線維芽細胞様の細胞についてもヒト造血幹細胞を維持する活性が認められなかったように、 A GM領域に存在する細胞の中でも特定の細胞種がヒト造血幹細胞の維持能をもっていることが明らカこされた。

また、ヒト造血幹細胞の増殖を支持する AGM- sl、 AGM-s3を用いた共培養系では、 CFU- GM、 CFU - G、 CFU-Mのヒト造血前駆細胞も増殖させることができた。

以上のことは、マウス A GM由来スト口一マ細胞株が、ヒトの造血幹細胞、造血前駆細胞の増殖を支持できるということを示している。すなわち、造血幹細胞の増殖メカニズムは種を越えて保存されており、ヒトの造血幹細胞、造血前駆細胞の増殖は、ヒト以外の異種の生物由来の A G M由来ストロ一マ細胞をもってしても可能であることが示された。実施例 2 A GM由来ストローマ細胞株のマウス骨髄造血幹細胞に対する

増殖支持活性の検討実施例 1で得られたマウス A GM由来ストロ一マ細胞株について、マウス骨髄由来造血幹細胞に対する増殖支持活性を確認した。く 1〉マウス骨髄からの造血幹細胞の調製

C57BL/6マウス（8週齢、雄）（3本 SLC株式会社）の大腿骨内の骨髄細胞を取り出し、 10% FCSを含む MEM培地にけん濁した。定法にしたがい（高津聖志、免疫研究の基礎技術、羊土社 1995) マウス骨髄単核細胞分画を比重遠心法により濃縮した後、染色バッファー（5% FCS、 0. 05%アジ化ナトリウムを含む PBS) にけん濁し、以下の方法により造血幹細胞分画を取得した（Osawa, M. , J. Immunol. , 156： 3207- 3214, 1996)。フィコエリスリン結合 Sea- 1抗体（Pharmingen社）、ァロフィコシァニン結合抗 c-KIT抗体（ライフテックオリエンタル社）、および、分化マーカー（L in) として以下の 6種類のピオチン化した分化抗原特異的な抗体、 CD45R/B220 (R A- 36B2)、 CD4 (腿 - 5)、 CD8 (53- 6. 72)、 Gr - 1 (RB6-8C5)、 TER119 (以上の 5つの抗体は、 Pharmingen社， SanDiegoより購入）、 Mac- 1 (Ml/70. 15. 1) (Serotec社， O ford, UK) を細胞けん濁液に添加し、 20分間、氷中で反応させた。染色バッファ —で 2回洗浄した後、染色バッファ一にけん濁し、テキサスレッド結合ストレプトァビジン（Life Technologi es社）を添加し、氷中に 20分放置した。 2回洗浄した後、セルソ一ティング（Becton Dickinson社、 FACSVantage) に供して、分化抗原陰性、 Sea- 1抗体陽性、かつ、 c- KIT陽性の造血幹細胞（c-KIT+Sca-1+Lin—造血幹細胞）を分取した。 FACSの設定は、ネガティブコントロールとして、フィコエリスリン結合ラットイムノグロブリン G2a (Cedarlane)、ァロフィコシァニン結合ラットイムノグロブリン G2b (Pharmingen)、あるいはテキサスレツド結合ストレプトアビジンのみで染色した骨髄細胞を用いて調整し、抗体に特異的に染色されている細胞のみを分取した。

< 2 > A G M由来ストロ一マ細胞株及びマウス骨髄由来造血幹細胞の共培養

AGM_s3を 5 X 10³ずつ 2 4ゥエルの培養皿に播種し、 10% FCSを含む MEM培地にて 2日間培養し、細胞が培養皿の底一面を覆うまで増殖させた。前述のマウス骨髄由来 C- KIT+Sca-1+Lin—造血幹細胞 100個を重層し、 1 mlの FCS 10%を含む MEM培地にて培養した。培養開始 1週間後に、同様の培地をさらに l ml添加した。培養 10日目に、トリプシン処理（0. 05% トリプシン， 0. 53mM EDTAを含む PBS中、 37°C、 3〜 5分）し、ストローマ細胞と造血細胞を同時に培養皿より剥がした。共培養開始時に採取した C- KIT+Sca- 1+Lin—造血幹細胞の一部と、共培養を行った細胞について、以下に示す造血幹細胞の評価実験を行い、造血幹細胞の増殖状況を解析した。上記共培養系にて培養した細胞は、適宜希釈して 1 mlメチルセルロース培養系に付し、 3連で解析を行った。メチルセルロース培養系は、 α -培地（Flow Labo ratori es社）に 0. 9°/。メチルセルロース（信越化学）、 3 0 %ゥシ胎児血清（HyClo ne社）、 1 %結晶化脱ィオンゥシ血清アルブミン分画 V (Si gma社）、 0. 05mM 2-メルカプトエタノール（Eastman社）、 lOOng/ml マウス SCF、 20ng/ml マウス IL - 3、 2un i ts/ml ヒト EP0、 lOOng/ml ヒト IL- 6、 10ng/ml ヒト G- CSF、 4ng/ml ヒト TP0を添加し、培養皿（Falcon社製、 #1008) にて実施した。 1 0日間の培養で出現してくるコロニ一について、顕微鏡下で観察し、出現してきた細胞の性質について解析した。

結果を図 4に示す。増殖倍率は、共培養開始時のマウス骨髄由来 C- KIT+Sca_l⁺ Lin_造血幹細胞 100個に含まれている各コロニー形成細胞の数を 1とし、共培養後の各コロニ一形成数を表示した。赤血球コロニーを含む CFU-GEMMが著明に増加しており、マウス造血幹細胞が、 A GM由来スト口一マ細胞株との共培養によって増殖することが確認された。く 3 >マウスへの血液細胞移植

上記のマウス骨髄由来 C- KIT+Sca- 1+Lin—造血幹細胞 100個、あるいは、適宜希釈したく 2 >の共培養系から回収した細胞を、各々 3匹の 920Radの γ線照射した C5 7BL/6マウス（8週齢、雄）に、尾静脈より移植した。移植後 1 2日にマウスより脾臓を摘出し、脾臓に形成されたコロニー数（CFU- S12 ： day 12 spleen colony- for ming unit)を算定した。

その結果、 c- KIT+Sca- 1+Lin—造血幹細胞 100個を移植したマウスでは、 3 ± 1個の脾臓コロニ一が形成された。一方、共培養系から回収した細胞 1ゥエル分を 6 分の 1に希釈して移植したマウスでは、 4 ± 1個の脾臓コロニーが検出された。したがって、当初 100個の C- KIT+Sca- 1+Lin—造血幹細胞からは、約 2 4 ( 4 x 6 ) 個の脾臓コロニー形成細胞に増殖していたと計算される。すなわち、共培養によつて脾臓コロニー形成細胞は約 8倍に増殖した。

この結果は、脾臓コロニーを形成できる造血幹細胞が、 A G M由来ストローマ細胞株との共培養により増殖していることを示している。マウス造血幹細胞の増殖を A GM由来スト口一マ細胞株が支持するということは、ヒトの造血幹細胞の増殖を、 A GM由来ストロ一マ細胞株が支持できるという結果をサポートしている。実施例 3 免疫不全マウス移植系を用いたヒト造血幹細胞分画の維持、増殖の確認

< 1〉ヒト臍帯血細胞の免疫不全マウスへの移植

ヒト造血幹細胞あるいは前駆細胞の AGM - s3による維持、増殖を確認するため、ヒトの造血幹細胞を含むヒト臍帯血細胞を AGM- s3と共培養し、免疫不全マウスへ移植した。免疫不全マウスに生着するヒト造血細胞の解析を行うことで、骨髄球系ならびにリンパ球系への分化が可能な多分化能を有するヒト造血幹細胞および造血前駆細胞の共培養後の生存♦増殖について検討を行った。

詳細には、ヒト臍帯血由来の単核球細胞 1 X 10⁶個を、分離直後、および AGM- s 3と 4週間共培養後に、 NOD/Shi- scidマウスに移植した。細胞の調製および共培養の条件は実施例 1と同様に行った。 NOD/Shi- scid マウスへの細胞の移植は、 300 Radの γ線を照射した 8から 1 0週齢の NOD/Shi- scid (実験動物中央研究所）の尾静脈より細胞を移植することにより行った。さらに、 NOD/Shi - scidの NK細胞活性を抑制するために抗ァシァロ GM-1抗体（2( g/ml) (和光純薬） 300 1を、移植実施の直前と移植後 11日目に腹腔内投与した。移植後 5週目にマウスより骨髄細胞を採取し、ヒト細胞を特異的に認識する各種抗ヒト血球マーカ一抗体で染色することによって、ヒトの血液細胞の生着を確認した。細胞を移植していないマウスから採取した骨髄細胞についても同様に染色を行った。これらの染色技法、およぴ以下の FACSを用いた解析は、実施例 1に記載の方法と同様にして行った。

< 2 >マウス骨髄におけるヒト造血細胞の検出

移植後のマウス骨髄細胞について汎血球マ一力一である CD45の発現を、 FITC標識抗ヒト CD45抗体（Becton Dickinson社）を用いて FACSにより検出した。また、 F ACSのネガティブコントロールとして FITC標識マウス IgGl (Becton Dickinson杜）を用いた。その結果、細胞を移植していないマウスの骨髄細胞では、抗ヒト CD45 抗体に反応する細胞は検出されなかった。一方、分離直後の単核球を移植したマウスでは 6. 2°/。の骨髄細胞がヒト細胞であった。また、 AGM- s3と共培養を行った単核球を移植したマウス骨髄でも 5. 2%の細胞がヒトの細胞であった。この結果は、移植したヒト造血細胞に造血幹細胞あるいは造血前駆細胞が含まれていたので、免疫不全マウスに移植した後 5週間にわたり、ヒトの造血細胞の出現が認められたと考えられる。さらに、 AGM-s3と共培養せずに移植したものと、共培養後に移植したものとで、マウス骨髄におけるヒト細胞の存在比率がほとんど変わらなかつたことは、 AGM - s3上で造血幹細胞あるいは造血前駆細胞が生存あるいは増殖していたと結論できるく 3 >マウスに移植したヒト造血細胞の骨髄球系、リンパ球系細胞への分化能上記移植マウス骨髄中の抗ヒト CD45抗体に陽性のヒト血液細胞の表面抗原を詳細に解析し、移植したヒト細胞が各種血球に分化していることを確認した。すなわち、 Cy5標識フィコエリスリン（PECy5) 標識 CD45抗体と、各種分化抗原に対する抗体、つまり、フィコエリスリン（PE) 標識の抗 CD13抗体、抗 CD33抗体、抗 CD 14抗体、抗 CD19抗体、 FITC標識の抗 CD10抗体、又は抗 CD34抗体とを用いて二重染色した。これらの抗体は、抗 CD34抗体のみ I隱 unoteck社より購入し、その他のすベての抗体は Becton Dickinson社より購入した。 FACSを用いて CD45陽性細胞をゲートし、ヒト血液細胞でのこれら分化抗原の発現を解析した。

その結果、 CD45陽性細胞の内、 CD34陽性細胞が 8°/。の頻度で存在していることが確認された。この結果は、幼若な造血細胞が、 4週間の AGM-s3との共培養において維持され、かつマウスに移植後も幼若な形質を維持していたことを示している。さらに、 CD45陽性細胞の内、骨髄球の分化マ一カーである CD13、 CD33、 CD14の各抗原が陽性の細胞は、それぞれ 29%、 38°/。、 12%であった。また、リンパ球系の細胞については、 B細胞マ一カーである CD19陽性細胞は 58%の頻度で存在が確認された。レシピエントマウスに骨髄球系おょぴリンパ球系の細胞の出現が同時に認められたことから、移植されたヒト造血細胞中には骨髄球細胞、リンパ球細胞に分化が可能である未分化な造血幹細胞あるいは造血前駆細胞が存在していたことが示された。すなわち、 4週間の AGM_s3との共培養で、多分化能を有するヒト造血幹細胞を生存もしくは増殖させることが可能であると考えられる。実施例 4 移植実験を用いたマウス骨髄由来造血幹細胞に対する

生存または増殖促進活性の検討以下に示す細胞分画法の基本的な手技は、 Herzenberg, L. A. , "Weir' s Handboo k oi Experimental Immunology, 5th edition , Blackwel丄 Science Inc. 1997；高津聖志、「免疫研究の基礎技術」羊土社、 1 9 9 5にしたがい行った。細胞分離用に用いた抗体は全て、 Pharmingen社より購入した。

8〜 1 0週令の C57BL- Ly5. lpepマウス（日本クレアに飼育委託）より骨髄細胞を分離した。骨髄細胞懸濁液を Lymphoprep (Nycomed社）に重層し、 1500rpm， 25°C， 30分間遠心し、 Lymphoprepと上層との界面に集まった細胞を回収した。細胞を染色バッファー（PBS (リン酸緩衝生理食塩水）、 5% FCS (Hyclone社）、 ImM EDTA、 0. 05% NaN₃) で 2回洗い、染色バッファーに懸濁した。この細胞懸濁液に分化抗原マーカ一に対するピオチン化抗体、つまり、抗 CD4抗体、抗 CD8抗体、抗 CDllb抗体、抗 Gr- 1抗体、抗 B220抗体、及び抗 Terll9抗体を添加し、氷中で 3 0分間放置した。その後、染色バッファ一で 2回洗浄後、アビジンをコートした磁性体ビーズ（アビジンマグネットビーズ、 Perseptive社）を添加し、氷中で 3 0分間放置した。再度、染色バッファ一で 2回洗浄後、磁石を用いてマグネットビーズを集めて、分化抗原を発現している細胞を除去し、分化抗原陰性細胞群（LirT細胞）を取得した。

Lin—細胞に、 FITC標識抗 CD34抗体、フィコエリスリン（PE) 標識抗 Sea- 1抗体、 Texas Red標識アビジン、およびァロフィコシァニン（APC)標識抗 c- KIT抗体を添加し、氷中で 3 0分間放置した。染色バッファーで 2回洗浄後、セルソ一ター（FA CSVantage, Becton Dickinson社）にて、造血幹細胞画分（CD34陰性〜弱陽性、 Sea- 1陽性、 C- KIT陽性細胞）を選別した。造血幹細胞と AGM_s3を共培養する際の基礎培地としては、 α MEM培地（GIBC0社）に 10% FCS (Hyclone社）を添加したものを用いた。 5 X 10⁴個の AGM- s3を 48穴プレートに播種後、 3日間培養した。この AGM- s3上に、セルソータ一により分離した造血幹細胞を 50個ずつ加え、 0および 1週間培養を行った。

培養後、 PBS (GIBC0社）で 1回洗浄し、トリプシン液（GIBC0社）を添加した。 37°C、 5分間静置後、細胞培養用培地を添加し細胞を回収した。回収した細胞を 96穴プレートに添加し、さらに放射線照射マウスの短期間の生存を支持するためレスキュー細胞として、 C57BL/6N (日本チヤ一ルスリパー）の骨髄から調製した Lin—細胞を各ゥエルに 10⁴個加えた。各ゥエルの細胞を懸濁後、 X線を致死線量照射（9. 5Gy) した C57BL/6N (日本チヤ一ルスリバ一）に尾部静脈より移植した。移植後経時的に、各マウスの眼窩静脈より血液を採取し、赤血球を溶血後、細胞を FITC標識抗 Ly5. 1抗体、 PE標識抗 Mac- 1抗体、 PE標識抗 Gr- 1抗体、 APC標識抗 B220抗体、または APC標識抗 Thy- 1抗体で染色して、骨髄球系（Mac- 1陽性または Gr- 1陽性）細胞、及びリンパ球系（B220陽性または Thy_l陽性）細胞における Ly5. 1抗体陽性細胞の割合をフローサイトメトリ一により算定した。

結果を、図 5に示した。この図から明らかなように、 AGM- s3上で造血幹細胞を培養したものでは、 1、 2ヶ月後の末梢血に占める培養幹細胞に由来する細胞の割合は、 AGM- s3との共培養開始時の造血幹細胞を移植した群（Input)と同等であることが判明した。これらの結果から、本発明により、造血幹細胞あるいは造血前駆細胞を生存もしくは増殖させることが可能であると考えられる。実施例 5 マウス胎児造血幹細胞分画に対する生存又は増殖促進活性の検討以下に示す細胞分画法の基本的な手技は、 Herzenberg, L. A.， "Weir' s Handboo k of Experimental Immunology, 5th edition ， Blackwell science Inc. 1997；高津聖志、「免疫研究の基礎技術」羊土社、 1 9 9 5にしたがい行った。細胞分離用に用いた抗体は全て、 Pharmingen社より購入した。

8週令以上の雌雄 C57BL- Ly5. lpepマウス（日本クレアに飼育委託）を交配し、交尾後 14日目の雌マウスより胎児を摘出した。実体顕微鏡下で無菌的に胎児肝臓を分離し、 23Gの針を通して肝臓細胞を分散させ、 PBSに懸濁した。この肝臓細胞懸濁液を等量の Lymphoprep (Nycomed社）に重層し、 1500rpm, 20°C， 10分間遠心し、 Lymphoprepと上層との界面に集まった細胞を回収した。細胞を染色バッファー

(PBS (リン酸緩衝生理食塩水）、 5% FCS (Hyclone社）， ImM EDTA, 0. 05% NaN₃) で 2回洗い、染色バッファ一に懸濁した。細胞懸濁液に分化抗原マ一力一に対するピオチン化抗体、つまり、抗 CD3抗体、抗 Gr_l抗体、抗 B220抗体、及ぴ抗 Terll 9抗体を添加し、氷中で 3 0分間放置した。その後、染色バッファ一で 2回洗浄後、ァビジンをコートした磁性体ビーズ（ァビジンマグネットビーズ、 Perseptive社）を添加し、氷中で 3 0分間放置した。再度、染色バッファ一で 2回洗浄後、磁石を用いてマグネットビーズを集めて、分化抗原を発現している細胞を除去し分化抗原陰性細胞群（Lin—細胞）を取得した。

上記 Lin—細胞に、フィコエリスリン（PE)標識抗 Sea- 1抗体、ァロフィコシァニン (APC)標識抗 c- KIT抗体、および Texas Red標識アビジンを添加し、氷中で 3 0分間放置した。染色バッファーで 2回洗浄後、セルソータ一（FACSVantage, Becton Dickinson社）にて、造血幹細胞画分（Sea- 1陽性、 c-KIT陽性、分化抗原陰性細胞）を選別した。上記造血幹細胞と AGM-S3を共培養する際の基礎培地としては、 α ΜΕ Μ培地（GIBC0社）に 10% FCS (Hyclone社）を添加したものを用いた。 5 X 10⁴個の AGM- s3を 48穴プレートに播種後、 3日間培養した。この AGM- s3上に、セルソ一タ一により分離した造血幹細胞を 10³個ずつ加え 0および 4日間共培養をおこなった。培養後、 PBSで 1回洗浄し、トリプシン液（GIBC0社）を添加した。 37°Cで 5分間保温した後、細胞培養用培地を添加し細胞を回収した。回収した細胞を 96穴プレートに添加し、さらに放射線照射マウスの短期間の生存を支持するためレスキユー細胞として、 C57BL/6N (日本チヤ一ルスリバ一）の骨髄から調製した Sea- 1陽性、 C- KIT陽性、分化抗原陰性細胞を各ゥニルに 10³個加えた。各ゥエルの細胞を懸濁後、致死量の X線（9. 5Gy) を照射した C57BL/6N (日本チヤ一ルスリバ一）に尾部静脈より移植した。移植後経時的に、各マウスの眼窩静脈より血液を採取し、赤血球を溶血後、細胞を FITC標識抗 Ly5. 1抗体、 PE標識抗 Mac- 1抗体、 PE標識抗 Gr - 1抗体、 APC標識抗 B220抗体、または APC標識抗 Thy- 1抗体で染色して、骨髄球系

(Mac- 1陽性または Gr- 1陽性）細胞、及びリンパ球系（B220陽性または Thy- 1陽性）細胞における Ly5. 1抗原陽性細胞の割合、すなわち移植細胞由来の血液細胞の割合をフローサイトメトリ一により算定した。

結果を図 6に示した。この図から明らかなように、 AGM-s3上で造血幹細胞を培養したものでは、移植から 1 、 2ヶ月後のレシピエントマウスの末梢血に占める培養造血幹細胞に由来する細胞の割合は、 AGM- s3との共培養開始時の造血幹細胞を移植した群（Input)と同等もしくはそれを上回っていることが判明した。これらの結果を考慮すると、本発明により、胎児由来の造血幹細胞あるいは造血前駆細胞を生存もしくは増殖させることが可能であると考えられる。産業上の利用の可能性本発明のストロ一マ細胞株は、造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持することができる。

本発明のストロ一マ細胞株を用いると、造血幹細胞および造血前駆細胞を增殖させることができる。本発明の方法により増殖した造血幹細胞および造血前駆細胞は、血液細胞移植用の移植片、遺伝子治療用の標的細胞として好適に利用することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 哺乳動物胎児の AGM領域から分離、株化され、かつ、造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る細胞株。

2 . 造血幹細胞または造血前駆細胞を少なくとも一部が多分化能を維持したまま増殖させ得る請求項 1記載の細胞株。

3 . 少なくとも一部が細胞周期の回転を伴うように造血幹細胞または造血前駆細胞を生存させ得る請求項 1または 2記載の細胞株。

4 . 前記造血幹細胞おょぴ造血前駆細胞がヒト由来である請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の細胞株。

5 . 発癌遺伝子またはァポプトーシス関連遺伝子が導入され、該遺伝子によつて自己の増殖または生存が調節される請求項 1〜 4のいずれか一項に記載の細胞株。

6 . 細胞刺激因子をコードする遺伝子が導入された請求項 1〜 5のいずれか一項に記載の細胞株。

7 . 前記哺乳動物がマウスである請求項 1記載の細胞株。

8 . 請求項 1〜 7のいずれか一項に記載の細胞株とともに培養されて増殖した又は生存が維持された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む移植片。

9 . 請求項 1〜 7のいずれか一項に記載の細胞株とともに培養されて増殖し又は生存が維持され、かつ、外来遺伝子が導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む遺伝子治療用組成物。

1 0 . 哺乳動物胎児の A GM領域から分離、株化され、かつ、造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る細胞株とともに、少なくとも造血幹細胞もしくは造血前駆細胞を含む細胞群またはその分画物を培養することを特徴とする、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する方法。

1 1 . 前記細胞株に発癌遺伝子またはアポブト一シス関連遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項 1 0記載の方法。

1 2 . 前記細胞株に細胞刺激因子をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項 1 0記載の方法。

1 3 . 前記培養に、細胞刺激因子の添加を伴う、請求項 1 0または 1 1記載の方法。

1 4 . 前記細胞群が、臍帯血、胎児肝臓、骨髄、胎児骨髄、または末梢血由来である請求項 1 0〜1 3のいずれか一項に記載の方法。

1 5 . 哺乳動物胎児の A GM領域から分離、株化され、かつ、造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る細胞株とともに培養されて増殖した又は生存が維持された造血幹細胞または造血前駆細胞を移植することを特徴とする造血幹細胞または造血前駆細胞の移植方法。

1 6 . 哺乳動物胎児の A GM領域から分離、株化され、かつ、造血幹細胞およぴ造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る細胞株とともに培養されて増殖した又は生存が維持された造血幹細胞または造血前駆細胞に外来遺伝子を導入し、該遺伝子導入細胞を移植することを特徴とする遺伝子治療法。