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WO1999009060A1 - PROTEINE 1(3)mbt, POLYNUCLEOTIDE CODANT POUR LADITE PROTEINE, SON POLYNUCLEOTIDE ANTISENSE ET ANTICORPS RECONNAISSANT LADITE PROTEINE - Google Patents

PROTEINE 1(3)mbt, POLYNUCLEOTIDE CODANT POUR LADITE PROTEINE, SON POLYNUCLEOTIDE ANTISENSE ET ANTICORPS RECONNAISSANT LADITE PROTEINE Download PDF

Info

Publication number
WO1999009060A1
WO1999009060A1 PCT/JP1998/003551 JP9803551W WO9909060A1 WO 1999009060 A1 WO1999009060 A1 WO 1999009060A1 JP 9803551 W JP9803551 W JP 9803551W WO 9909060 A1 WO9909060 A1 WO 9909060A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mbt
sequence
gene
protein
polynucleotide
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/003551
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshihiko Kishimoto
Shin-Ichiro Niwa
Yasuko Nagamine
Hisashi Koga
Hideyuki Saya
Original Assignee
Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Electric Industries, Ltd. filed Critical Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority to CA002300371A priority Critical patent/CA2300371A1/en
Priority to EP98936718A priority patent/EP1004596A4/en
Publication of WO1999009060A1 publication Critical patent/WO1999009060A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity

Definitions

  • the present invention relates to a homologous protein of Drosophila 1 (3) mbt protein or a homologue of a polynucleotide encoding the protein.
  • the present invention also relates to an antisense polynucleotide of the polynucleotide.
  • the present invention also relates to an antibody that recognizes the homolog protein.
  • the Drosophila 1 (3) mbt gene (hereinafter, this gene is abbreviated as d-1 (3) mbt gene) is encoded by the Drosophila 1 (3) mbt protein (hereinafter, the protein is referred to as d- 1 (3 abbreviated as mbt.)
  • d- 1 3 abbreviated as mbt.
  • the deletion of the d-1 (3) mbt gene causes malignant tumors of the adult optogenetic neuroblast (adult optic neur ob last) and ganglion mother cells (ganglion mothercell). It is known to cause hyperplasia of the imaginal disc. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a homologous gene (homolog gene) of the d-1 (3) mbt gene. It is an object of the present invention to retrieve, isolate, determine the nucleotide sequence of the gene, produce a protein (homolog protein) encoded by the gene, and obtain an antibody that recognizes the protein.
  • the EST database is searched based on the nucleotide sequence information of the dl (3) mbt gene, and a nucleotide sequence having homology with dl (3) mbt is selected. Furthermore, a primer consisting of a part of the nucleotide sequence of the nucleotide sequence was prepared, and a human fetal brain cDNA library was transformed into a type III PCR using the primers to obtain a homologous gene (hereinafter referred to as h- 1 (3) abbreviated as mbt gene) and discloses its nucleotide sequence.
  • h- 1 (3) abbreviated as mbt gene
  • the present invention also provides a mouse homologous gene of the d—l (3) mbt gene (hereinafter abbreviated as m—1 (3) mbt gene :) as h—1 (3)
  • m—1 (3) mbt gene a mouse homologous gene of the d—l (3) mbt gene
  • h—1 (3) a primer used in the process of isolating the mbt gene and a primer newly prepared from a part of the base sequence selected above.
  • a mouse neonatal brain cDNA library 1 was transformed into type III. It is isolated by PCR and discloses its nucleotide sequence.
  • the present invention similarly isolates a rat homologous gene of the dl (3) mbt gene (hereinafter abbreviated as r-1 (3) mbt gene) and discloses the nucleotide sequence thereof. Is what you do.
  • nucleotide sequences of the h-1 (3) mbt gene, the m-1 (3) mbt gene and the r-1 (3) mbt gene obtained by the present invention are those having a high homology in the mb trepeat portion. It is.
  • the present invention relates to a homolog of the d—l (3) mbt gene, the h—1 (3) mbt gene, the m—1 (3) mbt gene or the ⁇ —1 (3) mbt gene in other animals.
  • the present invention discloses a method for obtaining a cloning gene.
  • the homologues of the d—l (3) mbt gene in other animals are the h-1 (3) mbt gene, the m—1 (3) mbt gene, and the r—1 (3) mbt gene.
  • CDNA fragment obtained from the nucleotide sequence of the gene, or polynucleotide obtained from the nucleotide sequence of the cDNA fragment It can be obtained by hybridization using a cDNA library of the other animal as a probe.
  • genes which are the individual elements of the set of h-1 (3) mbt gene, m_l (3) mbt gene, r-1 (3) mbt, and their homolog genes are referred to as 1 (3) It is called mbt gene.
  • the present invention provides a protein encoded by the 1 (3) mbt gene.
  • the protein is a homolog protein of d-1 (3) mbt, h-1 (3) mbt, m-1 (3) mbt, or r-1 (3) mbt.
  • h-1 (3) mbt, m-1 (3) mbt, r-1 (3) mbt, and proteins that are individual elements of a set of homologous proteins are referred to as 1 (3 ) mbt protein or simply 1 (3) mbt.
  • the present invention also discloses an antisense polynucleotide comprising a complementary nucleotide sequence to the above nucleotide sequence.
  • the present invention also discloses a method for producing 1 (3) mbt using the above-mentioned transformant into which 1 (3) mbt gene has been introduced.
  • the present invention provides an antibody which recognizes the above 1 (3) mbt, and shows that it is possible to produce an antibody from 1 (3) mbt, that is, generally from 1 (3) mbt. It is shown. Furthermore, the present invention shows that it is possible to detect 1 (3) mbt from animal tissues or animal cell lines by analysis by the Western blot method ⁇ ELISA using the antibody. It is.
  • the present invention provides a Northern blot hybridizer using a gene probe. Analysis by the Chillon method demonstrates that 1 (3) mbt mRNA can be detected in human and mouse tissues and cell lines, and that 1 (3) mbt mRNA is naturally expressed in these animals. It is shown.
  • the present invention also discloses the chromosomal location of the h-1 (3) mbt gene.
  • FIG. 1 is a diagram comparing the amino acid sequences of h-1 (3) mbt, m-1 (3) mbt and r-1 (3) mbt.
  • FIG. 2 is a diagram comparing the amino acid sequences of h-1 (3) mbt and d-1 (3) mbt.
  • FIG. 3 is a diagram showing the positional relationship between cDNA fragments and EST obtained in the process of obtaining the h-1 (3) mbt gene.
  • FIG. 4 is a diagram showing the positional relationship of cDNA fragments obtained in the process of obtaining the m-1 (3) mbt gene.
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing the results of Northern plate hybridization in which h-1 (3) mbt type 1 cDNA was hybridized to mRNA from human tissues. .
  • FIG. 6 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blot hybridization in which mRNA of each human tissue was hybridized with h-1 (3) mbt type 1 cDNA.
  • FIG. 7 is an electrophoretogram showing the results of Northern plate hybridization of hRNA (3) mbt type 1 cDNA, which was hybridized for mRNA of human tissues. .
  • FIG. 8 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blot hybridization of hRNA (3) mbt type 1 cDNA hybridized for mRNA of each human cell line.
  • FIG. 9 is an electrophoresis photograph showing the results of RT-PCR performed on human normal leukocytes and cancer cell lines.
  • Figure 10 is Aru £
  • Figure 11 is a diagram showing a 0 -21 1 11 base click evening one that ⁇ 031 1 gene, the antigen comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 of Sequence Listing Usagi
  • FIG. 4 is an electrophoretic photograph showing the results of a Western plot in which an antibody obtained by immunization was reacted with h-1 (3) mbt.
  • FIG. 12 is an electrophoretic photograph showing the results of a Western plot in which an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 in the sequence listing was reacted with h-1 (3) mbt. It is.
  • FIG. 13 is an electrophoresis showing the results of a Western blot in which an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was reacted with h-1 (3) mbt. It is a photograph.
  • FIG. 14 shows the results of measuring the absorbance by the ELISA method by reacting an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing with h-1 (3) mbt.
  • FIG. 14 shows the results of measuring the absorbance by the ELISA method by reacting an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing with h-1 (3) mbt.
  • FIG. 15 is a fluorescence micrograph showing the results of immunohistological staining of T98G-MG cells with an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
  • FIG. 16A is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of nuclear DNA in cells with PI.
  • FIG. 16B is a fluorescence micrograph showing the results of tissue staining of recombinant h-1 (3) mbt type 1 in cells with FITC.
  • FIG. 16C is a fluorescence micrograph showing the results of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI and intracellular recombinant h-1 (3) mbt type 1 with FITC.
  • FIG. 17A is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI.
  • TJP FIG. 17B is a fluorescence micrograph showing the results of tissue staining of recombinant h-1 (3) mbt type 2 in cells with FITC.
  • FIG. 17C is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI and intracellular recombinant h-1 (3) mbt type 2 with FITC.
  • FIG. 18A is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI.
  • FIG. 18B is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of 1 (3) mbt in cells with FITC.
  • FIG. 18C is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of nuclear DNA in cells with PI and intracellular 1 (3) mbt with FITC.
  • FIG. 19 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blot hybridization in which 0-1 DNA of m-1 (3) 111131 was hybridized with respect to the mRNA of each mouse adult tissue.
  • FIG. 20 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blot hybridization in which mRNA of mouse fetal tissue was hybridized with 00-1 of m-1 (3) 111131.
  • FIG. 21 shows the results of Western blot hybridization in which an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 in the sequence listing was reacted with m-1 (3) mbt. It is an electrophoresis photograph.
  • FIG. 22A is a micrograph of the cells.
  • FIG. 22B is a fluorescence micrograph showing the results of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI.
  • FIG. 22C is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of intracellular recombinant m-1 (3) mbt with FITC.
  • FIG. 22D is a fluorescence micrograph showing the results of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI and intracellular recombinant m-1 (3) mbt with FITC.
  • the homologue of d-1 (3) mbt of the present invention is not limited to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 in the sequence listing.
  • the polynucleotide to be encoded or a part thereof in particular, a polynucleotide consisting of the whole or part of the base sequence of the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 in the sequence listing
  • the present invention also includes a protein encoded by cDNA obtained from a cDNA library of each animal.
  • the well-conserved nucleotide sequence is the portion containing the mbt repeat.
  • H- 1 (3) mbt described in SEQ ID NO: 2 of the nucleotide sequence is a portion from the 865th T to 1809th C of the nucleotide sequence, and m-l (SEQ ID NO: 6 shown in SEQ ID NO: 6) 3) The portion from the 1062th T to the 2006th C of the base sequence of the mbt gene, and the 1805th to 861th base of the base sequence of the r_l (3) mbt gene described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • a full-length 1 (3) mbt gene can be obtained from a cDNA library of the target animal by the following operation.
  • T4 polynucleotide kinase 3 Sephad exG—25 (registered trademark, manufactured by Pharmacia) equilibrated with T50E (50 mM Tris-C1 pH 8.0, ImMEDTA) was applied to a 1.5 ml polyprep column ( (Bio-Rad Co., Ltd.) so that the bed volume becomes 1 ml, and the DNA reaction solution heat-treated in 2) is loaded on the column.
  • the entire nucleotide sequence of the 1 (3) mbt homolog gene is determined by the dye-minine-one-one method. At this time, if the genes obtained from each plaque are not full-length, select the required number of overlapping genes, cut them with an appropriate restriction enzyme site in the overlapping part, and cut them to full-length. Combine so that 5. Determination of amino acid sequence
  • step 4 From the nucleotide sequence determined in step 4, determine the amino acid sequence of 1 (3) mbt homolog protein.
  • Example 2 Insert the 1 (3) mbt homolog gene obtained above in the same manner as 9 in Example 1 into an appropriate vector (for example, TA cloning vector), and then introduce it into a host (for example, Escherichia coli). Can be used to produce a transformant.
  • an appropriate vector for example, TA cloning vector
  • a host for example, Escherichia coli
  • the polynucleotide can be changed by a natural mutation or an artificial mutation (for example, a point mutation method) without changing the main function of the polypeptide encoded by the polynucleotide.
  • 1 (3) mbt of the present invention also comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 in the sequence listing have been substituted, deleted or added. It is possible to produce proteins, ie, 1 (3) mbt mutants.
  • the amino acid sequence of the 1 (3) mbt mutant of the present invention can be determined from the nucleotide sequence of the gene encoding the mutant.
  • a commercially available program for example, For example, it is possible to use Mac Vector (registered trademark, manufactured by Eastman Chemical Company).
  • the polynucleotide encoding 1 (3) mbt of the present invention includes all degenerate patterns.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is a naturally occurring human 1 (3) mbt (h-1 (3) mbt) type 1 gene, and is represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence described is a naturally occurring human 1 (3) mbt
  • (h-1 (3) mbt) is a type 2 gene, and the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing is a naturally occurring mouse 1 (3) mbt (m-1 (3) mbt) gene, and the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is a naturally occurring rat l (3) mbt (r-l (3) mbt) gene.
  • the present invention includes an antisense polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the antisense strand of the polynucleotide encoding 1 (3) mbt, and a derivative thereof.
  • the antisense polynucleotide is capable of hybridizing to a polynucleotide encoding 1 (3) mbt, and if the hybridizing polynucleotide is a polynucleotide of a coding region, the polynucleotide is used. Can inhibit the biosynthesis of the polypeptide that it encodes.
  • the antisense polynucleotide for inhibiting the biosynthesis of the polypeptide preferably comprises 15 or more bases.
  • the antisense polynucleotide of the present invention or a part thereof includes all of a plurality of nucleotides consisting of a base, a phosphate, and a sugar, including non-naturally occurring nucleotides. Typical are antisense DNA and antisense RNA.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be prepared by using known antisense technology to obtain various DNAs having high binding strength to target DNA or mRNA, tissue selectivity, cell permeability, nuclease resistance, and intracellular stability. Thus, a novel antisense polynucleotide derivative can be obtained.
  • an antisense polynucleotide or a derivative thereof having a base sequence complementary to the base sequence of the region forming the stem loop should be designed.
  • the antisense polynucleotide and the derivative thereof of the present invention can form a stem loop as necessary.
  • an antisense polynucleotide having a sequence complementary to the sequence near the translation initiation codon, the ribosome binding site, the cabling site, and the splice site can generally be expected to have a high expression suppressing effect. Accordingly, the antisense polynucleotide of the present invention or a derivative thereof, which is complementary to the 1 (3) mbt encoding gene or the vicinity of the translation initiation codon of mRNA, a ribosome binding site, a capping site, and a splice site. Those containing the sequence are expected to have a high expression suppressing effect.
  • the derivatives generally known at present are preferably derivatives having at least one of enhanced nuclease resistance, tissue selectivity, cell permeability, and avidity. Particularly preferred are derivatives having a phosphorothioate bond as a skeletal structure.
  • the polynucleotides and derivatives thereof of the present invention also include derivatives having these functions or structures.
  • Natural antisense polynucleotides can be synthesized using a chemical synthesizer.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be prepared by a PCR method using the gene encoding 1 (3) mbt as a ⁇ type. Some derivatives, such as methylphosphonate and phosphorothioate, can be chemically synthesized.
  • the desired antisense can also be obtained by performing the operation according to the instructions attached to the chemical synthesizer and purifying the obtained synthetic product by the HP LC method using reverse phase chromatography or the like.
  • a sense polynucleotide or a derivative thereof can be obtained.
  • the polynucleotide encoding 1 (3) mbt of the present invention, its antisense polynucleotide or a part thereof is used as a probe, It can be used as a probe for screening the 1 (3) mbt gene from cDNA libraries and the like. At this time, those having a GC content of 30 to 70% can be suitably used. Further, a polynucleotide comprising a continuous base sequence of 15 bases or more is particularly preferred.
  • the polynucleotide used as a probe may be a derivative. Usually, a sequence having the above number of bases or more is recognized as a sequence having specificity.
  • a cDNA library used in screening using the probe one prepared from mRNA can be preferably used.
  • a group of cDNAs selected by random sampling from one of these cDNA libraries can be used as a search sample. Also, commercially available products can be used.
  • a DNA consisting of a continuous base sequence of 12 or more bases in the base sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 or a polynucleotide (antisense polynucleotide) hybridizing to the DNA is: It can be used as a probe to screen 1 (3) mbt gene from cDNA library etc.
  • a polynucleotide encoding 1 (3) mbt of the present invention its antisense polynucleotide or a polynucleotide that is a part thereof is referred to as a probe. Then, by performing Northern blot hybridization on mRNA derived from each tissue, it is possible to find a tissue in which mRNA expressed from 1 (3) mbt gene is expressed.
  • a transformant by introducing the plasmid into an appropriate host such as Escherichia coli by a known method. It is possible to produce a 1 (3) mbt or 1 (3) mbt mutant by culturing a transformant of the present invention into which the 1 (3) mbt gene has been introduced and allowing the gene to be amplified or the protein to be expressed. It is. Next, the product is collected and, if necessary, concentrated, solubilized, dialyzed, various types of chromatography, etc., to obtain the 1 (3) mbt or 1 (3) mbt mutant of the present invention. It can be purified.
  • Purification methods for purifying 1 (3) mbt or 1 (3) mbt mutants from the obtained culture include immunoprecipitation, salt precipitation, ultrafiltration, isoelectric point precipitation, and gel filtration. , Electrophoresis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, antibody chromatography, etc., various affinity chromatography, chromatofocusing, adsorption chromatography, and reversed phase There is a chromatography method and the like, which may be selected as appropriate.
  • the 1 (3) mbt or 1 (3) mbt mutant to be produced may be produced in a transformant as a fusion peptide with another polypeptide.
  • treatment with a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as a protease to cut out the 1 (3) mbt or 1 (3) mbt mutant is performed. Will be needed.
  • the present invention relates to the antigenicity of 1 (3) mbt, as exemplified in Example 6, 7, 8 or 9, specific to 1 (3) mbt or 1 (3) mbt obtained by the above method.
  • the purpose of the present invention is to clarify that an antibody can be easily obtained by immunizing an animal derived from 1 (3) mbt and an animal other than human with an oligopeptide having a specific amino acid sequence. Therefore, the antibody of the present invention that recognizes 1 (3) mbt (hereinafter sometimes referred to as the 1 (3) mbt antibody) is composed of 1 (3) mbt and an animal from which the 1 (3) mbt is derived.
  • a part of the protein may be synthesized, for example, using a peptide synthesizer.
  • a part of the protein has eight or more amino acid residues.
  • the 1 (3) mbt antibody of the present invention also includes a monoclonal antibody within its scope.
  • antibodies also include active fragments.
  • the active fragment means a fragment of an antibody having an antigen-antibody reaction activity, the concrete, F (ab 7) 2, Fab ', Fab, F v , and the like.
  • F (ab,) 2 is obtained, and when digested with nodine pine, Fab is obtained.
  • F ab is a monovalent antibody active fragment in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked by a linker.
  • a chimeric antibody can be obtained by retaining these active fragments and substituting other portions with fragments of another animal.
  • the antibody of the present invention can be used for elucidation of functions such as 1 (3) mbt expression and elucidation of a mechanism of forming a malignant tumor.
  • Methods for detecting mbt include a method using an antibody and a method using an enzymatic reaction.
  • the method using an antibody include (1) a method for detecting 1 (3) mbt using a labeled 1 (3) mbt antibody, 1 (3) an mbt antibody and a labeled secondary antibody of the antibody. 1 (3) mbt detection method.
  • a label for example, a radioisotope (RI), an enzyme, avidin or biotin, or a fluorescent substance (FITC, rhodamine, etc.) is used.
  • Examples of the method utilizing an enzymatic reaction include an ELISA method, an immunoagglutination method, an estamplot method, a method for identifying an immunoreactive molecule using flow cytometry, or a method similar thereto.
  • primers were synthesized from a human cDNA library to obtain a DNA fragment consisting of a part of the nucleotide sequence of the above H23073 c5, P1 primer 5 as primer, -CCATCAAAGT GCAGGCGTAG G -3, (base sequence described in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing), 3 ′ primer as P 2 primer
  • 5′-TAGCCACATA CCTCAGCCAC G-3 (base sequence described in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing) was designed and synthesized using a DNA synthesizer (ABI, model 392).
  • the synthesized primer was adjusted to 2 O pmo with distilled water. Using this as a PCR primer, the following PCR operation was performed.
  • PCR was performed under the following conditions using a human fetal brain cDNA library 1 (Clontech).
  • a PCR was performed.
  • a liquid having the following composition was placed in a test tube, and mineral oil was layered on the test tube, and left at 94 ° C for 5 minutes.
  • reaction was repeated 50 times by repeating “a cycle of 60 ° C. for 30 seconds, followed by 72 ° C. for 1.5 minutes, and then at 94 ° C. for 30 seconds”.
  • reaction was repeated 40 times by repeating a cycle of “60 ° C. for 30 seconds, followed by 72 ° C. for 1 minute, and then 94 ° C. for 30 seconds”.
  • reaction was carried out at 55 ° C for 2 minutes and finally at 72 ° C for 10 minutes to carry out the extension reaction of the fragment to complete the PCR operation.
  • fragment A The DNA fragment obtained from the 5, extension reaction (abbreviated as “fragment A” hereinafter) was subjected to mini-gel electrophoresis (0.75% agarose gel), and the fragment A band was cut out from the gel.
  • Fragment A was recovered using Gene Clean (manufactured by Bio 101), and bands were checked by minigel electrophoresis. Fragment A was taken in 1 ⁇ 1 and diluted with 99/1 TE.
  • the absorbance at 260 nm (A260) was measured, and the DNA concentration was calculated (the DNA concentration when A260 was 1.0 was set to 50 ⁇ 1 / ml). Fragment A was diluted with TE so that the DNA concentration was 1 ⁇ g / ⁇ 1.
  • the extension reaction to the 3 'side was performed using the same method as the extension reaction to the 5' side in step 3.
  • the primers were P3 primer 5, -MGCTGTTTG ACCG CATGAA C-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing) as the 5' primer, and P4 primer 5, -MGCACCTGT TTGTGAGCCA G as the 3 'primer.
  • -3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 23 in the Sequence Listing) was designed, synthesized using a DNA synthesizer (ABI, model 392), and adjusted to 20 pmo1 / 1/1 with distilled water. Was used.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained by the above 3 ′ extension reaction (hereinafter sometimes referred to as fragment and B) was determined in the same manner as in 4. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • the PCR product was subjected to minigel electrophoresis (0.75% agarose gel). As a result, a band of about 2.4 kbp was observed.
  • the h-1 (3) mbt gene band obtained above was cut out from the gel.
  • Ge The h-1 (3) mbt gene was recovered using neC1ean (manufactured by Bio 101), and the band was checked by minigel electrophoresis.
  • a DNA sequence was performed on this diluted solution by using the T 7 primer, by the Dye-Mine-Mine-Eye method, and by using an automatic sequencer (ABI model 373A).
  • — 1 (3) The nucleotide sequence of the mbt gene was determined. As a result, it was found that the h-1 (3) mbt gene has an overnight splice form. The shorter one was named Type 1 and the longer one was named Type 2.
  • the nucleotide sequence of the h-1 (3) mbt type 1 gene is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the nucleotide sequence of the h-1 (3) mbt type 2 gene is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • Type 2 has 118 bases inserted near the C-terminus of type 1 and between the 2373th position and the 2374th position of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in terms of the base sequence.
  • FIG. 3 shows the positional relationship between fragments A and B obtained in the above process.
  • the amino acid sequence of h-1 (3) mbt was determined.
  • the amino acid sequence of h-1 (3) mbt type 1 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of h-1 (3) mbt type 2 is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • Type 1 and type 2 differ in the amino acids after the 709th amino acid.
  • the amino acid sequences of d-1 (3) mbt and h-1 (3) mbt are shown in FIG.
  • the zinc finger domain, the mbt repeat and the protein-rich domain (SPM) are boxed.
  • the matching rate of d— 1 (3) mbt and h—l (3) mbt in the mb t repeat is 43.7%, Turned out to be quite preserved. Therefore, mbt-repeat is considered to play an important role in the function of this protein.
  • h-1 (3) mbt type 1 gene consisting of the above nucleotide sequence was inserted into a TA cloning vector, and the vector was introduced into Escherichia coli DH5 to prepare a transformant.
  • This transformant was named TA—h—1 (3) mbt, and on July 9, 1997, 1-3 1-3 Tsukuba East Higashi, Ibaraki, Japan, National Institute of Bioscience and Human Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. (Accession No.
  • P 7 primer one 5, -TGMCTCCTC CTCCTTGTAA CCT-3 ' ( nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 26 in Sequence Listing) and P 8 primers 5' -GTCCATGTAC TTCATCCTCA C-3 5 ( nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 in the Sequence Table ) was used to amplify a mouse neonatal brain cDNA (lambda ZAP II) library.
  • the DNA sequence was carried out by the auto-sequencer (881 model 3738) by the Dye-Mine-Mine-Eye-One method, and the nucleotide sequence of the obtained DNA was determined.
  • M13 reverse primer 5, -CAGGAAACAG CTATGAC-3 '(sequence in lambda ZAP II, base sequence described in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing) and P7 primer as primers and DNA synthesis It was synthesized using a machine (ABI, model 392). The synthesized primer was adjusted to 2 Opmo with distilled water. Using this as a PCR primer, the following PCR operation was performed.
  • a mouse neonatal brain cDNA library (Clontech) was used, and PCR was performed under the following conditions.
  • a liquid having the following composition was placed in a test tube, and mineral oil was layered on the test tube, and left at 94 ° C for 5 minutes.
  • Newborn mouse brain cDN A library (l ⁇ g / ⁇ l)
  • reaction was carried out at 55 ° C for 2 minutes and finally at 72 ° C for 10 minutes to carry out the extension reaction of the fragment to complete the PCR operation.
  • a second PCR operation was performed using CACTAAAGGG-3 ′ (sequence in lambda ZAP II, the base sequence described in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing) and P1 primer.
  • a liquid having the following composition was put into a test tube, and mineral oil was layered on it, and left at 94 ° C for 5 minutes.
  • PCR buffer 1 0-fold concentration (40 0 mM T ris- HC l (pH 8. 3), 1 MKC 1, 1 0 0 mM Mg C l 2, 1 0 0 mM DT T)
  • reaction was repeated 35 times by repeating "a cycle at 60 ° C for 30 seconds, then at 72 ° C for 1 minute, and then at 94 ° C for 30 seconds".
  • fragment D The DNA fragment obtained by the extension reaction obtained above (hereinafter referred to as fragment D) was subjected to mini gel electrophoresis (0.75% agarose gel), and the fragment A band was cut out from the gel. Fragment D was recovered using GeneClean (manufactured by Bio 101), and bands were checked by minigel electrophoresis. Fragment D was taken 11 and diluted with 99 ⁇ ⁇ 1 TE. The absorbance at 260 nm (A260) was measured, and the DNA concentration was calculated (the DNA concentration when A260 was 1.0 was set to 50/1 / ml). Fragment D was diluted with TE so that the DNA concentration was 1 ⁇ 1 / ⁇ 1.
  • This diluted solution was subjected to DNA sequencing using the Auto Sequencer (ABI model 373A) using the T3 primer and the P1 primer according to the Dye-Minute-Minus-Eye method.
  • the nucleotide sequence of D was determined. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
  • the extension reaction to the 3 'side was performed using the same method as the extension reaction to the 5' side in step 3.
  • Primers were designed with M13 and P8 primers for the first PCR, and T3 and P6 primers for the second PCR, using a DNA synthesizer (ABI, model 392), and used after being adjusted to 2 Opmo 1 / ⁇ 1 with distilled water. 6. Determination of nucleotide sequence (2)
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained by the above 3 ′ extension reaction (hereinafter sometimes referred to as fragment and E) was determined in the same manner as in 4. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 13 in the sequence listing. 7. Acquisition of m-1 (3) mbt gene
  • 5 Sense primer P 9 corresponding to a part of fragment D as 5 primer 5'-GTTGAAATGC TGGCGTAGTC-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing); 3, an antisense primer P 10 5'-CCCAGTCAGT CACTTAAAGA CATC-3' (corresponding to a part of fragment E as a primer)
  • the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing) was synthesized using a DNA synthesizer (ABI model 392).
  • a PCR reaction was performed using a mouse neonatal brain cDNA library (Clontech) as type I and the above primers.
  • a liquid having the following composition was placed in a test tube, and a 20: 1 layer of mineral oil was layered thereon, and left at 94 ° C for 5 minutes.
  • Taq polymerase (5uni t s / ⁇ l) 0.5.1
  • reaction was repeated 40 times by repeating a cycle of “60 ° C. for 30 seconds, followed by 72 ° C. for 1 minute, followed by 94 ° C. for 30 seconds”. Then, the reaction was performed at 55 ° C for 2 minutes and finally at 72 ° C for 10 minutes to complete the PCR operation.
  • the PCR product was subjected to mini gel electrophoresis (0.75% agarose gel). As a result, a band of about 2.6 kbp was observed.
  • nucleotide sequence (3) The band of the m-1 (3) mbt gene obtained above was cut out from the gel. The m-1 (3) mbt gene was recovered using Gene C 1 ean (manufactured by Bio 101), and bands were checked by minigel electrophoresis.
  • m-1 (3) mbt gene 1 ⁇ 1 of m-1 (3) mbt gene was taken and diluted with 99 ⁇ 1 of TE.
  • the absorbance at 26 Onm (A260) was measured and the DNA concentration was calculated (the DNA concentration when A260 was 1.0 was 50 / l / ml).
  • the m-1 (3) mbt was diluted with TE so that the DNA concentration was ⁇ 1.
  • a DNA sequence was carried out using a T 7 primer, a dye quenching method, and a DNA sequencer (Hyo 1 model 373). 1 (3) The nucleotide sequence of mbt was determined. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • FIG. 4 shows the positional relationship between fragments C, D, and F obtained in the above process. 9. Determination of amino acid sequence
  • amino acid sequence of m-1 (3) mbt was determined. This amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
  • the homology between the h-1 (3) mbt gene and the m-1 (3) mbt gene is 87%, and the homology between the h-1 (3) mbt protein and the m-1 (3) mbt protein is 70%, a protein that is very well preserved across species.
  • m-1 (3) mbt gene comprising the above nucleotide sequence was inserted into a TA cloning vector, and the vector was introduced into Escherichia coli DH5 to prepare a transformant.
  • Example 3 Isolation of rat 1 (3) mbt (r-1 (3) mbt) gene and determination of its nucleotide sequence and amino acid sequence encoded by the gene
  • a rat neonatal brain cDNA library that was self-made using a kit (manufactured by GIBCO BRL) was used.
  • a kit manufactured by GIBCO BRL
  • the fragment F having high homology to H23073 was obtained.
  • the sequence of fragment F is shown as SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
  • nucleotide sequence of the full length r-1 (3) mbt gene was determined. This nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO: 8 in the sequence listing. 5. Determination of amino acid sequence
  • amino acid sequence of r-1 (3) mbt was determined. This amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
  • the homology between m-1 (3) mbt and r-1 (3) mbt is over 90%, and is a very well-conserved protein among species.
  • the amino acid sequences of h-1 (3) mbt and m-1 (3) 111131: p-1 (3) mbt are shown in FIG. In the figure, the point of the mbt repeat is indicated by a frame. The agreement rate of the amino acid in the mbt repeat among the three was 95.0%, indicating that it was very well conserved. Therefore, mbt repeats are thought to play an important role in the function of this protein.
  • mRNA human poly A + RNA
  • mRNA human various cells
  • poly A + RNA mRNA
  • 2 ⁇ g of each blotted membrane Human Tis sue Northern Blot I, II and Human Cel
  • l Line Mult iple Ti ssue Nort Hern Blot manufactured by Clonetech
  • mbt type 1 gene to Mo 1 ecu 1 ar Clonin AL aborat ory Manual Second Ed Ition was hybridized according to the description on pages 7.39 to 7.52, and analyzed by Northern plate hybridization method.
  • Figures 5 to 7 show photographs of the results for each tissue. From the photograph, it was found that h-1 (3) mbt (5.5 kb band) was expressed in all tissues.
  • FIG. 8 shows photographs of the results for various cells. From the photograph, expression was observed in all cells except SW480.
  • Example 5> h—1 (3) Expression of an overnight splice form of the mbt gene
  • h-1 (3) About the expression ratio of mbt type 1 gene and the same type 2 gene And analyzed by RT-PCR.
  • FIG. 9 shows the results.
  • the upper row of FIG. 9 shows the results for humans, and the alphabet in each lane is for identifying each volunteer.
  • the upper band is a type 2 band and the lower band is a type 1 band. From the figure, type 2 was predominantly expressed in five human normal leukocytes and cancer cell lines. Type 1 was predominantly expressed in one human normal leukocyte. The expression of type 1 was dominant in the other normal human leukocyte.
  • the full-length h_l (3) mbt gene type 1 was inserted into one pCGN vector and one pBJ-Myc vector, and the respective vectors were introduced into COS cells to prepare transformants. The following operations are the same for each.
  • This transformant was added to 1 ⁇ 10 6 cells in 50 mM Tris—HC1, 15 OmM NaCl, 1 Triton X—100, 50 mM rhodoacetamide, 2 mM MgCl 2 , 2 mM CaCl 2 , 0.1% NaN 3 , A cell lysate consisting of 10 ⁇ g / ml soybean trypsin inhibitor, l / g / ml aprotinin, ImM PMS F (phenylmethylsulfonyl fluoride), 1 ⁇ g / ml leptin 100 ⁇ 1 was added and dissolved with good stirring. After being left on ice for 60 minutes, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected.
  • amino acid sequence of h-1 (3) mbt described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is an amino acid sequence obtained by adding cysteine (C) to the N-terminus of the amino acid sequence from positions 6 17 to 635 of the following amino acid sequence.
  • amino acid sequence A (sequence described in SEQ ID NO: 17 of the Sequence Listing) and the amino acid sequence h- 1 (3) mbt described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing from positions 148 to 167 of the amino acid sequence A peptide consisting of the following amino acid sequence B (sequence described in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing), which is an amino acid sequence obtained by adding cysteine (C) to the N-terminus of the amino acid sequence of the above, was synthesized. The addition of cysteine was added to the squash to combine with mocyanin (KHL). Synthesis was outsourced to Iwaki Glass Co., Ltd.
  • the serum was salted out by adding saturated ammonium sulfate to a final concentration of 50%.
  • the sample was centrifuged to precipitate the fraction containing the antibody. Then, the precipitate was dissolved in PBS, and the salt was prayed to PBS.
  • the antibody was affinity purified using a protein G Sepharose column (Pharmacia). As a result, a total of 5 mg of the peptide-specific antibody was obtained.
  • the h-1 (3) mbt gene described in SEQ ID No. 2 in the sequence listing was inserted into the vector pGEX-2TH (see FIG. 10) incorporating the GST gene, and the vector was introduced into Escherichia coli DH5. Thus, a transformant was prepared. GST-h-1 (3) mbt in which GST was bound to the N-terminus of h-1 (3) mbt was produced in the transformant. In the same manner as in Example 4, GST-linked recombinant h-1 (3) mbt was purified.
  • Example 9 Confirmation of reactivity of h-1 (3) mbt antibody
  • hOS (3) mbt protein was produced in COS cells, and the protein was subjected to SDS-PAGE electrophoresis.
  • the electrophoresed gel was transferred to a nitrocellulose membrane using a transplot system (Marisol).
  • the nitrocellulose membrane was immersed in Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and left standing for 1 hour to block. Then, at 0.05% Tween 20 / PBS
  • Example 6 or 7 The reactivity of each of the antibodies prepared in Example 6 or 7 was confirmed by the Western protocol according to the following procedure. A solution diluted with PBS to 1 g / ml was added to the membrane, and reacted at room temperature for 2 hours. Then, remove the membrane
  • Peroxidase-labeled ⁇ egret IgG solution (manufactured by Caltag) is added to PBS with PBS.
  • the solution diluted 1:00 was added to the above-mentioned membrane, and further reacted for 1 hour at room temperature. Thereafter, the plate was washed three times with 0.05% Tween20 / PBS for 5 minutes.
  • antibody B The titer of an antibody (hereinafter sometimes referred to as antibody B) obtained by immunizing rabbits with the peptide comprising the amino acid sequence of sequence B prepared in Example 6 as an antigen was measured by ELISA.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence of Sequence B was dissolved in PBS to a concentration of 25 ⁇ g / ml, and the solution was added to each well of a 96-well ELISA plate (Xenobind, Xenopore). ⁇ Dispensed one at a time and allowed to stand at 4 ° C overnight.
  • Block Ace manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • distilled water was dispensed into each well at a ratio of 200/1, and allowed to stand at room temperature for 2 hours to perform blocking.
  • Antibody B was prepared in the following order from the first column of the plate: 10 ⁇ g / ml, 5 g / ml, 2.5 jug / m
  • a solution double-diluted with PBS so as to have a concentration of 1,..., 0.005 was dispensed into each well at a ratio of 50/1, and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • IgG purified from blood of a non-immunized egret was used.
  • a protein IgG antibody (manufactured by Vector One) was dispensed into each well in a volume of 50 ⁇ 1, and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed four times with 0.05% Tween20 PBS, and OPD (orthophenylenediamine) -H 2 O 2 / PCB was dispensed at 100 ⁇ l / well into each well. After sufficient color development, the reaction was stopped with 2N sulfuric acid, and the absorbance at 490 nm was measured with a microplate reader (manufactured by Bio-Rad). C The measured absorbance was graphed in FIG. In the figure, the horizontal axis represents the concentration of the added antibody or the dilution ratio of the serum, and the vertical axis represents the absorbance at 490 nm. From the figure, it was found that the titer of antibody B was higher than that of control.
  • Antibody B was used to immunohistochemically evaluate the expression status of h-1 (3) mbt in T98G-MG cells (malignant glioma cell line) expressing h-1 (3) mbt type 1. It was examined by staining.
  • the slide-cultured cells were treated with 3.7% formaldehyde for 3 minutes, and then treated with methanol cooled at ⁇ 20 ° C. for 3 minutes to fix the cells. Thereafter, the slide was washed three times for 5 minutes each with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5).
  • Block Ace manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Block Ace was placed on the tissue on the slide glass, and left standing at room temperature for 1 hour to perform blocking. Thereafter, the slide was washed three times with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) for 5 minutes each.
  • mbt is a protein that exists in the nucleus, and is a protein that is unevenly distributed in the nucleus.
  • the full length h-1 (3) mbt type 2 gene was inserted into a pBJ-Myc vector, and the vector was introduced into VA13 cells to prepare a transformant.
  • the type 1 gene was also introduced into VA 13 cells. Recombinant proteins were expressed in these transformants. Intracellular nuclear DNA was stained with PI and intracellular recombinant protein was stained with FITC.
  • Figure 16A shows nuclear DNA in cells expressing h-1 (3) mbt type 1
  • FIG. 16B is a micrograph showing the result of staining for h-1 (3) mbt type 1 in the same cells.
  • FIG. 16C is a micrograph showing the result of simultaneously observing nuclear DNA in cells and h-1 (3) mbt type 1.
  • FIG. 17C is a micrograph showing the result of simultaneous observation of intracellular nuclear DNA and h-1 (3) mbt type 2.
  • FIG. 18A is a photomicrograph showing the result of PI staining of U20S cell nuclear DNA
  • FIG. 18B is a photomicrograph showing the result of staining for h-1 (3) mbt in U2OS cell cells.
  • FIG. 18C is a micrograph showing the result of simultaneous observation of nuclear DNA in cells and h-1 (3) mbt.
  • blot 2 g each of poly A + RNA (mRNA) in mouse (adult) tissue and poly A + RNA (mRNA) in mouse embryo.
  • Northern blot hybridization method as in Example 4 using the purified membrane (Mouse ssue Northern Blot (manufactured by Clontech)) and the labeled full-length ml (3) mbt gene. Analysis was performed.
  • a photograph of the results for each mouse adult tissue is shown in FIG. From the photograph, m-1 (3) mbt (6.3 kb band) was recognized specifically in the myocardium and skeletal muscle.
  • FIG. 20 shows a photograph of the result for the mouse fetus.
  • the m-l (3) mbt gene was introduced into COS cells to prepare a transformant, and the transformant was used to prepare a recombinant m-1 (3) mbt c -
  • Peptides having the following amino acid sequence C were synthesized, and antibodies recognizing m-1 (3) mbt were prepared in the same manner as in Example 8.
  • m-l (3) mbt protein produced in COS cells was subjected to SDS-PAGE electrophoresis.
  • the electrophoresed gel was transferred to a nitrocellulose membrane using a trans-blot system (Marisol).
  • Nitrocellulose membrane was immersed in Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and left standing for 1 hour to block. Thereafter, the plate was washed twice with 0.05% Tween20 / PBS for 5 minutes.
  • Example 16 The reactivity of each of the antibody prepared in Example 16 and the anti-Myc antibody was confirmed by the Western blot hybridization method in the same manner as in Example 9.
  • FIG. 21 shows the result. As can be seen from the figure, as a result of the antibody reaction, a band was observed at a size similar to that of humans (at a position of 120 kD), indicating that the antibody prepared in Example 16 recognized m-l (3) mbt. confirmed. ⁇ Example 18> m-1 (3) mbt tissue staining
  • the mouse cell line SWI SS3T3 was transformed with the antibody prepared in Example 16 Tissue staining was performed in the same manner as in Example 12.
  • FIGS. 22A-D Photographs of the results are shown in FIGS. 22A-D.
  • FIG. 22A is a micrograph of the cells.
  • FIG. 22B shows the result of staining for m-1 (3) mbt in the same cells.
  • FIG. 22C shows the result of staining DNA in the cells with PI.
  • FIG. 22D is the result of superimposing FIG. 22A and FIG. 22B. As can be seen, nuclear chromatin was stained.
  • Example 19 1 (3) Cell trait change caused by mbt gene expression ⁇ 6/0? Expression of 1 (3) mbt was observed in the system, and changes in cell morphology were observed.
  • Cre / LoxP system please refer to the website of In-Yuichi Net of the Gene Analysis Facility of the Institute of Medical Science, The University of Tokyo (http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/idenshi/hpmain.html). Information can also be obtained from.
  • the antibody of the present invention that recognizes 1 (3) mbt, its gene or 1 (3) mbt is effective for analyzing the mechanism of malignant tumor formation.
  • the 1 (3) mbt gene and 1 (3) mbt are substances involved in nuclear transcription and cell division.

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Description

明糸田書
1 (3) mbt蛋白質、 該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、 そのアンチ センスポリヌクレオチドおよび該蛋白質を認識する抗体
技術分野
本発明は、 ショウジヨウバエ 1 (3) mbt蛋白質のホモログ蛋白質または 該蛋白質をコードするポリヌクレオチドのホモログに関する。 また、 前記ポリヌ クレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドに関する。 また、 前記ホモログ蛋白 質を認識する抗体に関する。
背景技術
脊椎動物の中でもヒトは最も高度に分化した神経系を持つ。 しかし、 神経系に ついての解析は，その機構が複雑なために遅れている。 特に脳神経系に発生する 腫瘍については、 他の腫瘍に比べその解析が遅れている。 脳神経系においては、 悪性腫瘍はもちろんのこと、 良性腫瘍であっても発生部位によっては患者の生命 を脅かすことがあり、 脳神経腫瘍の発生機序の解明の進展が待たれている。
一方、 ショウジヨウバエでは、 神経発生の解析の過程で多くの突然変異体 が得られており、 その遺伝学的解析がなされている。 ショウジヨウバエ 1 (3) mbt遺伝子 （以後、 該遺伝子を d— 1 (3) mb t遺伝子と略す。 ） がコード するショウジヨウバエ 1 (3) mb t蛋白質 （以後、 該蛋白質を、 d— 1 (3) mb tと略す。 ） は、 プロリンリヅチドメインとジンクフィンガードメインとを 有し、 かつ、 特徴的な約 100アミノ酸からなる繰り返し配列 （mb t - r e p e at) を 3力所持つ蛋白質である。 また、 d— 1 (3) mbt遺伝子は、 その 欠失により、 アダルトォプテイクニューロブラスト （adu l t opt i c neur ob l as t) やガングリオン母細胞 (gang l i on mo t he r c e l l) の悪性腫瘍と、 成虫原基の過形成を生じることが知られている。 発明の開示
本発明は、 かかる d— 1 (3) mb t遺伝子の相同遺伝子 （ホモログ遺伝子） を検索し、 単離し、 その塩基配列を決定し、 該遺伝子がコードする蛋白質 （ホモ ログ蛋白質） を作製し、 さらには該蛋白質を認識する抗体を取得することを課題 とするものである。
すなわち、 本発明は、 d—l (3) mb t遺伝子の塩基配列情報に基づいて E STデータベースを探索し、 d— l (3) mbtとホモロジ一を有する塩基配列 を選び出す。 さらに、 該塩基配列の一部の塩基配列からなるプライマ一を作製し、 該プライマーを用いたヒト胎児脳 cDNAライブラリーを錡型にした P CRによ り、 ヒトにおける相同遺伝子 （以下、 h— 1 (3) mbt遺伝子と略する。 ） を 単離し、 その塩基配列を開示するものである。
また、 本発明は、 同様に、 d— l (3) mb t遺伝子のマウスにおける相同遺 伝子 （以下、 m— 1 (3) mbt遺伝子と略する。 ：） を、 h— 1 ( 3 ) mb t遺 伝子を単離する過程で用いるプライマー、 および前記選び出される塩基配列の一 部の塩基配列から新たに作製したプライマーと用いて、 マウス新生仔脳 c DNA ライブラリ一を鍊型にした P C Rにより単離し、 その塩基配列を開示するもので ある。
また、 本発明は、 同様に、 d— l (3) mb t遺伝子のラットにおける相同遺 伝子 （以下、 r— 1 (3) mbt遺伝子と略する。 ） を単離し、 その塩基配列を 開示するものである。
本発明により得られる、 h— 1 (3) mbt遺伝子、 m— 1 (3) mb t遺伝 子および r— 1 (3) mb t遺伝子の塩基配列は、 mb t r e p e a tの部分 におけるホモロジ一が高いものである。
本発明は、 他の動物における、 d— l (3) mbt遺伝子、 h— 1 (3) mb t遺伝子、 m— 1 (3) mb t遺伝子または Γ— 1 (3) mb t遺伝子のホモ口 グ遺伝子を取得する方法を開示するものである。
すなわち、 他の動物における d— l (3) mb t遺伝子のホモログ遺伝子は、 h- 1 (3) mbt遺伝子、 m— 1 (3) mbt遺伝子、 r— 1 (3) mbt遺 伝子の塩基配列から得られる c D N Aフラグメント、 または該 c D N Aフラグメ ントの塩基配列より得られるポリヌクレオチド （一本鎖 DNA、 cDNAに対す る RN Aまたはそれらが化学修飾されたものを含む） をプローブとして、 該他の 動物の c D N Aライブラリ一を用いたハイプリダイズにより得ることが可能であ る。 また、 cDNAライブラリ一中の該部分を PCRによって増幅させても当該 動物における d— 1 (3) mb t遺伝子のホモログ遺伝子を取得することが可能 である。
本明細書においては、 h— 1 (3) mbt遺伝子、 m_l (3) mbt遺伝子、 r- 1 (3) mbt、 およびそれらのホモログ遺伝子の集合の個々の要素である 遺伝子を、 1 (3) mbt遺伝子という。
さらに、 本発明は、 前記 1 (3) mbt遺伝子がコードする蛋白質を提供する ものである。 前記蛋白質は、 d— 1 (3) mbt、 h- 1 (3) mbt、 m— 1 (3) mbtまたは r— 1 (3) mb tのホモログ蛋白質である。 本明細書にお いて、 h— 1 (3) mbt、 m— 1 (3) mbt、 r- 1 (3) mbtおよびそ れらのホモログ蛋白質の集合の個々の要素である蛋白質を 1 (3) mbt蛋白質 または単に 1 (3) mbtという。
また、 本発明は、 前記塩基配列の相補塩基配列からなるアンチセンスポリヌ クレオチドをも開示するものである。
また、 本発明は、 前記の 1 (3) mbt遺伝子を導入した形質転換体を用いて、 1 (3) mb tを作製する方法を開示するものである。
また、 本発明は、 前記 1 (3) mbtを認識する抗体を作製し、 1 (3) mb tの抗原性、 すなわち一般に 1 (3) mbtから抗体を作製することが可能であ ることを示すものである。 さらに、 本発明は、 前記抗体を用いたウエスタンブ ロット法ゃ EL I SA法による解析により、 動物の組織または動物細胞株から 1 (3) mb tを検出することが可能であることを示すものである。
また、 本発明は、 遺伝子プロ一ブを用いたノーザンプロットハイプリダイゼ一 シヨン法による解析により、 ヒトおよびマウスの各組織や細胞株から 1 (3) m b tの mRNAを検出できること、 およびこれらの動物で天然に 1 (3) mb t の mRN Aが発現していることを示すものである。
また、 本発明は、 h— 1 (3) mb t遺伝子について染色体上の位置を開示 するものである。
図面の簡単な説明
第 1図は、 h— 1 (3) mbt、 m- 1 (3) mbtおよび r一 1 (3) mb t のァミノ酸配列を対比させた図である。
第 2図は、 h— 1 (3) mbtと d— 1 (3) mb tのアミノ酸配列を対比させ た図である。
第 3図は、 h— 1 (3) mb t遺伝子を取得する過程で得られた cDNAフラグ メントおよび E S Tの位置関係を示す図である。
第 4図は、 m— 1 (3) mb t遺伝子を取得する過程で得られた cDNAフラグ メントの位置関係を示す図である。
第 5図は、 ヒト各組織の mRNAについて、 h— 1 ( 3 ) mb tタイプ 1の c D N Aをハイブリダイズさせたノ一ザンプロヅトハイブリダイゼ一ションの結果を 示す電気泳動写真である。
第 6図は、 ヒト各組織の mRNAについて、 h— 1 ( 3 ) mb tタイプ 1の c D N Aをハイブリダイズさせたノ一ザンブロットハイブリダイゼ一ションの結果を 示す電気泳動写真である。
第 7図は、 ヒト各組織の mRN Aについて、 h— 1 (3) mbtタイプ 1の cD N Aをハイプリダイズさせたノ一ザンプロヅトハイブリダイゼ一ションの結果を 示す電気泳動写真である。
第 8図は、 ヒト各細胞株の mRN Aについて、 h—l (3) mbtタイプ 1の c DNAをハイブリダィズさせたノーザンブロヅトハイブリダィゼ一シヨンの結果 を示す電気泳動写真である。 T/JP98/03551 第 9図は、 ヒト正常白血球ならびに癌細胞株について R T— P C Rを行った結果 を示す電気泳動写真である。
第 10図は、 0311遺伝子を揷入した 0 —21111べク夕一を示す図でぁる£ 第 11図は、 配列表の配列番号 17に記載のアミノ酸配列からなる抗原をゥサギ に免疫して得られる抗体を h— 1 ( 3) mb tに反応させたウエスタンプロット の結果を示す電気泳動写真である。
第 12図は、 配列表の配列番号 18に記載のアミノ酸配列からなる抗原をゥサギ に免疫して得られる抗体を h— 1 (3) mb tに反応させたウエスタンプロット の結果を示す電気泳動写真である。
第 13図は、 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなる抗原をゥサギに 免疫して得られる抗体を h— 1 (3) mb tに反応させたウエスタンブロッ トの 結果を示す電気泳動写真である。
第 14図は、 配列表の配列番号 18に記載のアミノ酸配列からなる抗原をゥサギ に免疫して得られる抗体を h— 1 (3) mbtに反応させ、 ELI SA法により 吸光度測定した結果を示す図である。
第 15図は、 配列表の配列番号 18に記載のアミノ酸配列からなる抗原をゥサギ に免疫して得られる抗体で T 98 G— MG細胞を免疫組織染色した結果を示す蛍 光顕微鏡写真である。
第 16 A図は、 細胞内の核 DNAを P Iで組織染色した結果を示す蛍光顕微鏡写 真である。
第 16B図は、 細胞内の組み換え h— 1 (3) mbtタイプ 1を FITCで組織 染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
第 16C図は、 細胞内の核 DNAを P Iで、 細胞内の組み換え h— 1 (3) mb tタイプ 1を F I T Cで組織染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
第 17A図は、 細胞内の核 DNAを P Iで組織染色した結果を示す蛍光顕微鏡写 真である。 TJP 第 17B図は、 細胞内の組み換え h— 1 (3) mb tタイプ 2を F I TCで組織 染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
第 17C図は、 細胞内の核 DNAを P Iで、 細胞内の組み換え h— 1 (3) mb tタイプ 2を F I TCで組織染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
第 18A図は、 細胞内の核 DNAを P Iで組織染色した結果を示す蛍光顕微鏡写 真である。
第 18B図は、 細胞内の 1 (3) mb tを FIT Cで組織染色した結果を示す蛍 光顕微鏡写真である。
第 18C図は、 細胞内の核 DNAを P Iで、 細胞内の 1 (3) mbtをFI TC で組織染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
第 19図は、 マウス成体の各組織の mRNAについて、 m— 1 (3) 111131の0 D N Aをハイブリダィズさせたノーザンプロットハイブリダィゼ一シヨンの結果 を示す電気泳動写真である。
第 20図は、 マウス胎児の組織の mRNAについて、 m— 1 (3) 111131の00 N Aをハイブリダィズさせたノーザンブロットハイブリダィゼ一シヨンの結果を 示す電気泳動写真である。
第 21図は、 配列表の配列番号 19に記載のアミノ酸配列からなる抗原をゥサギ に免疫して得られる抗体を m— 1 (3) mb tに反応させたウエスタンプロット ハイプリダイゼ一ションの結果を示す電気泳動写真である。
第 22 A図は、 細胞の顕微鏡写真である。
第 22B図は、 細胞内の核 DNAを P Iで組織染色した結果を示す蛍光顕微鏡写 真である。
第 22 C図は、 細胞内の組み換え m— 1 (3) mb tを F I T Cで組織染色した 結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
第 22D図は、 細胞内の核 DNAを P Iで、 細胞内の組み換え m— 1 (3) mb tを F I T Cで組織染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の d— 1 (3) mbtのホモ口グは、 配列表の配列番号 1、 3、 5また は 7に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に限定されることはなく、 これらの蛋 白質をコードするポリヌクレオチドまたはその一部、 特には配列表の配列番号 2、 4、 6または 8に記載の塩基配列のコード領域の全部またはその一部の塩基配列 からなるポリヌクレオチドをプロ一ブとして、 各動物の cDNAライブラリーか ら得られる cDNAがコードする蛋白質も本発明に含まれる。
h- 1 (3) mb t遺伝子、 m— l (3) mb t遺伝子および r— 1 (3) m bt遺伝子の間で、 よく保存されている塩基配列は mbtリピートを含む部分で あり、 配列表の配列番号 2に記載の h— 1 (3) mb t遺伝子の塩基配列の 86 5番目の Tから 1809番目の Cまでの部分であり、 配列表の配列番号 6に記載 の m— l (3) mb t遺伝子の塩基配列の 1062番目の Tから 2006番目の Cまでの部分であり、 配列表の配列番号 8に記載の r_l (3) mbt遺伝子の 塩基配列の 861番目の丁から 1805番目の Cまでの部分に相当する。
この塩基配列からなる DNAフラグメントをプロ一ブとして用いて、 以下の操 作により、 目的とする動物の cDNAライブラリ一から全長の 1 (3) mbt遺 伝子を得ることができる。
1) プロ一プとする DNAを Takara MEGA LABELキット (登録商標、 宝酒造社製） を用いて取扱説明書の通りに標識する。
2 ) 次に、 下記の組成の DNA反応液を調製し、 この液を 37°Cで 30分間 インキュベートした後、 70°Cで 10分間熱処理し、 酵素を失活させる。
DNAプロ一ブ （2pmo l/〃l) 2〃1
10倍ホスホラィレイシヨン緩衝液 2μΛ
〔ァ— 32P〕 ATP (37 OMBq/ml) (アマシャム製）
5 / 1
T 4 ポリヌクレオチドキナーゼ 3) T 50 E (50 mM T r i s -C 1 pH 8. 0, ImM ED T A) で平衡化された S ephad exG— 25 (登録商標、 フアルマシア社製） を 1. 5 m 1ポリプレップカラム （バイオラッド社製） にべヅドボリュ一ムが 1 mlになるように詰め、 2) で熱処理をした DNA反応液を該カラムに載せる。
4) その後、 200〃 1 T 50 Eをカラムに 4回流し、 2回目の 200^ 1 で溶出した画分から標識化 DN Aプローブを得る。
5) 上記で得られた標識化 DN Aプローブ画分のうち 150〃 1を、 ニトロ セルロース膜上に固定したプラークの c DN Aプロ一ブ （ c DNAライブラリー のニトロセルロース膜上への固定は、 、 Mo 1 e c u 1 a r C l on i n nd E d i t i on (Co l d Spr i n Ha rb o r Lab o r at o ry P r e s s、 1989年） 9. 38-9. 4 1ページに記載の方法 にしたがって行える。 ） と以下の条件でハイブリダィズさせる。
①プレハイプリダイゼーシヨン
6 X S S C
5 xD enha l d t ' s
0. 05% ピロリン酸ナトリウム
1 0 j g/ m 1 d enat ur e d he r r i ng s p e rm
DNA
0. 5 % SD S
総液量 50ml
反応温度 37 °C
反応時間 1時間
②ハイブリダイゼ一シヨン
6 X S S C
l xD enha la t 5 s 0. 05% ピロリン酸ナトリウム
100 g/ m 1 denatured herr in sperm
DNA
1 x 106 cpm/ml cDNAプローブ
総液量 50ml
反応温度 42°C
反応時間 18時間
6) ハイブリダィズの終了したニトロセルロース膜を以下の条件で 1回ずつ 洗浄する。
① 6xSS 0. 1 %SD S 500ml
温度 40。C
時間 20分間
② 3xSSC、 0. 1 %SD S 500ml
時間 42。C
時間 20分間
7) 洗浄したニトロセルロース膜を X線フィルム （例えば、 コダック社製 X AR5フィルム） に一 80°Cでー晚露光し、 オートラジオグラフを撮影する。
8)得られたォ一卜ラジオグラフから、 陽性のプラークの位置を決定し、 対 応する寒天上のプラークを SM溶液に回収する。
9) 回収したプラークは、 常法により再度 NZY寒天培地上にプラーク形成 を行わせ、 ニトロセルロース膜上に固定する。
10) 5) 〜9) の過程を 3回繰り返し、 陽性のプラークを単一なものにす る。 該プラークを回収し、 100〃1の SM溶液に懸濁し、 ファージを安定化さ せる。 該プラークから単離した遺伝子が 1 (3) mbtホモログ遺伝子である。
3. 1 (3) mbtホモログ遺伝子の大量調製 1 ) SM溶液に懸濁したプラークのファージ 50 1と Y 1090 r—大腸 菌 20 / 1を混合し、 37。 15分間放置する。
2) その後、 100〃g/mlアンピシリンを含む 10ml NZ Y培地に 1) で混合した溶液を移し、 37°Cで 6時間培養する。
3) 8000 rpm、 5分間遠心分離し、 上清を回収する。
4) 該上清に、 5M NaC 1を lml、 ポリエチレングリコ一ル 6000 を 1. 1 gを加え、 溶かす。
5) 該溶液を氷上に 1時間置き、 その後 10000 rpm、 4°Cで 20分間 遠心分離を行う。
6) 沈殿を回収し、 700 z 1の SM溶液に懸濁する。
7) クロ口ホルムを 500 / 1加えて撹拌し、 残った大腸菌を溶かす。
8) 5000 rpm、 10分間遠心分離し、 水層を回収する。
9) これに、 lmg/ml RNa s eA、 5 mg/m 1 DNas e l (共にシグマ製） を各 1〃1ずつ加え、 37°Cで 1時間放置したのち、 20%ポ リエチレングリコ一ル 6000 (0. 8M NaC 1) を 600〃 1加え、 氷上 に 30分間放置する。
10) 4°Cで、 15000 rpm、 20分間遠心分離した後、 沈殿を回収す る。
1 1 ) この沈殿に 500〃 1の S M溶液、 50 1の 5M NaC l、 50 1の 0. 5M EDTAを加え、 更に、 400〃 1のフエノールを加えて撹袢 し、 ファージを溶かして cDNAを遊離させる。
12) 該溶液を室温で 15000 r pm、 5分間遠心分離した後、 水層を回 収する。 これに lmlのエタノールを加え、 15000 rpm、 20分間遠心分 離し、 液層を捨てる。
13) 70 %エタノール lmlで沈殿を洗浄し、 100〃1の丁 溶液 （丁 r i s -C 1 pH 8. 0 10 mM、 1 mM E D T A) に沈殿を溶かし、 D NA溶液を得る。
4. 1 (3) mbtホモログ遺伝子の塩基配列の決定
実施例 1と同様にしてダイ夕一ミネ一夕一法により 1 (3) mbtホモログ 遺伝子の全塩基配列を決定する。 このとき、 各プラークから得られた遺伝子が完 全長でない場合、 オーバ一ラップする遺伝子を必要な数だけ選びだし、 オーバ一 ラップする部分の適当な制限酵素サイ トで切断してそれらを完全長になるように 結合する。 5. アミノ酸配列の決定
4. で決定した塩基配列から、 1 (3) mbtホモログ蛋白質のアミノ酸配列 を決定する。
6. 形質転換体の作製
実施例 1の 9. と同様にして上記で得た 1 (3) mbtホモログ遺伝子を適 当なベクタ一 （例えば、 TAクローニングベクター） に挿入した後、 宿主 （例え ば、 大腸菌） に導入することで形質転換体を作製することができる。
自然の変異によりまたは人工の変異 （例えば、 ポイントミュ一テーシヨンの手 法） により、 ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの主たる機能に変化を 与えることなく、 該ポリヌクレオチド変化させることが可能である。 この方法に より、 本発明の 1 (3) mbtについても配列表の配列番号 1、 3、 5または 7 に記載のアミノ酸配列における一または複数のアミノ酸を置換、 欠失または付加 したアミノ酸配列からなる蛋白質、 すなわち 1 (3) mbt変異体を作製するこ とが可能である。
本発明の 1 (3) mbt変異体のアミノ酸配列は、 該変異体をコードする遺伝 子の塩基配列から決定することが可能である。 例えば、 市販のプログラム （例え ば、 Ma cVe c t o r (登録商標、 イース トマンケミカル社製） を用いて可能 である。
遺伝暗号の縮重により、 ポリヌクレオチドから生産されたポリペプチドのアミ ノ酸配列を変えることなく、 該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一部の 塩基を他の種類の塩基に置換することができる。 したがって、 本発明の 1 (3) m b tをコードするポリヌクレオチドとは、 縮重の全てのパ夕一ンを含むもので ある。
配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなる DN Aは、 天然に存在するヒト 1 (3) mbt (h— 1 (3) mbt) タイプ 1遺伝子であり、 配列表の配列番 号 4に記載の塩基配列からなる DNAは、 天然に存在するヒト 1 (3) mb t
(h- 1 (3) mbt) タイプ 2遺伝子であり、 配列表の配列番号 6に記載の塩 基配列からなる DNAは、 天然に存在するマウス 1 (3) mb t (m- 1 (3) mbt) 遺伝子であり、 配列表の配列番号 8に記載の塩基配列からなる DNAは、 天然に存在するラット l (3) mbt (r— l (3) mbt) 遺伝子である。
本発明は、 前記 1 (3) mbtをコードするポリヌクレオチドのアンチセン ス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体を含む ものである。 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 1 (3) mbtをコードする ポリヌクレオチドにハイプリダイズすることが可能なものであり、 それがハイブ リダイズするポリヌクレオチドがコ一ド領域のポリヌクレオチドであれば該ポリ ヌクレオチドがコ一ドするポリべプチドの生合成を阻害することが可能である。 ポリべプチドの生合成を阻害するためのアンチセンスポリヌクレオチドは、 1 5塩基以上からなることが好ましい。 一方、 細胞内に全長のアンチセンスポリヌ クレオチドを取り込ませるのは、 あまりに長くても不適である。 細胞内にアンチ センスポリヌクレオチドを取り込ませ、 1 (3) mb tの生合成を阻害させる場 合、 12塩基以上 30塩基以下、 好ましくは 15塩基以上 25塩基以下、 より好 ましくは 18塩基以上 22塩基以下の塩基からなるアンチセンスポリヌクレオチ ドを用いるのがよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその一部分は、 塩基、 リン酸、 糖からなるヌクレオチドが複数結合したものが、 天然には存在しないものを含め て全て含まれる。 代表的なものは、 アンチセンス D NAとアンチセンス R N Aで ある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドについて、 公知のアンチセンス技術を 用いて、 目的の D N Aや mR N Aとの結合力、 組織選択制、 細胞透過性、 ヌクレ ァ一ゼ耐性、 細胞内安定性の高い様々なアンチセンスポリヌクレオチド誘導体が 得られる。
ハイブリダィズのし易さの点では、 一般的には、 ステムループを形成している 領域の塩基配列に相補的な塩基配列を持つアンチセンスポリヌクレオチドまたは その誘導体を設計するとよいとされている。 本発明のアンチセンスポリヌクレオ チドおよびその誘導体は、 必要に応じ、 ステムループを形成することが可能であ る。
また、 翻訳開始コドン付近、 リボソーム結合部位、 キヤッビング部位、 スプラ ィス部位の配列に相補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチドは、 一般に高い発現抑制効果が期待できる。 したがって、 本発明のアンチセンスポリ ヌクレオチドまたはその誘導体であって、 1 ( 3 ) mb tをコードする遺伝子ま たは mR N Aの翻訳開始コドン付近、 リボソーム結合部位、 キヤッビング部位、 スプライス部位の相補的な配列を含むものは、 高い発現抑制効果が期待される。 現在一般的に知られている誘導体は、 ヌクレアーゼ耐性、 組織選択性、 細胞透 過性、 結合力の少なくとも一が高められた誘導体であることが好ましい。 特に好 ましくは、 フォスフォロチォェ一ト結合を骨格構造として有する誘導体である。 本発明のポリヌクレオチドおよびその誘導体についても、 これらの機能または構 造を有する誘導体が含まれる。
天然型のアンチセンスポリヌクレオチドであれば、 化学合成機を使用して合 成したり、 1 (3) mbtをコードする遺伝子を錶型とする PCR法により本発 明のアンチセンスポリヌクレオチドを作製することができる。 また、 メチルフォ スフォネート型やフォスフォロチォェ一ト型等、 誘導体の中には、 化学合成でき るものもある。 この場合には、 化学合成機に添付されている説明書にしたがって 操作を行い、 得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いた HP LC法 により精製することによつても、 目的のアンチセンスポリヌクレオチドまたはそ の誘導体を得ることができる。
本発明の 1 (3) mb tをコードするポリヌクレオチド、 そのアンチセンス ポリヌクレオチドまたはそれらの一部 （連続する 12塩基以上の塩基配列からな るポリヌクレオチド） であるポリヌクレオチドをプロ一ブとして、 cDNAライ ブラリー等から 1 (3) mb t遺伝子をスクリーニングするためのプローブとし て使用可能である。 このとき GC含有率が 30ないし 70%のものが好適に使用 可能である。 また、 連続する 15塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド が特に好ましい。 プローブとして用いる該ポリヌクレオチドは誘導体であっても よい。 通常、 上記の塩基数以上の配列は特異性のある配列であると認識されてい る。 該プローブを用いたスクリーニングにおいて使用する cDNAライブラリー としては、 mRNAから作製されたものが好ましく使用できる。 これらの cDN Aライブラリ一からランダムサンプリングにより選択された一群の cDN Aを検 索の試料とすることができる。 また、 市販のものでも使用可能である。
例えば、 配列表の配列番号 2、 4、 6または 8に記載の塩基配列のうちの連続 する 12塩基以上の塩基配列からなる D N Aまたは該 D N Aにハイブリダィズす るポリヌクレオチド （アンチセンスポリヌクレオチド） は、 cDNAライブラリ —等から 1 (3) mb t遺伝子をスクリーニングするためのプローブとして使用 可能である。
また、 本発明の 1 (3) mb tをコードするポリヌクレオチド、 そのアンチセ ンスポリヌクレオチドまたはそれらの一部であるポリヌクレオチドをプローブと して、 各組織由来の mRN Aについてノーザンブロヅ トハイブリダィゼーシヨン を行うことにより、 1 (3) mb t遺伝子由来の mRN Aが発現している組織を 見出すことが可能である。
プラスミ ドを大腸菌等の適当な宿主に導入して、 形質転換体を得ることは公知 の方法により可能である。 本発明の 1 (3) mb t遺伝子を導入した形質転換体 を培養して遺伝子の増幅または蛋白質の発現を行わせ、 1 (3) mbtまたは 1 (3) mbt変異体を作製させることが可能である。 次に作製物を回収し、 必要 に応じて濃縮、 可溶化、 透析、 各種クロマトグラフィー等の操作を行うことによ り、 本発明の 1 (3) mbtまたは 1 (3) mb t変異体を精製することが可能 である。
形質転換体の培養については、 各種の教科書があり、 本発明に記載の塩基配列 に基づいて 1 (3) mbtまたは 1 (3) mb t変異体を作製させることは、 公 知の方法により可能である。 このとき、 宿主としては、 大腸菌等の最近、 酵母、 動物細胞のいずれも使用可能であるが、 特には動物細胞が好ましい。 細胞に遺伝 子を導入するには、 リボソーム法、 エレクトロボ一レ一シヨン法等を用いること ができる。 特に、 核内微量注入法を用いることが好ましい。
得られた培養物から 1 (3) mbtまたは 1 (3) mbt変異体を精製する精 製方法には、 免疫沈降法、 塩析法、 限外濾過法、 等電点沈殿法、 ゲル濾過法、 電 気泳動法、 ィオン交換ク口マトグラフィ一法、 疎水性クロマトグラフィ一法ゃ抗 体クロマトグラフィー法等の各種ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 クロマト フォ一カシング法、 吸着ク口マトグラフィ一法および逆相クロマトグラフィ一法 等があり、 適宜選択して行えばよい。
また、 製造段階において、 製造する 1 (3) mbtまたは 1 (3) mbt変異 体は、 他のポリぺプチドとの融合べプチドとして形質転換体に作製させてもよい。 この場合は、 精製工程において、 ブロムシアン等の化学物質やプロテアーゼ等の 酵素で処理して、 1 (3) mbtまたは 1 (3) mb t変異体を切り出す操作が 必要になる。
本発明は、 1 (3) mb tの抗原性について、 実施例 6、 7、 8または 9に 例示するように、 前記方法により得られた 1 (3) mbtまたは 1 (3) mb t に特異的なアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを 1 (3) mb tが由来する動 物およびヒト以外の動物に免疫することで容易に抗体が得られるものであること を明らかにするものである。 したがって、 本発明の 1 (3) mb tを認識する抗 体 （以降、 1 (3) mbt抗体ということがある） は、 1 (3) mbtを該 1 (3) mb tが由来する動物およびヒト以外の動物に免疫感作することにより得 られる抗体であって、 該抗体が本発明の 1 (3) mb tを認識することがウェス タンプロット法、 EL I SA法や免疫染色法 （例えば FACSでの測定） 等によ り確認される抗体をその範囲内に含む。
また、 免疫原として、 蛋白質の一部であっても該蛋白質の一部をゥシ血清ァ ルブミンなどの他のキヤリァ一蛋白質に結合させたものを用いることは、 よく用 いられる方法である。 該蛋白質の一部は、 例えばペプチド合成機を用いて合成し てもよい。 なお、 蛋白質の一部としては、 8アミノ酸残基以上であることが好ま しい。
抗原性が明らかとなった物質については、 免疫感作によってポリクロ一ナル抗 体が得られるならば、 該免疫した動物のリンパ球を用いたハイプリ ドーマにより モノクローナル抗体が産生されることはよく知られている （ 『Ant ib o d i e s A Labo rat o ry Manua l』 (Co l d S r ing Harbo r Lab o rat o ry Pr e s s、 1988) Chapt e r 6) 。 したがって本発明の 1 (3) mb t抗体はモノクローナル抗体もその範囲 内に含むものである。
本発明においては、 抗体は活性フラグメントをも包含するものである。 活性 フラグメントとは、 抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味し、 具 体的には、 F (ab7 ) 2、 Fab'、 Fab, F vなどを挙げることができる。 例えば、 本発明の抗体をペプシンで分解すると F (ab， ) 2 が得られ、 ノヽ' パインで分解すると Fabが得られる。 F (ab， ) 2を 2—メルカプトェ夕ノ —ルなどの試薬で還元して、 モノョ一ド酢酸でアルキル化すると F ab， が得ら れる。 Fvは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた一価の抗体 活性フラグメントである。
これらの活性フラグメントを保持し、 その他の部分を他の動物のフラグメント に置換することでキメラ抗体が得られる。
本発明の抗体は、 1 (3) mbtの発現等の機能の解明や悪性腫瘍の形成機 構の解明のために使用可能である。
1 (3) mbtの検出については、 抗体を用いる方法、 酵素反応を利用する 方法が挙げられる。
抗体を用いる方法としては具体的には、 ①標識された 1 (3) mbt抗体を用 いて 1 (3) mbtを検出する方法、 1 (3) mb t抗体および該抗体の標識 二次抗体を用いて 1 (3) mbtを検出する方法が挙げられる。 標識としては、 例えば放射性同位元素 （RI)、 酵素、 アビジン又はビォチン、 もしくは蛍光物 質 （F I T Cやローダミン等） が利用される。
酵素反応を利用する方法としては、 例えば、 EL I SA法、 免疫凝集法、 ゥ エスタンプロット法、 フローサイ トメ トリーを用いた免疫反応分子の同定方法又 はそれらに類似する方法が挙げられる。
以下に実施例を挙げて、 より詳細に本発明を説明するが、 本発明は以下の実施 例に限定されるものではない。
<実施例 1> h— 1 (3) mbt遺伝子の単離および塩基配列の決定 1. E S Tデ一夕ベースの検索
イン夕一ネットの E S Tデ一夕ベース （mRN Aの断片の配列を登録してある デ一夕べ一ス、 h t t p： / / www. ncbi. n 1 m. nin. ov. / i html) に登録された配列 （EST) から、 ショウジヨウバエの 1 (3) mb t遺伝子とホモロジ一のある配列を探索したところ、 H 23073として登 録されている配列がヒッ卜した。
2. プライマ一の合成
ヒト cDN Aライブラリ一から、 上記の H 23073の塩基配列の一部の塩基 配列からなる DN Aフラグメントを取得するために以下のブライマーを合成した c 5， プライマーとして P 1プライマー 5， -CCATCAAAGT GCAGGCGTAG G- 3， （配 列表の配列番号 20に記載の塩基配列） 、 3' プライマ一として P 2プライマ一
5' -TAGCCACATA CCTCAGCCAC G- 3， （配列表の配列番号 2 1に記載の塩基配列） を設計し、 DNA合成機 （AB I社製、 モデル 392) にて合成した。 合成した プライマ一は、 蒸留水で 2 O pmo に調製した。 これを P C Rプライマ —として用いて、 以下の P CR操作を行った。
3. P CR ( 1)
c DN Aライプラリーには、 ヒト胎児脳の cDNAライブラリ一 （クロ一ンテ ック社製） を用い、 以下の条件で P CRを行った。
プライマ一として P 2プライマ一のみを使用し、 5' 方向への一方向のみの
P CRを行った。 PCR操作は、 以下の組成からなる液を試験管に入れ、 その上 にミネラルオイルを 1 5〃 1重層し、 94 °Cで 5分間放置した。
cDNAライブラリ一 （ l〃g/〃 l) 2〃 1
dNTP混合液 （各 NTPを 20 pmo 1 /〃 1にて蒸留水中に溶解）
1 JLL 1
P 2プライマ一 （20 pmo 1/〃 1) Ιμ.1
10倍濃度の P CR緩衝液 （400 mM T r i s -HC 1 (pH8. 3) 、 1 M KC Is l O OmM MgCl2、 l O OmM DTT)
Figure imgf000020_0001
蒸留水 9 1
T a qポリメラ一ゼ （5 un i t/ / l) 0. 5 ju 1 合計 15〃 1
その後、 「60°Cで 30秒間、 続いて 72°Cで 1. 5分間、 続いて 94°Cで 3 0秒間のサイクル」 を 50回繰り返して反応を行った。
次いで 55°Cで 2分間、 最後に 72°Cで 10分間反応させて、 断片の伸長反 応を行い P CR操作を完了した。
その後、 上記で得た PCR産物を錶型として、 P 1プライマ一を用いて 2度目 の PCR操作を行った。 2度目の PCR操作は、 以下の組成からなる液を試験管 に入れ、 その上にミネラルオイルを 20〃1重層し、 94 °Cで 5分間放置した。 上記で得た PCR産物 （ l〃g/〃l) 5 zl
dNTP混合液 2 zl
P 1プライマー （ 20 pmo 1/〃 1 ) 1 μ.1
10倍濃度の P CR緩衝液 （40 OmM T r i s -HC 1 (pH8. 3) 、 1M KC 1、 10 OmM MgC l2、 100 mM DTT) 2μ. Ι 蒸留水 9. 5 1
Taqポリメラ一ゼ （5un i t s/〃 l) 0. 5〃1
合計 20 1
その後、 「 60 °Cで 30秒間、 続いて 72 °Cで 1分間、 続いて 94 °Cで 30秒 間のサイクル」 を 40回繰り返して反応を行った。
次いで 55°Cで 2分間、 最後に 72 °Cで 10分間反応させて、 断片の伸長反 応を行い P C R操作を完了した。
4. 塩基配列の決定 （ 1 )
上記で得た 5， 伸長反応による DN A断片 （以降、 フラグメント Aというこ とがある） をミニゲル電気泳動 （0. 75%ァガ口一スゲル） させて、 フラグメ ント Aのバンドをゲルから切り出した。 Gene C l ean (バイオ 101社 製） でフラグメント Aを回収して、 ミニゲル電気泳動でバンドをチェックした。 フラグメント Aを 1〃 1取り、 99 / 1の TEにて希釈した。 260 nmでの 吸光度 （A260) を測定し、 DNA濃度を計算した （A 260が 1. 0のとき の DNA濃度を 50〃 1/mlとした。 ） 。 D N A濃度が 1〃 g/〃 1になるよ うに TEでフラグメント Aを希釈した。
この希釈液について、 T 7プライマ一を用いて、 ダイ夕一ミネ一夕一法によ り、 オートシ一クェンサー （八ョ 1モデル373八） を用いて、 DNAシークェ ンスを行い、 フラグメント Aの塩基配列を決定した。 この塩基配列を配列表の配 列番号 9に示す。 5. PCR (2)
3 ' 側への伸長反応を 3. の 5' 側への伸長反応と同様の手法を用いて行つ た。 プライマーは、 5' プライマーとして P 3プライマー 5，- MGCTGTTTG ACCG CATGAA C-3' (配列表の配列番号 22に記載の塩基配列） を、 3' プライマーと して P 4プライマー 5，- MGCACCTGT TTGTGAGCCA G-3' (配列表の配列番号 23 に記載の塩基配列） を設計し、 DNA合成機 （AB I社製、 モデル 392) にて 合成し、 蒸留水で 20 pmo 1/〃 1に調製したものを用いた。
6. 塩基配列の決定 （ 2 )
前記の 3' 伸長反応により得られた DNA断片 （以降、 フラグメンと Bとい うことがある） について、 4. と同様の手法で塩基配列を決定した。 この塩基配 列を配列表の配列番号 10に示す。
7. h- 1 (3) mbt遺伝子の取得
5， プライマ一としてフラグメント Aの一部に相当するセンスプライマー P 5 プライマー 5，-ATGAGGCGM GAGAGGGCCA TG-3' (配列表の配列番号 24に記載の 塩基配列） を、 3， プライマ一としてフラグメント Bの一部に相当するアンチセ ンスプライマ一 P 6プライマ一 5， -GTTAGGATCC TTGCAGTAAA TCAC-3' (配列表 の配列番号 2 5に記載の塩基配列） を DNA合成機 （AB Iモデル 3 9 2) で合 成した。 ヒト胎児脳 cDNAライブラリー （クローンテック社製） を錡型として上記の プライマ一を用いて P CR反応を行った。 以下の組成からなる液を試験管に入れ、 その上にミネラルオイルを 2 0〃 1重層し、 94 °Cで 5分間放置した。
ヒ ト胎児脳 c DNAライブラリ一 （ l〃g/〃 l) 5 1
dNTP混合液 （各 NTPを 20 pmo 1 /〃 1に蒸留水中に溶解） 1〃 1 P 5センスプライマ一 （2 0 pmo 1/〃 1) 1 j 1
P 6アンチセンスプライマー （2 0 pmo 1/〃 1) 1 μ.1
1 0倍濃度の P CR緩衝液 （40 OmM T r i s— HC 1 (pH 8. 3) 、 1 M K C 1、 1 0 OmM MgC l 2、 1 0 OmM D TT) T aqポリメラーゼ （ 5 un i t s/〃 1) 0. 5 1
蒸留水 9. 5 1
合計 2 0〃 1
その後、 「6 0°Cで 3 0秒間、 続いて 7 2°Cで 1分間、 続いて 94 °Cで 3 0秒間のサイクル」 を 40回繰り返して反応を行った。 次いで、 5 5°Cで 2分間、 最後に 7 2°Cで 1 0分間反応させて P CR操作を完了した。
上記の反応後、 P CR産物について、 ミニゲル電気泳動 （0. 7 5%ァガロ —スゲル） を行った。 その結果、 約 2. 4 kbpのバンドが観察された。
上記により h— 1 (3) mb t遺伝子が単離された。
8. 塩基配列の決定 （3)
上記で得た h— 1 (3) mb t遺伝子のバンドをゲルから切り出した。 Ge ne C 1 e an (バイオ 101社製） で h— 1 (3) mb t遺伝子を回収して、 ミニゲル電気泳動でバンドをチェックした。
h- 1 ( 3) mb t遺伝子を 1〃 1取り、 99〃 1の T Eにて希釈した。 2 6 Onmでの吸光度 （A260) を測定し、 DNA濃度を計算した （A260が 1. 0のときの DNA濃度を δΟ^ΐΖπιΙとした。 ） 。 DNA濃度が l /g/ 1になるように TEで h— 1 (3) mbtを希釈した。
この希釈液について、 T 7プライマ一を用いて、 ダイ夕一ミネ一夕一法によ り、 ォ一トシ一クェンサ一 （AB Iモデル 373A) を用いて、 DNAシ一クェ ンスを行い、 h— 1 (3) mb t遺伝子の塩基配列を決定した。 この結果、 h— 1 (3) mb t遺伝子にはォ一夕ナティブスプライスフォームが存在することが 分かった。 短い方をタイプ 1、 長い方をタイプ 2と名付けた。 h— 1 (3) mb tタイプ 1遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号 2に、 h— 1 (3) mbtタイ プ 2遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号 4に示す。 タイプ 2は、 タイプ 1の C 末端近く、 塩基配列でいうと配列番号 2に記載の塩基配列の 2373番目と 23 74番目の間に 118塩基が挿入されている。
前記過程で得られたフラグメント A、 Bの位置関係を図 3に示す。
9. アミノ酸配列の決定
上記の塩基配列より、 h— 1 (3) mbtのアミノ酸配列を決定した。 h— 1 (3) mbtタイプ 1のァミノ酸配列を配列表の配列番号 1に、 h— 1 (3) mbtタイプ 2のァミノ酸配列を配列表の配列番号 3に示す。 タイプ 1とタイプ 2とは 709番目以降のアミノ酸が異なる。
d— 1 (3) mbtと h— 1 (3) mb tのアミノ酸配列を図 2に示す。 図中、 ジンクフィンガードメイン、 mb tリピートおよびプロティンリッチドメイン (SPM) の箇所を枠で囲って示す。 d— 1 (3) mbtと h—l (3) mbt の mb tリピートでの一致率は 43. 7%であり、 mb tリピートにおいて両者 はかなり保存されていることが分かった。 したがって、 mbt— r ep e atは、 この蛋白質が機能を発揮する上で重要な働きをしていると考えられる。
10. 形質転換体の作製
上記の塩基配列からなる全長の h—1 (3) mb tタイプ 1遺伝子を TAク ローニングベクターに挿入し、 該ベクタ一を大腸菌 DH 5ひに導入して形質転換 体を作製した。 この形質転換体を TA— h— 1 (3) mb tと名付け、 平成 9年 7月 9日に、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号、 工業技術院生命工学工業 技術研究所に寄託し （受託番号 FERM P— 16317) 、 さらに、 平成 10 年 7月 13日に国際寄託当局である、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号、 工業技術院生命工学工業技術研究所に移管した （受託番号 FERM BP— 64 18) 。 く実施例 2〉m— 1 (3) mb t遺伝子の単離ならびにその塩基配列および 該遺伝子がコードするァミノ酸配列の決定
1. DN A断片の取得
P 7プライマ一 5，-TGMCTCCTC CTCCTTGTAA CCT-3' (配列表の配列番号 26 に記載の塩基配列） および P 8プライマー 5' -GTCCATGTAC TTCATCCTCA C-35 (配列表の配列番号 27記載の塩基配列） を用いて、 マウス新生仔脳 cDNA (ラムダ ZAP I I) ライブラリーを増幅した。 T 7プライマーを用いて、 ダイ 夕一ミネ一夕一法により、 オートシークェンサ一 （八81モデル373八） を用 いて、 DNAシークェンスを行い、 得られた DNAの塩基配列を決定した。 この 結果、 前記の H 23073の塩基配列の一部に相同性のある塩基配列からなる D NA断片を取得することができた （以降、 この DNA断片をフラグメント Cとい うことがある。 フラグメント Cの塩基配列を配列表の配列番号 1 1に示す。 ） 。 2. プライマーの合成
プライマ一として M 1 3リバ一スプライマー 5， -CAGGAAACAG CTATGAC-3' (ラムダ ZAP I I内にある配列、 配列表の配列番号 28に記載の塩基配列） と P 7プライマ一を設計し、 DNA合成機 （AB I社製、 モデル 392) にて合成 した。 合成したプライマ一は蒸留水で 2 Opmo に調製した。 これを P CRプライマ一として用いて、 以下の P CR操作を行った。
3. P CR ( 1)
cDNAライブラリ一には、 マウス新生仔脳 cDN Aライブラリ一 （クロ一ン テック社製） を用い、 以下の条件で P CRを行った。
PCR操作は、 以下の組成からなる液を試験管に入れ、 その上にミネラルオイ ルを 1 5 1重層し、 94 °Cで 5分間放置した。
マウス新生仔脳 cDN Aライブラリ一 （ l〃g/〃 l)
2 z 1
dNTP混合液 （各 NTPを 20 pmo 1 / / 1に蒸留水中に溶解）
1 JLL 1
M 13リバースプライマ一 （20pmo l/〃 l)
1 /a 1
P 7プライマ一 （20 pmo l/〃l)
1 pi 1
10倍濃度の P CR緩衝液 （400 mM T r i s— HC l (pH8. 3) 、 1 M KC 1、 l O OmM MgC l2、 10 OmM DTT)
1. 5// 1
丁& ポリメラ一ゼ （51111；1七 3/ / 1) 0. 5〃 1
蒸留水 8 j 1
合計 15 1 P / 551 その後、 「6 0°Cで 3 0秒間、 続いて 72°Cで 1. 5分間、 続いて 9 4°Cで 3 0秒間のサイクル」 を 3 0回繰り返して反応を行った。
次いで 5 5°Cで 2分間、 最後に 7 2 °Cで 1 0分間反応させて、 断片の伸長反 応を行い P CR操作を完了した。
その後、 上記で得た P C R産物を鎵型として、 T 3プライマ一 5' -AATTAACCCT
CACTAAAGGG-3' (ラムダ ZAP I I内にある配列、 配列表の配列番号 2 9に記 載の塩基配列） と P 1プライマーを用いて 2度目の P CR操作を行った。 2度目 の P C R操作は、 以下の組成からなる液を試験管に入れ、 その上にミネラルオイ ルを 2 0 1重層し、 9 4°Cで 5分間放置した。
上記で得た P C R産物 （ 1〃 g//JL 1 ) 5〃 1
dNTP混合液 2 1
T 3プライマ一 （20 11101/〃 1) 1 ju 1
P 1プライマ一 （2 ◦ pmo 1) 1 JL 1
1 0倍濃度の P C R緩衝液 （40 0 mM T r i s— HC l (pH 8. 3) 、 1 M K C 1、 1 0 0 mM Mg C l 2、 1 0 0 mM DT T)
2 ju l
T aqポリメラ一ゼ （ 5 un i t s/〃 1) 0. 5〃1
蒸留水 8. 5 z l
合計 2 0〃 1
その後、 「 6 0 °Cで 3 0秒間、 続いて 7 2 °Cで 1分間、 続いて 94 °Cで 3 0秒 間のサイクル」 を 3 5回繰り返して反応を行った。
次いで 5 5°Cで 2分間、 最後に 7 2 °Cで 1 0分間反応させて、 断片の伸長反 応を行い P C R操作を完了した。 4. 塩基配列の決定 （ 1 )
上記で得た 5， 伸長反応による DNA断片 （以降、 フラグメント Dというこ とがある） をミニゲル電気泳動 （0. 75%ァガロースゲル） させて、 フラグメ ント Aのバンドをゲルから切り出した。 GeneCl ean (バイオ 101社 製） でフラグメント Dを回収して、 ミニゲル電気泳動でバンドをチェックした。 フラグメント Dを 1 1取り、 99〃 1の TEにて希釈した。 260 nmでの 吸光度 （A260) を測定し、 DNA濃度を計算した （A260が 1. 0のとき の DNA濃度を 50〃 1/mlとした。 ） 。 D N A濃度が 1〃 1/〃 1になるよ うに TEでフラグメント Dを希釈した。
この希釈液について、 T 3プライマーと P 1プライマ一を用いて、 ダイ夕一ミ ネー夕一法により、 オートシークェンサ一 （AB Iモデル 373 A) を用いて、 DN Aシークェンスを行い、 フラグメント Dの塩基配列を決定した。 この塩基配 列を配列表の配列番号 12に示す。
5. PCR (2)
3' 側への伸長反応を 3. の 5' 側への伸長反応と同様の手法を用いて行つ た。 プライマーは、 1度目の P CRには M 13プライマーと P 8プライマ一を、 2度目の P CRには T 3プライマ一と P 6プライマ一を設計し、 DNA合成機 (AB I社製、 モデル 392) にて合成し、 蒸留水で 2 Opmo 1/〃 1に調製 したものを用いた。 6. 塩基配列の決定 （2)
前記の 3' 伸長反応により得られた DNA断片 （以降、 フラグメンと Eとい うことがある） について、 4. と同様の手法で塩基配列を決定した。 この塩基配 列を配列表の配列番号 13に示す。 7. m- 1 (3) mb t遺伝子の取得
55 プライマ一としてフラグメント Dの一部に相当するセンスプライマ一 P 9 5' -GTTGAAATGC TGGCGTAGTC-3' (配列表の配列番号 30に記載の塩基配列） を、 3， プライマーとしてフラグメント Eの一部に相当するアンチセンスプライマー P 10 5' -CCCAGTCAGT CACTTAAAGA CATC- 3' (配列表の配列番号 31に記載の 塩基配列） を DNA合成機 （AB Iモデル 392) で合成した。
マウス新生仔脳 cDN Aライブラリー （クローンテック社製） を鎵型として上 記のプライマーを用いて P CR反応を行った。 以下の組成からなる液を試験管に 入れ、 その上にミネラルオイルを 20〃 1重層し、 94 °Cで 5分間放置した。 マウス新生仔脳 cDNAライブラリ一 （l〃g/〃l) 5〃1
dNTP混合液 （各 NTPを 20 pmo 1 /〃 1に蒸留水中に溶解）
1 JLL 1
P 9センスプライマ一 （20 pmo 1 j 1
P 10アンチセンスプライマ一 （20 pmo 1/ 1) 1 μ.1
10倍濃度の P CR緩衝液 （40 OmM Tr i s— HC1 ( H 8. 3) 、 1 M KC1、 10 OmM MgCl2、 100 mM DTT)
2μ. Ι
Taqポリメラ一ゼ （5uni t s/〃l) 0. 5〃1
蒸留水 9. 5〃1
合計 20 1
その後、 「60°Cで 30秒間、 続いて 72°Cで 1分間、 続いて 94 °Cで 30 秒間のサイクル」 を 40回繰り返して反応を行った。 次いで、 55°Cで 2分間、 最後に 72°Cで 10分間反応させて PC R操作を完了した。
上記の反応後、 PCR産物について、 ミニゲル電気泳動 （0. 75%ァガロ ースゲル） を行った。 その結果、 約 2. 6 kbpのバンドが観察された。
上記により m— 1 (3) mb t遺伝子が単離された。
8. 塩基配列の決定 （ 3 ) 上記で得た m— 1 (3) mb t遺伝子のバンドをゲルから切り出した。 Ge ne C 1 e an (バイオ 101社製） で m— 1 (3) mb t遺伝子を回収して、 ミ二ゲル電気泳動でバンドをチェックした。
m— 1 (3) mb t遺伝子を 1〃 1取り、 99〃 1の T Eにて希釈した。 2 6 Onmでの吸光度 （A 260) を測定し、 DNA濃度を計算した （A260が 1. 0のときの DNA濃度を 50 /l/mlとした。 ） 。 DNA濃度が 〃 1になるように TEで m— 1 (3) mbtを希釈した。
この希釈液について、 T 7プライマ一を用いて、 ダイ夕一ミネ一夕一法によ り、 ォ一トシ一クェンサ一 （八ョ 1モデル373 ） を用いて、 DNAシークェ ンスを行い、 m— 1 (3) mbtの塩基配列を決定した。 この塩基配列を配列表 の配列番号 6に示す。
また、 前記過程で得られたフラグメント C、 Dおよび Fの位置関係を図 4に 示す。 9. アミノ酸配列の決定
上記の塩基配列より、 m— 1 (3) mb tのアミノ酸配列を決定した。 この ァミノ酸配列を配列表の配列番号 5に示す。
h- 1 (3) mbt遺伝子と m—1 (3) mb t遺伝子のホモロジ一は、 8 7%であり、 h— 1 (3) mbt蛋白質と m—1 (3) mbt蛋白質のホモロジ —は 70%であり、 種間で大変よく保存された蛋白質である。
10. 形質転換体の作製
上記の塩基配列からなる全長の m— 1 (3) mbt遺伝子を T Aクローニン グベクタ—に挿入し、 該ベクターを大腸菌 D H 5ひに導入して形質転換体を作製 した。 <実施例 3 >ラット 1 (3) mbt (r- 1 (3) mbt) 遺伝子の単離な らびにその塩基配列および該遺伝子がコ一ドするアミノ酸配列の決定
前記の実施例 2のマウスの場合と同様にして、 ： r— 1 (3) mb t遺伝子の 単離、 その塩基配列の決定を行った。 以下にその概要を述べる。
1. DN A断片の取得
cDNAライブラリ一は、 キット （GIBC0BRL社製） を使用して自作したラッ ト新生仔脳 cDNAライブラリ一を用いた。 前記 P 8プライマ一と P 1 1プライ マ一 5， - ATCCAGAMT CATAGCCATG ACT- 3， （配列表の配列番号 32に記載の塩基 配列） を用いた PCRにより、 H 23073と相同性の高いプラグメント Fを得 た。 フラグメント Fの配列を配列表の配列番号 14に示す。
2. P CR ( 1 )
5， 方向へのクロ一ニングは、 前記 P 1 1プライマ一と P 12プライマ一 5， -GTTGAAATGC TGGCGTAGTC C-3' (配列表の配列番号 33に記載の塩基配列） を用 いた 1度だけの P CRにより行った。 P CRのサイクル数は 40回とした。 この 結果、 フラグメント Gを得た。 フラグメント Gの配列を配列表の配列番号 1 5に 示す。
3. P CR (2)
3， 方向へのクロ一ニングは、 1度目の P CRを前記 P 8プライマ一のみを 用いてサイクル数を 50回として行い、 2度目の PCRを前記 P 5プライマーと P 13プライマ一 5， -GGCCACGCGT CGACTAGTAC-3' (3' RACEキット （ベー リンガーマンハイム社製） のアダプタ一プライマ一、 配列表の配列番号 34に示 す塩基配列） を用いてサイクル数を 40回として行った。 この結果、 フラグメン ト Hを得た。 フラグメント Hの配列を配列表の配列番号 16に示す。 4. 塩基配列の決定
上記で得たフラグメント F、 Gおよび Hから全長の r— 1 (3) mbt遺伝 子の塩基配列を決定した。 この塩基配列を配列表の配列番号 8に示す。 5. アミノ酸配列の決定
上記の塩基配列より、 r— 1 (3) mb tのアミノ酸配列を決定した。 この ァミノ酸配列を配列表の配列番号 7に示す。
m— 1 (3) mbtと r— 1 (3) mb tのホモロジ一は、 90%以上であ り、 種間で大変よく保存された蛋白質である。 h— 1 (3) mbt、 m— 1 (3) 111131:ぉょび ー1 (3) mbtのアミノ酸配列を図 1に示す。 図中、 m b tリピートの箇所を枠で囲って示す。 3者の間で mbtリピートにおけるアミ ノ酸の一致率は 95. 0%であり、 大変よく保存されていることが分かった。 し たがって、 mbtリピートは、 この蛋白質が機能を発揮する上で重要な働きをし ていると考えられる。
<実施例 4>h— 1 (3) mb tの各組織における発現
ヒトの各組織のポリ A + RNA (mRNA) およびヒトの各種細胞のポリ A + RNA (mRNA) それぞれについて、 各 2〃 gをブロットしたメンプレン (Human Tis sue Northern B lot I、 同 I Iおよび Human Cel l Line Mult iple Ti ssue Nort hern Bl ot (クローンテック社製） ） に、 標識化した全長の h— 1 ( 3 ) mb tタイプ 1遺伝子を、 M o 1 e c u 1 a r Clonin A L aborat ory Manual Second Ed i t ion 7. 39 ページないし 7. 52ページの記載にしたがってハイブリダィズさせ、 ノーザン ブロヅトハイブリダィゼ一シヨン法による解析を行った。
h— 1 (3) mbt遺伝子の標識化は以下の操作により行った。 1) Takara MEGA LAB ELキット （登録商標、 宝酒造社製） を用いて取扱説明書の通りに標識した。
2) 次に、 下記の組成の DN A反応液を調製し、 この液を 37°Cで 30分間 インキュベートした後、 70°Cで 10分間熱処理し、 酵素を失活させた。
DNAプローブ （ 2 pmo 1 ) 2 μ.\
10倍ホスホラィレイシヨン緩衝液 2〃1
〔ァ一32 Ρ〕 ΑΤΡ (37 OMBq/ml) (アマシャム製）
T 4 ポリヌクレオチドキナーゼ 1 a 1
合計 10〃 1
3) T 50 E (5 OmM T r i s -C 1 pH8. 0, 1 mM ED T A) で平衡化された SephadexG— 25 (登録商標、 フアルマシア社製） を 1. 5mlポリプレップカラム （バイオラッド社製） にベッ ドボリュームが 1 mlになるように詰め、 2) で熱処理をした DNA反応液を該カラムに載せた。
4) その後、 200〃 1 T 50 Eをカラムに 4回流し、 2回目の 200〃1 で溶出した画分から標識化 DN Aプローブを得た。
各組織についての結果の写真を、 図 5ないし図 7に示す。 写真より、 h— 1 (3) mbt (5. 5kbのバンド） が全ての組織で発現していることが分か つた。
各種細胞についての結果の写真を図 8に示す。 写真より、 SW480を除く 全ての細胞に発現が認められた。 く実施例 5>h— 1 (3) mb t遺伝子のォ一夕ナティブスプライスフォー ムの発現
h- 1 (3) mbtタイプ 1遺伝子および同タイプ 2遺伝子の発現割合につい て RT— P CRで解析した。
ヒト正常白血球 （7名のボランティア） ならびに癌細胞株 （U2 OS、 T 98 G、 RBR 17 Tおよび U251) の mRNAを、 前記 P 5プライマ一および P 6プライマーを用いて RT— PC Rを行った後、 P CR産物を電気泳動した。 こ の結果を、 図 9に示す。 図 9の上段はヒトについての結果を示し、 各レーンのァ ルフアベットは各ボランティアを識別するためのものである。 上のバンドがタイ プ 2のバンドであり、 下のバンドがタイプ 1のバンドである。 図から 5名のヒト 正常白血球ならびに癌細胞株ではタイプ 2が優位に発現していた。 そして、 1名 のヒト正常白血球ではタイプ 1が優位に発現していた。 他の 1名のヒト正常白血 球については、 ややタイプ 1の発現が優位であった。 く実施例 6>組み換え h— 1 (3) mbt蛋白質の作製 （1)
全長の h_l (3) mb t遺伝子タイプ 1を p CGNベクタ一および pB J — My cベクタ一に挿入し、 該ベクターをそれぞれ COS細胞に導入して形質転 換体を作製した。 以下の操作はそれぞれについて同じである。
この形質転換体を 1 X 106個に、 50 mM Tr i s— HC1、 15 OmM NaCl、 1 T r i t o n X— 100、 50 mMョードアセトアミ ド、 2 mM MgCl2、 2mM CaCl2、 0. 1 % NaN3、 10〃g/ml大 豆トリプシンインヒビ夕一、 l /g/mlァプロチニン、 ImM PMS F (フ ェニルメチルスルホニルフロライ ド） 、 1〃g/mlロイぺプチンからなる組成 の細胞溶解液 100〃 1を、 加えてよく攪拌して溶解した。 氷上に 60分間放置 した後、 15, 000 r pmで 10分間遠心分離し、 上清液を回収した。
回収した上清液に、 免疫していないゥサギの I gG lmgを結合させた C NB r活性化セファロ一スビーズ （フアルマシア社製） （抗体濃度 lmg/ml 樹脂） 50mlを添加した。 4°Cで一晩反応後、 遠心分離を行い、 ビーズに結合 する非特異的結合蛋白質を除去し、 上清を回収した。 この上清 10〃1を、 等量の SD S— PAGE用サンプルバッファ一および 1 〃 1の 2—メルカプトエタノール （2ME) と混和し、 95°Cで熱処理を 5分間 行った。 その後、 5— 20%のグラディエントゲルで電気泳動した。
電気泳動後、 ゲルをクマシ一染色した。 その結果、 約 12 O kDの位置にバン ドが観察され、 組み換え h— l (3) mbtが作製されたことが確認された。 なお、 h— l (3) mb tの計算上の分子量は 86 kDであるが、 組み換え h — 1 (3) mb tの分子量は約 1 20 kDであった。 く実施例 7 > h— l (3) mb tを認識する抗体の作製 （ 1)
1. 抗原の作製
配列表の配列番号 1に記載の h— 1 (3) mb tのアミノ酸配列の 6 1 7位 から 63 5位までのアミノ酸配列の N末端にシスティン （C) を付加したァミノ 酸配列である下記のアミノ酸配列 A (配列表の配列番号 1 7に記載の配列） およ び配列表の配列番号 1に記載の h— 1 (3) mb tのァミノ酸配列の 148位か ら 1 67位までのアミノ酸配列の N末端にシスティン （C) を付加したアミノ酸 配列である下記のアミノ酸配列 B (配列表の配列番号 18に記載の配列） からな るペプチドをそれぞれ合成した。 システィンの付加はスカシ貝へモシァニン （K HL) と結合させるために付加した。 合成は岩城硝子 （株） に委託した。
配列 A ： CGR I GRPPKYRK I PQEDFQT
配列 B : CMKKRKRREYQSP SEEE SEPE
合成したペプチド 2mgをマレイミ ド化 KLH (ピアス社製） 2mgに結合 させた。 反応はピアス社のキットの説明書に記載の方法にしたがった。
2. 免疫
配列 Aからなる抗原、 配列 Bからなる抗原について、 それぞれ抗原液 ( 1 jug
/ml) 100 i l PB S 0. 5 m 1を及びフロイントコンプリートアジュ バンド （ディフコ社製） 0. 5mlをシリンジに取り、 混合してェマルジヨンと し、 ゥサギの背に 4箇所に分けて皮下接種した。
1週間後、 2回目の免疫を行った。 2回目からはアジュバンドをフロイントイ ンコンプリートアジュバンド （ディフコ社製） に変えて免疫を行った。 その他の 操作は 1回目と同様である。 2回目以降は 1週間間隔を開けて、 合計 6回免疫を 打った。
3. 抗体の精製
最終免疫の 1週間後、 採血した。 この血液を室温で 3時間静置し、 十分に血液 凝固を行った後、 3， 000 rpmで 5分間遠心分離を行い、 上清 （血清） を回 収した。
この血清に飽和硫安を最終濃度が 50%になるように加えて塩析した。 この サンプルを遠心分離して、 抗体が含まれる画分を沈殿させた。 その後、 沈殿物を PBSに溶解し、 さらに PB Sに対して塩祈した。
その後、 プロテイン Gセファロースカラム （フアルマシア社製） を用いて、 抗 体をァフィ二ティー精製した。 その結果、 全量で 5 m gのペプチド特異的抗体が 得られた。
<実施例 8>h— 1 (3) mbtを認識する抗体の作製 （2)
1. 抗原の作製
GS T遺伝子を組み込んだベクタ一 pGEX— 2 TH (図 10参照） に配列 表の配列番号 2に記載の h— 1 (3) mbt遺伝子を挿入し、 該ベクターを大腸 菌 DH 5ひに導入して形質転換体を作製した。 該形質転換体に h— 1 (3) mb tの N末端に GSTを結合させた GST— h— 1 (3) mb tを作製させた。 実 施例 4と同様にして GST結合組み換え h— 1 (3) mbtを精製した。
作製したペプチド 2mgをマレイミ ド化 KLH (ピアス社製） 2mgに結合 させた。 反応はピアス社のキットの説明書に記載の方法にしたがった。 TJP /03551
2. 免疫
実施例 6と同様にして、 抗原液 （l〃g/ml) 100〃1、 PBS 0. 5 mlを及びフロイントコンプリートアジュバンド （ディフコ社製） 0. 5 mlを シリンジに取り、 混合してェマルジヨンとし、 ゥサギの背に免疫した。
3. 抗体の精製
実施例 6と同様にして、 ゥサギの血液から抗体を精製した。 <実施例 9>h— 1 (3) mbt抗体の反応性の確認
実施例 6と同様にして、 COS細胞に h—l (3) mbt蛋白質を作製させ、 該蛋白質を SD S— PAGE電気泳動した。 電気泳動したゲルをトランスプロッ トシステム （マリソル社製） を用い、 泳動された蛋白質をニトロセルロースメン プレンに転写した。
ニトロセルロースメンブレンをブロックエース （大日本製薬社製） に浸し、 1 時間静置してブロッキングした。 その後、 0. 05 %Twe e n 20/PB Sで
5分間、 2回洗浄した。
実施例 6または 7で作製した抗体それぞれについて以下の操作でウエスタン プロヅト法により反応性を確認した。 1 g/m 1になるように P B Sで希釈し たものを、 メンブレンに加え、 室温で 2時間反応させた。 その後、 メンブレンを
0. 05%Twe e n 20/PB Sで 5分間 x 3回洗浄した。
ペルォキシダ一ゼ標識化ゥサギ I gG溶液 （カルタグ社製） を PBSで 10
00倍に希釈した液を、 上記メンブレンに加え、 さらに 1時間室温にて反応させ た。 その後、 0. 05%Tween20/PBSで 5分間 X 3回洗浄した。
ECLキット （アマシャム社製） の発色液 5mlをメンブレンに加えて 1分間 反応させた。 その後、 このメンブレンを X線フィルムに 20秒間露光して現像し た。 結果を図 1 1ないし 13に示す。 この結果、 いずれの抗体を反応させても、 1 20 kDの位置にバンドが観察され、 抗体が h— 1 (3) mb tを認識するこ とが確認された。 <実施例 10 >抗体の力価の測定
実施例 6で作製した配列 Bのァミノ酸配列からなるペプチドを抗原としてゥ サギに免疫して得られた抗体 （以降、 抗体 Bということがある） の力価を EL I S A法にて測定した。
1. 抗原の作製
配列 Bのアミノ酸配列からなるペプチドを 25〃 g/mlの濃度となるよう に PB Sに溶解して、 96ゥエル E L I S Aプレート （キセノバインド （Xen ob i nd) 、 キセノポア社製） の各ゥエルに 50〃 1ずつ分注し、 4°Cで一晩 静置した。
抗原液を捨て、 蒸留水で 4倍に希釈したブロックエース （大日本製薬社製） を 各ゥエルに 200 / 1ずつ分注し、 室温で 2時間静置してブロッキングを行った c
2. —次抗体反応
ブロッキング液を捨て、 一次抗体として抗体 Bを添加した。 抗体 Bは、 プレ —卜の 1列目から順に、 1 0〃g/ml、 5 g/ml、 2. 5jug/m
1、 · · ·、 0. 005の濃度になるように PB Sで倍々希釈した液を、 各ゥェ ルに 50 / 1ずつ分注し、 室温で 1時間静置して反応させた。 コントロールには、 免疫していないゥサギの血液から精製した I gGを用いた。
3. 二次抗体反応
反応後、 抗体液を捨て、 0. 05%Twe e n 20/PB Sでプレートを 4 回洗浄し、 次いで二次抗体として PB Sで 1000倍希釈したピオチン化抗ゥサ ギ I gG抗体 （ベクタ一社製） を各ゥエルに 50〃1ずつ分注し、 室温で 1時間 静置した。
4. 発色反応
二次抗体を捨てた後、 0. 05%Twe en20 PBSでプレートを 4回 洗浄し、 OPD (オルトフエ二レンジァミン） 一 H 202/PCBを各ゥエルに 100〃 1ずつ分注した。 十分に発色後、 2 Nの硫酸で反応を止めた後、 490 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダ一 （バイオラッド社製） にて測定した c 測定した吸光度をグラフにして図 14に示す。 図中、 横軸は加えた抗体の濃度 または血清の希釈倍率を表しており、 縦軸は 490 nmにおける吸光度を表して いる。 図から抗体 Bの力価はコントロールに比べて高いことが分かった。
<実施例 11>組織染色
抗体 Bを用いて、 h— 1 (3) mb tタイプ 1が発現している T 98 G— MG 細胞 （悪性グリオ一マ細胞株） における h— 1 (3) mbtの発現状態を免疫組 織染色により検討した。
細胞をラプチエックチヤンバ一ズスライ ド中で培養した。
次いで、 スライ ド培養した細胞を 3. 7%ホルムアルデヒドで 3分間処理した 後、 — 20°Cで冷却したメタノールで 3分間処理を行い固定した。 その後、 スラ イ ドを 50mM Tr i s-HCl (pH7. 5 ) で 5分間ずつ 3回洗浄した。
次いで、 ブロックエース （大日本製薬社製） をスライ ドグラス上の組織に載 せ、 室温で 1時間静置してブロッキングを行った。 その後、 スライ ドを 50 mM Tr i s-HCl (pH7. 5) で 5分間ずつ 3回洗浄した。
抗体 Bを 1 g/m 1になるように P B Sで希釈した抗体液をスラィ ド上の細 胞に滴下し、 室温で 1時間反応させた。 その後、 スライ ドを 50 mM Tr i s -HC 1 (pH7. 5) で 5分間、 3回洗浄した。 PB Sで 1000倍に希釈した F I T C標識化抗ゥサギ I gG抗体液 （カル タグ社製） をスライ ド上の細胞に加え、 室温で 1時間反応させた。 その後、 スラ イ ドを 50mM T r i s -HC 1 (pH7. 5) で 5分間、 3回洗浄した。 発色後、 スライ ドを蛍光顕微鏡で観察した。 この顕微鏡写真を図 15に示す。 図 15より、 細胞内の核が染まっており、 しかも核のなかでも核クロマチンが染 まっていることが分かった。 これより 1 (3) mbtは核に存在する蛋白質であ り、 しかも核において偏在している蛋白質であることが分かった。
<実施例 12>組み換え h— 1 (3) mbt蛋白質の組織染色
全長の h— 1 (3) mbtタイプ 2遺伝子を pBJ— My cベクターに揷入 し、 該ベクターを VA 13細胞に導入して形質転換体を作製した。 また、 タイプ 1遺伝子についても VA 13細胞に導入した。 これらの形質転換体に、 組み換え 蛋白質を発現させた。 細胞内の核 DNAを P Iで、 細胞内の組み換え蛋白質を F I TCで組織染色した。
図 16Aは h— 1 (3) mbtタイプ 1を発現させた細胞内の核 DNAを P
I染色した結果を、 図 16Bは同細胞内の h— 1 (3) mbtタイプ 1を染色し た結果を示す顕微鏡写真である。 図 16Cは、 細胞内の核 DNAと h— 1 (3) mb tタイプ 1とを同時に観察した結果を示す顕微鏡写真である。
図 17八は11—1 (3) mbtタイプ 2を発現させた細胞内の核 DN Aを P I染色した結果を、 図 17Bは同細胞内の h— 1 (3) mbtタイプ 2を染色し た結果を示す顕微鏡写真である。 図 17Cは、 細胞内の核 DNAと h— 1 (3) mbtタイプ 2とを同時に観察した結果を示す顕微鏡写真である。 図 18 Aは、 U20S細胞の核 DNAを PI染色した結果を、 図 18Bは、 U2 OS細胞の細 胞内の h— 1 (3) mbtを染色した結果を示す顕微鏡写真である。 図 18Cは、 細胞内の核 DNAと h— 1 (3) mbtとを同時に観察した結果を示す顕微鏡写 真である。 これらの図から、 h— 1 (3) mbtタイプ 2は、 タイプ 1に比べて、 より 凝集した核 DN Aに沿って発現することが分かった。
<実施例 13 >染色体マッピング
h-1 (3) mb tの全長遺伝子の染色体マッピングを行った。 h— 1 (3) mb tの遺伝子の一部をプローブとした F I SHおよび P CR法に基づいた r a d iat ion hybr id (リサ一チジエネテイクス社製） のいずれの解析 法においても結果は一致し、 染色体 20q l 1に位置づけられた。 く実施例 14>m— 1 (3) mb tの各組織における発現
マウス 1 (3) mb t遺伝子の発現について、 マウス （成体） の各組織のポ リ A + RNA (mRNA) およびマウス胎児のポリ A + RN A (mRNA) それ ぞれについて、 各 2 gをブロットしたメンブレン （Mous e Ti s sue Northern Blot (クロ一ンテック社製） ） ならびに標識化した全 長の m—l (3) mbt遺伝子を用いて、 実施例 4と同様してノーザンプロット ハイブリダイゼ一ション法による解析を行った。 マウス成体各組織についての結果の写真を、 図 19に示す。 写真より、 m— 1 (3) mbt (6. 3kbのバンド） を心筋および骨格筋特異的に認めた。 マウス胎児についての結果の写真を図 20に示す。 写真より、 胎児では、 体性 5日頃から筋特異的 b—ァクチンの発現と並行して 6. 3 kbのバンドの発現を 認めた。 く実施例 15 >組み換え m—l (3) mbt蛋白質の作製
実施例 6と同様にして、 COS細胞に m—l (3) mbt遺伝子を導入し、 形質転換体を作製し、 該形質転換体に組み換え m— 1 (3) mbtを作製させた c -
<実施例 16 >m- 1 (3) mb tを認識する抗体の作製
配列表の配列番号 7に記載の m_ 1 (3) mb tのアミノ酸配列の C末端部 分である 804位から 826位までのアミノ酸配列の N末端にシスティン （C) を付加したアミノ酸配列である下記のアミノ酸配列 C (配列表の配列番号 19に 記載の配列） からなるペプチドをそれぞれ合成し、 実施例 8と同様にして、 m— 1 (3) mbtを認識する抗体を作製した。
配列 C： KLGPALKIYNAILMFKNNDDVFK <実施例 17>m— 1 (3) mbt抗体の反応性の確認
実施例 10と同様にして、 COS細胞に作製させた m—l (3) mbt蛋白 質を SD S— PAGE電気泳動した。 電気泳動したゲルをトランスブロットシス テム （マリソル社製） を用い、 泳動された蛋白質をニトロセルロースメンプレン に転写した。
ニトロセルロースメンプレンをブロックエース （大日本製薬社製） に浸し、 1 時間静置してブロッキングした。 その後、 0. 05%Twe e n20/PB Sで 5分間、 2回洗浄した。
実施例 16で作製した抗体および抗 My c抗体それぞれについて実施例 9と 同様にして、 ウエスタンブロヅトハイブリダィゼ一シヨン法により反応性を確認 した。
この結果を図 21示す。 図から分かるように、 抗体を反応させた結果、 ヒトと ほぼ同様のサイズ （120kDの位置） にバンドが観察され、 実施例 16で作製 した抗体が m—l (3) mbtを認識することが確認された。 <実施例 18>m— 1 (3) mbtの組織染色
マウス細胞株 SWI SS 3T3を、 実施例 16で作製した抗体により、 実 施例 12と同様にして、 組織染色した。
結果の写真を図 22 A— Dに示す。 図 22 Aは、 細胞の顕微鏡写真である。 図 22Bは、 同細胞中の m— 1 (3) mb tを染色した結果である。 図 22 Cは、 同細胞中の DNAを P Iで染色した結果である。 図 22Dは、 図 22Aと図 22 Bとを重ねた結果である。 図から分かるように、 核クロマチンが染色された。
<実施例 19 > 1 (3) mbt遺伝子の発現がもたらす細胞形質変化 〇 6/ 0 ？系にょり 1 (3) mbtを発現させて、 細胞形態の変化を観 察した。 Cr e/LoxP系については、 東京大学医科学研究所遺伝子解析施設 のイン夕一ネットのホームページ (h t t p ： / /www. ims. u - t o k y o . a c . j p/ i d e n s h i/h pma i n. html) からも情報が得 られる。
◦ N/OFF発現用カセッ トプラスミ ド pCALNLw (東京大学医科学研 究所遺伝子解析施設から譲受した） に] —1 (3) mbtタイプ 1 cDNAおよ びタイプ 2 c DNAをそれぞれ組み込み、 それぞれ h— 1 (3) mbtの発現が 認められない VA13および U 25 1細胞株に導入して安定発現株を得た。 この 細胞株に対して C r eリコンピナ一ゼ発現アデノウィルスを感染させ、 細胞形態 の変化を観察した。 その結果、 2種の細胞株ならびにタイプ 1およびタイプ 2の いずれでも多核細胞の出現が認められた。
この結果から、 1 (3) mb t遺伝子および 1 (3) mb tは細胞分裂に関 与しており、 1 (3) mb tの発現が癌化における重要な過程であることが分か つた。
産業上の利用可能性
本発明の 1 (3) mbt、 その遺伝子または 1 (3) mb tを認識する抗体 は悪性腫瘍の形成の機序解析に有効である。
また、 1 (3) mbt遺伝子および 1 (3) mbtは、 核内での転写および 細胞分裂に関与する物質である。

Claims

請求の範囲
1. 配列表の配列番号 1、 3、 5または 7のいずれかに記載のァミノ 酸配列を少なくとも有するァミノ酸配列からなる蛋白質。
2. 配列表の配列番号 1、 3、 5または 7に記載のアミノ酸配列にお ける一または複数のアミノ酸配列を置換、 欠失または付加してなるアミノ酸配列 からなる蛋白質。
3. 請求項 1または 2に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
4. 請求項 3に記載のポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列 からなるアンチセンスポリヌクレオチドまたは該アンチセンスポリヌクレオチド の誘導体。
5. 請求項 3に記載のポリヌクレオチドまたは請求項 4に記載のァン チセンスポリヌクレオチドのうちの一部であって、 連続する 12塩基以上からな るポリヌクレオチド。
6. 化学修飾された請求項 3ないし 5のいずれか一項に記載のポリ ヌクレオチド。
7. 配列表の配列番号 2、 4、 6または 8のいずれかに記載の塩基 配列からなる D N Aのホモログである c D N Aを取得する方法であって、 請求項 4ないし 6のいずれかに記載のポリヌクレオチドをプロ一ブとして、 cDNAラ ィブラリ一から該プローブとしたポリヌクレオチドとハイプリダイズする c D N Aを取得する方法。
8. プローブとするポリヌクレオチドが、 配列表の配列番号 2に記載 の塩基配列の 865番目の Tから 1809番目の Cまでの部分の塩基配列からな る DNA、 配列表の配列番号 6に記載の塩基配列の 1062番目の Tから 200 6番目の Cまでの部分の塩基配列からなる DNAまたは配列表の配列番号 8に記 載の塩基配列の 861番目の丁から 1805番目の Cまでの部分の塩基配列から なる DN Aのいずれかである請求項 7に記載の cDN Aを取得する方法。
9. 配列表の配列番号 2、 4、 6または 8のいずれかに記載の塩基配 列からなる DN Aのホモログであって、 請求項 7または 8に記載の方法によって 取得される cDNA。
10. 請求項 1に記載の蛋白質のホモログであって、 請求項 9に記 載の cDNAがコ一ドするアミノ酸配列からなる蛋白質。
11. 請求項 1、 2または 10のいずれか一項に記載の蛋白質を認
BB ¾ る几体。
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GATEFF E., LOEFFLER T., WISMAR J.: "A TEMPERATURE-SENSITIVE BRAIN TUMOR SUPPRESSOR MUTATION OF DROSOPHILA MELANOGASTER: DEVELOPMENTAL STUDIES AND MOLECULAR LOCALIZATION OF THE GENE.", MECHANISMS OF DEVELOPMENT., ELSEVIER SCIENCE IRELAND LTD., IE, vol. 41., 1 January 1993 (1993-01-01), IE, pages 15 - 31., XP002915043, ISSN: 0925-4773, DOI: 10.1016/0925-4773(93)90052-Y *
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WISMAR J., ET AL.: "THE DROSOPHILA MELANOGASTER TUMOR SUPPRESSOR GENE LETHAL(3) MALIGNANT BRAIN TUMOR ENCODES A PROLINE-RICH PROTEIN WITH A NOVEL ZINC FINGER.", MECHANISMS OF DEVELOPMENT., ELSEVIER SCIENCE IRELAND LTD., IE, vol. 53., 1 January 1995 (1995-01-01), IE, pages 141 - 154., XP002915042, ISSN: 0925-4773, DOI: 10.1016/0925-4773(95)00431-9 *

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