WO1999031254A1

WO1999031254A1 - Genes de geranyl diphosphate synthase

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Publication number: WO1999031254A1
Application number: PCT/JP1998/005590
Authority: WO
Inventors: Chikara Ohto; Keishi Narita; Tokuzo Nishino; Shin-Ichi Ohnuma
Original assignee: Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-10
Publication date: 1999-06-24
Also published as: JPH11169178A; JP3562280B2; CA2281206C; EP0974661A4; CN1252838A; EP0974661A1; CA2281206A1; US6395525B2; KR20000071073A; US20010051359A1; CN1130460C

Description

明細書ゲラニルニリン酸合成酵素遺伝子技術分野

本発明は、ゲラニルニリン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えべクタ一、並びにゲラニルニリン酸合成酵素及びゲラニルニリン酸の製造方法に関する。背景技術

生体内で重要な機能を持つ物質のうち、イソプレン（i soprene ： 2-メチル- 1，3-ブタジエン）を構成単位として生合成される物質は数多い。これらの化合物はイソプレノイド（i soprenoid) 、テルぺノイド（terpenoid) 又はテルペン (terpene) とも呼ばれ、炭素数によりへミテルペン（hemi terpene, C5) 、モノテノレペン mono terpene, CIO) 、セスキテソレペン sesqui terpene, C15) 、ンテルペン（di terpene, C20) 、セスタテルペン（sesterterpene, C25) 、トリテルペン（tri terpene, C30) 、テトラテルペン（tetraterpene, C40) などに分類される。

これらの物質の実際の生合成は、活性型イソプレン単位であるイソペンテニル二リン酸（IPP : isopentenyl diphosphate) が合成されるところから始まる。架空の前駆体物質として提唱されたイソプレン単位の真の姿は、結局、活性型イソプレン単位といわれる IPPである。

IPPの異性体であるジメチルァリル二リン酸（DMAPP : dimethylal lyl diphosphate) は、 IPPとの縮合反応によってゲラニルニリン酸（GPP: geranyl diphosphate) 、ネリルニリン酸（neryl diphosphate) 、フアルネシル二リン酸 ( FPP : farnesyl diphosphate) 、ゲラニルゲラニルニリン酸（GGPP : geranyl geranyl diphosphate ) 、ゲラニルフアルネシル二リン酸（GFPP: geranyl farnesyl diphosphate ) 、へキサプレニノレ二リン酸 ( HexPP : hexaprenyl diphosphate) 、へフタプレニノレニリン酸 (HepPP : heptaprenyl d iphosphate) などの鎖状活性型ィソプレノイドに合成されることが知られている。

FPPや GGPPなどでは全トランス型（aU- £¾) が活性型と考えられるが、 c/s縮合反応することによって天然ゴム、ドリコール ·パクトプレノール（ゥンデカプレノール）、あるいは植物で見出される各種ポリプレノール等が合成される。これらの化合物は、分子内に持つピロリン酸と炭素骨格とのリン酸エステル結合ェネルギ一を用いて縮合反応が進行することによリ合成されるものと考えられ、反応副産物としてピロリン酸が生成すると考えられている。

ァリル性（allylic) 基質である DMAPP、 GPP、 FPP、 GGPP, GFPPなどに IPPを順次縮合していく活性型イソプレノィド合成酵素は、プレニルニリン酸合成酵素又はプレニルトランスフェラ一ゼど呼ばれている。プレニルニリン酸合成酵素は、主要反応産物の炭素数の違いにより名称を区別している。例えば、炭素数 15個のフアルネシルニリン酸の生成を触媒する酵素はフアルネシルニリン酸合成酵素 (FPP synthase) と呼ばれ、炭素数 20個のゲラニルゲラニルニリン酸の生成を触媒する酵素はゲラニルゲラニルニリン酸合成酵素（GGPP synthase) と呼ばれる。すでに、バクテリア、ァ一キア（archaea) 、真菌、植物、動物から各種ブレ二ルニリン酸合成酵素遺伝子が得られており、フアルネシルニリン酸合成酵素、ゲラニルゲラニルニリン酸合成酵素、へキサプレニルニリン酸合成酵素、ヘプタプレニルニリン酸合成酵素、ォクタプレニルニリン酸合成酵素、ノナブレニルニリン酸合成酵素（ソラネシル二リン酸合成酵素）、ゥンデカブレニルニリン酸合成酵素などについて、酵素の精製、活性測定及び遺伝子クロ一ニング ·塩基配列決定が報告されている。

産業的にも生命科学的にも重要かつ多岐にわたる化合物合成の根本をなすこれらプレニルニリン酸合成酵素は、一般的に不安定であり比活性も低く、工業的に利用することが期待できなかった。ところ力ここ数年、好熱性のバクテリアやァ一キアから耐熱性の FPP合成酵素や GGPP合成酵素遺伝子が単離され [ に Chen and D. Poulter (1993), J Biol Chem, 268(15), 11002-11007; T. Koyama et al.

(1993) , J. Biochem. (Tokyo), 113(3), 355-363; S.-i. Ohnuraa et al.

(1994) J. Biol. Chem. , 269(20), 14792-14797]、プレニルニリン酸合成酵素を利用するための条件が整つてきた。炭素数 10〜25のプレニルニリン酸を合成する酵素はホモダイマ一であリ、 in vitroで反応させるのは比較的容易でその報告例も多い。その中でも炭素数 10のプレニルニリン酸である GPPを特異的に合成する活性をもつ酵素は、部分精製の報告はあるが (L.Heide and U.Berger, 1989, Arch Biochem Biophys, 273(2)， 331-8) 単離されていない。豚の肝臓から GPP合成酵素の精製に成功したとして報告されている力' ( J.K.Dorsey et aし， 1966, J Biol Chem, 241(22)， 5353- 5360. ) 、この酵素は FPPの合成も同時に触媒してしまうため、現在のプレニルニリン酸合成酵素の定義からは FPP合成酵素と呼ぶベきものである。

GPPは、知られている多くのモノテルペンのうち、最初の合成中間体であり、モノテルペンの生合成経路で最も重要な化合物である。

モノテルペンの代表的な物質であるゲラニオール及びその異性体ネロールはいずれも薔薇油主成分の香料であり、楠抽出物の樟脳は、防虫剤としても利用されている。

しかしながら、 GPP合成酵素遺伝子はいまだに単離されていない。

そこで、好熱性生物由来の安定で比活性の高いホモダイマ一型のプレニルニリン酸合成酵素のアミノ酸配列を人工的に改変し、 GPPの合成反応を特異的に触媒するホモダイマ一型耐熱性プレニルニリン酸合成酵素を人工的に作リ出す技術が要求されている。

好熱性生物由来のプレニルニリン酸合成酵素としては、これまでに、バシルス .ステアロザーモフィラス Bacillus stearothermophilus) 由来の FPP合成酵素とスルフォロバス ' ァシドカルダリウス（ Sulfolobus acidocaldarius) の GGPP合成酵素で改変された例がある。 5. ac/i/oca/ r/usの GGPP合成酵素の変異型酵素とその遺伝子は、 HexPP合成酵素活性欠損の出芽酵母サッカロミセス ·セレピシェ（ Saccha醒 yces serevisiae) のグリセ口ール代謝能を相補することを指標にして選択された [ S.-i. Ohnuma et al. (1996) J. Biol. Chem. , 271(31), 18831-18837 ]₀ リコペン（lycopene) 合成を指標に、 GGPP合成活性をもつ stearothermophilus FPP合成酵素の変異型酵素とその遺伝子が得られ [ S.-i. Ohnuma et al. (1996) , J. Biol. Chem. , 271(17), 10087-蘭 5]、更に、 Asp- richドメイン I保存配列 (DDXX(XX)D) の 5アミノ酸残基上流のアミノ酸残基をコ一ドする遺伝子を部位特異的変異させることによって、 GGPPから HexPPまでのプレニルニリン酸を様々な割合で合成する 18種の変異型酵素とその遺伝子が得られた [ S. - i . Ohnuma et al . ( 1996) J. Bi o l . Chem. , 271 (48) , 30748-30754 ]。そして、 Asp- r i chドメイン I保存配列（DDXX(XX)D) の 5アミノ酸残基上流に位置するアミノ酸残基が反応産物の鎖長制御に関与することがわかった。

しかし、 GPPを特異的に合成する活性を有する変異型酵素は得られていない。発明の開示

本発明は、ゲラニルニリン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、フアルネシル二リン酸合成酵素のァミノ酸配列の一部を置換することによりゲラニルニリン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の（a ) 又は（b ) の組換えタンパク質である。

( a ) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質

( b ) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において第 8 2番目のアミノ酸を除く少なくとも 1個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなリ、かつゲラニルニリン酸合成酵素活性を有するタンパク質

さらに、本発明は、上記（a ) 又は（b ) の組換えタンパク質をコードする遺伝子である。

さらに、本発明は、配列番号 2で表される塩基配列を含む、ゲラニルニリン酸合成酵素遺伝子である。

さらに、本発明は、前記遺伝子を含む組換えべクタ一である。

さらに、本発明は、前記組換えベクターによって形質転換された形質転換体である。

さらに、本発明は、前記形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からゲラ二ルニリン酸合成酵素を採取することを特徴とするゲラニルニリン酸合成酵素の製造方法である。さらに、本発明は、前記形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からゲラ二ルニリン酸を採取することを特徴とするゲラニルニリン酸の製造方法である。さらに、本発明は、前記形質転換体の培養物をイソペンテニルニリン酸又はその異性体に作用させることを特徴とするゲラニルニリン酸の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

プレニルニリン酸合成酵素（ヘテロダイマーの場合は一方のサブユニット）のアミノ酸配列には 5つの保存領域が存在することが知られている [ A. Chen et al . ( 1994) Protein Sci .，3(4)， 600-607 ] 。この 5つの保存領域には、反応産物又は反応基質が結合していると考えられているァスパラギン酸残基に富む領域が 2箇所存在する。この領域を「ァスパラギン酸リッチドメイン」又は「Asp- richドメイン」といい、このうち、プレニルニリン酸合成酵素のァミノ末端側に位置する Asp-richドメイン（上記保存領域 I Iに位置する）を Asp-richドメイン I (配列：「DDXX(XX)D」（配列中、かっこ内の「XX」は存在しない場合がある））とし、カルボキシル末端側に位置する Asp- richドメイン（上記保存領域 Vに位置する）を Asp-richドメイン I Iとして両者を区別する。

上記のようなァスパラギン酸リツチドメインを有するプレニルニリン酸合成酵素としては、フアルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニルニリン酸合成酵素、へキサプレニルニリン酸合成酵素、ヘプタブレニルニリン酸合成酵素、ォクタブレニルニリン酸合成酵素、ノナプレニルニリン酸合成酵素、ゥンデカブレニルニリン酸合成酵素などがあげられる。さらに具体的な例として、バシルス 'ステアロサ一モフィラス Baci l lus stearo thermophi lus) のフアルネシソレニリン酸合成酵素、大腸菌 Escherichia col i) のフアルネシル二リン酸合成酵素、サッカロミセス ·セレピシェ（ SacchsLromyces cerevisiae) のファルネシノレニリン酸合成酵素、ラットのフアルネシル二リン酸合成酵素、ヒトのフアルネシルニリン酸合成酵素、サッカロミセス 'セレヒシェ { Saccharomyces cerevisiae) のへキサプレニルニリン酸合成酵素などが挙げられる。これらのうち、細菌型のファルネシルニリン酸合成酵素のアミノ酸配列における上記保存領域 I〜Vのァミノ酸配列を図 4に示す。図 4において、 1 . はバシルス 'ステアロザ一モフィラス由来のフアルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を、 2. は大腸菌由来のフアルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を示す。枠で囲まれた部分（四角内）はァスパラギン酸リッチドメイン I、星印（☆) はァスパラギン酸リッチドメイン Iの N末端から 4アミノ酸残基分 N末端側のアミノ酸残基を示す。

本発明は、前記 Asp - richドメイン I よりも 4アミノ酸残基上流に位置するアミノ酸残基を、そのアミノ酸よリも大きな分子量を持った他のアミノ酸残基に改変することにより、ゲラニルニリン酸合成酵素を創出し、当該酵素反応によリゲラニルニリン酸を製造することを特徴とする。すなわち、前記ァスパラギン酸リツチドメイン I を構成するアミノ酸配列「DDXX(XX)D」のうち、 N末端のアミノ酸 (Asp) から 4個 N末端側に存在するアミノ酸残基（図 4、 ☆印を付した Ser) を、 Serよリも分子量の大きい他のアミノ酸残基（Gly及び Alaを除くいずれかのアミノ酸、すなわち Val、 Leu, lie, Thr、 Asp, Glu、 Asn、 Gin, Lys、 Arg、 Cys、 Met, Phe、 Tyr、 Trp、 His及び Proからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸）に置換するものである。置換するアミノ酸は G 1 y及び A 1 a以外であれば特に限定されないが、 Pheが好ましい。

具体的には、本発明のゲラニルニリン酸合成酵素は、フアルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列（配列番号 5に記載のアミノ酸配列を参照）のうち第 82残基目の Ser残基を、例えば Phe残基に置換することにより得ることができる。

かかる置換は、例えば、熱安定性も高く比活性も高いと報告されている stearothermophilus 由来の FPP合成酵素遺伝子の塩基配列を一部改変することにより行うことができる。

(1) 変異導入の目的遺伝子の調製

変異を導入するための目的遺伝子は、バシルス · ステアロザ一モフィラス

{Bacillus stearothermophilus) 由来の FPP合成酵素 (以下 BstFPSと略す) 遺伝子である。 BstFPS遺伝子の全塩基配列は公知であり（T.Koyama et al. (1993) J. Biochem, 113, 355-363；配列番号 4)、また DDBJなどの遺伝情報データベースでァクセッション番号 D13293として公開されている。

B. stearothennophi lusもなどの各種微生物の寄託機関から入手可能であるため（ATCC 10149) 、通常の遺伝子クロ一ニング法（J. Sambrookら編（1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) によつて BstFPS遺伝子部分の DNAを得ることができる。

次に、得られた DNA断片を適当なプラスミドベクタ一（例えば PTV118N；宝酒造）につないで変異導入のためのプラスミド DNAとする。このプラスミド DNAを pFPSとする。

(2) 変異導入用オリゴヌクレオチドの合成及び変異の導入

変異導入のためのオリゴヌクレオチドは、 BstFPSの 82位のアミノ酸残基をコ一ドする Serコドンを、 Gly及び Alaを除く任意の（Ser以外の）アミノ酸をコードするコドン（例えば Pheコドン）に置換する目的に加えて、新たに SJDHIの切断部位 (5'TCATGA 3' ) が導入されるような設計になっており、例えば以下の塩基配列が挙げられる。

5' - CAT ACG TAC TTC TTG ATT CAT GAT GAT TTG-3' (配列番号 6 ) この塩基配列は、 ·¾ρΗΙ切断部位を導入しても BstFPS遺伝子がコードするアミノ酸配列はコドンの縮重により変化しないよう設計されている。この切断部位の導入によリ、消化後のァガロースゲル電気泳動で置換変異導入されたブラスミドを検出することができる。

なお、オリゴヌクレオチドの合成は通常の化学合成装置を用いて行うことができ、さらに合成したオリゴヌクレオチドをリン酸化した後失活処理（例えば 70°C で 10分間）しておくことが好ましい。

次に、前記オリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて、前記の通り作製したプラスミドに置換変異を導入する。変異の導入法は特に限定されず、例えば Kunkel法（ Proc. Natl. Acad. Sci. , USA(1985)82， 488 ) に基づく市販のキット (Mutan-Kキット；宝酒造社）を用いてもよく、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR 法）を用いてもよい。

得られた一本鎖 DNAを錡型にして、相補鎖合成用プライマ一 DNAをァ二一リングさせて二本鎖を合成する。これをプラスミドに組み込んで大腸菌株に形質転換を行う。

本発明の遺伝子は、例えば、生来のアミノ酸配列をコードする DNA (配列番号 4 ) に部位特異的変異や PCR法等の常法にしたがって変異を導入することにより容易に得ることが出来る。

得られたクローンについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム -ギルバート法、ダイデォキシ法等の公知手法により行うことができるが、通常はダイデォキシ法に基づいた自動塩基配列決定装置を用いて配列決定が行われる。配列番号 2に本発明の遺伝子の塩基配列を、配列番号 1及び 3に本発明のゲラ二ルニリン酸合成酵素のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がゲラニルニリン酸合成酵素活性を有する限り、変異が導入されたァミノ酸配列（配列番号 1又は 3 ) の第 82番目のアミノ酸（例えば Phe) を除く当該アミノ酸配列において少なくとも 1個（例えば 1若しくは数個）のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号 1又は 3で表わされるアミノ酸配列の第 1番目の Metが欠失した配列を有するものなども、本発明のゲラニルニリン酸合成酵素に含まれる。また、これらのゲラニルニリン酸合成酵素をコードする遺伝子も、本発明の遺伝子に含まれる。

ここで、ゲラニルニリン酸合成酵素活性とは、 IPP又はその異性体（例えば DMAPP) を基質として GPPを合成する触媒活性を意味する。なお、変異の導入は、前記と同様の手法により行うことができる。

一旦本発明のゲラニルニリン酸合成酵素遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は該遺伝子を鎵型とした PCRによって、あるいは該遺伝子の塩基配列を有する DNA断片をプローブとしてハイブリダィズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。

(3) ベクタ一の構築

本発明の組換えべクタ一は、適当なベクタ一に本発明の遺伝子を連結（挿入）することによリ得ることができる。本発明の遺伝子を揷入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。本発明の組換えべクタ一を作製するのに使用できるベクターは、大腸菌等からアル力リ抽出法（B i rnbo im, H. C. & Do ly, J. ( 1979) Nuc l e i c ac i d Res 7 : 1513)又はその変法等により調製することができる。また、市販のものをそのまま用いてもよく、目的に応じて誘導した各種ベクターを用いてもよい。例えば、 pMBl由来の複製開始点を持つ pBR322、 pBR327、 pKK233- 2、 ρΚΚ233- 3、 pTrc99Aなどが挙げられる。また、コピ —数が向上するように改変した pUC18、 pUC19、 pUC 118、 pUC1 19、 pTV1 18N、 pTV119N、 pB luescr ipt, pHSG298、 pHSG396など、さらには、 pSC 101、 Co lEl、 Rl、 F因子等に由来するプラスミドも挙げられる。さらに、発現後の精製がより容易な融合タンパク質発現べクタ一、例えば pGEX系べクタ一や pMal系べクタ一も利用できる。

また、プラスミド以外にもえファージゃ M13ファージのようなウィルスベクタ —やトランスポゾンによっても遺伝子導入が可能である。ファージ DNAとしては、例えば M13mpl8、 M13mpl9 、 A gt lO、； L gt l l等が挙げられる。

これらのベクターへのゲラニルニリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片の組込みは、適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知の方法で行うことが出来る。例えば、精製された DNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位に挿入してベクタ一に連結する方法などが採用される。

本発明の遺伝子は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、宿主に応じた複製開始点、発現制御配列などを含めることができる。さらに、転写プロモーター、転写ターミネ一ター、リボソーム結合配列等を組み込んでもよい。この場合、プロモータ一としては Ptac、 Plac、 Ptrcが挙げられ、ターミネータ一としては rrnBターミネータ —が挙げられ、リボソーム結合配列としては SD配列（5' -AGGAGG-3'で代表される）が挙げられる。

こうして作製されるプラスミドベクターの具体的なものとしては実施例中の pFPSmが挙げられる。

(4) 形質転換体の作製

本発明の形質転換体は、本発明の発現用組換えべクタ一を、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。

ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（ /a co l i) 、バシルス · ズブチリス Baci 1】us subtil is), バシルス · ブレビス（Baci Uus 6reWs)等のエツシエリヒア属又はバシルス属に属する細菌、サッカロミセス · セレピシェ

{Saccharo yces cerevisiae) . ヒキア ·ノストリス (Pichia pastris) 等のサッカロミセス属又はピキア属に属する酵母、ァスペルギルス · ォリゼ一

{Aspergi 1 lus oryzae) 、ァスぺノレギメレス - 二力一 (Aspergi 1 lus niger) 等のァスペルギルス属に属する糸状菌、カイコの培養細胞、 COS細胞又は CH0細胞等の動物細胞、あるいは植物細胞等が挙げられる。

大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、転写プロモータ一、リボソーム結合配列、本発明の

DNA、転写ターミネータ一により構成されていることが好ましい。また、転写プ口モーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

DNAから mRNAの転写を開始するするプロモータ配列として、天然に存在する配列（例えば lac、 trp、 bla、 lpp、 PL、 PR、 T3、 T7など）を用いることができる。また、これらのプロモータ一以外にも、それらの変異体（例えば lacUV5) 又は天然にあるプロモーター配列を人工的に融合した配列（例えば tac、 trcなど）が知られており、本発明にも使用できる。

ここで、 mRNAから蛋白質を合成する能力を調節する配列として、リボソーム結合部位（GAGGおよびその類似配列）から開始コドンである ATGまたは GTGまでの距離が重要であることは既知である。また、 3'側に転写終了を指令するターミネ一ター（例えば、 rrnBTlT2) が組換え体での蛋白質合成効率に影響することはよく知られている。従って、本発明では、これらの配列を使用することにより、遺伝子の発現を効率よく行わせることができる。

細菌への外来遺伝子の導入方法としては、細菌に DNAを導入する方法であれば特に限定されない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Pro Natl. Acad.Sci., USA, 69, 2110-2114(1972)), エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられる。

酵母を宿主として用いる場合は、発現べクタ一として例えば YEpl3、 YEp24、 YCp50等が用いられる。この場合のプロモータ一としては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば gallプロモーター、 gallOプロモータ一、熱ショックタンパク質プロモータ一、 MF a 1プロモータ一等が挙げられる。

酵母への外来遺伝子の導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクト口ポレーシヨン法（Methods. Enzyrao l . , 194, 182- 187 ( 1990) )、スフエロプラスト法（Pro Nat l . Acad. Sci . , USA, 84, 1929-1933 ( 1978)、酢酸リチウム法（J. Bacter i o l . , 153, 163 - 168( 1983) )等が挙げられる。動物細胞を宿主として用いる場合は、発現べクタ一として例えば pcDNAI /Amp、 pcDNAI等が用いられる。この場合、プロモータ一としてヒトサイトメガロウィルスの初期遺伝子プロモータ一等を用いてもよい。

動物細胞への外来遺伝子の導入方法としては、例えばエレクトロポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法等が挙げられる。

植物細胞への外来遺伝子の導入方法としては、ァグロパクテリゥムによる感染法が広く用いられ、直接導入法としては例えばプロトプラスト法、エレクトロボレ一シヨン法、ボンバードメント法等が挙げられる。

なお、本発明の組換えベクターは、大腸菌 DH5 aに導入され（pFPSm(S82F) /DH5 α )、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に、 1997年 12月 12日付で、 FERM BP-6551としてブダぺスト条約に基づき国際寄託されている。

(5)ゲラニルニリン酸合成酵素の製造

本発明のゲラニルニリン酸合成酵素は、前記形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。

本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。

大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養が効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸、クェン酸等の有機酸、グリセロール、メタノール、エタノ一ル、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニゥム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカ一等が用いられる。

無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシゥム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム、塩化カルシウム等が用いられる。

培養は、大腸菌を宿主として用いた場合、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、 37°Cで 16〜24時間行う。培養期間中、 11は6〜 8に保持する。 p Hの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、バッファ一等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 .

プロモーターとして誘導性のプロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてィンデューサーを培地に添加してもよい。例えば、 l acプロモータ一を用いた発現べクタ一で形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル- /3 -D-チォガラクトビラノシド（IPTG)等を、 trpプ口モータ一を用いた発現べクタ一で形質転換した微生物を培養するときにはィンドールァクリル酸（ I AA)等を培地に添加してもよい。

動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されている RPMI 1640培地、 DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。

培養は、通常、 5〜10% C0₂存在下、 37°Cで 2〜20日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ベニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

植物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されている MS培地、又はこの培地にカナマイシン、各種植物ホルモン等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、 20〜30°Cで 3〜14日行う。

培養後、本発明のゲラニルニリン酸合成酵素が菌体内又は細胞内に生産される場合には菌体又は細胞を破砕して細胞抽出物を調製する。また、本発明のゲラニルニリン酸合成酵素が菌体外又は細胞外に生産される場合には遠心分離等により菌体又は細胞を除去して培養上清を調製する。次に、これらの培養物（細胞抽出物又は培養上清）を、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば塩析、有機溶剤沈殿、ゲル濾過、ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、当該培養物中から本発明のゲラニルニリン酸合成酵素を単離精製することができる。

但し、本発明のゲラニルニリン酸合成酵素は、上記培養物から酵素を精製しなくてもゲラニルニリン酸合成酵素活性を有する場合もあるため、当該酵素活性を有する限り、その細胞抽出物又は培養液をそのまま粗酵素溶液として用いることもできる。

(6) プレニルニリン酸の製造

本発明によれば、実施例に示すように、本発明の DNAにより形質転換した宿主を培養することにより、培養物中に GPPを蓄積することができ、これを採取することにより GPPを製造することができる。

本発明はまた、本発明の酵素を基質となる IPP又は DMAPPに作用させることによつても GPPを製造することができる。この方法においては、溶媒、特に水溶液中で、本発明の酵素を反応基質に作用させ、必要に応じて反応溶液中から目的とするプレニルニリン酸を採取すればよい。酵素としては、生成酵素だけではなく、種々の段階まで半精製して得られる耝酵素、または培養菌体もしくは培養物などの酵素含有物でもよい。また、前記の酵素、粗酵素または酵素含有物を常法にしたがって固定した固定化酵素であってもよい。

基質としては IPP及び又は DMAPPが用いられる。反応用の溶媒としては水または水性緩衝液、例えば Tri s緩衝液ゃリン酸緩衝液が用いられる。図面の簡単な説明

図 1は、変異型 BstFPSと野生型 BsrFPSの酵素活性の結果を示す図である。

図 2は、薄層クロマトグラフの写真である。

図 3は、変異型 BstFPSと野生型 BsrFPSの反応産物特異性を示す図である。図 4は、フアルネシルニリン酸合成酵素のアミノ酸配列を比較した図である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は以下の実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。

なお、本明細書中で、アミノ酸残基は以下の 1文字表記または 3文字表記の略号で示される。

A -zr

， Ala， / フ―一一ノ

し，し ys _t

Asp ，タ、 j ffift

Ώ ，；ノ Λノヽフ ^wi

u ·

， u ill ，ンノレ ^ wL

U '

ile ，ェ -r-一一ノレノノ一― ノ

n · H \ \

， uiy ，ンリノノ

U Π nib ，レ \ 7 Aブ、ノ、プ、ノ

T 1 T i p . ゝノノ ΓΤつ、ノ、ノ

κ T · リノジンン

L Leu；ロイシン

M Met；メチォニン

N Asn；ァスパラギン

P Pro , プロリン

Q Gin■ グルタミン

R Arg アルギニン

S Ser ·セリン

T Thr スレ才ニン

V • Val バリン

W , Trp トリブトファン

Y ； Tyr チロシン

また、アミノ酸残基の置換は「置換前のアミノ酸残基」「アミノ酸残基番号」

「置換後のアミノ酸残基」の順番で 1文字表記のアミノ酸残基記号で表す。例えば、第 82番目の Serを Pheに置換する場合は、「S82F」のように表示する。

〔実施例 1〕 FPP合成酵素遺伝子を含むプラスミドの作製

宝酒造よリ市販されているプラスミドベクタ一 pTV118Nの yVcol- //// ΛΙΙ部位にバシルス 'ステアロザーモフィラス Bacillus stearothennophilus) 由来の FPP 合成酵素（BstFPS) 遺伝子をサブクロ一ニングした。このプラスミド DNAを pFPS とする。なお、 BstFPS遺伝子の全塩基配列は、 T.Koyama et al. (1993) J. Biochem, 113, 355-363、又は DDBJなどの遺伝情報データベースでァクセッション番号 D13293として公開されている。

〔実施例 2〕変異導入用オリゴヌクレオチドの合成

実施例 1で得られた遺伝子に変異を導入するため、次のオリゴヌクレオチドを合成した。

5，- CAT ACG TAC TTC TTG ATT CAT GAT GAT TTG-3' (配列番号 6) 上記オリゴヌクレオチドの配列は、 BstFPSの 82位のアミノ酸残基をコードする Serコドンを Pheコドンに置換する目的に加えて、新たに spHIの切断部位 (5'TCATGA 3') が導入されるような設計になっている。この SspHI切断部位の導入ではコドンの縮重のため BstFPS遺伝子がコードするアミノ酸配列は変化しない。 spHI切断部位の導入により、 spHI消化後のァガロースゲル電気泳動で置換変異導入されたプラスミドを検出することができる。

合成したオリゴヌクレオチドは以下の反応溶液中で 37°Cで 30分間リン酸化をした後 70°Cで 10分間失活処理した。

10 pmol/μΐ オリゴヌクレオチド 2μ1

10Xカイネーシヨン緩衝液 Ιμΐ

lOOOraM Tris-Cl (pH8.0)

lOOmM MgCl₂

70mM DTT

lOmM ATP \β \

H₂0 5 μ 1

T4ポリヌクレオチドキナーゼ Ιμ ΐ 〔実施例 3〕 BstFPS遺伝子の 82位のァミノ酸残基に対するコドンへの置換変異の導入

実施例 2で作製したオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて Kunkel法によつて実施例 1で作製したプラスミドに置換変異を導入した。 Kunkel法を行うにあたっては、宝酒造から市販されている Mutan-Kキットを用いた。実験手順も Mutan- Kキット添付の実験書に従った。

大腸菌 CJ- 236をホスト細胞としてプラスミド pFPS中のチミン塩基がデォキシゥラシル塩基に置き換わつた一本鎖 DNAを調製した。

得られた一本鎖 DNAを錡型にして相補鎖合成用ブライマ一 DNAを下記のようにァニ —リングさせた。一本鎖 DNA 0.6 pmol

アニーリング緩衝液 1^1

200 mM Tris-Cl (pH8.0)

100 mM MgCl₂

500 mM NaCl

10 mM DTT

プライマー DNA (実施例 2) 1 n\

H₂0 最終容積 ΙΟ Ιにする。さらに、 25μ1の伸長緩衝液、 60ユニットの大腸菌 DNA リガーゼ、 1ユニットの Τ4 DNAポリメラ一ゼを加え、 25でで 2時間相補鎖合成反応を行った。ただし、伸長緩衝液は、 50 mM Tris- CI (pH8.0)、 60 mM酢酸アンモニゥム、 5 mM MgCl₂、 5 mM DTT、 1 mM NAD、 0.5 mM dNTPである。

反応後、 3 1の 0.2 M EDTA (pH8.0)を加え、 65°Cで 5分間処理することによリ反応を停止させた。

〔実施例 4〕 BstFPS遺伝子の 82位のアミノ酸残基に対するコドンへ置換変異が導入された遺伝子を持つ形質転換体の作製

実施例 3により作製した DNA溶液を用いて、下記のようにして大腸菌 DH5 株へ CaCl₂法により形質転換を行った。すなわち、 50mM CaCl₂で処理した DH5 αコンビテント細胞懸濁液に DNA溶液を加え、氷上で 30分保持した。

得られた形質転換体を、形質転換選択マーカ一であるアンピシリン含有寒天プレートにまき、 37°Cで一晩培養した。アンピシリン耐性を表現型としてもつ形質転換体よりプラスミド DNAを調製し、 spHI消化後ァガロースゲル電気泳動にかけることにより、得られた形質転換体のうち、 SspHI切断部位を BstFPSコード領域に持つ置換変異型 pFPSプラスミドを選択した。

次に、選択した置換変異型 PFPSプラスミドの BstFPS遺伝子の 82位アミノ酸残基に対するコドン周辺の塩基配列をダイデォキシ法によって決定した。その結果、 82位の Serコドン（TCT) 力^ he (TTC) コドンに置き換わった置換変異型 BstFPS遺伝子（配列番号 2 ) を含む pFPSプラスミドが得られた。この変異体を S82Fと表示し、プラスミドを pFPSmとする。

〔実施例 5〕変異型 BstFPSの活性測定

実施例 4で得られた変異型および野生型 BstFPS遺伝子を含む 2種の形質転換体、さらに、ベクタ一 PTV118Nのみを保持する形質転換体から下記のようにして粗酵素液を調製した。

2x LB培地で一晚培養した形質転換体を遠心によリ集菌し、菌体破碎用緩衝液 (50mM Tri s-C l (pH8. 0)、 10 mM /3 -メルカプトエタノール、 ImM EDTA) に懸濁した。これを超音波破砕処理し、さらに、 4°C、 10，000r. p. m.、 10分遠心処理した上清を 55°Cで 30分熱処理し、大腸菌由来のプレニルニリン酸合成酵素活性を失活させた。これをさらに同条件で遠心処理し、その上清を粗酵素抽出液として下記の反応溶液中、 55°Cで 15分反応を行った。

[r¹⁴C]-IPP ( IC i /mo l ) 25 nmo l

ァリル性ニリン酸（DMAPPまたは GPPまたは FPP) 25 nmo l

Tri s-C l (pH8. 5) 50 mM

MgCl₂ o mM

NH₄C1 50 mM

/3—メルカプトエタノール 50 mM

酵素液 50 g

H_?0で lmlにする < 反応後、 3mlの水飽和ブタノールを加えて反応産物をブタノ一ル層に抽出した。得られたブタノ一ル層 lmlに液体シンチレ一夕一3mlを加えて、液体、ンンチレ一ションカウンタ一により放射活性を測定した。

結果を図 1に示す。図 1は S82F変異型 BstFPSと野生型 BsrFPSの酵素活性を示すグラフである。サンプル番号 1、 4、 7はべクタ一 pTV118Nのみを保持する宿主から調製したもの、サンプル番号 2、 5、 8は S82F変異型 BstFPSをコードする遺伝子を保持する宿主から調製したもの、サンプル番号 3、 6、 9は野生型 BstFPSをコードする遺伝子を保持する宿主から調製したものである。また、サンプル番号 1、 2、 3はァリル性基質として DMAPPを用いたときの結果を、サンプル番号 4、 5、 6はァリル性基質として FPPを用いたときの結果を、サンプル番号 7、 8、 9はァリル性基質として FPPを用いたときの結果を示す。

図 1より、野生型酵素は DMAPPと GPPをァリル性基質として利用でき FPPを基質としないが、 S82F変異型酵素は GPPをァリル性基質として利用する能力が極端に低下していることがわかる。

次に、別途同様に作製した反応液に、反応後すぐにジャガイモ酸性フォスファターゼ溶液（2mg/mlジャガイモ酸性フォスファターゼ、 0. 5M酢酸ナトリウム (pH4. 7) ) lmlを加えて 37°Cで脱リン酸化処理をした後、 3mlのペンタンで抽出した。これを薄層クロマトグラフィー（逆相 TLCプレート： LKC18 (Whatman社製）、展開溶液：アセトン水 = 9 1 ) により解析した。展開された脱リン酸化された反応産物をバイオイメージアナライザ一 BAS2000 (富士写真フィルム社製）にかけ、放射活性の位置及び相対量を決定した。

結果を図 2及び図 3に示す。図 2は、各ァリル性基質を用いたときの変異型 BstFPS反応産物の脱リン酸化物における TLC展開パターンを示す。比較として、野生型 BstFPSとベクターのみを保持する宿主よリ調製したサンプルを用いたときのものも示す。 s. f.は溶媒先端、 ori .は展開開始点、 G0Hはゲラニオール標準試料の展開位置、 F0Hはフアルネソール標準試料の展開位置をそれぞれ表す。 wi ld typeは野生型 BstFPSを用いたときの結果、 S82Fは変異型 BstFPSを用いたときの結果、 vectorはベクターのみを保持する宿主を用いたときの結果を示す。 n. d.は活性が検出されなかったものを表す。図 3は、野生型 BstFPSと変異型 BstFPSの反応産物特異性を示すグラフであって、 IPP及び DMAPPを基質とした際の GGPP、 FPP及び GPPの生成割合を示すものである。

図 2及び図 3の結果より、野生型 BstFPSは FPPを特異的に合成する反応を触媒していたが、 S82F変異型 BstFPSでは GPPを特異的に合成する反応を触媒するようになった。すなわち、 S82F変異型 BstFPSは、ゲラニルニリン酸合成酵素と呼びうる酵素に変化したことになる。産業上の利用可能性

本発明により、ゲラニルニリン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えべクタ一、並びにゲラニルニリン酸合成酵素及びゲラニルニリン酸の製造方法が提供される。

本発明の遺伝子は、モノテルべン類合成を目的とした代謝工学や酵素工学に利用できる点で有用である。配列表フリーテキスト

配列番号 1 ： Xaaは Val、 Leu、 l i e, Thr、 Asp, Glu、 Asn、 Gln、 Lys、 Arg、 Cys、 Met, Phe、 Tyr、 Trp、 Hi s又は Proを表す。

配列番号 6 : FPP合成酵素のアミノ酸配列から設計し、かつ BspHI部位を有するオリゴヌクレオチド。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（ a) 又は（b) の組換えタンパク質。

(a) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質

(b ) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において第 82番目のアミノ酸を除く少なくとも 1個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニルニリン酸合成酵素活性を有するタンパク質

2. 以下の（ a) 又は（b) の組換えタンパク質をコードする遺伝子。

(a) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質

(b) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において第 82番目のアミノ酸を除く少なくとも 1個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニルニリン酸合成酵素活性を有するタンパク質

3. 配列番号 2で表される塩基配列を含む、ゲラニルニリン酸合成酵素遺伝子。

4. 請求項 2又は 3記載の遺伝子を含む組換えべクタ一。

5. 請求項 4記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。

6. 請求項 5記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からゲラニルニリン酸合成酵素を採取することを特徴とするゲラニルニリン酸合成酵素の製造方法。

7. 請求項 5記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からゲラニルニリン酸を採取することを特徴とするゲラニルニリン酸の製造方法。

8. 請求項 5記載の形質転換体の培養物をイソペンテ二ルニリン酸又はその異性体に作用させることを特徴とするゲラニルニリン酸の製造方法。