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WO1999031237A1 - Facteur inhibiteur de l'apoptose - Google Patents

Facteur inhibiteur de l'apoptose Download PDF

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Publication number
WO1999031237A1
WO1999031237A1 PCT/JP1998/005609 JP9805609W WO9931237A1 WO 1999031237 A1 WO1999031237 A1 WO 1999031237A1 JP 9805609 W JP9805609 W JP 9805609W WO 9931237 A1 WO9931237 A1 WO 9931237A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
protein
acid sequence
cells
cell death
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/005609
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuo Uchiyama
Yoshiyuki Ohsawa
Original Assignee
Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to AU15063/99A priority Critical patent/AU1506399A/en
Publication of WO1999031237A1 publication Critical patent/WO1999031237A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins

Definitions

  • the present invention relates to a factor having an activity of suppressing cell death (cell death suppressing factor, hereinafter referred to as PCTF35), a gene encoding the same, and a pharmaceutical use thereof.
  • PCTF35 cell death suppressing factor
  • Many neurodegenerative diseases are said to cause neurons to die and develop due to abnormalities in nerve cells or signal transmission between nerve cells.
  • Parkinson's disease is said to be caused by the degeneration of the substantia nigra neurons and the cessation of production of dopamine, one of the neurotransmitters, and the death of dopaminergic neurons.
  • Alzheimer's disease is said to cause dementia mainly due to death of neurons in the cerebral cortex and hippocampus.
  • Identification of a protein that suppresses nerve cell death which is thought to be the cause of neurological disease, or that promotes nerve cell growth, and the gene that encodes it, will provide an effective therapeutic agent for diseases caused by nerve cell death. It can be provided, and is extremely important in searching for compounds that mimic it. That is, a protein having an activity of suppressing the death of nerve cells can itself be an effective medicine, and at the same time, has a substance having a function similar to that of the protein, and has an action of inhibiting or promoting the function. It is also very useful when developing substances as drugs. Disclosure of the invention
  • the present inventors have focused on the b C 2 gene suppresses cell death, assuming inducible expression of proteins involved in curbing cell death, Toko filtrate was examined for the presence of such protein, By introducing the b2 gene, it was found that a factor (PCT F35) having the activity of suppressing cell death was secreted out of the transformed cells. Then, the PCTF 35 was purified and isolated, and further, based on the purified partial amino acid sequence of PCTF 35, the gene encoding the same (hereinafter referred to as pctf 35) was cloned, and the present invention was carried out. completed.
  • PCT F35 a factor having the activity of suppressing cell death
  • the present invention relates to a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in which one or several amino acids have been deleted, replaced or added. It is a protein that has the activity of inhibiting cell death.
  • the present invention relates to a gene encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a protein that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and has an activity of suppressing cell death.
  • the DNA to be loaded is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a protein that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and has an activity of suppressing cell death.
  • the present invention relates to a cell death inhibitory factor characterized by being a proteinaceous substance having the following physicochemical properties and physiological activities (1) to (4).
  • amino acid sequence from the 1st to 22nd amino acid on the N-terminal side is the following amino acid sequence; Va1etG1ySerG1yAspSperVa1
  • amino acid sequence at the N-terminal 1 38 to 14 1 is the following amino acid sequence Ty r A rg G ly A rg
  • the present invention is a pharmaceutical composition for suppressing cell death, comprising the protein or the cell death inhibitor as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a photograph showing the morphology of an organism, showing wild type PC12 cells in a growing state (the cell density is 2500 cells).
  • Figure 2 is a photograph showing the form of the biologically, wild-type PC 1 2 cells (cell density 2 500. 1 11 2) after 24 hours was shifted to serum-free medium, killing conditions 1 shows wild-type PC12 cells.
  • Figure 3 is a photograph showing the morphology of the organism. Wild-type PC12 cells (cell density of 2500 cells ⁇ 1112) were transferred to a serum-free medium containing the culture supernatant of PC12bc2 cells. The figure shows wild-type PC12 cells 24 hours after the transfer.
  • FIG. 4 shows a reversed-phase chromatograph of a culture supernatant of PC12 / bc £ 2 cells using 60% acetonitrile containing 0.05% of choline as a gradient solvent.
  • % NGF cell death suppressing activity
  • the longitudinal axis right and line shows the solvent gradient (Asetonitoriru concentration. / 0).
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of electrophoresis, and shows a gel stained with silver after fractionation 11 obtained by reverse phase chromatography was subjected to SDS-PAGE.
  • Figure 6 is a photograph showing the results of electrophoresis.
  • the fraction 11 obtained by reversed-phase chromatography was subjected to Natent-PAGE, followed by CBB-stained gel and the position of the confirmed protein. Or — as shown in 4.
  • FIG. 7 shows the cell death inhibitory activities of the proteins corresponding to -1 to -4 in FIG. 6 (the vertical axis represents% activity).
  • FIG. 8 is a photograph showing the result of electrophoresis, and is a diagram of a gel of a protein corresponding to -1 in FIG. 6 in which cell death inhibitory activity was confirmed, which was subjected to silver staining after SDS-PAGE.
  • FIG. 9 shows the N-terminal amino acid sequence of PCTF35 determined by the amino acid sequencer. In the figure? Means an unidentified residue.
  • FIG. 10 shows the amino acid sequence at the N-terminus of a 28 kd protein, which is a limited digest of PCTF 35, determined by the amino acid sequencer.
  • FIG. 11 is a photograph showing the results of electrophoresis and shows the results of exposure of Northern hybridization to mRNA extracted from a transformant containing the gene pctf35. Lanes 1 to 3 show each clone of PCI 2Zp CTF cells, lane 4 shows PC12 / pc DNA3 cells, and lane 5 shows wild-type PC12 cells.
  • FIG. 12 shows the survival rate of PC 12 / p CTF cells in serum-free medium.
  • the present inventors transduced the b2 gene into rat PC12 cells, which are pheochromocytomas, and analyzed the transformed cells (hereinafter referred to as PC12Zbc2 cells) for functional analysis of the b2 gene.
  • PC12Zbc2 cells transformed cells
  • Wild-type PC12 cells will die if serum is removed from a suitable growth medium. However, PC12 / bc2 cells transformed with the b2 gene continued to grow without cell death even in a serum-free medium, and exhibited the behavior of extending projections.
  • the present inventors have paid attention to the behavior of the PC12 / b2 cells and assumed that a factor having an activity of suppressing cell death may be secreted out of the cells. Therefore, a culture supernatant was prepared after culturing PC 12Zb c £ 2 cells, and this was added to a serum-free medium, that is, wild-type PC 12 placed in an environment where the cells died. It was confirmed that the wild-type PC12 continued to grow similarly to the PC12 / b2 cells, and extended the protrusion. This is, PC 12Zb C f 2 cells, showing that the releasing agent having activity of inhibiting the death of the other PC I 2 cells culture ground.
  • the present inventors investigated the factors that suppress cell death, which are thought to be present in this medium, by using reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) using 60% acetonitrile as a developing solvent, and polyacrylamide electrophoresis. (PAGE) was used for purification. As a result, a protein having a molecular weight of 35 kDa in SDS-PAGE could be recovered. By confirming that the recovered protein had an activity to suppress cell death, it was determined that the protein was the target cell death inhibitory factor, that is, PCTF35.
  • RP-HPLC reversed-phase high-performance liquid chromatography
  • PCTF35 target cell death inhibitory factor
  • the present inventors have studied the N-terminal 21 residues of PCTF35 purified by the above method. , And the N-terminal amino acid sequence of the limited digest obtained by cutting the peptide chain of PCTF 35 with Bromcian were analyzed (FIGS. 9 and 10). Oligonucleotides consisting of the deduced nucleotide sequence were synthesized based on these amino acid sequences, and messenger RNA (mRNA) prepared from PC12 cells by the polymerase chain reaction (PCR) method using this as a probe. From the cDNA library prepared from the above, the gene pctf35 encoding PCTF35 could be cloned.
  • mRNA messenger RNA
  • the gene pctf35 corresponds to a region encoding a PCTF35 consisting of a total of 256 amino acid residues including a signal peptide in the 1645 base pair (bp) base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • PCTF35 of the present invention is a secreted protein secreted extracellularly by a sidanal peptide consisting of 23 amino acid residues.
  • This secreted PCTF 35 is a protein with an estimated molecular weight of 24.9 kd consisting of 233 amino acid residues.According to the measurement of the molecular weight by SDS_PAGE, the molecular weight of secreted PCTF 35 is 35 kd. Therefore, it is considered that PCTF35 has undergone some modification such as a sugar chain.
  • PCTF 35 of the present invention to suppress cell death means that when PCTF 35 is added to cells, the cells continue to grow without being killed even in the absence of NGF and serum. Means that. When acted on PC12 cells, PCTF35 of the present invention exhibits an activity of suppressing cell death and an activity of promoting extension of projections.
  • wild-type PC12 cells were prepared from serum or NGF (Nurve
  • Such activity of PCTF 35 to suppress cell death can be confirmed by observing cell survival.
  • a simple method for measuring the activity of NGF which exhibits cell death-inhibiting activity similar to PCTF35 (Sasaki et al., Abstracts of the 4th Annual Meeting of the Japan Society for Alternatives to Animal Experiments, 1990, According to p. 85)
  • LDH lactate dehydrogenase
  • PCTF 35 which is a protein that suppresses cell death
  • PCTF 35 and the gene encoding it, Pctf 35 are extremely useful in developing a substance having a function similar to that of the protein, a substance having an action of inhibiting or promoting the function, or the like as a medicine.
  • the gene pctf35 is indispensable for mass-producing PCTF35 using genetic recombination technology and the like.
  • any gene that encodes a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is within the scope of the present invention.
  • a DNA that hybridizes with the DNA and encodes a bioactive protein having an activity of suppressing cell death is also included in the scope of the present invention. ⁇ .
  • the full-length sequence of the gene pctf35 is partially modified by various artificial treatments, for example, site-directed mutagenesis, random mutation by treatment with a mutagen, and mutation / deletion / ligation of DNA fragments by restriction enzyme cleavage. Even if the DNA sequence is changed, it is a DNA that hybridizes with the gene pctf35 under stringent conditions and encodes a bioactive protein having cell death inhibitory activity, even if the DNA sequence is changed. Irrespective of the difference from the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 Are within the range.
  • the degree of the above-mentioned DNA mutation is 90 ° / 90 ° with the DNA sequence of the gene pctf35.
  • a substance having the above homology is acceptable.
  • the degree of hybridization with the gene P ctf 35 can be determined under normal conditions (for example, when the probe is labeled with DIG DNA Labeling kit (Cat No. 1175033 manufactured by Boehringer Mannheim) at 32 ° C). In DIGE asy Hy b solution (Berlinger's Mannheim Co., Cat No.
  • the mutant is a protein having cell death inhibitory activity.
  • Variants are within the scope of the present invention.
  • the side chains of the amino acids that are the constituents of proteins differ in hydrophobicity, charge, size, etc., but do not substantially affect the three-dimensional structure (also called three-dimensional structure) of the entire protein In this sense, some highly conservative relationships are known empirically and by physicochemical measurements.
  • substitutions, insertions, and substitutions in the amino acid sequence of PCTF 35 shown in SEQ ID NO: 1 Even if it is a mutant protein due to deletion or the like, the mutation is a highly conserved mutation in the three-dimensional structure of PCTF 35, and the mutant protein has a cell death inhibitory activity like PCTF 35 If so, they can be said to be within the scope of the present invention.
  • the degree of mutation is within a range in which homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 90% or more.
  • Examples of such a mutant protein include a protein consisting of an amino acid sequence obtained by removing the amino acid sequence corresponding to the fern peptide from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 was obtained as follows. That is, as a result of searching a human fetal brain cDNA library using a part of the gene shown in SEQ ID NO: 3 as a probe, a sequence having high homology to the gene shown in SEQ ID NO: 2 was obtained. A gene which is considered to encode a human-derived cell death inhibitory factor shown in No. 5 was obtained.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 was obtained from the nucleotide sequence of this gene, and a protein having the amino acid sequence of this amino acid sequence excluding the amino acid sequence corresponding to the signal peptide was obtained.
  • PCTF 35 of the present invention can be produced in a medium by culturing rat PC12 cells transformed with the b2 gene in an appropriate medium.
  • the bc2 gene is recombined into a shuttle vector that can be replicated and maintained in both PC12 cells and Escherichia coli or Bacillus subtilis, such as pcDNA3, pAGE123, etc. It can be introduced into PC12 cells by a general gene transfer method such as the Yong method.
  • the transformed PC12 / bc £ 2 cells may be cultured in an appropriate medium such as RPMI1640 medium or HDMEM medium, and require no special culture method or means. do not do.
  • the PCTF 35 of the present invention is prepared by linking the gene pctf 35 of the present invention to a vector for recombination by a general gene recombination technique to prepare a recombinant gene pctf 35, It can also be produced by expression in a single host vector system.
  • a suitable vector is a plasmid derived from E. coli (eg, pBR32, pUCll8, etc., Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pC194, etc.), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, etc.), and more Animal viruses such as bacteriophage II retrovirus and vaccinia virus can be used.
  • an appropriate expression promoter can be connected upstream of the gene.
  • the promoter to be used may be appropriately selected depending on the host. For example, when the host is Escherichia coli, a T7 promoter, a lac promoter, a trp promoter, a p-promoter, etc., and when the host is a Bacillus genus, an SPO-based promoter, etc.
  • the host is a yeast, a PHO5 promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, or the like can be used.
  • an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, or the like can be used.
  • the PCTF35 of the present invention can also be expressed as a so-called fusion protein by linking the gene pctf35 to a gene encoding another protein (eg, glutathione S transferase, protein A, etc.). It is possible.
  • the fused PCTF35 expressed in this manner can be excised using an appropriate protease (eg, thrombin or the like).
  • Examples of the host that can be used for expression of the PCTF 35 of the present invention include various strains of Escherichiaco 1 i that is a genus Escherichia, various strains of Bacillus aci 1 1 uss ⁇ bti 1 is, and yeasts.
  • Various strains of S accharo my cescerevisiae and animal cells include COS-7 cells, CHO cells, PC12 cells and the like.
  • a transformation method generally used in accordance with the host cells to be used such as a calcium chloride method or an electroporation method, can be applied. it can.
  • the protein of the present invention for example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a mutant protein thereof, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 excluding the amino acid sequence corresponding to the signal peptide, Proteins consisting of amino acids It is useful as a drug that suppresses For example, it can be specifically applied to the treatment of diseases related to nerve cell death, such as Parkinson's disease and Alzheimer's disease.
  • the protein of the present invention can be prepared as a lyophilized product by a conventional method and applied to humans, for example, as an injection.
  • the dose may vary depending on the subject to be applied, the administration route and the like, but is usually from lg to l001718 / body weight 1 ⁇ g ⁇ day.
  • PC12 cells were cultured in a 6-well plate containing HDMEM medium for 24 hours, and then 1.5 ⁇ g of the expression vector pAGE123 obtained by recombining the human b2 gene was added, followed by the calcium phosphate method.
  • Marker substance G4 18 (Wako Pure Chemical Industries) 4 PC12 cells transformed with pAGE123 containing gene bc (2 by culturing for 14 days in HDMEM medium containing 50 g mL ( PCl SZb cf Z cells) were prepared.
  • the cell death inhibitory activity of PCTF35 of the present invention was measured according to the method of Sasaki et al. (Described above), and the lactate deoxygenase in wild-type PC12 cells when PCTF35 was allowed to act on wild-type PC12 cells.
  • the method for measuring the activity of the drogenase (LDH) was specifically measured by the following procedure.
  • a sample containing PCTF 35 was lyophilized and then dissolved in HDMEM medium to obtain a test sample.
  • prepared HDMEM media 200 mu L containing about 5000 wild-type PC 1 2 cells there was added a test sample 200 mu 1, C0 2 cell culture vessel For 24 hours. After the culture, each sample was collected in an Etbendorf tube, and wild-type PC12 cells were spun down and collected at 3000 X g for 5 minutes. After washing the collected PC12 cells with physiological saline (PBS) adjusted to pH 6.8 with phosphate buffer, the PC12 cells were solubilized with PBS containing 0.2% Tween.
  • PBS physiological saline
  • the eluted LDH activity was measured using MTX "LDH” (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical).
  • LDH low density lipoprotein
  • PC12 cells were also measured and set as a standard value, and the ratio (% NGF) to the standard value was calculated.
  • the cell death inhibitory activity of PCTF 35 contained in the test sample was determined.
  • the fraction 11 obtained in a) was freeze-dried and then dissolved in 100 L of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Add 4 ⁇ L of 5X sampling buffer to 16 ⁇ L of this dissolved sample, and heat for 5 minutes in boiling water to denature the sample. Perform SDS-PAGE under the following conditions, and fractionate The molecular weight of the protein contained in 11 was measured.
  • Running buffer 25 mM Tris, 0.192 M glycine, 0.1% SDS Electrophoresis conditions; Concentrated gel 50 V, Separation gel 150 V
  • the gel after electrophoresis was stained with Coomassie Blue (CBB) and the presence of protein was confirmed by the blue band.
  • the protein with the highest content in the recovered fraction was confirmed to have a molecular weight of 35 kd. Was done.
  • the gel after this CBB staining is shown in FIG.
  • Nativ e-PAGE was performed under the following conditions. Concentrated gel; l mL 12.5% T—2% C acrylamide solution
  • Running buffer 25 mM Tris, 0.192 M glycine
  • the excised gel is immersed in 200 // L 20 mM Tris buffer solution, pH 8.0 for 24 hours at 4 ° C to extract the protein in the gel, and the gel is centrifuged to recover the supernatant. did.
  • Each of the collected supernatants was dialyzed against HDMEM medium for 12 hours at 4 ° C., and the cell death inhibitory activity of each sample was confirmed. As a result, this activity was observed in the protein recovered from the gel corresponding to -1.
  • PC TF 35 located at 35 kd was transferred from immobilized gel to Immobilon P SQ membrane (Millipore) with 10 mM methanol containing 10% methanol. Using PS (pH 11) buffer, transcription was performed at 18 OmA for 90 minutes. The membrane after the transfer was immobilized by immersing it in a 50% methanol Z 10% acetic acid solution for 5 minutes, and stained with a Rapid Stain CBB Kit (Nakarai) for 20 minutes. Thereafter, the part where PCTF 35 is located is cut out by decolorization and drying, and the amino acid sequencer (HPG 1005A) manufactured by Hulett Packard Co., Ltd. is used to remove the PCTF 35 on the PSQ membrane according to the operation manual of the equipment. The N-terminal amino acid sequence was analyzed. The N-terminal amino acid sequence is shown in FIG.
  • the oligo DNA (sequence 11 below) corresponding to the sequence QQGKE AT, which is a part of the N-terminal 21 residues of PCTF 35 determined in Example 1 (FIG. 9), was designated as SENSE PRIMER.
  • the oligo DNA (the following sequence-2) corresponding to the amino acid sequence YRGRSVP (Fig. 10) at the N-terminus of the limited degradation product of PCTF 35 by bromocyan obtained in 6) was used as an ANTISENSE PRIMER, each of which was manufactured by PE Applied Biosystems. It was synthesized using a DNA synthesizer (AB I 380 B).
  • RNAs to be TA-3 ′ type II were extracted from PC cells using an ISOGEN kit (manufactured by Futatsu Gene) according to the instructions of the kit.
  • a reverse transcription reaction and PCR were carried out using TAKARA RNA PCR kit (AMV) (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) under the following conditions using all the RNAs as type II.
  • acrylamide gel electrophoresis (gel concentration: 10%) was performed according to a conventional method, and the gel was stained with ethidium / methylene chloride, and then irradiated with ultraviolet light, and the amplified DNA was located at a position corresponding to about 390 bp. Was confirmed, and a gel containing the band of the amplified DNA was cut out. After homogenizing this gel, add 350 ⁇ L of Maxam Gilbert buffer (0.5 mM ammonium sulfate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 OmM magnesium acetate) and leave at room temperature for 24 hours. After extracting the DNA fragment from, the supernatant was collected by centrifugation at 15000 X g for 10 minutes. The DNA fragment was purified from the recovered supernatant by ethanol precipitation.
  • Maxam Gilbert buffer 0.5 mM ammonium sulfate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 OmM magnesium acetate
  • the amplified DNA purified in 1) was transferred to pBluescriptll (manufactured by Stratagene), a vector sequencing primer, using a Ligation Pack manufactured by Futatsu Gene Co., Ltd. at 16 ° C under the following conditions. The reaction was carried out for 18 hours and ligated to prepare a recombinant vector. Purified amplified DNA 4 ⁇ 1 (200 ng)
  • the entire target gene was obtained by the following RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) method (Frohman. A., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, p8998 (1988)).
  • sequence 13 was synthesized for 3 ′ RACE, and sequence 14 was synthesized for 5 ′ RACE.
  • agarose gel electrophoresis (gel concentration: 1%) was performed according to a conventional method. The gel was stained with ethidium gel, and then irradiated with ultraviolet light. It was confirmed. Purification of amplified DNA from the gel containing the amplified DNA, integration into a vector, and sequencing were performed in the same manner as in 2) to determine the entire nucleotide sequence of the amplified DNA.
  • the amplified DNA was a DNA consisting of a total of 1,645 bp, and contained a 7 lbp ORF (Open Reading Flame) containing a termination codon in the amplified DNA.
  • the amino acid sequence encoded by this ORF contains the N-terminal amino acid sequence of PCTF 35 and a sequence fragment which partially matches the amino acid sequence at the N-terminus of 23 kd of its limited digest. Therefore, it was determined that the target gene Pctf35 was cloned.
  • SEQ ID NO: 3 shows the entire nucleotide sequence of 1645 bp, which is amplified DNA containing the gene pct35.
  • the amino acid sequence determined from the cloned gene is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the N-terminal amino acid sequence of PCTF35 shown in FIG. 9 is the amino acid sequence of the 1st to 22nd amino acids on the N-terminal side of PCTF35: Va1MetGlySerG1y Asp SerVa1ProGlyG1yVa1CysTrpLeuGinGinGlyLysGluAlaThr. It was also found that the N-terminal amino acid sequence shown in FIG. 10 corresponds to the N-terminal 138 to 141st amino acid sequence of PCTF35: TyrArgG1yArg.
  • a recombination vector pcDNA3 (Invitrogen) opened with the restriction enzymes EcoRI and XhoI was prepared, and the recombinant vector pcDNA35 containing the gene pctf35 obtained in Example 2-3) was added. 1 ⁇ g of 645 bp amplified DNA was added, and ligation, transformation and preparation of recombinant DNA were performed in the same manner as in 2) of Example 2 to obtain recombinant expression vector pCTF35.
  • HDMEM containing 3 clones of PC12 / p CTF cells, mock ⁇ PC12 cells, and wild-type PCI2 cells in a Petri dish 10 mm in diameter and 10% horse serum and 5% fetal bovine serum, respectively.
  • Medium (Gibco) Add 1 OmL, culture to 80-90% confluence, and use ISOGEN kit (Futtsubon Gene) and oligotex dT30 (Nippon Synthetic Rubber). mRNA was extracted. 2 / g mRNA was fractionated by agarose gel electrophoresis according to a conventional method, and then transferred to a membrane (NEN Gene Screen Plus) using 10 XSSC buffer at room temperature for 18 hours, followed by Northern hybridization. Was done.
  • a fragment of 1462 bp from the 5 'end of DNA shown in SEQ ID NO: 3 was used as type I and Ramdom Primer DNA Labeling Kit (manufactured by Takara Shuzo) using [ ⁇ -32P] d C
  • a TP-labeled DNA fragment was prepared.
  • Hybridization was carried out at 65 ° C for 16 hours in a solution having the following composition (all concentrations were final concentrations).
  • the membrane was washed twice with 2 XSSC buffer at room temperature for 5 minutes, then with 2 XSSC buffer containing 1% SDS at 60 ° C, twice for 30 minutes, and then with 0.1 XSSC buffer. Using 0.1% SDS at room temperature for 5 minutes once and washing at 51 ° C. Detection of signal after membrane washing is -80. For 24 hours using Hyperfi1m ⁇ -ECL (Amersham) film.
  • Wild type PC12 cells were placed in a 100 mm diameter Petri dish, and 5,000 cells / cm 3 , 10,000 cells cm 3 , 10 mL of serum-free HDMEM medium (Gibco) containing 250 ⁇ g / mL of NGF The cells were added at a cell density of 25,000 cells / cm 3 and cultured for 24 and 48 hours, and the number of viable cells was counted by the trepan pull-one dye exclusion test (Gibco). %.
  • the PC12 / p CTF cells and wild-type PCI2 cells obtained in 1) were 5,000 cells per 10 mL of serum-free HDMEM medium (Gibco) prepared in a Petri dish with a diameter of 10 mm.
  • hpctf35 human homologue of pctf35 obtained in Example 1
  • a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 was pro Brain5'-STRETCH PLUS cDNA Library (manufactured by CLONTECH) was screened.
  • Four hundred positive clones were obtained with a screen jungle of about 500,000 clones. Three of them were found to be genomic fragments, but one was a cDNA fragment containing a poly (A) tail, which partially had high homology with the pctf35 gene.
  • 5'-RACE was performed based on the above sequence.
  • PCR was performed using the ORF region sequence expected to be contained in the previously obtained genomic fragment, and the structure of the hpctf35 gene ORF was determined using the same library and cDNA derived from human placenta. Were determined.
  • the nucleotide sequence of the hpctf35 gene ORF encoding hpctf35 comprising a total of 263 amino acid residues including the signal peptide is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of hpct35 including the signal peptide deduced therefrom is shown in SEQ ID NO: 4.
  • a protein that suppresses cell death was obtained. Further, according to the present invention, the gene encoding the gene was successfully cloned.
  • the protein for suppressing cell death according to the present invention is useful for treating diseases associated with nerve cell death, and has a function similar to that of the protein, and has an effect of inhibiting or promoting the function of the protein. It is also very useful when developing substances as drugs.

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Description

明 现 曞 现胞死抑制因子 技術分野
本発明は、 现胞死を抑制する掻性を有する因子 现胞死抑制因子、 以䞋 P C T F 3 5ずする 、 それをコヌドする遺䌝子及びその医薬甚途に関する。
背景技術
神経倉性疟患の倚くは、 神経现胞たたは神経现胞間の信号䌝達に異倉が生じる こずにより、 神経现胞が死滅し発症するずされおいる。
このような神経倉性疟患の代衚䟋ずしお、 パヌキン゜ン病やアルツハむマヌ病 が挙げられる。 パヌキン゜ン症は、 黒質神経现胞が倉性しお神経䌝達物質の䞀぀ であるド䞀パミンが産生されなくなり、 ド䞀パミン䜜動性の神経现胞が死ぬこず により発症するず蚀われおいる。 䞀方、 アルツハむマヌ病は䞻に倧脳皮質や海銬 の神経现胞が死ぬこずによっお痎呆症状を呈するずされおいる。
以䞊に述べた神経现胞死が関連する疟病に関し、 発症原因である神経现胞死を 抑制する、 たたは神経现胞の生育若しくは成長を促す䜜甚を瀺す物質等が有効な 治療薬ずなり埗るず想定されおおり、 盛んに研究が行われおいる。
最近、 プロトオンコゞヌンである b c 2遺䌝子 Tsuj imoto ら、 Science, Vol. 228, p l440-1443, 1985) が现胞死を抑制するこずが報告されおいる Vaux D.し ら、 Nature, Vol. 335, p440-442 1988)。 その现胞死を抑制する機胜に぀ いお皮々の機構が提唱されおいるが、 完党には蚌明されおいない。
神経性疟患の原因であるず考えられる神経现胞死を抑制、 たたは神経现胞の成 長を促進させる蛋癜質、 䞊びにそれをコヌドする遺䌝子を同定すれば、 神経现胞 死に起因する疟患に有効な治療薬を提䟛するこずができ、 たたこれに擬䌌する化 合物の探玢を行う䞊で、 きわめお重芁な意矩を有する。 すなわち、 神経现胞の死 滅を抑制する掻性を有する蛋癜質は、 それ自䜓が有効な医薬ずなり埗るず同時に、 圓該蛋癜質の機胜ず同様の機胜を有する物質、 圓該機胜を阻害たたは促進する䜜 甚を有する物質等を医薬ずしお開発するに際しおも、 極めお有甚である。 発明の開瀺
本発明者らは、 b C 2遺䌝子が现胞死を抑制するこずに着目し、 现胞死の抑 制に関䞎する蛋癜質の誘導発珟を想定しお、 この様な蛋癜質の存圚を調べたずこ ろ、 b 2遺䌝子の導入により、 现胞死を抑制する掻性を有する因子 PCT F 3 5) 力;、 圢質転換现胞の倖に分泌されるこずを芋出した。 そしおこの PCT F 3 5を粟補、 単離し、 さらに粟補された PCTF 3 5の郚分アミノ酞配列を基 に、 それをコ䞀ドする遺䌝子 以䞋、 p c t f 3 5ずする をクロヌナングし、 本発明を完成した。
すなわち本発明は、 配列番号 1に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質、 もし くは配列番号 1のアミノ酞配列においお 1もしくは数個のァミノ酞が欠倱、 眮 換もしくは付加されたァミノ酞配列からなり、 か぀现胞死を抑制する掻性を有す る蛋癜質である。
曎に本発明は、 配列番号 1に蚘茉のァミノ酞配列からなる蛋癜質をコ䞀ドす る遺䌝子である。
曎に本発明は、 配列番号 2に蚘茉の塩基配列からなる DNA、 もしくは配列 番号 2の DNAずストリンゞェン卜な条件でハむブリダィズし、 か぀现胞死の 死滅を抑制する掻性を有する蛋癜質をコ䞀ドする DN Aである。
曎に本発明は、 以䞋の①〜⑀の理化孊的性状および生理掻性を有する蛋癜性物 質であるこずを特城ずする现胞死抑制因子である。
①プロトオンコゞヌンである b c£ 2遺䌝子で圢質転換された耐色现胞皮腫の培 逊液から埗るこずができる 
②還元䞋 SDS— PAGEによる掚定分子量は玄 3 5 000である
③现胞の死滅を抑制する掻性を有する 
④ N末端偎の 1から 22番目のアミノ酞配列が以䞋のァミノ酞配列である  V a 1 e t G 1 y S e r G 1 y A s p S e r V a 1
P r o G 1 y G 1 y V a 1 Cy s T r p L e u G i n
G i n G 1 y L y s G 1 u A 1 a T h r
â‘€ N末端偎の 1 3 8〜1 4 1番目のアミノ酞配列が以䞋のァミノ酞配列である Ty r A r g G l y A r g
曎に本発明は、 䞊蚘蛋癜質たたは现胞死抑制因子を有効成分ずしお含有する、 现胞死を抑制するための医薬組成物である。
図面の簡単な説明
図 1は、 生物の圢態を瀺す写真であっお、 生育状態の野生型 PC 1 2现胞を瀺 す 现胞密床は 2500個 。
図 2は、 生物の圢態を瀺す写真であっお、 野生型 PC 1 2现胞 现胞密床は 2 500個 。111 2 ) を無血枅培地に移行しお 24時間経過した埌の、 死滅状態 の野生型 PC 1 2现胞を瀺す。
図 3は、 生物の圢態を瀺す写真であっお、 野生型 PC 1 2现胞 现胞密床は 2 500個< じ 111 2 ) を、 PC 1 2 b c 2现胞の培逊䞊枅を含む無血枅培地に 移行しお 24時間経過した埌の、 野生型 PC 1 2现胞を瀺す。
図 4は、 P C 1 2/b c £2现胞の培逊䞊枅に぀いおの、 0. 05%の䞁 八 を含む 60%ァセトニトリルをグラゞェント溶媒ずした逆盞クロマトグラフを瀺 す。 瞊軞巊ずバ䞀グラフは现胞死抑制掻性 NGF) ず各画分の掻性倀を、 瞊 軞右ず折線は、 溶媒グラゞェント ァセトニトリル濃床。 /0) を瀺す。
図 5は、 電気泳動の結果を瀺す写真であっお、 逆盞クロマトグラフで埗た画分 1 1を SDS— PAGEした埌、 銀染色したゲルを瀺す。
図 6は、 電気泳動の結果を瀺す写真であっお、 逆盞クロマトグラフで埗た画分 1 1を Na t i v e— PAGEした埌、 CBB染色したゲルず、 確認された蛋癜 質の䜍眮を— 1ないし— 4で瀺したものである。
図 7は、 図 6の— 1ないし— 4に盞圓する蛋癜質の现胞死抑制掻性を瀺す 瞊 軞が掻性) 。
図 8は、 電気泳動の結果を瀺す写真であっお、 现胞死抑制掻性が確認された図 6の— 1に盞圓する蛋癜質の、 S DS— PAGE埌に銀染色したゲルの図である。 図 9は、 アミノ酞シヌケンサ䞀で決定された PCTF 35の N末端のアミノ酞 配列を瀺す。 図䞭のは、 未確認の残基を意味する。
図 10は、 アミノ酞シヌケンサ䞀で決定された、 PCTF 35の限定分解物で ある 28 k dの蛋癜質の N末端のァミノ酞配列を瀺す。 図 1 1は、 電気泳動の結果を瀺す写真であっお、 遺䌝子 p c t f 35を含んだ 圢質転換䜓から抜出した mRN Aに察するノヌザンハむブリダィれヌションの露 光結果を瀺す。 レヌン 1から 3は PC I 2Zp CTF现胞の各クロヌン、 レヌン 4は PC 1 2/p c DNA3现胞、 レヌン 5は野生型 PC 1 2现胞である。
図 1 2は、 P C 1 2/p CTF现胞の無血枅培地における生存率を瀺す。
発明を実斜するための最良の圢態
本発明者らは、 b 2遺䌝子の機胜解析のために、 これを耐色现胞腫である ラット PC 1 2现胞に圢質導入し、 その圢質転換现胞 以䞋、 PC 1 2Zb c 2现胞ずする の挙動を詳现に調べた。
野生型の PC 1 2现胞は、 適圓な生育可胜な培地から血枅を取り陀くず现胞死 に至る。 しかし、 b 2遺䌝子によっお圢質転換された PC 1 2/b c 2现胞 は、 無血枅培地においおも现胞死に至るこずなく生育を続け、 逆に突起を䌞展す るずいう挙動を瀺した。
本発明者らはこの PC 1 2/b 2现胞の挙動に着目し、 圓該现胞の倖に现 胞の死滅を抑制する掻性を有する因子が分泌されおいる可胜性を想定した。 そこ で、 PC 12Zb c£ 2现胞を培逊した埌の培逊䞊枅を調補し、 これを無血枅培 地、 すなわち现胞が死滅に至る環境䞋におかれた野生型 PC 1 2に加えたずころ、 この野生型 PC 1 2は PC 1 2/b 2现胞ず同様に生育を続け、 なおか぀突 起を䌞展させるこずが確認された。 このこずは、 PC 12Zb C f 2现胞が、 培 地䞭に他の PC I 2现胞の死滅を抑制する掻性を有する因子を攟出しおいるこず を瀺すものである。
本発明者らは、 この培地䞭に存圚するず思われる现胞死を抑制する因子を、 6 0%ァセトニトリルを展開溶媒ずした逆盞高速液䜓クロマトグラフィ RP—H PLC) 、 ならびにポリアクリルアミ ド電気泳動 PAGE) を甚いお粟補を詊 みた。 その結果、 SDS— PAGEにおける分子量が 35キロダルトン k d) の蛋癜質を回収するこずができた。 この回収蛋癜質に现胞死を抑制する掻性があ るこずを確認するこずにより、 圓該蛋癜質が目的の现胞死抑制因子、 即ち PCT F 35であるず刀断した
たた、 本発明者らは、 䞊蚘方法で粟補された PCTF 35の N末端 2 1残基た でのアミノ酞配列、 ならびに、 PCTF 35のペプチド鎖をブロムシアンで切断 しお埗られる限定分解物の N末端アミノ酞配列をそれぞれ解析した 図 9及び図 10) 。 これらのアミノ酞配列を基に掚定される塩基配列からなるオリゎヌクレ ォチドを合成し、 これをプロヌブずしたポリメラ䞀れチェむンリアクション P CR) 法により、 PC 1 2现胞から調補したメッセンゞャヌ RN A (mRNA) から調補した c DNAラむブラリヌから、 PCTF 35をコ䞀ドする遺䌝子 p c t f 35をクロ䞀ナングするこずができた。
たたクロ䞀ナングされた遺䌝子から決定される PCTF 35のアミノ酞配列か ら、 図 9及び図 1 0に瀺した N末端アミノ酞配列は、 それぞれ PCTF 35の N 末端偎の 1から 22番目のアミノ酞配列 V a 1 Me t G l y S e r G 1 y A s p S e r V a 1 P r o G l y G l y V a 1 C y s T r p L e u G i n G i n G l y L y s G 1 u A l a Th r) 、 N末端偎の 1 38〜 141番目のァミノ酞配列 T y r A r g G l y
A r g) に盞圓するこずが刀明した。
遺䌝子 p c t f 35は、 配列番号 3に瀺される 1 645塩基察 b p) の塩 基配列のうち、 シグナルぺプチドを含む党長 256個のァミノ酞残基からなる P CTF 35をコヌドする領域に盞圓する遺䌝子である。 たた、 その塩基配列なら びに PCTF 35の N末端配列の解析結果から、 本発明の PCTF 35は、 23 ァミノ酞残基からなるシダナルぺプチドによっお现胞倖に分泌される分泌型蛋癜 質である。 この分泌型 PCTF 35は、 233個のアミノ酞残基からなる掚定分 子量 24. 9 k dの蛋癜質で、 先の SDS_ PAGEによる分子量の枬定によれ ば分泌型 P C T F 35の分子量は 35 k dであるこずから、 PCTF35は糖鎖 等の䜕らかの修食を受けおいるものず思われる。
本発明の PCTF 35が有する现胞死を抑制する掻性ずは、 现胞に察しお PC TF 35を添加したずきに、 NG F及び血枅の非存圚䞋にあっおも现胞が死滅せ ずに生育を続けるこずを意味する。 たた、 本発明の PCTF 35は、 PC 1 2现 胞に䜜甚させた堎合には、 现胞死を抑制する掻性ず同時に突起の䌞展を促す掻性 を瀺す。 すなわち、 野生型の PC 1 2现胞は、 血枅たたは NGF (Nurve
Growth Factor神経现胞増殖因子、 Greene L A. , J. Cel 1. Biol. , Vol.78, p747(1978) ) を含む適圓な培地においおは、 生育を続ける 図 1 ) 力、 この状 態の现胞を血枅及び NG Fを含たない培地に 2500個/ c 皋床の䜎密床 状態にしお移すず、 やがお PC 1 2现胞は萎瞮しお党䜓の 90〜 100%が死滅 する 図 2) 。 しカゝし、 血枅及び NGFを陀去した培地に無血枅培地における P C 1 2/b c 1 2现胞の培逊䞊枅を添加するず、 NGFを添加したずきず同様に PC 1 2现胞は生存する 図 3) 。
この様な PCTF 35の现胞死を抑制する掻性は、 现胞の生存を芳察するこず で確認ができる。 たた、 より簡䟿的に枬定するには、 PCTF 35ず同様に现胞 死を抑制する掻性を瀺す NGFの簡易掻性枬定方法 䜐々朚ら、 1 990幎日本 動物実隓代替法孊䌚第 4回倧䌚芁旚集、 85頁 に準じ、 PCTF 35を现胞に 添加した埌の、 圓該现胞䞭の乳酞デヒ ドロゲナ䞀れ LDH) 掻性の倉化を確認 するこずで行うこずも可胜である。
このように、 现胞死を抑制する蛋癜質である PCTF 35は、 现胞死に起因す る疟患に有効な治療薬ずなり埗るものず考えられる。 たた、 PCTF 35ならび にそれをコヌドする遺䌝子 P c t f 35は、 圓該蛋癜質の機胜ず同様の機胜を有 する物質、 圓該機胜を阻害たたは促進する䜜甚を有する物質等を医薬ずしお開発 するに際しお、 極めお有甚であり、 特に遺䌝子 p c t f 35は、 遺䌝子組み換え 技術等を甚いお PCTF 35を倧量生産する䞊で䞍可欠のものである。
本発明においおは、 配列番号 1に瀺したアミノ酞配列を有する蛋癜質をコヌ ドするものであればいずれの遺䌝子も本発明の範囲内である。 たた、 本発明にお いおは、 配列番号 2に瀺した DNA配列の他に、 圓該 DNAずハむブリダィズ し、 か぀现胞死を抑制する掻性を有する生理掻性蛋癜質をコヌドする DNAも、 本発明の範囲內である。
すなわち、 遺䌝子 p c t f 35の党長配列においお、 皮々の人為的凊理、 䟋え ば郚䜍特異的倉異導入、 倉異剀凊理によるランダム倉異、 制限酵玠切断による D N A断片の倉異 ·欠倱 ·連結等により、 郚分的に D N A配列が倉化したものであ ぀おも、 これら DN A倉異䜓が遺䌝子 p c t f 35ずストリンゞェン卜な条件䞋 でハむブリダィズし、 か぀现胞死抑制掻性を有する生理掻性蛋癜質をコ䞀ドする DNAであれば、 配列番号 2に瀺した DN A配列ずの盞違に関わらず、 本発明 の範囲内のものである。
䞊蚘の DN A倉異の皋床は、 遺䌝子 p c t f 35の DN A配列ず 90 °/。以䞊の 盞同性を有するものであれば蚱容範囲內である。 たた、 遺䌝子 P c t f 35ずハ むブリダィズする皋床ずしおは、 通垞の条件䞋 䟋えば D I G DNA L a b e l i n g k i t (ベヌリンガ䞀 ·マンハむム瀟補 C a t No. 1 1 75033) でプロヌブをラベルした堎合に、 32°Cの D I G E a s y Hy b溶液 ベ䞀リンガ䞀'マンハむム瀟補 Ca t No. 1 603558) 䞭でハむブリダィズさせ、 50°Cの 0. 5 x S SC溶液 0. l% [w//v] SDSを含む 䞭でメンブレンを掗浄する条件 1 X S 3。は0. 1 5M Na C l、 0. 0 1 5M クェン酞ナトリりムである でのサザンハむブリダィ れヌシペンで、 遺䌝子 p c t f 35にハむブリダィズする皋床であればよレ、。 たた、 配列番号 1に瀺したアミノ酞配列ず異なる配列からなる蛋癜質であ぀ おも、 䞊蚘のごずく遺䌝子 p c t f 35ず盞同性の高い倉異䜓遺䌝子にコヌドさ れる蛋癜質であっお、 か぀现胞死抑制掻性を有する生理掻性蛋癜質であれば、 本 発明の範囲内のものである。
すなわち、 本発明の PCTF 35のアミノ酞配列の 1もしくは耇数個のァミノ 酞が欠倱、 眮換もしくは付加された倉異䜓であっおも、 圓該倉異䜓が现胞死抑制 掻性を有する蛋癜質であれば、 圓該倉異䜓は本発明の範囲内のものである。 蛋癜質の構成芁玠ずなるアミノ酞の偎鎖は、 疎氎性、 電荷、 倧きさなどにおい おそれぞれ異なるものであるが、 実質的に蛋癜質党䜓の 3次元構造 立䜓構造ず も蚀う に圱響を䞎えないずいう意味で保存性の高い幟぀かの関係が、 経隓的に たた物理化孊的な実枬により知られおいる。 䟋えば、 アミノ酞残基の眮換に぀い おは、 グリシン G 1 y) ずプロリン P r o) 、 G 1 yずァラニン A 1 a) たたはバリン Va 1 ) 、 ロむシン L e u) ずィ゜ロむシン  I 1 e) 、 グル タミン酞 G 1 u) ずグルタミン G i n) 、 ァスパラギン酞 A s p) ずァス パラギン A s n) 、 システィン Cy s) ずスレオニン T h r ) 、 Th rず セリン S e r) たたは A 1 a、 リゞン L y s) ずアルギニン A r g) 、 等 が挙げられる。
埓っお、 配列番号 1に瀺した PCTF 35のアミノ酞配列䞊の眮換、 挿入、 欠倱等による倉異蛋癜質であっおも、 その倉異が PCTF 35の 3次元構造にお いお保存性が高い倉異であっお、 その倉異蛋癜質が PCTF 35ず同様に现胞死 抑制掻性を有する生理掻性蛋癜質であれば、 これらは本発明の範囲内にあるもの ず蚀うこずができる。 倉異の皋床ずしおは、 配列番号 1に瀺したアミノ酞配列 ずの盞同性が、 90%以䞊のものが蚱容し埗る範囲である。
このような倉異蛋癜質ずしおは、 配列番号 4に瀺したアミノ酞配列のうちシ ダナルぺプチドに察応するァミノ酞配列を陀いたァミノ酞配列からなる蛋癜質が 挙げられる。 配列番号 4に瀺したアミノ酞配列は、 以䞋のようにしお埗られた ものである。 即ち、 䞊蚘した配列番号 3に瀺される遺䌝子の 1郚をプロヌブず しおヒ 卜の胎児脳 c DNAラむブラリ䞀を怜玢した結果、 配列番号 2に瀺した 遺䌝子ず高い盞同性を有する、 配列番号 5に瀺すヒ ト由来の现胞死抑制因子を コヌドするず考えられる遺䌝子が埗られた。 この遺䌝子の塩基配列から、 配列番 号 4に瀺したァミノ酞配列が埗られ、 このアミノ酞配列のうちシグナルぺプチ ドに察応するアミノ酞配列を陀いたアミノ酞配列を有する蛋癜質が、 配列番号 1に瀺したアミノ酞配列からなる蛋癜質の 1぀の倉異蛋癜質であり、 ヒ ト由来の 现胞死抑制因子ず考えられる。
本発明である PCTF 35は、 䞊述のように、 b 2遺䌝子で圢質転換した ラット PC 1 2现胞を適圓な培地を甚いお培逊させるこずにより、 培地䞭に生産 させるこずができる。 b c 2遺䌝子は、 PC 1 2现胞および倧腞菌、 枯草菌の 双方で耇補保持されるこずのできるシャ トルベクタ䞀、 䟋えば、 p c DNA3、 p AGE 1 23等に組み換え、 これをリン酞カルシりム法、 ゚レク トロボレ䞀シ ペン法等の䞀般的な遺䌝子導入法により、 PC 1 2现胞に導入するこずができる。 たた、 圢質転換された P C 1 2/b c £2现胞は、 R PM I 1 640培地、 H DM EM培地等の、 適圓な培地により培逊すればよく、 䜕ら特別な培逊方法や手 段を必芁ずしない。
本発明である PCTF 35は、 同じく本発明である遺䌝子 p c t f 35を、 侀 般的な遺䌝子組み換え技術によ぀お組み換え甚べクタヌに連結しお、 組み換え遺 䌝子 p c t f 35を調補し、 これを適圓な宿䞻べクタ䞀系で発珟させるこずで生 産するこずもできる。 適圓なベクタ䞀ずしおは、 倧腞菌由来のブラスミ ド 䟋、 p BR3 2 2、 p UC l l 8その他 、 枯草菌由来のプラスミ ド 䟋、 p UB 1 1 0、 p C 1 94その他 、 酵母由来のプラスミ ド 䟋、 p SH 1 9その他 、 さらにバクテリオファヌゞゃレトロりィルスやワクシニアりィルス等の動物りむ ルス等が利甚できる。 組み換えに際しおは、 適圓な合成 DN Aアダプタ䞀を甚い お翻蚳開始コドンや翻蚳終止コドンを付加するこずも可胜である。 さらに該遺䌝 子を発珟させるために、 遺䌝子の䞊流に適圓な発珟プロモヌタ䞀を接続するこず もできる。 䜿甚するプロモヌタ䞀は、 宿䞻に応じお適宜遞択すればよい。 䟋えば、 宿䞻が倧腞菌である堎合には、 T 7プロモ䞀タヌ、 l a cプロモヌタ䞀、 t r p プロモヌタヌ、 え pしプロモヌタ䞀などが、 宿䞻がバチルス属菌である堎合には S PO系プロモヌタヌ等が、 宿䞻が酵母である堎合には PHO 5プロモヌタ䞀、 GAPプロモヌタヌ、 ADHプロモヌタ䞀等が、 宿䞻が動物现胞である堎合には S V40由来プロモヌタ䞀、 レトロりむルスプロモヌタ䞀等が、 それぞれ䜿甚で さる。
たた本発明の PCTF 3 5は、 遺䌝子 p c t f 3 5を他の蛋癜質 䟋、 グルタ チオン S トランスフェラ䞀れ、 プロテむン Aその他 をコヌドする遺䌝子ず連結 するこずにより、 いわゆる融合蛋癜質ずしお発珟させるこずも可胜である。 この ようにしお発珟させた融合型 PCTF 3 5は、 適圓なプロテアヌれ 䟋、 トロン ビンその他 を甚いお切り出すこずが可胜である。
本発明の PCTF 35の発珟の際に利甚できる宿䞻ずしおは、 ェシヱリヒア属 菌である E s c h e r i c h i a c o 1 iの各皮菌株、 バチルス属菌である旊 a c i 1 1 u s s υ b t i 1 i sの各皮菌株、 酵母ずしおは S a c c h a r o my c e s c e r e v i s i a eの各皮菌株、 動物现胞ずしおは CO S— 7现 胞、 CHO现胞、 PC 1 2现胞等が利甚できる。
組み換え型遺䌝子 p c t f 3 5を甚いお、 䞊蚘宿䞻现胞を圢質転換する方法ず しおは、 塩化カルシりム法や゚レク トロポレヌシペン法等、 甚いる宿䞻现胞に応 じお䞀般に甚いられる圢質転換方法を適甚するこずができる。
本発明の蛋癜質、 䟋えば配列番号 1に瀺すアミノ酞配列からなる蛋癜質、 た たはその倉異蛋癜質、 䟋えば配列番号 4に瀺すァミノ酞配列のうちシグナルぺ プチドに察応するァミノ酞配列を陀レ、たァミノ酞配列からなる蛋癜質は、 现胞死 を抑制する医薬品ずしお有甚である。 䟋えば、 具䜓的には、 神経现胞死が関連す る疟病であるパヌキン゜ン病やアルツハむマヌ病などの治療に適甚するこずがで きる。
これらの疟病に適甚する堎合には、 本発明の蛋癜質は、 その凍結也燥品を通垞 の方法により補剀化しお、 䟋えば泚射剀ずしおヒ 卜に適甚するこずができる。 そ の投䞎量は、 適甚する察象、 投䞎ルヌト等により倉動し埗るが、 通垞 l g〜l 001718/ 䜓重1^ g · 日である。
以䞋、 実斜䟋およひ 隓䟋を瀺し、 本発明をさらに具䜓的に説明する。
以䞋に瀺す実斜䟋における各皮操䜜は、 垂販されおいる実隓キットを甚いる堎 合には、 キットに添付されおいる説明曞の蚘茉に埓い、 たたその他特に断らない 堎合は、 圓業者にずっお自䜓公知の各皮操䜜方法 Mo l e c u l a r
C l o n i n g、 2 n d. e d .  C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b. P r e s s、 1 98 9、 その他圓業者にずっお暙準的な方法を玹介した 技術解説曞等に蚘茉の方法、 以䞋垞法ずする により行った。
実斜䟋 1
PCTF 3 5の調補
1 ) b c 1 2遺䌝子の PC 1 2现胞ぞの導入
理化孊研究所から提䟛された野生型 P C 1 2 (Mah S.P. ら J. Neurochem. , Vol.63, p.1183-1186, 1993) 现胞を甚い、 S a t oらの方法 (J. Neurobio. , Vol. 25(10)ρ1227- 1234)に埓い、 以䞋の操䜜により b c f 2遺䌝子を導入した。
PC 1 2现胞は、 HDMEM培地を入れた 6穎プレヌトで 24時間培逊埌、 1. 5 ÎŒ gのヒ ト b 2遺䌝子を組み換えた発珟べクタ䞀 p AG E 1 23を加え、 リン酞カルシりム法により、 マヌカ䞀物質 G4 1 8 (和光玔薬 4 50 g mLを含む HDMEM培地で 1 4日間培逊するこずにより、 遺䌝子 b c ( 2を含 む p AG E 1 2 3によっお圢質転換した P C 1 2现胞 P C l SZb c f Z现 胞 を調補した。
2) 圢質転換现胞の培逊䞊枅の調補
1 ) で埗られた P C 1 2 b c i?2现胞を、 1 00 mm埄のシャヌレに 1 0。/0 銬血枅、 5%牛胎児血枅を添加した HDMEM培地 ギブコ瀟 1 0mLに加え お、 80— 90%コンブル゚ントになるたで前培逊した。
䞊蚘シャヌレ培逊の 3枚分に盞圓する b c £2//ρ C现胞を、 245 X 245 X 25mmの培逊トレィ 䜏友べ䞀クラむ ト瀟補 に甚意した前培逊ず同じ培 地 50 mLに接皮し、 再び 90%コンフルェントになるたで培逊した。 培逊埌の 现胞を、 血枅を含たない HDMEM培地を甚いお卜レむ䞭で 3回掗浄したのち、 同無血枅培地 5 OmLを加えお、 2日間培逊した。 この培逊埌の無血枅培地を回 収し、 さらに 5 OmLの同無血枅培 を新たに加えお 2日間培逊した埌の培地も 回収した。
以䞊の䜜業を繰り返し、 培逊䞊枅ずしお合蚈 100 OmLを甚意した。
3) PCTF 35の掻性枬定
本発明の PCTF 35の现胞死抑制掻性の枬定は、 䜐々朚らの方法 前述 に 準じ、 野生型 PC 1 2现胞に PCTF 35を䜜甚させた際の野生型 PC 1 2现胞 䞭の乳酞デヒ ドロゲナ䞀れ LDH) 掻性を枬定する方法、 具䜓的には以䞋の操 䜜により枬定した。
PCTF 35を含む詊料を凍結也燥させた埌に HDMEM培地に溶解させ、 被 怜詊料ずした。 24穎プレヌトの各穎に、 箄 5000個の野生型 P C 1 2现胞を 含む 200 ÎŒ Lの HDMEM培地を甚意し、 そこに被怜詊料 200 ÎŒ 1を添加し た埌、 C02 现胞培逊噚内で 24時間培逊した。 培逊埌、 各サンプルを゚ツべ ンドルフチュヌブに回収し、 3000 X g 5分間で野生型 PC 1 2现胞を遠沈、 回収した。 リン酞緩衝液で pH6. 8に調節した生理的食塩氎 PBS) で回収 した PC 1 2现胞を掗浄埌、 0. 2%Twe e nを含む PBSで圓該 PC 1 2现 胞を可溶化しお溶出される LDH掻性を、 MTX" LDH" (極東補薬補 を甚 いお枬定した。 PCTF 35を NGF l O O n g Zm Lに換えお同様の操䜜を行 ぀たずきの PC 1 2现胞内の LDH掻性をあわせお枬定しお暙準倀ずし、 この暙 準倀に察する比 NGF) をもっお被怜詊料に含たれる PCTF 35の现胞死 抑制掻性ずした。
4) PCTF 35の粟補
a ) 高速液䜓クロマトグラフ
2) で埗た培逊䞊枅 1 0◩ OmLを、 攛拌匏セル アミコン瀟補 を甚いお、 蛋癜質の分子量ずしお 10 k c〜 50 k dに盞圓する分画を 50倍 2 OmL) にたで粟補濃瞮した。 この濃瞮画分に぀いお、 以䞋の条件による逆盞高速液䜓ク 口マトグラフィ RP— HP LC) を行った。
機噚 日立補䜜所 株 補高速液䜓ク口マトグラフ L6009、 L6299、 し 4000、 D 2500)
怜出 UV (220 nm)
カラム東゜䞀 Ph e n y l—5 PWRP (7. 5 c m長 、 宀枩
展開液 A緩衝液 0. 05 %トリフロロ酢酞
B緩衝液 0. 05 %トリフロロ酢酞/ 60 %ァセ トニトリル 展開条件展開速床 l mLZ分
0分〜 50分 B緩衝液 0〜 20 %の盎線募配
50分〜 56分 B緩衝液 20〜 35 %の盎線募配
56分〜 68分 B緩衝液 35〜 47 %の盎線募配
68分〜 73分 B緩衝液 47〜 52。/。の盎線募配
73分〜 78分 B緩衝液 100 %
回収 l mL毎に画分しお回収
各回収画分に぀いお PCTF 35の掻性を枬定したずころ、 ァセトニトリル 2 5%前埌でカラムから溶出される画分 1 1が最も高い掻性を瀺した。 このクロマ トダラフの結果を図 4に瀺す。
b) SDS—ポリアクリルアミ ド電気泳動 SDS— PAGE)
a ) で埗た画分 1 1を凍結也燥埌、 1 00 Lの 20mMトリス塩酞緩衝液 (p H 8. 0) で溶解した。 この溶解埌の詊料 1 6 ÎŒ Lに 4 ÎŒ Lの 5 Xサンプ リング緩衝液を加え、 沞隰氎䞭で 5分間加熱しお倉性させた詊料に぀いお、 以䞋 の条件により SDS— PAGEを行っお、 画分 1 1䞭に含たれる蛋癜質の分子量 を枬定した。
濃瞮ゲル 0. 45mL 30%T - 2. 7%Cアクリルアミ ド溶液
0. 75mL 0. 4% SDSを含む 0. 5 Mトリス塩酞緩衝液
(p H6. 8)
1. 8mL 粟補氎 1 8 M L 1 0%過硫酞アンモニゥム溶液
6. 0 Ό L TEMED
分離ゲル ミニスラブゲル 1 mm厚
3 mL 30%T - 2. 7 %Cアクリルアミ ド溶液 0. 75mL 0. 4。/。303を含む1. 5Mトリス塩酞緩衝液
(p H 8. 8)
3. 7 5mL 粟補氎
70 ÎŒ L 1 0。/。過硫酞ァンモニゥム
1 0 Ό L TEMED
泳動緩衝液 2 5 mMトリス、 0. 1 9 2 Mグリシン、 0 · 1 % S D S 泳動条件濃瞮ゲル 50 V、 分離ゲル 1 50 V
泳動埌のゲルをクヌマシヌブルヌ CBB) で染色しお、 蛋癜質の存圚を青色 のバンドで確認したずころ、 回収画分䞭で最も含有量の倚い蛋癜質は、 分子量 3 5 k dであるこずが確認された。 この CBB染色埌のゲルを図 5に瀺す。
c) ポリアクリルアミ ド電気泳動 Na t i v e— PAGE)
a) の画分 1 1に぀いお、 以䞋の条件により N a t i v e— PAGEを行った。 濃瞮ゲル l mL 1 2. 5%T— 2%Cアクリルアミ ド溶液
0. 5 mL 0. 5Mトリス塩酞緩衝液  p H 6. 8)
2 m L 粟補氎
0. 5mL 4%リボフラビン溶液
3 Ό L TEMED
分離ゲル ミニスラブゲル 1 mm厚
3 mL 30%T - 2. 7 %Cアクリルアミ ド溶液
3 m L 1. 5 Mトリス塩酞緩衝液  p H 8. 8) 6 m L 粟補氎
53. 3 ÎŒ L 20%過硫酞アンモニゥム
6. 7 Ό L TEMED
泳動緩衝液 2 5 mMトリス、 0. 1 9 2 Mグリシン
泳動条件濃瞮ゲル 50 V、 分離ゲル 1 50 V 画分 1 1を凍結也燥埌、 1 6 /i Lの 20mMトリス塩酞緩衝液  p H 8. 0 ) で溶解した。 この溶解埌の詊料 3 2 ÎŒ ίに 8 /i Lの 5 Xサンプリング緩衝液を 加え、 泳動甚詊料を調補した。 䞊蚘ゲルを 2枚調補し、 泳動甚資料の 1 6 を 各ゲルに茉せお電気泳動を行った。 泳動埌のゲルの 1枚を C B Bで染色しお蛋癜 質の䜍眮を確認した 図 6の— 1ないし— 4) 。 CBB染色で確認した䜍眮— 1 ないし— 4に盞圓する郚分をもう 1枚のゲルからそれぞれ切り出した。 この切り 出したゲルを、 200// Lの 20 mMトリス緩衝溶液 p H 8. 0に 24時間、 4 °Cで浞しおゲル䞭の蛋癜質を抜出埌、 ゲルを遠心分離しお䞊枅を回収した。 この 回収された各䞊枅を、 HDMEM培地に察しお 1 2時間、 4°Cで透析した埌、 各 詊料の现胞死抑制掻性を確認した。 その結果、 — 1に盞圓する郚分のゲルから回 収された蛋癜質に、 圓該掻性が認められた。 各回収蛋癜質の现胞死抑制掻性を図
7に瀺す。
さらに、 この回収蛋癜質を再床 b) の方法に埓っお S DS— PAGEを行った ずころ、 35 k dの蛋癜質が確認され 図 8) 、 以䞊からこの蛋癜質が PCTF 35であるず刀断した。
5) PCTF 35の N末端アミノ酞配列の決定
3) の c) の S DS— PAGE電気泳動を行った埌の 35 k dに䜍眮する PC TF 35を、 泳動ゲルからィモビロン P SQ膜 ミリポア瀟補 に、 1 0%メタ ノヌルを含む 10 mMCA P S ( p H 1 1 ) 緩衝液を甚いお、 1 8 OmAで 90 分間の条件で転写させた。 転写埌の膜を 50 %メタノヌル Z 10 %酢酞溶液に 5 分間浞しお固定化し、 Rapid Stain CBB Kit (ナカラむ瀟補 で 20分間染色し た。 その埌、 脱色、 也燥しお PCTF 35が䜍眮する郚分を切り出し、 ヒュ䞀レ ットパッカヌド瀟補アミノ酞シヌケンサ䞀 HPG 1005A) を䜿甚しお、 圓 該機噚の操䜜マニュアルに埓い、 P SQ膜䞊の PCTF 35の N末端のァミノ酞 配列を分析した。 この N末端のアミノ酞配列を図 9に瀺す。
6) PCTF 35の郚分アミノ酞配列の決定
3) の c) の SDS— PAGE電気泳動を行った埌、 PCTF 35が䜍眮する 郚分の泳動ゲルを切り出し、 圓該ゲルをホモゞネヌトした- これに、 20 /i gの ブロムシアンを含む 70。/0蟻酞 100 ÎŒ Lを加え、 宀枩で 3時間反応させた埌、 1 5000 X gでホモゞネヌトされたゲルを回収した。 この回収されたゲルを 詊料ずしお 3) の b) の方法に埓っお SDS— PAGEを行った。 泳動埌のゲル を CB Bで染色したずころ、 箄 28 k dの盞圓する䜍眮に新たな蛋癜質、 すなわ ちブロムシアンによる PCTF 35の限定分解物のバンドが確認された。 この限 定分解物に぀いお 5) ず同様の操䜜を加え、 その N末端のアミノ酞配列を分析し た。 その結果、 図 10に瀺す配列が確認された。
実斜䟋 2
遺䌝子 p c t f 35のクロヌニング
1) RT— PCRによる遺䌝子の増幅
実斜䟋 1で決定した PCTF 35の N末端 21残基 図 9 ) の䞀郚である配列 QQGKE ATに盞圓するオリゎ DNA (䞋蚘の配列䞀 1 ) を SENSE PRIMERずし お、 さらに、 実斜䟋 1の 6) で埗たブロムシアンによる PCTF 35の限定分解 物の N末端のアミノ酞配列 YRGRSVP (図 1 0) に盞圓するオリゎ DNA (䞋蚘の配列— 2) を ANTISENSE PRIMERずしお、 それぞれ PEアプラむ ドバむオ システムズ瀟補の DNA合成機 AB I 380 B) を甚いお合成した。
配列— 1  5' — CA (A/G) C A (A/G) GG (A/C/G/T) AA
(A/G) G A (A/G) GC (A/G/C/T) AC— 3' 配列— 2  5' — GG (A/G/C/T) AC (A/C/G/T) (C/G)
(A/T) (A/G/C/T) C (G/T) (A/G/C/T) C C (A/G/C/T) C (G/T) (A/G) TA— 3' 铞型ずする党 RN Aは、 ISOGEN kit (二ツボンゞヌン瀟補 を甚い、 同 kit の 説明曞の蚘茉に埓っお P C现胞から抜出した。 この党 RN Aを螌型ずしお、 TAKARA RNA PCR kit(AMV) (宝酒造補 を甚い、 以䞋の条件で逆転写反応及び P C R (RT-PCR) を行った。
铞型党 RNA 5 Ό 1 ( 1 Ό g)
10 X P C R緩衝液 5 Ό
2. 5 mM d NT P 1 Ό
10 ÎŒ M オリゎヌクレオチド 配列䞀 1 ) 2 ÎŒ
1 0 ÎŒ Μ オリゎヌクレオチド 配列䞀 2 ) 2 ÎŒ æ°Ž 29 ÎŒ 1 逆転写酵玠 0. 5 ÎŒ 1
T a qポリメラ䞀れ 0. 5 1
2 5 mM 塩化マグネシりム 5 ÎŒ 1
総量 50 ÎŒ 1
䞊蚘反応液に察しお、 94 で 30秒間保持埌、 侀 2. 5 °CZ 2秒の速床で冷 华 5 5 °Cたで冷华し、 5 5。じで 30秒間保持した埌、 + 2. 5 °C/ 2秒の速床で 7 2°Cに加枩しお、 72°C 90秒間反応させる工皋を 30回繰り返しお、 目的配 列を増幅させた。
反応終了埌、 垞法に埓っおァクリルアミ ドゲル電気泳動 ゲル濃床 1 0%) を 行い、 ゲルをェチゞゥムブ口マむ ドで染色した埌、 玫倖光照射しお玄 3 90 b p に盞圓する䜍眮に増幅 DNAの存圚を確認し、 この増幅 DNAのバンドを含むゲ ルを切り出した。 このゲルをホモゞネヌトした埌、 350 ÎŒ Lのマクサムギルバ —ト緩衝液 0. 5Μ硫酞アンモニゥム、 0. 1 %SDS、 1 mM EDTA、 1 OmM酢酞マグネシりム を加えお宀枩で 24時間攟眮しお、 ゲルから DNA 断片を抜出埌、 1 5000 X g、 1 0分間遠心しお䞊枅を回収した。 この回収 䞊枅から゚タノヌル沈殿で D N A断片を粟補した。
2) 増幅 DN Aの塩基配列の決定
1 ) で粟補した増幅 DN Aを、 塩基配列決定甚べクタ䞀である pBluescriptll (Stratagene瀟補 に、 二ツボンゞヌン 株 補の Ligation Pack を甚いお、 以 䞋の条件で 1 6°Cで 1 8時間反応させお連結し、 組み換えべクタ䞀を調補した。 粟補増幅 DNA 4 ÎŒ 1 (200 n g)
pBluescriptll 1 Ό 1 ( 50 n g )
B AS 1. 2 5 1
Hexamine cobalt chloride 0. 5 Ό L
Spermidine 0. 5 Ό L
氎 0. 7 5 Ό L
D N ALigase 5 Ό 1
組み換えベクタヌを含む䞊蚘反応溶液 5 ÎŒ Lを甚いお、 ヒ䞀トショック法によ り倧腞菌 DH 5の圢質転換を行った。 圢質転換䜓を、 アンピシリン Amp) 5 0 ÎŒ g / m I 5— B r o m o— 4— C h i o r o— 3— i n d o 1 y 1 — j3— D— g a l a c t o s i d e (X— g a l ) 4 0 ÎŒ g / m 1 I s o p r o p y l - ]3 -D-T h i o -G a 1 a c t o p y r a n o s i d e ( I PTG) 1 0 0 ΌΜを含有する L B寒倩培地にプレヌティングし、 3 7°Cでヌ晚培逊した。 プレ䞀ト䞊の癜色コロニヌを 5 0 ÎŒ g/m 1の A m pを含む L B液䜓培地 1 0 m 1に接皮しお 3 7 °Cで䞀晩培逊し、 遠心分離によっお菌䜓を集めた埌、 組み換 え DNAを FlexiPrep (フアルマシア瀟補 で粟補した。
粟補された組み換え D N Aの 1 ÎŒ gを定法に埓っおアル力リ倉性させ、 ThermoSequenase Pre - mix cycle sequencing Kit マンャム瀟補) の |Ÿ明 に 埓っお、 ゞデォキシ法により増幅 DNAの塩基配列を決定した。 増幅 DNAの長 さは、 å…š 3 4 6 b pであった。
3 ) 遺䌝子 p c t f 3 5の取埗
2) で決定された 3 4 6 b pからなる塩基配列を基に、 目的遺䌝子党䜓の取埗 を以䞋の R A C E (Rapid Amplification of cDNA Ends) 法 Frohman . A. , et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.85, p8998(1988) ) により行った。
反応甚プラむマ䞀ずしお、 3 ' RACE甚に配列䞀 3を、 5 ' RAC E甚に配 列䞀 4をそれぞれ合成した。
GGTDAGC- 3 '
配列— 4  5 ' -GACTCTAGAGCTCGAGGACG CGC
AGGTCTGGGTGTCC- 3 '
1 ) で埗られた党 RN Aの 1 ÎŒ gを铞型ずしお Marathon cDNA amplification kit (クロヌンテック瀟補 の説明曞に埓い、 以䞋の条件で P C Rを行った。 螌型党 RNA 5 ÎŒ ( 1 ÎŒ g)
1 0 X P C R緩衝液 5 Ό
2. 5 m d NT P 1 Ό
1 0 ΌΜ オリゎヌクレオチド 配列䞀 3 ) 2 ÎŒ
\ 0 ΌΜ オリゎヌクレオチド 配列䞀 4 ) 2 ÎŒ æ°Ž 34. 5 ÎŒ 1
逆転写酵玠
T a qポリメラ䞀れ 0. 5 ÎŒ 1
総量 50 ÎŒ 1
䞊蚘反応液に察しお、 94 °Cで 30秒間保持埌、 — 2. 5°CZ2秒の速床で 7 2°Cたで冷华埌 4分問保持し、 + 2. 5 °CZ 2秒の速床で再び 94 °Cに戻す工皋 を 5回、 続いお 94。じで 30秒間保持埌、 — 2. 5。C/ 2秒の速床で 70 °Cたで 冷华埌 4分間保持し、 + 2. 5°C/2秒の速床で再び 94 °Cに戻す工皋を 5回行 ぀た埌、 さらに 94 °Cで 3 0秒間保持埌、 侀 2. 5。C/ 2秒の速床で 6 8 °Cたで 冷华埌 4分間保持し、 + 2. 5°C/2秒の速床で再び 94 °Cに戻す工皋を 30回 繰り返した。
反応終了埌、 垞法に埓っおァガロヌスゲル電気泳動 ゲル濃床 1 %) を行い、 ゲルをェチゞゥムブ口マむ ドで染色した埌、 玫倖光照射しお玄 1 600 b pに盞 圓する䜍眮に増幅 DN Aの存圚を確認した。 この増幅 DN Aを含むゲルからの増 幅 DNAの粟補、 ベクタヌぞの組み蟌み、 シ䞀ケンシングの各操䜜を 2) ず同様 にしお行぀お、 増幅 D N Aの党塩基配列の決定を行った。
その結果、 増幅 DNAは党 1 64 5 b pからなる DNAであり、 その䞭に終止 コ ドンを含む 7 l i b pの ORF (Open Reading Flame) を有しおいた。 この O RFにコヌドされるアミノ酞配列䞭に、 PCTF 3 5の N末端アミノ酞配列、 お よびその限定分解物 23 k dの N末端のァミノ酞配列ず郚分的に䞀臎する配列力' それぞれ含たれおいるこずから、 目的である遺䌝子 P c t f 3 5がクロ䞀ニング されたず刀断した。 この遺䌝子 p c t f 3 5を含む増幅 DNAである 1 64 5 b pの党塩基配列を配列番号 3に瀺す。
クロ䞀ニングされた遺䌝子から決定されるァミノ酞配列を配列番号 3に瀺す。 このアミノ酞配列から、 図 9に瀺した PCTF 3 5の N末端アミノ酞配列は、 P CTF 3 5の N末端偎の 1から 22番目のァミノ酞配列 V a 1 Me t G l y S e r G 1 y A s p S e r V a 1 P r o G l y G 1 y V a 1 C y s T r p L e u G i n G i n G l y L y s G l u A l a Th rに盞圓するこずが明らかずなった。 たた図 10に瀺した N末端アミノ酞配列は、 PCTF 35の N末端偎の 1 38 〜 14 1番目のアミノ酞配列 T y r A r g G 1 y A r gに盞圓するこず が明らかずなった。
実斜䟋 3
組み換え遺䌝子手法による PCTF 35の調補
1) 組み換え発珟ベクタヌ p CTF 35の構築ず PC 1 2现胞の圢質転換
制限酵玠 E c o R Iおよび Xh o Iで開環させた組み換え甚ベクタヌ p c DN A3 (むンビトロゞヱン瀟 1 ÎŒ gを調補し、 これに実斜䟋 2の 3 ) で埗た遺䌝 子 p c t f 35を含む党長 1 645 b pの増幅 DNA1 ÎŒ gを加え、 実斜䟋 2の 2) ず同様の操䜜によっお連結、 圢質転換ず組み換え䜓 DNAの調補を行い、 組 み換え発珟べクタ䞀 p CTF 35を埗た。
理化孊研究所から提䟛された野生型 PC 1 2现胞を H DM EM培地を入れた 6 穎プレヌトで 24時間培逊埌、 1. 5 ÎŒ gの組み換え発珟べクタ䞀 p CTF 35 を加え、 リン酞カルシりム法により、 マヌカ䞀物質 G41 8 (倧日本補薬 40 0 ÎŒ gZmLを含む HDMEM培地で 14日間培逊するこずにより、 該組み換え ベクタ䞀により圢質転換された PC 1 2现胞 PC I 2/p CTF现胞 を 3ク ロヌン調補した。 同時に p c DNA3で圢質転換された PC 1 2现胞 mo c k • PC 1 2现胞 も調補した。
2) ノヌザンハむブリダィれヌシペン
3クロヌンの PC 12/p CTF现胞、 mo c k^PC 1 2现胞、 ならびに野 生型 PC I 2现胞を、 それぞれ 1 O Omm埄のシャヌレに 10%銬血枅、 5 %牛 胎児血枅を添加した HDMEM培地 ギブコ瀟 1 OmLに加えお、 80— 90 %コンフルェン卜になるたで培逊した埌、 ISOGEN kit (二ツボンゞヌン瀟補 な らびに oligotex dT30 (日本合成ゎム瀟補 を甚いお各现胞から mRNAを抜出 した。 2 / gの mRNAを垞法に埓っおァガロヌスゲル電気泳動で分画埌、 10 X S S C緩衝液を甚いお宀枩、 1 8時間でメンブレン NEN瀟補 Gene Screen Plus) に転写し、 ノヌザンハむブリダィれ䞀シペンを行った。 プロヌブずしお、 配列衚 3に瀺した DN Aの 5 ' 末端から 1462 b pのフラグメントを螌型ずし お Ramdom Primer DNA Label ingKit (宝酒造瀟補 を甚いお [α— 32 P] d C T P暙識した DN A断片を調補した。 ハむブリダィれヌションは以䞋の組成の溶 液䞭で 濃床は党お終濃床 、 65°Cで 1 6時間行った。
10% デキストラン硫酞
1 % S D S
1 M N a C 1
2. 4 X 105 c p m/mL 暙識プロ䞀ブ
ハむブリダィれ䞀シペン終了埌、 メンブレンを 2 X S S C緩衝液で宀枩、 5 分を 2回、 次いで 1 %S D Sを含む 2 X S S C緩衝液で 60°C、 30分を 2回、 さらに 0. 1 X S S C緩衝液で宀枩、 5分を 1回の条件で 0. 1 %SDSを甚 レ、、 5 1°Cで掗浄した。 メンブレン掗浄埌のシグナルの怜出は、 ヌ80。じで24 時間、 Hy p e r f i 1 m^^-EC L (アマシャム瀟補 フィルムを䜿甚しお 行った。
この結果、 mo c k PC 1 2现胞および野生型 PC 1 2现胞に比べ、 3぀の P C 12Zp CTF现胞においお、 有意な発珟が確認された。 このハむブリダィれ —ション埌の露光結果を図 1 1に瀺す。
3 ) 組み換え䜓 PC 12 p CTF现胞の生存率の確認
野生型 P C 1 2现胞を、 100 mm埄のシャヌレに甚意した NG F 250 ÎŒ g /mLを含む無血枅 HDMEM培地 ギブコ瀟 1 0mLに察しお、 5000個 /cm3 , 10000個 cm3 , 25000個/ c m 3 の 3皮類の现胞密床 ずなるよう添加し、 24時間および 48時間培逊した埌の生现胞数を、 トレパン プル䞀色玠排陀詊隓 ギブコ瀟 により蚈枬しお、 これを 1 00%ずした。 1) で埗た PC 1 2/p CTF现胞、 ならびに野生型 PC I 2现胞を、 それぞれ 1 0 Omm埄のシャヌレに甚意した無血枅 HDMEM培地 ギブコ瀟 10 m Lに察 しお、 5000個/ c m3 、 10000個/ c m3 、 25000個 c m3 の 3皮類の现胞密床ずなるよう添加し、 24時間および 48時間培逊した埌の生现 胞数をそれぞれ蚈枬し、 PC 1 2/pCTF 35の现胞死抑制効果を確認した。 その結果、 PC 12Zp CTF现胞は、 野生型 P C 12现胞に比べ、 より生存 现胞数が倚かった 図 12) =
たた、 PC 12Zp CTF现胞を実斜䟋 1 ず同様に培逊しお埗た䞊枅の濃瞮液 に现胞死抑制効果が認められ、 たたこれを無血枅培地䞭の野生型 PC 1 2现胞に 添加したずころ、 现胞死が抑制されるこずが確認された。
実斜䟋 4
ヒ ト由来 p c t f 35の遺䌝子のクロ䞀ナング及びそのアミノ酞配列決定
実斜䟋 1で埗られた p c t f 35のヒ トホモログ h p c t f 35) を単離す るために、 配列番号 3に瀺す塩基配列の 1郚  7番目〜 777番目の塩基配 列 を プ ロ 侀 プ ず し お Human Fetal . Brain5 ' -STRETCH PLUS cDNA Library(CLONTECH瀟補 のスクリヌニングを行った。 箄 50䞇クロヌンのスクリ 䞀ナングにより 4぀のポゞティブクロヌンが埗られた。 そのうち 3぀はゲノム断 片であるこずが刀明したが、 䞀぀はポリA) tailを含む c DN A断片であり、 郚分的に p c t f 35遺䌝子ず高い盞同性を有しおいたため、 このクロヌンの配 列を基に 5' — RACEを行った。 たた、 先に埗られたゲノム断片に含たれるず 予想される ORF領域の配列を甚いた PCRを行い、 同ラむブラリ䞀及び、 ヒ ト 胎盀由来の c DNAを甚ぃおh p c t f 35遺䌝子 ORFの構造を決定した。 シグナルぺプチドを含む党長 263個のァミノ酞残基からなる h p c t f 35 をコ䞀ドする、 h p c t f 35遺䌝子 ORFの塩基配列を配列番号 5に瀺した。 たたそれから掚定されるシグナルペプチドを含む h p c t 35のアミノ酞配列を 配列番号 4に瀺した。
産業䞊の利甚可胜性
本発明により现胞死を抑制する蛋癜質が埗られた。 たた本発明により、 それを コ䞀ドする遺䌝子のクロヌニングに成功した。 本発明の现胞死を抑制する蛋癜質 は、 神経现胞死が関連する疟患の治療に有甚であり、 たた該蛋癜質の機胜ず同様 の機胜を有する物質、 該蛋癜質の機胜を阻害たたは促進する䜜甚を有する物質等 を医薬ずしお開発するに際しおも極めお有甚である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以䞋の a) たたは b) の蛋癜質
(a) 配列番号 1に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質
(b) 配列番号 1のアミノ酞配列においお 1もしくは数個のアミノ酞が欠倱、 眮換もしくは付加されたアミノ酞配列からなり、 か぀现胞死を抑制する掻 性を有する蛋癜質。
2. 配列番号 1に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質をコヌドする遺䌝子。
3. 以䞋の a) たたは b) からなる遺䌝子
(a) 配列番号 2に蚘茉の塩基配列からなる DN A
(b) 配列番号 2の DN Aずス トリンゞェン卜な条件でハむブリダィズし、 か぀现胞死を抑制する掻性を有する蛋癜質をコヌドする DNA。
4. 以䞋の①〜⑀の理化孊的性状および生理掻性を有する蛋癜性物質である こずを特城ずする现胞死抑制因子
①プロ トオンコゞヌンである b 2遺䌝子で圢質転換された耐色现胞腫の培 逊液から埗るこずができる 
②還元䞋 S DS— PAGEによる掚定分子量は玄 35 000である
③现胞の死滅を抑制する掻性を有する 
④ N末端偎の 1から 22番目のアミノ酞配列が以䞋のアミノ酞配列である  V a 1 Me t G 1 y S e r G 1 y A s p S e r V a 1
P r o G l y G 1 y V a 1 Cy s T r p L e u G i n
G i n G l y L y s G 1 u A l a Th r
â‘€ N末端偎の 1 38〜 14 1番目のアミノ酞配列が以䞋のァミノ酞配列である。
Ty r A r g G l y A r g
5. 請求項 1に蚘茉の蛋癜質たたは請求項 4に蚘茉の现胞死抑制因子を有効 成分ずしお含有する、 现胞死を抑制するための医薬組成物-
6. 蛋癜質が請求項 1に蚘茉のb) の蛋癜質である請求項 5の医薬組成物。
7. 蛋癜質が配列番号 4のァミノ酞配列のうちシグナルぺプチドに察応す るァミノ酞配列を陀いたァミノ酞配列からなる蛋癜質である請求項 6の医薬組成
s
。告
2Z
609S0/86df/13d ^ l 66 ΟΛ\
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